BioSMART Volume 7, Nomor 1 Halaman: 1-5
ISSN: 1411-321X April 2005
Aktivitas Inulinase Jamur yang Diisolasi dari Tanah Sekitar Umbi Dahlia (Dahlia pinnata Cav.) Study of inulinase activity from fungus isolated from soil around dahlia tuber (Dahlia pinnata Cav.) 1
SITI LUSI ARUM SARI♥, HARI HARTIKO Jurusan Biologi, FMIPA, Universitas Sebelas Maret (UNS) Surakarta 57126 2 Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada (UGM) Yogyakarta 55281 Diterima: 1 Pebruari 2005. Disetujui: 1 Maret 2005.
ABSTRACT The purposes of this research were to obtain inulinase producing fungus and to optimize temperature and pH condition for inulinase activity. This research was conducted in three steps: (i) isolation of inulinase producing fungus from soil around rizophere of Dahlia pinnata Cav., (ii) selection of highest inulinase producing fungi and determine the optimum incubation time, and (iii) studied the optimum temperature and pH condition for inulinase activity. There were two isolates have been isolated, Fusarium solani (Marc.) Sacc and Mucor sp. F. solani was choosed for the next step because it grown faster in medium with inulin as carbon source then Mucor Sp., showed by averange increasing of dry weight, each 18 mg/day and 3.33 mg/day. The inulinase activity of F. solani (temperature 50oC and pH 4.5) was higher then Mucor Sp. They were 0.113 u/mL and 0.023 U/mL. The optimum incubation time was 5 days. The inulinase activity was optimum at temperature 30oC and pH 3.5. Inulinase activity at optimum temperature and optimum pH was 0.615 U/mL. Key words: inulinase, inulin, fructose, Dahlia pinnata Cav.
PENDAHULUAN Sirup fruktosa dapat diproduksi secara enzimatik dengan bahan dasar berupa pati jagung, kentang, ubi kayu, ubi jalar, sagu dan dahlia. Umbi dahlia mengandung polimer pemanis alami yang disebut inulin. Inulin memiliki beberapa keunggulan sebagai substrat pembuatan sirup fruktosa yaitu: rendemen fruktosa yang dihasilkan lebih tinggi (dapat mencapai 92-98%), sedang pati hanya 45%; waktu biokonversi lebih singkat yaitu antara 10-12 jam, pati 3-3,5 hari; hanya memerlukan satu tahap reaksi enzimatis yaitu dengan inulinase, pati memerlukan tiga tahap yaitu liquidasi, sakarifikasi dan isomerasi dengan tiga jenis enzim yaitu λ amilase, amiloglukosidase dan glukoisomerase (Vandame dan Deryke, 1993). Vandame dan Deryke (1983) menyatakan bahwa enzim inulinase dapat diisolasi dari umbi dahlia, jerusalem artichoke, chichori dan dandelion namun aktivitasnya relatif rendah dibanding dengan inulinase yang diisolasi dari mikrobia. Mikrobia penghasil inulinase dapat diisolasi dari tanah sekitar umbi dan perakaran tanaman yang mengandung inulin seperti dahlia dan jerusalem artichoke. Mikrobia penghasil enzim inulinase antara lain: bakteri Bacillus sp., Flavobacterium multivorum, Arthrobacter ♥ Alamat Alamat korespondensi: korespondensi: Jl. Ir. Sutami 36A, Surakarta 57126 Candikuning, Baturiti, Tabanan, Bali 82191. Tel. & Fax.: +62-271-663375. +62-368-21273. e-mail:
[email protected],
[email protected] [email protected]
areofaciens (Allais et al, 1987), Actinomyces logisporus IFO 12885, Actinomyces cyanoalbus IFO 12587 (Ishibashi et al dalam Vandame dan Deryke, 1983); jamur Aspergillus sp., Chrysosporium pannorum, Pennicillium sp.; Yeast Debarianomyces sp., Saccaromyces sp., Candida keyfer dan Kluyferomyces sp. (Xiao et al, 1988) Lutony (1993) menyatakan bahwa produksi sirup fruktosa di Indonesia mengalami kendala yaitu belum adanya produsen enzim inulinase di dalam negeri. Mengingat hal tersebut diatas perlu diadakan penelitian lebih lanjut mengenai enzim inulinase. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan isolat jamur penghasil enzim inulinase dan menentukan suhu serta pH yang optimum untuk aktivitas inulinase. BAHAN DAN METODE Isolasi jamur dan pembuatan kultur sediaan Sebanyak 10 g tanah dimasukkan ke dalam 90 mL larutan pepton 0,1% steril digojok selama 15 menit kemudian didiamkan hingga mengendap. Setelah mengendap, cairan yang jernih diambil sebanyak 0,1 mL dan diinokulasikan secara spread plate pada medium isolasi agar plate yang mengandung inulin. Inkubasi dilakukan pada suhu kamar selama 4-6 hari. Selanjutnya diambil hifa dan diinokulasikan pada tiga titik dalam medium PDA hingga diperoleh biakan murni. Isolat murni yang diperoleh diinokulasikan pada media PDA miring dan diinkubasikan 2005 Jurusan Biologi FMIPA UNS Surakarta
B i o S M A R T Vol. 7, No. 1, April 2005, hal. 1-5
2
selama 5-7 hari pada temperatur kamar. Selanjutnya sediaan disimpan dalam lemari pendingin sebelum digunakan. Komposisi media untuk isolasi jamur penghasil inulinase (Xiao, 1988b) untuk setiap liter adalah: inulin 10 g, ekstrak daging 10 g, MgSO4.7H2O 0,5 g, FeSO4.7H2O 0,01 g, NaNO3 2 g, K2HPO4 0,5 g, KCl 0,4 g, streptomycin l 0,1 g dan agar 16 g. Untuk pemurnian dan pemeliharaan kultur, jamur ditumbuhkan pada media PDA (Potato Dextrosa Agar). Penetapan waktu inkubasi Sebanyak 15 mL medium cair diinokulasi dengan 0,2 mL inokulum dan diinkubasikan selama 6 hari pada temperatur kamar. Inokulum dibuat dengan melarutkan spora dari biakan miring umur 5 hari dengan 5 mL cairan medium. Selanjutnya dilakukan pengujian aktivitas inulinase, pengukuran kadar protein terlarut dan berat kering miselium pada hari 1, 2, 3, 4, 5, dan 6. Komposisi media untuk produksi Enzim (Nakamura dan Hoasi, 1969) untuk setiap liter adalah: 10 g inulin, 5 g pepton, 8 g NH4H2PO4, 4 g (NH4)2HPO4, 0,5 g MgSO4.7H2O, 0,01 g FeSO4.7H2O dan 0,5 g KCl. Preparasi sumber enzim Lima puluh mililiter media cair untuk produksi enzim diinokulasi dengan 1 mL inokulum, diinkubasikan pada temperatur kamar dan digoyang dengan kecepatan 100 rpm selama 5 hari. Setelah inkubasi, biakan disentrifus dengan kecepatan 5000 rpm selama 20 menit pada temperatur 4oC sehingga diperoleh crude ekstrak sebagai sumber enzim Penentuan aktivitas enzim Inulinase Media cair yang mengandung enzim sebanyak 1 mL ditambah 1 mL inulin sebagai substrat (larutan inulin 1% dalam 0,1 M buffer acetat PH 4,5). Selanjutnya campuran dinkubasikan pada temperatur 50o C selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan cara memasukkan tabung dalam air mendidih selama 5 menit. Dibuat blangko dengan memuat campuran yang sama tanpa diinkubasi tapi langsung dipanaskan. Gula reduksi yang dihasilkan langsung dianalisis dengan metoda Nelson-Somogyi (Sudarmanto dkk, 1992; Rouwenhorst et al., 1988), Aktivitas enzim ditentukan dengan rumus: Aktivitas enzim = P Y X BM W
p(y-x) unit/mL BM.W
= faktor pengenceran = Gula hasil aktivitas inulinase (µg/mL) = Gula pada blanko (µg/mL) = Berat molekul fruktosa = Waktu dalam menit.
Sebanyak 1 unit/mL aktivitas enzim didefinisikan sebagai sejumlah enzim yang dapat membebaskan 1 µmL fruktosa per menit. Aktivitas spesifik ditentukan dengan membandingkan aktivitas enzim yang terkandung dalam setiap mL (U/mg protein). Protein ditentukan dengan metoda Lowry.
Rancangan perlakuan Penelitian ini terdiri atas tiga tahap yaitu: (i) isolasi jamur penghasil inulinase, (ii) Penelitian pendahuluan untuk menetapkan waktu inkubasi dan pemilihan isolat, (iii) karakterisasi inulinase yang meliputi penentuan suhu dan pH optimum untuk aktivitas inulinase. Rancangam percobaan yang digunakan dalam penelitian pendahuluan adalah Rancangan Acak Berkelompok dengan dua faktor yaitu waktu inkubasi (1, 2, 3, 4, 5, 6) dan spesies jamur, masing-masing dengan 3 ulangan. Rancangan percobaan yang digunakan dalam karakterisasi inulinase adalah Ranangan Acak Lengkap dengan 16 perlakuan dan 5 ulangan. Analisis data Data yang diperoleh dari hasil penelitian dianalisis dengan ANAVA untuk mengetahui ada tidaknya beda nyata. Bila ada beda nyata dilanjutkan dengan uji DMRT untuk mengetahui letak perbedaannya. HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi jamur Hasil isolasi jamur dari tanah sekitar perakaran dahlia didapatkan dua isolat yaitu F. solani dan Mucor sp. Koloni F. solani pada media PDA berwarna putih dan membentuk cincin-cincin konsentris (Gambar 1a). F. solani memiliki ciri spesifik yaitu membentuk masa spora (sporodochia) yang berwarna kebiru-biruan dan mengeluarkan eksudat berupa cairan bening pada pusat cincin. Menurut Samson dan Hoekstra (1984) F. solani merupakan satu-satunya fusarium yang membentuk sporodochia berwarna kebirubiruan. Makrokonidia F. solani berbentuk bulan sabit dengan 3-4 septa (Gambar 2). Mikrokonidia berbentuk elipsoid hingga seperti ginjal. Koloni Mucor sp. pada media PDA berwarna putih kekuningan (Gambar 1b) dan hampir memenuhi seluruh petri dish pada hari ke 5. Mucor sp. memiliki ciri morfologis hifa bersepta, sporangium tumbuh pada hifa aerial, berbentuk bulat dan memiliki kolumela (Gambar 3). Pada uji pendahuluan untuk pemilihan isolat dan penetapan waktu inkubasi, jamur ditumbuhkan pada media cair yang mengandung inulin sebagai sumber karbon. Kultur diinkubasikan pada suhu kamar dan pH awal medium 5. Menurut Nakamura dan Hoasi (1969), Pertumbuhan jamur penghasil inulinase optimum pada pH 5 dan suhu kamar. Hasil uji pendahuluan menunjukkan bahwa F. solani. mampu tumbuh lebih baik pada media dengan inulin sebagai sumber karbon dibanding Mucor sp. Hal ini ditunjukkan dngan pertambahan berat kering F. solani yang lebih besar dibanding Mucor sp. selama inkubasi. Pertambahan berat kering rata-rata F. solani adalah 18 mg berat kering/hari sedangkan Mucor sp. adalah 3,33 mg berat kering/hari. Berat kering F. solani terus bertambah selama waktu inkubasi dan mencapai maksimum pada hari ke-5. Pertumbuhan Mucor sp. pada medium cair dengan inulin sebagai sumber karbon terhambat. Hal ini terlihat dengan pertambahan berat kering yang fluktuatif selama inkubasi (Gambar 4).
SARI dan HARTIKO – Inulinase jamur di sekitar umbi Dahlia pinnata
A
3
Gambar 2. Makrokonidia F. solani. (1000X)
B Gambar 1. A. Koloni F. solani pada media PDA umur 4 hari. B. Koloni Mucor sp. pada media PDA umur 4 hari.
Barat kering miselium (g)
0.1 2 0 .1 0.0 8
F u sa riu m so la n i M u co r S p .
0.0 6 0.0 4 0.0 2 0 0
1
2
3
4
5
6
7
H ari
Gambar 4. Hubungan antara waktu inkubasi dengan berat kering miselium pada temperatur kamar dan pH awal medium 5
Aktivitas inulinase Aktivitas inulinase ditentukan pada suhu 50oC pH 4,5. Menurut Nakamura dan Nakatsu, dalam Vandame dan Deryke (1983) temperatur rata-rata untuk aktivitas inulinase berkisar antara 45-50oC dan optimum pada temperatur 50oC. Aktivitas inulinase cenderung terjadi pada pH asam yaitu sekitar 4-5 dan optimum pada pH 4,5. Hasil uji Anava dan DMRT terhadap aktivitas inulinase selama waktu inkubasi menunjukkan perbedaan yang nyata (Tabel 1). Aktivitas enzim inulinase F. solani meningkat
Gambar 3. Morfologi Mucor sp. (1000X) a. hifa, b. sporangiofor, c kolumela, d. sporangium.
selama waktu inkubasi dan mencapai maksimum pada hari ke lima yaitu sebesar 0,11 unit. Pada hari ke-6 aktivitas inulinase menurun, hal ini berkaitan dengan menurunnya metabolisme pada fase stasioner. Hasil uji korelasi antara pertumbuhan (bertambahnya berat kering miselium) dan aktivitas inulinase F. solani menunjukkan korelasi yang signifikan. Peningkatan aktivitas inulinase diikuti dengan bertambahnya berat kering miselium. Aktivitas inulinase Mucor sp. pada hari pertama dan ke-2 sangat rendah. Pada hari ke-3 aktivitas inulinase meningkat dan mencapai maksimum yaitu sebesar 0,023 unit. Serlanjutnya aktivitas menurun mulai hari ke-4 hingga hari ke-6 (Gambar 5). Aktivitas inulinase mencapai maksimum pada fase logaritmik. Hal ini sesuai dengan pendapat Allais et al. (1986), bahwa inulinase mikrobia dihasilkan pada fase logaritmik. Pada fase logaritmik sel membelah dengan cepat dan konstan. Pada fase ini kebutuhan energi lebih besar dibanding fase lain karena metabolisme berjalan cepat. Untuk memenuhi kebutuhan energi dan sumber karbon maka mikrobia mengeluarkan inulinase untuk menghidrolisis inulin yang terdapat dalam media. Dengan demikian pembentukan inulinase pada fase ini meningkat. Inulinase dapat digolongkan sebagai metabolit primer. Pada fase stasioner aktivitas inulinase menurun. Pada fase stasioner metabolisme berjalan lemah sehingga kebutuhan energi menurun. Biosintesis enzim dihambat katabolit dalam medium disebut represi katabolik. Semakin lama
waktu inkubasi semakin besar jumlah gula reduksi sebagai hasil hidrolisis Inulin. Gula reduksi ini merupakan katabolit yang dapat menghambat aktivitas inulinase jika dalam jumlah yang besar. Dari hasil uji pendahuluan dipilih F. Solani untuk penelitian selanjutnya. Waktu inkubasi optimum F. solani. Ditetapkan selama 5 hari. Waktu inkubasi optimum ditentukan berdasarkan aktivitas inulinase tertinggi yaitu pada fase pertumbuhan logaritmik.
Aktivitas spesifik inulinase (U/mg protein)
B i o S M A R T Vol. 7, No. 1, April 2005, hal. 1-5
4
1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
Fusarium Mucor
0
1
Tabel 1. Hubungan antara waktu inkubasi dengan aktivitas inulinase pada suhu 50 oC pH 4,5.
Aktivitas inulinase (U/ml)
0.12 0.1 0.08
Fusarium
0.06
Mucor
0.04 0.02 0 0
1
2
3
4
5
6
7
Waktu inkubasi (hari)
Gambar 5. Hubungan antara waktu inkubasi dengan aktivitas inulinase pada temperatur 50oC, pH 4,5.
Hasil uji Anava terhadap aktivitas spesifik inulinase selama waktu inkubasi menunjukkan perbedaan yang nyata (Tabel 2). Aktivitas spesifik inulinase F. solani meningkat selama waktu inkubasi (Gambar 6). Peningkatan aktivitas spesifik inulinase F. solani memiliki korelasi yang signifikan dengan bertambahnya berat kering sel. Aktivitas spesifik inulinase F. solani mencapai maksimum pada hari ke 5 yaitu sebesar 1.3 U/mg protein. Aktivitas spesifik inulinase Mucor sp mencapai maksimum pada hari ke 3 yaitu sebesar 0.3 U/mg protein. Tabel 2. Hubungan antara waktu inkubasi dengan aktivitas spesifik inulinase pada suhu 50 oC, pH 4,5. Aktivitas spesifik (U/mL) Mucor sp. F. solani 0a 1 0a 2 0,189b 0a c 3 0,261 0,321d 4 1,089e 0,175b 5 1,256f 0,051g h 6 0,904 0,159b Keterangan: N = 3. Angka yang ditandai dengan huruf yang sama dinyatakan tidak berbeda nyata pada taraf nyata 5%. Hari
3
4
5
6
7
Gambar 6. Hubungan antara waktu inkubasi dengan aktivitas spesifik inulinase pada suhu 50 oC pH 4,5.
Penentuan temperatur dan pH optimum Parameter yang digunakan untuk mendapatkan gambaran kinetika enzim adalah aktivitas enzim yang dinyatakan dalam unit (U). Satu unit aktivitas enzim dinyatakan sebagai banyaknya fruktosa (µ mol) yang dibebaskan setiap mL crude enzim tiap menit (U/mL). Aktivitas enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain Temperatur, pH, konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, aktivator dan inhibitor. Hasil uji Anava dan DMRT (Tabel 3) memperlihatkan perbedaan yang signifikan antar perlakuan suhu pada pH 4,5. Pada Gambar 7 terlihat bahwa aktivitas inulinase meningkat dari suhu 25 oC dan mencapai maksimum pada suhu 30oC. Aktivitas inulinase menurun dengan cepat setelah temperatur optimum terlewati. Penurunan yang cepat terjadi hingga temperatur 40oC . Aktivitas inulinase relatif stabil sampai pada temperatur 65oC. Menurut Copeland (1996) peningkatan suhu pada reaksi enzimatik menyebabkan dua kemungkinan, pertama penurunan energi aktivasi yang berarti meningkatkan aktivitas enzim dan yang ke dua menurunkan aktivitas karena terjadinya denaturasi. Peningkatan aktivitas enzim dibawah suhu optimum disebabkan oleh peningkatan energi kinetik molekulmolekul yang bereaksi. Akan tetapi jika suhu terus ditingkatkan, energi kinetik molekul-molekul demikian besar hingga melampaui penghalang energi untuk memecahkan ikatan-ikatan sekunder yang mempertahankan enzim dalam keadaan aslinya/keadaan katalitik aktif. Akibatnya struktur sekunder dan tertier hilang disertai hilangnya aktivitas biologi. Menurut Vandame dan Derycke (1983) kenaikan suhu meningkatkan kelarutan inulin (substrat). Aktivitas inulinase (U/ml)
Aktivitas (U/mL) F. solani. Mucor sp. 0a 1 0a 2 0,015b 0a 3 0,022c 0,023c 4 0,094d 0,013b e 5 0,113 0,005f 6 0,091d 0,012b Keterangan: N = 3. Angka yang ditandai dengan huruf yang sama dinyatakan tidak berbeda nyata pada taraf nyata 5% Hari
2
W aktu inkubasi (hari)
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 25
30
35
40
45
50
55
60
65
Temperatur
Gambar 7. Pengaruh temperatur terhadap aktivitas inulinase pada pH 4,5.
SARI dan HARTIKO – Inulinase jamur di sekitar umbi Dahlia pinnata Tabel 3. Pengaruh temperatur terhadap aktivitas inulinase pada ph 4,5. Temperatur (oC)
Aktivitas (U/mL)
0,032a 25 30 0,458b 35 0,275c 40 0,155d 45 0,152d 50 0,114e 55 0,182f 60 0,067g 65 0,048h Keterangan: N = 3. Angka yang ditandai dengan huruf yang sama dinyatakan tidak berbeda nyata pada taraf nyata 5%.
Aktivitas inulinase meningkat dari pH 2,5 dan mencapai maksimum pada pH 3,5 (Gambar 8). Aktivitas inulinase tertinggi terjadi pada suhu 30oC pH 3,5. Aktivitas sedikit menurun pada pH 4 dan cenderung stabil hingga pH 4,5. Penurunan yang cepat terjadi setelah pH 4,5. Inulinase cenderung aktif pada pH asam. Hal ini sesuai dengan beberapa literatur misalnya pH optimum inulinase Aspergillus niger 3,8 (Pringsein dan Kohn, 1924 dalam Vandame dan Derycke, 1983), Talaromyces flavus 4-5 (Ishibashi et al., 1974 dalam Vandamme dan Derycke, 1983).
Tabel 4. Pengaruh pH terhadap aktivitas inulinase pada suhu 30oC. pH
Aktivitas (U/mL)
0,091a 2,5 3 0,224bc 3,5 0,615e 4 0,375d 4,5 0,459d 5 0,256c 5,5 0,155ab Keterangan: N = 3. Angka yang ditandai dengan huruf yang sama dinyatakan tidak berbeda nyata pada taraf nyata 5%.
KESIMPULAN Dari tanah di sekitar umbi dahlia dapat diisolasi jamur penghasil enzim inulinase yaitu F. solani dan Mucor sp. F.solani mampu tumbuh lebih baik pada medium yang mengandung inulin dibanding Mucor sp. dengan pertambahan berat kering rata-rata masing-masing 18 mg/hari dan 3,33 mg/hari. Waktu inkubasi optimum F. solani adalah 5 hari. Aktivitas inulinase F. solani lebih tinggi daripada Mucor sp pada taraf nyata 5%. Suhu optimum untuk aktivitas inulinase F. solani adalah 30oC sedang pH optimumnya 3,5. DAFTAR PUSTAKA
0 .7
Aktivitas (unit/ml)
5
0 .6 0 .5 0 .4 0 .3 0 .2 0 .1 0 2 .5
3
3 .5
4
4 .5
5
5 .5
pH
Gambar 8. Pengaruh pH terhadap aktivitas inulinase pada suhu 30oC.
Aktivitas inulinase yang cukup besar terjadi pada pH 3,5-4,5. Pada kisaran pH yang jauh dari pH optimum aktivitas inulinase kecil. Menurut Whitaker (1972) pH untuk aktivitas enzim berada pada range yang sempit . Perubahan pH menurut Wiseman (1985) merubah konformasi enzim, gugus pada posisi aktif maupun pengikatan enzim substrat. Hal ini disebabkan enzim mempunyai gugus yang mudah mengion disebut gugus prototropik, yang berada pada rantai samping asam amino. Scope (1987) menyatakan bahwa denaturasi karena pH disebabkan oleh pH yang jauh dari kisaran normal yang karena semakin banyaknya gugus prototropik yang bermuatan sejenis menyebabkan gaya tolak molekul protein besar dan terbukannya lipatan molekul protein sehingga katalitiknya hilang.
Allais, J.J., S. Kammoun, P. Blanc, C. Girard, and J.C. Baratti. 1986. Isolation and characterization of bacterial strains with inulinase activity. Journal of Applied and Environmental Microbiology 52 (5): 1086-1090. Allais, J.J., G. Hoyas-Lopez, S. Kammoun, and J.C. Baratti. 1987. Isolation and characterization of thermophilic bacterial strains with inulinase activity. Journal of Applied and Environmental Microbiology 53 (5): 942-945. Copeland, R.A. 1996. Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism, and Data Analysis. New York: Wiley. Lutony, T.L. 1993. Tanaman Sumber Pemanis. Jakarta: Penebar Swadaya. Nakamura, T. and S. Hoashi. 1969. Studies on microbial inulinase cultur condition for inulinase production by Penicillium. Nippon Nogeikagaku Koashi 43: 599. Rouwenhorst, R.J., L.E. Viseer, A.A. van der Baan, W.A. Sceffer, and P van Dijkken. 1988. Production, distribution, and kinetic properties of inulinase in continous culture of Kluiferomyces marxianus CBS 6556. Applied Environmental Microbiology 54 (5): 1131-1137. Samson, R.A., E.S. Hoekstra, and C.A.N. van Oorscot. 1984. Introduction to Food-Borne Fungi. Leiden: Centraalbureau Voor Schimmel Cultuters, BAARN, Netherland. Scope, R.K. 1987. Protein Purification and Practice. 2nd ed. New York: Springer Verlag Inc. Sudarmanto, Suhardi, dan U. Santoso. 1992. Petunjuk Laboratorium Analisis Karbohidrat. Yogyakarta: PAU Pangan dan Gizi UGM. Vandamme, E.J. and D.G. Deryke. 1983. Microbial inulinases fermentation process: properties and aplication. Advanced Applied Microbiology 29: 139-176. Wiseman, A. 1985. Hand Book of Enzime Bioteknology. 2nd ed. New York: Ellis Harwood Limited, John Willey and Son Inc. Xiao, R., M. Tanida, and S. Takao. 1988a. Inulinase from Chrisosporium pannorum. Journal of Fermentation Technology 66 (5): 553-558. Xiao, R., M. Tanida, and S. Takao. 1988b. Purification and some properties of endoinulinase from Chrysosporium pannorum. Journal of Fermentation and Bioengineering 64 (4): 244-248.
