ANALISIS SENYAWA AKTIF DALAM MATRIKS BIOLOGI Prof. Dr. Slamet Ibrahim S. DEA. Apt. Marlia Singgih Wibowo, PhD, Apt. Sekolah Farmasi ITB
INTRODUCTION Senyawa Aktif seperti Obat memiliki peran penting dalam tubuh kita, terutama saat penyembuhan penyakit Sampel Biologis adalah samples yg diambil dari sebagian tubuh untuk tujuan analisis , misalnya bloo/darah , urine, stomach contents ( including stomach washing and vomit/muntah), liver/hati, bile/empedu, brain, kidneys, meat, hairs, atau bagian tubuh. Blood atau urine samples adalah contoh sampel yang paling umum utk clinical cases dan utk mendeteksi misalnya : detect doping in athletes, in fatal or poisoning cases, in pharmacokinetics study, and in therapeutic drug monitoring.
Sampel biologi adalah contoh uji yang diambil atau berasal dari tubuh manusia, khewan atau tumbuhan berupa urin, darah, cairan lambung, daging, hati, atau jaringan lainnya. Matriks biologi adalah bahan-bahan lain di luar analit dalam sampel biologi. Analit dalam sampel dapat berupa senyawa tunggal atau campuran berbagai senyawa yang akan dianalisis.
SAMPEL DAN PENGAMBILAN SAMPEL
Blood/darah adalah sampel yg paling baik untuk identifikasi obat atau zat aktif lainnya dan utk analisis kuantitatif. Sampel darah harus diambil oleh petugas yang trampil dan berpengalaman untuk menjamin kebenaran sampel nya. Plasma atau serum biasanya digunakan untuk analisis klinis karena kandungan komponen darah lebih sedikit dibandingkan darah utuh. Namun kebanyakan obat terdistribusi antara erythrocytes dan plasma, rasio nya bervariasi. Karena alasan tersebut, plasma hrs dipisahkan dari eritrosit sesegara mungkin setelah penambahan anticoagulant untuk menjamin hemolisis erythrocytes tidak akan mempengaruhi analysis.
Urine memiliki keuntungan dibandingkan darah krn konsentrasi obat dalam urin dpt sekitar 100x lebih besar drpd dlm blood, dan bebas dari protein yg mungkin dpt mempengaruhi analysis. Kerugian sampel Urine adalah kebanyakan obat yang diekskresikan di urin hampir seluruhnya berada dlm bentuk metabolit nya, sehingga untuk membukikan keberadaan obat asli nya diperlukan analisis di jaringan lain.. Urine masih merupakan “sample of choice” utk deteksi dopping pada atlet karena mudah diperoleh dalam jumlah besar dan mengandung banyak senyawa2 secara bersamaan.
Sampel hati (liver extract) bermanfaat untuk analisis dalam “postmortem examination”. Banyak jenis obat yg berada dalam konsentrasi tinggi di hati dibandingkan di dalam darah. Sangat penting diperhatikan kantung empedu telah diikat terlebih dahulu, agar organ hati tidak terkontaminasi oleh empedu. Bile/empedu secara khusus bermanfaat sbg sampel utk deteksi “morphine-like compounds” karena dpt berada dlm konsentrasi yg tinggi dlm btk ikatan glucuronida. Sampel empedu harus dibuat terpisah.
1.
2.
3.
Analisis senyawa aktif dalam sampel biologi mempunyai berbagai tujuan: Untuk mengetahui/menetapkan adanya atau jumlah senyawa endogenik tertentu: kimia klinik untuk tujuan diagnosa. Untuk menetapkan adanya atau jumlah senyawa exogenik ( berasal dari luar tubuh):analisis metabolit, doping, keracunan, kesetaraan dan ketersediaan hayati suatu obat. Untuk memantau penggunaan obat baik dalam analisis farmakodinamik, pemantauan maupun kepatuhan pasien.
1.
2.
Berbagai kendala perlu diperhatikan dalam analisis senyawa aktif dalam sampel biologi yaitu: Kadar analit biasanya rendah, oleh karena itu perlu metode analisis yang sensitif. Dalam sampel biologi biasanya mengandung berbagai senyawa baik endogen maupun exogen yang dapat mempengaruhi hasil analisis. Oleh karena itu perlu analisis yang selektif atau dilengkapi dengan teknik pemisahan sebelum dilakukan analisis.
PENANGANAN SAMPEL 1.
2.
Transportasi dan Penyimpanan sampel: Semua spesimen (sebutan lain dari sampel biologi yang berasal dari tubuh manusia atau khewan) yang akan dianalisis hendaknya diberi label yang berisi nama pasien, nomor, asal, jenis, tujuan analisis, tanggal penerimaan, nama pemohon analisis, dll. Semua spesimen hendaknya disimpan pada suhu 4oC sebelum analisis, dan setelah dilakukan analisis sampel hendaknya disimpan selama 3 – 4 minggu pada suhu 4oC atau untuk beberapa sampel dan kasus, disimpan pada -20oC.
CONTAINER/ WADAH SAMPEL Sedapat mungkin menggunakan “Disposable container “ untuk menghindari kemungkinan kontaminasi. Sampel biologi cair paling baik ditempatkan dalam wadah gelas yang di seal dengan bahan yg inert (mis. PTFE liner). Tutup karet sebaiknya dihindari utuk mencegah kemungkinan absorpsi atau contamination. Wadah Plastik digunakan utk solid samples, selama tidak ada kontak dengan dinding wadah untuk mencegah absorpsi oleh dinding wadah. Sampel2 selanjutnya dikemas dalam kotak/boks karton untuk melindungi sampel, dan dibawa dalam tas berbahan polythene supaya tidak basah bila kehujanan selama proses transportasi.
STORAGE/PENYIMPANAN
Suatu obat dapat terdekomposisi (akibat proses photolysis, oxidation, hydrolysis, atau temperature) selama transportasi dan penyimpanan, , sehingga akan menyebaban kesalahan analisis. Secara umum, sampel biologis disimpan dalam suhu rendah. Dibawah 4oC dan hrs dianalisis dlm beberapa hari. Sampel dapat disimpan lebih lama pada suhu -20o, tetapi hanya bisa di “thawed” sekali saja sebelum analysis. Utk “long-term storage” , penyimpana dengan cara “freezedrying” disarankan. Sampel biologis membeku pada -20o utk preservasi. “Freezing/pembekuan” merupakan metode ideal utk menyimpan bahan2 obat. Kadang2 , senyawa preservative digunakan selama penyimpanan. Mis. sodium azide atau sodium fluoride or embalming fluids for dead body.
• PERLAKUAN AWAL
(PRETREATMENT) 1.
2.
3. 4.
Beberapa sampel biologi yang mengandung protein seperti darah (plasma dan serum) perlu diperlakukan awal berupa penghilangan protein (deproteinasi) dengan cara pengendapan atau hidrolisis. Pengendapan dilakukan dengan penambahan asam triklorasetat, amonium tungstat, atau amonium sulfat. Hidrolisis dilakukan dalam suasana asam. Ekstraksi dengan menggunakan pelarut organik yang sesuai. Kadang-kadang digunakan juga kromatografi kolom cepat atau mikrodialisis untuk isolasi senyawa aktifnya. Proses “clean-up” atau pemekatan dengan menggunakan ekstraksi fase padat (solid phase extraction). Pemekatan (penguapan) dan pelarutan dalam pelarut yang sesuai untuk pengukuran/analisis.
DRUGS COMMONLY TAKEN IN OVERDOSES Fraction A (Strong Acids): Salycilates, Phenytoin. Fraction A-2 (Weakly Acids): Barbiturates, Chlorpropamide, Glutethimide, Paracetamol, Phenylbutazone, and Phenytoin. Fraction A-3 (Neutral Drugs): Caffeine, Carbromal, Chlordiazepoxide, Chlormethiazole, Ethchlorvynol, Flurazepam, Glutethimide, Lorazepam, Meprobamate, Methaqualone, Methyprylone, Nitrazepam, Phenazone, Temazepam, Theophyline
Fraction B (Basic Drugs) Amitriptyline, Amphetamine, Caffeine, Chlordiazepoxide, Chlormethiazole, Chlorpromazine, Clomipramine, Desipramine, Dextropropyphene, Diazepam, Dihydrocodein, Dothiepin, Doxepin, Ergot alkaloids, Flurazepam, Imipramine, Lorazepam, Maprotiline, Methadone, Methaqualone, Mianserin, Morphine, Nitrazepam, Orphanedrine, Oxprenolol, Phenelzine, Propanolol, Quinine, Temazepam, Theophylline, Thioridazine, Trimipramine. Fraction BE (Benzophenones): Benzodiazepines Fraction O (Opiates): Codeine, Morphine, etc.
PENYIAPAN SAMPEL DAN PRETREATMENT Pilihan solvent utk extraction terbatas berdasarkan polaritas senayawa aktif yang akan dianalisis. Pilihan adalah antara ether, chlorinated hydrocarbons, ethyl acetate, atau acetone. Jika chloroform digunakan untuk kedua fraksi basa atau asam (Fraction B or A), the basic group should be performed first in order to avoid the loss chloroform-soluble salt in the chloroform used to extract the acids group. Techniques of general solvent extraction are used according to Stass-Otto method.
METODE EKSTRAKSI Dapat dilihat atau diadopsi dari pustaka primer (jurnal ilmiah) atau sekonder (buku teks, pegangan atau acuan). Secara umum dapat digunakan metode ekstraksi Stass-Otto atau Metode Jackson dalam Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons. Senyawa asam diekstraksi dalam suasana asam (pH < pKa - 2) dan senyawa basa pada suasana basa (pH > pKb + 2) dengan menggunakan pelarut organik yang sesuai. Sedangkan senyawa netral diekstraksi pada suasana netral (pH sekitar 7) dengan menggunakan pelarut organik.
• EKSTRAKSI
Ekstraksi cair-cair senyawa aktif seperti obat dan senyawa lipofilik lainnya dari spesimen ke dalam pelarut organik tak bercampur dengan air yang sesuai, biasanya dilakukan pada pH yang terkontrol. Ekstraksi bertujuanmenghilangkan air dan senyawa lain yang mengganggu analisis, dilanjutkan dengan pemekatan dengan penguapan atau dengan SPE dan akhirnya dilarutkan dalam pelarut yang sesuai sebelum dilakukan analisis. Ekstraksi dapat dilakukan dalam tabung reaksi sesuai dan pengocokan dilakukan dengan alat Vortex. Sedangkan penguapan dapat dilakukan dengan hembusan gas nitrogen, udara panas atau dalam alat penguap putar vakum (vacuum rotary evaporator). Pemisahan kadang-kadang dilakukan dengan sentrifugasi.
EXTRACTION
OF
URINE
To 10 ml of urine + phosphoric acid or tartaric acid to adjust pH 3, extract with 2 X 30 ml portions of ether. Combine the ether extracts and wash with 5 ml of water. Retain the aqueous layer for later extraction. Extract the ethereal layer with 5 ml of saturated sodium bicarbonate solution and retain the aqueous layer for possible examination for the presence of salicylate or strong acid- Fraction A-1). Extract the ethereal layer with 5 ml of 0.5 M sodium hydroxide and retain the aqueous extract for barbiturates or weakly acid (Fraction A-2). Wash the ethereal solution with water, discard the washing, dry the solution with anhydrous sodium sulfate, and evaporate to dryness. The residue may contain neutral drugs (Fraction A-3N)
FAKTOR-FAKTOR YANG HARUS
DIPERTIMBANGKAN DALAM EKSTRAKSI.
Sifat fisiko-kimia analit (pKa, stabilitas, kelarutan, volatilitas, dll.) Sifat alami (nature) dari sampel : mengandung protein atau lemak, stabilitas, dll.) Sifat fisiko-kimia pelarut organik yang digunakan (immiscibility, volatility, polarity, dan kemampuan pelarutan, dll.) Metode atau teknik analisis yang akan digunakan.
MISALNYA EKSTRAKSI SENYAWA DIURETIKA Sejumlah 3 ml urin dipipet kedalam tabung sentrifuga, tambahkan sejumlah baku internal dan tambahkan dapar fosfat pH 5 dan 0,5 g natrium sulfat anhidrat. Campuran divortex dan diekstraksi dengan 5 ml dietileter lalu divortex lagi selama 5 mn. Tabung disentrifugasi pada 2500 g selama 5 menit. Fase organik dipindahkan ke dalam tabung yang lain dan diuapkan dengan aliran udara panas atau hembusan gas Nitrogen atau penguap putar hampa. Residu dilarutkan dalam 200 µl metanol dan disaring melalui membran 0.45 µm, dan 5 atau 10 µl disuntikan kedalam kromatograf.
ANALISIS SENYAWA AKTIF
1. 2.
3.
Setelah diekstraksi, diuapkan, dan dilarutkan kembali dalam pelarut sesuai, analit dianalisis secara: Spektrofotometri (UV, IR, AAS/FES, MS) Kromatografi (KCKT, KG dan KLTDensitometri). Radioimunokimia (RIA, dll).
