A SZALICILSAV-FÜGGŐ VÉDEKEZÉSI MECHANIZMUSOK ÉS A STRESSZTOLERANCIA KAPCSOLATÁNAK VIZSGÁLATA BÚZÁBAN
KOVÁCS VIKTÓRIA
ELTE Biológia Doktori Iskola (Dr. Erdei Anna) Kísérletes Növénybiológia Doktori Program (Dr. Szigeti Zoltán)
Témavezetők:
Dr. Pál Magda
Dr. Janda Tibor
tudományos főmunkatárs
tudományos tanácsadó
Martonvásár 2014
1
TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ................................................................................................. 5 1. BEVEZETÉS ........................................................................................................................ 7 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ................................................................................................ 8 2.1. Általánosságban a növények és stressz kapcsolatáról ......................................................... 8 2.2. A növények védekező rendszere. ........................................................................................ 9 2.2.1 Az enzimatikus védekezőrendszer .................................................................................. 10 2.2.2 . A nem-enzimatikus védekező rendszer ......................................................................... 16 Aszkorbát. ................................................................................................................................. 16 Fenolok ..................................................................................................................................... 16 2.2.3. Védelemben szerepet játszó egyéb vegyületek .............................................................. 17 Poliaminok................................................................................................................................ 17 2.3. Biotikus és abiotikus stresszorok okozta változások ......................................................... 18 2.3.1. A lisztharmatfertőzés hatásai .......................................................................................... 18 2.3.2. A kadmiumstressz hatásai .............................................................................................. 20 2.3.3. A szárazságstressz hatásai .............................................................................................. 22 2.3.4. Az UV-B sugárzás hatásai .............................................................................................. 24 2.4. Szalicilsav a növényekben ................................................................................................. 26 2.4.1. A szalicilsav élettani hatásai ........................................................................................... 26 2.4.2. A szalicilsav bioszintézise ............................................................................................. 27 2.4.3. A szalicilsav szerepe biotikus és abiotikus stresszek során............................................ 29 2.4.4. A szalicilsav hatásmechanizmusa és annak szabályozása .............................................. 32 3. KUTATÁSI CÉL ............................................................................................................... 37 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ...................................................................................... 38 4.1. Növényi anyag, növénynevelés, kezelések paraméterei .................................................... 38 4.1.1. Búza növények nevelése és kezelése földben ................................................................ 38 Szántóföldi kísérlet ................................................................................................................... 38 Üvegházi kísérlet ...................................................................................................................... 38 4.1.2. Búzanövények nevelése és kezelése tápoldaton ............................................................. 40 4.2. Vizuális morfológiai változások értékelése ....................................................................... 42 Lisztharmat-fertőzöttség mértékének fenotípusos meghatározása ........................................... 42 Levélcsavarodás mértékének pontozása PEG-kezelt növényeken ........................................... 42 4.3. Relatív klorofilltartalom mérése ........................................................................................ 42
2
4.4. Klorofill fluoreszcencia indukció mérése .......................................................................... 43 4.5. Szalicilsav-extrakció és mennyiségi analízis..................................................................... 43 4.6. Poliaminok mennyiségi analízise ...................................................................................... 45 4.7. Korizmát-szintázt és izokorizmát-szintázt kódoló gének (CS és ICS) kifejeződésének vizsgálata valós idejű PCR-rel .................................................................................................. 46 4.8. A fenilalanin-ammónia-liáz (PAL) aktivitásának meghatározása ..................................... 46 4.9. Antioxidáns enzimek kivonása és aktivitás mérése........................................................... 47 4.9.1. Glutation-reduktáz .......................................................................................................... 47 4.9.2. Glutation-S-transzferáz................................................................................................... 47 4.9.3. Kataláz ............................................................................................................................ 48 4.9.4. Aszkorbát-peroxidáz....................................................................................................... 48 4.9.5. Gvajakol-peroxidáz ........................................................................................................ 48 4.9.6. Monodehidro-aszkorbát-reduktáz................................................................................... 48 4.10. Prolintartalom meghatározása ......................................................................................... 49 4.11. Lipidperoxidáció meghatározása ..................................................................................... 49 4.12. Statisztikai analízis .......................................................................................................... 50 5. EREDMÉNYEK ................................................................................................................. 51 5.1. Levélrozsda- és lisztharmatfertőzés hatásainak vizsgálata nagyszámú búza genotípusban szántóföldi körülmények között ............................................................................................... 51 5.2. Lisztharmatfertőzés hatásai búza genotípusokban üvegházi körülmények között ............ 56 5.2.1. A lisztharmatfertőzés hatásai szelektált, fiatalkori búza genotípusokra ......................... 56 5.2.2. A lisztharmatfertőzés hatásai felnőttkori Thatcher-alapú közel izogén búza vonalakra 60 5.3. Különböző abiotikus stresszek hatásai négy, eltérő SA-tartalmú búza genotípusra ......... 65 5.3.1. A kadmium hatásai ......................................................................................................... 65 5.3.2. A PEG-kezelés hatásai ................................................................................................... 73 5.4. Az UV-B sugárzás, Cd- és/vagy PEG-kezelés önálló, illetve kombinált hatásai búzanövényekre ........................................................................................................................ 79 5.4.1. Morfológiai változások ................................................................................................... 79 5.4.2. Változások a prolintartalomban ...................................................................................... 81 5.4.3. Változások az MDA-tartalomban ................................................................................... 82 5.4.4. A különböző kezelések hatásai az oHCA- és SA-tartalomra ......................................... 83 5.4.5. Változások a PAL aktivitásában ..................................................................................... 84 5.4.6. Változások az antioxidáns enzimek aktivitásában ......................................................... 85 6. EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA .................................................................................. 87
3
6.1. Nagyszámú búzagenotípus vizsgálata szántóföldi körülmények között ........................... 87 6.2. Biotikus stressz hatásai 4 különböző búzagenotípusban ................................................... 89 6.3. Különböző abiotikus stresszek hatásai búzában ................................................................ 93 6.3.1. Különböző koncentrációjú Cd hatásai búzanövényekben .............................................. 93 6.3.2. A PEG-kezelés hatásai búzanövényekre ...................................................................... 100 6.3.3. Az UV-B sugárzás hatásai Cd- vagy PEG-kezelt búzában .......................................... 105 7. ÖSSZEFOGLALÁS ......................................................................................................... 109 8. SUMMARY ....................................................................................................................... 111 9. FELHASZNÁLT IRODALOM ...................................................................................... 113 PUBLIKÁCIÓS JEGYZÉK. ............................................................................................... 141 Az értekezés alapjául szolgáló publikációk ............................................................................ 141 Az értekezés témájához közvetlenül nem kapcsolódó publikációk ....................................... 143 Köszönetnyilvánítás ............................................................................................................... 144
4
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ACN:
acetonitril
AGM:
agmatin
APX:
aszkorbát-peroxidáz
ASC:
aszkorbát
BA:
benzoesav
CAD:
kadaverin
CS:
korizmát-szintáz
DHA:
dehidroszkorbát
DHAR:
dehidroaszkorbát-reduktáz
DTNB:
5,5´-ditio-bis-(2-nitro-benzoesav)
EDTA:
etiléndiamin-tetraecetsav
Fm’:
maximális fluoreszcencia fényadaptált állapotban
Fs:
steady state fluoreszcencia fényadaptált állapotban
G-POD, POD:
(gvajakol-)peroxidáz
GR:
glutation-reduktáz
GSH:
redukált glutation
GSSG:
oxidált glutation
GST:
glutation-S-transzferáz
γ-EC:
γ-glutamil-cisztein
ICS:
izokorizmát-szintáz
KAT:
kataláz
MDA:
malondialdehid
MDHA:
monodehidro-aszkorbát
MDHAR:
monodehidroxiaszkorbát-reduktáz
MeOH:
metanol
NADH:
β-nikotinsavamid-adenin-dinukleotid, redukált
NADP+:
β-nikotinsavamid-adenin-dinukleotid-foszfat, oxidált
NADPH:
β-nikotinsavamid-adenin-dinukleotid-foszfat, redukált
NahG:
szalicilát-hidroxiláz enzimet kódoló gén
oANI:
orto-anizinsav
oHCA:
orto-hidroxifahéjsav, orto-kumársav
PA:
poliamin
5
PAL:
fenilalanin-ammónia-liáz
PC:
fitokelatin
PCS:
fitokelatin-szintáz
pHBA:
para-hidroxi-benzoesav
PPFD:
fotoszintetikus foton áram sűrűség (photosynthetic photon flux density)
PS I:
első fotokémiai rendszer
PS II:
második fotokémiai rendszer
PUFA:
többszörösen telítetlen zsírsav (polyunsaturated fatty acid)
PUT:
putreszcin
PVP:
polivinil-pirrolidon
ROS:
reaktív oxigénformák (reactive oxygen species)
Rubisco:
ribulóz-1,5-bifoszfát-karboxiláz/oxigenáz
SA:
szalicilsav
SAR:
szisztemikus szerzett rezisztencia (systemic acquired resistance)
SPD:
spermidin
SPN:
spermin
TBA:
tiobarbitursav
TCA:
triklór-ecetsav
6
1. BEVEZETÉS Napjaink egyik legfontosabb kérdése, hogy lesz-e elegendő élelmiszer bolygónk egyre növekvő lakossága számára. Évről évre súlyos élelmiszeripari és gazdasági károkat eredményeznek a szélsőséges időjárás okozta változások, úgymint az aszály, az egyre erőteljesebb UV-B és -C sugárzás, a hatalmas szélviharok, az ár- és belvizek, az enyhe telek és az ezek következtében felszaporodó kártevők, valamint a gyorsan módosuló patogén ágensek élelmezésre használt növényeink termésminőségére és termésmennyiségére kifejtett negatív hatásai. Szerte a világon szakemberek ezrei dolgoznak azon, hogy a különböző gyümölcs-, zöldség- és gabonaféléket ellenállóbbá tegyék egy vagy inkább több károsító tényezővel szemben lehetőleg termésveszteség nélkül, sőt inkább növelve az áruba bocsátható termékek mennyiségét. A másik kérdés, hogy a megtermelt növények és a belőlük készített élelmiszerek milyen minőségűek. Ma már sokan gondolják úgy, nem elegendő a létfenntartásunk számára kielégítő táplálékhoz jutnunk, hanem annak az emberi egészség számára még hasznosabbnak kell lennie. Részben ez a gondolat motiválja azokat a kutatásokat, amelyek során például egy-egy növény fehérjetartalmát még jobban megemelik (banán, szója), amelyeknek főleg az éhínség által sújtott országokban van nagy jövője; vagy a termés aminosav-tartalmát az emberi szervezet számára felhasználható legideálisabb összetételűvé alakítják. Hasonló jelentőségű terület a növények általi vakcina-termeltetés is. Annak érdekében, hogy a növények minőségét úgy befolyásoljuk, hogy azok sokkel egészségesebbek és hasznosabbak legyenek az emberi egészség számára, nem szükséges rögvest genetikailag módosított növényeket előállítanunk és használnunk. Számos gyógyszerünk előde növényi eredetű volt és hatóanyagaikat ma is használjuk. Ilyen például a szalicilsav (SA) is, melynek acetilált formája Aspirin néven közismert láz- és fájdalomcsillapító, melyet nemcsak a fűzfák tartalmazzák, hanem más növények is. Hasznossága a humán gyógyászatban vitathatatlan. Ha a növényeket kezeljük vele (exogén módon), sok esetben, koncentrációtól és fajtól függően, védi azokat a káros hatásoktól, például a hidegtől. De mi a helyzet a növény saját SA-tartalmával? Ha a növény nagyobb mennyiségben tartalmazza, akkor ugyanolyan ellenálló lesz, mintha kívülről kapná a SA-at? Esetleg még ellenállóbb lesz, vagy a SA mennyiségének nincs jelentősége a különféle károsító hatásokkal szembeni ellenállóképesség szempontjából? A felmerülő kérdések miatt jelen kutatás célja a búza különböző stresszkörülmények között adott élettani válaszainak jobb megismerése az endogén SA-szintjük tükrében.
7
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1 . Általánosságban a növények és a stressz kapcsolatáról A növényi stressz ma elfogadott definíciója a következő: „a stressz az a fiziológiai állapot, amelyben a növények növekedése, fejlődése és szaporodása a környezeti terhelés miatt
a
genomban
meghatározott
lehetőségek
alatt
marad”
(Larcher
1987-ben
megfogalmazott definíciója alapján). Vagyis a növény környezetének (abiotikus) tényezői mint pl. a hőmérséklet, a fény, a páratartalom, a levegő-, víz- és talajminőség, valamint a különböző élőlények (biotikus tényezők), mint az egyéb növények, az ember, az állatok, gombák, baktériumok, vírusok - kisebb-nagyobb mértékben eltolják a növények életterének minőségét az optimálistól a kedvezőtlenebb (ún. pejus), esetleg a rossz tartományba. Ez a növények számára stresszhelyzetet jelent, amikor is attól függően, hogy egy stresszor (stresszt kiváltó tényező) mennyi ideig és milyen mértékben van jelen, illetve a genomjában kódolva a növénynek milyen mértékű védekezésre van lehetősége az adott stresszorral szemben, a növény alkalmazkodhat, akklimálódhat, majd akklimatizálódhat a kialakult kedvezőtlen helyzethez. Ez úgy lehetséges, hogy a növény a stresszort vagy elkerüli, mint a lombhullató fák a téli fagyok okozta károsodásokat lombkoronájuk elvesztésével és anyagcseréjük drasztikus csökkentésével, vagy pedig ellenáll neki, tolerálja azt. A különböző stresszek általános, illetve az adott stresszorra jellemző, speciális folyamatokat egyaránt beindítanak a növényi testben, melyek közötti kapcsolat azonban sok esetben még nem tisztázott. Általánosnak tekinthetők az elsődleges stresszek (alacsony vagy magas hőmérséklet, szárazság, só, nehézfémek) által kiváltott másodlagos stresszekre (pl. ozmotikus-, oxidatív stresszre) adott válaszok főbb folyamatai, pl. az utóbbi esetében keletkező reaktív oxigénformák (ROS) semlegesítéséért felelős mechanizmusok és azok szabályozásában részt vevő jelátviteli utak működése. Ezt bizonyítja például az is, hogy számos tanulmány szerint az abiotikus és biotikus stresszek általánosan csökkentik a növények növekedését és terméshozamát (Kaur és Gupta, 2005; Manickavelu és mtsai, 2010; Sepehri és Golparvar, 2011; van Ginkel és Ogbonnaya, 2007), amely világszerte komoly gazdasági károkat okoz. Speciális válasznak tekinthető viszont az, hogy a fent említett általános folyamatok elemei vajon melyik növényben, növényfajban milyen mértékben vesznek részt a védelemben. Ez a növényvédelemmel és nemesítéssel foglalkozó szakemberek számára különösen fontos kérdés. Minél többet tudunk ezekről a védelmi mechanizmusokról, annál célzottabban lehet
8
egy-egy, sőt egyszerre akár több, a növényeket, különösen a gabonaféléket károsító tényezővel szembeni rezisztencia növelésének érdekében kutatásokat végezni. 2.2 . A növények védekező rendszere A növényen belül a stresszorok által okozott változások a morfológiai, élettani, molekuláris és genetikai szinteken egyaránt megmutatkoznak. A stresszindukált gének termékeinek egyik csoportját olyan anyagok alkotják, melyek közvetlen védelmet nyújthatnak a stresszekkel szemben, mint például a különböző ozmoprotektánsok szintézisére reagáló enzimek, antifreeze (fagyásvédő vagy fagyásgátló) fehérjék, chaperonok (dajkafehérjék) és detoxifikáló enzimek. A másik csoportja magába foglalja a génexpressziós és jelátviteli útvonalakat, melybe beletartoznak pl. a transzkripciós faktorok, protein kinázok és a foszfoinozitid anyagcsere enzimei (Kaur és Gupta, 2005). A másodlagosan jelentkező oxidatív stressz a normális növényi anyagcsere (pl. a légzés és a fotoszintézis) működése során, valamint stressz hatására, a molekuláris oxigénből (O2) keletkező ROS-ok túlzott mértékű felszaporodása miatt alakul ki (1. ábra).
1. ábra: A reaktív oxigénformák (ROS) keletkezésének sematikus ábrája (Sharma és mtsai, 2012 után).
Az O2 aktivációja két különböző úton történhet (1. ábra). Az O2 lépcsőzetes, monovalens redukciója szuperoxid aniongyök (O2•−), hidrogén-peroxid (H2O2), majd hidroxilgyök (•OH) keletkezéséhez vezet, míg az O2 energia-abszorpciója során szinglet
9
oxigén (1O2) keletkezik. A szuperoxid aniongyök nem enzimatikusan könnyen, spontán H2O2dá dizmutálódik, de ezt a reakciót a szuperoxid-dizmutáz (SOD) enzim is katalizálhatja. A H2O2 vízzé történő átalakítását a kataláz (KAT), a gvajakol-peroxidáz (G-POD, POD) és az aszkorbát-peroxidáz (APX) végzi (Sharma és mtsai, 2012). A ROS természetétől függően egyes típusok rendkívül toxikusak (pl. a O2•−). A különböző stresszorok (nehézfémek, szárazság, patogének, stb.) fokozzák felhalmozódásukat. Az intracelluláris ROS fokozott mennyisége már károsíthatja a sejtszerkezetet, a fehérjéket, lipideket, szénhidrátokat és nukleinsavakat is, mely végső soron oxidatív stresszt okoz (Gill és Tuteja, 2010b; Kocsy és mtsai, 2011). Ennek elkerülése érdekében a sejtek enzimatikus (a fent említett ROS-t átalakító/eltávolító
enzimek)
és
nem-enzimatikus
antioxidáns
folyamatai
gyorsan
detoxifikálják ezeket. Egyfelől a növények különböző mechanizmusokkal védekeznek az abiotikus és biotikus stresszek által megemelt ROS szintek okozta károsodások ellen. Másfelől viszont maguk is ROS-okat termelnek (H2O2) az aerob anyagcsere során, melyeket mint szignál molekulákat használják a különböző folyamatok, úgymint a patogének elleni védelem, a programozott sejthalál és a sztómák viselkedésének irányítására (Apel és Hirt, 2004; Gechev és mtsai, 2006; Karuppanapandian és mtsai, 2011; Sharma és mtsai, 2012). 2.2.1 Az enzimatikus védekezőrendszer Az alábbi fejezetben felsorolt enzimek (1. táblázat) közös jellemzője, hogy a különböző ROS-okat és egyéb gyököket eltávolítják az adott növényi részből. Enzim
EC szám
Katalizált reakció ·-
·-
szuperoxid-dizmutáz
1.15.1.1
O2 + O2 + H+ ↔ 2H2O2 + O2
kataláz
1.11.1.6
2H2O2 ↔ O2 + 2H2O
glutation-peroxidáz
1.11.1.12
2GSH + PUFA-OOH ↔ GSSG + PUFA + 2H2O
glutation-S-transzferáz
2.5.1.18
RX + GSH ↔ HX + R-S-GSH*
foszfolipid-hidroperoxid glutation-peroxidáz
1.11.1.9
2GSH + PUFA-OOH (H2O2) ↔ GSSG + 2H2O**
aszkorbát-peroxidáz
1.11.1.11
AA + H2O2 ↔ DHA + 2H2O
peroxidázok (pl. gvajakol-peroxidáz)
1.11.1.7
Donor + H2O2 ↔ oxidált donor + 2H2O***
monodehidroaszkorbát-reduktáz
1.6.5.4
NADPH + 2MDHA ↔ NADP+ + 2AA
dehidroaszkorbát-reduktáz
1.8.5.1
2GSH + DHA ↔ GSSG + AA
glutation-reduktáz
1.6.4.2
NADPH + GSSG ↔ NADP+ + 2GSH
* az R lehet alifás, aromás vagy heterociklusos csoport; az X lehet szulfát, nitrit vagy halogenid csoport ** a reakció H2O2-dal lassú *** az AA elektrondonorként szerepelhet
1. táblázat: A ROS eltávolító és detoxifikáló enzimek és az általuk katalizált reakciók (Blokhina és mtsai, 2003 után).
10
Ez több módon történhet. Az első esetben az enzim teljesen hatástalanítja a káros gyököt, ilyenek a peroxidázok és a KAT, melyek a H2O2-ot vízzé bontják. A második lehetőség, hogy a ROS-t olyan formává alakítják át, melyet más enzimek már hatástalanítani tudnak (pl. a SOD). A harmadik lehetőség a reaktív gyök konjugátum képzése és áthelyezése, bezárása pl. a vakuólumba (glutation-S-transzferáz, GST).
2.2.1.1 Az aszkorbát-glutation ciklus
2. ábra: Az aszkorbát-glutation ciklus (Locato és mtsai, 2013). A fehér négyzetekben levő enzimek az állati és növényi sejtekben egyaránt aktívak, a szürke négyzetben levő kizárólag a növényekben van jelen.
APX:
aszkorbát-peroxidáz; MDHAR: monodehidroaszkorbát-reduktáz; DHAR: dehidroaszkorbát-reduktáz; GR: glutation-reduktáz.
Az aszkorbát-glutation ciklus, más néven a Foyer-Halliwell-Asada ciklus (2. ábra) végzi a kloroplasztiszokban keletkező H2O2 semlegesítését, mivel itt nincs KAT-aktivitás. A ciklus elemei az aszkorbát és a glutation oxidált és redukált formái, illetve az ezeket átalakító vagy felhasználó enzimek, név szerint az APX, a monodehidroaszkorbát-reduktáz (MDHAR), a dehidroaszkorbát-reduktáz (DHAR) és a glutation-reduktáz (GR). Aszkorbát-peroxidáz (EC 1.11.1.11) Az APX egy olyan vastartalmú protein, mely erősen specifikus az aszkorbátra (ASC) mint elektrondonorra. Az aszkorbát-glutation ciklusban a H2O2 vízzé történő bontását katalizálja az alábbi reakció szerint: 2 ASC + H2O2 → 2 DHA + 2 H2O
11
Különböző APX izoformák találhatóak a szubcelluláris sejtszervecskékben, úgymint a kloroplasztiszokban, a mitokondriumokban, a peroxiszómákban és magában a citoszólban (Caverzan és mtsai, 2012), melyeknek mint védő elemeknek, fontos és közvetlen szerepük van a különböző környezeti stresszekkel szemben. Monodehidroaszkorbát-reduktáz (EC 1.6.5.4)
A MDHAR az egyszeresen oxidált ASC-t (monodehidro-aszkorbát, MDHA) NADP(H) jelenlétében közvetlenül regenerálja, amely azonban maga is egy eredményes elektron akceptor (Asada, 2006; Noctor és Foyer, 1998). Az MDHA közvetlenül aszkorbáttá történő
redukciója
felhasználásával
a
megy
fotoszintetikus végbe.
elektrontranszportláncból
Akárcsak
az
APX,
a
származó
kloroplasztiszon
elektron kívül
a
mitokondriumokban és a peroxiszómákban is megtalálható, ahol a H2O2 eltávolítását végzi (Mittler, 2002). Azt is leírták, hogy a megnövekedett MDHAR-aktivitás hozzájárul a paradicsom hidegtűréséhez (Stevens és mtsai, 2008). Egy hetes zöld- és feketebabnövényekben (Vigna mungo L. Hepper cv. Co4) n a Cr3+ és Cr6+ fokozta a MDHAR aktivitását (Karuppanapandian és Manoharan, 2008).
Dehidroaszkorbát-reduktáz (EC 1.8.5.1) A DHAR a kétszeresen oxidált ASC-t (dehidroaszkorbát, DHA) közvetlenül regenerálja miközben a GSH-t oxidálja. Az ASC újrahasznosításának fontos szabályozójaként szolgál. Az APX által oxidált ASC először MDHA-tá oxidálódik, ami spontán diszproporcionálódás vagy újabb oxidáció során DHA-tá alakul, melyet a DHAR redukál vissza ASC-tá. A DHAR sebesség-korlátozó mennyiségben expresszálódik és hozzájárul a szimplasztikus, illetve apoplasztikus ASC pool méretének és a redox állapotának szabályozásához (Chen és Gallie, 2006). Nagy mértékű kifejeződése fokozza a dohány- és Arabidopsis-növények ellenállását a környezeti stresszekkel szemben (Chen és Gallie, 2006; Eltayeb és mtsai, 2007).
Glutation-reduktáz (EC 1.6.4.2) A GR egy NADPH-függő heterotetramer enzim, mely bár a növényben több helyen is előfordul (citoszólban, mitokodriumokban, kukoricában a mezofill sejtekben) (Doulis és
12
mtsai, 1997), a legnagyobb aktivitást az aszkorbát-glutation ciklushoz kötődve a kloroplasztiszban mutatja. Itt a DHAR enzimmel ellentétesen működve a GSSG → GSH átalakulást katalizálja az alábbiak szerint: GSSG + NADPH + H+ → 2 GSH + NADP+ Ennek további jelentősége, hogy működése révén befolyásolja a DHAR működését is, így befolyásolja a GSH:GSSG arány szabályozását, ezáltal a sejt redox állapotát, továbbá a DHAR-on keresztül szerepe van a DHA → ASC átalakulásban, amely a H2O2 további detoxifikációját segíti elő és beindítja a különböző védekező folyamatokat (Szalai és mtsai, 2009). Ennek jelentősége különösen stressznek kitett növényekben mutatkozik meg, ahol a GR általában fokozott aktivitást mutat, melynek szerepe lehet a stresszel szembeni ellenállóképesség kialakulásában (Kocsy és mtsai, 2001). 2.2.1.2 . Egyéb antioxidáns enzimek Szuperoxid-dizmutáz (EC 1.15.1.1) Ez a fémtartalmú enzim a szuperoxid-aniongyök dizmutációval történő átalakítását katalizálja oxigénné és H2O2-dá az alábbi reakcióban: 2 O2˙¯ + 2 H+ → O2 + H2O2 Minden
aerob
szervezetben
megtalálható;
növényekben
a
kloroplasztiszokban,
a
mitokondriumokban, a glioxi- és peroxiszómákban szerepe különösen fontos, mivel itt képződhet szuperoxidgyök. Az enzim aktív oldalán található háromféle fémion, kofaktor alapján megkülönböztethetünk Cu/Zn-SOD-ot, mely feladatát a citoszólban, a kloroplasztisz sztómában és a peroxiszómában látja el; Mn-SOD-ot, mely szintén a peroxiszómában, valamint a mitokondrium mátrixában található; továbbá Fe-SOD-ot, mely elsősorban a prokariótákra jellemző, növényekben csak néhány család kloroplasztiszaiban fordul elő (Bowler és mtsai, 1994). A SOD-ok képezik az első védelmi vonalat a káros oxigénformák ellen. Transzgénikus réti csenkeszben a Cu/Zn-SOD-ot és az APX-t kódoló gének egyidejű túlexpresszáltatása megvédte a növényt az oxidatív stresszel szemben több abiotikus stressz esetén (Lee és mtsai, 2007). Ez az enzim nehézfémszennyezésre érzékeny, feketebab gyökerében krómkezelések hatására csökkent az aktivitása (Karuppanapandian és Manoharan, 2008).
13
Kataláz (EC 1.11.1.6) Ez a 4 alegységből felépülő hem-tartalmú enzim a legtöbb élőlényben előfordul. A H2O2-ot, annak koncentrációjától függően dizmutációval vízzé alakítja. Magas szubsztrátkoncentráció esetén a gyorsabb, úgynevezett katalitikus utat katalizálja: 2 H2O2 → 2 H2O + O2, míg alacsony szubsztrát-koncentráció (H2O210-6 M) mellett a peroxidatikus utat. Ebben az esetben H+-donorként különböző vegyületek (etanol, ASC, RH2) szerepelhetnek: RH2 + H2O2 → R + 2 H2O A KAT növényekben nagy mennyiségben megtalálható a peroxiszómákban, továbbá a citoszólban és a mitokondriumokban (Karuppanapandian és mtsai, 2011), viszont a kloroplasztiszban szerepét az APX veszi át. Bár több molekula H2O2 átalakítására képes, mégis kisebb az affinitása a H2O2-hoz, mint az APX-nak. A zárvatermőkben három gén kódolja a KAT-t (Sharma és mtsai, 2012). Willekens és mtsai (1995) a dohánygének expressziós mintázata alapján osztályozták ezt az enzimet. Az I. osztály KAT-ai a fotoszintetikus szövetekben fejeződnek ki és a fény által szabályozottak. A II. osztályba sorolt KAT-ok nagyobb mértékben expresszálódnak a szállítószövetekben, ugyanakkor a III. osztályba tartozó KAT-ok nagy mennyiségben vannak jelen a magokban és a fiatal magoncokban. A KAT aktivitása búzafélék gyökerében alacsonyabb, mint a levelekben. Rézzel szemben érzékeny durum növényekben Cu-kezelés hatására aktivitása megnőtt (Sgherri és mtsai, 2001). Gvajakol-peroxidáz (EC 1. 11.1.7) Ez az enzim a III. osztályba tartozó peroxidázok (POD-ok) közé tartozik, melyeket a növényekben multigén családok kódolnak. A csoport tagjai általában tartalmaznak egy ferriprotoporfirin IX prosztetikus csoportot. In vivo különböző fenolokat, fenolszármazékokat, míg in vitro sokféle vegyületet (gvajakol, pirogallol, benzoesav, stb.) oxidálnak (Mika és Lüthje, 2003). A laboratóriumi vizsgálatok során alkalmazott oxidálandó anyag alapján beszélhetünk gvajakol-peroxidázról, pirogallol-peroxidázról, stb. A következő reakciót katalizálják: DH2 + H2O2 (ROOH) → D + 2 H2O (ROH+H2O), ahol a DH2 az elektrondonor.
14
Fémtartalmúak, kb. 40-50 kDa nagyságú monomerekből épülnek fel. Az izoenzimek magas száma és a figyelemre méltó katalitikus sokoldalúságuk lehetővé teszi számukra, hogy részt vegyenek számos fiziológiai és fejlődési folyamatban a növény életciklusa során (Mika és Lüthje, 2003; Mika és mtsai, 2010; Passardi és mtsai, 2004; 2005). Megtalálhatóak a kloroplasztiszokban,
a
mitokondriumokban,
az
endoplazmatikus
retikulumban,
a
vakuólumban, a sejtfalban és a citoszólban (Karuppanapandian és mtsai, 2011). Részt vesznek az etilén képződésében, az auxin katabolizmusában – amely hormonnak kritikus szerepe van a növényi növekedésben és fejlődésben –, a ROS-ok (szuperoxid, hidroxil gyök) képződésében, illetve eliminálásában és egyéb öregedési folyamatokban. Kiemelkedő szerepet játszanak a patogén organizmusokkal szembeni védekezésben. Aktivitásuk fokozódását figyelték meg babban Pseudomonas syringae pv. phaseolica (Ádám és mtsai, 1995), uborkában Colletotrichum lagenarium (Dalisay és Kuć, 1995), napraforgóban Alternaria helianthi (Anjana és mtsai, 2007), illetve búzában sárga- vagy csíkosrozsda-fertőzést (Asthir és mtsai, 2010; Flott és mtsai, 1989) követően. A POD-ok sejtvédő hatása elsősorban az enzimreakció során létrejött oxidált termékek fiziológiai szerepében rejlik, de nem elhanyagolható a H2O2 semlegesítésének jelentősége sem.
Glutation-S-transzferáz (EC 2.5.1.18) A GST számos fehérje összefoglaló neve, melyeket egy rendkívül divergens, ősi géncsalád kódol. Ezek a citoszólban található enzimek oldható dimerekből épülnek fel, melyek mindegyike rendelkezik aktív kötőhellyel, ami glutation és hidrofób ligandumok megkötésére képes. A GST-k a glutationfüggő izomerizációkat, a toxikus szerves hidroperoxidok redukcióját, illetve különféle herbicidek konjugációját és detoxifikációját katalizálják, eközben kofaktorként GSH-t használnak (Dixon és mtsai, 2010). A növényi GST-k a GSH-t elektrofil xenobiotikumokhoz kötik, ezáltal megjelölve azokat a vakuoláris szekrécióhoz. Továbbá a másodlagos anyagcseretermékek és származékaik (reaktív oxilipinek, fenolok és flavonoidok) nem-katalitikus szállítását és tárolását végzik (Dixon és mtsai, 2010; Edwards és mtsai, 2000), úgymint az antocianinok vakuólumokba történő transzportálását (Sakihama és mtsai, 2002). Ezen kívül részt vesznek a kéntartalmú másodlagos anyagcsere-termékek (egyes illóanyagok és glükózinolátok) szintézisében is.
15
2.2.2 . A nem-enzimatikus védekező rendszer A nem-enzimatikus védelmi rendszer tagjai közé különböző kis molekulatömegű vegyületek tartoznak. Ide sorolhatóak egyes vitaminok (ASC, tokoferol, A- és K-vitamin), karotinoidok (pl. β-karotin), alkaloidok,
tiolvegyületek (cisztein, GSH, stb.), fenolos
vegyületek (fahéjsav és benzoesav származékok), flavonoidok (kvercetin, miricetin, rutin) és egyes nyomelemek (cink, vas, szelén) is (Gratão és mtsai, 2005; Valko és mtsai., 2006). A teljesség igénye nélkül bővebben csak az ASC, valamint a 2.4. fejezetben a dolgozatban szereplő fenolvegyületek közé tartozó szalicilsav (SA) és annak prekurzorai kerülnek bemutatásra. Aszkorbát Az ASC-ot (aszkorbinsav, C-vitamin) az 1900-as évek elején hexuronsav néven írták le. Szent-Györgyi Albert 1931-ben megjelent cikkében úgy jellemezte, hogy nagy redukáló erővel és reverzibilis oxidálhatósággal rendelkezik. Az aszkorbát-glutation ciklus tagja. Ez a vegyület egyike a legfontosabb oldódó redox molekuláknak, melyek kulcsfontosságú szerepet játszanak különböző anyagcsereutak megfelelő működésében. Regenerálja az oxidatív károsodásból származó egyéb metabolitokat, többek között a tokoferolokat, és megvédi a ROS-ok okozta irreverzibilis oxidációtól számos enzim (pl. a hidroxilázok) katalitikus oldalát (De Gara és mtsai, 2000). Sok reakcióban vesz részt, mint szubsztrát vagy kofaktor (De Gara és mtsai, 2010; Lodge, 2008). Gombákban, protozoákban, növényekben és állatokban, eltérő bioszintézis utakon, egyaránt szintetizálódik.
Fenolok A fenolvegyületek, mint pl. a flavonoidok, tanninok, sztilbének, hidroxifahéjsavak, benzoesavak, ligninek és különböző származékaik, a növényi szövetekben nagy mennyiségben előforduló, változatos másodlagos anyagcseretermékek, melyek a sikiminsav és fenilpropanoid útvonalak, illetve a pentóz-foszfát ciklus köztes termékeiből származnak (Randhir és mtsai, 2004). Közös jellemzőjük, hogy fenolcsoportot tartalmaznak, innen ered összefoglaló nevük is. Az emberi szervezet számára szintén rendkívül hasznos anyagok, egyes polifenolok bizonyítottan jelentős védelmet nyújtanak az öregedéssel és számos krónikus betegséggel, úgymint a kardiovaszkuláris megbetegedéssel (CVD), rákkal, diabétesszel,
16
különböző fertőzésekkel szemben (Pandey és Rizvi, 2009). A polifenolok ideális kémiai szerkezettel rendelkeznek a szabad gyökök befogásához és kimutatták, hogy in vitro sokkal hatásosabb antioxidánsok, mint az aszkorbát vagy a tokoferolok (Karuppanapandian és mtsai, 2011). A fenolvegyületek antioxidatív tulajdonságai az elektrondonorként való magas reaktivitásukból, a polifenol eredetű gyökök elektronokat delokalizáló és stabilizáló képességéből, illetve az átmeneti fémionokat keláló képességükből (a Fenton-reakció leállítása által) ered. Szintézisüket az UV-sugárzás és a patogénfertőzések egyaránt serkentik (Pandey és Rizvi, 2009). Számos nehézfém-szennyezésnek kitett növény gyökerében magas fenolvegyület-szintet találtak (Winkel-Shirley, 2002). Sakihama és mtsai (2002) úgy találták, hogy az Al, a Zn, a Ca, a Mg és a Cd stimulálja a fenoxilgyökök által indukált lipidperoxidációt. A fenolvegyületek stabilizálják a membránokat azok fluiditásának csökkentésével, a ROS-ok diffúziójának akadályozásával és a peroxidatív reakciók korlátozásával (Arora és mtsai, 2000; Blokhina és mtsai, 2003). Antioxidáns hatásukat úgy is kifejthetik, hogy a szabadgyökláncok terminátoraiként, valamint a lipidperoxidációt katalizálni képes redox-aktív fémionok csapdázóiként működnek. Részt vehetnek a növényi sejtek ROS-eltávolító kaszkádjában is (Winkel-Shirley, 2002). 2.2.3 . Védelemben szerepet játszó egyéb vegyületek Poliaminok A poliaminok (PA) csoportja - név szerint a diamin putreszcin (PUT), a triamin spermidin (SPD), a tetramin spermin (SPN), a kadaverin (CAD) és az agmatin (AGM) -, kisméretű, pozitív töltésű, alifás aminok, és az utóbbi kettő kivételével minden növényi sejtben megtalálhatóak. A PA-ok képesek kötődni a negatív töltésű molekulákhoz, vagyis a nukleinsavakhoz, savas foszfolipidekhez és különböző fehérjékhez, ezáltal védő szerepük van stresszkörülmények között (Liu és mtsai, 2007). Szabad, konjugált (kis molekulákhoz, pl. fenolos savakhoz asszociált) és kötött (különféle makromolekulákhoz asszociált) formában egyaránt előfordulnak. Arról is beszámoltak, hogy a PA-ok egyes stresszorokkal szemben védekező válaszokat váltanak ki (Hussain és mtsai, 2011), továbbá, hogy nemcsak a ROS-ok eltávolításában játszanak szerepet, hanem az antioxidáns enzimeket kódoló gének kifejeződésében is, mint aktivátorok. A PUT, SPD és SPN szabad formái a legjelentősebbek a növényekben. Kuznetsov és Shevyakova (2007) azt is leírták, hogy a konjugált formájú PAok sokkal hatásosabb ROS-eltávolítók, mint a szabad formájúak.
17
2.3 . Biotikus és abiotikus stresszorok okozta változások 2.3.1 . A lisztharmatfertőzés hatásai A lisztharmatok az Erysiphales rendbe tartozó externális, biotróf aszkuszos gombák, melyek a gazdasági növények egyik legismertebb, legközönségesebb és leggyorsabban módosuló kórokozói. A világ valamennyi mérsékelt övi növénytermesztő régiójában ismertek. Az időjárástól függően az általuk okozott fertőzés kisebb-nagyobb mértékben minden évben megjelenik (Leath és Bowen, 1989), és mind maga a fertőzés, mind a fertőzés elleni vegyszeres védekezés komoly gazdasági, utóbbi környezeti és egészségügyi károkat is okozhat. Az enyhe telet követő rendkívül csapadékos és meleg nyár, mint amilyen a 2014-es is volt Magyarországon, megfelelő környezeti feltételeket biztosít a telepek fejlődése számára, így a lisztharmat aktuális problémák forrása. Ez a kórokozó felelős például a hazai szőlőtermés jelentős veszteségéért, valamint részben az időben nem learatott kalászos gabonafélék és a napraforgó minőségromlásáért is. A lisztharmatok nevüket a növények levelein, szárain, termésein kialakuló, fehérszürkésfehér színű, lisztszerű micéliumaikról kapták. Kompatibilis gazda-patogén interakció esetén, árpában a Blumeria graminis f.sp. hordei konídiumai már kb. 10-12 órával az árpa levélfelszínére kerülésük után csírázni kezdtek, majd kialakultak a fertőzéshez szükséges appresszóriumok, végül a hausztóriumok, melyek a micéliummal ellentétben behatoltak a bőrszöveti sejtekbe, ahonnan tápanyagot vettek fel (Cowley és Waters, 2002). A gombamicélium által fedett hajtásfelszíneken csökkenhet a potenciálisan fotoszintetizáló felület. Cukorrépában a lisztharmat csökkentette a fotoszintetikus elektrontranszport hatékonyságát, valamint a nem ciklikus fotofoszforiláción keresztüli ATP-képződést, amely a CO2
asszimilációjának
csökkenéséhez
vezetett
(Magyarosy
és
mtsai,
1976).
Gabonanövényeknél, ha a fertőzés fiatal korban érte a növényeket, azok növekedése és fejlődése csökkent, a hajtások elfonnyadtak, elsatnyultak. A felnőttkori fertőzés csökkentette a gabonafélék szemtermésének mennyiségét és minőségét, különösen akkor, ha a zászlós leveleket a kalászolás és szemtelítődés időszakában támadta meg a lisztharmat (Griffey és mtsai, 1993). A búzalisztharmat (Blumeria graminis (DC.) Speer f.sp. tritici Ém. Marchal) erős fertőzéskor fogékony búzafajtán akár 40%-os termésveszteséget is okozhat. Éppen ezért a búzanemesítési programokban még mindig jelentős szelekciós kritérium a lisztharmattal szembeni ellenállóság. A rezisztens fajták sikeres létrehozásához nélkülözhetetlen a növények védekező és szabályozási folyamatainak alapos ismerete.
18
A lisztharmatfertőzés általános kísérő jelensége az oxidatív stressz kialakulása a növényekben, amelyet a ROS-ok fokozott termelődése és felhalmozódása vált ki (bővebben lásd a 2.3. fejezetben). Az ez elleni növényi védelem szerves részét képezik az antioxidáns enzimek (GR, KAT, APX, G-POD). Gabonafélékben működésük biotikus stressz során tapasztalt változásairól számos esetben beszámoltak (Asthir és mtsai, 2010; Harrach és mtsai, 2008; Ivanov és mtsai, 2005). A G-POD biotikus stressz esetén kulcsfontosságú szerepet tölt be (Scott-Craig és mtsai, 1995); hiszen egyike azoknak az enzimeknek, amelyek a kórrezisztenciáért
felelősek
a
különféle
gazda-patogén
kapcsolatokban,
az
olyan
folyamatokon keresztül, mint amilyen a lignifikáció is (Moldenhauer és mtsai, 2006). Árpa növények első levelének metil-jazmonátos kezelése szignifikánsan csökkentette a második leveleken a lisztharmat (Blumeria graminis f. sp. hordei) fertőzését, továbbá jelentősen megemelte a védelemmel kapcsolatos enzimek, úgymint a fenilalanin-ammóni-liáz (PAL) és a peroxidázok, aktivitását (Walters és mtsai, 2002). Az
Erysiphales
rend
tagjai
befolyásolják
a
különféle,
növekedésben,
immunválaszokban szerepet játszó anyagok mennyiségét és minőségét, pl. a PA-okét. Árpában a lisztharmat már 1-4 órával a fertőzést követően megemelte a szabad PUT és SPD, valamint a konjugált formájú PUT, SPD és SPN mennyiségét, amely együtt járt a PA-ok bioszintézisében
(ornitin-dekarboxiláz,
arginin-dekarboxiláz,
S-adenozil-metionin-
dekarboxiláz), illetve katabolizmusában (diamin-oxidáz, poliamin-oxidáz) szerepet játszó enzimek aktivitás-növekedésével (Cowley és Waters, 2002). Hasonló eredményeket okoz az első levelek metil-jazmonátos kezelése árpában, ugyanakkor a kezelt növények második leveleiben csak a konjugált PA formák mennyisége emelkedett meg, a szabad formáké nem (Walters és mtsai, 2002). A lisztharmatfertőzés a fenolvegyületek közé tartozó rezveratrol és glikozidjainak mennyiségét is jelentősen megnövelte szőlőbogyók héjában, és ez szoros összefüggésben állt a fertőzés mértékével (Romero-Pérez és mtsai, 2001). Inkompatibilis gazda-lisztharmat kapcsolat esetén a hausztóriumok nem tudnak behatolni a sejtekbe, a növény specifikus, a patogénnel szembeni rezisztenciáért felelős génekkel rendelkezik, amely hiperszenzitív reakciót (HR) vált ki, ami a gazdasejtek pusztulásához vezet (Cowley és Waters, 2002). A HR jelátviteli rendszerének tagjaként a SA fontos szerepet tölt be a patogéntámadással szembeni védekező folyamatokban (bővebben lásd a 2.4.3. fejezetben) (Catinot és mtsai, 2008; Horváth és mtsai, 2007). A megnövekedett endogén SA szintekről fertőzésnek kitett levelekben különféle növényfajok esetén számoltak be, míg az exogén SA alkalmazása számos biotikus stresszel szemben képes volt indukálni a rezisztenciát (Chaturvedi és Shah, 2007).
19
2.3.2 . A kadmiumstressz hatásai A kadmium (Cd) egy nehézfém, amely legnagyobb mennyiségben az erőművek, kohók, üzemek tevékenysége révén, a szennyvíziszappal és egyéb hulladékokkal kerül a környezetbe. Többek között a különböző ötvözetek galvanizálására, a festék-, akkumulátor- és műtrágyagyártásban használják, de előfordul a dízel-és fűtőolajokban is, emiatt a nagy forgalmú utak mentén nagyobb mennyiségben kerül a talajba, a levegőbe, sőt a növényzetbe is (Bakirdere és Yaman, 2008; Khan és mtsai, 2011; Naszradi és mtsai, 2004). A nem szennyezett talajokban a Cd koncentrációja átlagosan 0,04−0,32 μM, mérsékelten szennyezett talajokban 0,32−1 μM körüli. Azonban az ettől nagyobb mennyiségű Cd-ot tartalmazó talajokon már csak ezt a fémet tolerálni, illetve hiperakkumulálni képes fajok, például egyes disznóparéjfélék (Amaranthus retroflexus L.), pillangósvirágúak (Phaseolus acutifolius A. Gray), keresztesvirágúak (Thlaspi caerulescens, Arabidopsis halleri) és fűzfafélék (Salix viminalis L.) élnek meg (Cosio és mtsai, 2004; Schmidt, 2003). A különböző elemek felvételét számos tényező befolyásolja, úgy, mint a talaj pH értéke, egyéb fém- és szervesanyag-tartalma, éppen ezért a talaj magas nehézfém-koncentrációja nem mindig jár együtt a növények megnövekedett fémtartalmával. A Cd, mint kétértékű fémion képes más, szintén kétértékű fémionokat helyettesíteni, például az esszenciális elemek közzé tartozó cinket és vasat, ezért már kis koncentrációban is nagyon mérgező a növények, az állatok és az emberek számára egyaránt. Mivel a Cd-ot a növények képesek felhalmozni a szervezetükben, az a táplálékláncon keresztül bekerülhet az állatokba és az emberekbe, ahol többek között károsítja a mitokondriumokat és apoptózis vagy nekrózis általi sejthalált indukál, ami később szövetgyulladáshoz és fibrózishoz vezethet (Thijssen és mtsai, 2007), ezen kívül a máj, a vesék, a csontok, az ivarszervek, az idegrendszer kóros elváltozását okozza (Nordberg, 2003). A Cd-stressz összetett jelenség, amely több párhuzamos és egymást követő változást, eseményt indukál a növényekben (Pál és mtsai, 2006a). Először a gyökerekben okoz változásokat,
mivel
ez
a
rész
érintkezik 2+
2+
először
a
talajban,
vízben
található
2+
szennyezőanyaggal, ahonnan a Zn -, Fe - és Ca -csatornákon keresztül juthat be a gyökérsejtekbe (Clemens, 2006), onnan pedig a szállítórendszeren keresztül feljuthat a hajtásba. Az egyik leglátványosabb hatása a növekedés mértékének csökkentése (Das és mtsai, 1997), ez azonban függ az adott növény fajától, az alkalmazott Cd koncentrációjától és a kezelés időtartamától. Napraforgónövények 16 napig tartó, 0,1-1 mM CdCl2 kezelése koncentrációfüggő növekedésgátlást mutatott, de minden kezelt mag kicsírázott, magonccá
20
fejlődött és életben maradt a kezelés alatt (Groppa és mtsai, 2007). Borsó növények 50 µM CdCl2-os kezelése jelentősen gátolta a levelek és gyökerek növekedését, valamint a klorofilltartalmat (Sandalino és mtsai, 2001). Kukoricában az 1-40 mg/L hidropónikus oldathoz adagolt Cd csökkentette a gyökér és a hajtás száraz tömegét, illetve a levelek klorofilltartalmát a szövetek Cd-tartalmával fordított arányban (Root és mtsai, 1975). A paradicsomok hajtásai is ellenálltak a nagy dózisú (250 µM CdCl2) Cd-nak, annak ellenére, hogy növekedésgátlás jelentkezett (Delpérée és Lutts, 2008). Kukoricában a 0,5 mM Cd már egy nap elteltével csökkentette a gyökerek életképességét és a második fotokémia rendszer (PSII) kvantumhatásfokát (Pál és mtsai, 2002). Çanakci és Karaboğa (2013) arról számolt be, hogy a 25, 50, illetve 100 µM Cd uborkában egyaránt csökkentette a levélmegnyúlást, a száraz és friss tömeget, valamint a fotoszintetikus pigmentek mennyiségét. Carr és Murphy (2002) szerint a nem toxikus mennyiségű Cd javíthatja a növények ellenálló-képességét, azok ellenállóvá válhatnak a szállítórendszerüket támadó vírusokkal szemben. Viszont nagyobb koncentrációban a Cd zavarja a nukleinsavak, fehérjék és klorofillok szintézisét, és inaktiválja a PSII reakciócentrumát, ami klorózishoz, intenzív ROSképződéshez, lipidperoxidációhoz, összességében oxidatív stresszhez és a fotoszintézis csökkenéséhez vezet (Prasad és mtsai, 2004; Sobrino-Plata és mtsai, 2009). Ezen kívül a Cd erős komplexeket képez a kéntartalmú peptidekkel és fehérjékkel. A növények különböző mechanizmusokkal védekeznek a nehézfémek okozta károsodások ellen, ilyen folyamatok például a fémek kizárása, aktív kiválasztása a sejtekből, mozgásuk korlátozása az érzékeny szövetekben, a fémionok sejtfalhoz kötése, szerves molekulák általi kelációja és kompartmentalizációja a vakuólumokban (Benavides és mtsai, 2005; Gratão és mtsai, 2005). Ezekben a mechanizmusokban szerepet játszanak többek között a különféle tiolvegyületek. A GSH és prekurzorainak nehézfémek okozta mennyiségi változásairól számos növényfaj esetén beszámoltak (Çanakci és Karaboğa, 2013; Gill és Tuteja, 2010a). A GSH a nehézfémkötő fehérjékhez tartozó fitokelatinok (PC-k) prekurzora is, melyek szintén felhalmozódnak Cdnak kitett búzában (Stolt és mtsai, 2003). 3 hetes lucernanövények GSH-, homoglutation(hGSH) és PC-tartalma jelentősen megemelkedett 7 napig tartó 3, 10 és 30 M Cd-kezelést követően (Sobrino-Plata és mtsai, 2009). Az oxidatív stressz károsításának csökkentése érdekében megváltozik az antioxidáns védőfolyamatok működése is (Groppa és mtsai, 2001; 2008a,b). A Cd, a tiolokon kívül, az egyéb nem-enzimatikus vegyületeket felhalmozódását, köztük az aszkorbátét, szintén indukálja (Shan és mtsai, 2012). Továbbá úgy találták, hogy a Cd-kezelés fokozza az APX és G-POD aktivitását egy kevésbé Cd-érzékeny búza genotípusban, mialatt a jobban érzékenyben ezek az értékek a kontroll szinten maradtak, vagy
21
csak magasabb Cd-koncentráció esetén emelkedtek meg. Azonban növényfajtól, genotípustól függően, a magasabb koncentrációk vagy a hosszabb időtartamú kezelés gátolhatja az antioxidáns enzimeket (Hegedűs és mtsai, 2001; Lin és mtsai, 2007). 0,5 mM Cd csökkentette a KAT, APX és GR-aktivitást, a GSH- és klorofill-tartalmat, ugyanakkor fokozta a lipidperoxidációt napraforgó (Gallego és mtsai, 1999), illetve búza (Groppa és mtsai, 2001) levelében. 15 napos 50 μM-os Cd-kezelés csökkentette a GSH- és ASC-tartalmat, a GR, KAT, G-POD és Cu/Zn-SOD aktivitását, mialatt a Mn-SOD-ét csekély mértékben megemelte borsóban (Rodríguez-Serrano és mtsai, 2006). A vízi növények különösen érzékenyek a Cdra, így az már 5 μM-os koncentrációban alkalmazva redukálja a GR és a GST működését vízi jácint (Eichhornia crassipes (Mart.) Solms) és Salvinia auriculata Aubl. növények gyökerében, viszont a levelekben megemeli a GST-aktivitást (Vestena és mtsai, 2011). A Cd fokozza a fitohormonok és hormonhatású anyagok mennyiségét is. Borsóban az 50 μM Cd megemelte a jázmonsav (JA) és az etilén mennyiségét (Rodríguez-Serrano és mtsai, 2006; 2009). A Cd megnövelte a szabad SA-tartalmat árpa- (Metwally és mtsai, 2003), borsó- (Rodríguez-Serrano és mtsai, 2006) és kukoricanövények (Pál és mtsai, 2005; 2006a) gyökerében. Arabidopsis thaliana-ban 500 μM Cd drasztikus SA-szintemelkedést idézett elő, ami viszont már fokozta a Cd-indukálta oxidatív stressz káros hatásait (Zawoznik és mtsai, 2007). Továbbá ez a nehézfém növeli ezeken kívül egyéb fenolvegyületek (fahéjsavszármazékok) és a flavonoidok (epikatekin, rutin) mennyiségét is (Márquez-García és mtsai, 2012). 2.3.3 . A szárazságstressz hatásai A szárazság egyike azoknak a környezeti stresszeknek, amelyek a gabonaföldek károsításával a legnagyobb gazdasági károkat okozzák szerte a világon (Sepehri és Golparvar, 2011). A növények magjai különösen ellenállóak a kiszáradással szemben, ennek köszönhetően hosszú időn át és viszontagságos körülmények között is biztosítják az adott faj fennmaradását. Viszont a csírázáskor különösen érzékennyé válnak a vízhiányra, a bennük genetikailag kódolt, adott mértékű ellenálló-képesség csak pár nappal a csírázás után fejeződik ki (Bogdan és Zagdańska, 2006), és a növény fejlődése során folyamatosan változik, melyet a különböző környezeti hatások jelentősen befolyásolnak. Maga a szárazság mint stressz nem jár egyedül, ozmotikus és oxidatív stresszel együtt jelentkezik, és ezek együttes hatása a növényi szervezetet számos szinten befolyásolja. Rövidtávon a vízhiány legkorábbi jele, hogy csökken a növény vízpotenciálja, emiatt felborul a homeosztázis és ozmotikus
22
stressz alakul ki. A leglátványosabb változást a fenotípus szintjén láthatjuk, amikor a morfológiai változások már egyértelműen mutatják a növény vízhiányos állapotát. A fűféléknél ilyen például a levelek saját tengelyük körüli csavarodása, illetve a levéllemez kívülről befelé történő összetekeredése (O'Toole és Cruz, 1980), valamint a levél vastagságának csökkenése. Ezt a sejtek turgorának csökkenése okozza, amelyet a vízvesztés vált ki. A hosszú távú vízhiány redukált hajtásnövekedéshez, a levélfelület és a sztómasűrűség csökkenéséhez, ezzel ellentétesen viszont a gyökérzet növekedéséhez vezet. Deák és mtsai (2011) megfigyelték, hogy a szárazsággal szemben toleránsabb búzafajták levelei kisebbek voltak és alacsonyabb sztómasűrűséggel rendelkeztek, mint az érzékeny fajtáké. A hatékony növényi védelemért különböző, gyors és hatékony folyamatok aktiválódnak, melyek összehangolt működése szükséges a stresszhatások okozta károsodások kivédéséhez és megelőzéséhez. Az ozmotikus stressz Ca2+-ionok, nitrogén-monoxid (NO), H2O2 és abszcizinsav (ABA) felhalmozódását váltják ki a sejtekben, legelőször a gyökér sejtjeiben, amelyek jelátvivőkként működnek és számos ponton befolyásolják a védekezést. Ilyen pontok pl. a gyökerek hosszának és az oldalgyökerek számának növelése, ezek vízfelvételének növelése, továbbá a sztómazáródás serkentése, gátolva ezzel a növényi testben lévő víz transzspiráción keresztüli távozását (Pospišilová, 2003). Ez azonban gátolja a gázcserét, a szén-dioxid mennyisége megnő, míg az oxigén mennyisége lecsökken az intercelluláris térben. Ezzel ellentétben a fotoszintetikus elektrontranszport a stressz ellenére magasabb szinten maradhat. Az elektrontranszport működése és a CO2-fixáció közötti egyensúly felborulása esetén viszont az elektronok a molekuláris oxigénre kerülhetnek (Bencze és mtsai, 2011). Ez ROS-ok keletkezéséhez vezet (Niedzwiedz-Siegien és mtsai, 2004), melyek túlzott mennyisége viszont már károsítja a szervezetet, kialakul az oxidatív stressz. Az antioxidáns enzimek közül jelentősen nőtt a SOD, a KAT és a glutation-peroxidáz aktivitása, amelyek értékei magasabbak voltak közepes vízhiány esetén, mint magas vízhiánynál szójában (Masoumi és mtsai, 2010). Hasonló eredményeket kaptak napraforgóban (Pourtaghi és mtsai, 2011), Astragalus fajokban (Tan és mtsai, 2006), árpában (Salekjalal és mtsai, 2012), búzában (Bencze és mtsai, 2011; Wu és mtsai, 2012) és rizsben (Shehab és mtsai, 2010). Az oxidatív stressz során képződő H2O2 szignálmolekulaként szerepet játszik a különböző jelátviteli utakon, továbbá gátolja az akvaporinok vízcsatorna-aktivitását a gyökerekben (Parent és mtsai, 2009). Az ABA szintén hasonló hatást fejthet ki, ugyanakkor koncentrációjától függően serkentheti is az akvaporinok működését (Beaudette és mtsai, 2007), ezen kívül szerepet játszik a gyökérnövekedés serkentésében, az etilénképződés gátlásában (Tanaka és mtsai, 2005), a citokininek felhalmozódásában (Pospišilová és mtsai,
23
2005), és az enzimatikus antioxidáns rendszer aktiválásában, továbbá az ABA-függő jelátviteli utakon keresztül egyes stressztoleranciáért felelős gének aktiválásában. Szárazság hatására megfigyelhető a különböző ozmolitok (glicinbetain, prolin, poliolok, cukrok, stb), felhalmozódása a növényekben, melyek elősegítik a víz megtartását (Bencze és mtsai, 2011; Kameli és Lösel, 1993; Mohammadkhani és Heidari, 2008). PEG-gel indukált szárazság/ozmotikus stressz esetén kukoricában megemelkedett az oldható cukrok mennyisége, mialatt a keményítő-tartalom lecsökkent (Mohammadkhani és Heidari, 2008), ugyanezt tapasztalták búzában (Bogdan és Zagdańska, 2006) is. 2.3.4 . Az UV-B sugárzás hatásai Az ultraibolya (UV) sugárzás a fény hullámhosszától függően négy tartományra osztható: UV-A-ra (315–425 nm), UV-B-re (280–315 nm), UV-C-re (185–280 nm) és UV-Vre (100-185 nm). A sztratoszférikus ózonréteg elnyeli az UV-V és UV-C egészét, valamint az UV-B sugárzás alacsonyabb hullámhosszú részét, de az elvékonyodása, továbbá az ózonlyukak méretének és mennyiségének növekedése miatt nő a földfelszínt elérő, az élő szervezetre káros hatású UV-B és sajnos az UV–C sugárzás mértéke is (Alexieva és mtsai, 2001;
Häder
és
mtsai,
2007),
melyek
megváltoztathatják
a
növények
ismert
stressztényezőkkel szembeni adaptív folyamatait. Bár az UV-B változatos módon befolyásolja a magasabbrendű növényeket, általános hatása, hogy a legtöbb növényfaj esetén csökkenti a növekedést, a levélfelület nagyságát és vastagságát - a paliszád és mezofil szövetek elvékonyításán keresztül -, továbbá a levélnyél hosszát is (Kakani és mtsai, 2003a; ZukGolaszewska és mtsai, 2003). Ennek hátterében a növényi sejteken belül három különböző szintet, a genomot, a fotoszintetikus apparátust és a membránokat érintő változások állnak. A nukleinsavak szintjén az UV-B hatására a DNS egymáshoz közel lévő pirimidin bázisai dimereket képezhetnek, amelyek mutációt idéznek elő a replikáció alatt, és gátolják az érintett DNS szakaszon található gének kifejeződését (Hollósy, 2002). Ugyanakkor az UV-B rövid idő alatt serkenti a védelemben szerepet játszó gének expresszióját, míg a fotoszintetikus komplexekhez kötődőket gátolja (Agrawal és mtsai, 2009). A növények UV-B-vel szembeni, az evolúció során régóta kialakult védekező képességéről tanúskodik az UVR8 (UV Resistance Locus 8) UV-B fotoreceptor fehérje megléte Arabidopsis-ban és más fajokban, amely egy kromatinhoz kötődő UV-B-specifikus jelátviteli komponens, ami különféle gének expressziós szabályozásán keresztül befolyásolja az UV-védelmet (Hideg és mtsai, 2013; Kaiserli és Jenkins, 2007). Az UV-B második támadási pontja a fotoszintetikus rendszer,
24
melynek működését közvetve és közvetlenül egyaránt befolyásolja (Kakani és mtsai, 2003b). A 280 nm és ez alatti sugárzás már szignifikánsan csökkenti a fotoszintetikus hatékonyságot és a PSII kvantumhatásfokát. Ennek oka, hogy a PSII rendkívül érzékeny az UV-B és –C sugárzásra, különösen a D1 és D2 fehérjék reakciócentrumai (Jansen és mtsai, 1998; Zlatev és mtsai, 2012). A fotokémiai rendszerek károsodása ROS-képződést és az oxidatív stressz kialakulását vonja magával, melynek csökkentése érdekében fokozódik az antioxidáns védelmi rendszer működése az antioxidáns enzimek indukcióján és a nem-enzimatikus antioxidánsok (pl. fenolos vegyületek) serkentett szintézisén keresztül (Kakani és mtsai, 2003b; Majer és Hideg, 2012). A 280 nm-nél nagyobb, de a látható fénynél kisebb hullámhosszú sugárzás közvetlenül károsíthatja a kloroplasztisz ultrastruktúráját, ennek eredményeként a levelek klorotikussá válnak (Jansen és mtsai, 1998). A harmadik célpontot a membránok jelentik (An és mtsai, 2000). Az UV-B tavaszibúza-növények leveleiben megváltoztatja a mikroszomális membránok szerkezeti komplexitását és funkcióját. Drasztikusan csökkenti a foszfolipid-tartalmat, növeli a membránlipidek viszkozitását, ezáltal csökkenti a membránok fluiditását. Az UV-B ezen kívül csökkenti a zsírsavak mennyiségét, ami lipidperoxidációt indukál (Zlatev és mtsai, 2012). Az alacsonyabb dózisú UV-B stressz bár morfológiai, anyagcsere és génexpressziós változásokat okoz, főleg az antioxidáns rendszer stimulálásán keresztül a növények általános akklimációjához vezet, vagyis védelmet nyújthat más stresszekkel, vagy későbbi nagyobb UV-dózissal szemben (Kakani és mtsai, 2003b, Majer és Hideg, 2012). Árpában az UV-B sugárzás indukálta a fő H2O2-detoxifikáló enzimek (APX, POD, GR) aktivitását, és az előkezelések (200 mM NaCl, ill. a 45 perc 45 °C) fokozták az enzimatikus válaszokat, ezeken keresztül pedig a stressztoleranciát (Çakirlar és mtsai, 2011). Az UV-B hatásai a természetben más stresszekkel, például szárazsággal, extrém hőmérséklettel, más hullámhosszú és/vagy dózisú fénnyel, antropogén hatásokkal, együtt jelentkeznek. Mivel a különböző stresszorok gyakran ugyanazokon a jelátviteli utakon, folyamatokon keresztül befolyásolják a növényi szervezetet, fontos lehet a növényt érő stresszhatások sorrendje, minősége, időtartama és ezeknek a stresszhatásoknak az egymással való kapcsolata, szinergizmusa vagy éppen antagonizmusa. Mivel a stresszorok többsége külön-külön is szerepet játszik a gabonatermés mennyiségi és minőségi romlásában, amely komoly károkat jelent, a tudósok, növénynemesítők és –termesztők világszerte olyan kutatásokra összpontosítanak, amelyek célja a gabonafélék minél több stresszorral szembeni toleranciájának kialakítása, fokozása. Éppen ezért több és több információra van szükségünk a különböző stresszorokkal, stresszhatásokkal szembeni növényi válaszokról, védekező
25
mechanizmusokról, melyhez remélhetőleg ez a dolgozat is hozzájárul az egyes abiotikus stresszek egyéni, illetve kombinált hatásainak vizsgálatából származó eredményeivel.
2.4 . Szalicilsav a növényekben 2.4.1 . A szalicilsav élettani hatásai A SA, más néven 2-hidroxi-benzoesav, régóta ismert gyógyító hatásáról (Roth és Majerus, 1975). Acetilált formáját napjainkban az Aszpirin hatóanyagaként láz- és fájdalomcsillapításra, a trombózis kialakulásának csökkentésére széles körben használják. Korábban terápiás szerként alkalmazták például az autoimmun betegség, a szisztémás lupus erythematosus (SLE) és a reumás ízületi gyulladás (rheumatoid arthritis, RA) kezelésére (Mottram, 2003). Megtalálható ezen kívül számos kozmetikumban (samponokban, testápolókban, arckrémekben) is. Növényekben szerepe lehet az anyagcsere-folyamatokban, a biotikus és az abiotikus stresszekkel szemben egyaránt (erről bővebb információ a 2.4.3. fejezetben található), ugyanakkor más mechanizmusokban is közreműködhet. Régóta ismert, hogy a termogén növények, mint amilyenek a kontyvirágok (Arum sp.), a voodoo liliom (Sauromatum guttatum S.) és a mocsári káposzta (Symplocarpus foetidus L.) is, kalorigén anyaga ez a vegyület. Előbbiekben virágzáskor megemeli a virágok hőmérsékletét (akár 10-12 C-kal), az alternatív oxidáz expressziójának fokozásával, ezzel segítve az illatanyagok könnyebb kibocsátását, ezáltal a virágok megporzását végző rovarok csalogatását (Raskin és mtsai, 1990); utóbbiban a hőmérséklet emelése által védi ezt a nem-fagytűrő növényt az alacsony hőmérséklettől, így az még a hóval borított talajon is életben maradhat (Knutson, 1974). A SA és analógjai fokozták a levélterület és száraztömeg nagyságát kukoricában és szójában (Khan és mtsai, 2003). Továbbá búzaszemek alacsony koncentrációjú SA-oldatba (10−5 M) áztatása megemelte a fiatal növények leveleinek számát, valamint friss- és száraztömegét (Hayat és mtsai, 2005; Hussein és mtsai, 2007). A SA-kezelés fokozta a fotoszintézist a klorofill-tartalom és a Rubisco karboxiláz aktivitásának növelésével búzában (Singh és Usha, 2003) és Brassica fajokban (Hayat és mtsai, 2010), továbbá membrán-depolarizációt, retardált etilénszintézist és gátolt sebzési választ eredményezett szójában (Zhao és mtsai, 1995). Moharekar és mtsai (2003) arról számoltak be, hogy a SA serkentette a karotenoidok és a xantofillok bioszintézisét, továbbá fokozta a deepoxidáció arányát a klorofill pigmentek és a klorofill-a/b arány ezzel egyidejű
26
csökkentésével búza és Vigna radiata (L.) R. Wilczek növényekben. Az exogén SA már 0,01 mM koncentrációban alkalmazva megemelte a nettó fotoszintetikus rátát, a CO2-fixáció hatékonyságát, a nitrát-reduktáz aktivitását és a magtermelést Brassica juncea-ban (Fariduddin és mtsai, 2003). Kukoricában 0,01 M SA stimulálta a sótoleranciát a fotoszintetikus folyamatok aktiválásán át (Khodary, 2004). Az SA ezen kívül védi a fotoszintetikus apparátust az oxidatív károsodástól az antioxidáns rendszer aktiválásán keresztül (Krantev és mtsai, 2008). 2.4.2 A szalicilsav bioszintézise A SA bioszintézise három ismert úton történhet (Métraux, 2002). A sikiminsav útvonalon keresztüli szintézist először mikroorganizmusokban fedezték fel, később biotikus stressznek kitett növényekben is, ahol az 5-enolpiruvilsikimát-3-foszfátot a korizmát-szintáz (CS) korizmáttá alakítja, amely az izokorizmát-szintáz (ICS) segítségével izokorizmáttá alakul, ebből pedig az izokorizmát-piruvát-liáz (IPL) SA-at képez (Nugroho és mtsai, 2001; Wildermuth és mtsai, 2001). Stressznek kitett Arabidopsis-növények kloroplasztiszaiban a SA-szintézis elsősorban az izokorizmát-felhasználó útvonalon át történik (Dempsey és mtsai, 2011). Tríciummal jelölt SA-ban történő előáztatás után megnőtt a CS-t és ICS-t kódoló gének expressziója borsó magoncok epikotiljában (Szalai és mtsai, 2011).
3. ábra: A szalicilsav bioszintézis útvonalai (Métraux, 2002 után). CS: korizmát-szintáz, ICS: izokorizmátszintáz, PAL: fenilalanin-ammónia-liáz
27
A másik két út a fenilpropanoid útvonalból indul ki. Itt a fenilalanin a fenilalaninammónia-liáz (PAL, EC 1.6.5.4) hatására fahéjsavvá alakul, majd attól függően, hogy egy dekarboxilációs vagy egy hidroxilációs lépés következik-e, elválik egymástól a két út. Ha a fahéjsav oldallánca először karboxilálódik, benzoil-glükóz (a benzoesav, BA, glükozilált formája) keletkezik, amely egy hidroxilációt követően SA-vá alakul. Ha a fahéjsav először hidroxilálódik, akkor o-kumársav, más néven o-hidroxifahéjsav, majd dekarboxiláció után SA képződik (Métraux, 2002). A három útvonal egymással kapcsolatban áll a korizmát-mutáz enzimen keresztül, amely a korizmát L-arogenáttá történő átalakulását katalizálja, ami azután L-fenilalaninná alakul (Ogawa és mtsai, 2005). Radioaktív jelöléses módszerrel bizonyították, hogy a SA fahéjsavból keletkezik a PAL aktivitása által és azt, hogy a dohány PAL-t kódoló génjeinek csendesítése vagy a kémiailag gátolt PAL-aktivitás csökkentette a patogén-indukált SA-felhalmozódást Arabidopsis-ban, uborkában és burgonyában (Chen és mtsai, 2009). Métraux (2002) szerint a fenilpropanoid útvonal SA-bioszintézisben betöltött szerepe biotikus stressz során elhanyagolható a sikiminsav útvonaléhoz képest, ennek ellentmond Ogawa és mtsai (2006) megállapítása, mely szerint a dohánymozaik vírussal fertőzött dohány növények leveleiben ez az út az elsődleges. Ugyanakkor azt is felfedezték, hogy habár az ózonnak kitett dohányban a BA-on keresztül történt a SA-képződés, mialatt az ICS aktivitása és mRNS szintje nem változott, ugyanakkor az ózon-kezelt Arabidopsis thaliana-ban az ICSen keresztül zajlott a SA-termelődés (Ogawa és mtsai, 2005). Transzformált dohányban bakteriális ICS vagy IPL géneket fuzionáltattak egy erős növényi promóterhez, amely SAtúltermelést és a gének konstitutív expresszióját váltotta ki (Verbene és mtsai, 2000). Arabidopsis-ban az ICS1 gén kódolja a plasztiszokban található ICS-t, mely Pseudomonas syringae avirulens törzseivel történő inokulációt követően SA-felhalmozódást és a szisztemikus szerzett rezisztencia (Systemic Acquired Resistance, SAR) kialakulását idézte elő a szisztémás leveleken (Wildermuth és mtsai, 2001). Azt is leírták, hogy az ózonstressz drámai hatást fejt ki a prekorizmát-útvonal szabályozására dohány növényben (Jansik és mtsai, 2005). A képződő szabad formájú SA szintje változatos kémiai módosítások által szabályozódik, amely hosszú távon segítheti a SA-transzportot vagy kiegészítheti a szabad SA által indukált stresszválaszok aktivációját (Chen és mtsai, 2009). Az viszont máig tisztázatlan kérdés, hogy vajon a PAL vagy az ICS útvonal felelős-e a SA-felhalmozódásáért, és vezet biotikus stressz esetén a szisztemikus szerzett rezisztencia kialakulásához, továbbá, hogy melyik útvonal/útvonalak aktiválódnak abiotikus stresszek hatására.
28
2.4.3 . A szalicilsav szerepe biotikus és abiotikus stresszek során A SA stresszkörülmények között betöltött szerepét számos növényfajban vizsgálták (Bandurska és Stroinski, 2005; Cameron és mtsai, 1999; Delaney és mtsai, 1994; Krantev és mtsai, 2008). Önmagában a SA is okozhat stresszt a növények számára. Vízkultúrában nevelt paradicsomban az 1 mM SA csökkentette többek között a sztómakonduktanciát (gs), a maximális CO2-fixációs rátát, a fotoszintetikus kvantumhatásfokot és a Rubisco karboxilációs hatásfokát, majd végül a növények pusztulását okozta (Poór és mtsai, 2011). Őszi búza (Triticum aestivum cv. Dogu-88) levelében 24 óra elteltével, a 0,5 mM SA-kezelés csökkentette a transzspirációt és a sztómakonduktanciát, mialatt fokozta a lipidperoxidáció mértékét és a peroxidázok szintjét (Yordanova és Popova, 2007). Arabidopsis thaliana Landsberg erecta ökotípusában a 0,1; 0,5; 1; 2; 3 és 5 mM SA-kezelések fokozták a H2O2termelést, a lipidperoxidációt és a fehérjék oxidatív károsodását, továbbá klorofill- és karotinoid izomerek képződését eredményezték (Rao és mtsai, 1997). Ezen kívül a magasabb SA koncentráció gátolta, míg az alacsonyabb serkentette a gyökér és hajtásnövekedést a sztómazáródás befolyásolásán keresztül számos növényfajban (Gutiérrez-Coronado és mtsai, 1998; Hussein és mtsai, 2007; Manthe és mtsai, 1992). Szintén búzában az exogén SA csökkentette a transzspirációt (Luo és mtsai, 2009) és gátolta a cisz-ABA-indukált sztómazáródást; 0,05 mM koncentrációban alkalmazva pedig serkentette a gyökér apikális merisztémáinak sejtosztódását, fokozta az ABA és indolecetsav (IAA) felhalmozódását, de nem befolyásolta a citokinin-szintet (Shakirova és mtsai, 2003). Kakukkfűben (Thymus daenensis Celak.) az SA-kezelés csökkentette a vízhiány növekedésre és az esszenciális olajtartalom mennyiségére, ill. összetételére kifejtett negatív hatását (Pirbalouti és mtsai, 2014). A SA befolyásolja a Rhizobium-ok és hüvelyes növények között szimbiózist is. Az 1-5 mM SA gátolja a pillangósvirágúak gümőképződését, és csökkenti a nóduszok számát szójában (Lian és mtsai, 2000). Az ettől alacsonyabb SA-koncentráció a gümőképződés mértékének csökkenését idézi elő Vicia sativa és borsó növényekben, ugyanakkor Phaseolus vulgaris, Lotus japonicus és szója esetén határozott csomóképződés, de a noduláció elmaradása volt megfigyelhető (van Spronsen és mtsai, 2003). 0,1 illetve 0,5 mM SA növelte az APX és G-POD aktivitását, valamint az oHCA és a SA mennyiségét, ugyanakkor csökkentette a PA-szinteket fiatal borsó növényekben (Szalai és mtsai, 2011). Biotikus stressz során a SA szükséges a SAR kialakulásához, melyet egy helyi, patogénnel, mikróbával, vagy egy effektorral kapcsolatos molekuláris esemény vált ki
29
(Conrath, 2011), és ahol az SA, pontosabban ennek metilált formája, az endogén jelátvivő molekula szerepét tölti be. Maga a SAR a növényi rezisztencia azon fajtája, amikor a növény egy korábbi, kisebb mértékű fertőzés vagy valamilyen vegyszeres kezelés hatására ellenállóvá válhat egy későbbi, már nagy károkat okozó fertőzéssel vagy mérgezéssel, pl. permetezéssel szemben. Továbbá a SA szerepet játszik a hiperszenzitív reakció (HR) kialakításában, melynek köszönhetően a rezisztens gazdanövény sejtjei a fertőzés közvetlen környezetében a programozott sejthalál révén elpusztítják önmagukat, annak érdekében, hogy a kórokozót is elpusztítva megakadályozzák a betegség további terjedését, elszigetelve azt a még ép szövetektől. Pasqualini és mtsai (2002) úgy találták, hogy dohány növényben a SA modulálja a hiperszenzitív sejthalált. Paradicsomban (Lycopersicon esculentum. Mill cv. Vollendung) a SAR mesterségesen is kiváltható volt benzo-(1,2,3)-tiadiazol-7-karbotioiksav-S-metilészter (BTH) kezeléssel, amely a SA szintetikus analógja, és megvédte a növényt a 7 nappal későbbi uborkamozaik vírus sárga törzsének fertőzése (CMV-Y, yellow strain of Cucumber mosaic virus) által okozott nekrózistól (Anfoka, 2000). A SA-at katekollá átalakító enzim, a SA-hidroxiláz, fokozott működése gátolja a SAfelhalmozódását, ezáltal a SAR kialakulását is. A Pseudomonas putida-ból származó, a SAhidroxilázt kódoló NahG gént hordozó transzgénikus dohány- (Nicotiana benthamiana Domin) és Arabidopsis-növények, valamint a SA-termelésre képtelen Arabidopsis sid2 mutánsok fogékonyak voltak a patogénfertőzésre, bennük nem alakult ki SAR (Delaney és mtsai, 1994). A vírusfertőzések egyrészről a sejtek stresszválaszát, a SA mennyiségének növekedését, másrészről a növényi fejlődés csökkenését idézik elő. Ezek hatására számos gén indukálódik, mint például a β-1-3-glukanázt, a hősokkfehérjéket (HSP), kitinázokat kódolók és több, patogenezissel kapcsolatos (PR, pathogenesis-related) gén, mint amilyen a PR-1 is (Whitham és mtsai, 2006). A SA másik formája, a metil-SA, melynek képződését, a plasztiszokban, SA-ból a SA-karboxil-metil-transzferáz (SAMT) katalizálja (Huang és mtsai, 2003; Kumar és Klessig; 2003), szintén szerepet játszik a SAR kialakulásában. Gyors mobilizálhatósága miatt a SA helyett ez funkcionál jelmolekulaként és a patogénfertőzéstől távolabbi szövetekben indukálja a növényi védelmi rendszert (Park és mtsai, 2007), gátolva ezzel a fertőzés okozta károk növekedését. A SA exogén alkalmazása indukálja az ozmotikus stresszel szembeni toleranciát (Hussain és mtsai, 2010; Najafian és mtsai, 2009a,b). Búzanövénykék ozmotikus stresszel szembeni toleranciája csökkent nitrogén-monoxid hatására, mivel az lefékezte az indukált oxidatív stresszt redukáló SA-jelátvitelt (Alavi és mtsai, 2014). Rozmaring- (Rosmarinus
30
officinalis L.) és kakukkfű- (Thymus vulgaris L.) növények levelére permetezve a 150, 300, valamint 450 ppm SA is védelmet nyújtott az 50, 100, illetve 150 mM NaCl által okozott stresszel szemben (Najafian és mtsai, 2009a,b). Sóstressznek kitett növényekben a SA-kezelés hajtás- és gyökérnövekedést indukált, továbbá növelte a fotoszintetikus rátát, a sztómakonduktanciát és a vízfelhasználás hatásfokát, ezzel szemben csökkentette a transzspirációs rátát és a sejtek ionáteresztő képességét a kezeletlen növényekhez viszonyítva. Paradicsomban 10 mM SA az oxidatív védelmi mechanizmusok aktiválásán és egyes ozmolitok felhalmozásán keresztül fokozta a NaCl-dal szembeni toleranciát (Szepesi és mtsai, 2005). Búzában 0,05 mM SA-val történő kezelés csökkentette a fitohormonok szintjének sóstressz alatt bekövetkező változásait, megakadályozta az IAA- és a citokinin-tartalom csökkenését, és ez által redukálta a növény növekedésének stressz-indukálta gátlását (Shakirova és mtsai, 2003). SA-kezelt növényekben ABA-felhalmozódás is megfigyelhető, amely elősegíti az antistressz-reakciók kifejeződését, pl. a prolin-akkumulációt. Marcińska és mtsai (2013) megállapították, hogy búza exogén SA-val vagy ABA-val, továbbá PEG-gel történő kezelése javítja, különösen a toleráns genotípusokban, a PEG-indukált ozmotikus stressz káros hatásait a jobb ozmotikus beállításon keresztül, melyet inkább a prolin- és szénhidrát-tartalom növelésén keresztül érnek el, mintsem az antioxidáns kapacitás fokozásán át. Ezzel szemben hőstressz esetén az exogén SA, ABA, illetve 1-aminociklopropán-1karboxilsav (ACC , az etilén prekurzora) a magas hőmérséklet okozta oxidatív stressz hatását az antioxidáns rendszer indukcióján át csökkentették, növelve ezzel az Arabidopsis-növények hőtoleranciáját (Larkindale és Knight, 2002). Janda és mtsai (1999) kimutatták, hogy a SA exogén alkalmazása laboratóriumi körülmények között fokozza a kukorica hidegtűrését. Őszi búzában a 24 órás 0,5 mM SAelőkezelés szintén védelmet nyújtott a hidegkezeléssel szemben, amely a hideg okozta Rubisco
(ribulóz-1,5-biszfoszfát-karboxiláz/oxigenáz)
aktivitás
és
klorofill-tartalom
csökkenésének gátlásában, valamint az antioxidáns enzimek (APX, KAT, POD) és a glikolátoxidáz aktivitásának növelésében nyilvánult meg (Yordanova és Popova, 2007). Pál és mtsai (2011) szerint átfedés lehet a SA-kapcsolt stresszválasz és az ABA-indukálta hidegakklimáció között hidegkezelt kukoricában. Kukorica és árpa szemek 6 órás 500 µM SA oldatban való áztatása fokozta a belőlük kifejlődött, 14 napos növénykék 10, 15, ill. 25 μM Cd-mal szembeni toleranciáját. Ugyanez a hatás volt megfigyelhető, amikor 0,5 mM, tápoldathoz adagolt, SA-val kezelték az árpa növényeket, vagy 8 órán át 250, illetve 1000 μM SA-oldatban magáztatott len (Linum usitatissimum L.) növénykéket vizsgáltak (Belkadhi és mtsai, 2014). Az exogén SA növelte a
31
gyökér- és hajtáshosszt, a száraz- illetve frisstömeget, továbbá gátolta a lipidperoxidációt, melyet az MDA-tartalom alapján követtek nyomon 25 μM Cd jelenlétében (Metwally és mtsai, 2003). Tápoldatban lévő Cd jelenlétében a levélre permetezett 0,4 mM SA növelte a hüvelyek és a szárelágazások számát, ugyanakkor csökkentette a gyökér száraztömegét, a növény magasságát, továbbá a szártagok hosszát szójában, a SA-as permetezés ismétlése pedig negatív hatást gyakorolt a magasságra és a szártagok számára (Akbari és mtsai, 2013). A Cd-kezelések által megnövelt prolintermelés, lipidperoxidáció-szint és ionkiáramlás mértéke csökkent a SA-előkezelt növényekben. A Cd ezen kívül kukoricában csökkentette az APX és drasztikusan emelte a SOD aktivitását, ugyanakkor a SA-előkezelt növényekben megnövekedett APX, SOD és erősen redukált KAT aktivitás volt megfigyelhető (Krantev és mtsai, 2008). Az exogén SA csökkentette a 25 μM Cd-kezelés által indukált antioxidáns enzimaktivitásokat árpában (Metwally és mtsai, 2003). A Cd-szenzitív Phaseolus aureus és Cd-toleráns Vicia sativa magjainak 100 μM SA-ban való áztatása csökkentette az 50 μM Cd által indukált H2O2, illetve O2·- akkumulációját, valamint növelte a SOD, KAT és APX aktivitását (Zhang és mtsai, 2011). Az exogén SA befolyásolja a növényi részek ásványi anyagtartalmát is. Lucernában a 10 μM SA-kezelés elősegítette a Cd-felhalmozódását, továbbá fokozta a Cd K-, Mg-, Ca- és Fe-tartalomra kifejtett negatív hatását a gyökerekben, azonban a hajtásokban ennek ellentéte, a K-, Mg- és Ca-szintek növelése volt a jellemző, melyet a SA és a Cd külön-külön, illetve együttesen is indukált (Dražić és mtsai, 2006). Ezeken kívül az SA védő tevékenysége magában foglalja a különböző antistressz programok fejlesztését és a növekedési folyamatok helyreállításának gyorsítását a stressz megszűnése után (Shakirova és mtsai, 2003). 2.4.4 . A szalicilsav hatásmechanizmusa és annak szabályozása A SA hatása, illetve hatásmechanizmusa sokféle lehet a növényi testben. Számos jelátviteli útvonal eleme, melyek mind részt vesznek a stresszorok elleni védelemben. A teljesség igénye nélkül, csak a dolgozathoz legszorosabban kapcsolódókat emelem ki pontokba szedve, elsősorban az endogén SA-ra összpontosítva. i) Patogénfertőzés hatására a SA először felhalmozódik a növény fertőzött leveleinek kloroplasztiszaiban, majd lipidoldékony MeSA-vá alakulva átlép a plasztiszmembránon keresztül a citoplazmába (Kumar és Klessig, 2003), ahol a SABP2 (SA-binding protein 2) metilészteráz aktivitása által visszaalakulhat SA-vá és kifejtheti hatását a rezisztencia útvonalakra (Herrmann és Weaver, 1999). A MeSA-SA átalakulás megváltoztatja a
32
citoplazma redoxpotenciálját, ami aktiválja az NPR1-et (nonexpressor of pathogenesisrelated protein genes 1), amely egy transzkripciós kofaktor, és a védekező válaszok, köztük a SAR egyik nélkülözhetetlen, kulcsfontosságú regulátora a növényekben (Mou és mtsai, 2003). Normál körülmények között az NPR1 a citoplazmában multimer formában van jelen, azonban ahhoz, hogy beléphessen a sejtmagba, monomerekre kell bomlania (Kinkema és mtsai, 2000). A sejtmagban ezután a monomer NPR1 kapcsolódik a bZIP transzkripciós faktorok TGA vagy OBF családjának tagjaihoz, transzkripciós kaszkádot indít el, és aktiválja olyan védekező gének expresszióját, mint pl. a PR-1 (Despres és mtsai, 2003; Fan és Dong, 2002; Johnson és mtsai, 2003; Whitham és mtsai, 2006; Zhou és mtsai, 2000). Mindezek mellett pedig szabályozottan gátolja az alap celluláris folyamatok, mint a fotoszintézis génjeit, mintegy előtérbe helyezve a növényi immunválaszokat a növény növekedése árán (Spoel és Dong, 2012). ii) Megfigyelték azt is, hogy a helyi patogénfertőzés serkenti a MeSA-on kívül a glicerol-3-foszfát (G3P) mint mobilis immunszignál molekula, illetve a lipid-transzfer fehérjék (DIR1 (Defective in Induced Resistance 1), AZI1 (Azelaic Acid Induced 1)) képződését (Jung és mtsai, 2009). Ezután ezek a vegyületek a növény szállítórendszerén keresztül eljutnak annak szisztemikus, nem fertőzött részeibe, ahol indukálják a SA akkumulációját (4. ábra). A SA ezután a korábban leírt módon indukálja az antimikrobiális aktivitással rendelkező PR fehérjék szekrécióját (Ward és mtsai, 1991), továbbá kiváltja a hisztonok metilációját és egyéb kromatin-módosulásokat, amelyek előkészítik/felkészítik (priming) az immunkapcsolt géneket a fokozott expresszióra és immunmemóriát, valamint szomatikus homológ rekombinációval a BRCA2 (Breast Cancer Susceptibility 2) és RAD51 működésén keresztül az immunitás transzgenerációs memóriáját hozza létre (Spoel és Dong, 2012).
33
4. ábra: A SA szerepe és hatásmechanizmusa biotikus stressz során (Spoel és Dong, 2012).
iii) A SA befolyásolja más vegyületek, pl. a JA, metil-jazmonát (MeJA), etilén, ABA mennyiségét és hatásait (Jones és Dangl, 2006), és fordítva (Ogawa és mtsai, 2005; Pál és mtsai, 2013b). A JA, akárcsak a SA, védő szerepet tölt be biotikus stressz alatt, védi a növényt a rovaroktól és a nekrotróf patogénektől. Hatása különböző védő gének aktiválását eredményező jelkaszkádon keresztül nyilvánul meg (Li és mtsai, 2002), mely nem azonos a SA által befolyásolttal, bár vannak közös pontjaik, ilyen az NPR1 is, ami a két jelátviteli út közötti kapcsolat kritikus modulátora (Beckers és Spoel, 2006; Dong, 2004). Az Arabidopsis WRKY62 a WRKY III. transzkripciós faktor család tagja, amelyet a SA és MeJA is indukál. Már nagyon alacsony SA koncentráció esetén a citoszólikus NPR1 irányítja a MeJA-indukált WRKY62-expressziót, ami így leszabályozza a JA-válasz LOX2 és VSP2 gének expresszióját (Mao és mtsai, 2007). Szintén Arabidopsis-ban vizsgálták a glükoziltranszferáz UGT76B1-et, mint a SA-JA jelátviteli kapcsolatának újabb szereplőjét. Megállapították, hogy az UGT76B1
34
patogénfertőzés hiányában csökkenti a SA-függő növényi védelmet, elősegítve ez által a JA választ, továbbá késlelteti az öregedést (von Saint Paul és mtsai, 2011). Ebből is látható, hogy a SA és JA jelátvitele többnyire akadályozza egymást. Korábban egyértelmű antagonizmusról számoltak be a JA és a SA között, azonban egyre több ennek ellentmondó adat kerül napvilágra (Beckers és Spoel, 2006; Mika és mtsai, 2010; Proietti és mtsai, 2013; Thaler és mtsai, 2012). Hőstressznek kitett Arabidopsis növényeken végzett vizsgálatok alapján Larkindale és Knight (2002) feltételezték, hogy a SA, ABA és etilén által indukált oxidatív stressz elleni védelemben ez a három vegyület a Ca2+/CaM-jelátviteli úton keresztül fejti ki hatását. iv) Du és mtsai (2009) Arabidopsis-ban leírtak egy mechanizmust, melyben a Ca2+ szignál a SA-mediált immunválaszhoz kalmodulinon, AtSR1-en (Arabidopsis thaliana responsive 1), egy Ca2+/kalmodulin-kötő transzkripciós faktoron és az EDS1 (enhanced disease susceptibility 1 protein) SA regulátoron keresztül kapcsolódik. Arabidopsisban a megnövekedett SA szintek önmagukban elegendőek ahhoz, hogy fokozott immunválaszt és redukált növekedést okozzanak. Az AtSR1 interakcióba lép az EDS1 promóterével és represszálja annak expresszióját. A SA degradáló enzim, a NahG, expressziója egyaránt szupresszálja a kórrezisztenciát és a retardált növekedést néhány megemelkedett SA-szintű kórrezisztens (acd6, bon1, ssi1) mutánsban, de más mutánsokban (mpk4 és dnd1) csak a kórrezisztenciát. A folyamatos PR1 expressziója gátolt az Atsr1-1 NahG növényekben és mind az Atsr1-1 NahG, mind a vad típusú NahG növények sokkal érzékenyebbek a Pseudomonas syringae fertőzésre, mint a vad típusú növények. Az EDS1 képes dimert képezni és kölcsönhatásba lépni a PAD4-gyel (phytoalexin deficient 4), amely szintén a SAfelhalmozódás pozitív regulátora (Bartsch és mtsai, 2006). v) A SA befolyásolja az enzimatikus és nem-enzimatikus antioxidáns rendszert is, amelynek serkentett működésén keresztül fokozza a növények különböző stresszorokkal - pl. paraquattal, ózonnal, nehézfémekkel, alacsony és magas hőmérséklettel, szárazsággal szembeni toleranciáját (Choudhury és Panda, 2004; Krantev és mtsai, 2008; Larkindale és Huang, 2004; Metwally és mtsai, 2003, Pál és mtsai, 2011). Ugyanakkor ez a vegyület képes közvetlenül kötődni a KAT enzimhez, amelynek gátlása miatt megemelkedik a H2O2-szint (Conrath és mtsai, 1995). Dohányon, Arabidopsis-on, uborkán és paradicsomon végzett kísérletek során kiderült, hogy a SA-kötő fehérje, a SABP, valójában egy SA-gátolt KAT enzim, ami a SA kötődésekor elveszíti funkcióját, szerepe az, hogy serkenti a PR-1 gén expresszióját és fokozza a különböző patogénekkel, pl. a dohánymozaik vírussal szembeni toleranciát (Conrath és mtsai, 1995; Sánchez-Casas és Klessig, 1994). Rao és mtsai (1997)
35
szerint viszont az SA-indukált H2O2-termelés a Cu/Zn-SOD fokozott aktivitásával állt kapcsolatban Arabidopsis-ban és független volt a KAT, ill. APX működésétől. A H2O2 magas szintje serkenti az annak eliminálásáért felelős egyéb antioxidáns enzimek aktivitását (Çakirlar és mtsai, 2011), továbbá jelmolekulaként nagymértékben befolyásolja a proteinfoszfatázok, kinázok, ioncsatornák működését, az ABA-függő és –független jelátviteli utakat, amelyek szerepet játszanak a stressztolerancia kialakításában (Köhler és mtsai, 2003; Pei és mtsai, 2000; Rhee, 2006). Szárazságstressznek kitett paradicsom vagy sóstressznek kitett Brassica juncea növények levelére permetezve a SA fokozta a KAT, POD és SOD működését (Hayat és mtsai, 2008; Yusuf és mtsai, 2008). A SA az antioxidánsok másik csoportját képező tiolok mennyiségét is növeli. Megemelte a GSH-tartalmat és a GSH/GSSGarányt borsóban (Srivastava és Dwivedi, 1998), Arabidopsis-ban (Borsani és mtsai, 2001), illetve nikkel-hiperakkumuláló Thlaspi fajokban (Freeman és mtsai, 2005), ezáltal indukálva azok stressztoleranciáját. A GSH aktiválhatja az NPR1 és protein foszfatáz 2C fehérjék szabályozását, amelyek a SA és ABA jelzés fontos elemei (Meinhard és mtsai, 2002; Mou és mtsai, 2003). Fagopyron tartaricum levelek 150 mg l-1 SA-kezelése már 24-48 órán belül indukálta a flavonoid bioszintézis enzimeit kódoló géneket, név szerint a kalkone-szintáz (FtCHS), flavonol-szintáz (FtFLS-like), flavon-3-hidroziláz (FtF3H) és a 4-kumaroil-CoAligáz (Ft4CL) génjeit, amely a rutin mennyiségének nagymértékű emelkedését okozta (Sun és mtsai, 2012). Felmerül a kérdés, hogy vajon a növény saját, endogén SA-mennyisége egyáltalán befolyásolja-e a különböző stresszorokkal szembeni ellenálló-képességet. Ha igen, milyen mértékben és hogyan? Az exogén SA hatásairól fent számos információ található. Kérdés továbbá az is, hogy az endogén és az exogén SA hatásmechanizmusa azonos-e, vagy sem, ha nem, akkor milyen mértékben térnek el egymástól? Vajon szükséges-e egy adott SA-szint a stressztolerancia kialakításához? Ha igen, akkor az alacsony SA-szint hatásai fokozhatóak-e, esetleg szükség szerint kompenzálhatóak-e exogén SA-kezeléssel? Jelen dolgozat témája az endogén SA hatásainak vizsgálatára korlátozódott, abban a reményben, hogy sikerül néhány kérdésre választ találni.
36
3. KUTATÁSI CÉL A kutatás célja a búza különböző stresszkörülmények között adott élettani válaszainak jobb megismerése a kezdeti endogén szalicilsavszintjük tükrében. Elsősorban arra kerestük a választ, hogy: Egyes búzafajtáknak és vonalaknak milyen az endogén SA- és PA-tartalma? Változik-e ezeknek az anyagoknak, különösen a SA-nak a mennyisége és minősége biotikus, illetve abiotikus stresszkörülmények között. Ha igen, hogyan? Miként befolyásolják a különböző stresszek a növényi védekezőrendszert? Van-e kapcsolat a SA-függő illetve egyéb védekezési mechanizmusok között? Befolyásolja-e a növény alap SA-szintje annak stresszekkel szembeni toleranciáját? A fent leírtakon kívül a munka egyes fázisai az alábbi kérdéskörök szerint tagolódtak: Az első kísérletsorozatban célunk nagyszámú búzagenotípus (fajták és közel-izogén vonalak) endogén SA- és PA–tartalmának meghatározása volt kontroll, illetve mesterséges levélrozsda- és természetes lisztharmatfertőzésnek kitett növényekben. Vizsgáltuk, hogy vajon a kétféle kórokozó mely genotípusokat milyen sikerességgel képes fertőzni, és azt, hogy ez kapcsolatban áll-e a vizsgált két vegyület kiindulási és fertőzés által befolyásolt mennyiségével. A második kísérletsorozatban célunk a szántóföldi eredmények alapján kiválasztott genotípusokban a mesterséges lisztharmatfertőzés hatásainak vizsgálata volt ellenőrzött, üvegházi körülmények között. A harmadik kísérletsorozatban célunk a Cd-stressz hatásainak jobb megismerése volt korábban már vizsgált genotípusokban. Ennek érdekében magas (500µM) illetve alacsony (50µM) koncentrációban alkalmazott Cd SA-bioszintézisre és anyagcserére, valamint az antioxidáns védekezőrendszerre kifejtett hatásait vizsgáltuk különböző fejlettségi állapotban lévő növényekben azok Cd-mal szembeni toleranciájának függvényében. A negyedik kísérletsorozatban célunk a PEG-indukálta ozmotikus és szárazságstressz hatásainak jobb megismerése volt a korábban vizsgált, négy búzagenotípusban. Az ötödik kísérletsorozatban célunk az UV-B sugárzás egyedüli, illetve Cd-stressz vagy PEG-indukált ozmotikus stresszel kombinált hatásainak jobb megismerése volt egy választott búzafajtában.
37
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. Növényi anyag, növénynevelés, kezelések paraméterei 4.1.1. Búza növények nevelése és kezelése földben Szántóföldi kísérlet A szántóföldi kísérletek során 22 búza genotípus levelének SA- és PA-szint vizsgálatára került sor, köztük Thatcher-alapú közel-izogén vonalakat (TC, TC1, TC2C, TC3, TC3BG, TC3KA, TC9, TC11, TC18, TC19, TC24, TC25, TC26, TC28, TC29, TC33, TC34) és Martonvásáron nemesített őszi búzafajtákat (Mv Béres, Mv Hombár, Mv Marsall, Martonvásári 8=Mv 8 és Mv Regiment) használtunk (Kovács és mtsai, 2012). A Thatcheralapú közel-izogén vonalak szemei eredetileg Dr. James A. Kolmer-től (Cereal Disease Laboratory, USDA St. Paul, MN, USA) származtak. Ezek a vonalak jól ismert levélrozsdarezisztenciáért felelős géneket hordoztak (Lr1, Lr2, Lr3, Lr9, Lr11, Lr18, Lr19, Lr24, Lr25, Lr26, Lr28, Lr29, Lr33, Lr34), és különböző mértékű toleranciát mutattak a levélrozsdával szemben. A kísérletre az MTA Agrártudományi Kutatóközpont, Mezőgazdasági Intézet rozsdakertjében került sor. A szemek egyenként 1,4 m hosszú, kétsoros parcellákba lettek ültetve, egymástól 15 cm-re. A növények levélmintáinak leszedésére a mesterséges, levélrozsdával történő inokuláció után került sor.
A rozsdakertben a vizsgált növények
(GS37) köré fogékony búzaváltozatok voltak ültetve, a fertőzéshez a levélrozsda uredospóra keveréke lett felhasználva a Zadoks és mtsai (1974) által leírtak alapján. A spóraszuszpenzót injekciós fecskendő segítségével a növényekbe injektálták. Ezt követően a patogének természetes módon terjedtek szét a növényben a befecskendezésük helyétől. A mesterséges levélrozsda-fertőzésen kívül egyes genotípusokon kisebb-nagyobb mértékben megjelent a természetes lisztharmatfertőzés is. A begyűjtött mintákat a zászlós levelek alatti első és második levelek képezték a kontroll és fertőzött növények esetén egyaránt. A kontroll növényekről a fertőzés előtt, a fertőzöttekről az inokuláció után 14 nappal szedtünk mintákat. Üvegházi kísérlet Növénynevelés: A szántóföldi kísérletek alapján 11 különböző búza genotípust (Alcedo, Mv Marsall, Mv Toborzó, Mv Béres, Mv Hombár, Mv 8, TC33, TC29, TC26, TC19 és TC9) választottunk ki, melyek üvegházi körülmények között, fiatal (7 napos) korban lisztharmatfertőzésnek lettek kitéve.
38
A fiatalkori kísérletekben is használt genotípusok közül négy, levélrozsdával szemben ismert rezisztenciagént hordozó Thatcher-alapú közel-izogén vonal (TC9: Thatcher*6/Transfer, TC19: Thatcher*7/Translocation4, TC26: Thatcher*6/ST-1.25, TC33: Thatcher*6/P.I.58548) lett kiválasztva, és felnőtt (GS45) korban lisztharmatfertőzésnek kitéve. A búzavonalak növénykéi 2 °C-os, 28 napos vernalizációt követően 2:1 arányú föld:homok keverékbe, 11x18 cm-es cserepekbe (2 db növény/cserép); a fiatalkori kísérlethez 50x40 cm-es faládákba (50 db növény/sor/genotípus, 11 genotípus/faláda; 3 db kontroll és 6db fertőzött láda) lettek ültetve, majd mintaszedésig az üvegházban 22/16 °C-on (nappal/éjszaka), természetes és mesterségen fényen, 16 órás fotoperiódus mellett lettek nevelve. Fertőzés: Az inokuláció a lisztharmat ismert virulenciaspektrumú (melyet különböző hordozó gének segítségével határoztak meg: Pm0, 1, 2, 3a, 3b, 3c, 3d, 3f, 4a, 4b, 5, 6, 7, 8, 17, 2+6, 2+4b+8, 1+2+9 és 2+Mld) patotípusait tartalmazó keverékével történt. Az inokulációra a konídiumok levélfelületre szórásával, a növények 7 napos, illetve GS45 felnőtt állapotában került sor Zadoks és mtsai (1974) módszere alapján.
Mintavétel: A fiatalkori növények esetében minden levél, felnőttkori növények esetében minden vonal 8-8 cserepéről, a zászlós levelek alatti első, második és harmadik levelek lettek leszedve mintának, a kontroll és fertőzött növények esetén egyaránt, 3 nappal és 7 nappal az inokulációt követően. A leszedett mintákat
azonnal folyékony nitrogénben fagyasztottuk, majd
feldolgozásig -80 °C-on tároltuk. Azonban az antioxidáns enzimaktivitás-méréshez gyűjtötteket folyékony nitrogénes fagyasztás helyett először -20, majd -80°C-on tároltuk. Előkísérletek során mérhető különbségeket tapasztaltunk a kétféle fagyasztási mód között, az előbbi módszer alkalmazása nagyobb mértékben károsította a vizsgált működő fehérjéket, mint az utóbbi. A leírt mintaszedési eljárást alkalmaztuk minden, a későbbiekben leírt kísérlet során is.
39
4.1.2. Búzanövények nevelése és kezelése tápoldaton Az előkísérletek eredményei alapján négy, eltérő endogén SA tartalmú (Kovács és mtsai, 2012) búza (Triticum aestivum L.) genotípust, kettő viszonylag magas endogén SA tartalmú
Thatcher-alapú
közel
izogén
vonalat
(TC19=Thatcher*7/Translocation4,
TC33=Thatcher*6/P.I.58548) és kettő viszonylag alacsony SA tartalmú martonvásári őszi búza fajtát (Mv 8 és Mv Hombár) használtunk a további kísérletekhez. Ezeket használtuk a Cd-, illetve PEG-kezeléses kísérletekhez, míg a szintén alacsonyabb SA-tartlamú Mv Emesét az UV-B- és/vagy Cd- vagy PEG-kezeléses kísérlethez. A szemeket 3 napig Milli-Q vízzel nedvesített szűrőpapíron, sötétben, 22 °C-on csíráztattuk. Erre azért volt szükség, mert a tápoldatban történő nevelés technikai feltételei nem megfelelőek a búzaszemek csíráztatása számára. A szemek nehezen helyezhetőek el úgy az alkalmazott fémrácsokon, hogy a csírázáshoz elegendő folyadékot kapjanak, de ne száradjanak ki a tápoldat párolgása ellenére se, továbbá ne is ússzanak a tápoldatban, amely szintén gátolja a csírázást.
MAKROELEMEK
MIKROELEMEK
0,3125 mM KNO3
11,92 μM HBO3
0,45 mM Ca(NO3)2
4,57 μM MnCl2*4H2O
0,0625 mM KH2PO4
0,191 μM ZnSO4*7H2O
0,125 mM MgSO4*7H2O
0,08 μM CuSO4*5H2O 0,024 μM (NH4)6Mo7O24*4H2O 15,02 μM FeSO4*7H2O 23,04 μM Na2EDTA*5H2O
2. táblázat: A növényneveléshez használt módosított Hoagland tápoldat összetétele
A kicsírázott növényeket ezután főzőpohárban (12 növény/főzőpohár), 300 ml módosított összetételű (1. táblázat) Hoagland tápoldatban, az MTA ATK Mezőgazdasági Intézet Fitotron épületének Conviron PGR-36 típusú növénynevelő kamrájában (Controlled Environments Ltd, Winnipeg, Kanada) neveltük 20/18 °C-on 75% relatív páratartalom és 16/8 óra fény/sötét periódus (PPFD: 250 μmol m-2 s-1) mellett. A növények megfelelő tápanyag- és levegőellátottsága miatt kétnaponta a tápoldatok teljes cseréjére, a köztes napokon pedig az elpárolgott oldatok pótlására került sor.
40
4.1.2.1. Kadmiumkezelések paraméterei Magas kadmium-koncentráció A növények egy részét normál növekedési feltételek mellett (a 4.1.2. fejezetben leírtak szerint), a másik felét 500 M Cd(NO3)2-ot tartalmazó tápoldaton neveltük 11 napig. A kezelést követően mintát szedtünk minden növény leveléből és gyökeréből.
Alacsony kadmium-koncentráció A növények egyharmadát normál növekedési feltételek mellett neveltük, ezután 17 és 24 napos korban mintát szedtünk a levélből és a gyökérből. A növények második harmadát 50 M Cd(NO3)2-ot tartalmazó tápoldaton neveltük 17 napig, majd levél- és gyökérmintát szedtünk. A növények harmadik harmadát 17 napig normál körülmények között neveltük, azután 7 napig a tápoldathoz adagolt 50 M Cd(NO3)2-tal kezeltük, majd a 24 napos korban levél- és gyökérmintát szedtünk. A gyökérmintákat mérés és fagyasztás előtt először csapvízben, utána 92,2 mM EDTA-oldatban, majd Milli-Q vízben mostuk, a felesleges folyadékot pedig papírtörlővel itattuk le. Ezzel a módszerrel a gyökereken maradt Cd keletálható, és a tápoldat egyéb összetevőivel együtt a gyökereken maradó mennyisége minimálisra csökkenthető, ezáltal a mérési eredmények pontosabbá, megbízhatóbbá tehetőek. 4.1.2.2. Polietilén-glikollal (PEG) történő kezelések paraméterei A kísérletek során a 17 napos, normál körülmények közötti nevelés (a 4.1.2. fejezetben leírtak szerint) után a növények egyik felét megtartottuk kontrollnak, a másik felének tápoldatához 15 %-ban PEG-6000-et adtunk. Öt nap elteltével levél- és gyökérmintát szedtünk mind a kontroll, mind a kezelt növényekből. 4.1.2.3. UV-B sugárzással történő előkezelés/edzés paraméterei A martonvásári Mv Emese búzafajta szemeit a 4.1.2. fejezetben leírtak szerint csíráztattuk
ki,
majd
a
növénykéket
módosított
Hoagland
tápoldatot
tartalmazó
főzőpoharakban (12 növény/főzőpohár) neveltük az MTA ATK Mezőgazdasági Intézet Fitotron épületének Conviron GB-48 típusú növénynevelő kamrájában (Controlled Environments Ltd, Winnipeg, Kanada) 20/18°C-on 75% relatív páratartalom mellett. A
41
növényeket két csoportra osztottuk. Az első csoportot a 16/8 órás fény/sötét periódus (PPFD: 250 μmol m-2 s-1) során normál megvilágításnak (fehér fény) tettük ki, míg a másik csoportot fehér fénynek és egyidejűleg alkalmazott UV-B sugárzásnak tettük ki. Az UV-B-t 7 darab UV-B Narrowband TL 100W/01 típusú Philips lámpa szolgáltatta, melynek maximális sugárzása 311 nm-nél található. Az UV-B sugárzás dózisa a kontroll növények esetében 38 Watt cm-2, míg az UV-B-kezelteknél 430 Watt cm-2 volt. A két hetes növényeket mindkét megvilágítás esetén három csoportra osztottuk; egy részük volt a kontroll, második részük 50 μM Cd(NO3)2-ot kapott 7 napig, a harmadik részük 15% PEG-6000-et kapott 5 napig a tápoldathoz adagolva. A kezelések végén az első, második és harmadik levelekből, illetve a gyökerekből szedtünk mintát. 4.2. Vizuális morfológiai változások értékelése Lisztharmat-fertőzöttség mértékének fenotípusos meghatározása A levélbetegségek intenzitásának értékelésére általánosan használt Saari-Prescott pontozási skálát (0-9) (Saari és Prescott, 1975) alkalmaztuk minden búzafajta, illetve Thatcher-alapú közel-izogén búzavonal 16-16 növényének pontozására a lisztharmatfertőzés utáni hetedik napon, szántóföldi és üvegházi körülmények között egyaránt. Levélcsavarodás mértékének pontozása PEG-kezelt növényeken Pázsitfűféléknél a levélcsavarodás a levél vízhiányra adott válaszának erős megnyilvánulásaként értelmezhető. Ha a növények a stressz megjelenésének korai szakaszában levélcsavarodást mutatnak, az arra utal, hogy gyenge a szárazsággal szembeni toleranciájuk. A levelek csavarodásának pontozására egy 1-től 5-ig terjedő skála alapján került sor, ahol az 1 az alig vagy egyáltalán nem csavarodott levelet jelöli, míg az 5 a teljesen összecsavarodottat (O'Toole és Cruz, 1980). A levelek látható csavarodásának pontozására a PEG-kezelés ötödik napján történt. 4.3. Relatív klorofilltartalom mérése A relatív klorofilltartalom meghatározásához egy SPAD-502 klorofill mérő (Minolta Camera Co., Ltd, Japán) berendezést használtunk. A SPAD-502 mérő a levélen keresztül méri a vörös (650 nm) és az infravörös (940 nm) sugárzások áteresztőképességi együtthatóját,
42
transzmittanciáját, és egy relatív SPAD mérő értéket számol. A mérések a második vagy harmadik teljesen kifejlett levélen történtek. 4.4. Klorofill fluoreszcencia indukció mérése A PSII kvantumhatásfokát a F/Fm’ [(Fm’- Fs)/ Fm’] klorofill fluoreszcencia indukciós paraméterrel jellemeztük, ahol az Fm’ és az Fs a maximum és a steady-state klorofill fluoreszcencia szinteket mutatja fényadaptált állapotban. Ennek mérése teljesen kifejlett leveleken, egy impulzus amplitúdó modulált fluorométerrel (PAM-2000, Walz, Effeltrich, Németország) történt (Janda és mtsai, 1994). 4.5. Szalicilsav-extrakció és mennyiségi analízis A SA mennyiségi és minőségi elemzését HPLC-vel Meuwly és Métraux (1993) módszere szerint a következőképpen végeztük: 0,5 g növényi mintát folyékony nitrogénben, 0,25 g kvarchomok segítségével dörzsmozsárban homogenizáltuk, 2 ml 70 %-os metanolt 250 ng orto-anizinsavat (oANI: belső standard) és 25 μg para-hidroxi-benzoesavat (pHBA: extrakciós carrier) adtunk hozzá. Vortexeltük, majd a 4 °C-on 10000 g-vel 10 percig tartó centrifugálást követően a felülúszót félretettük. A csapadékot 2 ml 90%-os metanollal újra extraháltuk, vortexeltük, 4 °C-on 10000 g-vel 10 percig ismét centrifugáltuk. Az így képződött felülúszót a korábban félretetthez hozzáöntöttük és vákuumbepárlóban vizes fázisig bepároltuk. Ezután 1 ml 5%-os (w/v) TCA-t adtunk a mintákhoz, vortexeltük, 4 °C-on 10 percig 10000 g-vel centrifugáltuk. A felülúszóból a szabad SA-t 4 ml ciklohexán:etilacetát = 1:1 (v/v) elegyével extraháltuk. A felső szerves fázist Pasteur-pipettával üvegfiolákba átvittük, vákuumbepárlóban szárazra pároltuk és a mérésig −20 °C-on tároltuk. Az alsó vizes fázisból a kötött formájú SA savas hidrolízissel szabadítható fel, ezért a csövek tartalmához 25 μl 1 mg ml-1 pHBA-t, 5 μl 0,05 mg ml-1 oANI-t és 1,3 ml 8N HCl-t adtunk, ezután 80 °C-on 60 percig inkubáltuk, majd a fent leírtak szerint
extraháltuk. Az
üvegfiolákba
átpipettázott
felső
szerves
fázisokat
vákuumbepárlóban szárazra pároltuk és felhasználásig -20 °C-on tároltuk. Az így előkészített és tárolt mintákat a folyadékkromatográfiás mérés előtt az „A” szolvens 500 μl-ében visszaoldottuk és membránszűrőn átszűrtük. A méréshez Waters típusú HPLC-t (WATERS, Milford, MA, USA) használtunk, mely a következő részegységekből állt:
43
W2690
pumparendszer
(mely
tartalmazott
egy
automata
mintaadagolót,
oszloptermosztátot és gradiens keverésre alkalmas pumparendszert), UV/VIS diódasoros (W996) és egy W474 scanning fluoreszcens detektor. A mérési adatok kiértékelése Millenium32 program (WATERS, Milford, MA, USA) segítségével történt. A mintából 40 μlt injektáltunk az 5 μm szemcseméretű, 150x4,6 mm méretű Supelcosil ABZ-Plus analitikai oszlopra. A mérés során kétféle szolvenst használtuk (A: 12,5 mM Na-acetát (pH 2,6), 15% ACN; B: 100% ACN). Az elválasztáshoz használt gradiens program a 3. táblázatban található. Az oszlophőmérséklet az elemzés során 40°C volt. Detektáláshoz a diódasoros UV/VIS detektorral 230 és 300 nm között teljes spektrumot vettünk fel, melynek egyik célja az, hogy minden vegyületet a maximális abszorbanciánál tudjunk kiértékelni, másrészt a jellemző UV spektrum alapján is lehet azonosítani a csúcsot a retenciós idő mellett (benzoesav, ortohidroxi-fahéjsav és SA). A vizsgált vegyületek közül az orto-hidroxi-fahéjsav (oHCA) és a SA fluoreszkál is. Detektálásuk 317 nm gerjesztési és 436 nm kisugárzási (oHCA), illetve 305 nm gerjesztési és 407 nm kisugárzási hullámhosszon (SA) történt.
Áramlási Idő (perc)
sebesség
A%
B%
(ml/perc) 1
0
1
100
0
2
1
1
100
0
3
3
1
95
5
4
5
1
95
5
5
18
1
45
55
6
20
1
0
100
7
20,1
1,4
0
100
8
25
1
0
100
9
27
1
100
0
10
31
1
100
0
2. táblázat: Az SA és oHCA elválasztásához használt gradiens program.
44
4.6. Poliaminok mennyiségi analízise A mintaelőkészítés során 0,2 g növényi mintát folyékony nitrogénben eldörzsöltünk, 1 ml 0,2 M jéghideg perklórsavval extraháltunk, majd 20 percig jégben állni hagytuk. Ezután 4 °C-on 20 percig 10000 g-vel centrifugáltuk. 100 μl felülúszóból danzil-kloriddal származékot képeztünk Smith és Davies (1985) alábbi módszere szerint: Származékképzés: 100 μl mintához 200 μl telített nátrium-karbonátot és 400 μl acetonban oldott danzil-kloridot (5 mg ml-1) adtunk. Összerázás után 60 °C-on sötétben 60 percig inkubáltuk, majd 100 μl 100 mg ml-1 töménységű prolin oldatot adtunk hozzá, és további 30 percig szobahőmérsékleten sötétben inkubáltuk. Ezután a danzilszármazékokat 500 μl toluollal 30 másodpercig extraháltuk, és a szerves fázist vákuum alatt bepároltuk. A maradékot 1 ml 100 % metanolban felvettük 0,2 μm pórusméretű teflon membránszűrőn átszűrtük és Waters típusú HPLC-vel (WATERS, Milford, MA, USA) elemeztük, mely a következő részegységekből állt: W 2690 rendszer, mely tartalmaz egy automata mintaadagolót, oszloptermosztátot és gradiens keverésre alkalmas pumparendszert; és ehhez egy W474 típusú scanning fluoreszcens detektort csatlakoztattunk. A mérési adatok kiértékelése Millenium32 program (WATERS, Milford, MA, USA) segítségével történt. A fent leírt módon származékképzett mintából 2 μl-t injektáltunk a 18 μm szemcseméretű Supelcosil C18 töltetű 20x2,1 mm-es előtét oszlopra, mely után egy 100x2,1 mm analitikai oszlop volt kötve, amelyben Hypersil ODS 5 μm szemcseméretű töltet volt. A mérés során kétféle szolvenst használtuk (A: 44 % ACN; B: 7:3=ACN:MeOH). Az elválasztáshoz használt gradiens program a 4. táblázatban található. Az elemzés során az áramlási sebesség 0,5 ml/perc, az oszlophőmérséklet 40 °C volt. A danzil-kloriddal származékképzett poliaminok detektálása fluoreszcens detektorral 340 nm-es gerjesztési és 515 nm-es kisugárzási hullámhosszon történt.
Idő (perc)
A%
B%
0
100
0
13
3
97
14
0
100
18
0
100
19
100
0
31
100
0
3. táblázat: Poliaminok elválasztásához használt gradiens program.
45
4.7. Korizmát-szintázt és izokorizmát-szintázt kódoló gének (CS és ICS) kifejeződésének vizsgálata valós idejű PCR-rel A CS és ICS gének expressziós vizsgálatához levél- és gyökérmintákat szedtünk (a 3 független biológiai ismétlésen kívül 4-4 technikai ismétlést alkalmaztunk, 1 kezelés = 3 biológiai ismétlés = 3x4 technikai ismétlés). Az RNS izolálása TRIzol reagenssel (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), a minták kezelése „DNase I”-gyel, tisztítása „RNeasy Plant Mini Kit”-tel (Qiagen, Hilden, Németország) történt a gyártó utasításai szerint. Az izolált RNS mennyiségét és tisztaságát fotometriásan (NanoDrop ND-1000 UV-Vis spectrophotometer, NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA) határoztuk meg. 150 ng RNS reverz transzkripciója „High Capacity RNA-to-cDNA kit”-tel (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) történt. A valós idejű polimeráz láncreakció (real-time PCR) kivitelezése a SYBR Green detekciós módszerrel, a gyártó által mellékelt leírás szerint, és gén-specifikus primerekkel történt egy Applied Biosystems 7500 készülékkel (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). A endogén kontroll a búza β-aktin (AY663392) gén volt (forward:
GACAATGGAACCGGAATGGTC;
reverse:
GTGTGATGCCAGATTTTCTCCAT). A CS gén (búza CS1: GH456415.1; forward: GCGGCCATCGTCTCCACCAT; reverse: GGCCGAGGTACAGGGAGGGA) és ICS gén (búza
ICS:
EV254155.1;
forward:
TTCAGCTCCACCAAACCAACCA;
reverse:
GGTTTGCCCACTGAAGAAGCG) primerei ismert Triticum EST-k és génszekvenciák magasan konzervált régióira specifikusan lettek megtervezve, előállításukat a Sigma-Aldrich Co. LLC. vállalat végezte. Az endogén kontroll és a specifikus gének küszöb ciklus (threshold cycle, Ct) értékei közötti relatív arányt minden minta esetében kiszámoltuk. 4.8. A fenilalanin-ammónia-liáz (PAL) aktivitásának meghatározása 1 g levelet, illetve gyökeret dörzsmozsár segítségével homogenizáltunk 4 ml jéghideg 50 mM Tris-HCl (pH 8,8) pufferben, amely 5 mM -merkaptoetanolt és 4% (w/v) PVP-t tartalmazott. A homogenizátumot 10 percig 10000 g-vel centrifugáltuk, majd a felülúszót használtuk az enzimaktivitás meghatározásához. A 2,75 ml reakcióelegyben 50 mM L-fenilalanin, 50 mM Tris-HCl (pH 8,8) puffer és 250 l felülúszó volt. A reakciót a növényi extraktummal indítottuk el, 37 °C-on inkubáltuk, és 1 óra elteltével 10 % TCA-val állítottuk le. 5 perces centrifugálás (10000 g) után a PAL aktivitását spektrofotometriásan határoztuk meg. Az enzim működését jelző transz-fahéjsav képződését követhetjük nyomon,
46
a 290 nm-en mért abszorbancia növekedése révén (Gao és mtsai, 2008). A PAL-aktivitást Uban (unit, enzimatikus aktivitás egység), 1 g frisstömegre vonatkoztatva adtuk meg.
4.9. Antioxidáns enzimek kivonása és aktivitás mérése Az első öt antioxidáns enzim (GR, GST, KAT, APX és G-POD) aktivitásának elemzéséhez 0,5 g növényi szövetet dörzsmozsárban, kvarchomok segítségével, 2,5 ml, 3 mM MgCl2-ot és 1 mM EDTA-t tartalmazó jéghideg 0,5 mM Tris-HCl pufferben (pH 7,5) homogenizáltunk. A mintákat hűtött centrifugában 10000 g-vel 10 percig centrifugáltuk, majd a felülúszót szétosztottuk Eppendorf csövekbe. A GR aktivitását a friss mintákból, a többi enzim aktivitását egyszer, -20 °C-on fagyasztott mintákból mértük spektrofotométerrel (Shimadzu UV-VIS 160A, Kyoto, Japán). Mérésig a mintákat jégen tartottuk, a méréseket szobahőmérsékleten végeztük. A hatodik enzim, a MDHAR vizsgálatához ettől eltérő mintaelőkészítési módszert alkalmaztunk, amely a 4.9.6. fejezetben olvasható. Az aktivitásértékeket minden esetben nkat-ban, 1 g frisstömegre vonatkoztatva adtuk meg.
4.9.1. Glutation-reduktáz A GR aktivitásának meghatározása során 412 nm-en mértük az 5,5’-ditio-bis-(2nitro-benzoesav) (DTNB) redukcióját Smith és mtsai (1988) módszere alapján. A 3 ml össztérfogatú reakcióelegy 75 mM Na-foszfát puffert (pH 7,5), 0,15 mM dietiléntriaminpentaecetsavat, 0,75 mM 5,5’-ditio-bis-(2- nitro-benzoesav)-at, 0,1 mM NADPH-t, 0,5 mM oxidált glutationt és a reakciót indító 50 l növényi mintát tartalmazta.
4.9.2. Glutation-S-transzferáz A GST aktivitásának meghatározása során az S-2,4-dinitrofenil-glutation képződését mértük 340 nm-en Mannervik és Guthenberg (1981) módszere szerint. A 3 ml össztérfogatú reakcióelegy 72,7 mM Na-foszfát puffer (pH 6,5), 3,6 mM redukált glutationt és 1 mM 1kloro-2,4-dinitro-benzént tartalmazott. A reakciót 100 l mintával indítottuk el.
47
4.9.3. Kataláz A KAT aktivitását 240 nm-en a H2O2 fogyásával követtük nyomon (Janda és mtsai, 1999). A 3 ml össztérfogatú reakcióelegy 0,44 M Tris-HCl puffert (pH 7,4), 0,0375% H2O2 és 50 l növényi mintát tartalmazott. A reakciót a H2O2 hozzáadásával indítottuk. 4.9.4. Aszkorbát-peroxidáz Az APX aktivitásának meghatározása során az aszkorbinsav fogyását 290 nm-en követtük nyomon (Janda és mtsai, 1999). A 3 ml össztérfogatú reakcióelegy 0,2 M Tris-HCl puffert (pH 7,8), 5,625 mM aszkorbinsavat és növényi mintát tartalmazott. A reakciót 0,042 % H2O2-dal indítottuk el.
4.9.5. Gvajakol-peroxidáz A G-POD aktivitásának meghatározása Ádám és mtsai (1995) módszere szerint 470 nm-en történt a gvajakol oxidációjának nyomon követésével. A 3 ml össztérfogatú reakcióelegy 88 mM Na-acetát puffert (pH 5,5), 0,88 mM gvajakolt és a növényi mintát tartalmazta. A reakciót 0,0375 % H2O2 hozzáadásával indítottuk el.
4.9.6. Monodehidro-aszkorbát-reduktáz Az MDHAR aktivitásának mérése Krivosheeva és mtsai (1996) módosított módszerén alapul. A 0,5 g növényi anyagot dörzsmozsárban homogenizáltuk, majd 1,75 ml extrakciós puffert (melynek összetétele: 2 % polivinilpirrolidon (PVP), 1 mM EDTA, 1 mM L-aszkorbát, 0,25 % Triton-X 100 és 50 mM nátrium-foszfát puffer (pH 7,6)) adtunk a mintákhoz. Az aszkorbát-peroxidáz aktivitását 750 μl 50 mM Na-foszfát pufferben (pH:7,6) készült telített ammónium-szulfát oldat hozzáadásával gátoltuk. A minták 4 °C-on 10 percig 10000 g-vel történő centrifugálása után a reakcióelegy 2 mL Na-foszfát puffert (pH 7.0), 300 μl 20 mM GSH oldatot, 300 μL 2 mM dehidroaszkorbátot és 100 μL felülúszót tartalmazott. A dehidroaszkorbát aszkorbáttá redukálódását a Shimadzu UV-VIS 160A (Kyoto, Japán) spektrofotométerrel 265 nm-en, szobahőmérsékleten mért abszorbancia növekedésén keresztül követtük nyomon.
48
4.9.6.1. G-POD izoenzimek vizsgálata poliakrilamid-gélelektroforézissel A G-POD izoenzimek elválasztása 10 %-os nem-denaturáló poliakrilamid géleken, 1,5 óra, 25 mA áramerősség és maximális feszültség alkalmazásával történt Janda és mtsai (1999) módosított módszere alapján. A peroxidáz izoenzimek azonosításához a gélek 15 percig 0,68 mM benzidint, 5,5 mM gvajakolt, 0,63 mM MnCl2-ot és 5 mM H2O2-ot tartalmazó, 0,2 M Na-acetát pufferben lettek festve. A kiváltott színreakció leállításához 7 %os ecetsav oldat lett használva. A minták fehérjetartalmának meghatározására Bradford (1976) módszere alapján került sor.
4.10. Prolintartalom meghatározása Bates és mtsai (1973) módszere alapján 0,5 g növényi anyagot 1 g kvarchomok segítségével 4 ml Milli-Q vízben homogenizáltuk, majd 10 percig 4 °C-on és 10000 g-vel centrifugáltuk. A felülúszót vízzel kiegészítettük 10 ml-re, majd 2,5 ml felülúszót 3,4 ml ecetsavas ninhidrin reagenssel (12,5 mg ml-1) reagáltattunk. 5 ml toluollal történő extrahálás után
a
prolintartalmat
518
nm-en
Shimadzu
UV-VIS
160A
(Kyoto,
Japán)
spektrofotométerrel mértük. Standardként 250 μg ml-1 prolin törzsoldatból 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 és 1,5 μg ml-1 hígítási sor alapján kalibrációs egyenest készítettünk. A prolintartalmat μg-ban, 1g frisstömegre vonatkoztatva adtuk meg.
4.11. Lipidperoxidáció meghatározása A lipidperoxidáció meghatározása az MDA-tartalom mérésén alapszik. Az előkészítés során 0,2 g növényi mintát dörzsmozsárban 600 μl 0,1 %-os (w/v) TCA-val eldörzsöltünk, majd 12000 g-vel 10 percig centrifugáltuk. A felülúszó 300 μl-éhez 2 ml 0,5 % (w/v) TBA-t tartalmazó 20 %-os (w/v) TCA-t adtunk és az elegyet 90 °C-on 30 percig inkubáltuk. Az MDA-tartalom meghatározása spektrofotometriásan, 532 nm-en történt, a 600 nm-en mért nem specifikus abszorpció figyelembevételével. Az MDA-tartalmat nmol g-1 friss tömegben adtuk meg (Thomas és mtsai, 2004).
49
4.12. Statisztikai analízis Az eredmények 10 ismétlés átlagai a klorofill-a fluoreszcencia indukciós mérések és a klorofilltartalom esetében, 5 ismétlés átlagai az MDA- és prolintartalom, a PAL, illetve az antioxidáns enzimek aktivitásainak meghatározása és a HPLC-s analízisek, 3 ismétlés átlagai a CS és ICS gének expressziós szintjeinek meghatározása során. Mivel az általunk vizsgált paramétereket az öregedési folyamatok is befolyásolhatják (Prochazkova és mtsai, 2001), a paraméterek változásait az azonos korú kontroll növényekben mért értékekhez hasonlítottuk. A szignifikancia vizsgálathoz Student-féle kétmintás t-próbát, illetve Duncan-féle tesztet használtunk. A vizsgált paraméterek közötti kapcsolat vizsgálatához pedig elvégeztük a paraméterek korrelációs elemzését.
50
5. EREDMÉNYEK
5.1. Levélrozsda- és lisztharmatfertőzés hatásainak vizsgálata nagyszámú búza genotípusban szántóföldi körülmények között Az első kísérletsorozatban arra kerestük a választ, hogy vajon a különböző búzafajták, illetve vonalak milyen SA- és PA-szintekkel rendelkeznek kontroll és stresszkörülmények között, milyen a levélrozsdával szembeni ellenálló képességük, továbbá arra, hogy van-e kapcsolat a fent említett két vegyület kiindulási és/vagy stresszindukált szintje valamint a növények patogénnel szembeni toleranciája között. Ennek érdekében 22 búza genotípust mesterséges levélrozsda-fertőzésnek tettünk ki, majd vizsgáltuk a fertőzés élettani folyamatokra gyakorolt hatásait. A mintaszedés idején, néhány genotípuson nem voltak láthatóak a fertőzés tünetei. Habár 14 nappal az inokulációt követően levélrozsdafoltok jelentek meg a TC, TC1, TC3BG, TC11, TC24, TC25, TC26, TC28, TC33 és TC34 közel-izogén vonalakon, a fertőzés nem terjedt át a fertőzés helyétől távolabb eső levelekre. A többi genotípuson nem volt a sikeres fertőzést igazoló látható tünet. Mindezek mellett számos genotípuson megjelent a természetes lisztharmatfertőzés. Kicsi, fehér telepek jelentek meg a fogékony búzafajták/vonalak levelein, és jelentős különbségek mutatkoztak a különböző genotípusokon uralkodó fertőzés súlyosságában is. A fogékony genotípusokon a lisztharmat telepei a növények föld feletti részein mindenhol megjelentek (a Saari-Prescott skálán 9 és 7 pontot kaptak). A mérsékelten ellenálló genotípusokon a telepek csak a növények alsó levelein jelentek meg, közel a szárhoz, mialatt az ellenálló genotípusokon alig volt látható néhány telep (3 és 1 pontot kaptak a Saari-Prescott skálán). A fenotípusos vizsgálat alapján elmondható, hogy a TC1, TC2C, TC3, TC3BG, TC11, TC24, TC25, TC26, TC28, TC29, TC33 és a TC34 meglehetősen fogékony, míg a TC, TC3KA, TC9, TC18, TC19, Mv 8, Mv Marsall, Mv Béres, Mv Regiment és Mv Hombár sokkal ellenállóbb a lisztharmatfertőzéssel szemben. A szabad SA-szint egy nagyságrenddel alacsonyabb volt a levélmintákban, mint a kötött SA-szint, és néhány esetben a kimutathatósági határ alatt is volt, ezért a teljes SAtartalom főleg a kötött SA-ból állt (5. ábra). A totál endogén SA-tartalom a kontroll növények leveleiben körülbelül 150 és 2500 ng g–1 friss tömeg (FW) között mozgott.
51
5. ábra: A 22 szántóföldön nevelt búza genotípus kontroll és patogénekkel fertőzött leveleinek összes endogén SA-tartalmának
mennyiségi
változásai
levélrozsda-
illetve
lisztharmatfertőzést
követően
szántóföldi
körülmények között. A feltüntetett szignifikanciaszintek a SA-tartalom értékeinek kontroll és kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01; *** : p0,001) (n=5; SD).
A legmagasabb SA-szint a TC1-ben, a TC3BG-ben, a TC19-ben és a TC33-ban volt, míg 200 ng g–1 FW-nél alacsonyabb érték a 4 martonvásári fajtában, az Mv Marsallban, Mv Regimentben, Mv Hombárban és az Mv 8-ban, volt mérhető. A fertőzést követően a SA mennyisége a legtöbb genotípusban jelentősen megnőtt. Kivételt képezett az Mv Marsall, TC1, TC2C, TC3, TC9, TC18, TC19, TC34 és az Mv 8, ahol ez a növekedés nem volt szignifikáns. A növekedés mértéke 1,3-6-szoros tartományon belül mozgott. A legkisebb emelkedés a TC1, TC19 és TC29, a legmagasabb az Mv Regiment, Mv Hombár és az Mv 8 esetében volt megfigyelhető. A TC3BG és TC3KA vonalakban nem történt változás. A mintákból a szabad formájú PA-ok (AGM, CAD, PUT, SPD és SPN) mennyiségének elemzésére került sor (6. ábra). Az AGM és a CAD mennyisége a kimutathatósági határ alatt volt.
52
6. ábra: A 22 különböző búza genotípus kontroll és fertőzött növényeinek levelében mért szabad formájú PA-ok (PUT - putreszcin, SPD - spermidin, SPN - spermin) mennyiségi változásai levélrozsda- illetve lisztharmatfertőzést követően szántóföldi körülmények között. A feltüntetett szignifikanciaszintek a PA-tartalom értékeinek kontroll és kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01; *** : p0,001) (n=5; SD).
A SPD-tartalom volt a legmagasabb minden vizsgált búza genotípusban (6/B. ábra). A PUT-tartalom eltérő volt a 22 genotípus kontroll növényeiben, de 14 nappal a fertőzés után drasztikusan megnőtt minden vonalban, illetve fajtában (6/A. ábra). 1,6-3,5-szörös növekedést mértünk, a TC29-ben a legalacsonyabbat, az Mv Regimentben pedig a legmagasabbat. A SPD-tartalom mutatta a legnagyobb varianciát a vizsgált genotípusok kontroll növényeiben. A fertőzés után szignifikánsan emelkedett a TC2C, TC3BG, TC11, TC26 és TC33 közel-izogén Thatcher-alapú vonalakban, az Mv 8-ban viszont csökkent, a többi genotípusban pedig nem
53
változott. A SPN-tartalom szintén változatos képet mutatott a kontroll növényekben, a legkevesebb SPN a TC9-ben, TC28-ban és a TC29-ben, a legtöbb a TC18-ban, az Mv 8-ban és az Mv Marsallban volt (6/C. ábra). A fertőzés csak a TC11, TC26 és TC28 esetében okozott szignifikáns növekedést, míg az Mv 8-ban szignifikáns csökkenés volt megfigyelhető, a többi genotípusban a fertőzés kevésbé befolyásolta az SPN mennyiségét. Az antioxidáns enzimek (GR, GST, KAT, APX és G-POD) aktivitásai nem mutattak nagy különbségeket a 22 genotípus kontroll növényeiben (7. ábra). A fertőzés befolyásolta az enzimaktivitásokat, de minden enzim esetében máshogyan. A GR aktivitásában minden genotípusban kismértékű növekedés volt megfigyelhető, mely viszont csak a TC2C-ben, TC3ban, TC3BG-ben, TC3KA-ban, TC9-ben, TC18-ban, TC19-ben és az Mv Regimentben volt statisztikusan szignifikáns (7/A. ábra). A GST aktivitása is nőtt a fertőzést követően és ez a növekedés szignifikáns volt a TC2C, TC3, TC3BG, TC3KA, TC18, TC19, TC34, Mv Marsall és az Mv Regiment esetében (7/B. ábra). A biotikus stressz befolyásolta a KAT aktivitását is, mely jelentősen csökkent a fertőzés hatására minden genotípusban (7/C. ábra). Az APX aktivitás, 14 nappal a fertőzést követően, szintén szignifikánsan csökkent a kontrollhoz képest minden búzaváltozatban, kivéve a TC3-ban, a TC26-ban, az Mv Marsallban és az Mv 8-ban (7/D. ábra). A G-POD aktivitása jelentős mértékben csökkent a fertőzés után a TC2C, TC3KA, TC9, TC18, TC19, TC26, TC29 és a TC33 esetében a kontrollhoz viszonyítva (7/E. ábra).
54
7. ábra: Az antioxidáns enzimek (GR – glutation-reduktáz, GST – glutation-S-transzferáz, KAT – kataláz, APX – aszkorbát-peroxidáz, G-POD – gvajakol-peroxidáz) aktivitásában bekövetkező változások búzanövények leveleleiben levélrozsda- illetve lisztharmatfertőzést követően szántóföldi körülmények között. A feltüntetett szignifikanciaszintek az antioxidáns enzimek aktivitás-értékeinek kontroll és kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01; *** : p0,001) (n=5; SD).
55
5.2. Lisztharmatfertőzés hatásai búza genotípusokban üvegházi körülmények között 5.2.1. A lisztharmatfertőzés hatásai szelektált, fiatalkori búza genotípusokra A szántóföldi körülmények között jelentkező sokféle stresszhatás kiküszöbölése érdekében a további kísérletekre üvegházban került sor, amelyekben az előző kísérletek eredményei alapján 11 különböző, magas illetve alacsony SA-tartalmú, genotípust választottunk ki. A ΔF/Fm’ klorofill-a fluoreszcencia indukciós paraméter 3 nappal a fertőzés után csekély, míg 7 nappal a fertőzést követően jelentősebb mértékű csökkenést mutatott, viszont a genotípusok között nem volt jelentős különbség (az adatok nincsenek feltüntetve). Habár a levelek kiindulási teljes klorofill-tartalma az Alcedoban és a martonvásári nemesítésű búzafajtákban, az Mv 8 kivételével, magasabb volt, mint a Thatcher-alapú közel-izogén vonalakban, a lisztharmat 7 nap elteltével sem okozott számottevő változást egyik genotípusban sem (az adatok nincsenek feltüntetve). Valamennyi genotípus esetén, toleranciától függetlenül, azonos mértékben jelentek meg a lisztharmatfertőzés tünetei. 5.2.1.1. A SA-tartalom változása lisztharmatfertőzés hatására A növények endogén SA-tartalma számos tényezőtől függhet, mint pl. a növény egyedfejlődési szintje, élettani állapota, stb., melyeket a növénynevelés körülményei jelentősen befolyásolhatnak. A fiatal kontroll búzanövénykék levelében a szabad és kötött SA mennyisége széles határok között mozgott (a szabad SA-szintek 87-329 ng, a kötött SAszintek 54-106 ng SA g-1 FW közötti értékek voltak mérhetőek), ezen kívül az öregedés hatására egyaránt csökkent minden genotípusban (8. ábra). A Thatcher-alapú közel izogén vonalak közül a legalacsonyabb szabad SA-tartalommal a TC26 és TC29, ezzel szemben a legmagasabbal a TC33 és a TC19 rendelkezett. A szabad SA 3 nappal a fertőzést követően minden búzaváltozatban csökkent, de ez csak a genotípusok felében volt szignifikáns. Hasonló volt a tendencia a 7 napos növényekben is, az Alcedo, az Mv Béres, az Mv 8, a TC33, a TC29 és a TC9 kivételével, minden esetben jelentős mértékű csökkenést mértünk. A kötött SA már 3 nappal a fertőzés után megnőtt az Mv Toborzó, Mv Béres és TC33 levelében, mialatt a TC26-ban, a TC19-ben és a TC9-ben csökkent, viszont 7 nappal a fertőzés után csak az Mv Marsall esetén tapasztaltunk emelkedést, míg az Mv Toborzó és a TC29 kötött SA-mennyiségének visszaesését mértük, a genotípusok többségében pedig nem találtunk számottevő változást.
56
8. ábra: A szabad és kötött SA mennyiségében bekövetkező változások 3, illetve 7 nappal a lisztharmatfertőzést követően fiatal Thatcher-alapú közel-izogén búza vonalak leveleiben üvegházi körülmények között. A feltüntetett szignifikanciaszintek a SA-tartalom értékeinek kontroll és kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01; *** : p0,001) (n=5; SD).
5.2.1.2. Változások az antioxidáns enzimek aktivitásában lisztharmatfertőzés hatására A különböző vizsgált búza-genotípusokban az enzimatikus antioxidánsok alap aktivitása széles tartományban mozgott (9. ábra). A többi genotípushoz képest magas kezdeti GR-aktivitással rendelkezett az Mv Hombár, Mv Béres és a TC26 (9/A. ábra). Az öregedés mindenhol mérsékelte ennek az enzimnek a működését. A fertőzést követő 3. napon szignifikáns csökkenést tapasztaltunk az Mv Béres, Mv Hombár és TC19 esetében, míg csekély növekedést az Alcedo levelében, a többi genotípusban viszont számottevő változás nem volt mérhető. 7 nappal a fertőzés után szignifikáns változást csak az Mv Marsall GRaktivitásában találtunk. Az GST aktivitása (9/B. ábra) szintén nagy különbségeket mutatott a kontroll növényekben, aktivitása a legtöbb esetben nagymértékben csökkent az öregedés hatására. A fertőzés eltérő mértékben befolyásolta az egyes genotípusokban mérhető GSTaktivitás értékeit. 3 nappal a fertőzés után fokozott GST-aktivitás volt mérhető az Mv Marsallban, a TC33-ban és a TC29-ben, viszont szignifikáns csökkenést csak az Mv Hombár
57
aktivitása esetén találtunk. Ezzel szemben 7 nappal a fertőzést követően a genotípusok többségében szignifikánsan megnőtt az aktivitás. A kontroll növények KAT aktivitása (9/C. ábra) hasonlónak bizonyult minden búzagenotípusban, csak a TC26-é volt kicsit magasabb, és egyöntetű visszaesés volt megfigyelhető az öregedés következtében. A 3 napja fertőzött növények KAT-aktivitásában szignifikáns csökkenést csak az Mv Béresnél és a TC19-nél tapasztaltunk, mialatt a többi genotípusban a lisztharmatfertőzés nem okozott jelentős mértékű változást. A 7 napos mintákban viszont serkentett KAT-működést találtunk az Mv Marsall, Mv Béres, Mv 8, TC33, TC29 és TC26 levelében. Az APX aktivitása (9/D. ábra) az öregedést követően drasztikusan csökkent, a lisztharmatfertőzés 3 nap elteltével, az Mv Toborzót, a TC33-at és a TC19-et leszámítva, elhanyagolható mértékű változást idézett elő, míg 7 nap elteltével minden esetben fokozta az aktivitást. A G-POD működése (9/E. ábra) változatos képet mutatott. A kontroll növényekben az öregedés csak néhány genotípusban fokozta az aktivitást, a többi esetben nem befolyásolta azt. A fertőzés már 3 nappal később indukálta az Alcedoban, Mv Marsallban, Mv 8-ban és TC26-ban, valamint jelentősen csökkentette a TC33-ban, TC19-ben és TC9-ben; viszont 7 nappal később a legtöbb genotípusban szignifikánsan megemelte a G-POD aktivitását.
58
9. ábra: Az antioxidáns enzimek (GR – glutation-reduktáz, GST – glutation-S-transzferáz, KAT – kataláz, APX – aszkorbát-peroxidáz, G-POD – gvajakol-peroxidáz) aktivitásában bekövetkező változások 3, illetve 7 nappal a lisztharmattal
történő
inokulációt
követően
fiatalkorú
búzanövények
levelében.
A
feltüntetett
szignifikanciaszintek az antioxidáns enzimek aktivitás-értékeinek kontroll és kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01; *** : p0,001) (n=5; SD).
59
5.2.2. A lisztharmatfertőzés hatásai felnőttkori Thatcher-alapú közel izogén búza vonalakra A fiatal és a kifejlett növények toleranciája eltérhet egymástól. Ezt a fent leírtak is tanúsítják, azonban a szántóföldi kísérlet során számos egyéb stresszor is jelen volt a növénynevelés ideje alatt, így a szántóföldön nőtt idősebb növények eltérő mértékben megmutatkozó lisztharmattal szembeni toleranciájára más tényezők is hatással lehettek. Ezért a lisztharmatfertőzés stressztoleranciára gyakorolt hatásának pontosabb meghatározásához a fiatalkori kísérletben használt genotípusok közül négyet kiválasztottunk, a növényeket üvegházi körülmények között kalászolás előtti állapotig neveltük, majd a korábbi kísérlethez hasonlóan lisztharmatfertőzésnek tettük ki. 5.2.2.1. Fenotípusos különbségek és fotoszintetikus aktivitás Lisztharmatfertőzés után kicsi, fehér vagy szürke telepek jelentek meg minden fertőzött búza vonal levelén üvegházi körülmények között. Azonban a négy vonalnál jelentős különbségek voltak megfigyelhetőek a betegség/kór súlyosságában és a szimptómák fejlődésének arányában. A Saari-Prescott skála (Saari és Prescott, 1975) alapján, ahol a 0 a tünetmentes, a 9 pedig a nagyon fogékony növényt jelöli, a TC26 9-es fertőzöttségi pontot kapott, mivel a telepek a növények minden részét beborították, a TC33 viszont csak 7 pontot, mert ennél a betegség kisebb mértékben terjedt szét. A másik két vonalon a szürke lisztharmattelepek csak az alacsonyabban lévő leveleken, azoknak is a szárhoz közelebb eső részén jelentek meg, ezért a TC9 1 pontot, míg a TC19 3-at kapott. Ezek alapján úgy találtuk, hogy a TC33 és a TC26 meglehetősen fogékony a lisztharmatfertőzésre, viszont a TC19 és a TC9 sokkal ellenállóbbnak bizonyult. Ezen különbségek ellenére a ΔF/Fm’ klorofill-a fluoreszcencia indukciós paraméter, amely a PSII kvantumhatásfokát jelzi, jelentősen nem változott még 7 nappal a fertőzést követően sem a kontroll növényekben, sem pedig az inokulált növényekben. (10. ábra).
60
10. ábra: A PSII kvantumhatásfokát jelző F/Fm’ paraméter változásai 3, illetve 7 nappal a lisztharmatfertőzés után felnőtt korú búzában. (n=10; SD).
5.2.2.2. Az endogén szalicilsav mennyiségi és minőségi változásai
11. ábra: A szabad és kötött SA mennyiségében bekövetkező változások 3, illetve 7 nappal a lisztharmatfertőzést követően felnőtt korú Thatcher-alapú közel-izogén búza vonalak leveleiben üvegházi körülmények között. A feltüntetett szignifikanciaszintek a SA-tartalom értékeinek kontroll és kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01; *** : p0,001) (n=5; SD).
A szabad SA-tartalom 2-5-ször alacsonyabb volt a levélben, mint a kötött forma (glükozid-kötött SA). A kötött és a szabad endogén SA szintje jelentősen magasabb volt a TC19-ben és a TC33-ban, mint a TC26-ban és a TC9-ben. A TC33, TC26 és TC19 kontroll növényeiben a szabad SA-szint az öregedés hatására megnőtt, mialatt a kötött SA-tartalom a TC33 és TC19 esetében kismértékben csökkent, míg a másik két búzavonalban nem változott. Lisztharmatfertőzést követően a szabad SA mennyisége nem változott számottevően, kivéve a TC9 vonalban, ahol 43%-os növekedés volt mérhető a 3. napon. A fertőzés a kötött SA
61
szintjét jelentősen csökkentette (33%) a TC33 3 napos mintáiban. 7 nappal a fertőzés után, azonban a kötött SA-tartalom drasztikusan megnőtt a TC33-ban (56%) és a TC19-ben (82%) egyaránt, amíg a másik két genotípusban csak kicsi változás volt megfigyelhető (11. ábra). 5.2.2.3. Eltérések az enzimatikus antioxidáns rendszerben A négy búza vonal kontroll növényeiben az antioxidáns enzimek aktivitása változatos képet mutatott (12/I. A-E ábra).
12/I. ábra: Az antioxidáns enzimek (GR – glutation-reduktáz, GST – glutation-S-transzferáz, KAT – kataláz, APX – aszkorbát-peroxidáz, G-POD – gvajakol-peroxidáz) aktivitásában bekövetkező változások 3, illetve 7 nappal a lisztharmatfertőzést követően felnőtt korú Thatcher-alapú közel-izogén búza vonalak leveleiben üvegházi körülmények között. A feltüntetett szignifikanciaszintek az antioxidáns enzimek aktivitás-értékeinek kontroll és kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01; *** : p0,001) (n=5; SD).
A 3 napos kontrollban a GST aktivitása szignifikánsan alacsonyabb volt a TC26-ban, mint a TC33-ban (12/I. B. ábra, a statisztikus különbség az ábra könnyebb áttekinthetősége érdekében nincs feltüntetve), továbbá a KAT aktivitás is jelentősen alacsonyabb volt a TC26-
62
ban, mint a TC33-ban és a TC9-ben (12/I. C. ábra). Az ugyanezen a napon szedett kontroll mintákban az APX alacsonyabb volt a TC19-ben, mint a TC9-ben (12/I. D. ábra). A 7 napos kontrollokban a GR aktivitás a TC19-ben sokkal magasabb, mint a TC9-ben és a TC26-ban. A GST aktivitás is magasabb a TC19-ben, mint a TC26-ban és a TC33-ban, azonban a KAT és APX esetén nincs számottevő különbség. A legkifejezettebb változás a G-POD esetében volt mérhető, melynek aktivitása a TC19 és a TC26 vonalakban fele akkora volt a TC9-éhez és a TC33-éhoz képest a 3 napos mintákban, ezzel szemben a 7 napos mintákban már nem figyelhetőek meg ezek a különbségek (12/I. E. ábra). Az öregedés csak a TC19 vonal GR aktivitásában (12/I. A. ábra), a TC33 GST aktivitásában, a TC26 KAT aktivitásában, valamint a G-POD aktivitásban okozott jelentős változásokat, utóbbi esetében nagymértékű növekedést. A lisztharmatfertőzés minden vizsgált közel izogén búzavonalban befolyásolta ezeknek az enzimeknek az aktivitását, de eltérő módon. A 7 napos mintákban némileg (körülbelül 12 és 33%-ban) megemelte a GR aktivitását a TC19-ben és a TC26-ban. 16%-os GST aktivitás-növekedést okozott a 3 napos TC33 mintákban, ami 66%-ra nőtt a fertőzés hatására a 7. napra a 7 napos kontrollhoz viszonyítva, mialatt a TC19-ben és a TC33-ban a fertőzés csak a GST aktivitást emelte meg 40, illetve 48%-kal a 7 napra. A lisztharmat minden vonalban aktiválta az APX-et. A mért aktivitás-növekedés 3 nappal a fertőzés után csak a TC26-ban volt jelentős (17%), azonban a 7. napra minden vonalban nagymértékűvé vált (TC9: 50 %, TC19: 45 %, TC26: 46 %, TC33: 56 %). A fertőzést követően a KAT aktivitás csak a 7 napos TC19-ben (42%) és TC26-ban (43%) emelkedett szignifikánsan. A G-POD aktivitása viszont drasztikusan megnőtt minden vonalban már a 3. napra (TC9: 47 %, TC 19: 165 %, TC26: 315%, TC33: 88 %), mely tovább emelkedett a 7. napra, különösen a TC19 és a TC26 esetén (hozzávetőlegesen 61 és 47 %-kal). Lisztharmatfertőzés hatására a legnagyobb különbségeket mutató G-POD-ot nemdenaturáló poliakrilamid gélen vizsgálva minden búzavonalban 4 különböző izoenzim volt elkülöníthető (POD1, POD2, POD3 és POD4) mind a 3 napos, mind a 7 napos mintákban (12/II. ábra), kivéve a TC26-ot, ahol a POD4 hiányzott.
63
12/II. ábra: A különböző gvajakol-peroxidáz (G-POD, POD) izoenzimek aktivitásában lisztharmatfertőzés hatására bekövetkező változások búzanövények leveleiben 3, illetve 7 nappal a fertőzést követően.
A POD1 a legkisebb elektroforetikus mobilitású izoenzim. Ez adta a legintenzívebb sávot minden mintában és a fertőzöttekben még erősebben látszott. A POD2 nagyobb elektroforetikus mobilitással rendelkezett, mint a POD1, a kontroll mintákban csak a TC26ban jelent meg, míg a fertőzöttekben minden genotípusban, a TC26-ban pedig felerősödött. A POD3 és a POD4 sávjai gyengébben látszottak, mint az előző két izoenziméi. A POD3 elektroforetikus mobilitása nagyobb, mint a POD2-é, de kisebb, mint a POD4-é, és nagyobb aktivitást mutat a kontrollokban, különösen a TC19-ben, mint a fertőzött mintákban. A POD4, a legnagyobb elektroforetikus mobilitású izoenzim, a TC33, TC19 és TC9 kontroll és fertőzött mintáiban egyaránt megjelent, de hiányzott a TC26-ból. A POD izoenzimek aktivitása 7 nappal fertőzés után a 3 naposhoz hasonló mintázatot mutatott. A TC26 kontroll növényeinek POD aktivitása 7 nappal később jól láthatóan megnőtt a 3. napon mértekhez képest. A különböző paraméterek közötti korrelációs kapcsolat elemzése bár nem mutatja az ok-okozati összefüggéseket, és csak a lineáris korrelációt jelzi, azonban hasznos információval szolgálhat a korrelációk irányát és közelségét/szorosságát illetően. Ezért elvégeztük az általunk vizsgált paraméterek korrelációs analízisét, amely azt mutatta, hogy a GR működése szorosan összefüggött a szabad SA mennyiségével, valamint a GST, a KAT és az APX aktivitásával (5. táblázat). A GST aktivitása pozitívan korrelált a kötött SA szintjével,
64
továbbá az APX és G-POD aktivitásokkal, de a szabad SA-val csak kevésbé. A KAT működése is összefüggésben állt a másik két H2O2 eliminálásért felelős enzim aktivitásával.
5. táblázat: A felnőtt búzanövényekben vizsgált paraméterek közötti korrelációs elemzés eredménye lisztharmattal történő fertőzés után.
5.3. Különböző abiotikus stresszek hatásai négy, eltérő SA-tartalmú búza genotípusra Ebben a fejezetben két martonvásári, alacsony össz endogén SA-tartalommal rendelkező őszi búza fajtával (Mv Hombár, Mv 8), illetve két Thatcher-alapú, magas totál SA-tartalommal rendelkező közel-izogén vonallal (TC33 és TC19) végzett kísérletek eredményeiről számolok be, melyeket az előző méréssorozatok alapján választottunk ki, és használtunk modellként a további stresszélettani vizsgálatokhoz, hogy összefüggést keressünk a SA-tartalom és egyéb, az akklimatizációs folyamatokban szerepet játszó komponensek között.
5.3.1 . A kadmium hatásai 5.3.1.1 . A búza genotípusok Cd-toleranciájának meghatározása Az előkísérletek során különböző koncentrációjú (750, 500, 200, 100 és 50 µM) Cd(NO3)2-ot tartalmazó tápoldatban neveltünk búza növényeket azzal a céllal, hogy a további
65
kísérletek számára megtaláljunk azokat a koncentrációértékeket, amelyeknél a Cd látványosan befolyásolja az általunk vizsgált folyamatokat, de nem pusztítja el a növényeket. Az eredmények alapján az alábbi kísérleteket végeztük el. Az első kísérletben két különböző Cd-koncentrációt (500µM és 50µM) alkalmaztunk közvetlenül a csírázás után, annak érdekében, hogy megállapítsuk a vizsgált négy genotípus Cd-mal szembeni toleranciájának mértékét. A 11 napig, 500µM (0,5 mM) Cd-ot tartalmazó tápoldaton nevelt növények növekedése jelentős mértékben csökkent, a leveleik sárgulni kezdtek, a gyökereik beszürkültek és biomasszájuk sokkal kevesebb volt, mint a kontroll növényeké. Ez különösen a TC33 vonalnál mutatkozott meg. A PS II kvantumhatásfoka (PSII), melyet aF/Fm’ klorofill-a fluoreszcencia indukciós paraméter mutat, a Cd-kezelést követően minden genotípusban csökkent. A legjobban a TC33-ban, a legkevésbé az Mv Hombárban (13. ábra).
13. ábra: A kontroll és kezelt növények levelében mért ΔF/Fm’ értékek változásai alacsony, illetve magas koncentrációjú Cd-mal történő kezelést követően. A feltüntetett szignifikanciaszintek a ΔF/Fm’ értékek kontroll és kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01; *** : p0,001) (n=10; SD).
A Cd-mal szembeni tolerancia fokában hasonló különbségek voltak tapasztalhatók akkor is, amikor a csírázás után 17 napig 50µM Cd-ot tartalmazó tápoldaton neveltük a növényeket. Bár ebben az esetben a stressz tünetei kevésbé kifejezettek (14. ábra).
66
14. ábra: Fenotípusos különbségek a csírázást követő (A), illetve a későbbi fejlődési állapotban alkalmazott (B) 50 M Cd-os kezelések hatására az Mv Hombár kontroll és kezelt növényei között.
7 nap elteltével, a mintaszedéskor, a TC19, Mv Hombár és Mv 8 Cd-kezelt növényei kétlevelesek, míg a TC33-é csak másfél levelesek voltak. A levélcsúcsok itt is minden genotípusnál sárgultak, bár nem olyan erőteljesen, mint a magasabb Cd-koncentráció alkalmazásakor. A legmagasabb F/Fm’ paraméter itt is az Mv Hombárban volt mérhető (13. ábra). A második kísérlet során, amikor az 50 µM Cd-os kezelésre a növények egy későbbi fejlődési állapotában került sor (17 nappal a csírázást követően), a kezelést követő 7 nap elteltével a Cd nem váltott ki látható tüneteket az Mv Hombárban, az Mv 8-ban is csak csekély növekedésgátlást. Ezzel szemben a Thatcher-vonalakban, különösen a TC33-ban, a gátolt növekedés mellett, kismértékű klorózis és hervadás is jelentkezett. 5.3.1.2 . A Cd-kezelések hatásai a SA és prekurzorainak tartalmára Habár a kontroll növények szabad SA-tartalma a két martonvásári fajtában alacsonyabb, a közel-izogén vonalakban magasabb volt, a 11 napos, magas (0,5 mM) Cdkoncentrációjú tápoldaton nevelt növényekben fokozott mértékű SA-felhalmozódást figyeltünk meg minden genotípusban, szabad és kötött formában egyaránt (15. ábra). A kontroll növények kötött SA-szintje az Mv Hombárban volt a legalacsonyabb, a TC33-ban pedig a legmagasabb.
67
15. ábra: A szabad és kötött SA mennyiségében bekövetkező változások a kontroll és a 0,5 mM Cd-mal kezelt növények levelében 11 nappal a kezelés után. A feltüntetett szignifikanciaszintek a SA-tartalom értékeinek kontroll és kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01; *** : p0,001) (n=5; SD).
Alacsony (50 M) Cd-koncentráció alkalmazásakor a SA szintek szabad és kötött formában egyaránt magasabbak voltak a levélben, mint a gyökérben minden vizsgált genotípusban (16. ábra). A csírázástól kezelt növények közül a TC19-ben volt mérhető a legmagasabb össz SA-tartalom (szabad+kötött) (16/A-B. ábra). A Cd-kezelés drasztikus mértékben megemelte a kötött SA-szintet mind a négy búzafajtában, illetve vonalban, míg a szabad SA szintje csak a TC19-ben mutatott szignifikáns növekedést. A BA-tartalomban (16/C-D. ábra) nem volt kifejezett különbség a négy genotípus 17 napos kontrolljaiban. A szabad BA-tartalmak ugyanolyan arányúak a levelekben és a gyökerekben, mialatt a kötött forma mennyisége magasabb a levelekben, mint a gyökerekben. A korai Cd-kezelés a szabad BA-t csak a TC19-ben emelte meg, míg a kötött BA-t minden búzaváltozatban, méghozzá a TC33 kivételével, minden esetben szignifikánsan. A kontroll növényekben a szabad formájú oHCA mennyisége a kimutathatósági határ alatt volt, míg a kötött formáé (16/E és J. ábra) nem különbözött a genotípusokban, és magasabb volt a levélben, mint a gyökérben. A 7 napig tartó 50 M Cd-os kezelés (16. F-J ábra) a szabad SA esetében mérsékelt változásokat okozott, a kötött formához viszonyítva, bár minden genotípus levelében nagymértékű SA-felhalmozódás volt megfigyelhető. Itt a szabad SA mennyisége 2-6szorosára, a kötött SA-é 2-14-szeresére nőtt (16/F-G. ábra). A gyökerekben csak az Mv Hombár és az Mv 8 SA-tartalma növekedett meg, szabad és kötött formában egyaránt, a Thatcher-alapú közel-izogén vonalaké nem. A BA mennyisége a levélben szignifikáns, 1,5szörös növekedést csak a kötött formában az Mv Hombárban mutatott (16/H-I. ábra) a kezelés hatására, viszont a gyökerekben megnőtt a mennyisége az Mv 8-ban és a TC33-ban. A szabad
68
BA mennyisége a legtöbb esetben nem változott a 24 napos Cd-kezelt növényekben, ellenben az Mv Hombár és Mv 8 gyökereiben lecsökkent. A kötött oHCA szignifikánsan megemelkedett (1,5-6-szorosan) a TC19, az Mv 8 és az Mv Hombár levelében (16/J. ábra), valamint az Mv 8 gyökerében.
16. ábra: Az 50 M Cd-os kezelés hatásai a SA-bioszintézis útvonal elemeinek mennyiségére különböző fejlettségi állapotú búzanövényekben. A feltüntetett szignifikanciaszintek a SA-, BA-, illetve oHCA-tartalom értékeinek kontroll és kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01; *** : p0,001) (n=5; SD).
69
5.3.1.3 . Változások a PAL aktivitásában Cd stressz hatására A 24 napos növényeknél a kezdeti PAL aktivitás a martonvásári fajták (Mv 8 és Mv Hombár) leveleiben magasabb volt, mint a Thatcher-alapú vonalaké (TC19 és TC33), és ezek a különbségek szignifikánsak voltak az Mv 8 és a TC19 vagy a TC33 között (17. ábra, a statisztikus különbségek az ábra könnyebb áttekinthetősége érdekében nincsenek feltüntetve). Ezzel szemben a martonvásári genotípusok gyökereiben kicsit alacsonyabb volt a PAL aktivitása, mint a másik két genotípusban, de ez az eltérés csak az Mv Hombár és a TC19 között volt statisztikusan szignifikáns. A 7 napos Cd-kezelés hatására ennek az enzimnek az aktivitása jelentősen indukálódott a TC19 és a TC33 levelében, de nem változott, vagy csökkent az a Mv Hombárban. A Cd-kezelt növények gyökereiben megnőtt PAL aktivitás volt mérhető, amely csak a TC33-ban volt szignifikáns a kontrollhoz viszonyítva.
17. ábra: A PAL aktivitásának változásai a 7 napos Cd-kezelés hatására a vizsgált 4 búza genotípus levél- és gyökérmintáiban. A feltüntetett szignifikanciaszintek a PAL enzim aktivitásértékeinek kontroll és kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01; *** : p0,001) (n=5; SD).
5.3.1.4 . A CS és ICS gének expressziójának elemzése Cd-kezelés után A real-time PCR analízis eredménye azt mutatta, hogy a 24 napos növények (17+7 nap) levelében és gyökerében hasonló a CS gén expressziós szintjének tendenciája (16. ábra), és a Cd-kezelés alig befolyásolta azt. Az ICS gén expressziós szintje mind a négy genotípusban hasonló volt, a gyökerekben pedig magasabbnak bizonyult, mint a levelekben.
70
A kezelés csak az Mv 8-ban okozott csekély, ámde statisztikusan szignifikáns növekedést (18. ábra).
18. ábra: A Cd-kezelés hatásai a 24 napos növények CS és ICS génjeinek expressziós szintjére a vizsgált négy búza genotípusban. A feltüntetett szignifikanciaszintek a CS és ICS gének expressziós értékeinek kontroll és kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01; *** : p0,001) (n=3; SD).
5.3.1.5 . A Cd-kezelés hatásai az enzimatikus antioxidáns rendszerre A csírázástól 50 M Cd-ot tartalmazó tápoldaton nevelt növények levelében még 17 nap elteltével is az enzimatikus antioxidáns rendszer fokozott működését figyeltük meg (19 A-E. ábra). A G-POD és APX esetében a Cd hatására szignifikáns aktivitásnövekedés volt mérhető, azonban sem a kezelt, sem a kontroll növényekben nem volt genotípusbeli különbség (19/E és D ábrák). A KAT aktivitása a TC19 kivételével minden genotípusban indukálódott, különösen a TC33-ban (19/C ábra). A GST-t eltérő módon befolyásolta a hosszan tartó nehézfémszennyezés (19/B. ábra). Aktivitása az Mv Hombárban és a TC19-ben jelentősen lecsökkent, mialatt az Mv 8-ban és a TC33-ban kis mértékben ugyan, de megemelkedett. A GR viszont egyértelműen csökkent működést mutatott minden genotípusban (19/A ábra). Érdekesség, hogy míg a két peroxidáznál nem található különbség a genotípusok kontroll növényei között, addig a másik három enzimnél igen. A legkisebb enzimaktivitás az Mv 8-nál mérhető, míg a többi búzagenotípusnál, különösen az Mv Hombárban ettől magasabb értékek találhatóak.
71
19. ábra: Az alacsony koncentrációban alkalmazott Cd (50 M) hatása az antioxidáns enzimek (GR – glutationreduktáz, GST – glutation-S-transzferáz, KAT – kataláz, APX – aszkorbát-peroxidáz, G-POD – gvajakolperoxidáz) aktivitására a négy búzagenotípusban. A feltüntetett szignifikanciaszintek az antioxidáns enzimek aktivitás-értékeinek kontroll és kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01; *** : p0,001) (n=5; SD).
72
A 24 napos kontroll növényekben a kiindulási antioxidáns enzimaktivitások csak néhány esetben mutattak genotípusfüggő különbséget (19/F-J. ábra). A levelek GR aktivitása szignifikánsan magasabb volt az Mv Hombárban, mint az Mv 8-ban és a TC33-ban, mialatt a gyökereké az Mv Hombárban volt a legalacsonyabb (19/F ábra, a statisztikus különbségek az ábra könnyebb áttekinthetősége érdekében nincsenek feltüntetve). A G-POD aktivitás a levelekben és a gyökerekben egyaránt hasonló volt mind a négy genotípusban (19/J. ábra). A legalacsonyabb KAT aktivitás a TC33 levelében és az Mv Hombár gyökerében volt mérhető (19/H. ábra). A legalacsonyabb APX és a GST-aktivitás a TC33 levelében és a TC19 gyökerében volt (19/I. és G. ábrák). A növények 7 napos 50 M Cd-os kezelése után ezeknek az enzimeknek az aktivitása a levelekben jelentősen nem változott, kivéve a G-POD-ot, amelyé a TC19-ben nőtt, és a GST-t, amelyé az Mv Hombárban kifejezetten csökkent. Ezzel ellentétben, a gyökerekben szignifikáns változások mutatkoztak meg, különösen a GR, a KAT és a GST esetében. Az Mv Hombár és az Mv 8 gyökerének GR aktivitása Cd hatására megnőtt. A G-POD-aktivitás a TC33-ban csökkent, mialatt a KAT aktivitása az Mv Hombárban megnőtt, a másik három genotípusban pedig lecsökkent. Az APX aktivitásában nem volt mérhető változás, mialatt a GST minden genotípus gyökerében indukálódott.
5.3.2 . A PEG-kezelés hatásai 5.3.2.1. Morfológiai és fotoszintetikus változások a PEG-kezelés hatására A vízhiány korai hatásai már 5 nappal a PEG-kezelést követően mind a négy genotípusnál jelentkeztek. Ez a csökkent levél- és gyökérbiomasszában, a levelek csavarodásában és hervadásában mutatkozott meg, de a tünetek erőssége eltérést mutatott a búzagenotípusok között (20. ábra). A TC33 és az Mv Hombár levelei mutattak a leginkább, illetve a legkevésbé kifejezett levélcsavarodást, ezért a TC33 5, míg az Mv Hombár 3 pontot kapott az 1-től 5-ig terjedő levélcsavarodási skálán (O'Toole és Cruz, 1980), ahol az 1 a legkevésbé, az 5 a legjobban csavarodó levelet jelöli. Az Mv 8 és a TC19 tünetei a kettő közzé estek, így ezek 4-4 pontot kaptak. A száraz tömeg/friss tömeg arány minden genotípusban hasonló volt, a PEG-kezelés minden esetben fokozta azt, és a gyökerekben ez az arány sokkal nagyobb volt, mint a levelekben. A Mv Hombár gyökerében kicsit nagyobb különbség volt mérhető, mint a másik három búzaváltozatban.
73
20. ábra: A vizsgált négy búzagenotípus 5 napos PEG-kezelés okozta morfológiai változásai. A bal oldali növények a kontrollok, a jobb oldaliak a PEG-kezeltek.
A kontroll növények aktuális kvantumhatásfok (PSII) értékei nem mutattak genotípusbeli eltérést. A PEG az Mv Hombárban kevésbé, a többi genotípusban nagyobb mértékben okozott csökkenést ebben a paraméterben, de ez a változás egyik esetben sem volt szignifikáns (adatok nincsenek bemutatva). 5.3.2.2. A prolintartalom változása A prolintartalom nagyobb volt az Mv Hombár és az Mv 8 gyökerében, mint a Thatcher-alapú vonalakéban. A levelekben az Mv Hombárban volt a legtöbb, a TC33-ban pedig a legkevesebb a kiindulási prolinmennyiség. A PEG-kezelés drasztikus mértékben megemelte a prolinszintet a levelekben és a gyökerekben egyaránt. A mért értékek hasonlóak voltak a négy genotípusban, a levelekben magasabbak, a gyökerekben ettől kicsit alacsonyabbak, kivéve a TC33-at, ahol a levélben a legmagasabb prolinmennyiség volt mérhető (21. ábra). Azonban a kiindulási és a stressz-indukált változások mértéke genotípusonként eltért, ami különösen a gyökerekben volt számottevő. Az Mv Hombár és Mv 8 gyökerében a nagyobb kiindulási prolinszint az 5 napos 15%-os PEG-kezelés hatására csak
74
kismértékben nőtt, mialatt a közel-izogén Thatcher-alapú vonalak alacsony prolinszintje szignifikáns emelkedést mutatott. A levelekben a legkiemelkedőbb változás a TC33-ban volt, amelyben a legkisebb kezdeti prolinszinthez a legmagasabb stressz okozta változás társult.
21. ábra: Az 5 napos PEG-kezelés hatása a prolintartalomra a négy búzagenotípus levelében és gyökerében. A feltüntetett szignifikanciaszintek a prolintartalom értékeinek kontroll és kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01; *** : p0,001) (n=5; SD).
5.3.2.3. A PEG-kezelés hatásai a SA-tartalomra A szabad és a kötött formájú SA mennyiségének kontroll körülmények közötti genotípusbeli különbségei jól detektálhatóak (22. ábra). A szabad SA kiindulási szintje az Mv Hombár és az Mv 8 levelében kisebb, míg a két Thatcher-alapú közel-izogén vonaléban nagyobb volt. A legnagyobb szabad SA-tartalom a TC19-ben, ettől némileg kevesebb a TC33-ban, míg az Mv Hombárban és az Mv 8-ban ezektől kisebb, azonos mennyiségű volt mérhető. A gyökerekben, az Mv 8 kivételével, a levélben találtaktól kevesebb szabad SA volt jelen. Hasonló volt a helyzet a kötött SA mennyiségében is. A levélben mért kötött SAtartalom szintén a két TC genotípusban volt a legnagyobb, ezt sorrendben az Mv 8 és az Mv Hombár követte. A gyökerek kötött SA-mennyisége sokkal kisebb volt, mint a leveleké, genotípusos különbséget pedig csak a TC19 esetében mutatott, ahol a többihez képest nagyobb értékeket mértünk. A kötött SA mennyisége levelekben és gyökerekben egyaránt körülbelül tízszerese volt a szabad SA-énak.
75
22. ábra: Az 5 napos PEG-kezelés hatása a szabad és kötött szalicilsav (SA) mennyiségére a négy búzagenotípus levél- és gyökérmintáiban. A feltüntetett szignifikanciaszintek a SA-tartalom értékeinek kontroll és kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (n=5; SD).
Az 5 napig tartó 15 %-os PEG-gel történő kezelés hatására sem a szabad, sem a kötött SA mennyisége nem mutatott szignifikáns változást a vizsgált szervekben. Ha a kapott eredményeket a minták száraz tömegére vonatkoztatva adjuk meg, akkor a kezelés minden genotípusban csökkenti az eredményeket, jelentős mértékű csökkenést viszont csak a TC33 és a TC19 gyökerének kötött SA-szintjében láthatunk. A többi esetben, habár markánsabbak a különbségek, mégsem beszélhetünk szignifikáns változásról. Ahogyan a kötött SA kiindulási szintjei, úgy a PEG által csökkentett mennyiségei között sem mutatkozott meg egyértelmű, genotípusos vagy fajtacsoportra jellemző különbség a levelek esetében, ezzel szemben a gyökerekben a Thatcher-alapú közel-izogén vonalakban jelentősen kisebb mennyiség volt mérhető, mint a martonvásári nemesítésű búzafajtákban. 5.3.2.4. A PEG-kezelés hatásai az antioxidáns enzimek aktivitására Az aszkorbát-glutation ciklus enzimei közül a GR és a MDHAR aktivitása (23/A. és B. ábra) a levelekben magasabb, mint a gyökerekben, és a PEG a legtöbb esetben szignifikánsan megnövelte azt. A legmagasabb GR-aktivitás az Mv Hombár levelében volt (23/B. ábra). Az APX kevésbé aktív a TC19 kontroll gyökerében, mint a többi genotípusban. A kontroll növények levelében az APX leginkább az Mv Hombárban, legkevésbé a TC19-ben volt aktív (23/C. ábra). A PEG-kezelés indukálta ezt az enzimet különösen a martonvásári fajták gyökerében, továbbá az Mv 8 és a TC19 levelében. A kezelést követően a legkisebb APX aktivitás az Mv Hombár levelében volt mérhető, a kontroll növényekhez viszonyítva. A
76
GR-t a kezelés pozitívan befolyásolta minden búza genotípusban, viszont genotípusok közötti különbség sem a kontroll, sem pedig a kezelt növények gyökerében nem volt.
23. ábra: Az 5 napos PEG-kezelés hatása az antioxidáns enzimek (GR – glutation-reduktáz, GST – glutation-Stranszferáz, KAT – kataláz, APX – aszkorbát-peroxidáz, G-POD – gvajakol-peroxidáz) aktivitására a különböző búzagenotípusok levél- és gyökérmintáiban. A feltüntetett szignifikanciaszintek az antioxidáns enzimek aktivitás-értékeinek kontroll és kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01; *** : p0,001) (n=5; SD).
Bár a KAT-aktivitás eltéréseket mutatott a genotípusok leveleiben, valódi szignifikáns különbségek a kezelés hatására, az Mv 8 kivételével, nem találhatóak a búzagenotípusok között (23/D. ábra). A gyökerekben nem volt genotípusos különbség sem a kontroll, sem a kezelt növények esetében, bár a PEG jelentősen megemelte az aktivitást. A G-POD aktivitása a kontroll növényekben hasonló volt, továbbá a levelekben alacsonyabbnak bizonyult, mint a gyökerekben (23/E. ábra). A PEG szignifikánsan megnövelte az aktivitást minden vizsgált genotípus levelében, a TC33 és TC19 esetében sokkal erőteljesebben, mint a másik két fajtában. A többi antioxidáns enzim közül a GST aktivitása a levelekben a kezelés hatására
77
nem változott, míg a gyökerekben minden esetben szignifikánsan megemelkedett, különösen az Mv Hombárban és a TC19-ben (23/F. ábra). Ha számoltunk a PEG-kezelés jelentős vízcsökkentő hatásával és az enzimek mért aktivitás értékeit a minták száraz tömegére vonatkoztatva adtuk meg, azt kaptuk, hogy a MDHAR és a G-POD a PEG-kezelés hatására fokozottabban működött minden genotípus levelében. Viszont a többi enzim aktivitása csökkent mindkét vizsgált szervben és ez a csökkenés az APX, a G-POD és a GR esetében szignifikánsnak bizonyult. 5.3.2.5. A vizsgált paraméterek korrelációelemzése A friss mintákra vonatkoztatott adatok szerint szignifikánsan pozitív korreláció található a SA formák között; a kötött SA-szint, illetve a GR, a KAT és a MDHAR aktivitása között; továbbá az aszkorbát-glutation ciklus enzimei közül a GR és a MDHAR, valamint a KAT aktivitása között. Viszont a G-POD aktivitása szignifikánsan negatív korrelációt mutatott a kötött SA-szinttel, illetve a GR és a KAT aktivitásával is (6. táblázat). (A dolgozatban szereplő kísérletek során, az adatok összehasonlítása érdekében, törekedtem az azonos mértékegységek használatára, ezért a PEG-kezelés különböző komponensekre kifejtett hatását is számszerűsítve a minták friss tömegére vonatkoztatva adtam meg, ahol viszont szükséges a helyes értékeléshez, ott az Eredmények megvitatása c. fejezet szövegében jeleztem a száraz tömegre vonatkoztatott változások mértékében bekövetkező esetleges eltéréseket, mivel a kezelés okozta vízvesztés jelentősen befolyásolhatja a kapott eredmények tendenciáját.)
78
6. táblázat: A PEG-kezeléssel indukált szárazságstressznek kitett növényekben mért paraméterek közötti korrelációs kapcsolat elemzése.
5.4. Az UV-B sugárzás, Cd- és/vagy PEG-kezelés önálló, illetve kombinált hatásai búzanövényekre Mivel a természetben egyszerre több stresszor van jelen, melyek befolyásolják a növényi növekedést, fejlődést, ezért életszerű többféle, már önmagában is stresszt okozó tényező növényekre gyakorolt hatásainak egyidejű vizsgálata. A földi élet számára az egyik legáltalánosabb stresszor az UV-B sugárzás és a szárazság; a SA-függő védelmi mechanizmusok jobb megértése szempontjából pedig a Cd-mal történő kezelés bizonyult informatívnak, ezért ezeknek a stressztényezőknek az egyedüli, valamint kombinált hatásait vizsgáltuk az Mv Emese őszibúza fajtában, különös tekintettel a stressztoleranciára. 5.4.1. Morfológiai változások Már a kísérlet elején, amikor a 3 napos előcsíráztatott növények tápoldatba kerültek rövid időn belül eltérés mutatkozott a különböző fényviszonyokon nevelt növények között. A normál (fehér) fénnyel megvilágított hajtások a normális növekedési, fejlődési ütemnek megfelelően zöldültek, de a normál fény és UV-B sugárzás együttes alkalmazása a hajtások
79
mag felőli részének antociános, vöröses elszíneződését idézték elő (24. ábra), a fejlődő levelek azonban itt is zöldek voltak. Az idő előre haladtával a vöröses szín halványult, majd eltűnt, a kezelés kezdetekor már egyik növényen sem volt látható.
24. ábra: A normál fényen nevelt növénykék hajtásai zöldek maradtak (A), ezzel szemben az UV-B sugárzásnak kitett búzahajtásokon antocián-felhalmozódás okozta vöröses elszíneződés volt megfigyelhető (B).
25. ábra: A PEG-, illetve Cd-kezelés hatásai az eltérő fényviszonyok mellett nevelt búzanövényekre.
A kontroll/normál fényviszonyokon nőtt növények növekedéséhez képest, az UV-B sugárzás a 21 nap alatt önmagában szemmel látható hajtásretardációt okozott, mialatt a gyökérzet fejlődését nem befolyásolta. A Cd stressz UV-B sugárzással kombinálva hasonló fenotípusos megjelenést eredményezett, mint amit az egyedüli UV-B stressz esetén találtunk, de a leveleken sárguló területek is megfigyelhetőek voltak, melyek meghaladták a Cd normál fényen kifejtett hatásának mértékét (25. ábra).
80
A F/Fm’ klorofill-a fluoreszcencia indukciós paraméter azt mutatta, az ebben a kísérletben alkalmazott kezelések egyike sem okozott szignifikáns változást a PS II kvantumhatásfokában (az adatok nincsenek feltüntetve). Azonban az 5 napos PEG-kezelés után normál fényen a növények hervadása volt megfigyelhető, amikor viszont UV-B fénnyel lett kombinálva, az UV-B növekedésgátló hatása mellett, a hervadás nem jelentkezett. Az O'Toole- és Cruz-féle levélcsavarodási skála (1980) szerint a PEG-kezelt növények 5 pontot, az UV+ PEG-kezeltek 1 pontot kaptak. Mialatt sem a PEG-, sem pedig az UV-B-kezelés nem befolyásolta a relatív klorofill-tartalmat, addig a Cd csökkentette azt mind a normál fényviszonyok, mind az UV-B-vel kiegészített fényviszonyok között nevelt növényekben (26. ábra).
26. ábra: A Cd- vagy PEG-kezelés hatása a normál (fehér), illetve normál és kiegészítő UV-B fényen nevelt búzanövények relatív klorofill-tartalmára. A különböző betűvel jelzett értékek szignifikánsan, p 0,05 valószínűségi szinten különböznek egymástól. (n=10; SD).
5.4.2. Változások a prolintartalomban A levél prolinszintjét a Cd és a PEG a normál, ill. kiegészítő UV-B-n nevelt növényekben is megemelte ugyan, de ennek mértéke elhanyagolható, az UV-B pedig önállóan nem befolyásolta azt. Ezzel párhuzamosan a PEG-kezelés UV-B-vel kombinálva, vagy a nélkül nagy prolintartalom-növekedést okozott a gyökerekben (27. ábra).
81
27. ábra: A Cd- vagy PEG-kezelés hatása a prolin mennyiségére normál (fehér), illetve normál és kiegészítő UV-B fényen nevelt búzanövények levelében és gyökerében. A különböző betűvel jelzett értékek szignifikánsan, p 0,05 valószínűségi szinten különböznek egymástól. (n=3; SD).
5.4.3. Változások az MDA-tartalomban A levelek MDA szintje jelentősen megnőtt Cd-, valamint PEG-kezelés után, illetve a kiegészítő UV-B-n nevelt növényekben, de a legmagasabb növekedés az UV-B-vel kombinált Cd stressz esetén volt mérhető (28. ábra). A gyökerekben az MDA-tartalom kis mértékben emelkedett meg, mely statisztikusan jelentős volt a Cd-mal vagy PEG-gel kezelt növényekben, ha azok UV-B sugárzásnak is ki voltak téve.
28. ábra: A Cd- vagy PEG-kezelés hatása a malondialdehid (MDA) mennyiségére normál (fehér), illetve normál és kiegészítő UV-B fényen nevelt búzanövénykék levelében és gyökerében. A különböző betűvel jelzett értékek szignifikánsan, p 0,05 valószínűségi szinten különböznek egymástól. (n=3; SD).
82
5.4.4. A különböző kezelések hatásai az oHCA- és SA-tartalomra A 21 napos növényekben az összes oHCA-tartalom kb. kétszer olyan magas volt, mint az összes SA-tartalom (29-30. ábra). A gyökerekben a szabad oHCA mennyisége a kimutathatósági határ alatt volt. A levelek és a gyökerek szabad és a kötött SA mennyisége, valamint a levelek szabad és kötött oHCA-tartalma a kezelés után hasonló mintázatot mutatott.
29. ábra: A Cd- vagy PEG-kezelés hatása a szabad és kötött szalicilsav (SA) mennyiségére normál (fehér), illetve normál és kiegészítő UV-B fényen nevelt Mv Emese növénykék levelében és gyökerében. A különböző betűvel jelzett értékek, melyek a szabad és kötött SA-formákra együttesen vonatkoznak, szignifikánsan, p 0,05 valószínűségi szinten különböznek egymástól. (n=3; SD).
Az 50 M Cd-os kezelés önmagában szignifikánsan megnövelte a teljes SA-tartalmat a levelekben, de UV-B sugárzással együttesen alkalmazva az UV-B tovább már nem fokozta a Cd önálló hatását (29. ábra). A gyökérben a totál SA-mennyiségben mért változások mintázata hasonló a levélben mértekhez, de ebben az esetben a Cd-kezelésen kívül, mind a PEG, mind az UV-B külön-külön és kombinálva is statisztikusan szignifikáns növekedést okozott a kontrollhoz viszonyítva. A kombinált UV+PEG-kezelés a gyökérben további SAtartalom-növekedést okozott a PEG által indukált változásokhoz képest, és ennek mértéke meghaladta az UV-B által egyedül kifejtett SA-szint emelését is. A levélben azonban az UV+PEG-kezelés hatásának mértéke a kombinációt alkotó két stresszhatás eredményei között található. A legmagasabb SA-tartalom-növekedés a levélben az egyedüli Cd- és a kombinált UV+Cd-kezelés esetén volt mérhető, mialatt a gyökérben csak az UV+Cd-kezelés esetén. A gyökérben a szabad oHCA mennyisége kimutathatósági határ alatti, a levélben pedig alacsony volt (30. ábra). Mennyiségét minden kezelés megemelte, ugyanez látható a
83
kötött formájú oHCA esetében is, leszámítva a PEG-kezelés hatását a levélben, azonban a kezelések között statisztikusan igazolható változás nem volt detektálható, kivéve a kombinált UV+Cd- és UV+PEG-kezeléseknél. A Cd és az UV-B külön-külön és kombinált kezelés (UV+Cd) formájában egyaránt megemelte a levelek teljes oHCA-tartalmát (30. ábra), önmagában az UV-B nagyobb mértékben, mint az egyedüli Cd-kezelés, viszont a kiegészítő UV-B-n nevelt növényekben az UV-B hatására megemelkedett oHCA-mennyiséget a Cdkezelés tovább már nem tudta növelni.
30. ábra: A Cd- vagy PEG-kezelés hatása a szabad és kötött orto-hidroxifahéjsav (oHCA) mennyiségére normál (fehér), illetve normál és kiegészítő UV-B fényen nevelt Mv Emese növénykék levelében és gyökerében. A különböző betűvel jelzett értékek szignifikánsan, p 0,05 valószínűségi szinten különböznek egymástól. (n=3; SD).
A PEG-kezelés önmagában nem tudta befolyásolni a levél teljes oHCA-tartalmát, de amikor a növények kiegészítő UV-B sugárzás mellett nőttek, növelte azt, bár ennek mértéke elmarad az UV-B egyedüli hatásáétól (30. ábra). A gyökérben minden alkalmazott kezelés (Cd, PEG, UV-B) megemelte a kötött oHCA-szintet, a legkifejezettebb változás a kombinált kezelések (UV+Cd és UV+PEG) esetében mutatkozott meg. 5.4.5. Változások a PAL aktivitásában A kezdeti PAL-aktivitás körülbelül 2,5-szer magasabb volt a gyökerekben, mint a levelekben (31. ábra). A levél PAL-aktivitásában csak a PEG-kezelés okozott csekély, de statisztikusan szignifikáns emelkedést a kontrollhoz viszonyítva, mialatt a gyökérét minden kezelés eltérő mértékben megnövelte. A Cd-kezelés alacsonyabb növekedést okozott a gyökér PAL-aktvitásában, mint a PEG vagy az UV-B. Bár ennek az enzimnek az aktivitása a
84
kiegészítő UV-B fényen nevelt növények gyökerében a kontroll növényekéhez képest magasabb volt, a kombinált UV+Cd-, illetve UV+PEG-kezelés ezt tovább már nem tudta fokozni.
31. ábra: A Cd- vagy PEG-kezelés hatása a fenilalanin-ammónia-liáz (PAL) enzim aktivitására normál (fehér), illetve normál és kiegészítő UV-B fényen nevelt növények leveleiben és gyökereiben. A különböző betűvel jelzett értékek szignifikánsan, p 0,05 valószínűségi szinten különböznek egymástól. (n=3; SD).
5.4.6. Változások az antioxidáns enzimek aktivitásában A különböző kezelések antioxidáns enzimaktivitásra gyakorolt hatásai a 32. ábrán láthatóak. A 21 napos búza növények leveleiben egyik kezelés sem befolyásolta a GR aktivitását (32/A. ábra).
A gyökerekben a PEG-kezelés önmagában és UV-B stresszel
kombinálva is jelentősen növelte ennek az enzimnek az aktivitását. A legnagyobb növekedés az UV+PEG-kezelés esetén volt mérhető. Az 50 M Cd-os kezelés vagy az UV-B sugárzás külön-külön nem okozott statisztikusan szignifikáns változást, azonban ezek kombinációja növelte a gyökerekben a GR-aktivitást. Csak az UV+Cd-kezelés okozott jelentős csökkenést a levelek GST-aktivitásában (32/B. ábra). Ezzel ellentétben, a gyökerekben önmagában a Cd és a PEG növelte, az UV-B sugárzás nem befolyásolta a GST-t. Amikor a Cd- vagy PEG-kezelés az UV-B stresszt követte, szintén megemelkedett az aktivitás, de ennek mértéke hasonló volt az UV-B nélkül mérthez. Ámbár a KAT aktivitása a kiegészítő UV-B fényen nőtt növények leveleiben jelentősen magasabb volt a normál fényen nőtt kontroll növényekéhez képest, mikor az UV-B Cd stresszel lett kombinálva, az aktivitás nem változott (32/C. ábra). Amikor viszont az UV-B
85
PEG-kezeléssel lett kombinálva hasonló növekedés volt tapasztalható, mint amit az UV-B sugárzás önmagában okozott. A gyökerekben azonban sem az UV-B, sem a Cd- vagy PEGkezelés, sem pedig ezek kombinációja nem befolyásolta a KAT-t. Az APX aktivitása jelentősen nem változott a levelekben az alkalmazott kezelések hatására (32/D. ábra). A gyökerekben is csak az UV-B stresszt követő Cd- vagy PEG-kezelés eredményezett szignifikáns növekedést. Érdekes módon, az UV-B sugárzással kiegészített fényen nevelt növények leveleiben a G-POD aktivitása szignifikánsan alacsonyabb volt a kontroll növényekben mértekhez képest (32/E. ábra). Bár, amikor az UV-B stresszt PEG-kezelés követte, a G-POD aktivitás ugyan megemelkedett, ennek ellenére továbbra is a kontroll értékek alatt maradt. Ezzel szemben, a gyökerekben a G-POD-aktivitás a PEG-kezelés után szignifikánsan megnőtt. Az UV-B nem befolyásolta, amikor viszont Cd-mal vagy PEG-gel lett kombinálva, statisztikusan szignifikánsan megnövelte azt.
32. ábra: A Cd- vagy PEG-kezelés hatása az antioxidáns enzimek (GR – glutation-reduktáz, GST – glutation-Stranszferáz, KAT – kataláz, APX – aszkorbát-peroxidáz, G-POD – gvajakol-peroxidáz) aktivitására normál (fehér), illetve normál és kiegészítő UV-B fényen nevelt búzanövények leveleiben és gyökereiben. A különböző betűvel jelzett értékek szignifikánsan, p 0,05 valószínűségi szinten különböznek egymástól. (n=3; SD).
86
6. EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA
6.1. Nagyszámú búza genotípus vizsgálata szántóföldi körülmények között Azért, hogy búzanövényekben pontosabb képet kapjunk a biotikus stressz, esetünkben a levélrozsda (Puccinia triticina) és a lisztharmat (Erysiphe graminis (DC.) Speer f. sp. tritici Em. Marchal) védekező rendszerre kifejtett hatásairól, továbbá, hogy megállapíthassuk, van-e összefüggés a különböző védővegyületek kiindulási és/vagy stresszindukált szintje, valamint az egyes búza genotípusok kórokozókkal szembeni ellenállósága között, több martonvásári búzafajta, illetve különböző ismert levélrozsdarezisztencia (Lr) géneket hordozó Thatcher-alapú közel-izogén búzavonal (22 különböző genotípus) vizsgálatára került sor. A martonvásári nemesítésű fajták betegségekkel szembeni ellenálló-képességéről számos adat állt rendelkezésünkre, azonban a Thatcher-alapú vonalakról, a levélrozsdával szembeni toleranciájukon kívül, nem volt ilyen jellegű információnk, ezért különösen a jövőbeni kísérletes munka számára szükségesnek tartottuk ezek tanulmányozását. A szántóföldi kísérletek alatt a levélrozsdával mesterségesen inokulált növényeken, genotípustól függően, kisebb-nagyobb mértékben megjelent a természetes lisztharmatfertőzés is. A fenotípusos vizsgálat során azt tapasztaltuk, hogy csak levélrozsdával szemben a TC, csak lisztharmattal szemben a TC2C, TC3 és TC29 vonalak mutattak érzékenységet, viszont a TC1, TC3BG, TC11, TC24, TC25, TC26, TC28, TC33 és TC34 vonalak mindkét patogénre fogékonynak bizonyultak. Ezzel szemben a TC, TC3KA, TC9, TC18, TC19, Mv 8, Mv Marsall, Mv Béres, Mv Regiment és Mv Hombár sokkal ellenállóbb volt a lisztharmatfertőzéssel szemben, mint más búzagenotípusok. Az egyes genotípusok ellenállóképességének hátterében álló folyamatok jobb megismerése érdekében meghatároztuk azok kiindulási illetve fertőzés utáni SA- és PAtartalmát, valamint az antioxidáns enzimek aktivitását. A dolgozat e részének alapját adó publikáció (Kovács és mtsai, 2012) volt az első, amely egyidejűleg hasonlította össze különböző levélrozsda- és lisztharmat-toleranciával rendelkező búza genotípus teljes SAtartalmát, PA-szintjeit és antioxidáns enzimaktivitásait. Különböző növényfajok leveleiben korábban már tanulmányozták az endogén SAtartalom növekedését biotikus stressz alatt (Huang és mtsai, 2005), továbbá úgy találták, hogy az exogén SA-kezelés fokozza a patogénfertőzéssel szembeni ellenálló-képességet (Chaturvedi és Shah, 2007). Azt is megállapították, hogy a SA felkészítette a növényeket a
87
védekezés fokozott indukciójára (Thulke és Conrath, 1998). Hückelhoven és mtsai (1999) szerint a lisztharmat árpában nem okozott SA-felhalmozódást. Továbbá az árpa SA-szintje alacsony maradt Erysiphe graminis f.sp. hordei-vel vagy E. graminis f.sp. tritici-vel történő fertőzés után is, viszont a Pseudomonas syringae pv. syringae-vel történő inokulációt követően megnőtt (Vallelian-Bindschedler és mtsai, 1998). A vizsgált 22 búzafajta, illetve vonal elemzése után a genotípusok teljes SA-tartalmában szignifikáns különbségek mutatkoztak a fertőzés előtt. A martonvásári nemesítésű vonalak SA-szintjei meglehetősen alacsonyak, míg a Thatcher-alapú közel-izogén vonalaké közepesek vagy magasak voltak. A levélrozsda-fertőzés és a megjelent természetes lisztharmatfertőzés után a SA-tartalom a genotípusok több mint felében, martonvásári és Thatcher-alapú búzaváltozatokban egyaránt, megemelkedett. Habár a levélrozsdával, és különösen a lisztharmattal szemben rezisztens genotípusok aránya a martonvásári fajták között magasabbnak bizonyult, mint a Thatcher-alapú vonalak között, nem találtunk kapcsolatot a SA-tartalom kezdeti vagy patogén-indukálta változásai és a toleranciaszint között. Az is lehetséges, hogy a saját eredményeink és a más szerzők által leírtak közötti különbséget az eltérő kísérleti körülmények okozták. Asthir és mtsai (2010) a búza PA bioszintézisének biotikus és abiotikus stressz alatti korai aktivációját írták le. Lisztharmat hatására árpában megnőtt a PUT, a SPD és a SPN szintje (Cowley és Walters, 2002). Egy másik patogén gomba, a sárgarozsda is megnövekedett PA-tartalmat idézett elő egy fertőzésre fogékony búza vonalban (Asthir és mtsai, 2010). Azt is megállapították, hogy a PA-ok változatos biotikus stresszorokkal szemben váltanak ki növényi védekező válaszokat (Hussain és mtsai, 2011). Az általunk végzett kísérletben, a fertőzés előtt a PA-ok közül a SPD esetében voltak a legkifejezettebb különbségek mérhetők a 22 búza genotípusban. Alacsony és magas SPD-tartalmú genotípus a martonvásári és a Thatcher-alapú genotípusok között egyaránt volt. A biotikus stressz szignifikáns növekedést okozott a PUT-tartalomban minden genotípusban, míg a másik két PA mennyiségét, az SPD-t és a SPN-t, alig befolyásolta. A PUT, a SPD és SPN előanyagaként, valószínűleg felhalmozódott a két másik PA szintézise előtt. A kezdeti és a stresszindukált
PA-szintek
közötti
különbségek
nem
korreláltak
a
biotikus
stressztényezőkkel szembeni tolerancia fokával. A növényi betegségek az antioxidáns rendszer fokozott működését, köztük az antioxidáns enzimekét, váltják ki számos növényfajban, de az ellenálló és fogékony genotípusok közötti különbségekről szóló tanulmányok számos ellentmondást tartalmaznak. A levélrozsda KAT- és GST-aktivációt okoz ellenálló búza genotípusban, mialatt a fogékony
88
genotípusokban ezek az enzimek gátlás alá kerültek (Ivanov és mtsai, 2005). Árpában a peroxidázok, a SOD, a GST, az APX és a GR erőteljesen indukálódtak a fogékony genotípusokban már 5-7 nappal a lisztharmattal való fertőzést követően, míg kevésbé kifejezett patogén-indukált növekedés volt megfigyelhető a rezisztens növények inokulált leveleiben (Harrach és mtsai, 2008). A sárga- vagy csíkosrozsda-fertőzés szintén a SOD, a KAT és a peroxidázok stimulációjához vezetett a fogékony búza vonalakban (Asthir és mtsai, 2010). Az antioxidáns enzimek kezdeti aktivitásaiban nagy különbségek nem voltak megfigyelhetőek az elvégzett kísérlet körülményei között. Csekély növekedés volt mérhető a GR, szignifikáns növekedés a GST aktivitásában, mialatt a KAT, az APX és a G-POD aktivitása csökkent a biotikus stressz után. Az érzékeny és fogékony búza genotípusok levélrozsda- és lisztharmat-fertőzésekre adott antioxidáns válaszai között mérhető különbséget nem találtunk. Meg kell azonban jegyezni, hogy a szántóföldi körülmények között nevelt növényekben mért változások nem csak a vizsgált biotikus stressztényezőknek volt köszönhető, hanem az öregedésnek és/vagy különböző abiotikus stresszeknek is. Az eredmények alapján az a következtetés vonható le, hogy bár a SA, a PA-ok és az antioxidáns enzimek fontos szerepet játszanak a biotikus stresszel szembeni védekező mechanizmusban, nincs kapcsolat a védő vegyületek kezdeti vagy stressz hatására megváltozott mennyisége, illetve a levélrozsdával vagy lisztharmattal szembeni tolerancia foka között az általunk vizsgált genotípusokban szántóföldi körülmények között. A megfigyelt változások sokkal inkább az adott genotípusra jellemző sajátosságok voltak, semmint toleranciafüggő jellegzetességek. 6.2. Biotikus stressz hatásai 4 különböző búzagenotípusban A szántóföldi körülmények között fennálló egyéb stresszhatások elkerülése érdekében üvegházi körülmények között vizsgáltuk a lisztharmat által indukált védekezési mechanizmusokat a szántóföldi kísérlet eredményei alapján kiválasztott búza genotípusok, fiatal és felnőtt (GS45 állapotú) növényeiben. A szántóföldi és az üvegházi körülmények növényekre gyakorolt hatásainak összehasonlíthatósága érdekében a hangsúly a felnőtt korú búzákból származó eredményeken van, azonban nem szabad elfelejtenünk, hogy a különböző életkorú növények egymástól eltérő válaszokat adhatnak. Az alábbiakban a fiatal növénykéken végzett kísérlet eredményeit csak ott taglalom, ahol jelentős eltérést tapasztaltunk az egyaránt lisztharmatfertőzésnek kitett, de eltérő fejlettségi állapotú búzák között.
89
Régóta ismert, hogy a lisztharmatfertőzés gátolja a fotoszintézist (Prokopová és mtsai, 2010). Mindazonáltal, annak ellenére, hogy a fertőzés jelei egyértelműen megmutatkoztak a növényeken, a lisztharmat nem volt hatással a PS II kvantumhatásfokára. Azonban, bizonyos védelmi mechanizmusok megváltozott működése egyes esetekben már korán, a fertőzést követő harmadik napon észlelhető volt a növényekben. A lisztharmat okozta fertőzés enzimatikus antioxidáns rendszerre kifejtett serkentő, illetve gátló hatását számos esetben leírták (Ashry és Mohamed, 2011; El-Zahaby és mtsai, 1995; Harrach és mtsai, 2008), továbbá azt is, hogy erre a patogénre érzékeny vagy ezzel szemben ellenálló gabonafélékben a fertőzés különbözőképpen befolyásolhatja az antioxidáns enzimaktivitást (lásd a 6.1. fejezetben). Asthir és mtsai (2009, 2010) leírták, hogy érzékeny búza vonalakban a sárgarozsda okozta kór is stimulálja a G-POD, a SOD és a KAT aktivitását, de a tünetek hiánya miatt ezeknek a paramétereknek a változásait a rezisztens vonalakban nem vizsgálták meg a fertőzés során. A különböző gombás betegségekben szenvedő gabonafélék peroxidáz izoenzim-mintázatának változásai (Flott és mtsai, 1989; Johnson és Lee, 1978; Scott-Craig és mtsai, 1995) azt mutatták, hogy a fogékony és ellenálló genotípusok a fertőzés után részben hasonló, részben különböző indukált vagy gátolt G-POD izoenzim-mintázatot mutatnak, a G-POD gének expressziója miatt (Baga és mtsai, 1995). Azt is kimutatták, hogy egy védelemhez kötődő intercelluláris árpa peroxidáz expressziója transzgénikus dohányban nem fokozta a rezisztenciát (Kristensen és mtsai, 1997). Az általunk vizsgált négy búza genotípus kezdeti enzimaktivitás-szintjei között kifejezett különbségek csak a G-POD esetén voltak mérhetőek, amelynek aktivitása fele olyan nagy volt egy rezisztens (TC19) és egy szenzitív (TC26) vonalban, mint a másik két genotípusban. Azonban ezek a különbségek később, a 7 napos kontroll növényekben az öregedés hatására eltűntek. A kísérlethez olyan felnőtt növényeket használtunk, melyeken már megjelentek a zászlós levelek. A kezelés időtartama meglehetősen rövid volt, de mivel a növényeket cserépben neveltük, lehetséges, hogy a kontroll növényekben mért változásokat a levelek öregedése okozta. A G-POD izoenzim mintázatának vizsgálatára is sort került azért, hogy megvizsgáljuk, vajon a fertőzés új izoformák indukciójához, vagy az ismert izoenzimek mennyiségének változásaihoz vezet-e. Az eredmények alapján elmondható, hogy a TC9, TC19 és TC33 vonalak izoenzim-mintázata a kontroll és a fertőzött növényekben egyaránt hasonló. A G-POD2 sávja hiányzott a 3 és a 7 napos kontrollokból, de a fertőzést követően megjelent, 7 nappal a fertőzés után nagyobb intenzitással, mint 3 nappal. A TC26-ban azonban ez az izoenzim már a 3 napos kontroll növényekben is jelen volt, az öregedés pedig fokozta az intenzitását. A fertőzés drasztikus növekedést idézett elő a G-POD2 aktivitásában
90
és sávjának intenzitása folyamatosan nőtt az öregedés hatására. Mivel az öregedés önmagában is fokozta ennek a sávnak az erősségét, a fertőzésnek kevesebb hatása volt 7 nappal a fertőzés után. A G-POD2 fertőzést követő megjelenése a másik három genotípusban vezethetett a GPOD aktivitás fotometriásan mért növekedéséhez (Pál és mtsai, 2013a). Melgar és mtsai (2006) 5 Williams- és Harosoy-alapú közel-izogén szója vonalban, amelyek eltérő rasszspecifikus rezisztencia géneket (rps, Rps1-k, Rps2, Rps3 és Rps6) hordoztak, vizsgálták az oldódó POD-ok akkumulációját az idő függvényében, eltérő Phytophtora sojae rasszokkal történő fertőzés során. Az eredmények azt mutatták, hogy a POD aktivitásának megemelkedését a fertőzött növényekben befolyásolta az eltelt idő, a növény genetikai háttere, a közel-izogén vonal minősége és a Phytophtora rasszok is. Anjana és mtsai (2007) napraforgóban (Helianthus annuus L.) vizsgálták a levélfoltosságot okozó nekrotróf patogén, az Alternaria helianthi G-POD izoformákra (PO1, PO2 és PO3) gyakorolt hatásait egy kórokozóra rezisztens és egy fogékony genotípusban üvegházi körülmények között. A PO1 jelen volt mindkét genotípus különböző időpontokban vett mintáiban, de a relatív intenzitása a rezisztensekben végig nagyobb, a fogékonyakban pedig alacsonyabb volt, különösen 12 és 48 órával a fertőzés után. A PO2-t és a PO3-t 2 órával a fertőzés után észlelték a rezisztens fertőzött mintákban, az intenzitásuk csökkent a 4. és 8 órában, de ismét megemelkedett a 12. órában. A fogékony genotípus fertőzött mintáiban a PO2 és a PO3 24 órával az inokuláció után magasabb intenzitást mutatott, mint a korábbi időpontokban. A 48. órában a PO2 maximális felhalmozódást mutatott, viszont a PO3 eltűnt. A korreláció analízis pozitív, lineáris kapcsolatot mutatott a legtöbb enzim aktivitása között, azonban, különbségek a lisztharmatfertőzésre adott antioxidáns válaszok között a két ellenálló (TC9 és TC19), valamint a két fogékony (TC26 és TC33) vonal között nem lehetett kimutatni (Pál és mtsai, 2013a). Az eredmények arra utalnak, hogy az antioxidáns enzimek aktivitásában mért változások a fertőzés következményei és nem a rezisztencia okai. A különböző patogének által okozott fertőzések eltérő mértékben befolyásolták a különböző SA-formák mennyiségét árpában (Hückelhoven és mtsai, 1999; VallelianBindschedler és mtsai, 1998). Ugyanakkor, habár a SA fontos szerepet tölt be a SAR kialakulásában (Park és mtsai, 2007; Thulke és Conrath, 1998; Ward és mtsai, 1991; Wildermuth, 2001), a SAR megnyilvánulása nem mindig korrelált a SA szisztemikus felhalmozódásával (Cameron és mtsai, 1999), melynek hátterében más vegyületek, például az azelainsav, akkumulációja is állhat (Conrath, 2011; Jung és mtsai, 2009). Ezen kívül feltételezhető, hogy a SA-felhalmozódás az egyes növényfajokban patogén-specifikus,
91
továbbá függ a fertőzés és a mintavétel közötti időintervallum hosszától. Ezzel magyarázható, hogy a felnőtt korú növények esetén a teljes SA-tartalomban nem tudtunk nagy növekedést kimutatni, a fiatalkorú növényekben pedig, különösen a szabad SA-tartalomban sok esetben jelentős mértékű csökkenést tapasztaltunk a lisztharmatfertőzést követően. Pozitív, egyenesen arányos korrelációt találtunk a szabad és kötött SA-tartalmak között, de nem volt kapcsolat a SA-tartalom változásai és a toleranciaszint között. Ezen felül az öregedés vagy a fertőzés által okozott változások nem magyarázhatóak egyszerűen a szabad és kötött formák közötti átalakulással, mivel az egyik forma növekedését nem követi a másik csökkenése (Pál és mtsai, 2013a). Az exogén SA-kezelés fokozta a gabonafélék hidegtűrését (Horváth és mtsai, 2007; Janda és mtsai, 1999), és növelte néhány antioxidáns enzim (GR és G-POD) aktivitását. A búzán végzett kísérletek során az exogén SA-kezelés nem fokozta a torsgombával (Gaeumannomyces graminis var. tritici) szembeni toleranciát, mert a PAL és a peroxidázok aktivitása nem stimulálódott a gyökerekben (Seah és mtsai, 1996). A TMV-fertőzött (Tobaco Mosaic Virus, dohánymozaik vírus) dohány peroxidáz génjének expresszióját a spermin indukálta, és nem a szalicilát által aktivált hiperszenzitív reakció (Hiraga és mtsai, 2000). Miután az endogén SA-tartalom a G-POD-aktivitástól eltérő mintázatot mutatott a leírt kísérleti körülmények között, és a szabad és kötött SA nem korrelált szignifikánsan a GPOD aktivitással, nem valószínű, hogy a SA-nak közvetlen, pozitív szerepe lenne a GPOD indukciójában. Viszont ennek ellentéte feltételezhető a GR esetében, ahol szignifikáns, pozitív korrelációs kapcsolatot találtunk a szabad SA és a GR-aktivitás között (Pál és mtsai, 2013a). A PA-ok számos funkciójuk mellett antioxidáns szerepet is betöltenek. Bioszintézisük korai aktivációját leírták búzában mind az abiotikus, mind a biotikus stresszekre adott válaszban (Asthir és mtsai, 2010). Stresszkörülmények között a növényfajok az endogén PA-szinteket tekintve különböző válaszokat mutatnak, néhányuk felhalmozza a PA-okat, míg mások PA-szintje nem változik vagy csökken, amikor kedvezőtlen környezetbe kerül (Liu és mtsai, 2007). Hasonló eredményeket találtak árpában is, ahol a szabad PUT és SPN, valamint a konjugált PUT, SPD és SPN mennyisége megnőtt a lisztharmattal történő inokulációt követően (Cowley és Walters, 2002). Az általunk végzett kísérletben, mind a négy búzavonalban a szabad és kötött formájú SPD és SPN felhalmozódott 7 nappal a lisztharmatfertőzés után (Pál és mtsai, 2013a). Mint a SPD és SPN előanyaga, a PUT valószínűleg felhasználódott ezen anyagok szintézisére, amelyek azután konjugált formában raktározódtak. Ezeket az eredményeket a korrelációs kapcsolatok elemzése is alátámasztotta, mivel a szabad PA-ok szoros, pozitív, szignifikáns kapcsolatban álltak a konjugált formákkal.
92
Antioxidáns hatásaik egyike az lehet, hogy a PA-ok képesek szabályozni az antioxidáns enzimek génjeinek expresszióját, Liu és mtsai (2007) szerint ugyanis a SPN serkentette a peroxidáz gének kifejeződését dohányban. Mivel az általunk végzett kísérletben a SPDtartalom szignifikánsan korrelált a mért antioxidáns enzimaktivitásokkal, feltételezhető, hogy összefüggés van a PA-ok és az antioxidáns enzimek között (Pál és mtsai, 2013a). Egyes publikációk szerint a SA-kezelés befolyásolja a PA-ok katabolizmusát (Szepesi és mtsai, 2011) és mennyiségét (Németh és mtsai, 2002). Azt is kimutatták, hogy dohánynövényekben a TMV fertőzés utáni SPN akkumuláció stimulálja két fontos mitogén-aktivált fehérje kináz (MAPK) aktivitását – a sebzés-indukált fehérje kinázét és a SA-indukált fehérje kinázét, melyek részt vesznek a növényi védekezésben (Takahashi és mtsai, 2003). Bizonyítékot találtak arra, hogy búzában a SA-val, a JA-val és a MAPK-val összefüggő jelátviteli útvonalak részt vesznek a lisztharmat-rezisztencia kifejeződésében, és ebben az általuk befolyásolt SAR gének pozitív szerepet játszanak (Meng és mtsai, 2002). Azt gondolják, hogy kapcsolat van az endogén SA- és PA-tartalmak és az antioxidáns aktivitások, valamint a növények különféle biotikus stresszekkel szembeni érzékenysége vagy ellenállósága között (Liu és mtsai, 2007; Talieva és Kondrat’eva, 2002). Ebben a kísérletben a korrelációs elemzés szignifikáns, pozitív összefüggést mutatott a szabad és konjugált SPD- és SPN-, valamint a szabad SA-szintek között (Pál és mtsai, 2013a). Összefoglalva, habár egyes esetekben szoros, pozitív korreláció volt található a SA- és az antioxidáns enzimaktivitások között, valamint ezek mindegyikének fontos szerepe lehet a védekezési mechanizmusokban, ebben a kísérletben nem volt közvetlen kapcsolat ezeknek a paramétereknek a változásai és a lisztharmatfertőzéssel szembeni tolerancia szintje között. Nem szabad elfelejteni azt sem, hogy ezeket a paramétereket a szeneszcencia is befolyásolhatja. A biotikus fertőző ágens, továbbá a fertőzés és az elemzés között eltelt idő intervalluma befolyásolhatja ezeknek a védővegyületeknek az alap szintjeit és a fertőzés által indukált változásait. 6.3. Különböző abiotikus stresszek hatásai búzában 6.3.1. Különböző koncentrációjú Cd hatásai búzanövényekben A nehézfémek növényekre és a táplálékláncon keresztül az állatokra, emberekre kifejtett károsító hatásairól számos esetben beszámoltak (Benavides és mtsai, 2005; Groppa és mtsai, 2008a,b; Khan és mtsai, 2011; Thijssen és mtsai, 2007; Zhou és mtsai, 2014). A Cd bár a természetben relatíve ritkán fordul elő, nagymértékű toxicitása miatt már kis
93
koncentrációban is rendkívül veszélyes, ezért a növényi védelmi rendszert már kis mennyiségben is nagymértékben indukálja. Ezen kívül a kísérletek során azért is ezt a fémet használtuk, mert tudjuk, hogy a Cd jelentősen befolyásolja a SA-bioszintézist (Pál és mtsai, 2005, 2006a; Zawoznik és mtsai, 2007), így a SA-val kapcsolatos védekező mechanizmusok Cd-kezeléssel indukálhatóak. Ugyanakkor az irodalmi adatok szerint a SA nehézfémstressz alatti szerepe meglehetősen ellentmondásos. A SA-as előkezelés számos növényfajban csökkentette a Cdtoxicitást (Çanakci és Karaboğa, 2013; Krantev és mtsai, 2008; Metwally és mtsai, 2003), azonban a SA hidropónikus oldatban való alkalmazása súlyosbította a Cd-stressz tüneteit (Pál és mtsai, 2002). A Cd-indukált SA-felhalmozódást különféle növényekben leírták, bár a pontos szerepe még tisztázatlan. Arabidopsis thaliana-ban a 0,5 mM Cd-kezelés háromszorosára emelte a SA-tartalmat, de azt is megállapították, hogy az endogén SA fokozhatja a Cd okozta oxidatív károsodást (Zawoznik és mtsai, 2007). Rizsben, melynek a búzáéhoz képest magas az alap SA-tartalma, a SA-előkezelés megnövekedett endogén SAszintet eredményezett és védelmet nyújtott a későbbi Cd-kezelés, H2O2 által közvetített, toxikus hatása ellen (Chao és mtsai, 2010). Az elvégzett kísérletek során a 11 napos 500 µM Cd-os kezelés drasztikus mértékben megemelte mind a négy vizsgált genotípus szabad és kötött SA-tartalmát. Minden növény redukált növekedést és fokozott klorózist mutatott, a gyökerek csökevényesek és elágazásmentesek voltak, melyek a nehézfém mérgezés tipikus tünetei. Megállapítottuk, hogy ez az alkalmazott Cd-koncentráció olyan mértékben károsítja a búza növényeket, hogy azok Cd-mal szembeni toleranciája, illetve a kezelésre adott élettani válaszaik közötti különbségek megállapítása nem lehetséges, így alacsonyabb Cdkoncentráció (50 µM) alkalmazása vált szükségessé. Mivel a Cd gátolja a csírázást (az 500 µM Cd 92 %-ban, az 50 µM Cd pedig 27 %-ban), előcsíráztatott növényeket használtunk. A növények egy csoportját már a csírázást követően 50 µM Cd-nak tettük ki. Rajtuk szintén megfigyelhetőek voltak, az előzőekhez hasonlóan, a Cd-mérgezés jellegzetes tünetei, a csökkent hajtás és gyökérnövekedés, illetve fejlődés, a levelek sárgulása a kloroplasztiszok degradációja, a csökkent vízellátottság és egyéb folyamatok miatt (Sobrino-Plata és mtsai, 2009), ellenben ezek mértéke elmaradt a magasabb Cd-koncentrációnál tapasztaltaktól. Az idősebb növények 7 napos Cd-kezelését követően eltérések mutatkoztak a genotípusok morfológiai és fotoszintetikus teljesítménye között. Az 1 hetes 50 µM Cd-os kezelés az Mv Hombárnál nem okozott látható elváltozást, az Mv 8-ban is csak kismértékben csökkentette a növekedést, mialatt a Thatcher-alapú vonalakban, különösen a TC33-ban, már nemcsak növekedésgátlást, hanem csekély klorózist és hervadást is kiváltott. Ennek ellenére a
94
fotoszintézis hatékonysága nem mutatott szignifikáns csökkenést. Az eredményeink alapján megállapítható, hogy az Mv Hombár ellenállóbb, míg az Mv 8, a TC19 és különösen a TC33 érzékenyebb volt a Cd-mal szemben. A korábbi eredmények azt mutatták, hogy a Cd növelte a BA, oHCA és SA szintjeit kukoricában, és ezek a változások korreláltak a Cd koncentrációjával (Pál és mtsai, 2005). Az elvégzett kísérlet során bizonyítást nyert, hogy a Cd-kezelés búza növényekben fokozza a kötött oHCA és az SA akkumulációját, - utóbbinak inkább annak szintézisén, mint szabad és kötött formáinak emelésén keresztül - különösen a levelekben. A korai izotópos vizsgálatok alapján feltételezhető, hogy a növények a SA-at fenilalaninból fahéjsavon és oHCA-n keresztül állítják elő, ahol a PAL katalizálta fenilalaninfahéjsav átalakulás a szintézisút fontos szabályozó lépése, míg a legújabb genetikai vizsgálatok azt mutatták ki, hogy a SA nagy részének előállítása izokorizmáton keresztül korizmátból történik. Az is lehetséges, hogy az adott növényben a PAL- és az ICS-útvonalak egyaránt részt vesznek a SA bioszintézisében és az anyagcsere vagy szabályozó hálózaton keresztül a két út eltérő választ ad stresszkörülmények között, és ez függ a vizsgált növény fajától (Chen és mtsai, 2009). A saját eredményeink is azt mutatják, hogy nemcsak a növényfajoknak, hanem a különböző növényi szerveknek is eltérőek a Cd stresszre adott SAval kapcsolatos válaszai. Habár a PAL-aktivitás szignifikánsan nőtt a Thatcher-alapú vonalak leveleiben, a martonvásári genotípusokban viszont nem, ezek a változások aligha magyarázzák a megfigyelt drámai SA felhalmozódást. Mivel a Cd-kezelés alig befolyásolta a CS és ICS gének expressziós szintjét, úgy tűnik, hogy a levelek SA-szintjének növekedése, a PAL-aktivitás fokozott indukciójának hiánya ellenére, a gyökérben képződő, majd a levelekbe szállítódó prekurzorainak köszönhető, amely az Mv 8 és Mv Hombár gyökereiben csak csekély Cd-indukált SA-szintnövekedést vagy akár csökkent szabad BA-tartalmat eredményezett. A SA szabályozása meglehetősen összetett jelenség. Nagyon kevés szabad és kötött formájú SA-at tartalmazó, egészséges dohánylevelekben, TMV-vel történt fertőzés után, nagymértékben megemelkedett a kötött SA-tartalom. Egy átmeneti csökkenés volt megfigyelhető a kötött BA mennyiségében, párhuzamosan a szabad BA és szabad SA kezdeti emelkedésével, ami azt jelezte, hogy a kötött BA nagyobb valószínűséggel lehet a SA közvetlen prekurzora (Chong és mtsai, 2001). A saját kísérletünkben azt találtuk, hogy a kontroll búza levelek szintén kevés SA-t és oHCA-t tartalmaznak, mind a szabad, mind a kötött formában. Mivel a Cd-mal szemben mérsékelten toleráns TC19-ben volt a legmagasabb a kötött SA, BA és oHCA-tartalom, a négy genotípus közül, nincs
95
kapcsolat a fenolvegyületek alap szintje és a Cd-tolerancia foka között. A Cd-indukálta szabad és kötött SA, valamint kötött oHCA változásai sokkal kifejezettebbek voltak a levelekben, mint a gyökerekben. Érdekes, hogy a Cd csak a kevésbé toleráns Mv Hombár és Mv 8 gyökerében növelte kis mértékben a szabad és kötött SA-tartalmat, habár a gyökér SA szintje és a Cd-tolerancia közötti kapcsolat nem egyértelmű. Salix viminalis-ban a SA-szintet nem befolyásolja sem a Cd-, sem a réz-, sem pedig a cinkkezelés, de hasonlóan a mi eredményeinkhez, nem volt különbség a nehézfémekkel szemben ellenálló, illetve azokra érzékeny klónok SA szintje között a kontrollokban (Landberg és Greger, 2002). Az oHCAról, mely a legnagyobb mértékű növekedést mutatta Cd-os kezelés után, korábban megállapították, hogy antioxidáns tulajdonságokkal rendelkezik (Foley és mtsai, 1999), ezért az eredmények alapján feltételezhető, hogy amellet, hogy a SA prekurzora, szerepe van a Cdra adott antioxidáns válaszban is. A nehézfémek antioxidáns rendszerre kifejtett hatását Brassica juncea (Markovska és mtsai, 2009), Platycladus orientalis, Sophora japonica (Zhou és mtsai, 2014), kukorica (Pál és mtsai, 2006a,b), árpa és egyéb fajokban (Gzyl és mtsai, 2009; Markovska és mtsai, 2009) egyaránt leírták. A Cd oxidatív stresszt okoz és fokozza a védő vegyületek szintézisét (Gratão és mtsai, 2005), többek között a fitokelatinokét, a tiolvegyületekét, az ASC-ét, és befolyásolja az antioxidáns enzimek aktivitását pl. Pinus sylvestris-ben, nyárfa hibridekben (Populus x Canescens) (Schutzendübel és mtsai, 2007), lucernában (Sobrino-Plata és mtsai, 2009) és búzában (Zhao, 2011). A képződő ROS-ok az antioxidáns rendszer serkentésén túl szerepet játszanak egyéb védelmi folyamatokban is, mint jelátvivők (Karuppanapandian és mtsai, 2011). Öt, különböző Cd-toleranciával rendelkező mustárfajta vizsgálata azt mutatta, hogy a legellenállóbb genotípus magasabb toleranciája az antioxidáns enzimek közötti jobb koordinációnak volt köszönhető (Gill és mtsai, 2011). Habár hasonló alap antioxidáns enzimaktivitásokat mértek, a Cd stressz különböző változásokat indukált toleráns és szenzitív uborka vonalak sejtjeiben (Gzyl és mtsai, 2009). Az elvégzett kísérlet eredményei azt mutatták, hogy az antioxidáns enzimek aktivitásának alap szintje nem különbözik jelentősen a vizsgált négy búza genotípusban, annak ellenére, hogy különbségek figyelhetőek meg a Cdmal szembeni toleranciájukban. A 17 napig Cd-nak kitett búza levelekben a H2O2 eliminálásáért felelős enzimek, a KAT, az APX és a G-POD, aktivitásai szignifikánsan megemelkedtek, mialatt a GR-é és a GST-é a legtöbb esetben jelentős mértékben csökkent. Ezzel szemben a 7 napos, idősebb kori Cd-kezelés szinte alig befolyásolta a levél antioxidáns aktivitásait, kivételt ez alól a TC33 és TC19 G-POD aktivitása, valamint az Mv Hombár GSTaktivitása jelentett, előbbiek szignifikánsan nőttek, míg utóbbi szignifikánsan csökkent.
96
Markovska és mtsai (2009) 5 napos 10, 30, 50 és 100 µM Cd-nak kitett indiai mustár növényekben az aszkorbát-glutation ciklus enzimeinek fokozott aktivitásáról, ellenben a ciklus rendezetlenné vált működéséről számoltak be, vagyis a Cd már kismértékben szétzilálta a növényi védelmet, ami a fotoszintetikus rendszer károsodásához vezethet. Nikkellel kezelt kávénövények sejtjei gyors APX-aktivitás növekedést mutattak, bár az aktivitások trendje alig mutatott eltérést a két vizsgált Ni-koncentráció (0,05 mM és 0,5 mM) között (Gomes-Junior és mtsai, 2006). Transzgénikus réti csenkesz növényben a Cd-, illetve az arzénkezelés még nagyobb mértékben megnövelte a Cu/Zn-SOD és az APX gének expresszióját a kloroplasztiszokban, mint a kontroll növényekben, ezzel szemben az arzénnak kitett levelekben mindkét enzim csökkent aktivitást mutatott más nehézfém-kezelésekhez viszonyítva és nem találtak szignifikáns különbséget a kontroll és a transzgénikus növények között (Lee és mtsai, 2007). Ennek magyarázata az lehet, hogy a különböző kezelések eltérő mértékben indukálhatják az egyes izoformákat kódoló gének expresszióját, a képződő fehérjék aktivitása viszont összeadódhat és a mérések során nem elkülöníthetők egymástól az egyes izoenzimek aktivitásbeli különbségei. Az Mv Hombár levelében bár magasabb volt a kiindulási GR-aktivitás, mint a másik három búza genotípusban, a Cd-kezelés ennél az enzimnél sem okozott változást. A 24 napos növények leveleiben hiányzó Cd-indukálta aktivitásváltozás arra utal, mint az a vizuális elemzéskor is megfigyelhető volt, hogy a nehézfém károsító hatása még alig nyilvánul meg a levelekben, hiszen nem a levél, hanem a gyökér az első növényi rész, amely érintkezik a tápoldathoz adott Cd-mal. Ezt támasztja alá az APX aktivitás változatlansága is a kezelés hatására, mivel ez az enzim a normális növényi növekedéshez elengedhetetlenül szükséges és csökkent működése retardált fejlődést okoz (Caverzan és mtsai, 2012). Az érzékenyebb Thatcher-alapú vonalak fokozódó G-POD aktivitása viszont sejtette, hogy a kezelés rövid időtartama miatt nem detektálható a Cd hatása. A levélcsúcsok sárgulása már a mérgezés tüneteinek egyike, vagyis a hosszabb időtartamú kezeléskor már a levelek enzimatikus antioxidáns védelmi rendszere is indukálódik. A kezelés okozta oxidatív stressz során képződő H2O2 eltávolítását a gyökerekben a rendkívül megemelkedett KAT-aktivitás biztosította. A Cd szignifikánsan megemelte a GR aktivitását mindkét martonvásári fajta gyökerében, mialatt a Thatcher-alapú közel-izogén vonalakban nem volt különbség. A megnövekedett GR-aktivitások az Mv 8-ban és az Mv Hombárban korreláltak a teljes GSH-tartalomban megfigyelt növekedéssel, továbbá, kapcsolatban állhattak ebben a két genotípusban a gyökér GSH/GSSG arányának növekedésével is (Kovács és mtsai, 2014b). A GSH-nak védő szerepe van a fémmérgezéssel szemben, így a GSH-tartalom növekedése növelheti a nehézfém stresszel szembeni toleranciát
97
(Zagorchev és mtsai, 2013). A magas GSH/GSSG-arányt a GR biztosítja, és a stressztoleráns genotípusokban általában magasabb arány mérhető, mint a stresszre érzékenyekben (Kocsy és mtsai, 2004). Ennél fogva a GR-aktivitásban, a GSH-tartalomban és a GSH/GSSG-arányban megfigyelt különbségek kapcsolatban vannak a Cd-tolerancia mértékével a vizsgált négy búza genotípusban (Kovács és mtsai, 2014b). A növényi stressztolerancia kapcsolatban áll a növény ASC-szintjével is (Zhang, 2013). Az általunk vizsgált búza fajták, illetve vonalak közül a teljes ASC-tartalom a legmagasabb az Mv Hombár (a legellenállóbb genotípus), a legalacsonyabb pedig a TC33 (a legérzékenyebb genotípus) levelében volt (Kovács és mtsai, 2014b). Szintén szignifikáns növekedést írtak le a teljes ASC-tartalomban durumbúzanövények gyökereiben Cd-stressz alatt, és ez a növekedés összefüggésben állt a Cd-kezelés által okozott magasabb DHA-tartalommal, mialatt a levelekben a kezelés nem befolyásolta sem a teljes, sem az oxidált formájú ASC-t (Paradiso és mtsai, 2008). Azt is leírták, hogy a Cd a PC-k szintézisét is stimulálta durumbúza gyökereiben, különösen a PC3-ét, mialatt a levelekben nem történt PC-szintézis (Paradiso és mtsai, 2008). Korábban Pál és mtsai (2006b) arról számoltak be, hogy a kukorica gyökereiben 1 nappal a 10 M Cd-os kezelés után a PC2-szint megemelkedett, de nem változott a leveleiben. Ezekhez az eredményekhez hasonlóan, az elvégzett kísérlethez kapcsolódóan azt találtuk, hogy az 50 M Cd növelte a PC-k mennyiségét, valamint a fitokelatin-szintáz (PCS) aktivitását a Cd-mal szemben ellenállóbb Mv Hombárban és Mv 8-ban, különösen azok gyökereiben (Kovács és mtsai, 2014b). Másrészről viszont, nem minden növény válaszol PC szintézissel a Cd-ra. Az, hogy Salix-ban Cd-stressz után PC-ok nem voltak kimutathatóak, azt feltételezi, hogy a nehézfémstresszel szembeni védelem a Salix fajokban független a PC-októl (Landberg és Greger, 2002). Az antioxidáns rendszer változásai és számos egyéb védő mechanizmus (pl. nehézfém-detoxifikáció)
aktivációja
is
köthető
a
jelátvivő
SA
aktivitásához
stresszkörülmények között (Çanakci és Karaboğa, 2013; Horváth és mtsai, 2007; Szalai és mtsai, 2013). Ezen eredmények alapján, a fitokelatinok jelentőségén kívül, a GSH központi szerepe a búza Cd-mal szembeni toleranciájában egyértelmű, az optimális redoxállapot és a fém-detoxifikáció tekintetében egyaránt (Kovács és mtsai, 2014b). Ezt megerősítik Huang és mtsai (2010) eredményei is, továbbá a Son és mtsai (2014) által leírtak, amely szerint dohányban az exogén 0,1 mM illetve 1 mM GSH enyhítette vagy visszafordította a Cd, Cu, illetve Zn-kezelések negatív hatásait a nehézfémtől és a GSH koncentrációjától függően. Erős korreláció volt kimutatható a levelekben a szabad és kötött SA formák mennyisége között, továbbá a kötött SA is pozitívan korrelált a kötött oHCA-val, mialatt a
98
szabad BA és kötött SA negatív szignifikáns korrelációban álltak egymással. A SA mennyisége, szabad és kötött formában egyaránt, pozitívan korrelált a G-POD- és PCSaktivitással, valamint a -glutamil-cisztein- (-EC) tartalommal, míg negatívan az ASC mennyiségével (Kovács és mtsai, 2014b). A gyökerekben a szabad és/vagy kötött SA-tartalom szignifikáns kapcsolatot mutatott a GSH, -EC, PC3 és ASC-tartalmakkal, valamint a GR és GST-aktivitásokkal, azonban a szabad BA negatív viszonyban állt az utóbbi paraméterekkel (Kovács és mtsai, 2014b). Az antioxidáns rendszer tagjai pozitív korrelációban álltak egymással és a fém detoxifikáló rendszerrel is. A leírt eredmények azt is jelezhetik, hogy a Cd-stressz alatti megnövekedett SA növelhette a GSH-tartalmat, és ezen keresztül indukálhatta az antioxidáns és fémdetoxifikáló rendszert, amely folyamatok segítik a búzanövénykék Cd-mal szembeni stressztoleranciáját (Kovács és mtsai, 2014b). Ezek az eredmények egybevágnak azokkal a korábbi felfedezésekkel, ahol a SA-szintek kontrollálása volt szükséges az optimális fotoszintézishez és redox-homeosztázishoz (Mateo és mtsai, 2006). Továbbá, kapcsolatot találták a SA és GR vagy GST között a búza x lisztharmat, mint gazda x patogén interakció során (Pál és mtsai, 2013a). Egy másik tanulmányban a SAelőkezelés védte az árpa növényeket a Cd-toxicitástól (Metwally és mtsai, 2003), és redukálta az antioxidáns enzimaktivitások Cd-általi fokozódását. A SA PC-szintézist befolyásoló hatását is leírták kukoricában Cd stressz alatt (Szalai és mtsai, 2013). Ezek az eredmények arra utaltak, hogy a SA nem az antioxidáns rendszer szintjén csökkentette a Cd toxicitását, hanem egyéb mechanizmusokon, mint például a fém detoxifikáción keresztül. Ugyanakkor azt is meg kell említeni, hogy az exogén SA hatásai nem egyenértékűek a stresszindukált endogén SA hatásmechanizmusával. Az eredményeink azt mutatják, hogy a Cd-stressz számos védővegyület szintézisét indukálta a különböző toleranciafokkal rendelkező búza növényekben. Habár a Cd-nak való kitettség az általunk vizsgált genotípusokban serkenti a SA-szintézist, különösen a levelekben, nincs közvetlen kapcsolat az alap, vagy stressz-indukált SAszintek és a Cd-tolerancia foka között. A SA bioszintézis útvonalainak vizsgálata során feltételezhető, hogy nem a korizmáton, illetve izokorizmáton át, hanem a BA-n és/vagy oHCA-n keresztüli szintézis útvonal lehet a felelős a Cd által indukált drámai SAakkumulációért. Habár a kötött formájú BA közvetlenül nem szolgál pool-ként a SAszintézis számára. Noha, a SA-mediált jelzés és a védő mechanizmusok közötti kapcsolat eltérő lehet a levelekben és a gyökerekben, a pozitív korreláció egyes SA-val kapcsolatos vegyületek és a védőanyagok között arra utal, hogy a SA-val kapcsolatos jelzés is szerepet játszhat a
99
nehézfémstresszel szembeni akklimációban, habár a közvetlen kapcsolat még tisztázatlan és további kutatást igényel. 6.3.2. A PEG-kezelés hatásai búzanövényekre A búza védekező rendszerének és stresszválasz-reakcióinak jobb megismerése érdekében
vizsgáltuk
ugyanezeknek
a
genotípusoknak
az
élettani
változásait
szárazság/ozmotikus stressz alatt. A szárazságra adott növényi válaszok közül az első a sztómák bezáródása, ami gátolja a transzspirációt és a gázcserét, ezáltal a fotoszintézis hatékonyságát (Bencze és mtsai, 2011; Chaves és mtsai, 2003; Cornic, 2000). A hajtások PEG-kezelés miatti vízvesztése a levelek turgorvesztését, elvékonyodását, saját tengelyük körüli tekeredését és a levéllemez csavarodását okozta minden általunk vizsgált genotípusban. Ezek a morfológiai elváltozások a fűfélékre jellemző, vízhiányra adott válaszok erőteljes megnyilvánulásai (O'Toole és Cruz, 1980). A legerőteljesebb tünetek a TC33-on, míg a legenyhébbek az Mv Hombáron látszottak, a TC19 és Mv 8 tünetei a kettő közé tehetőek a kontroll növényekhez viszonyítva. Bár az 5 napos PEG-kezelés jól látható morfológiai változást okozott minden genotípusnál, a PSII kvantumhatékonyságát mutató PSII értékekben szignifikáns eltérés nem volt látható, az általunk alkalmazott, stresszt nem okozó fényviszonyok mellett ez a fotoszintetikus paraméter nem alkalmas a szárazságstresszel szembeni ellenálló-képesség mértékének jellemzésére (Adir és mtsai, 2003; Skillman, 2008). Ezzel ellentétben a vizsgált növényi részek prolintartalma már megfelelő, mint stresszmarker (Anjum és mtsai, 2012; Mohammadkhani és Heidari, 2008). A prolin mennyisége minden genotípus levelében és gyökerében jelentősen megemelkedett, különösen a TC33 levelében (Kovács és mtsai, 2014c), amely a PEG-kezelés okozta károsodás elleni védekezés jele. Dohánysejteken végzett kísérletek során megállapították, hogy a külsőleg adagolt prolin és glicinbetain növeli a NaCl-dal szembeni toleranciát az antioxidáns enzimek serkentésén keresztül, továbbá úgy találták, hogy a prolinkezelés eredményesebben indukálja az antioxidáns védelmi rendszert, mint a glicinbetain (Hoque és mtsai, 2007). A NaCl és a PEG egyaránt ozmotikus és oxidatív stresszt idéz elő a növényi szervezetben, továbbá a só és a szárazság stressz jelátvitele nagyrészt azonos (Zhu, 2002), ezért feltételezhető, hogy a prolin védő hatása nemcsak só, hanem szárazságstressz esetén is részben ilyen módon nyilvánul meg. A szárazság stressz egyaránt befolyásolja az antioxidáns védekező rendszert és a SA szintet. A PEG O2 .−, H2O2- és MDA-akkumulációt váltott ki uborkában (Fan és mtsai, 2014)
100
és búzában (Niedzwiedz-Siegien és mtsai, 2004). Ezek szignálmolekulaként is szerepet játszanak szárazság stressz során, valamint indukálják az antioxidáns védelmet. Csírázást követően 2-3 napos búza növények szárított hajtásaiban a GR aktivitása csak a kezelést követő 0,5-1 órában nőtt, utána csökkenni kezdett, míg a KAT és a SOD aktivitása folyamatosan emelkedett (Niedzwiedz-Siegien és mtsai, 2004). Marcińska és mtsai (2013) leírták, hogy búzában a PEG-kezelés növelte a totál antioxidáns aktivitást fogékony fajtában, valamint a prolintartalmat szárazsággal szemben fogékony és toleráns fajtákban egyaránt, ezzel szemben a PEG+SA vagy PEG+ABA-kezelések nem befolyásolták ezeket a paramétereket. A kísérleteink során az 5 napos PEG-kezelés után az aszkorbát-glutation ciklus enzimei, különösen a MDHAR és a GR, fokozott működést mutattak a vizsgált búzanövények levelében. Ennek jelentősége, hogy ez a ciklus védi a kloroplasztiszban található fotoszintetikus rendszereket a szárazság stressz következményeként jelentkező ROSfelhalmozódás káros hatásaitól (Bencze és mtsai, 2011). A MDHAR szignifikáns aktivitásnövekedése alapján az APX aktivitásának szintén szignifikáns, emelt működését feltételeznénk, hiszen a MDHAR regenerálja a MDHA-ot az APX számára hasznosítható ASC-tá. A legtöbb genotípus esetén ezt is tapasztaltuk, azonban az Mv Hombár kezelt növényeiben számottevő változás nem volt mérhető, ellenben ebben a búzafajtában volt a legmagasabb a kiindulási APX-aktivitás. Ugyanezt figyeltük meg a GR esetében is. Az Mv Hombáréhoz képest minden genotípus kiindulási GR aktivitása alacsonyabb volt és ezekben a PEG-kezelés jelentősen indukálta ezt az enzimet. A kevésbé érzékeny Mv Hombár magasabb kezdeti GR aktivitása a magasabb kiindulási GSSG-tartalommal magyarázható, melyet a Cdmal végzett kísérletek során is tapasztaltunk (Kovács és mtsai, 2014b). Ezt támasztja alá Skladanka és mtsainak (2012) eredménye is, amely szerint a szárazság- és gombarezisztens Festulolium arundinacea hibridje, a F. pabulare kontrollált körülmények között magasabb GSSG tartalommal rendelkezett, mint az érzékenyebb F. braunii vagy Lolium perenne fűfajok. Úgy tűnik, hogy a kloroplasztisz védelmében az MDHAR szerepe a legjelentősebb. Hasonló eredményről számoltak be paradicsomon (Lycopersicon esculentum) és vad, sótoleráns rokonán (Lycopersicon pennellii) végzett kísérletek során (Mittova és mtsai, 2000), valamint rizsben is (Sharma és Dubey, 2005). A gyökerek fokozott, PEG-indukálta GR-aktivitása összhangban volt a rendkívül intenzív GST-működéssel. Ennek magyarázata, hogy a GR katalizálta reakcióban képződő GSH szubsztrátként, illetve kofaktorként szolgál a GST számára, amely ez által képes redukálni a stressz hatására képződő hidroperoxidokat (Ball és mtsai, 2004; Dixon és mtsai, 2010), valamint detoxifikálni egyes elektrofil vegyületeket, metabolitokat azok GSH-val
101
történő konjugálásán keresztül. Ezen kívül, a gyökerek ROS-okkal szembeni védelméhez nagyban hozzájárul a KAT és kisebb mértékben az APX megnőtt aktivitása a kezelt növényekben. Az eredményeink alapján elmondható, hogy a genotípusok közül a szárazsággal szemben legkevésbé érzékeny búzafajtában, az Mv Hombárban volt mérhető a legmagasabb APX és GR-aktivitás, melyet a szárazság tovább már nem növelt, ugyanakkor a többi búzagenotípusban csak az antioxidáns enzimek aktivitása alapján, nem lehetett egyértelműen meghatározni a szárazsággal szembeni toleranciájuk mértékét. Az eredményeinket alátámasztják Bencze és mtsai (2011) által leírtak, amelyek szerint a vizsgált búzafajták közül a legkevésbé, illetve leginkább szárazságtoleránsak kizárólag az antioxidáns enzimaktivitás (APX, KAT, GR és GST) értékeik alapján is elkülöníthetőek egymástól, azonban a többi fajta esetében nem lehet egyértelmű párhuzamot vonni
az
enzimaktivitások
szárazság
stressz
indukálta
változásai,
valamint
a
szárazságtolerancia foka között. Rövid időtartamú szárazságstressznek kitett uborka növények gyökerében szintén fokozott KAT-, POD-, APX- és SOD-működést mértek, ezzel ellentétben viszont csökkent az antioxidáns vegyületek (ASC, GSH) mennyisége, valamint a GR-, DHAR, MDHAR aktivitása, ami arra utalt, hogy a H2O2 és O2
.−
eltávolítását végző
enzimatikus tevékenység sokkal fontosabb szerepet játszik az uborkanövénykék gyökerének védelmében, mint a nem-enzimatikus rendszer (Fan és mtsai, 2014). Szárazságtoleráns őszi tritikáléban a fenolos vegyületek felhalmozódtak, míg az érzékeny genotípusban mennyiségük csökkent (Hura és mtsai, 2009). Rizsben a PEG- és a nitrogén-monoxid-kezelések egyaránt jelentős mértékben megemelték az oldható fenolok teljes mennyiségét, valamint a bioszintézisükben szerepet játszó PAL aktivitását, melyet az oxidatív stresszkörülmények indukáltak (Shehab és mtsai, 2010). A kísérlet során a PEG hatására a szabad és kötött formájú SA-szintek jelentős mértékben nem változtak a négy búzagenotípusban, és a kezelést követően nem mutattak egyértelmű genotípusos különbséget. Ha a mért adatokat a minták friss tömege helyett azok száraz tömegére vonatkoztatva adjuk meg, számolva a PEG-kezelés okozta vízvesztéssel, a szabad és kötött SA-tartalmak kismértékű, de a legtöbb esetben nem szignifikáns csökkenést mutatnak, különösen a gyökerekben, a legkisebb mértékű változást itt is az Mv Hombárban kaptuk, míg a legnagyobbakat a Thatcher-alapú közel-izogén vonalaknál. Az eredményeink alapján úgy tűnik, hogy a növényeknek az alkalmazott kezelés ellen nincs szükségük több SA-ra, azt a PEG-kezelés alatt egy adott értéknél limitálja. Ennek hátterében a szárazságstressz elleni védelemben szerepet játszó egyéb mechanizmusok állhatnak, mint például az ABA-függő folyamatok (Barnabás és mtsai, 2008; Liu és mtsai, 2006; Parent és mtsai,
102
2009), amelyek viszont magasabb SA-szintnél már gátolódhatnak a két vegyület antagonizmusa miatt (Marcińska és mtsai, 2013; Meguro és Sato, 2014). A gyökerek stressz hatására változó kötött SA-tartalma azonban szoros kapcsolatban állt a glutation és prekurzorainak
(cisztein,
γ-EC)
PEG
hatására
mutatott
szignifikáns
mennyiségi
növekedésével (Kovács és mtsai, 2014c), továbbá a GR és a GST enzimek fokozott aktivitásával, ami arra utal, hogy a SA a gyökerekben a tiolvegyületeken keresztül fejtette ki védő hatását a szárazságstresszel szemben, melyet kiegészített a serkentett, KAT általi H2O2elimináció. Viszont, ha figyelembe vesszük a PEG-kezelés okozta vízvesztést és korrigáljuk az adatokat, akkor, amíg a gyökerekben az antioxidáns enzimek aktivitása és a kötött SA mennyisége a kezelés hatására csökkenő tendenciát mutatott, addig a tiolok mennyisége szignifikánsan megemelkedett, vagyis a tiolok mennyiségi változásaiért csak részben felelős a SA. A gyökerekkel ellentétben, a levelekben viszont a tiolok szerepe csökkent, melyet a PEG hatására nem fokozódó, sőt inkább csökkenő GST-aktivitás mutat, a KAT szerepét pedig nagy részben átvették a peroxidázok (G-POD, APX) valamint a MDHAR. A levélben megfigyelhető PEG-okozta megnövekedett MDHAR-aktivitás szoros összefüggésben állt a levelek megemelt prolintartalmával, ami viszont az általunk elvégzett kísérletben nem állt összefüggésben a SA-tartalommal, bár ennek ellenkezőjéről korábban már beszámoltak. Misra és Saxena (2009) leírták, hogy 0,5 mM exogén SA serkentette a prolinszintézist a 100 mM NaCl-dal kezelt lencsenövényekben a prolin metabolizmus jelentős befolyásolása által (a bioszintézisét fokozta, ugyanakkor a lebontását gátolta), és hatása erőteljesebb volt, mint a NaCl-kezelésnek önmagában. Továbbá azt is megállapították, hogy az exogén SA és a NaCl hatása összeadódik és az általuk közösen kiváltott nagymértékű prolin-felhalmozódás a sztóma zárósejtek turgorának fenntartásához vezet, amely segíti a sóstresszel, ozmotikus stresszel szembeni védelmet. Az intenzív prolintermelés ezen kívül biztosítja a megfelelő NADPH-szintet többek között a GR és az MDHAR működéséhez is, vagyis az antioxidáns enzimek támogatásán keresztül aktiválja a védekező rendszer egyéb elemeit is (Ashraf és Foolad, 2007; Xu és mtsai, 2009). A prolin- és SA-tartalom közötti kapcsolatban megfigyelt ellentmondás a SA és az ABA antagonizmusával magyarázható, hiszen a prolin-akkumulációt az ABA-függő és ABA-független, esetünkben SA-függő jelátviteli utak egyaránt mediálhatják (Zhu, 2001; 2002). Habár az exogén SA által abiotikus stressz során indukált védekező folyamatokról (Alavi és mtsai, 2014; Hussain és mtsai, 2010; Misra és Saxena, 2009), valamint az endogén SA biotikus stressz alatt játszott védő szerepéről számos esetben beszámoltak (Conrath, 2011; Rivas-San Vicente és Plasencia, 2011; Spoel és Dong, 2012), ugyanakkor az endogén SA
103
maga is stresszor lehet a növény számára. Arabidopsis thaliana vad típusú Col-O és SAhiányos NahG mutánsának vizsgálatakor kiderült, hogy az endogén SA ROS-t generál a fotoszintetikus szövetekben só- és ozmotikus stressz alatt (Borsani és mtsai, 2001), ami oxidatív stresszt vált ki. Ezt a gondolatmenetet követve az eredményeink arra is utalhatnak, hogy az endogén SA kiindulási szintje búzában is kifejthet stresszhatást, melyet a növény a fokozott prolintermelésen keresztül az antioxidáns rendszer aktiválásával kompenzál szárazság stressz esetén. A MDHAR és a GR egyaránt NADPH-t igényel a működéséhez, emiatt egymás versenytársai a redukáló erőért. A SA-ról Cd-stressz esetén is bebizonyosodott, hogy pozitív kapcsolatban van a tiolvegyületekkel, amelyek védik a növény a Cd káros hatásaitól, vagyis a védekező rendszer kulcsfontosságú tagjai (Ball és mtsai, 2004; Kovács és mtsai, 2014b). Szárazság stressz során a tiolok védelemben betöltött szerepe szintén rendkívül jelentős (Shehab és mtsai, 2010), vagyis a bioszintézisüket indukáló SA védő hatása is szükséges ezzel a stresszel szemben. A túlságosan magas SA-szint viszont már károsíthatja a növényt, ezért a növény csökkenti a SA-mennyiségét, a felesleg káros hatása ellen pedig védekezésképpen prolint szintetizál, ami indukálja a MDHAR-t. Ennek az elméletnek az igazolásához viszont nincs elegendő bizonyítékunk, valamint nem a legmagasabb kezdeti SAtartalmú búzavonal, a TC19, esetén mértük a legnagyobb PEG-indukált prolinszintet, ezért további vizsgálatok elvégzése szükséges. Valószínűbbnek látszik az a feltételezés, miszerint az általunk vizsgált négy búza genotípusban a szárazságstressz káros hatásainak csökkentése érdekében nem a SA-függő folyamatok dominálnak, ugyanakkor azok hatása csak részben tér el a SA-étól. Bár a magasabb kezdeti SA-szinttel rendelkező genotípusok közöl a TC33 szárazsággal szemben érzékenyebbnek bizonyult, az alacsonyabb SA-szintűek közül pedig az Mv Hombár ellenállóbbnak, a kezelésre adott válaszok jellege általános, nem mutatott genotípusok közötti eltérést, nem volt egyértelmű összefüggésben a toleranciafokkal. Hasonló eredményeket kaptunk rizsben is (Pál és mtsai, 2014). Érdekesség, hogy a TC33 az eddigi eredmények alapján nemcsak a szárazsággal, hanem a Cd-mal és a lisztharmattal szemben is érzékenyebbnek látszott a többi vizsgált genotípusnál, az Mv Hombár viszont ellenállóbbnak. Hasonló összefüggésről számoltak be Sgherri és mtsai (2001), akik szerint a Triticum durum szárazsággal szemben ellenállóbb fajtája toleránsabbnak bizonyult Cu-zel szemben, mint a szárazságra érzékenyebb fajta. Lehetséges volna, hogy a fokozott szenzitivitás hátterében a magasabb alap SA-szint áll, vagy
104
a túlzott érzékenység idéz elő megemelkedett SA-szintet? Ezek megválaszolása további vizsgálatokat igényel. 6.3.3. Az UV-B sugárzás hatásai Cd- vagy PEG-kezelt búzában A korábbi kísérleteinket kiegészítve harmadik abiotikus stresszorként vizsgáltuk az UV-B sugárzásra adott válaszokat egy martonvásári nemesítésű búzafajtán, az Mv Emesén, amely tulajdonságaiban rendkívül hasonlít az Mv Hombárhoz. Számos esetben írtak a kiegészítő és környezeti UV-B sugárzás növényi növekedésre, anyagcserére, morfológiai, élettani és biokémiai változásaira kifejtett közvetett és közvetlen hatásairól a különböző növényfajokban (Alexieva és mtsai, 2001, 2003; Bieza és Lois, 2001; He és mtsai, 2011; Mishra és Agrawal, 2006; Solovchenko és Merzlyak, 2008; Xu és Sullivan, 2010; Zlatev és mtsai, 2012). Az UV-B stressz és más stresszfaktorok közötti kölcsönhatás vizsgálata segíthet a növények változó környezeti feltételekhez való alkalmazkodásának megértésében. Ennek a kísérletnek a fő célja az volt, hogy felfedjük, hogyan befolyásolja a folyamatos UV-B sugárzás, növeli-e vagy csökkenti a Cd- vagy a szárazság stressz hatását, továbbá vizsgáljuk a SA, mint szignál molekula, szintézisének és anyagcsere változásainak feltételezett szerepét, mely szerepet játszhat a különböző stresszorokkal szembeni akklimációs folyamatokban. Másfelől arra is kerestük a választ, hogy az UV-B sugárzás hogyan befolyásol bizonyos SAval kapcsolatos stresszválaszokat, amelyek fontosak lehetnek a szárazság vagy Cd-kezeléssel szembeni védekezési mechanizmusokban, búza növényekben. Mindamellett az UV-B sugárzás szárazsággal vagy Cd-mal kombinált, a SA szintézisére és mennyiségére kifejtett hatásairól, ugyanolyan kísérleti feltételek mellett nevelt búza növényekben, még nem számoltak be. A klorofill- és prolintartalom változásait is leírták az egyedüli UV-B-re, illetve kombinált UV-B és nehézfém- vagy szárazság stresszre adott válaszként számos növényfajban, de az UV-B hatása függ annak időtartamától és intenzitásától, továbbá az alkalmazott stressz-faktorok sorrendje is befolyásolhatja az eredményeket (Alexieva és mtsai, 2003; Mishra és Agrawal, 2006; Singh és mtsai, 2009). Ebben a kísérletben a kiegészítő UVB sugárzás alatt nevelt növényekben retardált növekedés volt megfigyelhető és a Cd fokozott oxidatív stresszt eredményezett, amely a leveleken, különösen a levélcsúcsokon, kifejezett sárguló területek formájában nyilvánult meg, mialatt az UV-B előkezelés vagy edzés enyhítette a PEG-kezelés által fokozott hervadást. A Cd-kezelés egyedül, valamint UV-B-vel együtt jelentősen csökkentette a totál klorofill-tartalmat, míg a prolinszint szignifikáns
105
növekedést csak a PEG-kezelés után mutatott normál és UV-B-vel kiegészített normál fényen egyaránt. A Cd- és PEG-kezelések, valamint az UV-B stressz önmagában jelentősen növelte a levelek lipidperoxidációját, a gyökérben viszont csak a kombinált kezelések (UV+Cd, illetve UV+PEG) eredményeztek MDA-szint emelkedést. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy mind a Cd, mind a PEG, mind pedig az UV-B-kezelés károsodást idézhetnek elő a búza növényekben, de a hatásmechanizmusuk eltérő (Kovács és mtsai, 2014a). A SA abiotikus stresszkörülmények közötti hatásmechanizmusával kapcsolatban ellentmondásos eredményekről számoltak be, mint például a Cd-kezelés okozta SAfelhalmozódásról (Metwally és mtsai, 2003; Pál és mtsai, 2005), az exogén SA-kezelés nehézfémekkel szembeni jótékony hatásáról (Krantev és mtsai, 2008; Popova és mtsai, 2009), ugyanakkor az általa kiváltott oxidatív stressz kialakulásáról, illetve gyökérzet-károsításáról (Pál és mtsai, 2002). Ebben a munkában, a levelekben és gyökerekben mért totál SA-tartalom változásai hasonló mintázatot mutattak, és összességében elmondható, hogy Cd-nak nagyobb hatása volt a SA-szintre, mint a PEG-nek vagy az UV-B-nek önmagában, továbbá az UV-B nem tudta tovább fokozni a Cd-indukált SA-felhalmozódást. Az UV-B sokkal hatásosabban tudta emelni az SA-tartalmat, mint a PEG-kezelés, de e két kezelés kombinálása hasonló emelkedést okozott, mint az egyedüli UV-B. Ezekkel ellentétben, az UV-B sugárzás egyedül nagyobb levél oHCA-tartalom növekedést okozott, mint a Cd-kezelés magában, miközben a kombinált UV+Cd-kezelés nem emelte statisztikusan szignifikánsan a Cd hatásait. Érdekesség, hogy bár a PEG-kezelésnek önmagában, a levélben, nem volt hatása a totál oHCA-tartalomra, a kombinált UV+PEG annak fokozódását eredményezte, de ennek értéke még mindig elmarad az UV-B-indukálttól. Másfelől, a gyökérben az UV+PEG-kezelés bizonyult
a
leghatásosabbnak,
mivel
a
legmagasabb
kötött
oHCA-akkumulációt
eredményezte. Korábban, ezekhez hasonlóan, kukorica növénykék leveleiben Cd stressz által kiváltott endogén SA-szintnövekedést találtak, amely összefüggésbe hozható a Cd-kezelt növények levelében megfigyelt oxidatív stresszel, továbbá a fenolvegyületek között a legmagasabb akkumulációt a kötött oHCA esetében találták (Pál és mtsai, 2005). Az endogén SA-tartalom szárazságstressz alatti változásait számos esetben leírták (Abreu és Munné-Bosch, 2008; Bandurska és Stroinski, 2005), ebben a kísérletben úgy találtuk, hogy a PEG-kezelés csak a gyökerekben indukálta a fenolvegyületek felhalmozódását, a levelekben nem, de UV-B sugárzással együtt mind a levelek, mind a gyökerek SA- és oHCA-szintje szignifikánsan megnőtt. Árpa növények levelében és gyökerében
az
összes
SA
mennyiségének
megemelkedését
is
leírák,
amikor
a
szárazságstresszt UV-B sugárzás előzte meg (Bandurska és Cie’slak, 2013). A megnőtt SA-
106
tartalom lehet a felelős az UV-B hervadást csillapító hatásáért, amit önmagában a PEGkezelés okoz. Ez a megfigyelés összhangban van egy nemrégiben készült tanulmánnyal, ahol az Arabidopsis SUMO E3 ligázát kódoló SIZ1 gén hiányáról számoltak be, amely csökkent sztómanyílást és erősebb szárazság toleranciát okozott a SA-indukálta ROS-felhalmozódás szabályozásán keresztül (Miura és mtsai, 2013). Mivel a sztómanyílás irányítása fontos a vízhasználat hatékonysága és szabályozása számára, valamint válasz a szárazságra, az UV-B stressz-indukálta SA-akkumulációnak lehet pozitív hatása a PEG-kezelt növényekben. A SA turgorfenntartásban betöltött közvetett vagy közvetlen szerepét a korábbi kísérletek eredményei is megerősítették (lásd a 6.3.2. fejezetben). Ezek szerint kapcsolat van a sztómanyílás szabályozásában szerepet játszó prolin fokozott akkumulációja és a megváltozott SA-szintek között (Kovács és mtsai, 2014c). Továbbá, amióta kimutatták, hogy az oHCA antioxidáns tulajdonságú (Foley és mtsai, 1999), az eredmények alapján feltételezhető, hogy az oHCA-tartalom növekedése a SA-bioszintézistől független is lehet és szerepet játszhat a Cd-ra, szárazságra és UV-B stresszre adott antioxidatív válaszban. A PAL-aktivitást, mely egy kritikus enzim a növények metabolizmusában, a ligninek, flavonoidok, antocianinok és egyszerű fenolsavak szintézisében (Li és mtsai, 2014), stimulálta az UV-B sugárzás (Jóźwiak-Żurek és mtsai, 2011), a Cd stressz (Pawlak-Sprada és mtsai, 2011) vagy a PEG-kezelés (Shehab és mtsai, 2010). Érdekesség, hogy míg a PALaktivitás a levelekben kisebb változásokat mutatott, addig a gyökerekben minden kezelés meg tudta emelni azt, különösen a PEG, UV-B és UV+PEG esetében, bár a kombinált kezelések összeadódott hatása nem volt megfigyelhető. Ezek az eredmények összhangban vannak a SA és az oHCA változásaival a gyökérben, de a Cd-kezelt növények levelében mért magasabb SA- és oHCA-tartalmakat, az UV-B vagy PEG-kezelt növényekhez viszonyítva, nem kísérte magasabb PAL-aktivitás, amely nem tudta megmagyarázni ezeket a különbségeket. Árpában azt találták, hogy a szárazság vagy UV-B által indukált SA-akkumulációt fokozott PAL és benzoesav-hidroxiláz enzimaktivitás kísérte (Bandurska és Cie’slak, 2013). Ráadásul a stresszindukálta SA- és oHCA-tartalmak változásainak hasonló mintázata alapján feltételezhető, hogy a SA az oHCA-n keresztül játszhat meghatározó szerepet, hasonlóan a rizsben találtakhoz (Pál és mtsai, 2013a). Ebben a munkában az alkalmazott kezelések különböző mértékben aktiváltak több, a növények akklimációjában szerepet játszó rendszert, úgymint az antioxidáns enzimeket és a fenilpropanoid útvonalat. A vizsgált növényi részek, a levelek és a gyökerek, eltérően reagáltak. Az UV-B és a Cd összeadódott hatása megnövekedett GR és APX aktivitást és gyökérpoliamin-szintet eredményezett (Kovács és mtsai, 2014a), amely összefüggésben állhat
107
a gyökerek fenolos vegyületeinek megemelkedett szintjével és megnyilvánult az UV-B sugárzás Cd-kezelt növényekre gyakorolt negatív hatásaként. A kiegészítő UV-B-t és Cd-ot kombináló kezelések sokkal hangsúlyosabb változásokat eredményeztek az antioxidáns enzimaktivitásokban és az antioxidáns vegyületek mennyiségében borsóban (Agrawal és mtsai, 2009). Az UV-B és PEG-kezelés kombinációja nem fejtett ki összeadódott hatást az antioxidáns enzimek aktivitására, jelezve, hogy bár mind az UV-B, mind a PEG indukálja a stresszt, kombinációjuk nem tudott megnövekedett károsodást okozni a búza növényekben. Úgy találták, hogy az exogén SA-kezelés késlelteti a levélcsavarodást az antioxidáns enzimek indukálása és az ozmoprotektánsok modulálása révén PEG-indukálta ozmotikus stressz során (Demiralay és mtsai, 2013; Marcińska és mtsai, 2013). Azonban, ebben a kísérletben az antioxidáns védekezési mechanizmusok nem álltak kapcsolatban a fenolvegyületek szintjeiben megfigyelt változásokkal. Hasonlóan a mostani eredményekhez, néhány esetben az UV-B sugárzásnak nehézfém vagy szárazság stresszel együtt lehet szinergista vagy antagonista hatása az antioxidáns rendszerre (Alexieva és mtsai, 2003; Mishra és Agrawal, 2006), alapvetően az alkalmazott UV-B-kezelés módszerétől, körülményeitől és intenzitásától függően. Összefoglalásként elmondható, hogy az UV-B sugárzásnak pozitív és negatív hatásai egyaránt vannak azonos körülmények között nevelt búza növényekben a másodlagos, abiotikus stresszfaktortól függően. A tapasztalt védő vagy károsító hatások kapcsolatban állhatnak a fenol vegyületek mennyiségében megfigyelt változásokkal. A SA különböző szerepe és hatásmechanizmusa magyarázhatja a különböző mértékben megnövekedett SA-szinteket a Cd- vagy PEG-kezelés esetében az UV-B-vel kiegészített normál fényen nevelt növényekben. Az UV-B sugárzás alatt alkalmazott PEG-kezelés nem okozott hervadást, és ez feltételezhetően a sokkal kifejezettebb SA-felhalmozódásnak volt köszönhető, amely a kombinált kezelés során védelmet nyújthat a szárazságstresszel szemben búzanövényekben. Ezekkel ellentétben, a Cd-kezelt növényekben a drámai SA-akkumuláció, melyet az UV-B tovább már nem növelt, kifejezett oxidatív stresszt eredményezett és aktiválta az antioxidáns rendszert, illetve más védő vegyületeket, mint amilyenek a poliaminok is (Kovács és mtsai, 2014a). Bár a gyökér PAL aktivitásának változásait követik a gyökér oHCA- és SA-szintjeinek változásai, azok mennyisége a levelekben annak ellenére is növekszik, hogy a levél fokozott PAL-aktivitása hiányzik.
108
7. ÖSSZEFOGLALÁS ♦ Munkánk során számos martonvásári nemesítésű búzafajta és Thatcher-alapú közel-izogén búzavonal alap és biotikus stressz által indukált SA- és PA-szintje lett meghatározva szántóföldi körülmények között, mely a jövőbeni kutatások számára szolgálhat információval. ♦ Az eredményeink alapján elmondható, hogy a vizsgált búzagenotípusokban a SA mennyisége minden általunk alkalmazott kezelés hatására megváltozott: UV-B sugárzás, Cd-stressz illetve felnőttkori biotikus stresszek hatására megnőtt, utóbbi két esetben erőteljesebben, míg szárazságstressz, továbbá fiatalkori lisztharmatfertőzés hatására alig változott vagy csökkent a SA-szint. ♦ Bár a SA részt vesz a búza növényeket érő különböző stresszek elleni védelemben, a kiindulási mennyisége vagy stresszindukált változásai nincsenek kapcsolatban a növények adott stresszel szembeni toleranciájának fokával. ♦ A TC33 Thatcher-alapú közel-izogén vonalról megállapítottuk, hogy magas kiindulási endogén SA-tartalommal rendelkezik, továbbá minden alkalmazott kezelésre érzékenyen reagál. Utóbbi miatt a búzafajták rezisztenciájának fokozását célzó nemesítési munkák számára nem javasolt, mint lehetséges keresztezési partner, ugyanakkor a stresszekre való fogékonysága és az egyéb búza genotípusokhoz képes magas alap SA-szintje közötti okokozati viszony feltárásához további vizsgálatok szükségesek, melyekhez ideális modellnövény lehet. ♦ Azt is megfigyeltük, hogy a vizsgált genotípusokban minden alkalmazott kezelés hatására, a károsodás/károsítás mértékének mérséklése érdekében, aktiválódott az antioxidáns védekező rendszer, melynek stresszekre adott válaszainak jellege általánosnak tekinthető, nem mutatott egyértelmű genotípusfüggést. Kivételt képzett az Mv Hombár, amelynek magasabb kezdeti antioxidáns enzimaktivitása magasabb szárazság-toleranciával párosult. ♦ A SA a lisztharmatfertőzött, a Cd-, illetve PEG-kezelt növényekben az antioxidáns rendszer, így például a GR és GST enzimek serkentett működésén keresztül fejti ki védő hatását, ugyanakkor a szárazságstressz során a SA-on kívül más vegyületek is befolyásolhatják ezen antioxidáns enzimek aktivitását. ♦ A SA bioszintézise abiotikus stresszek során nagy valószínűséggel a fenilpropanoid útvonalon keresztül történik, a sikiminsav útvonal szerepe ezekben a kísérletekben, a mintaszedés idején elhanyagolható volt.
109
♦ A fenilpropanoid útvonal abiotikus stresszkörülmények közötti jelentősége más védő vegyületek fokozott szintézise miatt is fontos, erre bizonyíték például az UV-B sugárzásnak kitett fiatal búza növények antociános elszíneződése is, ezért elképzelhető, hogy emiatt szerepe fontosabb volt a kísérleteink során, mint a sikiminsav útvonalé. ♦ Az UV-B sugárzás általunk alkalmazott dózisa és ideje jótékony, ún. eustressznek vagy edzésnek minősült, és habár gátolta a búza növénykék növekedését és fejlődését, ugyanakkor enyhítette a szárazság stressz hatásait, ezzel szemben viszont fokozta a Cd által okozott károsodás mértékét.
110
8. SUMMARY ♦ In the course of the work the initial and biotic stress-induced levels of endogenous SA and PA in numerous Martonvásár-bred wheat cultivars and near-isogenic lines of Thatcher were determined under field and greenhouse conditions, providing information that could be useful in future research. ♦ The results indicated that the SA quantity changed in response to all the treatments applied, rising in the case of UV-B radiation, Cd stress and biotic stressing in the adult stage, especially for the two latter, and exhibiting little change or decreasing in the case of drought stress and powdery mildew infection in young plants. ♦ Although SA is involved in the protection of wheat plants from various stress factors, neither the initial level of SA nor the changes induced by stress were related to the extent of tolerance exhibited by plants to a given stress. ♦ The near-isogenic Thatcher line TC33 was found to respond sensitively to all the treatments applied. It is therefore not recommended for use as a crossing partner when breeding for enhanced resistance. However, it could be an ideal model plant for further studies aimed at revealing a possible cause and effect relationship between its susceptibility to stress and the fact that it has a higher initial SA level than the other wheat genotypes. ♦ It was also observed that all the treatments applied to the test genotypes resulted in the activation of the antioxidant defence system to diminish the extent of damage. However, this could be regarded as a general stress response, as it did not exhibit any clear dependence on genotype. The only exception was Mv Hombár, where higher initial antioxidant enzyme activity was associated with better drought tolerance. ♦ In plants infected with powdery mildew or treated with Cd or PEG, SA exerts its protective effect via the antioxidant system, e.g. through the enhanced functioning of the GR and GST enzymes, while in the case of drought stress the activity of these antioxidant enzymes may also be influenced by compounds other than SA. ♦ It appears extremely likely that the biosynthesis of SA follows the phenylpropanoid pathway in the case of abiotic stress effects, while the role of the shikimic acid pathway was negligible at the sampling times used in the present experiments. ♦ The significance of the phenylpropanoid pathway under abiotic stress conditions is enhanced by the greater synthesis of other protective compounds, as proved by the
111
anthocyanin pigmentation of young wheat plants exposed to UV-B radiation, so this could be why it played a more important role than the shikimic acid pathway in the present work. ♦ The UV-B dose and exposure time used in these experiments proved to have a beneficial (eustress) or hardening effect, and although it inhibited the growth and development of the wheat seedlings, it mitigated the effects of drought stress. On the other hand, it increased the level of damage caused by Cd.
112
9. FELHASZNÁLT IRODALOM Abreu, M.E., Munné-Bosch, S. (2008). Salicylic acid may be involved in the regulation of drought-induced leaf senescence in perennials: A case study in field-grown Salvia officinalis L. plants. Environmental and Experimental Botany, 64, 105-112. Ádám, A.L., Bestwick, C.S., Barna, B., Mansfield, J.W. (1995). Enzymes regulating the accumulation of active oxygen species during the hypersensitive reaction of bean to Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Planta, 197, 240-249. Adir, N., Zer, H., Shochat, S., Ohad, I. (2003). Photoinhibition – a historical perspective. Photosynthesis Research, 76, 343-370. Agrawal, S.B., Singh, S., Agrawal, M. (2009). Ultraviolet-B induced changes in gene expression and antioxidants in plants. Advances in Botanical Research, 52, 47-86. Akbari, M., Baradaran Firouzabadi, M., Asghari, H., Farrokhi, N., Ghorbani, H. (2013). Complimentary response of salicyclic acid and cadmium on growth and yield traits of soybean. International Journal of Agronomy and Plant Production, 4, 1684-1696. Alavi, S.M.N., Arvin, M.J., Kalantari, K.M. (2014). Salicylic acid and nitric oxide alleviate osmotic stress in wheat (Triticum aestivum L.) seedlings. Journal of Plant Interactions, 9, 683-688. Alexieva, V., Sergiev, I., Mapelli, S.,Karanov, E. (2001). The effect of drought and ultraviolet radiation on growth and stress markers in pea and wheat. Plant, Cell and Environment, 24, 1337-1344. Alexieva, V., Ivanov, S., Sergiev, I., Karanov, E. (2003). Interaction between stresses. Bulgarian Journal of Plant Physiology, Special Issue, 1-17. An, L., Feng, H., Tang, X., Wang, X. (2000). Changes of microsomal membrane properties in spring wheat leaves (Triticum aestivum L.) exposed to enhanced ultraviolet-B radiation. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 57, 60–65. Anfoka, G.H. (2000). Benzo-(1,2,3)-thiadiazole-7-carbothioic acid S-methyl ester induces systemic resistance in tomato (Lycopersicon esculentum. Mill cv. Vollendung) to Cucumber mosaic virus. Crop Protection, 19, 401-405. Anjana, G., Kini, K.R., Shetty, H.S., Prakash, H.S. (2007). Differential expression of sunflower peroxidase isoforms and transcripts during necrotrophic interaction with Alternaria helianthi. Russian Journal of Plant Physiology, 54, 513–517.
113
Anjum, S.A., Farooq, M., Xie, X.Y., Liu, X.J., Ijaz, M.F. (2012). Antioxidant defense system and proline accumulation enables hot pepper to perform better under drought. Scientia Horticulturae, 140, 66–73. Apel, K., Hirt, H. (2004). REACTIVE OXYGEN SPECIES: Metabolism, oxidative stress, and signal transduction. Annual Review of Plant Biology, 55, 373-399. Arora, A., Byrem, T.M., Nair, M.G., Strasburg, G.M. (2000). Modulation of liposomal membrane fluidity by flavonoids and isoflavonoids. Archives of Biochemistry and Biophysics, 373, 102–109. Asada, K. (2006). Production and scavenging of reactive oxygen species in chloroplasts and their functions. Plant Physiology, 141, 391–396. Ashraf, M., Foolad, M.R. (2007). Roles of glycine betaine and proline in improving plant abiotic stress resistance. Environmental and Experimental Botany, 59, 206-216. Ashry, N.A., Mohamed, H.I. (2011). Impact of secondary metabolites and related enzymes in flax resistance and or susceptibility to powdery mildew. World Journal of Agricultural Sciences, 7, 78-85. Asthir, B., Koundal, A., Bains, N. S. (2009). Kinetic and thermodynamic behaviour of wallbound peroxidase from wheat leaves infected with stripe rust. Plant Growth Regulation, 59, 117–124. Asthir, B., Koundal, A., Bains, N.S., Mann, S.K. (2010). Stimulation of antioxidative enzymes and polyamines during stripe rust disease of wheat. Biologia Plantarum, 54, 329–333. Baga, M., Chibbar, R.N., Kartha, K.K. (1995). Molecular cloning and expression analysis of peroxidase genes from wheat. Plant Molecular Biology, 29, 647–662. Bakirdere, S.,Yaman, M. (2008). Determination of lead, cadmium and copper in roadside soil and plants in Elazig, Turkey. Environmental Monitoring and Assessment, 136, 401– 410. Ball, L., Accotto, G.P., Bechtold, U., Creissen, G., Funck, D., Jimenez, A., Kular, B., Leyland, N., Mejia-Carranza, J., Reynolds, H., Karpinski, S., Mullineaux, P.M. (2004). Evidence for a direct link between glutathione biosynthesis and stress defense gene expression in Arabidopsis. The Plant Cell, 16, 2448–246. Bandurska, H., Cie´slak, M. (2013). The interactive effect of water deficit and UV-B radiation on salicylic acid accumulation in barley roots and leaves. Environmental and Experimental Botany, 94, 9– 18.
114
Bandurska, H., Stroinski, A. (2005). The effect of salicylic acid on barley response to water deficit. Acta Physiologiae Plantarum, 27, 379-386. Barnabás, B., Jäger, K., Fehér, A. (2008). The effect of drought and heat stress on reproductive processes in cereals. Plant, Cell and Environment, 31, 11–38. Bartsch, M., Gobbato, E., Bednarek, P., Debey, S., Schultze, J.L., Bautor, J., Parker, J.E. (2006). Salicylic acid–independent ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY1 signaling in Arabidopsis immunity and cell death is regulated by the monooxygenase FMO1 and the nudix hydrolase NUDT7. The Plant Cell, 18, 1038-1051. Bates, L.S., Waldren, R.P.,Teare, I.D. (1973). Rapid determination of free proline for waterstress studies. Plant and Soil, 39, 205–207. Beaudette, P.C., Chlup, M., Yee, J., Emery, R.J.N. (2007). Relationships of root conductivity and aquaporin gene expression in Pisum sativum: diurnal patterns and the response to HgCl2 and ABA. Journal of Experimental Botany, 58, 1291–1300. Beckers, G.M, Spoel, S.H. (2006). Fine-tuning plant defense signaling: salicylate versus jasmonate. Plant Biology, 8, 1-10. Belkadhi, A., De Haro, A., Soengas, P., Obregon, S., Cartea, M.E., Chaibi, W., Djebali, W. (2014). Salicylic acid increases tolerance to oxidative stress induced by hydrogen peroxide accumulation in leaves of cadmium-exposed flax (Linum usitatissimum L.). Journal of Plant Interactions, 9, 647–654. Benavides, M.P., Gallego, S.M., Tomaro, M.L. (2005). Cadmium toxicity in plants. Brazilian Journal of Plant Physiology, 17, 21-34. Bencze, S., Bamberger, Z., Janda, T., Balla, K., Bedő, Z., Veisz, O. (2011). Drought tolerance in cereals in terms of water retention, photosynthesis and antioxidant enzyme activities. Central European Journal of Biology, 6, 376–387. Bieza, K., Lois, R. (2001). An Arabidopsis mutant tolerant to lethal ultraviolet-B levels shows constitutively elevated accumulation of flavonoids and other phenolics. Plant Physiology, 126, 1105–1115. Blokhina, O., Virolainen, E., Fagerstedt, K.V. (2003). Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress: a review. Annals of Botany, 91, 179-194. Bogdan, J., Zagdańska, B. (2006). Changes in the pool of soluble sugars induced by dehydration at the heterotrophic phase of growth of wheat seedlings. Plant Physiology and Biochemistry, 44, 787-794.
115
Borsani, O., Valpuesta, V., Botella, M.A. (2001). Evidence for a role of salicylic acid in the oxidative damage generated by NaCl and osmotic stress in Arabidopsis seedlings. Plant Physiology, 126, 1024-1030. Bowler, C., Van Camp, W., Van Montagu, M., Inzé, D., Asada, K. (1994). Superoxide dismutase in plants. Critical Reviews in Plant Sciences, 13, 199-218. Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72, 248–254. Çakirlar, H., Çiçek, N., Ekmekçi, Y. (2011). Is the induction of H2O2-detoxifying antioxidant enzyme activities sufficient to protect barley cultivars from oxidative stress by UV-B irradiation alone or pretreatment with high temperature and NaCl? Turkish Journal of Biology, 35, 59-68. Cameron, R.K., Paiva, N.L., Lamb, C.J., Dixon, R.A. (1999). Accumulation of salicylic acid and PR-1 gene transcripts in relation to the systemic acquired resistance (SAR) response induced by Pseudomonas syringae pv. tomato in Arabidopsis. Physiological and Molecular Plant Pathology, 55, 121–130. Çanakci, S., Karaboğa, Z. (2013). Some physiological and bichemical responses to cadmium in salicylic acid applied cucumber (Cucumis sativus L.) seedlings. Pakistan Journal of Botany, 45, 1963-1968. Carr, J.P., Murphy, A.M. (2002). Cadmium blocks viral invasion in plants. Nature Cell Biology, 4, E167 - E168. Catinot, J., Buchala, A., Abou-Mansour, E., Métraux, J.P. (2008). Salicylic acid production in response to biotic and abiotic stress depends on isochorismate in Nicotiana benthamiana. FEBS Letters, 582, 473–478. Caverzan, A., Passaia, G., Rosa, S.B., Ribeiro, C.W., Lazzarotto, F., Margis-Pinheiro, M. (2012). Plant responses to stresses: Role of ascorbate peroxidase in the antioxidant protection. Genetics and Molecular Biology, 35, 1011-1019. Chao, Y.Y, Chen, C.Y, Huang, W.D, Kao, C.H. (2010). Salicylic acid-mediated hydrogen peroxide accumulation and protection against Cd toxicity in rice leaves. Plant and Soil, 329, 327-337. Chaturvedi, R., Shah, J. (2007). Salicylic acid in plant disease resistance. In: Hayat, S., Ahmad, A. (eds.), Salicylic Acid: A Plant Hormone. Springer, Dordrecht, The Netherlands, pp. 335–370.
116
Chaves, M.M., Maroco, J.P., Pereira, J.S. (2003). Understanding plant response to drought: from genes to the whole plant. Functional Plant Biology, 30, 239-264. Chen, Z., Gallie, D.R. (2006). Dehydroascorbate reductase affects leaf growth, development, and function. Plant Physiology, 142, 775–787. Chen, Z., Zheng, Z., Huang, J., Lai, Z., Fan, B. (2009). Biosynthesis of salicylic acid in plants. Plant Signaling & Behavior, 4, 493-496. Chong, J., Pierrel, M.A., Atanassova, R., Werck-Reichhart, D., Fritig, B., Saindrenan, P. (2001). Free and conjugated benzoic acid in tobacco plants and cell cultures. Induced accumulation upon elicitation of defence responses and role as salicylic acid precursors. Plant Physiology, 125, 318-328. Choudhury, S., Panda, S.K. (2004). Role of salicylic acid in regulating cadmium induced oxidative stress in Oryza sativa L. roots. Bulgarian Journal of Plant Physiology, 30, 95–110. Clemens, S. (2006). Toxic metal accumulation, responses to exposure and mechanisms of tolerance in plants. Biochimie, 88, 1707–1719. Conrath, U. (2011). Molecular aspects of defence priming. Trends in Plant Science, 16, 524531. Conrath, U., Chen, Z., Ricigliano, J.R., Klessig, D.F. (1995). Two inducers of plant defense responses, 2,6-dichloroisonicotinic acid and salicylic acid, inhibit catalase activity in tobacco. Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS), 92, 7143-7147. Cornic, G. (2000). Drought stress inhibits photosynthesis by decreasing stomatal aperture, not by affecting ATP synthesis. Trends in Plant Science, 5, 187-188. Cosio, C., Martinoia, E., Keller, C. (2004). Hyperaccumulation of cadmium and zinc in Thlaspi caerulescens and Arabidopsis halleri at the leaf cellular level. Plant Physiology, 134, 716–725. Cowley, T., Walters, D.R. (2002). Polyamine metabolism in barley reacting hypersensitively to the powdery mildew fungus Blumeria graminis f. sp. hordei. Plant, Cell and Environment, 25, 461–468. Dalisay, R.F., Kuć, J.A. (1995). Persistence of reduced penetration by Colletotrichum lagenarium into cucumber leaves with induced systemic resistance and its relation to enhanced peroxidase and chitinase activities. Physiological and Molecular Plant Pathology, 47, 329–338. Das, P., Samantaray, S., Rout, G.R. (1997). Studies on cadmium toxicity in plants: a review. Environmental Pollution, 98, 29-36.
117
Deák, Cs., Jäger, K., Fábián, A., Nagy, V., Albert, Zs., Miskó, A., Barnabás, B., Papp, I. (2011). Investigation of physiological responses and leaf morphological traits of wheat genotypes with contrasting drought stress tolerance. Acta Biologica Szegediensis, 55, 69-71. De Gara, L., Locato, V., Dipierro, S., de Pinto, M.C. (2010). Redox homeostasis in plants. The challenge of living with endogenous oxygen production. Respiratory Physiology & Neurobiology, 173, S13–S19. De Gara, L., Paciolla, C., De Tullio, M.C., Motto, M., Arrigoni, O. (2000). Ascorbatedependent hydrogen peroxide detoxification and ascorbate regeneration during germination of a highly productive maize hybrid: evidence of an improved detoxification mechanism against reactive oxygen species. Physiologia Plantarum, 109, 7–13. Delaney, T., Uknes, S., Vernooij, B., Friedrich, L., Weymann, K., Negrotto, D., Gaffney, T., Gut-Rella, M., Kessmann, H., Ward, E., Ryals, J. (1994). A central role of salicylic acid in plant disease resistance. Science, 266, 1247-1250. Delpérée, C., Lutts, S. (2008). Growth inhibition occurs independently of cell mortality in tomato (Solanum lycopersicum) exposed to high cadmium concentrations. Journal of Integrative Plant Biology, 50, 300–310. Demiralay, M., Sağlam, A., Kadioğlu, A. (2013). Salicylic acid delays leaf rolling by inducing antioxidant enzymes and modulating osmoprotectant content in Ctenanthe setosa under osmotic stress. Turkish Journal of Biology, 37, 49-59. Dempsey, D.M. A., Vlot, A. C., Wildermuth, M. C., Klessig, D.F. (2011). Salicylic acid biosynthesis and metabolism. The Arabidopsis Book 9e0156. Published by the American Society of Plant Biologists. Despres, C., Chubak, C., Rochon, A., Clark, R., Bethune, T., Desveaux, D., Fobert, P.R. (2003). The Arabidopsis NPR1 disease resistance protein is a novel cofactor that confers redox regulation of DNA binding activity to the basic domain/leucine zipper transcription factor TGAI. The Plant Cell, 15, 2181-2191. Dixon, D.P., Skipsey, M., Edwards, R. (2010). Roles for glutathione transferases in plant secondary metabolism. Phytochemistry, 71, 338–350. Dong, X. (2004). NPR1, all things considered. Current Opinion in Plant Biology, 7, 547-552. Doulis, A.G., Debian, N., Kingston-Smith, A.H., Foyer, C.H. (1997). Differential localization of antioxidants in maize leaves. Plant Physiology, 114, 1031-1037.
118
Dražić, G., Mihailović, N., Lojić, M. (2006). Cadmium accumulation in Medicago sativa seedlings treated with salicylic acid. Biologia Plantarum, 50, 239-244. Du, L., Ali, G.S., Simons, K.A., Hou, J., Yang, T., Reddy, A.S.N., Poovaiah, B.W. (2009). Ca2+/calmodulin regulates salicylic-acid-mediated plant immunity. Nature Letters, 457, 1154-1158. Edwards, R., Dixon, D.P., Walbot, V. (2000). Plant glutathione S-transferases: enzymes with multiple functions in sickness and in health. Trends in Plant Science, 5, 193-198. Eltayeb, A.E., Kawano, N., Badawi, G.H., Kaminaka, H., Sanekata, T., Shibahara, T., Inanaga, S., Tanaka, K. (2007). Overexpression of monodehydroascorbate reductase in transgenic tobacco confers enhanced tolerance to ozone, salt and polyethylene glycol stresses. Planta, 225, 1255–1264. El-Zahaby, H.M., Gullner, G., Király, Z. (1995). Effects of powdery mildew infection of barley on the ascorbate-glutathione cycle and other antioxidants in different hostpathogen interactions. Phytopathology, 85, 1225-1230. Fan, H.F., Ding, L., Du, C.X., Wu, X. (2014). Effect of short-term water deficit stress on antioxidative systems in cucumber seedling roots. Botanical Studies, 55, 46. Fan, W., Dong, X. (2002). In vivo interaction between NPR1 and transcription factor TGA2 leads to salicylic acid-mediated gene activation in Arabidopsis. The Plant Cell, 14, 1377-89. Fariduddin, Q., Hayat, S., Ahmad, A. (2003). Salicylic acid influences net photosynthetic rate, carboxylation efficiency, nitrate reductase activity and seed yield in Brassica juncea. Photosynthetica, 41, 281-284. Flott, B.E., Moerschbacher, B.M., Reisener, H.J. (1989). Peroxidase isoenzyme patterns of resistant and susceptible wheat leaves following stem rust infection. New Phytologist, 111, 413–421. Foley, S., Navaratnam, S., McGarvey, D.J., Land, E.J., Truscott, G., Rice-Evans, C.A. (1999). Singlet oxygen quenching and the redox properties of hydroxycinnamic acids. Free Radical Biology and Medicine, 26, 1202-1208. Freeman, J.L., Garcia, D., Kim, D., Hopf, A., Salt, D.E. (2005). Constitutively elevated salicylic acid signals glutathione-mediated nickel tolerance in Thlaspi nickel hyperaccumulators. Plant Physiology, 137, 1082-1091. Gallego, S.M., Benavides, M.P., Tomaro, M.L. (1999). Effect of cadmium ions on antioxidant defense system in sunflower cotyledons. Biologia Plantarum, 42, 49–55.
119
Gao, S., Yan, R., Cao, M., Yang, W., Wang, S., Chen, F. (2008). Effects of copper on growth, antioxidant enzymes and phenylalanine ammonia-lyase activities in Jatropha curcas L. seedling. Plant, Soil and Environment, 54, 117-122. Gechev, T.S., Van Breusegem, F., Stone, J.M., Denev, I., Laloi, C. (2006). Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death. BioEssays, 28, 1091-1101. Gill, S.S., Khan, N.A., Tuteja, N. (2011). Differential cadmium stress tolerance in five indian mustard (Brassica juncea L.) cultivars. An evaluation of the role of antioxidant machinery. Plant Signaling & Behaviour, 6, 293-300. Gill, S.S., Tuteja, N. (2010a). Cadmium stress tolerance in crop plants Probing the role of sulphur. Plant Signaling & Behaviour, 6, 215-222. Gill, S.S., Tuteja, N. (2010b). Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry, 48, 909-930. Gomes-Junior, R.A., Moldes, C.A., Delite, F.S., Gratão, P.L., Mazzafera, P., Lea, P.J., Azevedo, R.A. (2006). Nickel elicits a fast antioxidant response in Coffea arabica cells. Plant Physiology and Biochemistry, 44, 420-429. Gratão, P.L., Polle, A., Lea, P.J., Azevedo, R.A. (2005). Making the life of heavy metalstressed plants a little easier. Functional Plant Biology, 32, 481-494. Griffey, C.A., Das, M.K., Stromberg, E.L. (1993). Effectiveness of adult-plant resistance in reducing grain yield loss to powdery mildew in winter wheat. Plant Disease, 77, 618– 622. Groppa, M.D., Rosales, E.P., Iannone, M.F., Benavides, M.P. (2008a). Nitric oxide polyamines and Cd-induced phytotoxicity in wheat roots. Phytochemistry, 69, 2609– 2615. Groppa, M.D., Tomaro, M.L., Benavides, M.P. (2001). Polyamines as protectors against cadmium or copper-induced oxidative damage in sunflower leaf discs. Plant Science, 161, 481–488. Groppa, M.D., Tomaro, M.L., Benavides, M.P. (2007). Polyamines and heavy metal stress: the antioxidant behavior of spermine in cadmium- and copper-treated wheat leaves. Biometals, 20, 185–195. Groppa, M.D., Zawoznik, M.S., Tomaro, M.L., Benavides, M.P. (2008b). Inhibition of root growth and polyamine metabolism in sunflower (Helianthus annuus L) seedlings under cadmium and copper stress. Biological Trace Element Research, 126, 246–256.
120
Gutiérrez-Coronado, M.A., Trejo-López, C., Larqué-Saavedra, A. (1998). Effects of salicylic acid on the growth of roots and shoots in soybean. Plant Physiology and Biochemistry, 36, 563–565. Gzyl, J., Rymer, K., Gwóźdź, E.A. (2009). Differential response of antioxidant enzymes to cadmium stress in tolerant and sensitive cell line of cucumber (Cucumis sativus L.) Acta Biochimica Polonica, 56, 723-727. Häder, D.P., Kumar, H.D., Smith, R.C., Worrest, R.C. (2007). Effects of solar UV radiation on aquatic ecosystems and interactions with climate change. Photochemical and Photobiological Sciences, 6, 267–285. Harrach, B.D., Fodor, J., Pogány, M., Preuss, J., Barna, B. (2008). Antioxidant, ethylene and membrane leakage responses to powdery mildew infection of near-isogenic barley lines with various types of resistance. European Journal of Plant Pathology, 121, 21– 33. Hayat, Q., Hayat, S., Irfan, M., Ahmad, A. (2010). Effect of exogenous salicylic acid under changing environment: A review. Environmental and Experimental Botany, 68, 14– 25. Hayat, S., Fariduddin, Q., Ali, B., Ahmad, A. (2005). Effect of salicylic acid on growth and enzyme activities of wheat seedlings. Acta Agronomica Hungarica, 53, 433–437. Hayat, S., Hasan, S.A., Fariduddin, Q., Ahmad, A. (2008). Growth of tomato (Lycopersicon esculentum) in response to salicylic acid under water stress. Journal of Plant Interactions, 3, 297–304. He, L., Jia, X., Gao, Z., Li, R. (2011). Genotype-dependent responses of wheat (Triticum aestivum L.) seedlings to drought, UV-B radiation and their combined stresses. African Journal of Biotechnology, 10, 4046-4056. Hegedűs, A., Erdei, S., Horváth, G. (2001). Comparative studies of H2O2 detoxifying enzymes in green and greening barley seedlings under cadmium stress. Plant Science, 160, 1085-1093. Herrmann, K.M., Weaver, L.M. (1999). The Shikimate pathway. Plant Physiology, 50, 473503. Hideg, É., Jansen, M.A.K., Strid, A. (2013). UV-B exposure, ROS, and stress: inseparable companions or loosely linked associates? Trends in Plant Science, 18, 107-115. Hiraga, S., Ito, H., Yamakawa, H., Ohtsubo, N., Seo, S., Mitsuhara, I., Matsui, H., Honma, M., Ohashi, Y. (2000). An HR-induced tobacco peroxidase gene is responsive to
121
spermine, but not to salicylate, methyl jasmonate, and ethephon. Molecular PlantMicrobe Interactions, 13, 210–216. Hollósy, F. (2002). Effects of ultraviolet radiation on plant cells. Micron, 33, 179-197. Hoque, M.A., Banu, M.N.A., Okuma, E., Amako, K., Nakamura, Y., Shimoishi, Y., Murata, Y. (2007). Exogenous proline and glycinebetaine increase NaCl-induced ascorbate– glutathione cycle enzyme activities, and proline improves salt tolerance more than glycinebetaine in tobacco Bright Yellow-2 suspension-cultured cells. Journal of Plant Physiology, 164, 1457-1468. Horváth, E., Szalai, G., Janda, T. (2007). Induction of abiotic stress tolerance by salicylic acid signalling. Journal of Plant Growth Regulation, 26, 290-300. Huang, G.Y., Wang, Y.S., Sun, C.C., Dong, J.D., Sun, Z.X. (2010). The effect of multiple heavy metals on ascorbate, glutathione and related enzymes in two mangrove plant seedlings (Kandelia candel and Bruguiera gymnorrhiza). Oceanological and Hydrobiological Studies, 39, 11-25. Huang, J., Cardoza, Y.J., Schmelz, E.A., Raina, R., Engelberth, J., Tumlinson, J.H. (2003). Differential volatile emissions and salicylic acid levels from tobacco plants in response to different strains of Pseudomonas syringae. Planta, 217, 767-775. Huang, Z., Yeakley, J., Garcia, E.W., Holdridge, J.D., Fan, J.B., Whitham, S. (2005). Salicylic acid-dependent expression of host genes in compatible Arabidopsis-virus interactions. Plant Physiology, 137, 1147-1159. Hückelhoven, R., Fodor, J., Preis, C., Kogel, K.H. (1999). Hypersensitive cell death and papilla formation in barley attacked by the powdery mildew fungus are associated with hydrogen peroxide but not with salicylic acid accumulation. Plant Physiology, 119, 1251–1260. Hura, T., Hura, K., Grzesiak, S. (2009). Physiological and biochemical parameters for identification of QTLs controlling the winter triticale drought tolerance at the seedling stage. Plant Physiology and Biochemistry, 47, 210-214. Hussain, K., Nawaz, K., Majeed, A., Khan, A., Lin, F., Ghani, A., Raza, G., Afghan, S., Ziaul-Hussnain, S., Ali, K., Shahazad, A. (2010). Alleviation of salinity effects by exogenous applications of salicylic acid in pearl millet (Pennisetum glaucum (L.) R. Br.) seedlings. African Journal of Biotechnology, 9, 8602–8607. Hussain, S.S., Ali, M., Ahmad, M., Siddique, K.H.M. (2011). Polyamines: natural and engineered abiotic and biotic stress tolerance in plants. Biotechnology Advances, 29, 300–311.
122
Hussein, M.M., Balbaa, L.K., Gaballah, M.S. (2007). Salicylic acid and salinity effects on growth of maize plants. Research Journal of Agriculture and Biological Sciences, 3, 321–328. Ivanov, S., Miteva, L., Alexieva, V., Karjin, H., Karanov, E. (2005). Alterations in some oxidative parameters in susceptible and resistant wheat plants infected with Puccinia recondita f.sp tritici. Journal of Plant Physiology, 162, 275–279. Janda, T., Szalai, G., Kissimon, J., Páldi, E., Marton, C., Szigeti, Z. (1994). Role of irradiance in the chilling injury in maize (Zea mays L.) plants. Planta, 208, 175–180. Janda, T., Szalai, G., Tari, I., Páldi, E. (1999). Hydroponic treatment with salicylic acid decreases the effects of chilling injury in maize (Zea mays L.) plants. Planta, 208, 175180. Jansen, M.A.K., Gaba, V., Greenberg, B.M. (1998). Higher plants and UV-B radiation: balancing damage, repair and acclimation. Trends in Plant Science, 3, 131–135. Jansik, I., Preisokowski, S., Kneifel, H. (2005). Ozone has dramatic effects on the regulation of the prechorismate pathway in tobacco (Nicotiana tabacum L. cv. Bel W3). Planta, 223, 20-27. Johnson, C., Boden, E., Arias, J. (2003). Salicylic acid and NPR1 induce the recruitment of trans-activating TGA factors to a defense gene promoter in Arabidopsis. The Plant Cell, 15, 1846-1958. Johnson, L.B., Lee, R.F. (1978). Peroxidase changes in wheat isolines with compatible and incompatible leaf rust infections. Physiological Plant Pathology, 13, 173–181. Jones, J.D.G., Dangl, J.F. (2006). The plant immune system. Nature, 444, 323-329. Jóźwiak-Żurek, A., Kozłowska, M., Nuc, K. (2011). Phenylalanine ammonia lyase under combined effects of enhanced UV-B radiation and allelopathy stress. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica, 53, 73-78. Jung, H.W., Tschaplinski, T.J., Wang, L., Glazebrook, J., Greenberg, J.T. (2009). Priming is systemic plant immunity. Science, 324, 89–91. Kaiserli, E., Jenkins, G.I. (2007). UV-B promotes rapid nuclear translocation of the Arabidopsis UV-B–specific signaling component UVR8 and activates its function in the nucleus. The Plant Cell, 19, 2662–2673. Kakani, V.G., Reddy, K.R., Zhao, D., Mohammed, A.R. (2003a). Effects of ultraviolet-B radiation on cotton (Gossypium hirsutum L.) morphology and anatomy. Annals of Botany, 91, 817-826.
123
Kakani, V.G., Reddy, K.R., Zhao, D., Sailaja, K. (2003b). Field crop responses to ultravioletB radiation: a review. Agriculture and Forest Meteorology, 120, 191–218. Kameli, A., Lösel, D.M. (1993). Carbohydrates and water status in wheat plants under water stress. New Phytologist, 125, 609-614. Karuppanapandian, T., Manoharan, K. (2008). Uptake and translocation of tri- and hexavalent chromium and their effects on black gram (Vigna mungo L. Hepper cv. Co4) roots. Journal of Plant Biology, 51, 192–201. Karuppanapandian, T., Moon, J.C., Kim, C., Manoharan, K., Kim, W. (2011). Reactive oxygen species in plants: their generation, signal transduction, and scavenging mechanisms. Australian Journal of Crop Science, 5, 709-725. Kaur, N., Gupta, A.K. (2005). Signal transduction pathways under abiotic stresses in plants. Current Science, 88, 1771-1780. Khan, S., Khan, M.A., Rehman, S. (2011). Lead and cadmium contamination of different roadside soils and plants in Peshawar City, Pakistan. Pedosphere, 21, 351–357. Khan, W., Prithviraj, B., Smith, D.L. (2003). Photosynthetic responses of corn and soybean to foliar application of salicylates. Journal of Plant Physiology, 160, 485–492. Khodary, S.E.A. (2004). Effect of salicylic acid on the growth, photosynthesis and carbohydrate metabolism in salt stressed maize plants. International Journal of Agriculture and Biology, 6, 5-8. Kinkema, M., Fan, W., Dong, X. (2000). Nuclear localization of NPR1 is required for activation of PR gene expression. The Plant Cell, 12, 2339-2350. Knutson, R.M. (1974). Heat production and temperature regulation in eastern skunk cabbage. Science, 186, 746-747. Kocsy, G., von Ballmoos, P., Rüegsegger, A., Szalai, G., Galiba, G., Brunold, C. (2001). Increasing the glutathione content in a chilling-sensitive maize genotype using safeners increased protection against chilling-induced injury. Plant Physiology, 127, 1147-1156. Kocsy, G., Kobrehel, K., Szalai, G., Duviau, M.P., Buzás, Z., Galiba, G. (2004). Abiotic stress-induced changes in glutathione and thioredoxin h levels in maize. Environmental and Experimental Botany, 52, 101-112. Kocsy, G., Pál, M., Soltész, A., Szalai, G., Boldizsár, Á., Kovács, V., Janda, T. (2011). Low temperature and oxidative stress in cereals. Acta Agronomica Hungarica, 59, 153-173. Kovács V., Gondor O.K., Majláth I., Szalai G., Janda T., Pál, M. (2014c). The effects of drought on plant defence system in wheat genotypes with different salicylic acid
124
content. In: Kőszegi Izabella (szerk.) Advances in Plant Breeding & Biotechnology Techniques: Book of Abstracts. 96 p. Mosonmagyaróvár, Magyarország, 2014.04.282014.04.29. Martonvásár: Pannonian Plant Biotechnology Association, 2014. pp. 4950. (Pannonian Plant Biotechnology Association Conference for PhD Students in Plant Biology) ISBN:978-963-89129-5-4. Kovács V., Gondor O.K., Szalai G., Majláth I., Janda T., Pál, M. (2014a). UV-B radiation modifies the acclimation processes to drought or cadmium in wheat. Environmental and Experimental Botany, 100, 122– 131. Kovács, V., Gondor, O.K., Szalai, G., Majláth, I., Janda, T., Pál, M. (2014b). Synthesis and role of salicylic acid in wheat varieties with different levels of cadmium tolerance. Journal of Hazardous Materials, 280, 12-19. Kovács, V., Vida, Gy., Szalai, G., Janda, T., Pál, M. (2012). Relationship between biotic stress tolerance and protective compounds in wheat genotypes. Acta Agronomica Hungarica, 60, 131–141. Köhler, B., Hills, A., Blatt, M.R. (2003). Control of guard cell ion channels by hydrogen peroxide and abscisic acid indicates their action through alternate signaling pathways. Plant Physiology, 131, 385-388. Krantev, A., Yordanova, R., Janda, T., Szalai, G., Popova, L. (2008). Treatment with salicylic acid decreases the effect of cadmium on photosynthesis in maize plants. Journal of Plant Physiology, 165, 920-931. Kristensen, B.K., Brandt, J., Bojsen, K., Thordal-Christensen, H., Kerby, K.B., Collinge, D.B., Mikkelsen, J.D., Rasmussen, S.K. (1997). Expression of a defence-related intercellular barley peroxidase in transgenic tobacco. Plant Science, 122, 173–182. Krivosheeva, A., Tao, D.L., Ottander, C., Wingsle, G., Dube, S.L., Öquist, G. (1996). Cold acclimation and photoinhibition of photosynthesis in Scots pine. Planta, 200, 296–305. Kumar, D., Klessig, D.F. (2003). High affinity salicylic acid-binding protein 2 is required for plant innate immunity and has salicylic acid-stimulated lipase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS), 100, 16101-16106. Kuznetsov, V.V., Shevyakova, N.I. (2007). Polyamines and stress tolerance of plants. Plant Stress, 1, 50–71. Landberg, T., Greger, M. (2002). Differences in oxidative stress in heavy metal resistant and sensitive clones of Salix viminalis. Journal of Plant Physiology, 159, 69-75. Larcher, W. (1987). Stress bei Pflanzen. Naturwissenschaften, 74, 158-167.
125
Larkindale, J., Huang, B. (2004). Thermotolerance and antioxidant systems in Agrostis stolonifera: involvement of salicylic acid, abscisic acid, calcium, hydrogen peroxide, and ethylene. Journal of Plant Physiology, 161, 405–413. Larkindale, J., Knight, M.R. (2002). Protection against heat stress-induced oxidative damage in Arabidopsis involves calcium, abscisic acid, ethylene, and salicylic acid. Plant Physiology, 128, 682-695. Leath, S., Bowen, K.L. (1989). Effects of powdery mildew, triadimenol seed treatment, and triadimefon foliar sprays on yield of winter wheat in North California. Phytopathology, 79, 152-155. Lee, S.H., Ahsan, N., Lee, K.W., Kim, D.H., Lee, D.G., Kwak, S.S., Kwon, S.Y., Kim, T.H., Lee, B.H. (2007). Simultaneous overexpression of both CuZn superoxide dismutase and ascorbate peroxidase in transgenic tall fescue plants confers increased tolerance to a wide range of abiotic stresses. Journal of Plant Physiology, 164, 1626-1638. Li, D., Luo, Z., Mou, W., Wang, Y., Ying, T., and Mao, L. (2014). ABA and UV-C effects on quality, antioxidant capacity and anthocyanin contents of strawberry fruit (Fragaria ananassa Duch.). Postharvest Biology and Technology, 90, 56–62. Li, X., Schuler, M.A., Berenbaum, M.R. (2002). Jasmonate and salicylate induce expression of herbivore cytochrome P450 genes. Nature, 419, 712-715. Lian, B., Zhou, X., Miransari, M., Smith, D.L. (2000). Effects of salicylic acid on the development and root nodulation of soybean seedlings. Journal of Agronomy and Crop Science, 185, 187–192. Lin, R., Wang, X., Luo, Y., Du, W., Guo, H., Yin, D. (2007). Effects of soil cadmium on growth, oxidative stress and antioxidant system in wheat seedlings (Triticum aestivum L.). Chemosphere, 69, 89-98. Liu, J.H., Kitashiba, H., Wang, J., Ban, Y., Moriguchi, T. (2007). Polyamines and their ability to provide environmental stress tolerance to plants. Plant Biotechnology, 24, 117–126. Liu, J.X., Liao, D.Q., Oane, R., Estenor, L., Yang, X.E., Li, Z.C., Bennett, J. (2006). Genetic variation in the sensitivity of anther dehiscence to drought stress in rice. Field Crops Research, 97, 87-100. Locato, V., Cimini, S., De Gara, L. (2013). Strategies to increase vitamin C in plants: from plant defense perspective to food biofortification. Frontiers in Plant Science, 4, 152. doi: 10.3389/fpls.2013.00152 Lodge, J.K. (2008). Molecular actions of ascorbic acid. Current Topics in Nutraceutical Research, 6, 1–13.
126
Luo, M.H., Yuan, S., Chen, Y.E., Liu, W.J., Du, J.B., Lei, T., Wang, M.B., Lin, H.H. (2009). Effects of salicylic acid on the photosystem 2 of barley seedlings under osmotic stress. Biologia Plantarum, 53, 663–669. Magyarosy, A.C., Schürmann, P., Buchanan, B.B. (1976). Effect of powdery mildew infection on photosynthesis by leaves and chloroplasts of sugar beets. Plant Physiology, 57, 486-489. Majer, P., Hideg, É. (2012). Existing antioxidant levels are more important in acclimation to supplemental UV-B irradiation than inducible ones: Studies with high light pretreated tobacco leaves. Emirates Journal of Food and Agriculture, 24, 598-606. Manickavelu, A., Kawaura, K., Oishi, K., Shin-I, T., Kohara, Y., Yahiaoui. N., Keller, B., Suzuki, A., Yano, K., Ogihara, Y. (2010). Comparative gene expression analysis of susceptible and resistant near-isogenic lines in common wheat infected by Puccinia triticina. DNA Research, 17, 211–222. Mannervik, B., Guthenberg, C. (1981). Glutathione transferase (Human placenta). Methods in Enzymology, 77, 231-235. Mao, P., Duan, M., Wei, C., Li, Y. (2007). WRKY62 transcription factor acts downstream of cytosolic NPR1 and negatively regulates jasmonate-responsive gene expression. Plant and Cell Physiology, 48, 833-842. Manthe, B., Schulz, M., Schnabl, H. (1992). Effects of salicylic acid on growth and stomatal movements of Vicia faba L.: Evidence for salicylic acid metabolization. Journal of Chemical Ecology, 18, 1525-1539. Marcińska, I., Czyczyło-Mysza, I., Skrzypek, E., Grzesiak, M.T., Janowiak, F., Filek, M., Dziurkaemail, M., Dziurkaemail, K., Waligórskiemail, P., Juzońemail, K., Cyganek, K. Grzesiak, S. (2013). Alleviation of osmotic stress effects by exogenous application of salicylic or abscisic acid on wheat seedlings. International Journal of Molecular Sciences, 14, 13171-13193. Markovska, Y.K., Gorinova, N.I., Nedkovska, M.P., Miteva, K.M. (2009). Cadmium-induced oxidative damage and antioxidant responses in Brassica juncea plants. Biologia Plantarum, 53, 151-154. Márquez-García, B., Fernández-Recamales, M.Á., Córdoba, F. (2012). Effects of cadmium on phenolic composition and antioxidant activities of Erica andevalensis. Journal of Botany, 2012, 1-6. Masoumi, H., Masoumi, M., Darvish, F., Daneshian, J., Nourmohammadi, G., Habibi, D. (2010). Change in several antioxidant enzymes activity and seed yield by water deficit
127
stress in soybean (Glycine max L.) cultivars. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca, 38, 86-94. Mateo, A., Funck, D., Muhlenbock, P., Kular, B., Mullineaux, P.M., Karpinski, S. (2006). Controlled levels of salicylic acid are required for optimal photosynthesis and redox homeostasis. Journal of Experimental Botany, 57, 1795-1807. Meguro, A., Sato, Y. (2014). Salicylic acid antagonizes abscisic acid inhibition of shoot growth and cell cycle progression in rice. Scientific Reports, 4, 1-11. Meinhard, M., Rodriguez, P.L., Grill, E. (2002). The sensitivity of ABI2 to hydrogen peroxide links the abscisic acid-response regulator to redox signalling. Planta, 214, 775–782. Melgar, J.C., Abney, T.S., Vierling, R.A. (2006). Peroxidase activity in soybeans following inoculation with Phytophthora sojae. Mycopathologia, 161: 37–42. Meng, L., Xiuying, K., Naxin, H., Ronghua, Z., Jizeng, J. (2002). Gene expression profiling related to powdery mildew resistance in wheat with the method of suppression subtractive hybridization. Chinese Science Bulletin, 47, 1990–1994. Métraux, J.P. (2002). Recent breakthroughs in the study of salicylic acid biosynthesis. Trends in Plant Science, 7, 332-334. Metwally, A., Finkemeier, I., Georgi, M., Dietz, K.J. (2003). Salicylic acid alleviates the cadmium toxicity in barley seedlings. Plant Physiology, 132, 272-281. Meuwly, P., Métraux, J.P. (1993). Ortho-anisic acid as internal standard for the simultaneous quantitation of salicylic acid and its putative biosynthetic precursors in cucumber leaves. Analytical Biochemistry, 214, 500–505. Mika, A., Boenisch, M.J., Hopff, D., Lüthje, S. (2010). Membrane-bound guaiacol peroxidases from maize (Zea mays L.) roots are regulated by methyl jasmonate, salicylic acid, and pathogen elicitors. Journal of Experimental Botany, 61, 831–841. Mika, A., Lüthje, S. (2003). Properties of guaiacol peroxidase activities isolated from corn root plasma membranes. Plant Physiology, 132, 1489–1498. Mishra, S., Agrawal, S.B. (2006). Interactive effects between supplemental ultraviolet-B radiation and heavy metals on the growth and biochemical characteristics of Spinacia oleracia L. Brazilian Journal of Plant Physiology, 18, 307-314. Misra, N., Saxena, P. (2009). Effect of salicylic acid on proline metabolism in lentil grown under salinity stress. Plant Science, 177, 181-189. Mittler, R. (2002). Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends in Plant Science, 7, 405-410.
128
Mittova, V., Volokita, M., Guy, M., Tal, M. (2000). Activities of SOD and the ascorbateglutathione cycle enzymes in subcellular compartments in leaves and roots of the cultivated tomato and its wild salt-tolerant relative Lycopersicon pennellii. Physiologia Plantarum, 110, 42-51. Miura, K., Okamoto, H., Okuma, E., Shiba, H., Kamada, H., Hasegawa, P. M., Murata, Y. (2013). SIZ1 deficiency causes reduced stomatal aperture and enhanced drought tolerance via controlling salicylic acid-induced accumulation of reactive oxygen species in Arabidopsis. The Plant Journal, 73, 91-104. Mohammadkhani, N., Heidari, R. (2008). Drought-induced accumulation of soluble sugars and proline in two maize varieties. World Applied Sciences Journal, 3, 448-453. Moharekar, S.T., Lokhande, S.D., Hara, T., Tanaka, R., Tanaka, A., Chavan, P.D. (2003). Effect of salicylic acid on chlorophyll and carotenoid contents of wheat and moong seedlings. Photosynthetica, 41, 315–317. Moldenhauer, J., Moerschbacher, B.M., Van der Westhuizen, A.J. (2006). Histological investigation of stripe rust (Puccinia striiformis f.sp. tritici) development in resistant and susceptible wheat cultivars. Plant Pathology, 55, 469–474. Mottram, P. (2003). Past, present and future drug treatment for rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus. Immunology and Cell Biology 81, 350-353. Mou, Z., Fan, W., Dong, X. (2003). Inducers of plant systemic acquired resistance regulate NPR1 function through redox changes. Cell, 113, 935–944. Najafian, S., Khoshkhui, M., Tavallali, V. (2009a). Effect of salicylic acid and salinity in rosemary (Rosmarinus officinalis L.): Investigation on changes in gas Exchange, water relations, and membrane stabilization. Advances in Environmental Biology, 3, 322328. Najafian, S., Khoshkhui, M., Tavallali, V., Saharkhiz, M.J. (2009b). Effect of salicylic acid and salinity in thyme (Thymus vulgaris L.): Investigation on changes in gas exchange, water relations, and membrane stabilization and biomass accumulation. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 3, 2620–2626. Naszradi, T., Badacsonyi, A., Németh, N., Tuba, Z., Batič, F. (2004). Zinc, lead and cadmium content in meadow plants and mosses along the M3 motorway (Hungary). Journal of Atmospheric Chemistry, 49, 593–603. Németh, M., Janda, T., Horváth, E., Páldi, E., Szalai, G. (2002). Exogenous salicylic acid increases polyamine content but may decrease drought tolerance in maize. Plant Science, 162, 569–574.
129
Niedzwiedz-Siegien, I., Bogatek-Leszczynska, R., Cômea, D., Corbineau, F. (2004). Effects of drying rate on dehydration sensitivity of excised wheat seedling shoots as related to sucrose metabolism and antioxidant enzyme activities. Plant Science, 167, 879-888. Noctor, G., Foyer, C.H. (1998). Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under control. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 49, 249– 279. Nordberg, G. (2003). Cadmium and human health: A perspective based on recent studies in China. Journal of Trace Elements in Experimental Medicine, 16, 307–319. Nugroho, L.H., Verberne, M.C., Verpoorte, R. (2001). Salicylic acid produced by isochorismate synthase and isochorismate pyruvate lyase in various parts of constitutive salicylic acid producing tobacco plants. Plant Science, 161, 911-915. Ogawa, D., Nakajima, N., Sano, T., Tamaoki, M., Aono, M., Kubo, A., Kanna, M., Ioki, M., Kamada, H., Saji, H. (2005). Salicylic acid accumulation under O3 exposure is regulated by ethylene in tobacco plants. Plant and Cell Physiology, 46, 1062-1072. Ogawa, D., Nakajima, N., Seo, S., Mitsuhara, I., Kamada, H., Ohashi, Y. (2006). The phenylalanine pathway is the main route of salicylic acid biosynthesis in Tobacco mosaic virus-infected tobacco leaves. Plant Biotechnology, 23, 395-398. O'Toole, J.C., Cruz, R.T. (1980). Response of leaf water potential, stomatal resistance, and leaf rolling to water stress. Plant Physiology, 65, 428-432. Pál, M., Horváth, E., Janda, T., Páldi, E., Szalai, G. (2005), Cadmium stimulates the accumulation of salicylic acid and its putative precursors in maize (Zea mays L.) plants. Physiologia Plantarum, 125, 356-364. Pál, M., Horváth, E., Janda, T., Páldi, E., Szalai, G. (2006a). Physiological changes and defence mechanisms induced by cadmium stress in maize. Journal of Plant Nutrition and Soil Science, 169, 239-246. Pál, M., Horváth, E., Janda, T., Páldi E., Szalai, G. (2006b). The effect of cadmium stress on phytochelatin,
thiol
and
polyamine
content
in
maize.
Cereal
Research
Communications, 34, 65-68. Pál, M., Janda, T., Szalai, G. (2011). Abscisic acid may alter the salicylic acid-related abiotic stress response in maize. Journal of Agronomy and Crop Science, 197, 368-377. Pál, M., Kovács, V., Szalai, G., Soós, V., Ma, X., Liu, H., Mei, H., Janda, T. (2014). Salicylic acid and abiotic stress responses in rice. Journal of Agronomy and Crop Science, 200, 1–11.
130
Pál, M., Kovács, V., Vida, Gy., Szalai, G., Janda, T. (2013a). Changes induced by powdery mildew in the salicylic acid and polyamine contents and the antioxidant enzyme activities of wheat lines. European Journal of Plant Pathology, 135, 35-47. Pál, M., Szalai, G., Horváth, E., Janda, T., Páldi, E. (2002). Effect of salicylic acid during heavy metal stress. Acta Biologica Szegediensis, 46, 119-120. Pál, M., Szalai, G., Kovács, V., Gondor, O.K., Janda, T. (2013b). Salicylic Acid-Mediated Abiotic Stress Tolerance. In: Shamsul Hayat, Aqil Ahmad, Mohammed Nasser Alyemeni (szerk.) Salicylic Acid Plant Growth and Development. Netherlands: Springer Dordrecht Heidelberg, 183-247. (ISBN:978-94-007-6427-9) Pandey, K.B., Rizvi, S.I. (2009). Plant polyphenols as dietary antioxidants in human health and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2, 270-278. Paradiso, A., Berardino, R., de Pinto, M.C. (2008). Increase in ascorbate–glutathione metabolism as local and precocious systemic responses induced by cadmium in durum wheat plants. Plant Cell Physiology, 49, 362-374. Parent, B., Hachez, C., Redondo, E., Simonneau, T., Chaumont, F., Tardieu, F. (2009). Drought and abscisic acid effects on aquaporin content translate into changes in hydraulic conductivity and leaf growth rate: A trans-scale approach. Plant Physiology, 149, 2000-2012. Park, S.W., Kaimoyo, E., Kumar, D., Mosher, S., Klessig, D. (2007). Methyl salicylate is critical mobile signal for plant systemic acquired resistance. Science, 318, 113-16. Pasqualini, S., Della, T.G., Ferranti, F., Ederli, L., Piccioni, C., Reale, L., Antonielli, M. (2002). Salicylic acid modulates ozone-induced hypersensitive cell death in tobacco plants. Physiologia Plantarum, 115, 204-212. Passardi, F., Cosio, C., Penel, C., Dunand, C. (2005). Peroxidases have more functions than a Swiss army knife. Plant Cell Reports, 24, 255–265. Passardi, F., Longet, D., Penel, C., Dunand, C. (2004). The class III peroxidase multigenic family in rice and its evolution in land plants. Phytochemistry, 65, 1879–1893. Pawlak-Sprada, S., Arasimowicz-Jelonek, M., Podgórska, M., Deckert, J. (2011). Activation of phenylpropanoid pathway in legume plants exposed to heavy-metals. Part I. Effect of cadmium and lead on phenylalanine ammonia-lyase gene expression, enzyme activity and lignin content. Acta Biochimica Polonica, 58, 211–216. Pei, Z.M., Murata, Y., Benning, G., Thomine, S., Klüsener, B., Allen, G.J., Grill, E., Schroeder, J.I. (2000). Calcium channels activated by hydrogen peroxide mediate abscisic acid signalling in guard cells. Nature, 406, 731-734.
131
Pirbalouti, A.G., Samani, M.R., Hashemi, M., Zeinali, H. (2014). Salicylic acid affects growth, essential oil and chemical compositions of thyme (Thymus daenensis Celak.) under reduced irrigation. Plant Growth Regulation, 72, 289-301. Poór, P., Gémes, K., Horváth, F., Szepesi, A., Simon, M.L., Tari, I. (2011). Salicylic acid treatment via the rooting medium interferes with stomatal response, CO2 fixation rate and carbohydrate metabolism in tomato, and decreases harmful effects of subsequent salt stress. Plant Biology, 13, 105–114. Popova, L.P., Maslenkova, L.T, Yordanova, R.Y. (2009). Exogenous treatment with salicylic acid attenuates cadmium toxicity in pea seedlings. Plant Physiology and Biochemistry, 47, 224-231. Pospišilová, J. (2003). Participation of phytohormones in the stomatal regulation of gas exchange during water stress. Biologia Plantarum, 46, 491–506. Pospišilová, J., Vágner, M., Malbeck, J., Trávníčková, A., Batková, P. (2005). Interactions between abscisic acid and cytokinins during water stress and subsequent rehydration. Biologia Plantarum, 49, 533-540. Pourtaghi, A., Darvish, F., Habibi, D., Nourmohammadi, G., Daneshian, J. (2011). Effect of irrigation water deficit on antioxidant activity and yield of some sunflower hybrids. Australian Journal of Crop Science, 5, 197-204. Prasad, S.M., Dwivedi, R., Zeeshan, M., Singh, R. (2004). UV-B and cadmium induced changes in pigments, photosynthetic electron transport activity, antioxidant levels and antioxidative enzyme activities of Riccia sp. Acta Physiologiae Plantarum, 26, 423430. Prochazkova, D., Sairam, R.K., Srivastava, G.C., Singh, D.V. (2001). Oxidative stress and antioxidant activity as the basis of senescence in maize leaves. Plant Science, 161, 765-771. Proietti, S., Bertini, L., Timperio, A.M., Zolla, L., Caporale, C., Caruso, C. (2013). Crosstalk between salicylic acid and jasmonate in Arabidopsis investigated by an integrated proteomic and transcriptomic approach. Molecular Biosystems, 9, 1169-1187. Prokopová, J., Mieslerová, B., Hlaváčková, V., Hlavinka, J., Lebeda, A., Nauš, J., Špundová, M. (2010). Changes in photosynthesis of Lycopersicon spp. plants induced by tomato powdery mildew infection in combination with heat shock pre-treatment. Physiological and Molecular Plant Pathology, 74, 205–213.
132
Rao, M., Paliyath, G., Ormrod, D.P., Murr, D.P., Watkins, C.B. (1997). lnfluence of salicylic acid on H2O2 production, oxidative stress, and H2O2-metabolizing enzymes, Salicylic acid-mediated oxidative damage requires H2O2. Plants Physiology, 115, 137-149. Randhir, R., Lin, Y.T., Shetty, K. (2004). Phenolics, their antioxidant and antimicrobial activity in dark germinated fenugreek sprouts in response to peptide and phytochemical elicitors. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition, 13, 295-307. Raskin, I., Skubatz, H., Tang, W., Meeuse, B.J.D. (1990). Salicylic acid levels in thermogenic and non-thermogenic plants. Annals of Botany, 66, 369-373. Rhee, S.G. (2006). Cell Signaling; H2O2, a necessary evil for cell signaling. Science, 312, 1882-1883. Rivas-San Vicente, M., Plasencia, J. (2011). Salicylic acid beyond defence: its role in plant growth and development. Journal of Experimental Botany, 1-18. Rodríguez-Serrano, M., Romero-Puertas, M.C., Pazmiño, D.M., Testillano, P.S., Risueño, M.C., del Ríó, L.A., Sandalio, L.M. (2009). Cellular response of pea plants to cadmium toxicity: cross talk between reactive oxygen species, nitric oxide, and calcium. Plant Physiology, 150, 229-243. Rodríguez-Serrano, M., Romero-Puertas, M.C., Zabalza, A., Corpas F.J., Gómez, M., del Río, L.A., Sandalio L.M. (2006). Cadmium effect on oxidative metabolism of pea (Pisum sativum L.) roots. Imaging of reactive oxygen species and nitric oxide accumulation in vivo. Plant, Cell and Environment, 29, 1532-1544. Romero-Pérez, A.I., Lamuela-Raventós, R.M., Andrés-Lacueva, C., de la Torre-Boronat, M.C. (2001). Method for the quantitative extraction of resveratrol and piceid isomers in grape berry skins. Effect of powdery mildew on the stilbene content. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, 210–215. Root, R.A., Miller, R.J., Koeppe, D.E. (1975). Uptake of cadmium—Its toxicity, and effect on the iron ratio in hydroponically grown corn. Journal of Environmental Quality, 4, 473476. Roth, G.J., Majerus, P.W. (1975). The mechanism of the effect of Aspirin on human platelets. The Journal of Clinical Investigation, 56, 624-632. Saari, E.E., Prescott, J.M. (1975). A scale for appraising for foliar intensity of wheat diseases. Plant Disease Reporter, 59, 377–380. Sakihama, Y., Cohen, M.F., Grace, S.C, Yamasaki, H. (2002). Plant phenolic antioxidant and prooxidant activities: phenolics-induced oxidative damage mediated by metals in plants. Toxicology, 177, 67–80.
133
Salekjalal, M., Haddad, R., Jafari, B. (2012). Effects of soil water shortages on the activity of antioxidant enzymes and the contents of chlorophylls and proteins in barley. American-Eurasian Journal of Agricultural & Environmental Sciences, 12, 57-63. Sánchez-Casas, P., Klessig, D.F. (1994). A salicylic acid-binding activity and a salicylic acidinhibitable catalase activity are present in a variety of plant species. Plant Physiology, 106, 1675-1679. Sandalino, L.M., Dalurzo, H.C., Gómez, M., Romero-Puertas, M.C., del Río, L.A. (2001). Cadmium-induced changes in the growth and oxidative metabolism of pea plants. Journal of Experimental Botany, 52, 2115-2126. Schmidt, U. (2003). Enhancing phytoextraction: the effect of chemical soil manipulation on mobility, plant accumulation, and leaching of heavy metals. Journal of Environmental Quality, 32, 1939-1954. Schutzendübel, A., Schwanz, P., Teichmann, T., Gross, K., Langenfeld-Heyser, R., Godbold, D.L., Polle, A. (2007). Cadmium-induced changes in antioxidative systems, H2O2 content and differentiation in pine (Pinus sylvestris) roots. Plant Physiology, 127, 887– 898. Scott-Craig, J.S., Kerby, K.B., Stein, B.D., Somerville, S.C. (1995). Expression of an extracellular peroxidase that is induced in barley (Hordeum vulgare) by the powdery mildew pathogen (Erysiphe graminis f. sp. hordei). Physiological and Molecular Plant Pathology, 47, 407–418. Seah, S., Sivasithamparam, K., Turner, D.W. (1996). The effect of salicylic acid on resistance in wheat (Triticum aestivum) seedling roots against the take-all fungus, Gaeumannomyces graminis var. tritici. Australian Journal of Botany, 44, 499–507. Sepehri, A., Golparvar, A.R. (2011). The effect of drought stress on water relations, chlorophyll content and leaf area in canola cultivars (Brassica napus L.). Electronic Journal of Biology, 7, 49-53. Sgherri, C., Milone, M.T.A., Clijsters, H., Navari-Izzo, F. (2001). Antioxidative enzymes in two wheat cultivars, differently sensitive to drought and subjected to subsymptomatic copper doses. Journal of Plant Physiology, 158, 1439–1447. Shakirova,
F.M.,
Sakhabutdinova,
A.R.,
Bezrukova,
M.V.,
Fatkhutdinova,
R.A.,
Fatkhutdinova, D.R. (2003). Changes in the hormonal status of wheat seedlings induced by salicylic acid and salinity. Plant Science, 164, 317-322.
134
Shan, C., Dai, H., Sun, Y. (2012). Hydrogen sulfide protects wheat seedlings against copper stress by regulating the ascorbate and glutathione metabolism in leaves. Australian Journal of Crop Sciences, 6, 248-254. Sharma, P., Dubey, R.S. (2005). Modulation of nitrate reductase activity in rice seedlings under aluminium toxicity and water stress: role of osmolytes as enzyme protectant. Journal of Plant Physiology, 162, 854–864. Sharma, P., Jha, A.B., Dubey, R.S., Pessarakli, M. (2012). Reactive oxygen species, oxidative damage, and antioxidative defense mechanism in plants under stressful conditions. Journal of Botany, 2012, 1-27. Shehab, G.G., Ahmed, O.K., El-Beltagi, H.S. (2010). Effects of various chemical agents for alleviation of drought stress in rice plants (Oryza sativa L.). Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca, 38, 139-148. Singh, B., Usha, K. (2003). Salicylic acid induced physiological and biochemical changes in wheat seedlings under water stress. Plant Growth Regulation, 39, 137-141. Singh, S., Mishra, S., Kumari, R., Agrawal, S.B. (2009). Response of ultraviolet-B and nickel on pigments, metabolites and antioxidants of Pisum sativum L. Journal of Environmental Biology, 30, 677-684. Skillman, J.B. (2008). Quantum yield variation across the three pathways of photosynthesis: not yet out of the dark. Journal of Experimental Botany, 1-15. Skladanka, J., Adam, V., Zitka, O., Krystofova, O., Beklova, M., Kizek, R., Havlicek, Z., Slama, P., Nawrath, A. (2012). Investigation into the effect of molds in grasses on their content of low molecular mass thiols. International Journal of Environmental Research and Public Health, 9, 3789-3805. Smith I.K., Vierheller T.L., Thorne C.A. (1988). Assay of glutathione reductase in crude tissue homogenates using 5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid). Analitical Biochemistry, 175, 408-413. Smith, M.A., Davies, P.J. (1985). Separation and quantitation of polyamines in plant tissue by high performance liquid chromatography of their dansyl derivatives. Plant Physiology, 78, 89-91. Sobrino-Plata, J., Ortega-Villasante, C., Flores-Cáceres, M.L., Escobar, C., Del Campo, F.F., Hernández, L.E. (2009). Differential alterations of antioxidant defenses as bioindicators of mercury and cadmium toxicity in alfalfa. Chemosphere, 77, 946–954.
135
Solovchenko, A.E., Merzlyak, M.N. (2008). Screening of visible and UV radiation as a photoprotective mechanism in plants. Russian Journal of Plant Physiology, 55, 719737. Son, J.A., Narayanankutty, D.P., Roh, K.S. (2014). Influence of exogenous application of glutathione on rubisco and rubisco activase in heavy metal-stressed tobacco plant grown in vitro. Saudi Journal of Biological Sciences, 21, 89–97. Spoel, S.H., Dong, X. (2012). How do plants achieve immunity? Defence without specialized immune cells. Nature reviews Immunology, 12, 89-100. Srivastava, M.N., Dwivedi, U.N. (1998). Salicylic acid modulates glutathione metabolism in pea seedlings. Journal of Plant Physiology, 153, 409-414. Stevens, R., Page, D., Gouble, B., Garchery, C., Zamir, D., Causse, M. (2008). Tomato fruit ascorbic acid content is linked with monodehydroascorbate reductase activity and tolerance to chilling stress. Plant, Cell and Environment, 31, 1086–1096. Stolt, J.P., Sneller, F.E.C., Bryngelsson, T., Lundborg, T., Schat, H. (2003). Phytochelatin and cadmium accumulation in wheat. Environmental and Experimental Botany, 49, 21-28. Sun, Z., Hou, s., Yang, W., Han, Y. (2012). Exogenous application of salicylic acid enhanced the rutin accumulation and influenced the expression patterns of rutin biosynthesis related genes in Fagopyrum tartaricum Gaertn leaves. Plant Growth Regulation, 68, 9–15. Szalai, G., Horgosi, Sz., Soós, V., Majláth, I., Balázs, E., Janda, T. (2011). Salicylic acid treatment of pea seeds induces its de novo synthesis. Journal of Plant Physiology, 168, 213–219. Szalai, G., Krantev, A., Yordanova, R., Popova, L.P., Janda, T. (2013). Influence of salicylic acid on phytochelatin synthesis in Zea mays during Cd stress. Turkish Journal of Botany, 37, 708-714. Szalai, G., Pap, M., Janda, T. (2009). Light-induced frost tolerance differs in winter and spring wheat plants. Journal of Plant Physiology, 166, 1826–1831. Szent-Györgyi, A. (1931). On the function of hexuronic acid in the respiration of the cabbage leaf. The Journal of Biological Chemistry, 90, 385–393. Szepesi, Á., Csiszár, J., Bajkán, S., Gémes, K., Horváth, F., Erdei, L., Deér, A.K., Simon, M.L., Tari, I. (2005). Role of salicylic acid pre-treatment on the acclimation of tomato plants to salt- and osmotic stress. Acta Biologica Szegediensis, 49, 123–125.
136
Szepesi, Á., Gémes, K., Orosz, G., Pető, A., Takács, Z., Vorák, M., Tari, I. (2011). Interaction between salicylic acid and polyamines and their possible roles in tomato hardening processes. Acta Biologica Szegediensis, 55, 165–166. Tanaka, Y., Sano, T., Tamaoki, M., Nakajima, N., Kondo, N., Hasezawa, S. (2005). Ethylene inhibits abscisic acid-induced stomatal closure in Arabidopsis. Plant Physiology, 138, 2337–234. Takahashi, Y., Berberich, T., Miyazaki, A., Seo, S., Ohashi, Y., Kusano, T. (2003). Spermine signaling in tobacco: activation of mitogen-activated protein kinases by spermine is mediated through mitochondrial dysfunction. The Plant Journal, 36, 820–829. Talieva, M.N., Kondrat’eva, V.V. (2002). Influence of exogenous salicylic acid on the level of phytohormones in tissues of Phlox paniculata and Phlox setacea leaves with special reference to resistance against the powdery mildew causative agent Erysiphe cichoracearum DC. f. phlogis Jacz. Biology Bulletin, 29, 551–554. Tan, Y., Liang, Z., Shao, H., Du., F. (2006). Effect of water deficits on the activity of antioxidative enzymes and osmoregulation among three different genotypes of Radix astragali at seeding stage. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 49, 60-65. Thaler, J.S., Humphrey, P.T., Whiteman, N.K. (2012). Evolution of jasmonate and salicylate signal crosstalk. Trends in Plant Science, 17, 260-270. Thijssen, S., Cuypers, A., Maringwa, J., Smeets, K., Horemans, N., Lambrichts, I., Van Kerkhove, E. (2007). Low cadmium exposure triggers a biphasic oxidative stress response in mice kidneys. Toxicology, 236, 29–41. Thomas, J.C., Perron, M., Davies, E.C. (2004). Genetic responsiveness to copper in the iceplant, Mesembryanthenuum crystallinum. Plant Science, 167, 259-266. Thulke, O.U., Conrath, U. (1998). Salicylic acid has a dual role in the activation of defencerelated genes in parsley. Plant Journal, 14, 35–42. Valko, M., Rhodes, C.J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. (2006). Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions, 160, 1-40. Vallelian-Bindschedler, L., Metraux, J.P., Schweizer, P. (1998). Salicylic acid accumulation in barley is pathogen specific but not required for defense-gene activation. Molecular Plant-Microbe Interactions, 11, 702–705. van Ginkel, M., Ogbonnaya, F. (2007). Novel genetic diversity from synthetic wheats in breeding cultivars for changing production conditions. Field Crops Research, 104, 86– 94.
137
van Spronsen, P.C., Tak, T., Rood, A.M.M., van Brussel, A.A.N., Kijne, J.W., Boot, K.J.M. (2003). Salicylic acid inhibits indeterminant-type nodulation but not determinant-type nodulation. Molecular Plant-Microbe Interactions, 16, 83–91. Verberne, M.C., Verpoorte, R., Bol, J.F., Blanco, J.M., Linthorst, H.J. (2000). Overproduction of salicylic acid in plants by bacterial transgenes enhances pathogen resistance. Nature Biotechnology, 18, 779-83. Vestena, S., Cambraia, J., Riberio, C., Oliveira, J.A., Oliva, M.A. (2011). Cadmium-induced oxidative stress and antioxidative enzyme response in water hyacinth and Salvinia. Brazilian Journal of Plant Physiology, 23, 131-139. von Saint Paul, V., Zhang, W., Kanawati, B., Geist, B., Faus-Keßler, T., Schmitt-Kopplin, P., Schäffner, A.R. (2011). The Arabidopsis glucosyltransferase UGT76B1 conjugates isoleucic acid and modulates plant defense and senescence. The Plant Cell, 23, 41244145. Walters, D., Cowley, T., Mitchell, A. (2002). Methyl jasmonate alters polyamine metabolism and induces systemic protection against powdery mildew infection in barley seedlings. Journal of Experimental Botany, 53, 747-756. Ward, E.R., Uknes, S.J., Williams, S.C., Dincher, S.S., Wiederhold, D.L., Alexander, D.C., Ahl-Goy, P., Métraux, J.P., Ryals, J.A. (1991). Coordinated gene activity in response to agents that induce systemic acquired resistance. The Plant Cell, 3, 1085–1094. Whitham, S.A., Yang, C., Goodin, M.M. (2006). Global Impact: Elucidating plant responses to viral infection. Molecular Plant-Microbe Interactions, 19, 1207-1215. Wildermuth, M.C., Dewdney, J., Wu, G., Ausubel, F.M. (2001). Isochorismate synthase is required to synthesize salicylic acid for plant defense. Nature, 414, 562-565. Willekens, H., Inze, D., Van Montagu, M., Van Camp, W. (1995). Catalases in plants. Molecular Breeding, 1, 207–228. Winkel-Shirley, B. (2002). Biosynthesis of flavonoids and effects of stress. Current Opinion in Plant Biology, 5, 218–223. Wu, G.Q., Zhang, L.N., Wang, Y.Y. (2012). Response of growth and antioxidant enzymes to osmotic stress in two different wheat (Triticum aestivum L.) cultivars seedlings. Plant Soil and Environment, 58, 534–539. Xu, C., Sullivan, J.H. (2010). Reviewing the technical designs for experiments with ultraviolet-B radiation and impact on photosynthesis, DNA and secondary metabolism. Journal of Integrative Plant Biology, 52, 377–387.
138
Xu, J., Yin, H.X., Li, X. (2009). Protective effects of proline against cadmium toxicity in micropropagated hyperaccumulator, Solanum nigrum L. Plant Cell Reports, 28, 325333. Yordanova, R., Popova, L. (2007). Effect of exogenous treatment with salicylic acid on photosynthetic activity and antioxidant capacity of chilled wheat plants. General and Applied Plant Physiology, 33, 155–170. Yusuf, M., Hasan, S.A., Ali, B., Hayat, S., Fariduddin, Q., Ahmad, A. (2008). Effect of salicylic acid on salinity induced changes in Brassica juncea. Journal of Integrative Plant Biology, 50, 1–4. Zadoks, J.C., Chang, T.T., Konzak, C.F. (1974). A decimal code for the growth stage of cereals. Weed Research, 14, 415–421. Zagorchev, L., Seal, C.E., Kranner, I., Odjakova, M. (2013). A central role for thiols in plant tolerance to abiotic stress. International Journal of Molecular Sciences, 14, 7405-7432. Zawoznik, M.S., Groppa, M.D., Tomaro, M.L., Benavides, M.P. (2007). Endogenous salicylic acid potentiates cadmium-induced oxidative stress in Arabidopsis thaliana. Plant Science, 173, 190-197. Zhang, F., Zhang, H., Xia, Y., Wang, G., Xu, L., Shen, Z. (2011). Exogenous application of salicylic acid alleviates cadmium toxicity and reduces hydrogen peroxide accumulation in root apoplasts of Phaseolus aureus and Vicia sativa. Plant Cell Reports, 30, 1475-1483. Zhang, Y. (2013). Biological role of ascorbate in plants. In: Ascorbic acid in plants, Springer briefs in plant science, doi: 10.1007/978-1-4614-4127-4_2, 7-33. Zhao, Y. (2011). Cadmium accumulation and antioxidative defenses in leaves of Triticum aestivum L. and Zea mays L. African Journal of Biotechnology, 10, 2936-2943. Zhao, H.J., Lin, X.W., Shi, H.Z., Chang, S.M. (1995). The regulating effects of phenolic compounds on the physiological characteristics and yield of soybeans. Acta Agronomica Sinica, 21, 351–355. Zhou, F., Wang, J., Yang, N. (2014). Growth responses, antioxidant enzyme activities and lead accumulation of Sophora japonica and Platycladus orientalis seedlings under Pb and water stress. Plant Growth Regulation, BRIEF COMMUNICATION 1-7. Zhou, J.M., Trifa, Y., Silva, H., Pontier, D., Lam, E., Shah, J., Klessig, D.F. (2000). NPR1 differentially interacts with members of the TGA/OBF family of transcription factors that bind an element of the PR-1 gene required for induction by salicylic acid. Molecular Plant-Microbe Interactions, 13, 191-202.
139
Zhu, J.K. (2001). Cell signaling under salt, water and cold stresses. Current Opinion in Plant Biology, 4, 401–406. Zhu, J.K. (2002). Salt and drought stress signal transduction in plants. Annual Review of Plant Biology, 53, 247-273. Zlatev, Z.S., Lidon, F.J.C., Kaimakanova, M. (2012). Plant physiological responses to UV-B radiation. Emirates Journal of Food and Agriculture, 24, 481-501. Zuk-Golaszewska, K., Upadhyaya, M.K., Golaszewski, J. (2003). The effect of UV-B radiation on plant growth and development. Plant Soil and Environment, 49, 135–140.
140
PUBLIKÁCIÓS JEGYZÉK Az értekezés alapjául szolgáló publikációk Bírált folyóirat-közlemények Kovács, V., Gondor, O.K., Szalai, G., Majláth, I., Janda, T., Pál, M. (2014a). UV-B radiation modifies the acclimation processes to drought or cadmium in wheat. Environmental and Experimental Botany, 100, 122– 131. IF: 2,578. Kovács, V., Gondor, O.K., Szalai, G., Majláth, I., Janda, T., Pál M. (2014b). Synthesis and role of salicylic acid in wheat varieties with different levels of cadmium tolerance. Journal of Hazardous Materials, 280, 12-19. IF: 4,331. Kovács, V., Vida, G., Szalai, G., Janda, T., Pál, M. (2012). Relationship between biotic stress tolerance and protective compounds in wheat genotypes. Acta Agronomica Hungarica, 60, 131–141. Pál, M., Kovács, V., Vida, Gy., Szalai, G., Janda, T. (2013). Changes induced by powdery mildew in the salicylic acid and polyamine contents and the antioxidant enzyme activities of wheat lines. European Journal of Plant Pathology, 135, 35-47. IF: 1,413.
Könyvfejezet Pál, M., Szalai, G., Kovács, V., Gondor, O.K., Janda, T. (2013). Shamsul Hayat, Aqil Ahmad, Mohammed Nasser Alyemeni (szerk.): Salicylic Acid-Mediated Abiotic Stress Tolerance. In: Shamsul Hayat, Aqil Ahmad, Mohammed Nasser Alyemeni (szerk.) Salicylic Acid Plant Growth and Development. Netherlands: Springer Dordrecht Heidelberg, 183-247. (ISBN:978-94-007-6427-9) Konferencia-kiadványok, poszterek Kovács, V., Gondor, O.K., Majláth, I., Szalai, G., Janda, T., Pál, M. (2013). Effects of UV-B radiation under different abiotic stress conditions in wheat. Studia Universitatis BabeşBolyai Biologia, 1, 53-54. Kovács, V., Gondor, O.K., Majláth, I., Szalai, G., Janda, T., Pál, M. (2014). The effects of drought on plant defence system in wheat genotypes with different salicylic acid content. In: Kőszegi Izabella (szerk.) Advances in Plant Breeding & Biotechnology Techniques: Book of Abstracts. 96 p. Mosonmagyaróvár, Magyarország, 2014.04.28-
141
2014.04.29. Martonvásár: Pannonian Plant Biotechnology Association, 2014. pp. 4950. (Pannonian Plant Biotechnology Association Conference for PhD Students in Plant Biology) ISBN:978-963-89129-5-4. Kovács, V., Pál, M., Vida, Gy., Szalai, G., Janda, T. (2011). Effect of powdery mildew infection on the antioxidant enzyme activities in different lines of Thatcher-based wheat. Acta Biologica Szegediensis 55, 99-100. Kovács, V., Pál, M., Vida, Gy, Szalai, G., Janda, T. (2012). Study of antioxidant enzyme activities in different lines of Thatcher-based wheat during powdery mildew infection. Abstracts Plant Biology Congress Freiburg 2012 jointly organized by FESPB and EPSO, Freiburg im Breisgau, 366.p. Kovács, V., Szalai, G., Janda, T., Pál, M. (2013). Kadmium tolerancia vizsgálata búzában. In: Hoffmann B, Kollaricsné Horváth M (szerk.) XIX. Növénynemesítési Tudományos Nap: Összefoglalók. Konferencia helye, ideje: Keszthely, Magyarország, 2013.03.07 Budapest: MTA Agrártudományok Osztályának Növénynemesítési Bizottsága, 2013. p. 108. (ISBN:978-963-9639-50-8) Pál, M., Kovács, V., Gondor, O.K., Janda, T., Szalai, G. (2014). Investigation on the synthesis and role of salicylic acid in wheat varieties with different levels of cadmium tolerance. Plant Biology Europe, FESPB/EPSO 2014 Congress, Abstract Book Poster Presentations, Dublin, p46. Pál, M., Kovács, V., Szalai, G., Janda, T. (2012). A szalicilsav függő védekezési mechanizmusok kapcsolata egyéb jelátviteli utakkal kalászos gabonafélékben. I. ATK Tudományos Nap, Felfedező kutatások az Agrártudományi Kutatóközpontban: Összefoglalók. Martonvásár, ISBN:978-963-8351-40-1. Pál, M., Kovács, V., Vida, Gy., Szalai, G., Janda, T. (2011). Changes in salicylic acid and polyamine contents following powdery mildew infection of near-isogenic Thatcher wheat lines carrying different Lr genes. Acta Biologica Szegediensis 55, 139-141. Pál, M., Kovács, V., Vida, Gy., Szalai, G., Janda, T. (2012). A stressztűrő képesség és bizonyos védő vegyületek kapcsolata különböző búza genotípusokban. XVIII. Növénynemesítési Tudományos Napok: Összefoglalók, Budapest, ISBN: 978-9638351-38-8. Egyéb publikációk Kovács, V., Vida, Gy., Szalai, G., Janda, T., Pál, M. (2013). A lisztharmat-rezisztencia élettani háttere búzában. Martonvásár az MTA Agrártudományi Kutatóközpont
142
közleményei 2013/1 XXV. Évfolyam 1. szám, 18-19. (ISSN: 1217-5498) felelős kiadó: Dr. Bedő Zoltán, felelős szerkesztő: Dr. Veisz Ottó
Az értekezés témájához közvetlenül nem kapcsolódó publikációk Bírált folyóirat-közlemények Gondor, O.K, Szalai, G., Kovács, V., Janda, T., Pál, M. (2014). Impact of UV-B on droughtor cadmium-induced changes in the fatty acid composition of membrane lipid fractions in wheat. Ecotoxicology and Environmental Safety, 108, 129-134. IF: 2,482. Kocsy, G., Pál, M., Soltész, A., Szalai, G., Boldizsár, Á., Kovács, V., Janda, T. (2011). Low temperature and oxidative stress in cereals. Acta Agronomica Hungarica, 59, 153-173. Pál, M., Kovács, V., Szalai, G., Soós, V., Ma, X., Liu, H., Mei, H., Janda, T. (2014). Salicylic acid and abiotic stress responses in rice. Journal of Agronomy and Crop Science, 200, 1–11. IF: 2,151. Konferencia-kiadványok, poszterek Gondor, O.K., Szalai, G., Janda, T., Kovács, V., Pál, M. (2014). Impact of UV-B on drought or cadmium induced changes in fatty acid composition of membrane lipid fractions in wheat. In: Dudits D, Dusha I (szerk.) Fiatal Biotechnológusok Országos Konferenciája "FIBOK 2014": Program és összefoglalók. 100 p. Szeged, Magyarország, 2014.03.07 Szeged: JATE Press, p. 49. ISBN:978-963-315-167-9. Pál, M., Kovács, V., Szalai, G., Soós, V., Ma, X., Liu, H., Mei, H., Janda, T. (2014). Effects of low temperature and drought on rice with different levels of drought tolerance. Plant Biology Europe, FESPB/EPSO 2014 Congress, Abstract Book Poster Presentations, Dublin, p54. Pál, M., Kovács, V., Szalai, G., Soós, V., Ma, X., Liu, H., Mei, H., Janda, T. (2014). Alacsony hőmérséklet és szárazság hatása eltérő stressztűrő- képességgel rendelkező rizsfajtákban. In: Veisz Ottó (szerk.) Növénynemesítés a megújuló mezőgazdaságban: XX. Növénynemesítési Tudományos Nap. 522 p. Budapest, Magyarország, 2014.03.18 Budapest: MTA Agrártudományok Osztályának Növénynemesítési Bizottsága, 344348. ISBN:978-963-8351-42-5.
143
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Köszönetemet szeretném kifejezni az MTA Agrártudományi Kutatóközpont Mezőgazdasági Intézete vezetőségének, hogy lehetővé tette számomra a doktori disszertáció elkészítését. Köszönöm Dr. Janda Tibornak, hogy a Növényélettani Osztály vezetőjeként lehetőséget és helyet biztosított a kutatómunkám elvégzéséhez. Köszönöm témavezetőimnek, Dr. Pál Magdának és Dr. Janda Tibornak, hogy sok-sok türelemmel és odafigyeléssel irányították munkámat és segítették szakmai fejlődésemet. Köszönöm közvetlen kollégáimnak, Dr. Szalai Gabriellának, Dr. Majláth Imrének, Dr. Darkó Évának és Gondor Orsolya Kingának, hogy tanácsaikra, támogatásukra és segítségükre mindig számíthattam. Külön köszönettel tartozom Kóti Gyulánénak† és Kövesdi Ferencnének a kísérletek kivitelezése során nyújtott lelkiismeretes és nélkülözhetetlen segítségüket, tanácsaikat, építő jellegű kritikáikat. Köszönöm Dr. Páldi Emilnek és Jankovicsné Oláh Tímeának támogatásukat. Köszönettel tartozom a Fitotron Osztály munkatársainak a növénynevelés során nyújtott mindennemű segítségükért. Köszönetemet fejezem ki minden kollégámnak, akik bármilyen formában segítették munkámat. Szeretném megköszönni szüleimnek, testvéremnek, nagymamámnak és nagypapámnak, hogy mindig mellettem álltak, szeretetükkel és türelmükkel mindenben támogattak. Hálásan köszönöm páromnak, hogy derűlátásával, szeretetével és türelmével mindenben segített, ami nélkül ez a dolgozat nem készülhetett volna el.
144
