A PACAP SZEREPE A GONADOTROPH HORMON SZEKRÉCIÓ SZABÁLYOZÁSÁBAN Doktori értekezés
VASZINÉ DR. SZABÓ ENIKŐ Semmelweis Egyetem Humánmorfológiai és Fejlődésbiológiai Intézete
SEMMELWEIS EGYETEM SZENTÁGOTHAI JÁNOS IDEGTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA NEUROENDOKRINOLÓGIA PROGRAM Programvezető: Dr. Liposits Zsolt, igazgatóhelyettes, MTA doktora
Témavezető:
Dr. Köves Katalin egyetemi tanár, MTA doktora
Hivatalos bírálók:
Med. Habil. Dr. Rékási Zoltán egyetemi docens, PhD Dr. Altdorfer Károly egyetemi adjunktus, PhD
Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:
Dr. Rácz Károly egyetemi tanár, MTA doktora Dr. Kovács Krisztina, tud. főmunkatárs, MTA doktora Dr. Madarász Emilia, tud. főmunkatárs, MTA doktora
BUDAPEST, 2006
TARTALOMJEGYZÉK
Oldal RÖVIDÍTÉSEK
3
BEVEZETÉS
4
IRODALMI HÁTTÉR
6
A PACAP izolálása és karakterizálása
6
A PACAP receptorai és hatásmechanizmusa
8
A PACAP sorsa a receptorhoz való kötődés után 11 A PACAP eloszlása
12
A PACAP biológiai hatása
18
KÍSÉRLET CÉLJA
24
ANYAG ÉS MÓDSZER
25
Állatok
25
Cell Immunoblot Assay
26
Sandwhich Enzyme Immunoassay
29
Képanalízis
29
Kísérleti protokoll
30
KÍSÉRLETI EREDMÉNYEK
31
MEGBESZÉLÉS
43
KÖVETKEZTETÉSEK
49
ÖSSZEFOGLALÁS
50
SUMMARY
51
IRODALOMJEGYZÉK
52
KÖSZÖNETNYILVÁNITÁS
67
MEGJELENT CIKKEK ÉS KONGRESSZUSI ELŐADÁSOK JEGYZÉKE
68
SAJÁT KÖZLEMÉNYEK ÉS ELŐADÁS ABSZTRAKTOK KÜLÖNLENYOMATAI
71
2
RÖVIDÍTÉSEK cAMP: ciklikus adenozin monofoszfát CIBA: cell immunoblot assay CRF: corticotroph hormon releasing hormon DAB: diaminobenzidin tetrahidrochlorid FSH: folliculus stimuláló hormon Gs: guanozin kötő fehérje, GTP dependens adenilát ciklázt aktivál Gq: guanozin kötő fehérje, phospholipase-C-t aktivál GTP: guanozin trifoszfát GnRH: gonadotroph hormon releasing hormon icv: intracerebroventrikuláris IP3: inozitol trifoszfát iv: intravénás LH: luteinizáló hormon M65: Maxadilan 65 mRNA: messenger ribonukleinsav PACAP: pituitary adenylate cyclase activating polypeptide PAC1: PACAP 1 receptor P23-P27, P38, P6-30, P6-32, P6-38, P3-32: különböző számú aminosavból álló PACAP polipeptidek RT-PCR: revers transcript-polymerase chain reaction S-EIA: sandwich enzyme immunoassay VIP: vasoactive intestinal polypeptide VIP4-28, VIP10-28: különböző molekulasúlyú VIP polipeptidek VPAC1, VPAC2: VIP-et és PACAP-ot kötő közös receptor
3
BEVEZETÉS Számos külső inger, elsősorban fény impulzusok, befolyásolva egy belső biológiai órát, szabályozzák és összehangolják a neuroendokrin rendszer cirkadian oszcillatorikus működését. Scharrer (1964) elképzelése szerint a fényimpulzusok a nervus opticuson keresztül nemcsak a látóközpontot érik el, hanem a hypothalamusban lévő biológiai órát, a nucleus suprachiasmaticust is, ennek a magnak belső, saját ritmusát befolyásolva biológiai ritmusokat szabályoznak (lásd Klein és mtsai, 1991), többek között nőstény patkányban a hypothalamo-hypophysealis gonad rendszer ciklusos működését is. A hypothalamo-hypophysealis-gonad rendszer működésének szabályozásában számos neuropeptid, neurotranszmitter vesz részt. A legfontosabb ezek közül a gonadotroph hormon releasing hormon (GnRH), amelyet Schally és munkatársai izoláltak 1971-ben.
Immunhisztokémiai vizsgálatok kiderítették, hogy ez a peptid
patkányban elsősorban a septum medialis részében és a preopticus areaban termelődik (Baker és mtsai, 1975; Sétáló és mtsai, 1975). Innen indul el a GnRH pálya, amelynek rostjai az eminentia mediana felületes zonájában végződnek (Sétáló és mtsai, 1976, Merchenthaler és mtsai, 1980). Ez a tíz aminosavból álló peptid fokozott mértékben szintetizálódik az ovulációt megelőző napon délelőtt, amellyel egyidőben nő a perifériás vérben az oestrogen szint. Konstans megvilágítási viszonyok mellett (5-19 óra világos periódus), délután 14-16 óra között (ún. kritikus periódus) ürül a GnRH a portalis vérbe. Ez a fokozott GnRH kidobás hozza létre a luteinizáló hormon (LH) fokozott kidobását (LH surge) a keringésbe, előidézve az ovulációt (1. ábra, A). Intakt nőstény patkányban az ovuláció négy- vagy ötnaponként következik be, azaz az állatnak négy- vagy ötnapos ciklusa van. A GnRH ciklusos elválasztását az ovariális, majd uterinális ciklus követi. Ugyancsak ciklusosan változik a hüvelykenet citológiai képe. A kenetvétel egy non-invaziv módszer, amely alkalmas a ciklus stádium megállapítására (1. ábra, B). A tizenöt évvel ezelőtt izolált és karakterizált hypophysis adenilát cikláz aktiváló polipeptidről (Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide, PACAP) is kiderült, hogy szerepet játszik a gonadotroph hormon szekréció szabályozásában.
4
1. ÁBRA
5
IRODALMI HÁTTÉR A PACAP izolálása és karakterizálása A PACAP adenilát cikláz enzim aktiváló tulajdonsága alapján izolálták birka hypothalamusból (Miyata és mtsai, 1989). A PACAP génjét elöször emberi here génkönyvtárból izolálták (Kimura és mtsai, 1990). A gén emberben a 18. kromoszóma rövid karján, a P11-es lókuszon található és 2681 nukleotidból áll (Hosoya és mtsai, 1992). A PACAP két bioaktív amidált formában van jelen, egy 27 aminosavból (P27) és egy 38 aminosavból (P38) álló formában. A P38 a C terminálison 11 aminosavval hosszabb, így magába foglalja a P27 teljes szekvenciáját. A P27 és a P38 egy 176 aminosavból álló prekurzorból származik (2. ábra). A birka és az emberi propeptid 82%-os homológiát mutat a patkány PACAP propeptiddel (Ogi és mtsai, 1990). A PACAP aminosav szekvenciája birka, patkány és emberi szervezetben azonos, és a biológiailag aktív regió szekvenciája az evolúció során nem változott (lásd Vaudry és mtsai, 2000), nem emlős PACAP-ban is ugyanaz. A P38 a szervezetben nagyobb arányban van jelen, mint a P27. Az összes PACAP 90%-a P38, és csak 10%-a P27 (Arimura és mtsai, 1991). A PACAP karakterizálása során kiderült, hogy 68%-ban mutat szerkezeti homológiát a secretin családba tartozó vazoaktív intesztinális polipeptiddel (Vasoactive Intestinal Polypeptide, VIP) (Miyata és mtsai, 1989) (3. ábra). Ebbe a peptid családba tartozik többek között a peptid histidin isoleucin, helodermin, helospectin, secretin és a
glucagon is. A secretin-család tagjai jelentős
mennyiségben fordulnak elő az idegrendszer mellett az emésztőtraktusban is, így gasztrointesztinális peptideknek is tekinthetők. Gyakran találkozunk az irodalomban a „brain-gut" peptid elnevezéssel. Ez természetesen nem azt jelenti, hogy ebbe a csoportba tartozó peptidek nem fordulnak elő más szervrendszerekben. A központi idegrendszer és az emésztőtraktus mellett a „brain-gut” peptidek közül több megtalálható a légző és a reproduktív rendszerben, de a kiválasztó rendszer és a nyirokrendszer sem kivétel.
6
PACAP38
H-S-D-G-I-F-T-D-S-Y-S-R-Y-R-K-Q-M-A-V-K-K-Y-L-A-A-V-L-GK-R-Y-K-Q-R-V-K-N-K-CONH2
PACAP27
H-S-D-G-I-F-T-D-S-Y-S-R-Y-R-K-Q-M-A-V-K-K-Y-L-A-A-V-LCONH2
VIP
H-S-D-A-V-F-T-D-N-Y-T-R-L-R-K-Q-M-A-V-K-K-Y-L-N-S-I-L-NCONH2
3. ábra. PACAP27, PACAP38 és VIP szekvenciája. A fekete színnel jelölt aminosavak mindhárom peptidben azonosak. A piros színű aminosavak a PACAP-ra jellemzőek, a zöld színnel jelöltek a VIP-ben fordulnak elő.
7
A PACAP receptorai és hatásmechanizmusa A PACAP a szervezetben hatását specifikus membrán receptorokon keresztül fejti ki. A receptornak hét transzmembrán valamint egy G proteinkötő doménje van (4. ábra). A receptor szerkezetében hasonló a secretin családba tartozó peptidek más receptorához. A PACAP N-terminális vége játszik szerepet a receptor aktivációban (Gourlet és mtsai, 1991); C-terminális vége a kötőhely felismerést segíti (Gourlet és mtsai, 1996). A PACAP-nak három receptorát irták le (Pisegna és mtsai, 1993, Ogi és mtsai, 1993, Miyamoto és mtsai, 1994, Journot és mtsai, 1995), amelyekhez a PACAP és a VIP különböző mértékben kötődik. A PAC1 két-három nagyságrenddel nagyobb affinitást mutat PACAP-pal szemben, mint VIP-pel szemben. Két fő típusa ismert: a PAC1A a P27-t és P38-t azonos mértékben köti, a PAC1B százszor nagyobb affinitást mutat P38 iránt. A PAC1 receptornak több splice variánsa létezik. A splice variánsokat egy vagy két 27-28 aminosavból álló kazetta hiánya vagy megléte hozza létre (Journot és mtsai, 1994), amelyek más-más second messenger mechanizmust feltételeznek. A hosszabb forma a harmadik intracelluláris hurkon hip, hop1, vagy hop2 kazettát tartalmaz. A PAC1 receptorok e variánsai G-protein kapcsolt hatásmechanizmussal működnek hasonlóan a calcitonin, a secretin és a parathormon receptorokhoz. Gs proteinen keresztül GTP dependens adenilát ciklázt aktiválnak, így növelik az intracelluláris cAMP szintet. Ez a mechanizmus feltehetőleg a szabályozott fehérje, vagy peptid mRNA expresszióját fokozza (Ishizaka és mtsai, 1993) (4. ábra). A ligand rövidebb formához kötődése, amely sem hip, sem hop kazettát nem tartalmaz phospholipase-C-t aktivál. Gq proteint aktiválva a phospholipase-C rendszeren keresztül növeli az intracelluláris Ca2+ szintet. Ez történhet azáltal, hogy az intracelluláris raktárakat üríti ki IP3 közvetítésével, ez egy gyors Ca2+ mobilizáció (Pantaloni és mtsai, 1996) (5. ábra). Egy másik splice variáns, amelyben szubsztitució jön létre a II. és IV. transzmembrán szakasz szekvenciájában, L típusú feszültség függő Ca2+ csatornákat nyit meg a sejtmembránban, amely egy lassúbb mechanizmus (Chatterjee és mtsai, 1996). Ez a mechanizmus hypophysis mellső lebenyből LH kidobást aktivál (6. ábra). A VPAC1 a PACAP-ot és a VIP-et azonos affinitással köti. Valójában ez a VPAC1 azonos a klasszikus VIP receptorral (Usdin és mtsai, 1994). A VPAC1 egy Ca2+ dependens
8
4.5.6.ábra
9
intracelluláris Ca2+ növelő folyamatot aktivál, amely feltehetőleg nem a phospholipaseC kaszkádot veszi igénybe (Rawlings és mtsai, 1993, Sreedharan és mtsai, 1994, Journot és mtsai, 1995). A VPAC2 receptoron a PACAP nem VIP-vel, hanem heloderminnel osztozik (Sreedharan és mtsai, 1993, Couvineau és mtsai, 1994, Usdin és mtsai, 1994, Adamou és mtsai, 1995). A PAC1 receptornak ismert szelektív agonistája a Maxadilan, egy természetes peptid, amelyet a Lutzomyia longipalpis, hétköznapi nevén homoki légy nyálmirigyéből vontak ki (Moro és Lerner, 1997). Agonistaként ismert a C-terminálison rövidebb P23, P24, P25, P26 (Gourlet és mtsai, 1996). Az első öt aminosav elhagyása antagonistát eredményez. Ez a P6-38 (Robberecht és mtsai, 1992). PAC1 receptor antagonista továbbá a Maxadilan 65 (M65) (Fizzane és mtsai, 2004). Mindkét VPAC receptor agonistája az egy aminosavval szubsztituált VIP (Gozes és mtsai, 1995). A PACAP C-terminálison rövidebb formái közül a P23, P24, P25, P26 agonistája a VPAC1 receptornak, míg a VPAC2 receptornak csupán a P25 és P26 (Gourlet és mtsai, 1996). VPAC1 szelektív agonistája az N-terminálison rövidebb VIP4-28 (Summers és mtsai, 2003) és a P6-30, P6-32, P6-38 (Gourlet és mtsai, 1995). VPAC2 receptor szelektív agonistája a P3-32 (Gourlet és mtsai, 1995) és egy ciklikus peptid a Ro53-1553 (Xia és mtsai, 1997). A VPAC receptorok nem specifikus kompetitív antagonistája a szintetikus 4Cl – D - Phe6, Leu17 - VIP (Pandol és mtsai, 1986) és a VIP10-28 (Turner és mtsai, 1986). A VPAC receptorok antagonistája MetHybrid, Neurotensin6-11-VIP7-28 (Gozes és mtsai, 1995). VPAC1 receptor antagonista a PG97-269 (Fizzane és mtsai, 2004). VPAC2 receptor antagonista az N-terminálison rövidebb VIP4-28 (Summers és mtsai, 2003) és az N-terminálison rövidebb P6-38 (Fizzane és mtsai, 2004). A PACAP receptorok széles eloszlást mutatnak a szervezetben. A kölünböző receptorok
az
egyes
szervekben
más-más
arányban
vannak
jelen.
Magas
koncentrációban lehet kimutatni PAC1 receptort az agyban (Masuo és mtsai, 1991), az adenohypophysisben (Vígh és mtsai, 1993), a mellékvesevelőben (Shivers és mtsai, 1991), a testisben, az ovariumban és a pancreasban (Usdin és mtsai, 1994). A receptor mRNA legnagyobb mennyiségben a cortex cerebriben (Masuo és mtsai, 1991), a cortex cerebelliben, a hippocampusban, a bulbus olfactoriusban, a gyrus dentatusban, az area postremaban és a nucleus supraopticusban expresszálódik (Shioda és mtsai, 1997). A
10
VPAC1 receptor a központi idegrendszer mellett megtalálható a tüdőben (Lam és mtsai, 1990), a májban (Usdin és mtsai, 1994), a thymusban (Waschek és mtsai, 1995), a mellékvesevelőben (Usdin és mtsai, 1994) és a gasztrointesztinális traktusban (Gottschall és mtsai, 1990). VPAC1 receptor mRNA legnagyobb mennyiségben a cortex cerebelliben, a hippocampusban, a bulbus olfactoriusban, a gyrus dentatusban, az area postremaban és a nucleus supraopticusban expresszálódik (Shioda és mtsai, 1997). VPAC2 receptor mRNA teljesen más eloszlást mutat, és feltehetőleg kiegészíti a VPAC1 receptor eloszlását. VPAC2 receptor mRNA van a thalamusban, a nucleus suprachiasmaticusban, a nucleus amygdalae centralisban és a nuclei pontisban (Usdin és mtsai, 1994, Sheward és mtsai, 1995). A periférián VPAC2 receptor mRNA található a szívben (Adamou és mtsai, 1995), a tüdőben (Lam és mtsai, 1990), a pancreasban, az adenohypophysisben, az ovariumban és a gasztrointesztinális traktusban (Usdin és mtsai, 1994). A PACAP sorsa receptorhoz való kötődés után A PACAP más ligandhoz hasonlóan a sejt felszínén lévő receptorhoz kötődik, majd a receptorhoz való kötődés után azzal együtt internalizálódik. Ez a folyamat az endocytosis. A receptor-ligand interakcióban a PACAP receptor C-terminalis végén található 416-419-es pozicióban lévő négy aminosav, arginin, serin, tyrosin és lysin játszanak alapvető szerepet (Pisegna és mtsai, 2000). Arra vonatkozóan, hogy mi történik a felesleges PACAP-pal az extracelluláris térben, nincsenek kísérleti adatok. A receptort tartalmazó sejt felszínén lévő peptidázok valószínüleg lebontják. A legjobban tanulmányozott lebontó enzim a neutralis endopeptidáz (lásd Böhm és mtsai, 1997). PACAP sejten belüli sorsára vonatkozóan szintén nincsenek kísérleti adatok. Valószínűleg hasonló a sorsa, mint más receptorral együtt internalizálódott ligandnak. A receptor foszforilálódik, majd clathrin és β-arrestin közbejöttével endosomába kerül. Endosomalis acidificatio választja le a ligandot a receptorról. A receptor recirkulál, újra kiül a sejtfelszínre, a ligand pedig lysosomában degradálódik (lásd Trowbridge és mtsai, 1993). A PACAP eloszlása
11
A PACAP megtalálható a központi és perifériás idegrendszerben és a szervezet más szöveteiben is. A PACAP eloszlását vizsgálták idegi és nem idegi elemekben. Az eredmények azt mutatják, hogy a PACAP szinte mindenhol megtalálható a szervezetben. PACAP immunreaktivitást írtak le a hypothalamusban, ahonnan a peptidet izolálták, és számos más extrahypothalamikus struktúrában: a septumban, a hippocampusban, habenulában, az amygdalaban, a thalamusban, különböző kérgi területeken és néhány agytörzsi struktúrában is (Köves és mtsai, 1990, 1991, Piggins és mtsai, 1996, Hannibal és mtsai, 1995, Légrádi és mtsai, 1994, Palkovits és mtsai, 1995, Kausz és mtsai, 1999) (7. ábra). A peptid azonban nemcsak a központi, de a perifériás idegrendszerben is jelen van. PACAP immunreaktív idegrostok mutathatók ki a gasztrointesztinális rendszerben is, a lamina propriaban, a tunica submucosaban, a lamina muscularis mucosaeban és a tunica muscularis externában (Sundler és mtsai, 1992, Köves és mtsai, 1993) (8. ábra). PACAP pozitív sejtek mutathatók ki a gyomor és a vékonybél plexus myentericusában (Portbury és mtsai, 1995). A reproduktív szervek simaizomzatában PACAP immunreaktív rostok találhatók (Fahrenkrug és mtsai, 1996). A pancreasban mind az exokrin (Köves és mstai, 1993), mind az endokrin részben található PACAP immunreaktivitás (Filipsson és mtsai, 1998). Az exokrin mirigyek között PACAP immunreaktív idegrostok találhatók (Fridolf és mtsai, 1992), míg a Langerhans szigetekben a β-sejtek PACAP immunpozitívak (Yada és mtsai, 1996). A nyálmirigyekben (Hauser-Kronberger és mtsai, 1992) és a fog pulpában (Ichikawa és mtsai, 2003) is mutattak ki PACAP immunreaktív rostokat. Ezzel összhangban PACAP immunreaktivitás látható a primer érző ganglionokban, így a ganglion trigeminale és a ganglion spinale idegsejtjeiben is (Moller és mtsai, 1993, Kausz és mtsai, 1998) (8. ábra). PACAP immunreaktív rostok figyelhetők meg a perifériás szervek (húgyhólyag falában: Moller és mtsai, 1993, bélfalban: Köves és mtsai, 1993) és a központi idegrendszer ereinek falában (Baeres és Moller, 2004) (8. ábra).
12
7. ábra
13
8. ábra
14
A perifériás idegrendszerben a VIP és a PACAP gyakran koexpresszálódik ugyanabban a sejtben (Sundler és mtsai, 1992); azonban a hypothalamusban nincs koexpresszió a VIP és PACAP között (Vereczki és mtsai, 2003). Ez a morfológiai megfigyelés is arra utal, hogy a két peptidnek egymástól eltérő a szerepe a központi idegrendszerben. A PACAP legnagyobb koncentrációban a hypothalamusban mutatható ki (Arimura és mtsai, 1991). Birkában PACAP pozitivitás figyelhető meg a nucleus supraopticusban és a nucleus paraventricularisban (Köves és mtsai, 1990). A PACAP immunreaktív rostok részben az eminentia mediana zona externájában, részben az eminentia mediana zona internán átfutva a hypophysis hátsó lebenyében végződnek. Ugyanezeket figyelték meg pókmajom és ember idegrendszerében is (Vígh és mtsai, 1991). Intakt patkányban a PACAP alig festhető a hypothalamusban, azonban kolhicin kezelés, hypophysectomia, vagy hypophysis nyélátmetszés után intenzív PACAP festés figyelhető meg a nucleus supraopticusban és nucleus paraventricularisban, a commissura anterior magjában és a nucleus periventricularis anteriorban (Köves és mtsai, 1994) (9. ábra). PACAP neuronok patkányban a nucleus paraventricularis magnocellularis részének ventralis és periventricularis sejtcsoportjában vannak. Egy retrograd tracer, a Fast Blue intraperitonealis beadása után a központi idegrendszer azon részein, ahol hiányzik a vér-agy gát, ilyenek az eminentia mediana zona externájának kapilláris hurkai és a hypophysis hátsó lebenyének erei, idegrostok felveszik és a sejttestjük felé szállítják a tracert. Intakt állatban mind a hátsó lebenybe belépő magno-, mind az eminentia mediana kapillaris hurkai körül végződő parvocelluláris sejtek perikaryonja jelölődnek. Ha pengebeültetéssel a hypophysis nyélen át megakadályozták a tracer bejutását a hátsó lebeny felöl, akkor csak hypophyseotroph neuronok jelölődtek. Ezek között voltak olyanok, amelyek PACAP immunreaktivitást mutattak, azaz hypophyseotrophok. Ezek az eminentia medianaban végződő PACAP tartalmú rostok patkányban csak speciális körülmények között tartalmaznak annyi PACAP-ot, ami immunfestéshez elegendő, például kolhicin kezelés, hypophysectomia (10. ábra), nyélátmetszés vagy szemeltávolítás után.
A kolhicin kezelés, hypophysectomia és
nyélátmetszés az ürülést gátolja, míg szemeltávolítás után a termelt PACAP mennyisége nő.
15
9. ábra Hypothalamus SO, PV
16
10. ábra EM
17
A PACAP valóban ürül a portalis kapillárisokba, mert Dow és munkatársai (1994) kimutatták, hogy a PACAP koncentrációja magasabb a hypophysis portális vérben, mint az általános keringésben. A fenti adatok arra utalnak, hogy a hypothalamikus PACAP nemcsak a hypophysis hátsó lebenyében szabadulhat fel, hanem elérheti a mellső lebenyt, és résztvesz annak szabályozásában is. RT-PCR és immunhisztokémiai módszer segítségével tett megfigyelések arra utalnak, hogy számos más neuropeptid mellett a PACAP is szintetizálódik az adenohypophysisben. Radleff-Schlimme és munkatársai (1998) RT-PCR technika segítségével PACAP gén expressziót találtak hypophysis mellső lebenyében (11. ábra). Köves és munkatársai (1998) immunhisztokémiai festéssel hím és a ciklus prooestrus stádiumában lévő nőstény patkányban az adenohypophysisben kerek és ovális PACAP immunreaktív sejteket figyeltek meg. A sejtek eloszlása jellegzetes volt. Legnagyobb számban a mellső lebeny úgynevezett gonadotroph zónájában voltak megfigyelhetők. A PACAP pozitív sejtek eloszlása hasonló volt a gonadotroph sejtek eloszlásához, de az utóbbiak nagyobb számban fordultak elő. Kettős festést alkalmazva a PACAP immunreaktivitás sok esetben LH illetve folliculus stimuláló hormon (FSH) immunreaktivitással kolokalizált (12. ábra). A PACAP megtalálható az endokrin rendszer más szerveiben is. Patkány testisben PACAP immunreaktivitás a fejlődő ivarsejtekben figyelhető meg (Shioda és mtsai, 1994), a kifejlett spermiumban nem; nőstényben, az ovariumban a PACAP immunreaktivitás a preovulációs follikulus granulosa sejtjeiben van jelen, ahol in situ hibridizációs módszerrel is kimutatták (Gräs és mtsai, 1996), tehát csak átmenetileg expresszálódik. PACAP található a pancreas Langerhans-sziget β-sejtjeiben (Yada és mtsai, 1996), a mellékpajzsmirigyben (Luts és Sundler, 1994) és a mellékvesevelő chromaffin sejtjeiben (Frödin és mtsai, 1995). A PACAP biológiai hatása A PACAP biológiai hatása nagyon sok féle: neuroendokrin hormon, neurotranszmitter és neuromodulátor, neuroprotektív faktor és fejlődést befolyásoló, trophicus faktor. 11.ábra
18
19
12. ábra
20
Munkám a PACAP hypophysis mellső lebenyben játszott szerepével foglalkozik, ezért csak neuroendokrin szerepére vonatkozó kísérleti adatokat tekintem át részletesen. A PACAP a központi idegrendszerben legnagyobb mennyiségben a hypothalamus magnocelluláris magvaiban található, ahol a PACAP immunreaktivitás részleges kolokalizációt mutat arginin vasopressin (Takahashi és mtsai, 1994) és oxytocin immunreaktivitással (Köves és mtsai, 1994). Miután az oxytocin és a vasopressin egymással nem kolokalizál (Dierickx és mtsai, 1979), az oxytocin vagy vasopressin tartalmú PACAP sejtek külön sejtpopulációt képeznek. A nucleus supraopticusba és a nucleus paraventricularisba adott PACAP fokozza a neuronok kisülésének gyakoriságát, és membrán depolarizációt idéz elő (Uchimura és mtsai, 1996). A magból a PACAP immunreaktív rostok, mint tractus supraopticoparaventriculo-hypophyseos, az eminentia mediana zona internáján keresztül a hypophysis hátsó lebenyébe lépnek. 1995-ben Murase és munkatársai leírták, hogy az icv adott PACAP serkentette a vasopressin, de nem befolyásolta az oxytocin kidobást. Azonban férfiban, iv infúzióban adva fokozta a vasopressin szekréciót, de az oxytocin elválasztást nem befolyásolta (Chiodera és mtsai, 1995). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a PACAP részt vesz a hátsó lebeny működésének szabályozásában. A PACAP egy lehetséges hypophyseotroph faktor. A hypothalamusban termelt PACAP az eminentia mediana zona externáján át bejuthat a hypophysis portális keringésébe, és így a hypophysis mellső lebenyében endokrin módon befolyásolhatja annak működését. A PACAP megfelel a klasszikus kritériumoknak, amely szerint hypophyseotroph faktornak lehet nevezni. 1. PACAP mutatható ki a portalis erek körül található idegvégződésekben az eminentia mediana zona externájában (Köves és mtsai, 1991) (10. ábra). 2. A PACAP koncentrációja magasabb a hypophysis portalis vérben, mint az általános keringésben (Dow és mtsai, 1994). 3. Magas affinitású PACAP receptorok találhatók az adenohypophysisben (Gotschall és mtsai, 1990, Vígh és mtsai, 1993, Rawlings és mtsai, 1996). 4. PACAP adenohypophysis sejtkultúrából hormon kidobást eredményez (Miyata és mtsai, 1989, Tsujii és mtsai, 1994). 5. A PACAP hiánya befolyásolja a hypophysis mellső lebeny működését. Elsősorban súlyos metabolikus és hőszabályozási zavart eredményez. Olyan egér populációban,
21
amelyek megérik az ivarérett kort, az ovuláció előfordulási aránya a kontroll állatokhoz képest csökkent (Sherwood és mtsai, 2005). Miután a PACAP szintetizálódik a hypothalamo-hypophysealis-gonad tengely mindhárom szintjén, ezért nyilvánvaló, hogy szerepet játszik a rendszer működésében. Szabályozó szerepét in vivo és in vitro kísérletek támasztják alá. In vivo hím patkányokban a P38 icv adminisztrációja, vagy iv adott infúziója növelte a plazma LH szintet (Osuga és mtsai, 1992, Leonhardt és mtsai, 1992). Ovariektomizált birkában az icv bejuttatott P38 csökkentette az LH pulzusok amplitúdóját és frekvenciáját (Sawangjaroen és Curlewis, 1994), és patkányban a prooestrus délutánján az un. „kritikus periódus" előtt, amikor az idegrendszer felkészül a fokozott GnRH kidobásra, az icv adott P38 gátolta a másnap esedékes ovulációt, míg iv adva nem befolyásolta azt (Köves és mtsai, 1996). Ez utóbbi megfigyelés arra utal, hogy a PACAP LH surge gátló hatását nem a hypophysis szintjén, hanem a hypothalamuson át fejti ki. Ezt a gátló hatást corticotroph hormon releasing hormon (CRF) és endogén opioidok közvetítik, mert CRF antagonista és naloxon a gátló hatást jelentős mértékben visszafordította (Kántor és mtsai, 2001). Férfiban a PACAP iv infúziója nem befolyásolta az LH illetve az FSH szintet (Hammond és mtsai, 1993). A fenti in vivo kísérletek arra utalnak, hogy a PACAP hatása függ a fajtól, a nemtől és a beadás módjától (1. táblázat).
Beadott Beadás Faj és nem Válaszreakció Anyag módja ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ P38 icv hím patkány LH pl⇑ P38 iv hím patkány LH pl⇑ P38 icv ovx birka LH f,a⇓ P38 icv (pro) patkány ovuláció⇓ P38 iv (pro) patkány ovuláció∅ P38 iv férfi LH pl∅
1. táblázat. A PACAP in vivo hatása az LH szekrécióra és az ovulációra különböző speciesekben intracerebroventricularis (icv) és intravénás (iv) beadás után. ovx = ovariektomizált; pro = prooestrus stádiumban lévő állat; pl = plazma; f = frekvencia; a = amplitúdó; ∅ = nincs válasz; ⇑ = emelkedés; ⇓ = csökkenés.
22
A PACAP in vitro primer hypophysis mellső lebeny sejtkultúrában gyengén stimulálta az LH és FSH kidobását (Ortman és mtsai, 1999), GnRH-val együtt adva, potenciálta annak hatását gonadotroph sejtvonalon (Culler és Paschall, 1991). Négy órás oestradiol kezelés tovább fokozta mind a basalis, mind a GnRH vagy PACAP stimulált LH kidobást. Progesteron még tovább növelte az oestradiol hatását. Ha a hypophysis sejteket hosszú idejű oestradiol és progesteron hatásnak tették ki, a sejtek GnRH-ra és PACAP-ra adott LH válasza csökkent (Ortman és mtsai, 1999). Fenti szerzők azt is vizsgálták, hogy milyen second messenger mechanizmus vesz részt ezekben az interakciókban. A rövid idejű oestradiol növelte a cAMP accumulatiot mind a GnRH stimulált, mind a nem válaszoló LH sejtekben. Ugyanakkor a hosszú idejű oestradiol kezelés a PACAP stimulált cAMP produkciót gátolta. Míg más szerzők munkájából ismert, hogy a GnRH az LH releaset foszfatidil inozitol rendszeren keresztül serkenti, a PACAP L típusú feszültség függő Ca2+ csatornát megnyitva fokozza az LH kidobást. Míg in vitro gonadotroph sejttenyészetben a PACAP potenciálta a GnRH hatását az LH kidobásra (Culler és Paschall, 1991), addig perifúziós rendszerben a PACAP egyszeri alkalommal megnövelte a hypophysis mellső lebeny sejtek LH szekréciójának amplitúdóját, ezt követően az LH basalis szintre esett vissza, a sejtek rezisztensé váltak PACAP iránt. Hasonló válaszreakciót kaptak állandó GnRH adás esetén. Mediumban állandóan jelenlévő PACAP növelte a pulzálisan adott GnRH előidézte LH szekréció amplitúdóját (Tsujii és mtsai, 1994). A 2. táblázat összefoglalja a PACAP hatását a hypophysis mellső lebeny gonadotroph sejtjeinek LH szekréciójára in vitro rendszerekben: primér sztatikus sejtkultúrában és dinamikus perifúziós rendszerben. Sztatikus kultúrában a PACAP, az oestrogen és a progesteron potenciálták a GnRH hatását rövid idejű tenyésztés esetén, míg ha hosszabb ideig történt a kezelés, akkor ezek a hormonok gátló hatásúak voltak. Perfúziós rendszerben a PACAP és a GnRH hatása függ attól, hogy a perfúziós folyadékban állandóan vagy impulzusokban vannak jelen ezek a hormonok.
Beadott anyag és
In vitro modell
a beadás módja
23
Válaszreakció
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ P38 GnRH E P ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ ª primer sejtkultúra LH secr. ⇑ ª ª primer sejtkultúra LH secr. ⇑⇑ ª ª ª 4h primer sejtkultúra LH secr. ⇑⇑⇑ ª ª ª ª 4h primer sejtkultúra LH secr. ⇑⇑⇑⇑ ª ª ª ª hossz primer sejtkultúra LH secr. ⇓ ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ ª pulz perifúziós rendszer LH a ⇑ ª áll perifúziós rendszer LH a ∅ ª áll ª pulz perifúziós rendszer LH a ⇑
2. táblázat. A PACAP hatása az LH szekrécióra in vitro modellben (primer sejtkultúrában és perifúziós rendszerben). Pulz = pulzatilis adagolás; áll = PACAP vagy GnRH állandó koncentrációban található az átfolyó mediumban; 4h = 4 órás oestrogen és oestrogen-progesteron kezelés; hossz = oestrogen és progesteron hosszan tartó jelenléte a mediumban; a = amplitúdó; secr. = szekréció; ∅ = nincs változás; ⇑ = LH emelkedése; ⇓ = LH csökkenése.
KÍSÉRLET CÉLJA Az irodalmi adatokból egyértelmű, hogy a PACAP mind hím, mind nőstény patkányban szintetizálódik a hypothalamo-hypophysealis-gonad tengely minden szintjén,
azonban
expresszióját
számos
tényező
befolyásolja.
A
központi
idegrendszerben mennyisége változik a kísérleti állatok korától és a megvilágítási viszonyoktól függően. Patkányban az ontogenezis során mennyisége növekszik a második hónap végéig, majd szintje a későbbiekben konstanssá válik (Masuo és mtsai, 1994). A fény-sötét periódustól függően is változást mutat a PACAP szint. Patkány nucleus suprachiasmaticusában (Fukuhara és mtsai, 1997), és csirke agytörzsében és közti agyában (Józsa és mtsai, 2001) koncentrációja magasabb a sötét, mint a világos periódusban. Cell immunoblot assay (CIBA) és sandwich enzyme immunoassay (S-EIA) segítségével a következő kérdésekre kerestük a választ: 1. A PACAP ürül-e in vitro a hypophysis mellső lebeny sejtekből?
24
2. Ha igen, a PACAP-ot milyen sejtek ürítik. 3. A PACAP S-EIA segítségével mérve milyen értéket mutat a mellső lebenyben fiziológiás körülmények között? 4. A PACAP ürítés in vitro függ-e a nemtől, nőstényben a ciklus stádiumtól és függ-e a napszaktól, amikor az állatokat feláldoztuk? 5. Az LH ürítés in vitro függ-e a nemtől, nőstényben a ciklus stádiumtól és a napszaktól, amikor az állatokat feláldoztuk? 6. A PACAP in vitro befolyásolja-e a gonadotroph sejtek LH ürítését, és a gonadotroph sejtek PACAP iránti érzékenysége függ-e a nemtől, nőstényben a ciklus stádiumtól és a napszaktól, amikor az állatokat feláldoztuk? 7. A PACAP in vitro milyen koncentrációban befolyásolja a gonadotroph sejtek LH ürítését, és ez a koncentráció közel áll-e a fiziológiás mennyiséghez?
ANYAG ÉS MÓDSZER Állatok Kísérleteinket 3-4 hónapos Sprague-Dawley (CRL:CD) patkányokon végeztük. Az állatokat 22±2°C-on tartottuk, konstans fényviszonyok között (világos periódus: 519 óráig). A ciklus prooestrus és dioestrus stádiumában lévő nőstény és hím patkányokat használtunk a kísérleteinkhez. A nőstény patkányok ciklus stádiumát hüvelykenet alapján határoztuk meg. A kísérleti állatoktól naponta kenetet vettünk. A kenetet metilén kékkel megfestettük, és megvizsgáltuk a citológiai képet. Csak azokat az állatokat használtuk, amelyek két egymást követő szabályos négy napos ciklust mutattak. A hím patkányokat random módon választottuk ki. Az állatokat a 1986-os strasbourgi a kísérleti és más tudományos célokra használt gerinces állatok védelmére megalakult európai egyezmény szabályai szerint kezeltük (Engedély szám: 27-37/99). Cell Immunoblot Assay (CIBA)
25
Sejttenyésztés: A kísérleti állatok hypophysisét CIBA segítségével dolgoztuk fel (Arita, 1993; és Cimini, 1994, Nemeskéri által módosítva). Az állatokat dekapitációval öltük meg, a hypophysiseket steril körülmények között azonnal kivettük és minimal essential mediumban (GIBCO EUROPE-Cat No 072-1800) többször átmosva sztereomikroszkóp alatt szabályos darabokra vágtuk. Spinner flaskába (Bellco-Cat No 1967-00025) kimért 10 ml 0.11% trypsines (Sigma-T4799) és 0,1% bovine serum albumint (Sigma-A8551) tartalmazó minimal essential mediumba helyeztük a hypophysis darabokat lekerekített végű Pasteur-pipettával. Ez után 37oC-on Penicillin-Streptomycin jelenlétében inkubáltuk vigyázva, hogy önálló sejteket kapjunk, de azok épek maradjanak. Egy 2-3 hónapos állat esetében ez körülbelül kétszer 15 perc. Az inkubáció alatt két alkalommal 5% CO2 – 95% levegő keverékével dúsítottuk és 50-50 alkalommal, Pasteur pipettával agitáltuk. A sejt szuszpenziót centrifugáltuk 1000-es fordulatszámon 37oC-on 10 perc alatt. A felülúszót leöntöttük. Szeparálás után a sejteket haemocytometerben megfestettük. A trypánkéket élő sejtek nem veszik fel. Impermeábilisak a festékkel szemben (Freshney, 1994). Néhány sejt mutatott festést, becslésünk szerint a sejtek 95 %-a szeparálás után élt. A sejt szuszpenziót annyira higítottuk fel Dulbecco's Modified Eagle's Mediummal (GIBCO BRL-Cat No 13016-0199), hogy minden 15μl-nyi cseppben 7000 sejt legyen. Kis méretű egyszer használatos steril Petri-csészékbe (Greiner Labortechnik-35/10mm) steril rozsdamentes rácsokat helyeztünk, amelyekre 5X5 mm-es "supported" nitrocellulóz membránokat (BIO-RAD Laboratories) tettünk. A Petri-csészébe 650μl Dulbecco's Modified Eagle's Mediumot, a membránokra 15μl-nyi szuszpenziót helyeztünk. A sejteket 22 óráig tenyésztettük 37oC-on 5% CO2 -95% levegő jelenlétében. A tenyésztési idő alatt a sejtek által ürített hormont és peptideket a nitrocellulóz membrán megkötötte, amelyeket immunfestéssel tettünk láthatóvá (13. ábra).
26
13. ábra. Nitrocellulóz membránok rozsdamentes rácsokon. Immuncitokémia: A tenyésztés után a membránokat 4%-os paraformaldehid oldatban (pH 7,4) fixáltuk, átmostuk 1% Tween-t tartalmazó Tris pufferrel, majd 10%-os bovine serum albuminnal. Ezt követően hozzáadtuk az LHβ (1:10000) illetve PACAP (1:6000) ellenanyagot. Az LHβ ellenanyag tengerimalacban készült (NIDDK-NHPP, University of
Maryland,
Baltimore).
A
PACAP
ellenanyag
nyúlban
készült
Arimura
laboratóriumában, ott történt az ellenanyag jellemzése is (Köves és mtsai, 1990, 1991). Az ellenanyag felismeri mind a PACAP38-t, mind a PACAP27-et. A PACAP illetve az LH ellenanyaggal történt inkubálás után a következő napon ismét átmostuk a membránokat 0,1M foszfát pufferrel, majd rátettük a biotinált tengerimalac illetve nyúl immunglobulin ellen termelt ellenanyagot (Vectastain ABC kit, Vector). Másnap ismét átmostuk a membránokat 0,1M foszfát pufferrel és tovább inkubáltuk avidin-biotinperoxidáz komplex-el. Az ellenanyag kötés helyét diaminobenzidin tetrahidrochlorid (DAB) és H2O2 segítségével vagy fluoreszcens festéssel tettük láthatóvá. A kettős festés esetén a PACAP-ot ABC technikával, az LH-t indirekt immunfluoreszcens festéssel és fluoreszcens izotiocianát konjugátummal tettük láthatóvá. Ebben az esetben az LHβ ellenanyag hígítása 1:500 volt.
27
Az ellenanyagok specificitását LH illetve PACAP-al történő kimerítés után hypophysis metszetekben ellenőriztük. A specificitás teszteléséhez paraformaldehid perfúzióval előzetesen fixált patkányok hypophysisét használtuk. A hypophysiseket szukróz oldattal kezeltük (30% cukor foszfát pufferben), majd 20 μm vastag fagyasztott metszeteket készítettünk. Az 1:6000-es munkahígítású PACAP antiszérumot 50 μg PACAP38-cal, az 1:10000-es hígítású LH ellenanyagot 10 μg LH-val előinkubáltuk a festést megelőző napon. Háttérblokkolás után a festéseket hasonló módon végeztük, mint a membránok esetében. Az ellenanyagokat akkor fogadtuk el specifikusnak, ha a kimerített, azaz a megfelelő peptiddel előinkubált ellenanyaggal nem kaptunk festést, ugyanakkor a kimerítetlen szérum specifikusan festett. A 14. ábra A része PACAP immunfestést mutat, míg B része parallel metszeten a kimerített szérummal történő festést mutatja be. Ezen a metszeten festést nem kaptunk.
28
Sandwich Enzyme Immunoassay (S-EIA) Tizenöt hím állatot délelőtt 10h-kor dekapitációval megöltünk, a hypophysiseket azonnak eltávolítottuk. A mellső lebenyeket steril körülmények között szeparáltuk, megmértük és szárazjégen megfagyasztottuk, -70°C-on tároltuk, a S-EIA előtt felengedtük, hármasával pooloztuk és homogenizáltuk (Ultrasonic Homogenizer, Chicago) trifluoroecetsavban. A homogenizált hypophysis mellső lebenyeket 12000-es fordulatszámon 20 percig 4°C-on centrifugáltuk. A felülúszót speedvac-kel szárítottuk, lemostuk, és ismét szárítottuk, hogy a trifluoroecetsavat eltávolítsuk. A hypophysisek PACAP38 tartalmát négy paralellben mértük. A PACAP-al kezelt gonadotroph sejttenyészetek tenyésztő médiumának PACAP38 koncentrációját az inkubálás után mértük. A mintákat és a standard peptidet (PACAP1-38) PA-6N monoklonális ellenanyaggal (PACAP38 N-terminális vége ellen termelt ellenanyag) bevont microtest ELISA lemezbe tettük és 96 óráig inkubáltuk 4oC-on. Ezt követően a lemezben lévő lyukakat 1% bovine serum albumint tartalmazó 0.02M-os foszfát pufferrel (pH7) mostuk. Az inkubációs idő végén a lemezt torma peroxidáz jelölt PA-2C monoklonális ellenanyaggal (PACAP38 C-terminális vége ellen termelt ellenanyag) kezeltük 24 órán át 4oC-on, majd foszfát pufferrel mostuk. A torma peroxidáz aktivitást TMB microwell peroxidáz rendszerrel mértük (Kirkegaad és Perry Laboratórium, USA). Az ellenanyagot Suzuki és munkatársai (1993) állították elő és karakterizálták,
és
bocsájtották a munkacsoport rendelkezésére. Képanalízis A kapott eredményeket képanalizáló program segítségével elemeztük. Minden egyes membránon 10-10 látóteret fényképeztünk le, majd az Image Pro Plus-0.4 program segítségével megmértük a blotok átmérőjét és területét, és megszámoltuk a blotokat. Az egyes csoportok adatait a Graphpad Prisma programban található unpaired t-test segítségével hasonlítottuk össze.
29
Kísérleti protokoll A kísérleti állatokat reggel 10, délután 16 és este 20 órakor öltük meg, az utóbbi két csoportot az LH surge elején és végén. Kísérletünkhöz hím, vagy prooestrus illetve dioestrus stádiumban lévő nőstény patkányokat használtunk. A membránok egy részét PACAP ellenanyaggal, a membránok másik részét LH ellenanyaggal festettük meg, és az esetek egy részében kettős festést alkalmaztunk. Minden időpontban három kísérleti csoportunk volt. Minden csoportban 2 illetve 3 állat szerepelt. A membránok egy része kontrollként szolgált, másik részét 10-7M koncentrációjú PACAP38-al kezeltük, a PACAP-ot a membránok alá a tápfolyadékba helyeztük. A 3. táblázat mutatja a kísérleti csoportokat, a napszakot, amikor az állatokat feláldoztuk, a kezelés típusát, és az alkalmazott festési eljárást.
10h kontroll
16h 10-7PAC
20h
kontroll
10-7PAC
kontroll
10-7PAC
PRO
P, LH
LH
P, LH
LH
P, LH
LH
DI
P, LH
LH
P, LH
LH
P, LH
LH
HÍM
P, LH
LH
P, LH
LH
P, LH
LH
3. táblázat. Kísérleti protokoll. Rövidítések: 10-7PAC=10-7M PACAP koncentráció a tenyésztő médiumban, DI=dioestrus, LH=LH immunfestés, P=PACAP immunfestés, PRO=prooestrus
30
KÍSÉRLETI EREDMÉNYEK 1. Az LH blotokhoz hasonlóan PACAP blotok mindegyik időpontban megölt állat hypophysis mellső lebeny sejttenyészetében előfordultak. Az ürített PACAP-ot és LH-t a nitrocellulóz membránon az ürítő sejtek körül megfestett köralakú blot jelezte. Az egyes sejtek hormon termelésének különbözőségét a blotok eltérő átmérője jelzi (15. ábra). Az esetek egy részében a PACAP-ot illetve LH-t ürítő sejt látszik a blot közepében, az esetek többségében a sejt a blot közepén nem ismerhető fel. A nem ürítő sejtek kontúr vonala éles. Tenyészetben a sejtek sokszor elvesztik kerek, vagy ovoid alakjukat. A PACAP blotok átmérője azonos idejű tenyésztés esetén kisebb volt, mint az LH blotok átmérője, azaz azonos idejű (22 órás) tenyésztés alatt a sejtek kevesebb PACAP-ot ürítettek, mint LH-t. A prooestrus délelőttjén 10 órakor feláldozott nőstény patkány hypophysis tenyészetéből származó PACAP és LH blotok átmérőjét oszlopdiagramon ábrázoltuk (16. ábra). 2. A PACAP-ot ürítő sejtek részben gonadotroph sejtek. Kettős festéssel a PACAP és LH immunreaktivitás között sok esetben kolokalizációt figyeltünk meg. A 17. ábrán az LH immunreaktivitást indirekt immunfluoreszcens módszerrel festve zöld fluoreszcencia, a PACAP immunreaktivitást barna DAB reakció termék jelzi. Jól megfigyelhető az LH és PACAP blotok méretbeli különbsége. A PACAP sejtek egy része nem ürít 22 órás tenyésztés alatt sem, nem ürítő LH sejtet elvétve találtunk. Az ábra A része olyan sejtet mutat, amelyik PACAP-ot nem ürített, a DAB reakció éles kontúrja utal erre, míg ugyanaz a sejt LH-t ürített. Elmosódott szélű zöld fluorescenciát mutató blot utal az ürített LH-ra. Az ábra B része olyan sejtet mutat, amelyik PACAP-ot is, és LH-t is ürített. A PACAP blot átmérője jól láthatóan kisebb, mint az LH blot átmérője.
31
15. ábra PACAP és LH blotok szövettan 16. ábra PACAP és LH blotok Oszlopdiagramm
32
17. ábra Kettős festés Barna-zöld
33
3. A hypophysis mellső lebenyében jelenlévő PACAP fiziológiás koncentrációja nM nagyságrendű. Tizenöt hím állat hypophysiséből öt 3-3 hypophysisből álló pool-t képeztünk. Erre azért volt szükség, mert az egyedi hypophysisekben nagyon alacsony a PACAP mennyisége, és a mennyiségi meghatározáshoz használt S-EIA érzékenységi szintje alá esik. Három-három hypophysisből elvégzett mérés segítségével megállapítottuk, hogy a hypophysisekben a PACAP koncentrációja rendkívül alacsony, 10-9 és 10-10 M közé esik (18. ábra). 4. A különböző időpontokban kivett hypophysis mellső lebeny sejttenyészetekben a PACAP blotok száma és nagysága különbözött. Két-két állatból származó 6 nitrocellulóz membránon lévő összes blotot összeadtuk, és a különböző csoportok adatait összehasonlítottuk. Nőstény patkányokban prooestrusban magasabb volt a PACAP blotok száma, mint dioestrusban, ahol csak elvétve találtunk egy-egy blotot. A PACAP blotok száma feltűnően megnőtt azokban a tenyészetekben, amelyek a prooestrus napján este nyolc órakor kivett hypophysisekből származtak. A ciklusnak ebben a fázisában délelőtt 10 órakor és a délután 16 órakor megölt állatok hypophysis tenyészetében is több blot volt, mint dioestrusban, és voltak olyan sejtek, amelyek pozitívan festődtek, de nem ürítettek PACAP-ot, míg este 20 órakor ölve meg az állatokat a blotok száma sokszorosára nőtt, és számos PACAP pozitív sejtet láttunk, amelyek nem ürítettek PACAP-ot, de igen intenzíven festődtek (4. táblázat, 19. ábra). Hím állatokban a PACAP blotok száma nagyon alacsony volt. A délelőtt 10 és 16 órakor kivett hypophysisek tenyészetében hat és öt, a 20 órakor kivett hypophysisek tenyészetében tizenegy blot volt (4. táblázat, 19. ábra). 4. táblázat. PACAP blotok száma a különböző kísérleti csoportokban
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ ⎯⎯ Kísérleti csoportok Prooestrus Dioestrus Hím ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ 10h 16h 20h 10h 16h 20h 10h 16h 20h ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ Blotok száma 37 73 440 1 1 3 6 5 11
34
18. ábra S-EIA 19. ábra PACAP blot szám
35
A 19. ábra oszlopdiagramon mutatja be a PACAP blotok számában a prooestrus vagy dioestrus stádiumában megölt nőstények és hímek hypophysis tenyészetében megfigyelt és a 4. táblázatban bemutatott különbséget. Igaz, hogy ezek az adatok statisztikailag nem értékelhetők (miután minden oszlop egy értéket képvisel és nem átlag eredményt), azonban úgy tűnik, hogy a blotok száma mindegyik kísérleti csoportban este 20 órakor megölt állatok hypophysis tenyészetében magasabb, mint más időpontban kivett hypophysisek esetében. A 20. ábra fénymikroszkópos képen 20 órakor megölt prooestrus (A), dioestrus (B) stádiumában lévő nőstény és hím (C) patkány hypophysis sejttenyészetének PACAP immunfestett képét mutatja. Azért választottuk a szövettani kép bemutatására ezt az időpontot, mert a blotok száma, átmérője és területe ekkor volt a legmagasabb a ciklus mindkét stádiumában lévő nőstény és hím állatok esetében is. Az ürítő sejtek körüli blotok elmosódott kontúrúak, míg a nem ürítő sejtek kontúrvonala éles. Hímben nem ürítő sejtet elvétve láttunk. Dioestrus stádiumban feláldozott nőstény hypophysis tenyészetében ezek száma valamivel magasabb volt, míg prooestrusban történt ölés esetén ezek száma jelentősen megnőtt. Ugyanez a jelenség figyelhető meg a blotok esetében is. A prooestrus stádiumában megölt nőstények hypophysis tenyészetében a 10 órás és a 20 órás csoportban különbség nem volt a PACAP blotok átmérője és területe között (21. ábra), míg 16 órai tenyészetekben mindkét paraméter szignifikánsan kisebb volt. Dioestrus stádiumában kivett tenyészetekben 1, 1 és 3 blotot találtunk. Itt nem találtunk statisztikailag szignifikáns különbséget. Ez annak tudható be, hogy a blotok száma rendkívül alacsony volt. Hímekben az este kivett hypophysisek tenyészetében az alacsony számú 11 blot feltűnően nagy volt. Ezek szignifikánsan nagyobbak, mint a 10 és 16 órakor kivett hypophysisek tenyészetében, és ezek a blotok szignifikánsan nagyobbak voltak a prooestrus bármely időszakában megfigyelt blotoknál.
36
20. ábra PACAP blotok fénymikroszkópos képe: 20h pro-di-him
37
21. ábra PACAP blotok átmérője és területe minden időpontban pro-di-him
38
5. Minden csoportban sok LH blotot láttunk, azonban ezek nagysága és száma különbözött az egyes csoportokban. LH ürítés minden tenyészetben volt, de annak mértéke különbözött az egyes csoportokban. Az LH blotok száma minden kísérleti állatban, kivéve a prooestrus estéjét, sokkal magasabb volt, mint a PACAP blotok száma. Az egyes kísérleti csoportokban az LH blotok számát az 5. táblázat, az LH blotok átmérőjét és területét a 22. ábra oszlopdiagramon mutatja be. 5. táblázat. LH blotok száma a különböző kísérleti csoportokban
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ ⎯⎯ Kísérleti csoportok Prooestrus Dioestrus Hím ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ 10h 16h 20h 10h 16h 20h 10h 16h 20h ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ Blotok száma 115 147 47 126 52 98 79 57 75
Prooestrus stádiumában 10 és 16 órakor megölt nőstény állatok hypophysisének tenyészetében az ürítő és blotot képező LH sejtek száma magas volt, ez a szám jelentősen csökkent estére, a lezajlott LH surget követően. Dioestrus reggelén a prooestrus reggeléhez hasonlóan magas blot számot találtunk, azonban a blotok szignifikánsan kissebbek voltak, míg a 16 órakor kivett hypophysis tenyészetekben alacsony blotszám mellett a blotok nagysága kicsit magasabb volt, de a prooestrusos szintet nem érte el. Feltűnően megnőtt a blotok átmérője és területe dioestrusos állatok esti tenyészetében. A különbség elérte, sőt szignifikánsan meg is haladta a prooestrusra jellemző nagyságot. Hímekben a hormont ürítő sejtek száma reggel 10 és este 20 órakor magasabb volt, mint délután 16 órakor, amikor az ürítő sejtek száma 57-re csökkent. A ürítő sejtek által képezett LH blotok átmérője és területe reggel 10 és este 20 órakor közel azonos volt, míg az LH blotok szinte tűszúrásnyian picik voltak délután 16 órakor. A 10 és 20 órakor mért blotok átmérője és területe közötti különbség nem volt szignifikáns, azonban a 16 órakor mért blotok átmérője és területe a reggel és este mért blotokéhoz képest szignifikáns különbséget mutatott (22. ábra).
39
22. ábra kezeletlen LH blotok him-nőstény
40
6. A PACAP kezelés a kivétel időpontjától függően befolyásolta az LH szekréciót. Ha a mellső lebenyek tenyésztését a 10-10 M koncentrációjú PACAP jelenlétében végeztük, az nem befolyásolta az LH szekréciót, ezért ezt a kezelést a későbbiekben nem alkalmaztuk. Nőstényekben 10-7 M koncentrációjú PACAP hozzáadása a médiumhoz különböző időpontokban más-más módon befolyásolta az LH szekrécióját (23. ábra, A, B, C, D) mind a prooestrus, mind a dioestrus stádiumában lévő állatokból származó tenyészetekben. Az ürítő sejtek száma a PACAP-al kezelt tenyészetekben délelőtt 10 órakor jóval alacsonyabb volt, mint a kezeletlen tenyészetekben, 16 és 20 órakor az ürítő sejtek száma ezzel szemben megnőtt a kontroll csoporthoz képest. Az LH blotok átmérője és területe prooestrusban délelőtt 10 órakor ellentétes irányú változást mutatott, a sejtek által képzett blotok szignifikánsan nagyobbak voltak a kezelt tenyészetekben a kezeletlenekhez képest, 16 és 20 órakor az egyedi sejtek által ürített hormon mennyisége nem különbözött. Dioestrusban délelőtt a blotok átmérője és területe szignifikánsan nőtt, ugyanakkor 16 és 20 órakor szignifikáns csökkenés volt megfigyelhető az LH ürítésben. Hímekben a PACAP kezelés a blotok számát nem befolyásolta, míg az egyedi sejtek hormon ürítése 10 és 20 órakor kivett tenyészetekben szignifikánsan csökkent (23. ábra, E, F). 7. A tenyésztő médiumhoz adott PACAP koncentrációtól függően befolyásolta a mellső lebeny sejtek LH ürítését. A tenyésztés végén a médiumban még jelenlévő PACAP mennyiségét S-EIA segítségével visszamértük. Azokban a tápfolyadékokban, ahol a PACAP-ot 10-7 M koncentrációban tettük a Petri-csészébe, 10-10 M koncentrációt tudtunk mérni (18. ábra). Ez a mennyiség a hypophysisekben mért mennyiséghez hasonló, tehát fiziológiásnak tekinthető. Azokban a tenyészetekben, ahol 10-10 M PACAP-ot adtunk a médiumhoz, a PACAP nem volt mérhető, és nem befolyásolta a sejtek LH ürítését.
41
23. ábra PACAP kezelés hatása LH secretiora
42
MEGBESZÉLÉS Az irodalmi adatok és kísérleti eredményeink is arra utalnak, hogy a PACAPnak
szerepe
van
a
hypothalamo-hypophysealis-gonad
tengely
működésének
szabályozásában (Köves és mtsai, 2003, Fahrenkrug és mtsai, 1996). Arra vonatkozóan vannak korábbi irodalmi adatok, hogy patkány ováriumban a PACAP átmenetileg expresszálódik, csak a preovulációs tüsző granulosa hámjában mutatható ki PACAP mRNA, a ciklus más stádiumában nem (Lee és mtsai, 1999, Ko és mtsai, 1999). Munkacsoportunk eredményei arra utalnak, hogy a PACAP nemcsak az ováriumban mutat ciklussal összefüggő változást, hanem a hypophysisben is. PACAP csak a prooestrus napján kivett nőstény patkány hypophysis mellső lebenyében festhető, a ciklus más stádiumában nem (Köves és mtsai, 1998). Eredményeink összhangban vannak Wuttke és munkatársai (1994) és Radleff-Schlimme és munkatársai (1998) RTPCR technikával nyert azon megfigyelésével, hogy a hypophysisben lévő PACAP mRNA mennyiségét az oestrogen emeli, és prooestrusban ezért van immunfestéshez elegendő PACAP, míg a ciklus más stádiumában nincs. Kísérleti munkánkban alkalmazott CIBA alkalmas néhány sejt hormonürítésének detektálására. Az egy sejt által ürített hormon mennyisége nagyon kicsi, azonban ezzel a technikával ilyen kis hormon mennyiség is felismerhető. Hypophysis mellső lebeny sejttenyészeteinkben a PACAP blotok száma és mérete szignifikánsan kisebb volt, mint az LH blotoké. Ez a megfigyelés arra utal, hogy a PACAP kisebb mennyiségben ürül, mint a hypophysisből a véráramba ürített, és távoli célszerven ható LH. Ennek alapján feltételezhető, hogy a hypophysisben termelt PACAP lokálisan, auto- és parakrin módon befolyásolja az LH sejtek GnRH-ra adott válaszreakcióját. A PACAP autokrin hatását már korábban is feltételezték RadleffSchlimme és munkatársai (1998). A kísérleti állatokat ismételt intravénás PACAP bolus injekciókkal kezelték, és azt tapasztalták, hogy ez a beavatkozás körülbelül hatszorosára növelte a PACAP génexpressziót a hypophysis mellső lebenyében. Feltételezték, hogy a PACAP-ot szintetizáló sejt membránján lévő PACAP-ra specifikus PAC1 receptoron keresztül befolyásolta saját expresszióját, mert a VIP nem befolyásolta a PACAP génexpressziót.
43
Ha a blotok számát és területét összeszorozzuk, információt kapunk a PACAP és az LH ürítés dinamizmusáról. A PACAP ürítés napi ritmusa jellegzetes. Mindegyik csoportban az este kivett hypophysisekben a legmagasabb. Ilyenkor az állatházban sötét van. Ez úgy tűnik, jó összhangban van munkacsoportunk korábbi megfigyelésével, hogy nagyon intenzíven festődő PACAP immunreaktív sejtek jelennek meg a hypophysis mellső lebenyében szemeltávolítás után három héttel olyan ciklus stádiumban is, amikor intakt állatban nem festhetők. Ha a ciklusos megvilágításban tartott nőstény patkányt prooestrus stádiumban 20 órakor, a lezajlott LH surge után áldozzuk fel, és vesszük ki a hypophysist tenyésztésre, akkor a PACAP-ot ürítő sejtek száma sokszorosára, 12-13szorosára nő, míg a dioestrusos nőstény patkányban és hímben még ilyenkor is alig található PACAP-ot ürítő sejt. Ebből a jelenségből azt a következtetést vontuk le, hogy a ciklusos nőstényben a prooestrus estéjén megfigyelt PACAP szint emelkedés sokkal inkább a hormonális miliőben bekövetkezett változásnak tudható be, mint a rövid idejű fényhiánynak. Ez az az időpont, este 20 óra, amikorra a prooestrus napján lezajlik az LH surge, és ezt követően az LH ürítés hosszabb-rövidebb idő után minimumra csökken. A 24. ábra a PACAP ürítés dinamizmusát mutatja be a különböző kísérleti csoportokban. Az LH ürítés dinamizmusa (25. ábra) világosan utal arra, hogy a prooestrus napján megölt állatok hypophysis gonadotroph sejtjei más információt kaptak in vivo, mint a dioestrus napján megölt nőstények, vagy hím állatok. Ez utóbbi két csoportban az LH ürítés dinamizmusa hasonló volt, míg prooestrusban egészen más mintázatot figyelhetünk meg. Az LH ürítés mértéke azokban a tenyészetekben, amelyekben a sejtek az LH surge lezajlása után, 20 órakor kivett hypophysisből származnak, jelentősen lecsökkent, jelezvén, hogy a sejtek kiürítették tartalmukat in vivo, míg a délelőtt és a surge előtt kivett tenyészetekben a sejtek jelentős tartalékkal rendelkeztek. Jól ismert tény, hogy az endokrin szervek ritmusosan műkdnek, circannularis, circadian és circhoralis ritmusokat mutatnak. A madarakból kivett corpus pineale in vitro superfúziós rendszerben is megtartotta melatonin szekréciójának circadián ritmusát (Csernus és Mess, 2003). Érdekes tény, hogy a 24 órás periódus nem szüntethető meg in vitro, de fáziseltolás elérhető, ha a környezeti megvilágítás fénysötét
periódusait
44
24. és 25. ábra
45
eltolják. A fény hullámhossza is befolyásolja a napi ritmust. Saját kísérleti anyagunkban a tenyésztés 37°C-on történt 22 órán át, végig sötét környezetben. Így a kapott értékeket a külső környezet azonos módon befolyásolta, a megfigyelt különbségek így, feltételezésünk szerint, a sejtek in vivo környezetből magukkal hozott, ott beíródott különböző információknak tudhatók be. A PACAP önmagában más, hypothalamusból származó, szabályozó faktor közbejötte nélkül is képes befolyásolni a gonadotroph sejtek LH ürítését. Eredményeink arra utalnak, hogy ez a hatás függ a kísérleti állat nemétől, a napszaktól, és nőstényben a ciklus stádiumtól, amikor a hypophysiseket kivettük tenyésztésre. A PACAP hatása a gonadotroph sejtek válaszkészségére szintén különbözik a kivétel időpontjától függően. A prooestrus stádiumában lévő nőstényekből reggel kivett hypophysis tenyészetben gátló hatású volt, csökkentette az össz-blotterületet, majd ezt követően stimulálta az LH ürítést a kezeletlen kontrollokhoz viszonyítva. Dioestrus stádiumban és hímben az LH blotok összterületét vizsgálva nem kaptunk értékelhető változást a PACAP kezelt tenyészetekben a kezeletlenekhez viszonyítva, aminek egyik oka, hogy ebben a két kísérleti csoportban nagyon alacsony a blotok száma, azaz az ürített hormon mennyisége. A PACAP felfedezése után két évvel Culler és Paschall (1991) leírták, hogy gonadotroph sejtvonalon a peptid potenciálja a GnRH hatását az LH szekrécióra. Hasonló megfigyelést tettek Tsujii és munkatársai (1994) perifúziós rendszerben. Egy francia munkacsoport (Lariviere és mtsai, 2005) az utóbbi évben felderítette, hogy a PACAP és a GnRH közti úgynevezett „cross-talk” az LH sejten belül zajlik. A GnRH hatását az LH szekrécióra a IP3/PKC second messenger mechanizmus közvetíti, míg a PACAP a cAMP/PKA keresztül fejti ki hatását. A két peptid együtt adásakor a sejten belül, a kétféle „second messenger” mechanizmus között „cross-talk” van. A PACAP hatása az LH szekrécióra, azaz stimuláló vagy gátló, a GnRH és a PACAP arányától függ. Vizsgálataink szerint valószínű, hogy in vivo a prooestrus estéjén emelkedő hypophysis PACAP szint a csökkenő GnRH szinttel együtt gátló hatású az LH kidobásra. Feltételezésünk szerint auto- és parakrin módon részt vesz az LH surge leállításában. In vitro vizsgálataink nem adnak felvilágosítást arra vonatkozóan, hogy a hypothalamusból származó PACAP miként vesz részt ebben a folyamatban.
46
Munkacsoportunk korábbi eredményei alapján (Köves és mtsai, 1996, Kántor és mtsai, 2000, Kántor és mtsai, 2001) valószínűnek tűnik, hogy a hypothalamikus PACAP hatása is függ nőstényben a ciklus stádiumtól. A prooestrus napján a kritikus periódus előtt intracerebroventricularisan adva az LH surge-t az esetek 70-75 %-ban gátolja, ezzel megakadályozva a másnap esedékes ovulációt. Intravénás adása nem befolyásolja az LH surge kialakulását. Tehát ezt a hatást más hypothalamikus faktorok közvetítik. Kísérleti eredményeink alapján levont következtetéseinket messzemenően támogatják Moore és munkatársainak (2005) pár hónappal ezelőtt tett megfigyelései, amelyek arra utalnak,
hogy
a
PACAP
mRNA
mennyisége
a
hypothalamikus
nucleus
paraventricularisban és a hypophysis mellső lebenyében az ovariális ciklussal összefüggő változást mutat. Laboratóriumukban alkalmazott megvilágítási körülmények között a prooestrusos LH surge csúcsa a kora délutáni órákra esik. Ezt előzi meg az GnRH kidobása a portális vérbe. A munkacsoport úgy találta, hogy a PACAP mRNA mennyisége a nucleus paraventricularisban déli 12 órakor a legmagasabb, majd az ún. kritikus periódus alatt lecsökken, ilyenkor lehetővé válik a GnRH fokozott kidobása, ami előidézi az LH surge-t. Ezt a megállapítást in situ hybridizatios módszer mennyiségi analízisére alapozták. A PACAP mRNA mennyiségének növekedése csak a ciklus
prooestrus
stádiumára,
és
csak
a
nucleus
paraventricularis
középső
szubdivíziójára jellemző. A PACAP expressziója a hypophysis mellső lebenyében is a ciklussal
összefüggő,
jellegzetes
változást
mutatott.
A
PACAP
mRNA
meghatározásokat RT-PCR technika segítségével végezték, az mRNA mennyiségét amplifikálták. A kapott eredmények arra utalnak, hogy a meta- és diooestrus alatti nagyon alacsony értékek tovább csökkennek az LH surge idejében, majd azt követően a prooestrus éjjelén az mRNA mennyisége nő és másnap az estrus reggelén újra alacsony. Közvetlenül ezt megelőzően a hypophysis mellső lebeny PACAP mRNA emelkedését követi a follistatin mRNA mennyiségének emelkedése, ami az FSH szelektív szupresszióját idézi elő. A PACAP sejtkultúrában a fiziológiáshoz közel álló mennyiségben képes befolyásolni az LH szekréciót. Tenyészeteinkben akkor értük el a fiziológiáshoz hasonló PACAP szintet, amikor a mediumhoz 10-7 M koncentrációban adtunk PACAP38-at. S-IEA segítségével csak 10-10 M koncentrációt tudtunk mérni a tenyésztési periódus végén. Valószínű oka ennek a jelenségnek, hogy a PACAP jelentős
47
része a Petri-csésze falához kötődött, és így jelentősen esett a medium PACAP koncentrációja. Ha a PACAP koncentrációja 10-10 M volt a tenyésztés kezdetén, akkor a tenyésztési idő végén a PACAP a rendelkezésünkre álló technika segítségével nem volt mérhető, a fiziológiás szint alá esett, és feltehetően ez volt az oka, hogy nem befolyásolta az LH szekréciót. Munkánkkal kapcsolatban felmerülhet a kérdés, miért választottunk 22 órás tenyésztési időt. A pécsi munkacsoport vizsgálatai arra utalnak, hogy a hypophysis sejtek releasing hormonokkal kezelve másodperceken belül ürítenek klasszikus hormonokat (Csernus és mtsai, 1994). Vizsgálatainkban elsősorban a PACAP ürítést vizsgáltuk, és ezzel parallel az LH ürítést. Technikánk alapvetően különbözik a superfúziós rendszertől. Az egy-egy sejt által ürített hormon mennyisége PACAP esetén nagyon kicsi, a több sejt által ürített hormon mennyisége nem adódik össze. A nitrocellulóz membran megköti a szekretált hormont a sejt körül, amely ürítette, és amit immunfestéssel mutatunk ki. A hosszabb időn át ürített nagyobb mennyiségű hormont könnyebb immunfestéssel detektálni. Az LH ürítéshez elegendő lett volna rövidebb tenyésztési idő, de a festések parallel tenyészetekben történtek, így azonos tenyésztési időt kellett alkalmaznunk.
48
KÖVETKEZTETÉSEK Vizsgálati eredményeink alapján a következő új megállapításokat tettük. 1. A CIBA alkalmas egészen kevés, akár egy-egy sejt ürítésének detektálására is. 2. A PACAP in vitro körülmények között, hypothalamikus és egyéb faktorok közbejötte nélkül ürül a hypophysis mellső lebeny sejtekből. 3. A sejtek által ürített PACAP mennyisége kisebb, mint az LH mennyisége. Ez arra utal, hogy a hypophysis eredetű PACAP feltehetően auto- és parakrin módon hat az LH szekrécióra, és nem valószínű, hogy az általános keringésen keresztül befolyásol endokrin funkciókat. 4. A hypophysis mellső lebeny sejtek PACAP ürítése függ a nemtől, nőstényben a ciklus stádiumtól, és a napszaktól, amikor az állatok hypophysisét kivettük. Legmagasabb PACAP ürítést prooestrust követően este 20 órakor kivett tenyészetekben figyeltünk meg. Ez arra utal, hogy a hypophysisben lokálisan ürített PACAP mennyisége függ a hormonális miliőtől. 5. A PACAP hatása az LH szekrécióra szintén különbözik a kísérleti feltételektől függően. A prooestrus stádiumában lévő nőstényekből reggel kivett hypophysis tenyészetben stimuláló hatású volt, növelte a blotok összterületét, míg dioestrus stádiumban és hímben az LH blotok összterületét vizsgálva alig kaptunk választ. 6. Vizsgálataink arra utalnak hogy a hypophysis mellső lebeny sejtek tenyészetben hypothalamikus faktorok jelenléte nélkül megőríznek magukkal hozott információkat, amelyek
befolyásolják
a
mediumban
lévő
(„imprinting”).
49
PACAP-ra
adott
válaszreakciót
ÖSSZEFOGLALÁS A hypophysis adenilát cikláz aktiváló polipeptidet (PACAP) adenilát cikláz enzim aktiváló tulajdonsága alapján izolálták birka hypothalamusból. A szervezet számos helyén megtalálható, azonban legnagyobb mennyiségben a hypothalamusban termelődik. A hypophysis mellső lebenyében is szintetizálódik, ahol RT-PCR technikával kimutatható, azonban immunfestéshez elegendő mennyiség csak a prooestrus napján van a mellső lebenyben. Számos adat utal arra, hogy a PACAP-nak szerepe van a gonadotroph hormon szekréció szabályozásában. Kísérleteinkben sejt immunoblot assay (CIBA) módszerrel kimutattuk, hogy PACAP nemcsak prooestrusban ürül egyedi hypophysis mellső lebeny sejtekből, hanem más ciklus stádiumban is (Szabó és mtsai, Regul. Pep. 109:75-81, 2002; Regul. Pep. 123: 139-145, 2004), azonban az ürítő sejtek száma ezekben a stádiumokban nagyon kevés. A sejtek által ürített PACAP mennyisége kisebb, mint az LH mennyisége, amelyet a sejtek körül immunfestés után kialakult blot átmérője jelez. A nagyobb mennyiségben termelt LH az általános keringésbe jutva távoli szerveken fejti ki hatását. Feltételezhető, hogy a kisebb mennyiségben termelt PACAP auto- vagy parakrin módon hat a hypophysis mellső lebenyében (Köves és mtsai, J. Mol. Neurosci. 20: 141-152, 2003). A hypophysis mellső lebeny sejtek PACAP ürítése napi ritmust is mutat, amely prooestrus stádiumban levő nőstény patkányban más, mint dioestrusban lévő nőstényekben, vagy hím patkányokban. A PACAP blotok száma a prooestrus estéjén az LH surge után 12-13 szorosára nő. In vitro körülmények között a gonadotroph sejtek LH ürítése változik PACAP kezelés hatására. A gonadotroph sejtek PACAP-ra adott válaszkészsége változik attól függően, hogy a mellső lebenyt mikor vettük ki tenyésztésre, azaz függ a napszaktól, de függ az állat nemétől és nőstényben a ciklus stádiumtól. Prooestrusos nőstényben délelőtt gátolta, délután az LH surge alatt stimulálta a sejtek által ürített LH mennyiségét a kezeletlen tenyészetekhez képest. Dioestrusos nőstényben és hím patkányban a PACAP nem befolyásolta értékelhetően a gonadotroph sejtek LH ürítését. Mivel a PACAP blotok száma a prooestrusos nőstény patkány esti tenyészetében volt messze a legmagasabb, így feltételezhető, hogy a csökkenő GnRH/PACAP arány következtében in vivo részt vesz az LH surge leállításában (Szabó és mtsai, 2004).
50
SUMMARY The pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) was isolated from ovine hypothalamus based on its ability to activate adenylate cyclase. It is present in a number of places in the body, but it is synthesized in the greatest amount in the hypothalamus. PACAP mRNA can be demonstrated in the anterior pituitary by RTPCR tecnique, but PACAP enough for immunostaining is present only on the day of proestrus. Numerous data reveal that PACAP plays a role in the regulation of gonadotroph hormone secretion. In our experiments we used the cell immunoblot assay (CIBA) to show that PACAP is secreted by anterior pituitary cells and released in vitro not only by pituitaries taken out on the day of proestrus, but also on other days of the estrous cycle (Szabó et al, Regul. Pep. 109: 75-81, 2002; Regul. Pep. 123: 139-145, 2004), however the number of PACAP secreting cells in the latter stages is very low. The amount of PACAP released by the cells is less than the amount of LH released. This is shown by the diameter of the blots formed around the cells and visualized by immunstaining. LH synthesized in a greater amount affects organs distant from the pituitary gland through the general circulation. Supposedly PACAP, synthesized in a lesser amount, has an auto- or paracrine effect in the anterior pituitary (Köves et al, J. Mol. Neurosci. 20: 141152, 2003). The anterior pituitary cells release PACAP in a daily rhythm which is similar in male and female rats; however, the number of PACAP blots was much higher in proestrus than in other stage of estrous cyle. On the night of proestrus the number of blots increases 12-13 times. Under in vitro conditions PACAP added to the medium changes the LH release of gonadotroph cells. The changes depend on the time of sacrifice when the pituitaries were removed, that is on the time of day, on the gender of the animal and in females on the stage of estrous cycle. In proestrous females in the morning PACAP inhibited LH release compared to untreated cells, in the afternoon when LH surge happens in vivo it stimulated LH. In diestrous stage of females and in males PACAP did not significantly affect LH release of gonadotroph cells compared to untreated cells. Because the number of PACAP blots was highest in the night in cell cultures of proestrous female rats, it lets us suppose that the decreasing GnRH/PACAP ratio plays a role in the terminating of the LH surge (Szabó et al, 2004). IRODALOMJEGYZÉK
51
Adamou JE, Aiyar N, Van Horn S, Elshourbaghy NA. Cloning and functional characterization of the human vasoactive intestinal peptide (VIP)-2 receptor. Biochem Biophys Res Commun, 209:385-392, 1995 Arimura A, Somogyvári-Vígh A, Miyata A, Mizuno K, Coy DH, Kitada C. Tissue distribution of PACAP as determined by RIA: highly abundant in the rat brain and testes. Endocrinology, 129:2778-2789, 1991 Arita J, Kojima Y, Kimura F. Measurement of the secretion of a small peptide at the single cell level by the cell immunoblot assay: thyroidectomy increases the number of substance P-secreting anterior pituitary cells. Endocrinology, 132:682-688, 1993 Baeres FM, Moller M. Origin of PACAP-immunoreactive nerve fibers innervating the subarachnoidal blood vessels of the rat brain. J Cereb Blood Flow Metab, 24:628-635, 2004 Baker BL, Dermody WC, Reel JR. Distribution of gonadotropin-releasing hormone in the rat brain as observed with immunocytochemistry. Endocrinology, 97:125-135, 1975 Böhm SK, Grady EF, Bunnett NW. Regulatory mechanisms that modulate signalling by G-protein-coupled receptors. Biochem J, 322:1-18, 1997 Chatterjee TK, Sharma RV, Fisher RA. Molecular cloning of a novel variant of the pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) receptor that stimulates calcium influx by activation of L-type calcium channels. J Biol Chem, 271:3222632232, 1996 Chiodera P, Volpi R, Capretti L, Coiro V. Effects of intravenously infused pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide on arginine vasopressin and oxytocin secretion in man. Neuropeptides, 6:1490-1492, 1995
52
Cimini V, Van Noorden S, Mahadeva H, Polak JM. The cell blot assay in analysis of rat anterior pituitary cell secretion. Histochem J, 6:59-66, 1994 Couvineau A, Rouyer Fessard C, Darmoul D, Maoret JJ, Carrero I, Ogier DE, Laburthe M. Human intestinal VIP receptor: cloning and functional expression of two cDNA encoding proteins with different N-terminal domains. Biochem Biophys Res Commun, 200:769-776, 1994 Csernus V, Mess B. Biorhythms and pineal gland. Neuroendocrinol Lett, 24: 404-11, 2003 Csernus V, Rékási Z, Mess B. Differences in hormone release patterns from the anterior pituitary and the pineal gland. Acta Biol Hung 45: 207-21, 1994 Culler MD, Paschall SC. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) potentiates the gonadotropin-releasing activity of luteinizing hormone-releasing hormone. Endocrinology, 129:2260-2262, 1991 Dierickx K, Vandesande F. Immunocytochemical demonstration of separate vasopressin-neurophysin
and
oxytocin-neurophysin
neurons
in
the
human
hypothalamus. Cell Tissue Res, 196:203-212, 1979 Dow RC, Bennie F, Fink G. Pituitary adenylate cyclase-activating peptide-38 (PACAP38) is released into hypophyseal portal blood in the normal male and female rats. J Endocrinol, 142:R1-R4, 1994 Fahrenkrug J, Steenstrup BR, Hannibal J, Alm P, Ottesen B. Role of PACAP in the female reproductive organs. Ann NY Acad Sci, 805:394-407, 1996 Filipsson K, Pacini G, Scheurink AJ, Ahrén B. PACAP stimulates insulin secretion but inhibits insulin sensitivity in mice. Am J Physiol, 274:E834-E842, 1998
53
Fizzane L, Sigaudo-Roussel D, Saumet JL, Fromy B. Evidence for the involvement of VPAC1 and VPAC2 receptors in pressure-induced vasodilatation in rodents. J Physiol, 554:519-528, 2004 Freshney IR. Culture of animal cells: a manual of basic technique. Wiley-Liss, New York, 1994:288-292 Fridolf T, Sundler F, Ahrén B. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP): occurrence in rodent pancreas and effects on insulin and glucagon secretion in the mouse. Cell Tissue Res, 269:275-279, 1992 Frödin M, Hannibal J, Wulff BS, Gammeltoft S, Fahrenkrug J. Neuronal localization of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide 38 in the adrenal medulla and growth-inhibitory effect on chrommaffin cells. Neuroscience, 65:599-608, 1995 Fukuhara C, Suzuki N, Matsumoto Y, Nakayama Y, Aoki K, Tsujimoto G, Inouye SI, Masuo Y. Day-night variation of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) level in the rat suprachiasmatic nucleus. Neurosci Lett, 229:49-52, 1997 Gottschall PE, Tatsuno I, Miyata A, Arimura A. Characterization and distribution of binding sites for the hypothalamic peptide, pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. Endocrinology, 127:272-277, 1990 Gourlet P, Woussen-Colle MC, Robberecht P, De Neef P, Cauvin A, Vandermeers-Piret MC, Vandermeers A, Christophe J. Structural requirements for the binding of the pituitary adenylate-cyclase activation in pancreatic and neuronal membranes. Eur J Biochem, 195:535-541, 1991 Gourlet P, Vandermeers A, Vandermeers-Piret MC, Rathé J, De Neef P, Robberecht P. C-terminally shortened pituitary adenylate cyclase-activating peptides (PACAP)
54
discriminate PACAP I, PACAP II-VIP1 and PACAP II-VIP2 recombinant receptors. Regul Pept, 62:125-130, 1996 Gozes I, Lilling G, Glazer R, Ticher A, Ashkenazi IE, Davidson A, Rubinraut S, Fridkin M, Brenneman DE. Superactive lipophilic peptides discriminate multiple vasoactive intestinal peptide receptors. J Pharmacol Exp Therap, 273:161-167, 1995 Gozes I, Fridkin M, Brenneman DE. VIP hybrid antagonist: from developmental neurobiology to clinical applications. Cell Mol Neurobiol, 15:675-687, 1995 Gräs S, Hannibal J, Georg B, Fahrenkrug J. Transient periovulatory expression of pituitary adenylate cyclase-activating peptide in rat ovarian cells. Endocrinology, 137:4779-4785, 1996 Hammond PJ, Talbot K, Chapman R, Ghatei MA, Bloom SR. Vasoactive intestinal peptide, but not pituitary adenylate cyclase activating peptide, modulates the responsiveness of the gonadotrophs to LHRH in man. J Endocrinol, 137:529-532, 1993 Hannibal J, Mikkelsen JD, Clausen H, Holst JJ, Wulff BS, Fahrenkrug J. Gene expression of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) in the rat hypothalamus. Regul Pept, 55:133-148, 1995 Hauser-Kronberger C, Albegger K, Saria A, Hacher GW. Neuropeptides in human salivary (submandibular and parotid) glands. Acta Otolaryngol, 112:343-348, 1992 Hosoya M, Kimura C, Ogi K, Ohkubo S, Miyamoto Y, Kugoh H, Shimuzu M, Onda H, Oshimura M, Arimura A. Structure of the human pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) gene. Biochem Biophys Acta, 1129:199-206, 1992 Ichikawa H, Sugimoto T. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptideimmunoreactive nerve fibers in rat and human toothpulps. Brain Res, 980:288-292, 2003
55
Ishizaka K, Tsujii T, Winters SJ. Evidence for a role for the cyclic adenosine 3’, 5’monophosphate/protein kinase-A pathway in regulation of the gonadotropin subunit messenger ribonucleic acids. Endocrinology, 133:2040-2048, 1993 Journot L, Spengler D, Pantaloni C, Dumuis A, Sebben M, Bockaert J. The PACAP receptor: Generation by alternative splicing of functional diversity among G-protein coupled receptors in nerve cells. Semin Cell Biol, 5:263-272, 1994 Journot L, Waeber C, Pantaloni C, Holsboer F, Seeburg PH, Bockaert J, Spengler D. Differential signal transduction by six splice variants of the PACAP receptor. Biochem Soc Trans, 23:133-137, 1995 Józsa R, Somogyvári-Vígh A, Reglődi D, Hollosy T, Arimura A. Distribution and daily variations of PACAP in the chicken brain. Peptides, 22:1371-1377, 2001 Kausz M, Murai Z, Arimura A, Köves K. Distribution of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) immunoreactive elements in the brain stem of rats studied by immunohistochemistry. Neurobiology, 7:19-31, 1999 Kausz M,
Arimura A,
Köves K. Distribution and somatotopical localization of
pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the trigeminal ganglion of cats and rats. Ann NY Acad Sci, 865:529-532, 1998 Kántor O, Molnár J, Heinzlmann A, Arimura A, Fürst Zs, Köves K. Study on the hypothalamic factors mediating the inhibitory effect of PACAP38 on ovulation. Peptides, 22:2163-2168, 2001 Kimura C, Ohkubo S, Ogi K, Hosoya M, Itoh Y, Onda H, Miyata A, Jiang L, Dahl RR, Stibbs HH. A novel peptide which stimulates adenylate cyclase: molecular cloning and characterization of the ovine and human cDNAs. Biochem Biophys Res Commun, 166:81-89, 1990
56
Klein DC, Moore RY, Reppert SM. Suprachiasmatic nucleus. The mind’s clock. New York, Oxford: Oxford University Press, 51-76, 1991 Ko C, In YH, Park-Sarge OK. Role of progesterone receptor activation in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide gene expression in rat ovary. Endocrinology, 140:5185-5194, 1999 Köves K, Arimura A, Vígh S, Somogyvári-Vígh A, Miller J. Immunohistochemical demonstration of a novel peptide, pituitary adenylate cyclase activating polypeptide, in the ovine hypothalamus. Endocrinology, 127:264-271, 1990 Köves K, Arimura A, Görcs TJ, Somogyvári-Vígh A. Comparative distribution of immunoreactive pituitary adenylate cyclase activating polypeptide and vasoactive intestinal polypeptide in rat forebrain. Neuroendocrinology, 54:159-169, 1991 Köves K, Arimura A, Vígh S, Somogyvári-Vígh A, Miller J. Immunohistochemical localization of PACAP in the ovine digestive system. Peptides, 14:449-455, 1993 Köves K, Görcs TJ, Kausz M, Arimura, A. Present status of the knowledge about the distribution and colocalization of PACAP in the forebrain. Acta Biol Hung, 45:297321, 1994 Köves K, Molnár J, Kántor O, Lakatos A, Görcs TJ, Somogyvári-Vígh A, Fürst Zs, Arimura A. PACAP participates in the regulation of the hormonal events preceeding the ovulation. Acta Biol Hung, 47:239-249, 1996 Köves K, Kántor O, Scammell JG, Arimura A. PACAP colocalizes with luteinizing and follicle-stimulating hormone immunoreactivities in the anterior lobe of the pituitary gland. Peptides, 19:1069-1072, 1998
57
Köves K, Kántor O, Molnár J, Heinzlmann A, Szabó E, Szabó F, Nemeskéri Á, Horváth J, Arimura A. The role of PACAP in gonadotropic hormone secretion at hypothalamic and pituitary levels. J Mol Neurosci, 20:141-152, 2003 Lam HC, Takahashi K, Ghatei MA, Kanze SM, Polak JM, Bloom SR. Binding sites of a novel neuropeptide pituitary-adenylate-cyclase-activating polypeptide in the rat brain and lung. Eur J Biochem, 193:725-729, 1990 Lariviére S, Garrel G, Robin MT, Counis R, Cohen-Tannoudji J. Differential mechanisms for PACAP and GnRH cAMP induction contribute to cross-talk between both the hormones in the gonadotrope LβT2 cell line. Regul Pept, 133:148, 2005 Lee J, Park HJ, Choi HS, Kwon HB, Arimura A, Lee BJ, Choi WS, Chun SY. Gonadotropin stimulation of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) messenger ribonucleic acid in the rat ovary and the role of PACAP as a follicle survival factor. Endocrinology, 140:818-826, 1999 Légrádi G, Shioda S, Arimura A. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-like immunoreactivity in autonomic regulatory areas of the rat medulla oblongata. Neurosci Lett, 176:193-196, 1994 Leonhardt S, Jarry H, Kreipe A, Werstler K, Wuttke W. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) stimulates pituitary hormone release in male rats. Neuroendocrinol Lett, 14:319-327, 1992 Luts L, Sundler F. Peptide-containing fibers in the parathyroid glands of different species. Regul Pept, 50:147-158, 1994 Masuo Y, Ohtaki T, Masuda Y, Nagai Y, Suno M, Tsuda M, Fujino M. Autoradiographic distribution of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) binding sites in the rat brain. Neurosci Lett, 126:103-106, 1991
58
Masuo Y, Tokito F, Matsumoto Y, Shimamoto N, Fujino M. Ontogeny of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its binding sites in the rat brain. Neurosci Lett, 170:43-46, 1994 Merchenthaler I, Kovács G, Lovász G, Sétáló G. The preoptico-infundibular LHRH tract of the rat. Brain Res, 198:63-75, 1980 Miyamoto Y, Habata Y, Ohtaki T, Masuda Y, Ogi K, Onda H, Fujino M. Cloning and expression of a complementary DNA encoding the bovine receptor for PACAP. Biochem Biophys Acta, 1218:297-307, 1994 Miyata A, Arimura A, Dahl RR, Minamino N, Uehara A, Gottschall PE, Jiang L, Culler MD, Coy DH. Isolation of a novel 38 residue-hypothalamic polypeptide which stimulates adenylate cyclase in the pituitary cells. Biochem Biophys Res Commun, 164:567-574, 1989 Moller K, Zhang YZ, Hakanson R, Luts A, Sjölund B, Uddman R, Sundler F. Pituitary adenylate cyclase-activating peptide is a sensory neuropeptide: immunocytochemical and immunochemical evidence. Neuroscience, 57:725-732, 1993 Moore JP Jr, Burger LL, Dalkin AC, Winters SJ. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide messenger RNA in the paraventricular nucleus and anterior pituitary during the rat estrous cycle. Biol Reprod, 73:491-499, 2005 Moro O, Lerner EA. Maxadilan, the vasodilator from sand flies, is a specific pituitary adenylate cyclase-activating peptide type I receptor agonist. J Biol Chem, 272:966-970, 1997 Murase T, Kondo K, Arima H, Iwasaki Y, Ito M, Miura Y, Oiso Y. The expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) mRNA in rat brain: possible role of endogenous PACAP in vasopressin release. Neurosci Lett, 185:103106, 1995
59
Ogi K, Kimura C, Onda H, Arimura A, Fujino M. Molecular cloning and characterization of the cDNA for the precursor of rat PACAP. Biochem Biophys Res Commun, 173:1271-1279, 1990 Ogi K, Miyamoto Y, Masuda Y, Habata Y, Hosoya M, Ohtaki T, Masou Y, Onda H, Fujino M. Molecular cloning and functional expression of a cDNA encoding a human PACAP receptor. Biochem Biophys Res Commun, 196:1511-1521, 1993
Ortman O, Asmus W, Diedrich K, Schulz KD, Emons G. Interactions of ovarian steroids with pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide and GnRH in anterior pituitary cells. Europ J Endocrinol, 140:207-214, 1999 Osuga Y, Mitsuhashi N, Mizuno M. In vivo effect of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide38 (PACAP38) on the secretion of luteinizing hormone (LH) in male rats. Endocrinol Jpn, 39:153-156, 1992
Palkovits M, Somogyvári-Vígh A, Arimura A. Concentrations of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) in human brain nuclei. Brain Res, 699:116120, 1995 Pandol SJ, Dharmsathaphorn K, Shoeffield MS, Vale W, Rivier J. Vasoactive intestinal peptide receptor antagonist [4Cl-D-Phe6, Leu17] VIP. Am J Physiol, 250:G553-G557, 1986 Pantaloni C, Brabet P, Bilanges B, Dumuis A, Houssami S, Spengler D, Bockaert J, Journot L. Alternative splicing in the N-terminal extracellular domain of the pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) receptor modulates receptor selectivity and relative potencies of PACAP-27 and PACAP-38 in phospholipase C activation. J Biol Chem, 271:22146-22151, 1996
60
Piggins HD, Stamp JA, Burns J, Rusak B, Semba K. Distribution of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) immunoreactivity in the hypothalamus and extended amygdala of the rat. J Comp Neurol, 376:278-294, 1996 Pisegna JR, Wank SA. Molecular cloning and functional expression of the pituitary adenylate cyclase activating polypeptide type I receptor. Proc Natl Acad Sci USA, 90:6345-6349, 1993
Pisegna JR, Lyu RM, Germano PM. Essential structural motif in the C-terminus of the PACAP type I receptor for signal transduction and internalization. Ann NY Acad Sci, 921:195-201, 2000
Portbury AL, McConalogue K, Furness JB, Young HM. Distribution of pituitary adenylyl cyclase activating peptide (PACAP) immunoreactivity in neurons of the guinea-pig digestive tract and their projections in the ileum and colon. Cell Tissue Res, 279:385-392, 1995
Radleff-Schlimme A, Leonhardt S, Wuttke W, Jarry H. Evidence for PACAP to be an autocrine factor on gonadotrope cells. Ann NY Acad Sci, 865:486-491, 1998
Rawlings RS, Canny JB, Leong AD. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide regulates cytosolic Ca2+ in rat gonadotropes and somatotropes through different intracellular mechanisms. Endocrinol, 132:1447-1452, 1993 Rawlings SR, Hazareh M. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) and PACAP/VIP receptors: action on the anterior pituitary gland. Endocrine Rev, 17:429, 1996
61
Robberecht P, Gourlet P, De Neef P, Woussen-Colle MC, Vandermeers-Piret MC, Vandermeers A, Christophe J. Structural requirements for the occupancy of pituitary adenylate cyclase-activating peptide (PACAP) receptors and adenylate cyclase activation in human neuroblastoma NB-OK-1 cell membranes. Discovery of PACAP(638) as a potent antagonist. Eur J Biochem, 207:239-246, 1992 Sawangjaroen K, Curlewis JD. Effects of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and vasoactive intestinal polypeptide (VIP) on prolactin, luteinizing hormone and growth hormone secretion in the ewe. J Neuroendocrinol, 6:549-555, 1994 Sétáló G, Vígh S, Schally AV, Arimura A, Flerkó B. LHRH containing neural elements in the rat hypothalamus. Endocrinology, 96:135-142, 1975 Sétáló G, Vígh S, Schally AV, Arimura A, Flerkó B. Immunohistological study of LHRH containing nerve fibers of the rat hypothalamus. Brain Res, 103:597-602, 1976 Sherwood NM, Adams BA, Isaac ER, Wu S. Knocked down and out: PACAP in development, reproduction and feeding. Regul Pept, 130:142, 2005 Sheward WJ, Lutz EM, Harmar AJ. The distribution of vasoactive intestinal peptide 2 receptor messenger RNA in the rat brain and pituitary gland as assessed by in situ hybridization. Neuroscience, 67:409-418, 1995 Shioda S, Légrádi G, Leung WC, Nakajo S, Nakaya K, Arimura A. Localization of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide and its messenger ribonucleic acid in the rat testis by light and electron microscopic immunocytochemistry and in situ hybridization. Endocrinology, 135:818.825, 1994 Shioda S, Shuot Y, Somogyvári-Vígh A, Légrádi G, Onda H, Coy DH, Nakajo S, Arimura A. Localization and gene expression of the receptor for pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in the rat brain. Neurosci Res, 28:345-354, 1997
62
Shivers BD, Görcs TJ, Gottschall PE, Arimura A. Two high affinity binding sites for pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide have different tissue distributions. Endocrinology, 128:3055-3065, 1991 Sreedharan SP, Patel DR, Huang JX, Goetzl EJ. Cloning and functional expression of a human neuroendocrine vasoactive intestinal peptide receptor. Biochem Biophys Res Commun, 193:546-553, 1993 Sreedharan SP, Patel DR, Xia M, Ichikawa S, Goetzl EJ. Human vasoactive intestinal peptide 1 receptor expressed by stable transfectants couple to two distinct signaling pathways. Biochem Biophys Res Commun, 203:141-148, 1994 Summers MA, O’Dorisio MS, Cox MO, Lara-Marquez M, Goetzl EJ. A lymphocytegenerated fragment of vasoactive intestinal peptide with VPAC1 agonist activity and VPAC2 antagonist effects. J Pharmacol Exp Therap, 306:638-645, 2003 Sundler F, Ekbald E, Absood A, Hakanson R, Köves K, Arimura A. Pituitary adenylate cyclase-activating peptide: a novel vasoactive intestinal peptide-like neuropeptide in the gut. Neuroscience, 46:439-454, 1992 Suzuki N, Harada M, Kitada C, Ohkubo S, Matsumoto H, Watanabe T. Production of immunoreactive pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) by human neuroblastoma cells, IMR:32 detection and characterization with monoclonal and polyclonal antibodies against different epitopes of PACAP. J Biochem, 113:549-556, 1993 Takahashi K, Totsune K, Murakami O, Satoh F, Sone M, Ohneda M, Sasano H, Mouri T. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP)-like immunoreactivity in human hypothalamus: co-localization with arginin vasopressin. Regul Pept, 50:267275, 1994
63
Trowbridge IS, Collawn JF, Hopkins CR. Signal-dependent membrane protein trafficking in the endocytic pathway. Annu Rev Cell Biol, 9:129-161, 1993 Tsujii T, Ishizaka K, Winters SJ. Effects of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide on gonadotropin secretion and subunit messenger ribonucleic acids in perifused rat pituitary cells. Endocrinology, 135:826-833, 1994 Turner JT, Jones SB, Bylund DB. A fragment of vasoactive intestinal peptide, VIP(1028), is an antagonist of VIP in the colon carcinoma cell line, HT29. Peptides, 7:849854, 1986 Uchimura D, Katafuchi T, Hori T, Yanaihara N. Facilitatory effects of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) on neurons in the magnocellular portion of the rat hypothalamic paraventricular nucleus (PVN) in vitro. J Neuroendocrinol, 8:137-143, 1996 Usdin TB, Bonner TI, Mezey E. Two receptors for vasoactive intestinal polypeptide with similar specificity and complementary distributions. Endocrinology, 135:26622680, 1994
Vaudry D, Gonzales JB, Basille M, Yon L, Fournier A, Vaudry H. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide and its receptors: from structure to functions. Pharmacol Rev, 52:269-324, 2000 Vereczki V, Köves K, Tóth ZsE, Baba A, Hashimoto H, Fógel K, Arimura A, Kausz M. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide does not colocalize with vasoactive intestinal polypeptide in the hypothalamic magnocellular nuclei and posterior pituitary of cats and rats. Endocrine, 22:225-237, 2003 Vígh S, Arimura A, Gottschall PE, Kitada C, Somogyvári-Vígh A, Childs GV. Cytochemical characterization of anterior pituitary target cells for the neuropeptide
64
pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP), using biotinylated ligands. Peptides, 14:59-65, 1993 Waschek JA, Bravo DT, Richards ML. High levels of vasoactive intestinal peptide/pituitary adenylate cyclase-activating peptide receptor mRNA expression in primary and tumor lymphoid cells. Regul Pept, 60:149-157, 1995 Wuttke W, Benter S, Jarry H. Evidence for a steroid modulated expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the anterior pituitary of rats. Neuroendocrinology, 60 (supplement 1):17, 1994 Xia M, Sreedharan SP, Goetzl EJ. Predominant expression of type II vasoactive intestinal peptide receptors by human T lymphoblastoma cells: transduction of both Ca2+ and cyclic AMP signals. J Clin Immun, 16:21-30, 1996 Yada T, Sakurada M, Nakata M, Ihida K, Yaekura K, Shioda S, Kikuchi M. Current status of PACAP as a regulator of insulin secretion in pancreatic islets. Ann NY Acad Sci, 805:329-342, 1996
65
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek, Dr. Köves Katalinnak, hogy hosszú évek során olyan sokat tanított és segített, és lehetővé tette számomra, hogy laboratóriumában dolgozhassam. Köszönetet szeretnék mondani Dr. Nemeskéri Ágnesnek, aki a diákköri éveim alatt volt témavezetőm és, neki köszönhetem a CIBA módszer elsajátítását és a lehetőséget, hogy laboratóriumában a sejttenyésztéshez szükséges eszközöket használhassam. Köszönöm Fogarasi Juditnak és Takács Tivadarnénak technikai segítségüket, amely nélkül nem boldogultam volna. Szeretném
megköszönni
dr.
Heinzlmann
Andreának,
munkatársamnak, a segítséget, amellyel bármikor rendelkezésemre állt.
66
közvetlen
MEGJELENT CIKKEK ÉS KONGRESSZUSI ELŐADÁSOK JEGYZÉKE Publikációs tevékenységek Közlemények: Szabó E, Nemeskéri Á, Heinzlmann A, Suzuki N, Arimura A, Köves K. Cell immunoblot assay study demonstrating the release of PACAP from individual anterior pituitary cells of rats and the effect of PACAP on LH release. Regulatory Peptides, 109:75-81, 2002 Szabó E, Nemeskéri Á, Arimura A, Köves K. Effect of PACAP on LH release studied by cell immunoblot assay depends on the gender, on the time of day and in female rats on the day of the estrous cycle. Regulatory Peptides, 123:139-145, 2004 Köves K, Vereczki V, Kausz M, Kántor O, Molnár J, Nemeskéri Á, Heinzlmann A, Szabó E, Szabó F, Fógel K, Lakatos A, Szeiffert G, Arimura A. PACAP and VIP in the photoneuroendocrine system (PNES). Medical Science Monitor, 8:SR5-20, 2002 Köves K, Kántor O, Molnár J, Heinzlmann A, Szabó E, Szabó F, Nemeskéri Á, Horváth J, Arimura A. The role of PACAP in gonadotropic hormone secretion at hypothalamic and pituitary levels. Journal of Molecular Neuroscience, 20:11-22, 2003 Könyvrészlet: Köves K, Vereczki V, Molnár J, Kántor O, Heinzlmann A, Szabó E. Presence and role of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide in the photoneuroendocrine system. Rythmic Biological Processes (Editors: Valér Csernus, Béla Mess). Kiadó: Dialóg Campus, Budapest-Pécs, pp: 147-165, 2003
Kongresszusi tevékenységek
67
Előadás: XIVth International Congress of the Polish Pharmacological Society Kraków, Lengyelország 2001. szeptember 10-13. Szabó E, Nemeskéri Á, Köves K. PACAP released by anterior pituitary cells influences the LH release in an autocrine manner. Cell immunoblot assay (CIBA) study. Polish Journal of Pharmacology, 53:95, 2001 Orvos- és Gyógyszertudományi diákköri konferencia Semmelweis Egyetem 2000. február 16-17. Szabó E. A PACAP szerepe a hypophysis gonadotroph hormonok szekréciójának szabályozásában proösztruszos nőstény patkányokban. Ph.D. Tudományos Napok Semmelweis Egyetem 2001. február 22-23. Szabó E, Heinzlmann A. A PACAP, mint lokális faktor, befolyásolja az LH szekréciót hypophysis mellső lebeny sejtkultúrában. Poszter: 13th International Symposium on Regulatory Peptides Cairns, Queensland, Australia 2000. október 22-26. Köves K, Szabó E, Arimura A, Nemeskéri Á. The responsiveness of LH cells to PACAP changes during the day of proestrus. Regulatory Peptides, 94:74, 2000
5th International Meeting: VIP, PACAP, Secretin, Glucagon and Related Peptides Santa Barbara, California
68
2001. november 4-8. Köves K, Szabó E, Arimura A, Nemeskéri Á. The responsiveness of LH cells to PACAP is different in male and female rats studied by cell immunoblot assay (CIBA). Regulatory Peptides, 102:59, 2001 6th International Symposium on VIP, PACAP and Related Peptides Hakone, Japán 2003. szeptember 1-4. Szabó E, Nemeskéri Á, Arimura A, Köves K. Effect of PACAP on LH release depends on the gender, on the time of day and in female rats on the day of the estrous cycle. Cell immunoblot assay study. Regulatory Peptides, 115:97, 2003 Magyar Anatómus Társaság XI. Kongresszusa Debrecen 2001. június 14-16. Szabó E, Nemeskéri Á, Köves K. Egyedi hypophysis mellső lebeny sejt PACAP és LH ürítésének tanulmányozása sejt immunoblot assay (CIBA) segítségével.
69
SAJÁT KÖZLEMÉNYEK ÉS ELŐADÁS ABSZTRAKTOK KÜLÖNLENYOMATAI
70
