Analýza DNA. Co zjišťujeme u DNA DNA. PCR polymerase chain reaction. Princip PCR PRINCIP METODY PCR

Co zjišťujeme u DNA  Genetickou podstatu konkrétních proteinů  Mutace – bodové (sekvenční delece nebo inzerce nukleotidů), chromosomové aberace (numerické, strukturální)  Polymorfismy – konkrétní mutace, které se vyskytují v populaci s frekvencí vyšší než 1%  Podobnost DNA mezi druhy  Vlastnosti - koncentraci, čistotu, chemické vazby s proteiny, funkci …

Analýza DNA

PCR – polymerase chain reaction

DNA    

ACGGTCGACTGCGATGAACTCCC ACGGTCGACTGCGATCAACTCCC ACGGTCGACTGCGATTTGAACTCCC

izolace detekce DNA specifické analýzy DNA struktury hlavní metody pro práci s DNA: PCR sekvenace RFLP DNA hybridizace - blotting



Nobelova cena za její objev v roce 1984



obdoba DNA replikace, která se odehrává v buňkách



amplifikace (zmnožení) vybraných úseků DNA



u oblasti, kterou se snažíme amplifikovat musíme znát sekvenci koncových částí



cyklické střídání těchto teplotních kroků: denaturace – dvoušroubovice se oddělí na jednotlivá vlákna (teplota; chemická činidla) annealing (anýlink) – ke koncové oblasti vybraného úseku se naváží primery (oligonukleotidy – jednovláknové řetězce; cca 20bp ) elongace – prodloužení primeru vkládáním jednotlivých dNTP (A,G,C,T) na základě komplementarity k templátové DNA

3´ 5´

5´ 3´

primer

Princip PCR

PRINCIP METODY PCR Teplotní denaturace

1. CYKLUS

Annealing primerů

5´ 3´

3´ 5´

5´

3´

3´

5´

5´

3´

3´

5´

5´ 3´ 5´ 3´

3´ 5´ 3´ 5´

DENATURACE

PRIMERY

Taq POLYMERÁZA

Elongace

Teplotní denaturace

(1 MOLEKULA)

(2 MOLEKULY) DENATURACE PRIMERY

2. CYKLUS

Taq POLYMERÁZA

(4 MOLEKULY)

Annealing primerů

3. CYKLUS

DENATURACE PRIMERY Taq POLYMERÁZA

4. CYKLUS

(16 MOLEKUL)

5. CYKLUS

(32 MOLEKUL)

(8 MOLEKUL)

Elongace

1

PCR

Elektroforéza

 v reakci: templát (DNA), Taqpolymeráza (teplotně stabilní), primery, dNTP (jednotlivé nukleotidy) a vhodný pufr  z jednoho cílového lokusu pro dané primery vznikne po 1 cyklu denaturace, annealingu a elongace vždy dvojnásobek DNA fragmentů (velikost fragmentu je dána primery)  možno vyjádřit matematicky 2n – kde n je počet cyklů

 metoda, která slouží k rozdělení amplifikovaných DNA fragmentů o nestejné délce  DNA má celkově slabě negativní náboj a v elektrickém poli putuje ke kladné elektrodě  rychlost putování je závislá na její celkové délce

Kolik bude DNA fragmentů po 8 PCR cyklech?

28= 256

 gel (agaróza, polyakrylamid) je ponořen do vhodného pufru mezi elektrody – v gelu u záporné elektrody jsou jamky, do kterých se dává vzorek DNA – pustí se elektrický proud – po čase se fragmenty rozdílných délek rozdělí – vizualizace fragmentů se provádí například ethidiumbromidem (interkalačního činidla), které svítí v UV světle

3'

Sekvenace

5'

5'

*

Analyzovaná DNA (jednovláknová)

3'

Značený primer

DNA-polymerasa, primer, nukleotidy - rozdělení do čtyř zkumavek. Přidány jednotlivé ddNTP: ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP

 Zjištění konkrétní sekvence vybraného úseku DNA řetězce  Při vhodných podmínkách sekvenační PCR se syntetizují řetězce všech možných velikostí  Fragmenty (řetězce) mají rozlišení ve své délce i o jeden nukleotid  Sangerova metoda - chemicky modifikované dNTP (deoxyribonukleosidtrifosfátů) na ddNTP (dideoxyribonukleosidtrifosfáty), které postrádají 3'-OH skupinu; za ddNTP si při elongaci už nemůže přisednout žádný normální nukleotid a dojde tedy k terminaci elongace  Pro sekvenaci se do PCR reakce dá: zkoumaný fragment DNA, primer pro jedno vlákno DNA, pufr, polymeráza a mix normálních dNTP a odlišně fluorescenčně značených ddNTP (detekce laserem)  Elektroforetická detekce - sekvenace se odehrává ve 4 reakčních směsích (ddATP; ddTTP; ddCTP; ddGTP); obvykle bývá radioaktivně značený primer, rozlišení fragmentů v gelu

PCR syntéza komplementárního vlákna (značeno barevně pro jednotlivé ddNTP) ve směru 5'→3'

* * *

A

* C A A

* G

*

C

*

G

* C

*

*

G

*

*

T T T

Elektroforéza A

C

G

T

-

+ Výsledná sekvence na syntetizovaném vlákně:

5'- C T A G T A G G T C C A - 3' Sekvence analyzované DNA (komplementarita párování basí):

3'- G A T C A T C C A G G T - 5'

Sekvenace - Sanger

Restrikční endonukleázy - restriktázy

AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAATTGCATGGCAACTGCAGATCGATGCAAGTGCCGATC TTCAGGCTAGCAATCGAAGGCTTAACGTACCGTTGACGTCTAGCTACGTTCACGGCTAG

Enzymy, které štípou dvouvláknovou molekulu DNA uvnitř řetězce a to vždy v konkrétní pozici, charakteristické pro danou restriktázu (restrikční místo)

začne probíhat sekvenační PCR s mixem dNTP a fluoresčenčně značenými ddNTP

 např. Eco R1 – restriktáza izolovaná z Escherichia coli, která specificky štípe v sekvenci G^AATTC

AAGTCCGATCGTTAGCTTC AAGTCCGATCGTTAGCTTCC AAGTCCGATCGTTAGCTTCCG AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGA AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAA AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAAT AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAATT AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAATTG AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAATTGC

AATGCTAATGCCTAGTCAAGCTTTCATCGAGAATTCCAGTCGAA TTAGCTTTACGGATCAGTTCGAAAGTAGCTCTTAAGGTCAGCTT

nejkratší fragment ve schématu bude svítit červenou barvou a nejdelší také červenou

AATGCTAATGCCTAGTCAAGCTTTCATCGAG TTAGCTTTACGGATCAGTTCGAAAGTAGCTCTTAA

AATTCCAGTCGAA GGTCAGCTT

speciální elektroforéza s laserovou detekcí fluorescenčně barvených ddNTP

2

Identifikace restrikčních míst

RFLP – restriction fragment length polymorphism

Na uvedeném vlákně najděte restrikční místa pro nabídnuté enzymy  charakteristické fragmenty pro každého jedince po naštípání celkové DNA restriktázami  jednotlivé cílové sekvence vybraných restriktáz mohou být mutovány, nebo v rámci jiných delecí/inzercí posunuty (variabilita restrikčních míst)  každý člověk má proto charakterictické rozložení restrikčních míst pro určitou restriktázu (restrikční mapy)  Mendelovská dědičnost délky restrikčních fragmentů

restrikční místo Alu I

AG / CT

Sau 3AI

/ GTAC

Msp I

C / CGG EcoRI – štípání fragmentů 2 jedinců

5´G.G.G.C.G.T.A.C.A.T.A.G.C.T.A.A.T.G.G.C.A.A.G.C.T.A.T.G.G.T.3´

AGAATTCGCCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATTGAGCTCGAATTCC AGAATTCGCCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATTGAGCTCGAATTCC

na elektroforéze bude mít druhý jedinec delší fragment 8

RFLP – restriction fragment length polymorphism

Southern - blotting  Jméno po objeviteli Southernovi; umožňuje z velkého množství fragmentů (např. po štěpení celkové DNA restrikčními endonukleázami) specificky detekovat DNA fragment  V doslovném překladu pijákování – tzn. nasátí PCR produktů z elektroforetického gelu na membránu (nylonovou) a jejich následná analýza  Hybridizace = spojení dvou jednovláknových DNA podle pravidla komplementarity  Gel se denaturuje v chemickém činidlu – tím se denaturuje i dvouvláknová DNA a na membránu jsou blottována jen jednořetězcová vlákna a to v takovém uspořádání, v jakém byla na elektroforetickém gelu  Následuje hybridizace s radioaktivně značenou próbou – membrána je ponořena do roztoku s jednovláknovým radioaktivně značeným řetězcem DNA  Na základě komplementarity basí buď dojde/nedojde k hybridizaci  Nenavázaná próba je odmyta –  V případě úspěšné hybridizace „svítí“ na membráně fragment tvořený jedním vláknem DNA a jedním vláknem próby

Southern - blotting

Southern blot – hybridizace sondy

DNA

Sonda

Zahřátí (denaturace) Ochlazení (renaturace)

12

3

Fenylketonurie

PAH gen Fenylketonurie  defekt genu pro fenylalanin hydroxylázu (PAH) – AR onemocnění  PAH – 13 exonů  mnoho mutací (více než 400 známých v roce 2000) • Mutace - např. delece v 2. exonu;

 defekt genu pro fenylalanin hydroxylázu (PAH) – AR onemocnění  PAH – 13 exonů  mnoho mutací (více než 400 známých v roce 2000)

detekce systémem restrikční endonukleázy (viz obrázek) Při negativním výsledku vyšetření jednoho exonu  vyšetření mutací v dalších exonech

 Fenylketonurie

RFLP – prenatální vyšetření

RFLP metoda Autosomálně recesivní onemocnění (např. cystická fibróza, fenylketonurie)

Fenylketonurie - AR A)

Vyšetření je informativní Druhá dcera má genotyp Aa

B)

Vyšetření je informativní Plod heterozygot - zdravý

RFLP metoda

RFLP metoda

Polycystická choroba ledvin - AD

GR onemocnění – hemofilie (obdobné pro barvoslepost)

Vyšetření je informativní Druhá dcera má genotyp aa

Dcera zdravá Genotyp X+Xh Přenašečka

4

Polymorfismy lidské DNA - vazebná analýza v přímé a nepřímé diagnostice

Nondisjunkce u Downova syndromu

Mikrosatelity (syn. krátké tandemové repetice) STR…short tandem repeats, SSR…simple sequence repeats

TAGCCATCGGTACACACACACACACACAGTGCTTCAGTAGC TAGCCATCGGTACACACACACACAGTGCTTCAGTAGCGTAG Pokud se detekovatelný polymorfismus nachází dostatečně blízko lokusu, ve kterém se vyskytuje kauzální mutace pro sledovanou chorobu, bude možné jej využít i bez znalosti molekulární podstaty daného onemocnění: → vazba polymorfismu s mutovanou alelou.

Tři rodokmeny rodin s dětmi postiženými Downovým syndromem (prostá trisomie). Výsledek analýzy DNA – tetranukleotidového polymorfismu na chromozómu 21 - je znázorněn pod rodokmeny.

V závislosti na frekvenci crossing-overu bude současně s mutací předáván z rodičů na potomky → kosegregace markeru s mutovanou alelou.

Od kterého z rodičů zdědilo dítě třetí kopii chromozómu 21? V kterém meiotickém dělení došlo k nondisjunkci? 3

1

Nondisjunkce u Downova syndromu

Nondisjunkce u Downova syndromu

?

?

Meióza I u otce nebo

Meióza I u otce nebo

u matky

u matky

Meióza I u matky

2

3

Polymorfismy lidské DNA využívané v přímé a nepřímé diagnostice

Nondisjunkce u Downova syndromu

Jednonukleotidové polymorfismy (single nucleotide polymorphisms – SNP) SNP C/A TAGCCATCGGTA N GTACTCAATGATCAGCT ?

G C Meióza I u otce nebo u matky

T A Meióza I u matky

Meióza II u matky 4

1

5

DNA čipy - microarrays

Polymorfismy lidské DNA využívané ve vazebné analýze, přímé a nepřímé diagnostice

 Moderní metoda analýzy DNA v několika lokusech současně  Genové čipy obsahují velké množství sond, které hybridizují s různými oblastmi genomu  Rovněž využívá hybridizace  Využití nanotechnologií – manipulace se vzorky probíhá převážně roboticky a vyhodnocení je softwarové

Jednonukleotidové polymorfismy (single nucleotide polymorphisms – SNP) V 99.9% sekvence DNA se lidé od sebe vzájemně neliší. Ze zbývajícího 0.1% rozdílu tvoří SNP přes 80%. Projekt lidského genomu nyní pokračuje mj. ve formě identifikace miliónů SNP, které jsou shromažďovány ve veřejně přístupných databázích. Možnost typizace mnoha set tisíc SNP v jednom vzorku pomocí DNA čipů by měla usnadnit identifikaci alel, zodpovědných za řadu prevalentních onemocnění.

2

6