AKTIVITAS ENZIM SELULASE ISOLAT ASAL INDONESIA PADA BERBAGAI SUBSTRAT LIMBAH PERTANIAN
BESTY MARANATHA
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2008
ABSTRAK BESTY MARANATHA. Aktivitas Enzim Selulase Isolat Asal Indonesia pada Berbagai Substrat Limbah Pertanian. Dibimbing oleh ANJA MERYANDINI dan TITI CANDRA SUNARTI. Kemampuan kompleks enzim selulase dari bakteri selulolitik dalam mendegradasi substrat selulosa sangat beragam. Di alam bakteri selulolitik menghadapi polimer-polimer yang tidak berupa selulosa saja namun juga hemiselulosa dan lignin. Penelitian ini menguji kemampuan enzim selulase bakteri Gram positif isolat C4-4, C11-1, C5-1, C5-3 dan kelompok aktinomiset isolat KBM-2 dan KBM- 4 pada substrat limbah pertanian seperti jerami padi, tongkol jagung dan kulit pisang. Pengukuran aktivitas enzim selulase ekstrak kasar dilakukan pada hari optimum produksi enzim selulase tiap isolat dengan modifikasi metode Miller (1959) pada substrat selulosa murni seperti CMC (Carboxymethyl cellulose) Sigma dan CMC Daisel, Avicel dan Kertas saring Whatman No. 1 serta substrat selulosa kompleks seperti jerami padi, tongkol jagung dan kulit pisang. Isolat C11-1 dan KBM-2 memiliki aktivitas enzim selulase yang relatif tinggi dibandingkan isolat lain pada substrat selulosa CMC Sigma, Avicel dan Kertas saring Whatman no. 1. Hal ini menggambarkan enzim ekstrak kasarnya mengandung endo-1,4-β-glukanase dan ekso-1,4-β-glukanase. Kemampuan enzim selulase isolat C11-1 dan KBM-2 dalam mendegradasi substrat limbah pertanian juga tinggi. Isolat C11-1 memiliki aktivitas enzim selulase tertinggi pada substrat jerami padi sebesar 179 x 10-3 nkat/ml, sedangkan KBM-2 memiliki aktivitas enzim selulase tertinggi pada substrat kulit pisang sebesar 118 x 10-3 nkat/ml. Isolat C4-4 memiliki aktivitas selulase tertinggi pada substrat kulit pisang sebesar 180 x 10-3 nkat/ml. Isolat C5-1 dan C5-3 memiliki aktivitas enzim selulase yang relatif kecil pada substrat CMC, Avicel dan kertas saring sehingga kemampuan enzim selulase isolat tersebut juga relatif kecil dalam mendegradasi substrat limbah pertanian. Namun isolat C5-1 dan C5-3 berturut-turut memiliki aktivitas yang tinggi pada substrat kulit pisang yaitu 262 x 10-3 nkat/ml dan 210 x 10-3 nkat/ml. ABSTRACT BESTY MARANATHA. The Cellulose Activities of Isolates from Indonesia on Agricultural Waste. Under the direction of ANJA MERYANDINI and TITI CANDRA SUNARTI. The abilities of cellulose enzymes of cellulolytic bacteria to degrade cellulose substrates vary. In nature, cellulolytic bacteria face a huge polymer not only cellulose but also hemicelluloses and lignin. The objective of this research was to investigate the ability of cellulase enzymes of Gram positive bacteria isolates of C4-4, C11-1, C5-1, C5-3 and actinomycetes isolates of KBM-2 and KBM-4 to degrade agriculture waste such as rice straw, corn cob and banana peel. The determination of cellulase activity was conducted at the highest production time, using crude enzymes with the modification of Miller methods (1959) on pure cellulose substrates such as CMC (Carboxymethyl cellulose) Sigma and CMC Daisel, Avicel and Filter paper Whatman No. 1, as well as complex cellulose substrates such as rice straw, corn cob and banana peel. Isolates of C11-1 and KBM-2 have higher cellulase activity than others in degrading CMC Sigma, Avicel, and Filter paper. These show that they have endo-1,4-β-glucanase and exo1,4-β-glucanase in its crude enzymes. The ability of cellulase enzymes isolates C11-1 and KBM-2 are also high in degrading substrates of agriculture waste. Isolate C11-1 has the highest cellulase enzyme activity on rice straw substrate of 179 x 10-3 nkat/ml, however, isolate KBM-2 has the highest cellulose enzyme activity on banana peel substrates of 118 x 10-3 nkat/ml. Isolate C4-4 has the highest cellulose enzyme activity on banana peel substrates of 180 x 10-3 nkat/ml. Isolates of C5-1 and C5-3 have relatively low cellulase activities in CMC Sigma, Avicel, and Filter paper as they have also small enzymes activities in degrading substrates of agriculture waste. However, isolates of C5-1 and C5-3 have high cellulose enzymes activities on banana peel substrates of 262 x 10-3 nkat/ml and 210 x 10-3 nkat/ml, respectively.
AKTIVITAS ENZIM SELULASE ISOLAT ASAL INDONESIA PADA BERBAGAI SUBSTRAT LIMBAH PERTANIAN
BESTY MARANATHA
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2008
Judul Skripsi Nama NIM
: Aktivitas Enzim Selulase Isolat Asal Indonesia pada Berbagai Substrat Limbah Pertanian : Besty Maranatha : G34103032
Menyetujui
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Titi Candra Sunarti, M.Si NIP. 131 956 683
Dr. Anja Meryandini, MS NIP. 131 663 016
Mengetahui Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
Dr. Drh. Hasim, DEA NIP. 131 578 806
Tanggal Lulus :
PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Kuasa atas segala anugrah dan kasihNya sehingga penulis berhasil menyelesaikan laporan skripsi ini. Penelitian yang dilaksanakan pada bulan Februari hingga Oktober 2007 ini berjudul Aktivitas Enzim Selulase Isolat Asal Indonesia pada Berbagai Substrat Limbah Pertanian di Laboratorium Mikrobiologi FMIPA IPB dan Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis PPSHB LPPM IPB. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Anja Meryandini, MS dan Dr. Ir. Titi Candra Sunarti, M.Si yang telah memberikan dana, ilmu, saran serta solusi selama penelitian. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr. Nisa Rachmania Mubarik M.Si sebagai Kepala Bagian Mikrobiologi Departemen Biologi FMIPA IPB dan kepada Dr. Suharsono sebagai Kepala Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi Lembaga Penelitian dan Pemberdayaan Masyarakat Institut Pertanian Bogor serta kepada Dr. Ir. Lisdar A. Manaf sebagai Wakil Komisi Pendidikan yang menguji dan turut menyempurnakan skripsi ini. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada staf Laboratorium Mikrobiologi FMIPA IPB dan Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis PPSHB LPPM IPB; Mbak Heni, Mbak Dewi, Pak Mulya. Kepada temanteman yang terus memberikan semangat dan inspirasi kepada penulis; Mbak Niken, Mas Hasrul, Bu It, Wahyu, Tri, Mega, Ocha dan Junika. Terima kasih kepada orang tua dan seluruh keluarga penulis atas doa, kasih sayang dan nasihat selama ini. Penulis berharap skripsi ini dapat bermanfaat.
Bogor, Desember 2007
Besty Maranatha
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 12 Mei 1985. Penulis merupakan anak pertama dari empat bersaudara dari Bapak Robiden Panjaitan dan Ibu Aslina Hutauruk. Tahun 2003 penulis lulus dari SMU 89 Jakarta Timur dan pada tahun yang sama penulis diterima di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI. Selama mengikuti kuliah penulis pernah menjadi asisten dosen untuk praktikum mata ajaran Mikrobiologi Dasar (tahun ajaran 2005/2006) dan Fisiologi Prokariot (tahun ajaran 2007/2008). Penulis melaksanakan tugas praktik lapangan selama satu bulan di Laboratorium Rumah Sakit Karya Bhakti Bogor. Penulis juga aktif dalam kegiatan organisasi PMK (Persekutuan Mahasiswa Kristen) IPB.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL...........................................................................................................................i DAFTAR GAMBAR ......................................................................................................................i DAFTAR LAMPIRAN...................................................................................................................i PENDAHULUAN ......................................................................................................................... 1 Latar Belakang................................................................................................................. 1 Tujuan.............................................................................................................................. 1 BAHAN DAN METODE .............................................................................................................. 1 Tempat dan Waktu Penelitian.......................................................................................... 1 Bahan dan Alat ................................................................................................................ 1 Metode Penelitian ............................................................................................................ 1 Penetapan Waktu Optimum Produksi Enzim Selulase............................................... 1 Pembuatan kurva Pertumbuhan ......................................................................... 2 Aktivitas Harian Enzim Selulase....................................................................... 2 Pengukuran Aktivitas Enzim Selulase pada Berbagai Substrat.................................. 2 Produksi Enzim Ekstrak Kasar .......................................................................... 2 Persiapan Substrat ............................................................................................. 2 Uji Aktivitas Enzim pada Berbagai Subtrat....................................................... 2 HASIL PENELITIAN.................................................................................................................... 3 PEMBAHASAN ........................................................................................................................... 5 SIMPULAN……. .......................................................................................................................... 6 SARAN.......................................................................................................................................... 6 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................................... 7 LAMPIRAN................................................................................................................................... 8
DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1 Karakterisasi suhu dan pH optimum aktivitas selulase ..................................................... 3 Tabel 2 Nilai aktivitas enzim selulase tiap isolat terhadap berbagai substrat................................. 4
DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1 Kurva pertumbuhan dan aktivitas harian enzim selulase isolat C4-4 ............................ 3 Gambar 2 Kurva pertumbuhan dan aktivitas harian enzim selulase isolat C11-1 .......................... 3 Gambar 3 Kurva pertumbuhan dan aktivitas harian enzim selulase isolat C5-1 ............................ 3 Gambar 4 Kurva pertumbuhan dan aktivitas harian enzim selulase isolat C5-3 ............................ 4 Gambar 5 Aktivitas harian enzim selulase isolat KBM-2 .............................................................. 4 Gambar 6 Aktivitas harian enzim selulase isolat KBM-4 .............................................................. 4
DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1 Komposisi Bahan-Bahan yang Digunakan ................................................................. 9 Lampiran 2 Kurva Standar Glukosa............................................................................................. 10 Lampiran 3 Metode Kerja Pengukuran Aktivitas Enzim Selulase pada Berbagai Substrat ......... 11
1
PENDAHULUAN Latar belakang Enzim merupakan biokatalisator yang mampu mempercepat reaksi biokimia yang terjadi di dalam sel maupun di luar sel (Poedjiadi 1994). Penggunaan enzim dalam mendegradasi polimer di bidang industri maupun pertanian telah banyak dilakukan untuk efisiensi biaya produksi. Salah satu enzim yang digunakan untuk mendegradasi polimer karbohidrat adalah enzim selulase. Enzim selulase sangat diandalkan dalam degradasi bahan berserat selulosa dan banyak digunakan pada industri detergent, makanan ternak, tekstil, dan pabrik kertas (Kirk 2002). Sektor pertanian Indonesia yang terus berkembang membutuhkan solusi dalam penanganan limbah pertaniannya. Jerami, tongkol jagung dan kulit pisang merupakan limbah pertanian yang mengandung serat terutama selulosa, yang penanganannya masih dengan cara dibakar. Dengan bantuan enzim selulase, limbah pertanian tersebut dapat dimanfaatkan kembali sebagai pakan ternak ataupun kompos. Enzim selulase merupakan sistem enzim yang terdiri atas endo-1,4-β-glukanase, ekso-1,4-β-glukanase, dan β-D-glukosidase. Endo-1,4-β-glukanase memotong ikatan rantai dalam selulosa menghasilkan molekul selulosa yang lebih pendek, ekso-1,4-βglukanase memotong ujung rantai selulosa menghasilkan molekul selobiosa, sedangkan β-D-glukosidase memotong molekul selobiosa menjadi dua molekul glukosa (Kim 1995). Setiap mikroorganisme selulolitik memiliki komposisi enzim selulase yang berbeda-beda, sehingga penelitian mengenai kemampuan selulolitik isolat baru perlu dilakukan. Mikroorganisme selulolitik dari kelompok bakteri memiliki tingkat pertumbuhan yang cepat sehingga waktu yang dibutuhkan untuk produksi enzim menjadi lebih pendek. Selain itu, tingkat variasi genetik kelompok bakteri sangat beragam sehingga memungkinkan dilakukan rekayasa genetika untuk optimasi produksi maupun aktivitas enzim selulasenya (Alam et al 2004). Penelitian ini menggunakan bakteri selulolitik yang telah berhasil diisolasi dalam penelitian pendahuluan. Isolat tersebut mampu mendegradasi selulosa pada suhu 50 ºC dan dalam media agar-agar CMC
Sigma (Carboxymethyl membentuk zona bening.
cellulose)
Tujuan Tujuan penelitian ini adalah menguji aktivitas enzim selulase dari empat isolat bakteri selulolitik yang mampu tumbuh pada suhu 50 °C dan dua isolat aktinomiset pada substrat selulosa sintetik seperti CMC, avicel dan kertas saring serta substrat limbah pertanian berupa jerami padi, tongkol jagung, dan kulit pisang.
BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi FMIPA IPB dan Laboratorium Bioteknologi Hewan PPSHB PPM IPB pada bulan Februari-Oktober 2007. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah bakteri Gram positif isolat C11-1 berasal dari pengomposan kulit pisang di Kec. Cikalong Kulon, isolat C4-4, C5-1, C5-3 yang berasal dari kompos pisang di Kec. Panyingkiran dan aktinomiset isolat KBM-2 dan KBM-4 berasal dari tanah sawah di Kab. Kebumen yang merupakan koleksi Dr. Anja Meryandini. Substrat yang digunakan adalah CMC (Carboxymethyl cellulose) dari Sigma, CMC Daisel, Avicel, kertas saring Whatman no.1 berukuran 1 x 6 cm2, kulit pisang (Kepok mentah), tongkol jagung dan jerami padi. Pereaksi yang digunakan antara lain DNS (Asam Dinitrosalisilat), 0.2 M bufer fosfat pH 7, 0.2 M bufer sitrat pH 5 dan 3.5 dan 0.2 M tris HCl pH 8. Alat yang digunakan adalah inkubator bergoyang, vorteks, penangas, pH meter, sentrifus, pipet mikro, spektrofotometer, saringan berpori 65 mesh. Metode Penelitian Penelitian ini terdiri atas 2 tahap. Tahap pertama adalah penetapan waktu optimum aktivitas enzim selulase tiap isolat. Tahap kedua adalah pengukuran aktivitas enzim selulase pada berbagai substrat berdasarkan data pada tahap pertama. Penetapan Waktu Optimum Produksi Enzim Selulase Tahap pertama penelitian ini mengkaji hubungan kurva pertumbuhan bakteri
2
dengan kurva aktivitas harian enzim selulasenya. Pembuatan Kurva Pertumbuhan. Peremajaan isolat dilakukan pada media agar miring CMC Sigma 1% (b/v) pada suhu ruang hingga berumur 24 jam dan disimpan pada refrigerator pada suhu 4 ºC. Masingmasing sebanyak satu lup isolat berumur 24 jam diinokulasikan ke dalam 100 ml media cair CMC Sigma 1% (b/v) pada Erlenmeyer 500 ml yang juga mengandung glukosa 0.1% (b/v) dan ekstrak khamir 0.2% (b/v) (Lampiran 1). Kultur diinkubasi pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 120 rpm pada 29 ºC. Setiap 24 jam densitas kultur sel diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm. Nilai absorbansi tersebut dikorelasikan dengan kurva standar sel. Penetapan kurva standar sel dilakukan pada hari ke-2 atau ke-3 yaitu pada saat sel mencapai fase eksponensial. Aktivitas Harian Enzim Selulase. Sebanyak 1 lup isolat C4-4, C11-1, C5-1, C5-3 yang berumur 24 jam dan sebanyak 5 potong koloni isolat KBM-2 dan KBM-4 yang berdiameter 1 cm berumur 4 hari masing-masing diinokulasi ke dalam media cair CMC Sigma 1% (b/v) pada Erlenmeyer 500 ml. Enzim ektrak kasar didapatkan dengan mensentrifugasi kultur sel pada 8400 g, suhu 4 °C selama 15 menit. Pengukuran aktivitas enzim selulase dilakukan dengan modifikasi metode Miller (1959) dengan menggunakan enzim ekstrak kasar dan glukosa sebagai standar pada konsentrasi 0.02 mg/ml – 0.2 mg/ml (Lampiran 2). Aktivitas enzim selulase diuji terhadap substrat CMC Sigma 1 % (b/v) yang dilarutkan dalam bufer fosfat pH 7 pada suhu 50 ºC selama 60 menit. Oleh karena proses pengomposan dapat mencapai suhu 50 ºC maka aktivitas enzim selulase bakteri selulolitik yang digunakan dalam penelitian ini dilakukan pada suhu 50 ºC. Sampel merupakan reaksi substrat dan enzim yang diinkubasi pada suhu 50 ºC kemudian dicampur dengan DNS, kontrol merupakan campuran antara substrat dan enzim tanpa diinkubasi pada suhu 50 ºC yang kemudian dicampur DNS, blanko merupakan campuran antara substrat, DNS dan akuades. Perhitungan aktivitas enzim selulase dinyatakan dengan nkat/ml, yang diacu berdasarkan Dybkaer (2001). Satu unit aktivitas enzim selulase adalah jumlah enzim yang dibutuhkan untuk melepas 1
µmol gula pereduksi per menit dan satu unit aktivitas enzim setara dengan 16.67 nkat/ml. Aktivitas enzim selulase dinyatakan dengan rumus di bawah ini: nkat/ml =
(Xs – Xk ) x 1000 x fp
x 16.67
BM glukosa x t Keterangan : : Kadar gula sampel (mg/ml) Xs : Kadar gula kontrol (mg/ml) Xk t : Waktu inkubasi (menit) fp : Faktor pengenceran Pengukuran aktivitas enzim selulase pada berbagai substrat Produksi Enzim Ekstrak Kasar. Isolat ditumbuhkan terlebih dahulu pada media cair CMC Sigma 1 % (b/v) di Erlenmeyer 500 ml pada suhu 29 ºC dan digoyang pada 120 rpm selama waktu optimum panennya berdasarkan data pengamatan pada tahap pertama. Setelah waktu yang ditetapkan, kultur sel disentrifugasi pada 8400 g, suhu 4 °C selama 15 menit untuk memisahkan biomassa. Supernatan merupakan enzim ekstrak kasar. Persiapan Substrat. Jerami padi, tongkol jagung dan kulit pisang dikeringkan terlebih dahulu pada suhu 70 °C dalam oven selama 3 hari. Kemudian masing-masing substrat dihaluskan menggunakan alat blender dan diayak dengan saringan 65 mesh. Substrat disterilisasi untuk mencegah kontaminasi. Uji Aktivitas Enzim pada Berbagai Substrat. Sebanyak 5 ml substrat CMC Sigma, CMC Daisel dan avicel ditambahkan 5 ml enzim ekstrak kasar. Untuk substrat Kertas saring, sebanyak 2.5 potong Kertas saring 1 x 6 cm2 ditambahkan 2.5 ml bufer dan 5 ml enzim ekstrak kasar. Sebanyak 0.05 g substrat jerami padi, tongkol jagung dan kulit pisang ditambahkan 5 ml bufer dan 5 ml enzim ekstrak kasar. Reaksi antara substrat dan enzim ekstrak kasar dilakukan di dalam Erlenmeyer 100 ml selama 60 menit pada suhu optimum. Setelah itu reaksi dihentikan dengan menambahkan 50 μl NaOH 0.2 M atau dengan menginkubasinya pada suhu 100 °C. Untuk substrat CMC Sigma dan Daisel, campuran substrat-enzim dipindahkan sebanyak 2 ml ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 2 ml DNS dan segera diinkubasi pada suhu 100 °C. Sebanyak 1 lembar kertas saring 1 x 6 cm2 dan 3 ml larutannya (enzim ekstrak kasar
3
HASIL PENELITIAN Hubungan antara kurva pertumbuhan dan kurva aktivitas harian enzim selulase Kurva pertumbuhan isolat C4-4, C11-1, C5-1, C5-3 disajikan bersama dengan kurva aktivitas harian enzim selulasenya pada Gambar 1-4.
0.8
7.5
0.6 7.0 0.4
Log sel
Aktivitas selulase
8.0
6.5
0.2 0.0
6.0 0
1
2
3
4
5
6
Waktu (hari) aktivitas selulase (nkat/ml) kurva pertumbuhan (log sel)
Gambar 1 Kurva pertumbuhan dan aktivitas harian enzim selulase isolat C4-4. Aktivitas enzim selulase diuji terhadap substrat CMC (Sigma) pada suhu 50 ºC, pH 7 (bufer fosfat 0.2 M). 7.0
0.8
6.5
0.6 6.0 0.4
Log Sel
Aktivitas selulase
1.0
5.5
0.2 0.0
5.0 0
1
2
3
4
5
6
7
Waktu (hari) aktivitas selulase (nkat/ml) kurva pertumbuhan (log sel)
Gambar 2 Kurva pertumbuhan dan aktivitas harian enzim selulase isolat C11-1. Aktivitas enzim selulase diuji terhadap substrat CMC (Sigma) pada suhu 50 ºC, pH 7 (bufer fosfat 0.2 M).
Puncak aktivitas dan waktu optimum untuk produksi enzim selulase isolat C4-4 adalah hari ke-2 (Gambar 1), dan hari ke-3 untuk isolat C11-1 (Gambar 2). 1.0
7.0
0.8
6.8
0.6
6.6
0.4
6.4
0.2
6.2
0.0
Log sel
Tabel 1 Karakterisasi suhu dan pH optimum aktivitas selulase pada substrat CMC Sigma (Sari 2007) Nama Suhu pH optimum Isolat optimum C4-4 70 ºC 5.0 (bufer sitrat) C5-3 80 ºC 5.0 (bufer sitrat) C5-1 90 ºC 3.5 (bufer sitrat) C11-1 70 ºC 8.0 (tris HCl) KBM-2 50 ºC 7.0 (bufer fosfat) KBM-4 50 ºC 7.0 (bufer fosfat)
1.0
Aktivitas selulase
dan bufer) dipindahkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 2 ml DNS kemudian segera diinkubasi pada suhu 100 °C. Setelah inkubasi campuran substrat avicel, jerami padi, tongkol jagung dan kulit pisang dengan enzim selesai segera ditambahkan 50 μl NaOH 0.2 M. Lalu suspensi tersebut disentrifus pada kecepatan 2500 rpm selama 25 menit. Sebanyak 2 ml supernatannya diambil dan ditambahkan 2 ml DNS lalu diinkubasi pada suhu 100 °C. Seluruh sampel diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Perlakuan pada substrat CMC Sigma dan Daisel, avicel, kertas saring, dan substrat limbah pertanian berbeda karena tidak semua substrat tersebut larut dalam bufer. Konsentrasi substrat tiap Erlenmeyer adalah 1% (b/v) kecuali avicel 2% (b/v). Suhu inkubasi substrat-enzim serta pH larutan bufer disesuaikan dengan jenis isolat yang digunakan. Hal tersebut dapat diketahui dari penelitian sebelumnya yang telah mengkarakterisasi suhu dan pH optimum aktivitas enzim selulase setiap isolat (Tabel 1). Uji aktivitas enzim selulase pada berbagai substrat setiap isolat dilakukan secara duplo dan dua ulangan dengan menggunakan metode Miller (1959) yang telah dimodifikasi (Lampiran 3).
6.0 0
1
2 3 4 5 6 7 Waktu (hari) aktivitas selulase (nkat/ml) kurva pertumbuhan (log sel)
Gambar 3 Kurva pertumbuhan dan aktivitas harian enzim selulase isolat C5-1. Aktivitas enzim selulase diuji terhadap substrat CMC (Sigma) pada suhu 50 ºC, pH 7 (bufer fosfat 0.2 M).
4
7.0
0.04
6.8
0.03
6.6
0.02
6.4
0.01
6.2
0.00 1
2 3 4 Waktu (hari)
5
0.4 0.2
1
2
3
4
5
6
7
Waktu (hari) Aktivitas selulase (nkat/ml)
Gambar 6 Aktivitas harian enzim selulase isolat KBM4. Aktivitas enzim selulase diuji terhadap substrat CMC (Sigma) pada suhu 50 ºC, pH 7 (bufer fosfat 0.2 M).
Waktu optimum isolat KBM-2 dan KBM-4 untuk produksi enzim selulase adalah hari ke-4 (Gambar 5 dan 6).
Kurva pertumbuhan dan aktivitas harian enzim selulase isolat C5-3,. Aktivitas enzim selulase diuji terhadap substrat CMC (Sigma) pada suhu 50 ºC, pH 7 (bufer fosfat 0.2 M).
1.0 Aktivitas selulase
0.6
0
aktivitas selulase(nkat/ml) kurva pertumbuhan (log sel)
Gambar 4
0.8
0.0
6.0 0
1.0 Aktivitas selulase
0.05
Log sel
Aktivitas selulase
Puncak aktivitas dan waktu optimum untuk produksi enzim selulase isolat C5-1 adalah hari ke-3 (Gambar 3) dan hari ke-2 untuk isolat C5-3 (Gambar 4). Kurva pertumbuhan isolat C5-3 mengalami penurunan jumlah sel setelah inkubasi 24 jam.
Aktivitas enzim berbagai substrat
selulase
pada
Hasil uji aktivitas enzim selulase menunjukkan tidak semua isolat memiliki enzim ekstrak kasar yang mampu mendegradasi substrat limbah pertanian (Tabel 2).
0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0
1
2
3
4
5
6
7
Waktu (hari) aktivitas selulase (nkat/ml)
Gambar 5 Aktivitas harian enzim selulase isolat KBM2. Aktivitas enzim selulase diuji terhadap substrat CMC (Sigma) pada suhu 50 ºC, pH 7 (bufer fosfat 0.2 M).
Tabel 2 Nilai aktivitas enzim selulase tiap isolat terhadap berbagai substrat No 1 2 3 4 5 6
Isolat C4-4 C5-1 C5-3 C11-1 KBM-2 KBM-4
CMC Sigma 112 42 20 193 483 479
CMC Daisel 95 28 20 267 529 566
Aktivitas Enzim (nkat/ml) x 10-3 Avicel Kertas Jerami Tongkol Saring padi Jagung 31 74 88 81 8 0 94 80 0 70 90 40 17 82 128 179 75 73 107 112 71 192 90 99
Kulit pisang 180 262 210 147 118 16
5
PEMBAHASAN Hubungan Kurva Tumbuh dan Produksi Enzim Selulase Setiap bakteri selulolitik menghasilkan kompleks enzim selulase yang berbedabeda, tergantung dari gen yang dimiliki dan sumber karbon yang digunakan. Dalam penelitian ini, semua isolat tumbuh pada media cair CMC Sigma yang mengandung CMC Sigma 1% (b/v) sebagai komponen indusernya. Glukosa 0.1% (b/v) dan ekstrak khamir 0.2% (b/v) juga ditambahkan pada media sebagai pemacu tumbuh sel di fase awal (White 1995). Setelah glukosa pada medium tumbuhnya habis maka bakteri akan memanfaatkan sumber karbon selulosa dengan mensintesis enzim selulase. Pada Gambar 1, 2, 3 terlihat bahwa aktivitas enzim selulase meningkat seiring dengan pertumbuhan selnya. Namun ketika sel mencapai fase stasioner, aktivitas enzim selulase menurun. Pada fase stasioner kecepatan pembelahan sel sama dengan kecepatan kematian sel dan lisis sel sehingga pada fase ini selain enzim selulase, enzim protease juga dihasilkan (Martina et al. 2002). Hal ini menyebabkan turunnya aktivitas enzim selulase. Turunnya jumlah sel pada isolat C5-3 disertai dengan munculnya komponen mengapung berwarna putih pada kaldu kultur isolat ini pada hari ke-2 inkubasi. Partikel ini bukanlah kontaminan karena tidak terdapat koloni berbeda pada goresan kuadrannya. Namun komponen tersebut tidak diidentifikasi lebih lanjut. Pada saat puncak aktivitas enzim selulase, bakteri mengeluarkan enzim selulase secara maksimal ke lingkungan luarnya. Namun terjadi feed back inhibition sehingga dapat menghambat aktivitas pada enzim selulase. Molekul glukosa sebagai produk akhir dari enzim selulase menempel pada sisi alosterik enzim sehingga sisi aktif enzim selulase tidak dapat lagi ditempati oleh substrat selulosa. Selain itu terjadi represi sintesis enzim selulosa oleh karena kehadiran glukosa yang berlimpah. Glukosa merupakan sumber karbon sederhana yang dapat merepresi sintesis enzim selulase (Abalos et al. 1997). Karena masing-masing isolat memiliki waktu optimum untuk produksi enzim yang berbeda, maka untuk mendegradasi substrat limbah pertanian seperti jerami padi, tongkol jagung dan kulit pisang digunakan enzim ekstrak kasar yang
diproduksi pada waktu puncak aktivitas enzim selulase tiap isolat. Aktivitas Enzim Selulase pada Substrat Selulosa Murni Pada pH dan suhu optimumnya, tiap isolat memiliki aktivitas optimum enzim selulase pada substrat yang berbeda. Hal ini menunjukkan tiap isolat memiliki kompleks enzim selulase yang berbeda. Isolat, C5-1, C11-1, C4-4, KBM2 dan KBM-4 memiliki aktivitas selulase optimum pada substrat CMC Sigma berturutturut sebesar 0.042 nkat/ml, 0.267 nkat/ml, 0.112 nkat/ml, 0.483 nkat/ml dan 0.566 nkat/ml. Hal ini menggambarkan bahwa isolat C11-1, C5-1, C4-4, KBM-2 dan KBM-4 memiliki sejumlah besar endo-1,4-β-glukanase. Substrat CMC Sigma (Carboxymethyl cellulose) merupakan substrat selulosa murni yang berbentuk amorphous sehingga aktivitas enzim selulase pada substrat CMC Sigma merupakan aktivitas enzim endo-1,4-β-glukanase (Lynd et al. 2002). Endo-1,4-β-glukanase bekerja pada rantai dalam CMC Sigma menghasilkan oligosakarida atau rantai selulosa yang lebih pendek. Di antara keempat isolat tersebut, KBM-2 memiliki aktivitas enzim selulase yang paling tinggi terhadap substrat CMC Sigma. Aktivitas enzim selulase pada substrat Avicel yaitu substrat selulosa yang berbentuk kristalin (Kim H 1995), menunjukkan adanya aktivitas enzim ekso-1,4-β-glukanase, yang memotong ujung rantai oligo-sakarida menjadi selobiosa, yaitu dua molekul glukosa yang berikatan secara β1,4-glikosidik. Semua isolat yang digunakan pada penelitian ini memiliki aktivitas enzim selulase pada substrat Avicel yang relatif rendah. Isolat C4-4, C11-1, C5-3, KBM-2 dan KBM-4 memiliki aktivitas enzim selulase pada substrat kertas saring, yaitu selulosa sintetik campuran antara selulosa amorphous dan kristalin. Hal ini menunjukkan isolat tersebut memiliki sinergisme antara enzim endo-1,4-βglukanase dan ekso-1,4-β-glukanase. Dalam mendegradasi selulosa menjadi glukosa, enzim endo-1,4-β-glukanase, ekso-1,4-β-glukanase, dan β-glukosidase bekerja secara sinergis (Lynd et al. 2002). Setelah enzim endo-1,4-βglukanase memotong bagian amorphous, ekso1,4-β-glukanase memotong bagian ujung rantai selulosa kristalin menjadi gula pereduksi. Kemudian gula pereduksi tersebut diikat oleh larutan DNS (asam dinitrosalisilat) yang menghasilkan warna jingga. Semakin besar jumlah gula pereduksi yang dihasilkan semakin pekat warna pereaksinya. Tidak ditemukannya aktivitas enzim selulase isolat C5-1 pada
6
substrat kertas saring kemungkinan karena sangat kecilnya aktivitas enzim ekso- 1,4-βglukanase pada isolat tersebut. Aktivitas Enzim Selulase pada Substrat Limbah Pertanian Substrat jerami padi, tongkol jagung dan kulit pisang merupakan substrat selulosa yang tidak murni. Menurut Davendra (1982) yang diacu dalam Husnadjat (1998), jerami padi terdiri atas 33% selulosa, 26 % hemiselulosa, 7% lignin serta 13% silika. Komposisi serat tongkol jagung adalah 23.74% lignin, 65.96% selulosa, dan 10.82% hemiselulosa (Pratiwi 2006). Robetson (1993) menganalisis komposisi kulit pisang mentah berdasarkan analisis dinding sel (% Berat kering) yaitu: 37.52 % hemiselulosa, 12.06 % selulosa, 7.04 % lignin dan 0.36 % silika. Selulosa terbungkus dan terikat secara ikatan kovalen maupun non-kovalen pada lignin dan hemiselulosa (Perez et al. 2002). Hemiselulosa maupun lignin akan mengganggu aktivitas enzim selulase yang hanya spesifik memotong ikatan β-1,4glikosidik pada selulosa. Oleh sebab itu untuk meningkatkan luas permukaan substrat maka jerami padi, tongkol jagung dan kulit pisang diperkecil ukurannya sampai 65 mesh. Pengocokan pada saat inkubasi substrat-enzim juga memperbesar kontak antara enzim selulase dan komponen selulosa sehingga dapat meningkatkan aktivitas enzim selulase. Isolat C11-1 dan KBM-2 relatif mampu mendegradasi jerami padi, tongkol jagung dan kulit pisang (Tabel 2). Isolat tersebut juga memiliki aktivitas yang tinggi pada selulosa murni (CMC Sigma, CMC Daisel dan Avicel). Hal ini menunjukkan bahwa isolat C11-1 dan KBM-2 memiliki enzim selulase yang potensial. Isolat C5-3, C5-1, C4-4 dan KBM-4 relatif kurang mampu mendegradasi jerami padi, tongkol jagung dan kulit pisang. Aktivitas selulase yang rendah pada substrat sintetik (CMC Sigma, CMC Daisel dan Avicel) dan limbah jerami padi, tongkol jagung dan kulit pisang menunjukkan bahwa isolat C5-1 dan C5-3 memiliki enzim selulase yang kurang potensial. Hal yang menghambat aktivitas selulase pada substrat jerami padi, tongkol jagung, dan kulit pisang adalah komponen lignin. Lignin membungkus dan mengikat selulosa secara fisik sehingga menghalangi enzim selulase bekerja maksimal pada substrat.
Sekalipun memiliki aktivitas selulase yang relatif kecil terhadap substrat jerami padi dan tongkol jagung, isolat C5-1, C4-4 dan C5-3 memiliki aktivitas yang tinggi terhadap limbah kulit pisang yaitu 0.262 nkat/ml, 0.180 nkat/ml dan 0.21 nkat/ml. Hal ini mungkin disebabkan oleh kadar lignin yang terdapat pada kulit pisang lebih sedikit daripada tongkol jagung. Kadar silika pada kulit pisang juga lebih sedikit dibandingkan pada jerami padi. Secara umum aktivitas enzim selulase tiap isolat lebih tinggi pada substrat limbah pertanian dibandingkan pada substrat selulosa murni. Kemungkinan hal ini disebabkan oleh adanya enzim hemiselulolitik pada enzim ekstrak kasar yang diproduksi oleh bakteri. Bakteri Clostridium cellulovorans mensintesis enzim hemiselulolitik (xylA) saat tumbuh pada substrat selulosa seperti selobiosa (Han et al. 2003). Han et al. (2003) juga menyatakan ekspresi enzim selulase berhubungan dengan ekspresi enzim hemiselulase. Kemungkinan hal ini juga dapat terjadi pada isolat yang digunakan pada penelitian ini.
SIMPULAN Aktivitas tertinggi enzim selulase isolat C5-1, C5-3, C4-4 dan KBM-2 terhadap substrat limbah pertanian adalah pada limbah kulit pisang yaitu berturut-turut sebesar 262 x 10-3 nkat/ml, 210 x 10-3 nkat/ml, 180 x 10-3 nkat/ml dan 118 x 10-3 nkat/ml. Isolat C11-1 dan KBM-4 memiliki aktivitas tertinggi berturutturut pada limbah jerami padi (179 x 10-3 nkat/ml) dan tongkol jagung (99 x 10-3 nkat/ml). Isolat C5-3 dan C5-1 relatif kurang mampu mendegradasi jerami padi dan tongkol jagung yaitu dengan aktivitas sebesar 90 x 10-3 nkat/ml dan 40 x 10-3 nkat/ml untuk C5-3 serta 94 x 10-3 nkat/ml dan 80 x 10-3 nkat/ml untuk C5-1.
SARAN Karena tingginya aktivitas enzim selulase isolat-isolat yang digunakan pada penelitian ini pada substrat limbah pertanian maka perlu dilakukan pengujian enzim ekstrak kasar dari isolat C4-4, C5-1, C5-3, C11-1, KBM-2 dan KBM-4 terhadap substrat xilan maupun lignin untuk melihat kemampuan enzim terhadap substrat tersebut.
7
DAFTAR PUSTAKA Abalos J. M. F., Arribas A. R., Garda A. L., Santamaria R. I. 1997. Effect of carbon source on the expression of celA1, a cellulase-encoding gene from Streptomyces halstedii JM8. FEMS Microbiol Letters 153: 97103. Alam M. Z., Manchur M. A., Anwar M. N. 2004. Isolation, purification, characterization of cellulolytic enzymes produced by the isolate Streptomyces omiyaensis. Pakist J Biol Sci 7(10): 1647-1653. Dybkaer R. 2001. Unit katal for catalytic activity. Pure Appl Chem 73: 927931. Husnadjat. 1998. Peningkatan daya cerna isolat bakteri selulolitik rumen kerbau pada dinding sel jerami pada dengan dipacu faktor pertumbuhan [skripsi].Bogor: Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Han S O., Yukawa H., Inui M., Doi R H. 2003. Regulation of expression of cellulosomal cellulase and hemicellulase genes in Clostridium cellulovorans. J Bacteriol 185(20): 6067-6075. Kim H. 1995. Characterization and substrate specivicity of an endo-β-1,4-Dglukanase I (Avicelase I) from an extracellular multienzyme complex of Bacillus circulans. Appl Environ Microbiol 61: 959-965. Kirk O. 2002. Industrial Enzyme Applications. Bagsvaerd, Denmark: Elsevier Science Ltd. Lynd L R., Weimer P. J., Zyl W. H., Pretorius I S. 2002. Microbial cellulose utilization: fundamental and biotechnology. Microbiol Molecul Bio Reviews 66: 506-577. Martina A., Yuli N., Sutisna M. 2002. Optimasi beberapa faktor fisik terhadap laju degradasi selulosa kayu albasia Paraserianthes falcataria (L) Nielsen dan karboksimetilselulosa (CMC) secara enzimatik oleh jamur. J Natur 4:156-163. Miller G L. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem 31: 426428. Perez J., Munoz-Dorado J, Rubia T., Martinez J. 2002. Biodegradation and biological treatment of cellulose,
hemicellulose and lignin: an over view. J Int Microbiol 5: 53-63. Poedjiadi A. 1994. Dasar-DasarBiokimia. Jakarta: UI Press. Pratiwi F M R. 2006. Produksi xilanase dari Streptomyces sp. pada substrat xilan tongkol jagung [skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Robetson E. 1993. Evaluasi nutrisi, korelasi vegetatif dan kemungkinan kulit pisang sebagai makanan ternak ruminansia menggunakan teknik in vitro dan in situ [Karya Ilmiah]. Bogor: Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Sari W. W. 2007. Karakterisasi selulase bakteri asal tanah pertanian Jawa Tengah dan Jawa Barat [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. White D. 1995. The Physiology and Biochemistry of Prokaryotes. New York: Oxford University Pres.
8
LAMPIRAN
9
Lampiran 1. Komposisi Bahan-bahan yang Digunakan a. Bufer Fosfat (pH 7.0, 0.2 M) Larutan bufer fosfat pH 7.0 terdiri dari 39 ml NaHPO4.H2O 0.2 M (27.8 g dalam 1000 ml akuades) dan 61 ml Na2HPO4.2H2O 0.2 M (35.6 g dalam 1000 ml akuades). Kemudian bufer disimpan di dalam botol steril pada suhu ruang. b. Bufer Sitrat (pH 3.5 dan pH 5.0, 0.2 M) Bufer sitrat terdiri asam sitrat 0.2 M (19.21 g/l akuades) dan larutan Na2HPO4.2H2O 0.2 M (35.6 g/l akuades). Larutan buffer pH 5 mengandung 24.3 ml asam sitrat dan 25.7 ml larutan Na2HPO4.2H2O. Sedangkan buffer pH 3.5 mengandung 35.9 ml asam sitrat dan 14.1 ml larutan Na2HPO4.2H2O. c. Bufer Tris HCl (pH 8 0.2 M) Larutan 0.2 M bufer tris HCl pH 8 mengandung larutan tris (larutan A) HCl 24.2 g/l akuades dan (larutan B) larutan 0.2 M HCl. Perbandingan larutan A dan B adalah 3:1. d. Pembuatan DNS Dinitrosalisilat terdiri atas 10 g NaOH padat, 182 g KNa Tartrat, 0.5 g Na2SO3, 10 g DNS dan dicampurkan dengan akuades steril, ditera sampai 1000 ml. e. Pembuatan Media CMC Sigma (Carboxymethyl cellulose) Media CMC Sigma mengandung 10 g carboxymethyl cellulose, 0.2 g MgSO4.7 H2O, 0.75 g KNO3, 0.5 g K2HPO4, 0.02 g FeSO4.7 H2O, 0.04 g CaCl2, 2 g ekstrak khamir, dan 1 g glukosa lalu dilarutkan dalam 1000 ml akuades.
10
Lampiran 2 Kurva Standar Glukosa
Kurva Standar Glukosa 0.5
Absorban
0.4 0.3 0.2
y = 2.1742x + 0.0115 2 R = 0.9887
0.1 0 0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
konsentrasi glukosa (mg/ml)
Konsentrasi glukosa (mg/ml) 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20
Absorban pada λ 540 nm 0.001 0.017 0.067 0.114 0.168 0.222 0.283 0.333 0.391 0.437
Contoh Perhitungan Aktivitas enzim selulase : Tanpa dilakukan pengenceran enzim Absorban terkoreksi sampel : 0.5 Absorban terkoreksi kontrol : 0.1 Maka kadar glukosa : Sampel : y = 2.1742x + 0.0115 0.5 = 2.1742x + 0.0115 X = 0.5 – 0.0115 2.1742 X = 1.062 mg/ml Kontrol : y = 2.1742x + 0.0115 0.1 = 2.1742x + 0.0115 X = 0.1 – 0.0115 2.1742 X = 0.192 mg/ml
Aktivitas Selulase : (1.062 – 0.192) x 1000 X 16.67 180 x 60 menit =
1.343
nkat/ml
11
Lampiran 3 Metode Kerja Pengukuran Aktivitas Enzim Selulase pada Berbagai Substrat 5 ml Substrat
CMC Sigma
CMC Daisel
Avicel
Sebanyak 2.5 potong Kertas Saring 1x 6 cm2 ditambah 2.5 ml bufer
Sebanyak 0.05 g substrat ditambahkan 5 ml bufer Jerami padi
Tongkol jagung
Kulit Pisang
Substrat dicampurkan dengan 5 ml enzim ekstrak kasar dalam Erlenmeyer 100 ml Inkubasi dalam inkubator bergoyang, digoyang pada kecepatan 120 rpm selama 60 menit pada suhu optimum
CMC Sigma
CMC Daisel
Sebanyak 2 ml dipindahkan ke dalam tabung
Kertas saring
Avicel, Jerami padi, tongkol jagung dan kulit pisang
Sebanyak 3 ml larutan dan 1 lembar kertas saring (1 x 6 cm) dipindahkan ke dalam tabung
Ditambah 50 µL NaOH 0.2 M dan disentrifus, 2500 rpm selama 20 menit
Sebanyak 2 ml dipindahkan ke dalam tabung
Ditambahkan 2 ml larutan DNS Inkubasi 100 ºC, 15 menit
Ukur Absorbansi pada λ 540 nm
