AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN SITOTOKSISITAS EKSTRAK FLAVONOID DAUN KENIKIR (Cosmos caudatus), RUMPUT MUTIARA (Oldenlandia corymbosa), DAN SIRSAK (Annona muricata)
PITRIA APRILANI RAHMAT
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Aktivitas Antioksidan dan Sitotoksisitas Ekstrak Flavonoid Daun Kenikir (Cosmos caudatus), Rumput Mutiara (Oldenlandia corymbosa), dan Sirsak (Annona muricata) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Februari 2015 Pitria Aprilani Rahmat NIM G44124011
ABSTRAK PITRIA APRILANI RAHMAT. Aktivitas Antioksidan dan Sitotoksisitas Ekstrak Flavonoid Daun Kenikir (Cosmos caudatus), Rumput Mutiara (Oldenlandia corymbosa), dan Sirsak (Annona muricata). Dibimbing oleh LATIFAH K. DARUSMAN dan WULAN TRI WAHYUNI. Flavonoid merupakan senyawa bahan alam yang diketahui memiliki khasiat sebagai antikanker. Aktivitas antioksidan lazim dihubungkan dengan manfaatnya dalam terapi kanker. Penelitian ini mengkaji potensi antioksidan dan antikanker dari ekstrak etanol dan fraksi n-butanol daun kenikir (Cosmos caudatus), rumput mutiara (Oldenlandia corymbosa), dan sirsak (Annona muricata). Ekstrak etanol sirsak menunjukkan aktivitas antioksidan terhadap radikal bebas 2,2-difenil-1pikrilhidrazil dan toksisitas terhadap larva Artemia salina terbaik dengan nilai IC50 dan LC50 berturut-turut 37.91 dan 114.52 µg/mL. Fraksionasi ekstrak etanol sirsak menggunakan kromatografi kolom menghasilkan 7 fraksi. Uji sitotoksik dari ekstrak kasar etanol sirsak, fraksi 3, dan fraksi 5 terhadap sel kanker payudara (MCF-7) menunjukkan bahwa ekstrak kasar etanol sirsak memiliki aktivitas antioksidan dan sitotoksik terbaik. Identifikasi menggunakan spektrum inframerah dan ultraviolet-tampak mengonfirmasi ekstrak tersebut mengandung senyawa flavonoid. Kata kunci: Annona muricata, antioksidan, flavonoid, sel MCF-7, sitotoksisitas
ABSTRACT PITRIA APRILANI RAHMAT. Antioxidant and Cytotoxicity Activity of Flavonoid Extracts of Kenikir (Cosmos caudatus), Rumput Mutiara (Oldenlandia corymbosa), and Soursop (Annona muricata) Leaves.. Supervised by LATIFAH K. DARUSMAN and WULAN TRI WAHYUNI. Flavonoids are secondary metabolites which often exhibits anticancer properties. The antioxidant activity of flavonoid is often related with its abilities as cancer treatment for human. This study examined antioxidant activity and anticancer potency of ethanol exctract and n-butanol fraction of kenikir (Cosmos caudatus), rumput mutiara (Oldenlandia corymbosa), and soursop (Annona muricata) leaves. The soursop ethanol extract exhibited the highest 2,2-diphenyl1-picrylhydrazyl radical scavenging activity and toxicity toward Artemia salina larvae with IC50 and LC50 values of 37.91 and 114.52 µg/mL, respectively. Seven fractions were obtained from fractionating the ethanol exctract of soursop by using column chromatography. Cytotoxic assay of the ethanol crude extract of soursop, fraction 3, and fraction 5 toward breast cancer cells (MCF-7) showed that the highest antioxidant and cytotoxic activities were shown by the ethanol extract of soursop. Infrared and ultraviolet-visible spectra confirmed that the extract contains flavonoids. Keywords: Annona muricata, antioxidant, cytotoxicity, flavonoids, MCF-7 cells
AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN SITOTOKSISITAS EKSTRAK FLAVONOID DAUN KENIKIR (Cosmos caudatus), RUMPUT MUTIARA (Oldenlandia corymbosa), DAN SIRSAK (Annona muricata)
PITRIA APRILANI RAHMAT
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
Judul Skripsi : Aktivitas Antioksidan dan Sitotoksisitas Ekstrak Flavonoid Daun Kenikir (Cosmos caudatus), Rumput Mutiara (Oldenlandia corymbosa), dan Sirsak (Annona muricata) Nama : Pitria Aprilani Rahmat NIM : G44124011
Disetujui oleh
Prof Dr Ir Latifah K. Darusman, MS Pembimbing I
Wulan Tri Wahyuni, SSi MSi Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Dra Purwantiningsih Sugita, MS Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala nikmat, rahmat, dan karunia-Nya selama proses penelitian dan penyusunan sehingga karya ilmiah dengan judul Aktivitas Antioksidan dan Sitotoksisitas Ekstrak Flavonoid Daun Kenikir (Cosmos caudatus), Rumput Mutiara (Oldenlandia corymbosa), dan Sirsak (Annona muricata) berhasil diselesaikan. Karya ilmiah ini disusun berdasarkan penelitian yang dilaksanakan pada bulan Januari 2014 hingga Januari 2015 di Laboratorium Kimia Analitik, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor, Pusat Studi Biofarmaka IPB, Bogor, dan Pusat Studi Satwa Primata IPB, Bogor. Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Prof Dr Ir Latifah K. Darusman, MS dan Ibu Wulan Tri Wahyuni, SSi MSi selaku pembimbing yang senantiasa memberikan bimbingan, saran, serta motivasinya kepada penulis selama melakukan penelitian. Terima kasih kepada Mama, Bapak, Kakak dan teman diskusi terbaik Farhana, Ayu, dan Terra atas segala doa, kasih sayang, dan dukungannya kepada penulis selama ini. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada para laboran, Pak Eman, Pak Edi, Bu Nunung. Terima kasih kepada Wenny, Ichzan, Anisa, Putra, Lady, Anisyah, dan Eva atas bantuan, semangat kebersamaan, dan perjuangannya dalam menyelesaikan karya ilmiah ini. Semoga karya ilmiah ini dapat memberikan manfaat.
Bogor, Februari 2015 Pitria Aprilani Rahmat
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL
vii
DAFTAR GAMBAR
vii
DAFTAR LAMPIRAN
vii
PENDAHULUAN Latar Belakang Tujuan Penelitian Ruang Lingkup Penelitian METODE Alat dan Bahan Preparasi Sampel Penentuan Kadar Air Ekstraksi Flavonoid Uji Kadar Flavonoid Total Uji Aktivitas Antioksidan Metode DPPH Uji Toksisitas metode (BSLT) Pemilihan Eluen Terbaik Fraksionasi dengan Kromatografi Kolom Uji Sitotoksisitas Metode MTT Identifikasi Gugus Fungsi menggunakan FTIR Identifikasi Senyawa Flavonoid menggunakan Spektrofotometer UV-tampak HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Air Rendemen Ekstraksi Flavonoid Total Aktivitas Penangkapan Radikal Bebas DPPH Toksisitas Ekstrak terhadap Larva Artemia salina Eluen Terbaik Fraksionasi dengan Kromatografi Kolom Aktivitas Antioksidan dan Toksisitas Hasil Fraksionasi Sitotoksisitas terhadap Sel MCF-7 Analisis Spektrum FTIR Analisis Spektrum UV-tampak SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran
1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 5 5 5 6 6 6 6 6 7 8 9 10 11 12 12 13 14 14 14 14
DAFTAR PUSTAKA
15
LAMPIRAN
18
RIWAYAT HIDUP
37
DAFTAR TABEL 1 2 3 4
IC50 ekstrak etanol 95% dan fraksi n-butanol LC50 ekstrak etanol 95% IC50 dan LC50 hasil fraksionasi Serapan FTIR gugus-gugus fungsi ekstrak kasar etanol 95% sirsak
9 10 12 14
DAFTAR GAMBAR 1 2 3 4 5
Rendemen ekstrak etanol 95% dan fraksi n-butanol Kadar flavonoid total ekstrak etanol 95% dan fraksi n-butanol Kromatogram hasil uji KLT dengan eluen tunggal Kromatogram hasil uji KLT dengan eluen campuran Kromatogram hasil fraksionasi
7 8 10 11 11
DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Diagram alir penelitian Hasil determinasi sampel tanaman uji Kadar air Rendemen ekstrak Kadar flavonoid total Nilai IC50 uji antioksidan DPPH Nilai LC50 uji BSLT Rendemen hasil kromatografi kolom ekstrak etanol 95% sirsak Nilai IC50 dan LC50 fraksi hasil kromatografi kolom ekstrak etanol 95% sirsak 10 Nilai IC50 hasil uji sitotoksik terhadap sel MCF-7 11 Spektrum FTIR dan UV-tampak ekstrak kasar etanol 95% sirsak
18 19 21 22 24 27 30 32 33 35 36
PENDAHULUAN Latar Belakang Penyakit kanker merupakan salah satu ancaman utama terhadap kesehatan manusia. Kanker payudara merupakan penyebab kematian yang cukup tinggi pada wanita di dunia. Setiap tahun terdapat lebih dari 1.1 juta wanita penderita kanker payudara yang baru, dengan peningkatan kejadian lebih dari 5% setiap tahunnya (Pebriani et al. 2008). Salah satu penyebab kanker ialah radikal bebas. Secara alami, dalam keadaan sehat setiap organisme mempunyai sistem pertahanan dalam menjinakkan radikal bebas (pemacu oksidasi) melalui pembentukan antioksidan (penangkal oksidasi). Akan tetapi, dalam keadaan sakit, stres, pola hidup tak sehat, dan lingkungan yang tercemar pertahanan tubuh dapat terganggu sehingga menimbulkan berbagai penyakit, salah satunya kanker (Astawan 2009). Berbagai upaya penyembuhan telah dilakukan untuk melawan kanker seperti pembedahan, penyinaran, kemoterapi, dan imunoterapi tetapi hasilnya belum optimum (Supardjan dan Meiyanto 2002). Berdasarkan kondisi tersebut, diperlukan suatu alternatif pengobatan, salah satunya melalui pencarian bahan obat yang berasal dari bahan alam. Aktivitas antioksidan lazim dihubungkan dengan manfaatnya dalam terapi penyakit kanker (Birt et al. 2001). Rao et al. (2007) menyatakan bahwa efek antioksidan pada tanaman terutama disebabkan oleh senyawa fenolik, salah satunya flavonoid. Flavonoid diketahui mampu menginduksi terjadinya apoptosis yang berperan penting dalam proses perkembangan kanker (Ren et al. 2003). Tanaman yang diduga memiliki potensi sebagai antioksidan dan antikanker ialah kenikir (Cosmos caudatus), rumput mutiara (Oldenlandia corymbosa), dan sirsak (Annona muricata). Lee dan Vairappan (2011) menyatakan ekstrak etanol kenikir memiliki potensi sebagai antioksidan dengan Ascorbic Acid Equivalent Antioxidant Capacity (AEAC) sebesar 3200.37 ± 54.11 mg AA/100 g ekstrak dan berpotensi kuat dalam uji sitotoksik sel kanker leukemia murine P388 dengan nilai IC50 sebesar 25 µg/mL. Endrini (2011) melaporkan ekstrak metanol rumput mutiara memiliki aktivitas peredaman radikal 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) dengan nilai IC50 sebesar 270.53 µg/mL serta efek sitotoksik yang tinggi terhadap sel kanker MCF-7 dengan IC50 sebesar 22.67 µg/mL. Elisya et al. (2014) melaporkan fraksi etil asetat daun sirsak memiliki aktivitas peredaman radikal DPPH dengan nilai IC50 sebesar 94.17 µg/mL. Mustariani (2011) menyatakan ekstrak senyawa flavonoid kaemferol dari daun sirsak memiliki daya hambat proliferasi terhadap sel kanker Raji sekitar 76% pada konsentrasi kaemferol 250 µg/mL. Berdasarkan berbagai penelitian yang ada, diduga terdapat korelasi positif antara potensi suatu tanaman obat sebagai antioksidan dan antikanker. Oleh karena itu, penelitian ini perlu dilakukan untuk memperoleh ekstrak sampel dengan aktivitas antioksidan dan toksisitas terbaik untuk selanjutnya difraksionasi sehingga diperoleh fraksi-fraksinya. Fraksi dengan bioaktivitas terbaik diuji sitotoksisitasnya terhadap sel kanker MCF-7.
Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan menguji aktivitas antioksidan dan sitotoksisitas dari fraksi aktif ekstrak flavonoid sampel daun kenikir, rumput mutiara, dan sirsak terhadap sel kanker MCF-7 menggunakan uji Microculture Tetrazolium Technique (MTT).
Ruang Lingkup Penelitian Metode penelitian dilakukan mengikuti diagram alir (Lampiran 1) yang meliputi determinasi ketiga sampel daun di Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI, Bogor, preparasi sampel daun, ekstraksi flavonoid dengan pelarut etanol 95% dan partisi cair-cair dengan n-butanol, uji kadar flavonoid total, uji antioksidan metode DPPH, dan uji toksisitas ekstrak dengan metode Uji Letalitas Larva Udang (BSLT). Ekstrak dengan bioaktivitas terbaik difraksionasi menggunakan kromatografi kolom dengan eluen terbaik hasil Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Pemantauan fraksi dilakukan menggunakan KLT. Fraksi-fraksi kembali diuji aktivitas antioksidan dan toksisitasnya. Fraksi dengan bioaktivitas terbaik, diuji aktivitas sitotoksiknya terhadap sel kanker Michigan Cancer Foundation (MCF-7) menggunakan metode MTT serta didentifikasi menggunakan Inframerah Transformasi Fourier (FTIR) dan spektrofotometer UVtampak.
METODE Alat dan Bahan Peralatan yang digunakan meliputi spektofotometer FTIR Bruker Tensor 37, spektrofotometer UV-tampak Hitachi U-2800, microplate reader EPOCH, microplate reader BIO-RAD, sonikator AS ONE frekuensi 38 kHz, penguap putar Heidolph VV 2000, oven, neraca analitik, penangas air, lampu UV, kromatografi kolom, bejana kromatografi, desikator, peralatan kaca, dan peranti lunak Microsoft Excel. Bahan-bahan yang digunakan meliputi daun kenikir, rumput mutiara, dan sirsak yang diperoleh dari kebun Biofarmaka, Bogor, etanol 95%, n-butanol, nheksana, kloroform, aseton, etil asetat, metanol, asam format, asam asetat glasial, DMSO, DPPH (Sigma Aldrich), serbuk asam askorbat (Sigma Aldrich), standar kuersetin (Sigma Aldrich), HCl 25%, serbuk heksametilentetramina (HMT), serbuk AlCl3, air laut, pelat 96-sumur, pelat silika gel GF254, larva Artemia salina, sel kanker MCF-7, media Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI1640), larutan MTT, dan KBr.
3 Preparasi Sampel Sampel daun kenikir, rumput mutiara, dan sirsak dikeringkan. Setelah kering, sampel daun digiling dengan ukuran 60 mesh. Serbuk sampel kemudian disimpan dalam plastik kedap udara.
Penentuan Kadar Air (AOAC 2006) Cawan porselen bersih dikeringkan dalam oven bersuhu 105 °C selama 30 menit, kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Sebanyak 3 g serbuk sampel ditimbang ke dalam cawan porselen tersebut lalu dimasukkan ke dalam oven bersuhu 105 °C selama 3 jam. Setelah itu, cawan berisi sampel didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Penentuan kadar air dilakukan hingga diperoleh bobot yang konstan dan dilakukan sebanyak tiga kali ulangan. Kadar air sampel diperoleh melalui persamaan: Kadar air =
A–B x100% A
Ket: A = Bobot sampel awal (sebelum dikeringkan) (g) B = Bobot sampel setelah dikeringkan (g) Ekstraksi flavonoid (Al-Qudah et al. 2014) Serbuk sampel masing-masing ditimbang sebanyak 20 g kemudian diekstraksi dengan pelarut n-heksana sebanyak 100 mL untuk menghilangkan lemak. Ekstraksi dilakukan menggunakan sonikator dengan frekuensi 38 kHz selama 3 jam, lalu dilakukan penyaringan. Residu masing-masing sampel diekstraksi menggunakan pelarut etanol 95% sebanyak 100 mL menggunakan sonikator selama 3 jam, kemudian disaring. Filtrat hasil penyaringan dikumpulkan lalu dipartisi dengan pelarut kloroform (1:1), lapisan etanol dikumpulkan. Lapisan etanol yang diperoleh dipartisi kembali dengan pelarut n-butanol (1:1). Lapisan nbutanol dikumpulkan dan dipekatkan menggunakan penguap putar pada suhu 40 °C (fraksi n-butanol). Ekstrak etanol 95% diperoleh dengan memekatkan filtrat etanol dari tiap sampel menggunakan penguap putar. Ekstraksi dilakukan sebanyak tiga kali ulangan. Persen rendemen diperoleh menggunakan persamaan: Rendemen % =
bobot ekstrak (g) x 100% bobot sampel g x (1 – kadar air)
Uji Kadar Flavonoid Total (Depkes RI 2000) Sebanyak 200 mg ekstrak etanol 95% dan fraksi n-butanol tiap sampel ditimbang ke dalam erlenmeyer, ditambahkan 1 mL heksametilentetramina (HMT) 0.5% b/v, 20 mL aseton, dan 2 mL HCl 25% v/v. Setelah itu, campuran dihidrolisis dengan cara direfluks dalam penangas air selama 30 menit pada suhu
4 80 °C. Setelah dingin, campuran disaring dan filtrat hasil penyaringan dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL. Filtrat ditambahkan aseton hingga tanda tera lalu dihomogenkan. Sebanyak 20 mL filtrat dipipet dan dimasukkan ke dalam corong pisah, ditambahkan 20 mL akuades dan dipartisi sebanyak tiga kali masingmasing dengan 15 mL etil asetat. Fraksi etil asetat dikumpulkan dalam labu takar 50 mL, ditambahkan etil asetat hingga tanda tera lalu dihomogenkan. Sebanyak 10 mL larutan tersebut dipipet dan dimasukkan ke dalam labu takar 25 mL, ditambahkan 1 mL larutan berisi 2 g AlCl3 dalam 100 mL larutan asam asetat glasial 5% v/v (dalam metanol). Asam asetat glasial 5% ditambahkan hingga tanda tera lalu dihomogenkan. Absorbans diukur menggunakan spektrofotometer UV-tampak pada panjang gelombang 425 nm. Larutan standar dibuat dari standar kuersetin yang dilarutkan dengan asam asetat glasial 5%, kemudian diencerkan menjadi berbagai konsentrasi. Pengujian dilakukan sebanyak tiga kali ulangan.
Uji Aktivitas Antioksidan Metode DPPH (Salazar et al. 2011) Larutan stok dari tiap sampel dibuat dengan konsentrasi 1 mg/mL, kemudian diencerkan dalam etanol menjadi beberapa konsentrasi. Larutan sampel dipipet masing-masing sebanyak 100 µL ke dalam pelat 96-sumur, ditambahkan 100 µL larutan DPPH 125 µM dalam etanol, dan diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit. Setelah itu, absorbans diukur menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 517 nm. Asam askorbat digunakan sebagai kontrol postitif, sedangkan kontrol negatifnya ialah etanol. Pengujian dilakukan sebanyak tiga kali ulangan. Nilai IC50 diperoleh dari persamaan regresi grafik hubungan konsentrasi sampel uji dengan persen inhibisi. Persen inhibisi diperoleh melalui persamaan: % Inhibisi =
absorbans blangko – absorbans sampel x 100% absorbans blangko
Uji Toksisitas metode BSLT (Krishnaraju et al. 2005) Telur udang Artemia salina ditetaskan dalam sebuah wadah berisi air laut yang diaerasi secara konstan selama 48 jam. Setelah telur tersebut menetas, larva A. salina akan keluar dari cangkang telur dan siap digunakan dalam pengujian. Sebanyak 4.5 mL air laut berisi 10 ekor A. salina dimasukkan ke dalam pelat uji, kemudian ditambahkan 0.5 mL larutan ekstrak berbagai konsentrasi (0.1–10000) µg/mL. Pelat uji diinkubasi selama 24 jam. Persen kematian A. salina diperoleh berdasarkan persamaan dibawah berikut: % Kematian =
A. salina yang mati (sampel – blangko) x 100% Jumlah A. salina uji
Persen kematian yang diperoleh dikonversi ke dalam angka probit. Pengujian dilakukan sebanyak tiga kali ulangan. Kontrol negatif yang digunakan ialah air laut berisi 10 ekor A. salina. Nilai LC50 diperoleh dari persamaan regresi grafik hubungan logaritma konsentrasi sampel uji dengan angka probit.
5 Pemilihan Eluen Terbaik (Andersen dan Markham 2006) Pelat KLT jenis silika gel dipotong dengan lebar 1 cm, tinggi 10 cm, dan garis tepi 1 cm. Pelat KLT dipanaskan dalam oven bersuhu ±40 °C selama 30 menit. Ekstrak sampel yang telah dilarutkan dalam pelarut ekstraksi ditotolkan pada pelat KLT. Setelah kering, pelat tersebut dielusi dalam bejana berisi eluen tunggal yang telah dijenukan. Eluen tunggal yang digunakan terdiri atas metanol, aseton, n-butanol, asam asetat, etil asetat, asam format, kloroform, dan n-heksana. Elusi dilakukan hingga eluen mencapai batas tepi atas pada pelat, pelat kemudian diangkat dan dikeringkan. Noda hasil elusi diamati dibawah lampu UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm. Eluen yang memberikan noda terbanyak dan terpisah dengan baik dipilih sebagai eluen terbaik. Elusi menggunakan eluen campuran dengan berbagai perbandingan dilakukan bila eluen tunggal tidak memberi keterpisahan yang baik.
Fraksionasi dengan Kromatografi Kolom (Rouessac dan Rouessac 1994) Sebanyak 40 g silika gel digunakan untuk pemisahan 2 g ekstrak menggunakan kolom kromatografi dengan diameter 2.5 cm dan tinggi 55 cm. Ekstrak sampel dilarutkan dalam pelarut ekstraksi, lalu dipisahkan dengan sistem elusi gradien (peningkatan kepolaran) menggunakan eluen terbaik. Eluat dari kolom ditampung setiap 5 mL pada tabung reaksi dan dipantau pola pemisahannya menggunakan KLT. Noda hasil elusi diamati dibawah lampu UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm. Eluat dengan jumlah dan pola noda yang sama digabungkan dalam 1 fraksi. Tiap fraksi dipekatkan menggunakan vakum dan penguap putar, kemudian diuji aktivitas antioksidan dan toksisitasnya.
Uji Sitotoksisitas Metode MTT Sel MCF-7 yang telah dikultur dalam media RPMI-1640 disiapkan terlebih dahulu. Ke dalam pelat 96-sumur ditambahkan 100 µL/sumur suspensi sel yang mengandung 5 x 103 sel/sumur. Selanjutnya pelat diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37 °C. Setelah itu, sebanyak 100 µL larutan uji dengan konsentrasi 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400, dan 800 µg/mL dimasukkan masing-masing ke dalam sumur sebanyak 3 kali ulangan. Kontrol negatif disiapkan dengan perlakuan sama, namun tanpa penambahan larutan uji. Pelat berisi sel dan larutan uji diinkubasi selama 48 jam pada kondisi yang sama. Setelah itu ditambahkan larutan MTT 5 mg/mL sebanyak 10 µL pada tiap sumur dan diinkubasi kembali selama 4 jam hingga terbentuk kristal formazan berwarna biru pada sel hidup. Sebanyak 100 µL/sumur ditambahkan etanol 96% dan diukur absorbansnya dengan microplate reader pada panjang gelombang 595 nm. Nilai IC50 diperoleh dari persamaan regresi grafik hubungan konsentrasi sampel uji dengan persen inhibisi. Persen inhibisi diperoleh melalui persamaan: % Inhibisi =
absorbans blangko – absorbans sampel uji x 100% absorbans blangko
Identifikasi Gugus Fungsi menggunakan FTIR Sebanyak ±2 mg sampel uji teraktif ditambahkan bubuk KBr sebanyak ±200 mg kemudian diaduk hingga rata. Campuran ditempatkan dalam cetakan dan ditekan menggunakan hand press Shimadzu. Tekanan ini dipertahankan selama 5 menit, kemudian sampel (pelet KBr yang terbentuk) diambil dan ditempatkan dalam tempat sampel pada spektrofotometer FTIR untuk dianalisis.
Identifikasi Senyawa Flavonoid menggunakan Spektrofotometer UV-tampak Sebanyak ±10 mg sampel uji teraktif dilarutkan dengan metanol. Setelah itu dipindahkan ke dalam labu takar 50 mL, ditambahkan metanol hingga tanda tera lalu dihomogenkan. Larutan dianalisis menggunakan spektrofotometer UVtampak pada rentang panjang gelombang 400–200 nm.
HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Air Kadar air merupakan salah satu parameter analisis guna mengetahui ketahanan, daya simpan, serta cara penanganan sampel uji agar terhindar dari aktivitas mikrob. Selain itu, kadar air berguna sebagai faktor koreksi dalam menghitung rendemen ekstraksi. Air yang terkandung dalam simplisia sampel daun kenikir, rumput mutiara, dan sirsak dihilangkan dengan pemanasan pada suhu 105 °C. Menurut Harjadi (1993), air yang terikat secara fisik dapat dihilangkan dengan pemanasan pada suhu 100–105 °C. Kadar air rerata pada sampel daun kenikir, rumput mutiara, dan sirsak diperoleh berturut-turut sebesar 7.92 ± 0.07; 11.14 ± 0.03; dan 9.92 ± 0.05 %. Kadar air simplisia sampel daun kenikir dan sirsak kurang dari 10%. Hal ini menunjukkan bahwa bahan dapat disimpan dalam jangka waktu yang cukup lama. Lain halnya dengan simplisia daun rumput mutiara dengan kadar air lebih dari 10%. Menurut Materia Medika Indonesia (1995), simplisia dengan kadar air lebih dari 10% rentan terhadap pertumbuhan jamur maupun kapang dan dapat menurunkan bioaktivitas simplisia selama masa penyimpanan sehingga diperlukan penanganan yang tepat. Perhitungan kadar air dari ketiga sampel ditunjukkan pada Lampiran 3.
Rendemen Ekstraksi Komponen bioaktif yang diduga memiliki aktivitas antioksidan dan sitotoksik pada ketiga sampel ialah senyawa fenolik, salah satunya flavonoid. Flavonoid merupakan senyawa yang bersifat polar. Oleh karena itu, ekstraksi flavonoid umumnya menggunakan pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dan etil asetat (Markham 1988). Etanol 95% digunakan sebagai pelarut ekstraksi dalam penelitian ini. Rendemen ekstrak etanol 95% dan fraksi n-butanol pada Gambar 1 menunjukkan bahwa rerata rendemen ekstrak etanol 95% dari
7 ketiga sampel cenderung lebih besar dibandingkan dengan rendemen fraksi nbutanol. Etanol merupakan senyawa polar yang dikenal sebagai pelarut universal, karena selain mampu mengekstraksi komponen polar juga dapat mengekstraksi komponen nonpolar (Houghton dan Raman 1998). Oleh karena itu, rendemen ekstrak etanol yang diperoleh lebih tinggi. Rerata rendemen fraksi n-butanol yang rendah juga dapat disebabkan fraksi tersebut diperoleh melalui tahapan partisi cair-cair sehingga komponen senyawa menjadi berkurang. Partisi cair-cair ekstrak etanol 95% dengan n-butanol bertujuan memperoleh komponen fenolik yang bersifat semipolar, seperti kuersetin dan kaemferol (Mohamed et al. 2013). Ekstrak etanol 95% dan fraksi n-butanol sirsak memiliki rerata rendemen tertinggi, berturut-turut sebesar 12.46 ± 0.53 dan 7.99 ± 0.54%. Hal ini mengindikasikan banyaknya komponen senyawa pada daun sirsak yang mampu terekstraki dalam pelarut tersebut. Proses ekstraksi dilakukan dengan bantuan gelombang ultrasonik 38 kHz yang mampu merusak dinding sel tanaman sehingga mempercepat proses perpindahan massa senyawa bioaktif dari dalam sel ke pelarut (Melecchi et al. 2006). Perhitungan rendemen ekstrak dari ketiga sampel ditunjukkan pada Lampiran 4. 14 Rendemen (%)
12
12.46 10.99
10
8.18
7.99
8 6
4.34
4 1.44
2 0 Kenikir
Rumput mutiara
Gambar 1 Rendemen ekstrak etanol 95% (
Sirsak
) dan fraksi n-butanol (
)
Flavonoid Total Untuk mengetahui kandungan flavonoid dalam ekstrak etanol 95% dan fraksi n-butanol tiap sampel, digunakan metode pewarnaan AlCl3. Tahapan analisis diawali dengan hidrolisis menggunakan asam untuk memutus ikatan gula dengan flavonoid. Flavonoid dalam bentuk aglikon kemudian dipisahkan dari gula melalui partisi cair-cair dan dikompleks dengan AlCl3. Absorbans kompleks aglikon-AlCl3 diukur dengan spektrofotometer UV-tampak (Rohaeti et al. 2011). Gambar 2 menyajikan data kadar flavonoid total (mg ekuivalen kuersetin /g sampel) dari tiap ekstrak dan fraksi ketiga sampel. Perhitungan kadar flavonoid total tersebut diberikan pada Lampiran 5. Berdasarkan Gambar 2, ekstrak etanol 95% rumput mutiara dan sirsak memiliki kadar flavonoid total yang lebih besar dibandingkan dengan fraksi n-butanolnya. Pelarut etanol yang bersifat polar mampu mengekstraksi lebih banyak senyawa golongan flavonoid yang juga bersifat polar (terikat dengan gula) (Andersen dan Markham 2006). Lain halnya dengan fraksi n-butanol yang diperoleh melalui proses partisi cair-cair (terjadi
8 penurunan jumlah senyawa bioaktif). Hal berkebalikan terjadi pada sampel kenikir yang memiliki kadar flavonoid total ekstrak etanol 95% lebih rendah daripada fraksi n-butanolnya. Andarwulan et al. (2010) melaporkan kandungan senyawa flavonoid pada ekstrak metanol 50% kenikir didominasi oleh kuersetin dan kaemferol, yakni sebesar ±60% dari total senyawa flavonoid pada ekstrak tersebut. Kuersetin dan kaemferol merupakan senyawa flavonoid yang bersifat semipolar sehingga keduanya diduga terpartisi dalam n-butanol dan memberikan kadar flavonoid yang lebih tinggi.
mg ekuivalen kuersetin/g sampel
6 5
4.33 4.58
4
2.52
3
1.78
2
1.78 1.08
1 0
Kenikir
Rumput mutiara
Sirsak
Gambar 2 Kadar flavonoid total ekstrak etanol 95% ( ) dan fraksi n-butanol (
)
Aktivitas Penangkapan Radikal Bebas DPPH DPPH merupakan radikal bebas stabil yang lazim digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan dari senyawa bahan alam. Kelebihan metode ini ialah mudah, cepat, dan sensitif (She et al. 2010). Antioksidan memiliki kemampuan menetralisasi radikal bebas dengan menyumbangkan radikal hydrogen kepada molekul radikal bebas tersebut (Badarinath et al. 2010). Penangkapan atom hidrogen dari senyawa antioksidan oleh radikal DPPH menyebabkan DPPH tereduksi menjadi senyawa DPPH-H, dan warna larutan berubah dari ungu menjadi kuning (Szabo et al. 2006). Konsentrasi penghambatan 50% (IC50) ketiga sampel terhadap radikal bebas DPPH disajikan pada Tabel 1. Daya inhibisi yang sangat kuat terhadap radikal bebas DPPH dimiliki oleh fraksi n-butanol kenikir, sementara ekstrak etanol 95% kenikir memiliki daya inhibisi lebih rendah 36.66% daripada fraksi n-butanol nya (Tabel 1). Menurut Zuhra (2008), suatu senyawa dikategorikan sebagai antioksidan sangat kuat jika nilai IC50 kurang dari 50 µg/mL, kuat jika IC50 50–100 µg/mL, cukup kuat jika IC50 100–150 µg/mL, dan lemah jika IC50 151–200 µg/mL. Ekstrak etanol 95% rumput mutiara tidak menunjukkan aktivitas antioksidan karena pada konsentrasi lebih dari 500 µg/mL, belum mencapai persen inhibisi 50% (Lampiran 6). Namun demikian, fraksi n-butanolnya memiliki aktivitas inhibisi yang cukup kuat. Selain fraksi n-butanol kenikir, ekstrak etanol 95% dan fraksi n-butanol sirsak memiliki aktivitas inhibisi yang sangat kuat terhadap radikal bebas DPPH (Tabel 1). Aktivitas antioksidan dari ekstrak etanol 95% dan fraksi n-butanol sirsak lebih kuat dibandingkan dengan rumput mutiara, padahal kadar flavonoid total ekstrak etanol 95% dan fraksi n-butanol sirsak lebih rendah dibandingkan dengan
9 rumput mutiara. Menurut Rao et al (2008), selain senyawa flavonoid, efek antioksidan pada tanaman dapat disebabkan oleh senyawa fenolik lain seperti asam fenolat, tanin, dan diterpenoid fenolik. Lima et al. (2010) mengemukakan bahwa daun sirsak mengandung senyawa asetogenin yang berperan dalam aktivitas antioksidan dan antikanker pada tumbuhan suku Annonaceae. Gugus fungsi yang terdapat pada senyawa asetogenin memiliki kemampuan sebagai donor elektron bagi radikal bebas DPPH. Asetogenin merupakan senyawa poliketida yang bersifat sedikit polar. Hampir semua asetogenin mudah larut dalam pelarut organik (Wijaya 2012). Diduga senyawa asetogenin ikut terekstraksi dalam etanol 95% dan terpartisi dalam n-butanol sehingga meningkatkan aktivitas inhibisi terhadap radikal bebas DPPH. Fraksi n-butanol dari ketiga sampel menunjukkan aktivitas antioksidan yang lebih baik dibandingkan dengan ekstrak etanol 95% (Tabel 1). Namun, hanya ekstrak etanol 95% yang dipilih untuk diujikan pada tahapan selanjutnya. Tahapan ekstraksi yang panjang untuk memperoleh fraksi n-butanol, pemekatan fraksi yang cukup sulit, rendemen fraksi n-butanol yang rendah (Gambar 1), serta pelarut nbutanol yang kurang ekonomis menjadi pertimbangan tidak digunakannya fraksi tersebut pada tahapan selanjutnya. Tabel 1 IC50 ekstrak etanol 95% dan fraksi n-butanol IC50 (µg/mL) Sampel Etanol 95% (n=3) n-butanol (n=3) Kenikir 52.81 ± 0.30 16.14 ± 0.11 Rumput mutiara >500 102.44 ± 2.40 Sirsak 37.91 ± 0.03 25.26 ± 0.98 Vitamin C 4.99 ± 0.00
Toksisitas Ekstrak terhadap Larva Artemia salina Uji toksisitas dengan metode Uji Letalitas Larva Udang (BSLT) dilakukan sebagai uji pendahuluan untuk mendeteksi efek farmakologis dari senyawa bioaktif. Metode BSLT memiliki beberapa keunggulan, di antaranya waktu pelaksanaan cepat, biaya relatif murah, sederhana, serta tidak memerlukan teknik aseptik dan peralatan khusus (Meyer et al. 1982). Nilai LC50 menjadi parameter toksisitas suatu sampel uji, yaitu konsentrasi senyawa bioaktif yang dapat mematikan 50% populasi hewan uji, dalam hal ini larva A. salina. Toksisitas ekstrak etanol 95% ketiga sampel disajikan pada Tabel 2. Berdasarkan Tabel 2, toksisitas tertinggi (LC50 terendah) dimiliki oleh ekstrak sirsak, diikuti kenikir dan rumput mutiara. Menurut Meyer et al. (1982), ekstrak dari bahan alam dikategorikan toksik apabila memiliki LC50 kurang dari 1000 µg/mL. Pernyataan tersebut menunjukkan bahwa ketiga sampel bersifat toksik dan memiliki potensi sebagai antikanker. Perhitungan LC50 ketiga ekstrak ditunjukkan pada Lampiran 7. Aktivitas antioksidan dan toksisitas ketiga ekstrak menunjukkan korelasi positif. Ekstrak etanol 95% sirsak memiliki IC50 dan LC50 terendah, berturut-turut 37.91 ± 0.03 dan 114.52 ± 3.81 µg/mL. Oleh karena itu, ekstrak etanol 95% sirsak dipilih sebagai ekstrak dengan bioaktivitas terbaik untuk difraksionasi menggunakan kromatografi kolom, setelah melalui tahapan pemilihan eluen terbaik.
10 Tabel 2 LC50 ekstrak etanol 95% dan fraksi n-butanol LC50 (µg/mL) Sampel (n=3) Kenikir 183.49 ± 2.25 Rumput mutiara 678.60 ± 4.54 Sirsak 114.52 ± 3.81
Eluen Terbaik Eluen terbaik untuk ekstrak etanol 95% sirsak dipilih menggunakan KLT dengan fase diam silika gel GF254 dan fase gerak (eluen) metanol, aseton, nbutanol, asam asetat, etil asetat, asam format, kloroform, dan n-heksana. Analisis menggunakan KLT memiliki kelebihan, di antaranya metode sederhana, murah, waktu pemisahan singkat, dan memungkinkan beberapa sampel dianalisis secara bersamaan (Andersen dan Markham 2006). Berdasarkan pengamatan kromatogram di bawah lampu UV 254 dan 366 nm (Gambar 3), eluen n-heksana tidak menghasilkan noda pada pelat silika. Hal ini dapat disebabkan oleh cenderung polarnya komponen senyawa pada ekstrak sehingga sampel tertahan pada silika dan tidak terpisah oleh n-heksana. Eluen etil asetat menghasilkan noda pada bagian atas pelat yang menunjukkan bahwa terdapat komponen senyawa dalam ekstrak yang bersifat semipolar dan dapat dipisahkan dengan etil asetat.
a b c d e
f
g h
Gambar 3 Kromatogram hasil uji KLT dengan eluen tunggal n-heksana (a), etil asetat (b), aseton (c), asam format (d), asam asetat (e), kloroform (f), n-butanol (g), dan metanol (h). Eluen aseton, asam format, dan asam asetat menghasilkan noda berekor pada pelat silika yang menunjukkan bahwa eluen tersebut tidak mampu memisahkan komponen senyawa dengan sempurna. Eluen kloroform dan nbutanol menghasilkan 5 noda, sedangkan eluen metanol menghasilkan 8 noda. Hasil tersebut menunjukkan bahwa ketiga eluen mampu memisahkan komponenkomponen senyawa dalam ekstrak. Meskipun demikian, masih terdapat noda berekor di awal elusi serta noda yang kurang terpisah dengan baik pada ketiga eluen tersebut sehingga diperlukan pencampuran eluen dengan komposisi tertentu.
11 Pencampuran eluen dengan berbagai komposisi merujuk pada Andersen dan Markham (2006). Berdasarkan pengamatan kromatogram dibawah lampu UV, eluen EtOAc:HCOOH:H2O (9:1:1), EtOAc:HCOOH:CH3COOH:H2O (25:2:2:4), CHCl3:MeOH (9:1), CHCl3:MeOH:CH3COOH (90:5:5), dan CHCl3:CH3COOH (100:4) memiliki jumlah noda terbanyak, yaitu berturut-turut 6, 7, 7, 5 dan 7 noda (Gambar 4). Eluen CHCl3:MeOH (9:1) dipilih sebagai eluen terbaik karena selain memiliki jumlah noda yang banyak, elusi ekstrak menggunakan eluen tersebut mampu memisahkan noda-noda pada pelat silika dengan baik.
a Gambar
4
b
c
d
e
Kromatogram hasil uji KLT dengan eluen campuran EtOAc:HCOOH:H2O (9:1:1) (a), EtOAc:HCOOH:CH3COOH:H2O (25:2:2:4) (b), CHCl3:MeOH (9:1) (c), CHCl3:MeOH:CH3COOH (90:5:5) (d), dan CHCl3:CH3COOH (100:4) (e).
Fraksionasi dengan Kromatografi Kolom Fraksionasi ekstrak etanol 95% sirsak menggunakan kromatografi kolom dilakukan dengan sistem elusi gradien. Silika gel dikemas menggunakan eluen kloroform. Selanjutnya ekstrak yang telah dilarutkan dalam etanol 95% dielusi dengan kloroform 100%, kloroform:metanol (9:1, 8:2, 7:3, 4:6, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9), dan metanol 100%.
a b
c d
e
f
g
Gambar 5 Kromatogram hasil fraksionasi, fraksi 1 (a), fraksi 2 (b), fraksi 3 (c) fraksi 4 (d), fraksi 5 (e), fraksi 6 (f), dan fraksi 7 (g).
12 Fraksionasi menghasilkan 186 eluat yang digabung menjadi fraksi-fraksi berdasarkan pola KLT (jumlah noda) menggunakan eluen terbaik kloroform:metanol (9:1). Penggabungan eluat menghasilkan 7 fraksi (Lampiran 8) dengan pola KLT yang disajikan pada Gambar 5.
Aktivitas Antioksidan dan Toksisitas Hasil Fraksionasi Untuk memperoleh fraksi aktif yang akan diuji sitotoksisitasnya terhadap sel kanker MCF-7, tiap fraksi diuji toksisitas dan aktivitas antioksidannya. Menurut Birt et al. (2001) terdapat korelasi antara potensi flavonoid sebagai antioksidan dan antikanker. Berdasarkan Tabel 3, fraksi 1 − 4 tidak memiliki aktivitas antioksidan, namun fraksi 2−4 menunjukkan tingkat toksisitas yang sangat tinggi terhadap larva A. salina dan memiliki nilai LC50 yang berdekatan. Fraksi 5 dan 6 memiliki aktivitas antioksidan dan toksisitas yang cukup kuat. Fraksi 7 memiliki aktivitas antioksidan cukup kuat, akan tetapi baik fraksi 7 maupun fraksi 1 tidak menunjukkan toksisitas karena LC50 yang diperoleh lebih dari 1000 µg/mL (Meyer et al. 1982). Perhitungan nilai IC50 dan LC50 hasil fraksionasi dapat dilihat pada Lampiran 9. Tabel 3 IC50 dan LC50 hasil fraksionasi IC50 (µg/mL) LC50 (µg/mL) Fraksi (n=3) (n=3) 1 >3000 2 1.50 ± 0.12 >650 3 0.46 ± 0.02 4 1.07 ± 0.04 5 55.70 ± 1.27 169.92 ± 7.03 6 83.65 ± 2.06 293.64 ± 5.64 7 109.84 ± 1.83 2534.60 ± 58.89 Fraksi 5-7 menunjukkan aktivitas antioksidan dan toksisitas yang berkolerasi positif (Tabel 3). Namun demikian, beberapa fraksi memiliki aktivitas antioksidan dan toksisitas yang lebih lemah dibandingkan ekstrak kasarnya (Tabel 1 dan 2). Hal ini dapat disebabkan oleh adanya efek sinergis pada ekstrak kasar (Mohammed et al. 2013). Adanya efek sinergis akan memberikan bioaktivitas (dalam hal ini aktivitas antioksidan dan toksisitas) yang lebih kuat daripada bioaktivitas total yang diberikan senyawa aktif itu sendiri (Widyastuti 2005). Berdasarkan aktivitas antioksidan dan toksisitasnya, ekstrak etanol 95% sirsak, fraksi 3, dan fraksi 5 dipilih untuk diuji sitotoksisitasnya terhadap sel MCF-7.
Sitotoksisitas terhadap Sel MCF-7 Sitotoksisitas merupakan sifat toksik suatu agen kimia terhadap sel kanker yang diuji secara in vitro (NCI 2012). Pengujian sitotoksik dilakukan menggunakan metode pewarnaan dengan pewarna 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5difeniltetrazolium bromida (garam tetrazolium). Garam tetrazolium dapat berekasi
13 secara in vitro dengan enzim suksinat dehidrogenase yang dihasilkan sel hidup. Enzim tersebut akan mereduksi garam tetrazolium menjadi kristal formazan yang berwarna biru dan dapat diukur serapannya (Rachmani et al. 2012). Sel MCF-7 ditumbuhkan pada media RPMI-1640 yang mengandung suplemen berupa FBS 5% dan antibiotik PS 1%. Kultur sel diinkubasi pada suhu 37 °C dan CO2 5 % bertujuan untuk menjaga suhu dan pH fisiologis sel (Rachmani et al. 2012). Berdasarkan hasil uji diperoleh persen inhibisi terhadap proliferasi MCF-7 yang berkorelasi positif seiring dengan meningkatnya konsentrasi larutan uji. Hal ini menunjukkan semakin sedikit sel yang hidup pada konsentrasi larutan uji yang tinggi (Lampiran 10). Ekstrak kasar etanol 95% sirsak dan fraksi 3 memiliki nilai IC50 terhadap sel MCF-7 yang berdekatan dan keduanya menunjukkan daya hambat terhadap proliferasi sel MCF-7 yang lebih baik daripada fraksi 5 (IC50 sebesar 283.63 µg/mL). Meskipun ekstrak kasar etanol 95% dan fraksi 3 menunjukkan sitotoksisitas terhadap sel MCF-7 yang berdekatan, kedua sampel uji tersebut memiliki aktivitas antioksidan yang sangat berbeda. Ekstrak kasar memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat, sedangkan fraksi 3 tidak menunjukkan aktivitas antioksidan (Tabel 1 dan 3). Diduga terdapat perbedaan mekanisme dari senyawa bioaktif dalam perannya sebagai antioksidan dan zat sitotoksik. Aktivitas antioksidan merupakan upaya pencegahan oksidasi dengan menstabilkan radikal bebas DPPH, sedangkan sitotoksisitas merupakan upaya penghambatan proliferasi sel kanker bahkan pemicu terjadinya apoptosis (kematian sel kanker) (Meiyanto et al. 2008). Pernyataan tersebut dapat menjadi penyebab fraksi 3 memiliki sitotoksisitas yang kuat meskipun tidak menunjukkan aktivitas antioksidan. Fraksi 5 merupakan fraksi dengan aktivitas antioksidan tertinggi diantara ketujuh fraksi hasil fraksionasi (Tabel 3), namun sitotoksisitasnya terhadap sel kanker MCF-7 jauh lebih lemah dibandingkan kedua sampel uji lainnya. Ekstrak kasar etanol 95% sirsak memiliki aktivitas antioksidan (Tabel 1) dan sitotoksisitas terbaik dibandingkan fraksi-fraksinya sehingga ekstrak tersebut dipilih sebagai ekstrak terbaik yang selanjutnya diidentifikasi menggunakan FTIR dan UVtampak.
Analisis Spektrum FTIR Identifikasi gugus fungsi pada ekstrak kasar etanol 95% dilakukan menggunakan FTIR. Spektrum FTIR pada Lampiran 11 menunjukkan adanya serapan kuat dan melebar pada bilangan gelombang 3394.39 cm-1 yang menandakan adanya regang gugus O-H. Terdapat regang C-H yang ditandai dengan serapan pada bilangan gelombang 2925.36 cm-1 (Creswell et al. 2005). Terdapat serapan kuat pada bilangan gelombang 1619.46 cm-1 menandakan adanya regang gugus C=C yang dapat berasal dari struktur alifatik atau aromatik (Creswell et al. 2005). Regang gugus C-O pada spektrum FTIR ditunjukkan dengan adanya serapan pada bilangan gelombang 1055.61 cm-1 (Tabel 4). Hasil identifikasi dengan FTIR menunjukkan dugaan adanya senyawa flavonoid pada ekstrak tersebut.
Tabel 4 Serapan FTIR gugus-gugus fungsi ekstrak kasar etanol 95% sirsak Bilangan Literatura Gugus gelombang (cm-1) (cm-1) dugaan 3394.39 3200−3450 Regang O-H 2925.36 2900−3300 Regang C-H 1619.46 1500−1675 Regang C=C 1055.61 Regang C-O 1000−1300 a Sumber: Creswell et al. (2005)
Analisis Spektrum UV-tampak Identifikasi menggunakan UV-tampak dilakukan untuk mengkonfirmasi dugaan adanya senyawa flavonoid. Flavonoid mengandung sistem aromatik terkonjugasi, oleh karena itu flavonoid akan menunjukkan serapan yang kuat pada daerah spektrum UV-tampak (Harborne 1987). Hasil pemayaran dengan perubahan panjang gelombang 1 nm, menunjukkan ekstrak kasar etanol 95% sirsak memberikan puncak pada panjang gelombang 230.4 nm (Lampiran 11). Menurut Cresswell et al. (2005), adanya pucak pada panjang gelombang tersebut terjadi karena transisi π→π* dan n→ π* yang dapat dihasilkan oleh kromofor C=O dan C=C. Markham (1988) menyatakan serapan pada kisaran panjang gelombang 230−270 nm menunjukkan dugaan adanya senyawa flavonoid golongan kalkon dan auron. Akan tetapi, perlu adanya identifikasi lebih lanjut untuk memastikan kandungan senyawa pada ekstrak tersebut.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Ekstrak etanol 95% daun sirsak memiliki aktivitas antioksidan dan toksisitas terhadap larva A. Salina terbaik dibandingkan ekstrak daun kenikir dan rumput mutiara, dengan nilai IC50 dan LC50 berturut-turut 37.91 dan 114.52 µg/mL. Fraksionasi ekstrak etanol 95% daun sirsak menggunakan kromatografi kolom menghasilkan 7 fraksi. Ekstrak etanol 95% daun sirsak menunjukkan aktivitas antioksidan dan sitotoksisitas terhadap sel MCF-7 terbaik dibandingkan dengan fraksi 3 dan 5. Identifikasi menggunakan spektrum inframerah dan ultraviolettampak menunjukkan dugaan adanya senyawa flavonoid pada ekstrak tersebut.
Saran Perlu adanya pengujian sitotoksik pada sel normal (sel Vero) sehingga konsentrasi sampel uji yang tepat dapat diujicobakan pada sel kanker tanpa merusak sel normal. Selain itu, diperlukan identifikasi lebih lanjut menggunakan KCKT dan GC-MS untuk mengetahui senyawa yang berperan terhadap kedua bioaktivitas dari ekstrak kasar etanol 95% sirsak.
DAFTAR PUSTAKA [AOAC] Association of Official Analytical Chemist. 2006. Official Methods of Analysis. Ed ke-18. Washington DC (US): Association of Official Analytical Chemist. [Depkes RI] Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1995. Materia Medika Indonesia. Jilid VI. Jakarta (ID): Direktorat Jendral, Pengawasan Obat dan Makanan. [Depkes RI] Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta (ID): Depkes RI. [Dirjen POM] Direktorat Jendral Pengawas Obat dan Makanan. 1995. Materia Medika Indonesia Jilid III. Jakarta (ID): Departemen Kesehatan Republik Indonesia. [NCI] National Cancer Institute. 2012. Breast Cancer. National Cancer Institute [internet]. [diakses 2014 Des 11]. Tersedia pada: http://www.cancer.gov/cancertopics/types/breast.html. Al-Qudah MA, Al-Jaber HI, Zarga MHA, Orabi STA. 2014. Flavonoid and phenolic compounds from Salvia palaestina L. growing wild in Jordan and their antioxidant activities. Phytochem. 99(2014):115120.doi:10.1016/j.phytochem.2014.01.001. Andarwulan N, Batari R, Sandrasari DA, Bolling B, Wijaya H. 2010. Flavonoid content and antioxidant activity of vegetables from Indonesia. Food Chem. 121(2010):1231-1235.doi:10.1016/j.foodchem.2010.01.033. Andersen ØM, Markham KR. 2006. Flavonoids: Chemistry, Biochemistry, and Applications. Florida (US): Taylor & Francis Group. Astawan M. 2009. A-Z Ensiklopedia Gizi Pangan untuk Keluarga. Jakarta (ID): Dian Rakyat. Badarinath AV, Mallikarjuna RK, Chetty CMS, Ramkanth S, Rajan TVS, Gnanaprakash K. 2010. A review on in-vitro antioxidant methods: comparisons, correlations and considerations. Int J PharmTech Res. 2(2):1276-1285. Birt DF, Hendrich S, Wang W. 2001. Dietary agents in cancer prevention: flavonoids and isoflavonoids. Pharmacol Ther. 90:157177.doi:10.1016/s0163-7258(01)00137-1. Cresswell CJ, Olaf AR, Malcolm MC. 2005. Analisis Spektrum Senyawa Organik Ed ke-3. Bandung (ID): Institut Teknologi Bandung. Endrini S. 2011. Antioxidant activity and anticarcinogenic properties of rumput mutiara (Hedyotis corymbosa (L.) Lam.) and pohpohan (Pilea trinervia (Roxb.) Wight). J Med Plant Res. 5(16):3715-3718. Elisya Y, Kardono LBS, Simanjutak P. 2014. Tablet formulation of the ethyl acetate soluble exctract of soursop (Annona muricata L.) leaves. Asian J Appl Sci. 2(3):323-329. Harjadi W. 1993. Ilmu Kimia Analitik Dasar. Jakarta (ID): PT Gramedia Pustaka Utama. Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Ed ke-2. Padmawinata K, Soedira L, Penerjemah. Bandung (ID): Penerbit ITB. Terjemahan dari: Phytochemical Method.
16 Houghton PJ, Raman A. 1998. Laboratory Handbook for The Fractionation of Natural Exctract. London (GB): Chapman and Hall. Krishnaraju AV et al. 2005. Assessment of bioactivity of Indian medicinal plants using Brine Shrimp (Artemia salina) lethality assay. Int J Appl Sci Eng. 3:125-134. Lee TK, Vairappan CS. 2011. Antioxidant, antibacterial and cytotoxic activities of essential oils and ethanol extracts of selected South East Asian herbs. J Med Plant Res. 5(21): 5824-5290. Lima LARS, Pimenta LPS, Boaventura MAD. 2010. Acetogenins from Annona cornifolia and their antioxidant capacity. Food Chem. 122(2010):11291138.doi:10.1016/j.foodchem.2010.03.100. Lupea AX, Chambire D, Iditoiou C. 2006. Improved DPPH determination for antioxidant activity spectrophotometric assay. Chem Pap. 61(3):214216.doi:10.2478/s11696-007-0022-7. Markham KR. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Padmawinata K, penerjemah. Bandung (ID): Institut Teknologi Bandung. Terjemahan dari: Techniques of Flavonoid Identification. Meiyanto E, Susidarti RA, Handayani S, Rahmi F. Ekstrak etanolik biji buah pinang (Areca catechu L.) mampu menghambat proliferasi dan memacu apoptosis sel MCF-7. Maj Farm Indones. 19(12):12-19. Melecchi MIS, Péres VF, Dariva C, Zini CA, Abad FC, Martinez MM, Caramã EB. (2006). Optimization of the sonication extraction method of Hibiscus tiliaceus L. flowers. Ultrason Sonochem. 13(3):242250.doi:10.1016/j.ultsonch.2005.02.003. Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE, Jacobsen LB, Nichols DE, McLaughlin JL. 1982. Brine Shrimps: A convenient general bioassay for active plant constituent. Planta Med. 45:31-34.doi:10.1055/s-2007-971236. Mohammed MMD, El-Sharkawy ER, Matloub AA. 2013. Cytotoxic flavonoids from Diplotaxis harra (Forssk.) Boiss. growing in Sinai. J Med Plant Res. 7(1):19-23.doi:10.5897/jmpr11.721. Mustariani BAA. 2011. Potensi kaempferol daun sirsak sebagai penghambat proliferasi sel kanker raji [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Pebriani RB, Wardhani BWK, Widayanti E, Wijayanti NLK, Wijayanti TR, Riyanto S, Meiyanto E. 2008. Pengaruh ekstrak metanolik daun kenikir (Cosmos caudatus Kunth.) terhadap pemacuan apoptosis sel kanker payudara. Pharmacon. 9(1):21-26. Rachmani EPN, Suhesti TS, Widiastuti R, Aditiyono. 2012. The breast of anticancer from leaf extract of Annona muricata against cell line in T47D. Int J Appl Sci Technol. 2(1):157-164. Rao YK, Geethangili M, Fang SH, Tzeng YM. 2007. Antioxidant and cytotoxic activities of naturally occurring phenolic and related compounds: A comparative study. Food Chem Toxicol. 45(2007):17701776.doi:10.1016/j.fct.2007.03.012. Ren W, Qiao Z, Wang H, Zhu L, Zhang L. 2003. Flavonoids: promising anticancer agents. Med Res Rev. 23(4):519-534.doi:10.1002/med.10033. Rohaeti E, Heryanto R, Rafi M, Wahyuningrum A, Darusman LK. 2011. Prediksi flavonoid total tempuyung (Sonchus arvensis L.) menggunakan kombinasi
17 spektroskopi IR dengan regresi kuadrat terkecil parsial. J Kim. 5(2):101108. Rouessac F, Rouessac A. 1994. Chemical Analysis Modern Instrumentation Methods and Techniques. New York (US): John Willey & Sons. Salazar AR, Alejandro RLL, Lopez AJ, Alicia AGB, Waksman TN. 2011. Antimicrobial and antioxidant activities of plants from northeast of Mexico. Evid Based Complement Altern Med. 2011:1-6.doi:10.1093/ecam/nep127. She GM, Xu C, Liu B, Shi RB. 2010. Polyphenolic acids from Mint (the aerial of Mentha haplocalyx Briq.) with DPPH radical scavenging activity. J Food Sci. 75:C359-C362.doi:10.1111/j.1750-3841.2010.01603.x. Supardjan AM, Meiyanto E. 2002. Efek antiproliferatif pentagamavunon-0 terhadap beberapa sel kanker [laporan penelitian]. Yogyakarta (ID): Lembaga Penelitian Universitas Gadjah Mada. Szabo MR, Iditoiou C, Chambire D, Lupea AX. 2006. Improved DPPH determination for antioxidant activity spectrophotometric assay. Chem Pap. 61(3):214-216.doi:10.2478/s11696-007-0022-7. Widyastuti P. 2005. Bahaya Bahan Kimia pada Kesehatan Manusia dan Lingkungan. Jakarta (ID): Penerbit Buku Kedokteran EGC. Wijaya M. 2012. Ekstraksi Annonaceous acetogenin dari daun sirsak (Annona muricata) sebagai senyawa bioaktif antikanker [skripsi]. Depok (ID): Universitas Indonesia. Zuhra CF, Tarigan JB, Sihotang H. 2008. Aktivitas antioksidan senyawa flavonoid dari daun katuk (Sauropus androgunus (L) Merr.). J Biol Sumatera. 3(1):7-10.
18 Lampiran 1 Diagram alir penelitian Daun kenikir (Cosmos caudatus)
Daun rumput mutiara (Oldenlandia corymbosa)
Daun sirsak (Annona muricata)
Preparasi sampel Serbuk daun kenikir, rumput mutiara, dan sirsak Ekstraksi flavonoid (Al-Qudah et al. 2014) (ekstrak etanol dan fraksi n-butanol)
Ekstrak flavonoid daun kenikir
Ekstrak flavonoid daun rumput mutiara
Ekstrak flavonoid daun sirsak
1. Uji Flavonoid total 2. Uji Antioksidan DPPH 3. Uji BSLT Ekstrak dengan potensi bioaktivitas tertinggi 1. Pemilihan eluen terbaik 2. Fraksionasi dengan Kromatografi Kolom
Fraksi 1
Fraksi 2
Fraksi…
1.Uji Antioksidan DPPH 2.Uji BSLT Fraksi dengan potensi bioaktivitas tinggi Uji sitotoksik MTT Fraksi dengan daya sitotoksisitas terbaik
Identifikasi senyawa menggunakan spektrofotometer UV-tampak dan FTIR
19 Lampiran 2 Hasil determinasi sampel tanaman uji
20
21 Lampiran 3 Kadar air Sampel tanaman
Ulangan
Kenikir
1 2 3
Rerata kadar air (%) 1 2 3
Rumput mutiara Rerata kadar air (%)
1 2 3
Sirsak Rerata kadar air (%)
Bobot (g) Kadar air (%) Sampel awal Sampel kering 3.0000 2.7623 7.92 3.0000 2.7604 7.99 3.0002 2.7646 7.85 7.92 ± 0.07 3.0000 2.6655 11.15 3.0000 2.6671 11.10 3.0000 2.6652 11.16 11.14 ± 0.03 3.0003 2.7050 9.98 3.0001 2.7031 9.89 3.0002 2.7032 9.90 9.92 ± 0.05
Contoh perhitungan: Kadar air % =
A– B A
x 100%
Ket: A= Bobot sampel awal (sebelum dikeringkan) (g) B= Bobot sampel setelah dikeringkan (g) (3.0000 – 2.7623)g x 100% 3.0000 g = 7.92 %
Kadar air % =
Kadar air ulangan 1 + ulangan 2 + ulangan 3 3 7.92 + 7.99 + 7.85 % = 3 =7.92 %
Rerata kadar air % =
Standar deviasi=
x – x)² n–1
n i=1 (
(7.92 – 7.92)2 + (7.99 – 7.92)2 + (7.85 – 7.92)2 3–1 = 0.07 =
22 Lampiran 4 Rendemen ekstrak a) Rendemen ekstrak etanol 95% Sampel
Ulangan
1 2 3 Rerata rendemen (%) 1 Rumput 2 mutiara 3 Rerata rendemen (%) 1 Sirsak 2 3 Rerata rendemen (%) Kenikir
Bobot sampel (g) 20.0000 20.0001 20.0001
Bobot ekstrak (g) 2.1174 2.0922 1.9289
20.0001 20.0002 20.0002
1.5178 1.3920 1.4543
20.0001 20.0000 20.0002
2.1838 2.3553 2.1982
Rendemen (%) 11.50 11.36 10.47 10.99 ± 0.55 8.54 7.83 8.18 8.18 ± 0.36 12.12 13.07 12.20 12.46 ± 0.53
b) Rendemen fraksi n-butanol Sampel
Ulangan
1 Kenikir 2 3 Rerata rendemen (%) 1 Rumput 2 mutiara 3 Rerata rendemen (%) 1 Sirsak 2 3 Rerata rendemen (%)
Bobot sampel (g) 20.0001 20.0002 20.0004
Bobot ekstrak (g) 0.6694 0.7255 0.9493
20.0002 20.0002 20.0000
0.2450 0.3177 0.2058
20.0003 20.0003 20.0003
1.5386 1.3455 1.4353
Rendemen (%) 3.71 4.03 5.27 4.34 ± 0.82 1.38 1.78 1.16 1.44 ± 0.31 8.54 7.46 7.97 7.99 ± 0.54
Contoh perhitungan: bobot ekstrak (g) x 100% bobot sampel g x (1 – kadar air) 2.1174 g = x 100% 20.0000 g x (1 – 0.07792) = 11.50%
Rendemen % =
23 Rendemen (ulangan 1 + ulangan 2 + ulangan 3) 3 11.50 + 11.36 + 10.47 % = 3 = 10.99%
Rerata rendemen % =
Standar deviasi =
– x)² n–1
n i=1 (x
(11.50 – 10.99)2 + (11.36 – 10.99)2 + (10.47 – 10.99)2 = 3–1 = 0.55
24 Lampiran 5 Kadar flavonoid total a) Kurva kalibrasi standar kuersetin sampel kenikir
Absorbans
Konsentrasi standar (µg/mL) 0 1 3 5 7 9 11 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
Absorbans 0.000 0.112 0.301 0.470 0.662 0.860 1.040
y = 0.0938x + 0.0097 R² = 0.9996
0
2
4
6
8
10
12
Konsentrasi (µg/mL)
b) Kurva kalibrasi standar kuersetin sampel rumput mutiara dan sirsak Konsentrasi standar (µg/mL) 0 0.5 1 3 5 7 9 11
Absorbans 0.000 0.035 0.071 0.229 0.389 0.543 0.704 0.869
1 y = 0.0790x - 0.0055 R² = 0.9999
Absorbans
0.8 0.6 0.4 0.2 0 -0.2 0
2
4
6
8
Konsentrasi (µg/mL)
10
12
25 c) Rerata kadar flavonoid ekstrak etanol 95% Sampel
Ulangan
Absorbans
1 0.794 2 0.835 3 0.838 Rerata kadar total flavonoid (mgQE/g) 1 0.390 Rumput 2 0.398 mutiara 3 0.390 Rerata kadar total flavonoid (mgQE/g) 1 0.294 Sirsak 2 0.268 3 0.267 Rerata kadar total flavonoid (mgQE/g) Kenikir
Kadar flavonoid awal(mg/L) 8.36 8.80 8.83 5.01 5.11 5.01 3.79 3.46 3.45
Kadar flavonoid total (mgQE/g) 4.17 4.39 4.41 4.33 ± 0.13 2.50 2.55 2.50 2.52 ± 0.03 1.90 1.73 1.73 1.78 ± 0.01
d) Rerata kadar flavonoid fraksi n-butanol Sampel
Ulangan
Absorbans
1 0.336 2 0.364 3 0.361 Rerata kadar total flavonoid (mgQE/g) 1 0.107 Rumput 2 0.107 mutiara 3 0.109 Rerata kadar total flavonoid (mgQE/g) 1 0.057 Sirsak 2 0.067 3 0.064 Rerata kadar total flavonoid (mgQE/g) Kenikir
Contoh perhitungan: Kadar flavonoid awal (mg/L) y = a + bx y = 0.0938x + 0.0097 y – 0.0097 x= 0.0938 0.794 – 0.0097 x= 0.0938 = 8.36 mg/L
Kadar flavonoid awal(mg/L) 3.48 3.78 3.75 1.42 1.42 1.45 0.79 0.92 0.88
Kadar flavonoid total (mgQE/g) 4.34 4.71 4.67 4.58 ± 0.20 1.77 1.77 1.81 1.78 ± 0.01 0.99 1.15 1.10 1.08 ± 0.08
26 volume contoh L x kadar flavonoid awal Kadar flavonoid total = 0.010 L x 8.36 =
mg L
mg L
x fp
bobot contoh (g) x 10
0.2003 g = 4.17 mg/g Rerata flavonoid total =
Standar deviasi =
Kadar flavonoid (ulangan 1 + ulangan 2 + ulangan 3) 3 4.17 + 4.39 + 4.41 mg/g = 3 = 4.33 mg/g
x – x)² n–1
n i=1 (
(4.17 – 4.33)2 + (4.39 – 4.33)2 + (4.41 – 4.33)2 = 3–1 = 0.13
27 Lampiran 6 Nilai IC50 uji antioksidan DPPH a) Persen inhibisi ekstrak etanol 95% Sampel
Kenikir
Rumput mutiara
Sirsak
Konsentrasi (µg/mL) 0 10 20 30 40 50 60 0 250 300 350 400 450 500 0 10 20 30 40 50 60
1 0.272 0.244 0.221 0.194 0.174 0.151 0.110 0.272 0.275 0.262 0.259 0.258 0.252 0.246 0.272 0.239 0.201 0.150 0.136 0.086 0.065
Absorbans 2 0.272 0.253 0.234 0.201 0.163 0.149 0.114 0.272 0.275 0.268 0.253 0.254 0.247 0.243 0.272 0.235 0.197 0.161 0.128 0.085 0.070
3 0.272 0.243 0.223 0.211 0.154 0.136 0.117 0.272 0.275 0.266 0.255 0.258 0.250 0.246 0.272 0.239 0.205 0.140 0.129 0.074 0.071
Absorbans 2 0.281 0.263 0.213 0.173 0.150 0.105 0.086 0.383 0.297 0.248 0.211 0.189 0.161 0.140 0.262 0.220 0.185 0.171 0.142 0.106 0.075
3 0.281 0.266 0.218 0.171 0.139 0.110 0.093 0.383 0.302 0.246 0.207 0.185 0.159 0.143 0.262 0.215 0.191 0.165 0.141 0.107 0.073
1 10.29 18.75 28.68 36.03 44.48 59.56 -0.01 3.68 4.78 5.15 7.35 9.56 12.13 26.10 44.85 50.00 68.38 76.10
% Inhibisi 2 6.98 13.97 26.10 40.07 45.22 58.09 -0.01 1.47 6.99 6.62 9.19 10.66 13.60 25.57 40.81 52.94 68.75 74.26
3 10.6 18.01 22.43 43.38 50.00 56.99 -0.01 2.21 6.25 5.15 8.09 9.56 12.13 24.63 48.53 52.57 72.79 73.90
1 6.41 22.06 38.08 50.53 60.50 67.97 21.41 33.94 42.56 51.96 54.57 63.45 16.03 26.34 38.93 48.09 63.74 77.10
% Inhibisi 2 6.41 24.20 38.43 46.62 62.63 69.40 22.45 35.25 44.91 50.65 57.96 63.45 16.03 29.39 34.73 45.80 59.54 71.37
3 5.34 22.42 39.15 50.53 60.85 66.90 21.15 35.77 45.95 51.70 58.49 62.66 17.94 27.10 37.02 46.18 59.16 72.14
b) Persen inhibisi fraksi n-butanol Sampel
Kenikir
Rumput mutiara
Sirsak
Konsentrasi (µg/mL) 0 1 5 10 15 20 25 0 25 50 75 100 125 150 0 10 15 20 25 30 35
1 0.281 0.263 0.219 0.174 0.139 0.111 0.090 0.383 0.301 0.253 0.220 0.184 0.174 0.140 0.262 0.220 0.193 0.160 0.136 0.095 0.060
28 Contoh perhitungan: absorbans blangko – absorbans sampel x 100% absorbans blangko 0.272 – 0.244 = x 100% 0.272 = 10.29 %
% Inhibisi =
c) Nilai IC50 ekstrak etanol 95% dengan metode DPPH Sampel
Ulangan 1 Kenikir 2 3 Rerata IC50 (µg/mL) Rumput mutiara 1 Sirsak 2 3 Rerata IC50 (µg/mL)
Persamaan regresi y = 0.9454x – 0.1225 y = 1.0378x – 4.5833 y = 0.9958x – 1.2745
R2 0.9875 0.9890 0.9612
IC50 (µg/mL) 53.02 52.60 51.49 52.37 ± 0.79 Tidak menunjukkan aktivitas antioksidan pada konsentrasi > 500 µg/mL y = 1.2910x + 1.0784 0.9830 37.89 y = 1.2542x + 2.4265 0.9902 37.93 y = 1.3067x + 1.6912 0.9525 36.97 37.60 ± 0.55
d) Nilai IC50 fraksi n-butanol dengan metode DPPH Sampel
Ulangan 1 Kenikir 2 3 Rerata IC50 (µg/mL) 1 Rumput 2 mutiara 3 Rerata IC50 (µg/mL) 1 Sirsak 2 3 Rerata IC50 (µg/mL)
Persamaan regresi y = 2.5511x + 8.6115 y = 2.5674x + 8.7602 y = 2.5422x + 8.6649
R2 0.9738 0.9762 0.9621
y = 0.3217x + 16.5013 y = 0.3187x + 17.8938 y = 0.3217x + 17.8068
0.9721 0.9744 0.9524
y = 2.4602x – 10.4435 y = 2.2072x – 7.2955 y = 2.1505x – 5.1291
0.9954 0.9937 0.9935
Contoh perhitungan: Persamaan regresi ekstrak etanol sampel kenikir y = a + bx y = – 0.1225 + 0.9454x y + 0.1225 x= 0.9454
IC50 (µg/mL) 16.22 16.06 16.26 16.18 ± 0.11 104.13 100.74 100.07 101.65 ± 2.18 24.57 25.96 25.64 25.39 ± 0.73
29 Nilai IC50 ekstrak etanol sampel kenikir 50 + 0.1225 = 53.02 µg/mL x= 0.9454 Nilai IC50 rerata ekstrak etanol sampel kenikir (IC50 )1 + (IC50 )2 + (IC50 )3 IC50 rerata = 3 53.02 + 52.60 + 51.49 µg/mL = 3 = 52.37 µg/mL
Standar deviasi =
x – x)² n–1
n i=1 (
53.02 – 52.37 2 + 52.60 – 52.37 2 + 51.49 – 52.37 3–1 = 0.79 =
2
30 Lampiran 7 Nilai LC50 uji BSLT a) Jumlah larva mati Sampel
Kenikir
Rumput mutiara
Sirsak
Konsentrasi (µg/mL) 84.4 168.8 211.0 232.1 253.2 318.8 478.2 637.6 797.0 956.4 70.8 94.4 141.6 188.8 236.0
1 1 4 6 7 9 1 3 4 7 8 3 4 7 8 9
Larva mati 2 3 2 1 3 3 6 6 7 8 8 9 2 2 3 3 4 4 6 6 8 8 3 3 5 5 6 6 7 8 8 9
1 3.72 4.75 5.25 5.52 6.28 3.72 4.48 4.75 5.52 5.84 4.48 4.75 5.52 5.84 6.28
Angka probit 2 3 4.16 3.72 4.48 4.48 5.25 5.25 5.52 5.84 5.84 6.28 4.16 4.16 4.48 4.48 4.75 4.75 5.25 5.25 5.84 5.84 4.48 4.48 5.00 5.00 5.25 5.25 5.52 5.84 5.84 6.28
b) Penentuan nilai LC50 dengan metode analisis probit Sampel
Ulangan 1 Kenikir 2 3 Rerata LC50 (µg/mL) 1 Rumput 2 mutiara 3 Rerata LC50 (µg/mL) 1 Sirsak 2 3 Rerata LC50 (µg/mL)
Persamaan regresi y = 4.7077x – 5.4856 y = 3.3268x – 2.4334 y = 4.9998x – 6.1327
R2 0.9048 0.8166 0.8688
y = 4.4205x – 7.4003 y = 3.3397x – 4.3682 y = 3.3397x – 4.3682
0.9726 0.9034 0.9034
y = 3.4865x – 2.0347 y = 2.3833x + 0.1536 y = 3.2431x – 1.5216
0.9899 0.9706 0.9664
Contoh perhitungan: Persamaan regresi sampel kenikir y = a + bx y = – 5.4856 + 4.7077x y + 5.4856 x= 4.7077
LC50 (µg/mL) 168.78 171.55 168.51 169.62 ± 1.68 638.53 638.41 638.41 638.45 ± 0.07 104.16 108.01 102.55 104.91 ± 2.81
31 Nilai LC50 ekstrak sampel kenikir 5 + 5.4856 = 2.2273 x= 4.7077 log-1 (x) = 168.78 µg/mL LC50 = 168.78 µg/mL Nilai LC50 rerata ekstrak sampel kenikir (LC50 )1 + (LC50 )2 + (LC50 )3 LC50 rerata = 3 168.78 + 171.55 + 168.51 µg/mL = 3 =169.62 µg/mL
Standar deviasi=
x – x)² n–1
n i=1 (
(168.78 –169.62)2 + (171.55 –169.62)2 + (168.51 – 169.62)2 3–1 = 1.68 =
32 Lampiran 8 Rendemen hasil kromatografi kolom ekstrak etanol 95% sirsak
Hijau +++
Bobot fraksi (g) 0.1382
Rendemen fraksi (%) 3.07
Hijau +++
0.3684
8.19
Hijau ++
0.3671
8.16
Hijau kekuningan
0.3443
7.65
Kuning keemasan
0.1633
3.63
Kuning ++
0.6392
14.20
Kuning +
0.5492
12.20
Jumlah(%)
57.10
Fraksi
Eluen
Warna
1
K K K:M (9:1) K:M (9:1) K:M (8:2) K:M (8:2) K:M (7:3) K:M (6:4) K:M (6:4) K:M (5:5) K:M (5:5) K:M (4:6)
2 3 4 5 6 7
Ket: bobot ekstrak = 4.5000 g Contoh perhitungan: bobot fraksi (g) Rendemen % = x 100% bobot ekstrak g 0.1382 g = x 100% 4.5000 g = 3.07 %
33 Lampiran 9 Nilai IC50 dan LC50 fraksi hasil kromatografi kolom ekstrak etanol 95% sirsak a) Nilai IC50 fraksi hasil kromatografi kolom dengan metode DPPH Fraksi 1 2 3 4
Ulangan
Persamaan regresi
R2
IC50 (µg/mL)
IC50 > 650 µg/mL
1 5 2 3 Rerata IC50 (µg/mL) 1 6 2 3 Rerata IC50 (µg/mL) 1 7 2 3 Rerata IC50 (µg/mL)
y = 0.7512x + 9.0260 0.9853 y = 0.7583x + 7.9060 0.9705 y = 0.7837x + 5.2902 0.9787 y = 0.5206x + 5.2444 0.9915 y = 0.5902x + 1.0667 0.9917 y = 0.5973x + 0.9778 0.9790 y = 0.5032x – 6.3303 0.9748 y = 0.4873x – 3.0080 0.9658 y = 0.4888x – 3.1777 0.9703
54.55 55.49 57.05 55.69 ± 1.27 85.97 82.91 82.07 83.65 ± 2.05 111.94 108.78 108.79 109.84 ± 1.82
b) Nilai LC50 fraksi hasil kromatografi kolom dengan metode analisis probit Fraksi 1
Ulangan
1 2 2 3 Rerata LC50 (µg/mL) 1 3 2 3 Rerata LC50 (µg/mL) 1 4 2 3 Rerata LC50 (µg/mL) 1 5 2 3 Rerata LC50 (µg/mL) 1 6 2 3 Rerata LC50 (µg/mL)
Persamaan regresi R2 LC50 > 3000 µg/mL y = 2.0730x + 4.8186 0.8921 y = 1.9647x + 4.8959 0.9331 y = 2.0074x + 4.9407 0.9652 y = 2.8798x + 6.0459 y = 3.1239x + 6.1974 y = 3.1257x + 6.2481
0.9289 0.9569 0.9825
y = 2.4627x + 5.0873 y = 2.5170x + 5.1350 y = 2.8258x + 5.0836
0.9275 0.9721 0.8568
y = 2.2254x + 0.1898 y = 1.9280x + 0.7546 y = 2.5788x – 0.6596
0.8610 0.9206 0.9984
y = 2.7992x – 1.7245 y = 2.4407x – 0.8962 y = 3.6456x – 3.7431
0.8121 0.9298 0.9568
LC50 (µg/mL) 1.22 1.13 1.07 1.14 ± 0.08 0.43 0.41 0.40 0.42 ± 0.02 0.92 0.88 0.93 0.91 ± 0.03 145.04 159.21 156.55 153.60 ± 7.53 252.52 260.48 250.18 254.40 ± 5.40
34 1 2 3 Rerata LC50 (µg/mL) 7
y = 1.0040x + 1.5415 y = 1.0040x + 1.5415 y = 1.0381x + 1.4868
0.8358 0.8358 0.8467
2784.33 2784.33 2422.48 2663.71 ± 208.92
Contoh perhitungan (LC50 fraksi 2): Persamaan regresi y = a + bx y = 2.0730x + 4.8186 y – 4.8186 x= 2.0730 Nilai LC50 ekstrak sampel kenikir 5 – 4.8186 = 0.0875 x= 2.0730 log-1 x = 1.22 µg/mL LC50 = 1.22 µg/mL Nilai LC50 rerata ekstrak sampel kenikir (LC50 )1 + (LC50 )2 + (LC50 )3 LC50 rerata = 3 1.22 + 1.13 + 1.07 µg/mL = 3 = 1.14 µg/mL
Standar deviasi =
x – x)² n–1
n i=1 (
(1.22 – 1.14)2 + (1.13 – 1.14)2 + (11.07 – 1.14)2 = 3–1 = 0.08
35 Lampiran 10 Nilai IC50 hasil uji sitotoksik terhadap sel MCF-7 Sampel
Konsentrasi (µg/mL) 0.00 6.25 12.50 25.00 Fraksi 5 50.00 100.00 200.00 400.00 800.00 Persamaan regresi R2 IC50 (µg/mL)
1 0.514 0.410 0.433 0.377 0.353 0.327 0.183 0.128 0.029
Absorbans 2 3 0.518 0.513 0.464 0.403 0.402 0.449 0.419 0.458 0.342 0.377 0.370 0.388 0.232 0.237 0.184 0.177 0.030 0.036
Rerata % absrobans Inhibisi 0.515 ± 0.00 0.426 ± 0.03 17.35 0.428± 0.02 16.89 0.418 ± 0.04 18.8 0.357 ± 0.02 30.61 0.362 ± 0.03 29.78 0.217 ± 0.03 57.80 0.163 ± 0.03 68.35 0.032 ± 0.00 93.85 y = 0.0986x + 22.0340 0.9168 283.63
Contoh perhitungan: Absorbans (ulangan 1 + ulangan 2 + ulangan 3) 3 0.303 + 0.370 + 0.354 = 3 = 0.342
Rerata absorbans =
Standar deviasi =
x – x)² n–1
n i=1 (
(0.303 – 0.342)2 + (0.370 – 0.342)2 + (0.354 – 0.342)2 = 3–1 = 0.04 absorbans blangko – absorbans sampel x 100% absorbans blangko 0.5150 – 0.3423 = x 100% 0.5150 = 33.53 %
% Inhibisi =
Persamaan regresi: y = a + bx y = 0.1737x + 42.4223 y – 42.4223 x= 0.1737 Nilai IC50 ekstrak etanol 95% sirsak 50 – 42.4223 x= = 43.63 µg/mL 0.1737
36 Lampiran 11 Spektrum FTIR dan UV ekstrak kasar etanol 95% sirsak
Regang O-H
Regang C=C
Regang C-H
Spektrum FTIR
λ=230.4 nm
Spektrum UV-tampak
Regang C-O
37
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Depok pada tanggal 11 April 1992. Penulis merupakan putri kedua dari dua bersaudara pasangan Bapak Mamat Ruhimat dan Ibu Anik Susiana. Penulis menempuh jenjang pendidikan atas di SMA Negeri 5 Bogor dan lulus pada tahun 2009. Pada tahun yang sama, penulis menjadi mahasiswi di Akademi Kimia Analisis (AKA) Bogor dan lulus pada tahun 2012. Selama menjalani pendidikan diploma tiga, penulis aktif mengikuti kegiatan kemahasiswaan dan menjadi ketua Paduan Suara Mahasiswa AKA (Suvarnagita) masa jabatan 2010-2011. Selain itu penulis mengikuti kegiatan Pelatihan Pengantar Sistem Manajemen Lingkungan (ISO 14001) dan Pelatihan Pengantar Sistem Manajemen Mutu (ISO 9001:2001). Penulis melakukan Praktik Kerja Lapang (PKL) di Pusat Penelitian Limnologi-LIPI, Bogor dengan judul Penetapan Konsentrasi Fosfat untuk Menentukan Kemampuan Sedimen Sungai dan Sawah dalam Menjerap Fosfat secara Spektrofotometri UV-tampak. Selama masa studi di IPB, penulis pernah menjadi asisten praktikum Asas Kimia Analitik, Departemen Kimia IPB tahun ajaran 2014-2015.
