EGYETEMI DOKTORI (PH.D.) ÉRTEKEZÉS
A HYPOPHYSIS ADENILÁT-CIKLÁZ AKTIVÁLÓ POLIPEPTID (PACAP) HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA KÜLÖNBÖZİ IDEGRENDSZERI KÁROSODÁSOKAT MODELLEZİ ÁLLATKÍSÉRLETEKBEN
Dr. Tamás Andrea
PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR ANATÓMIAI INTÉZET
Témavezetık: Dr. Reglıdi Dóra, Dr. Lengvári István Programvezetı: Dr. Csernus Valér
Pécs, 2005.
2
TARTALOMJEGYZÉK
I. Bevezetés ........................................................................................................................ 3. II. Hypophysis adenilát-cikláz aktiváló polipeptid (PACAP) .............................................. 6. III. Célkitőzéseink .............................................................................................................. 9. IV. Anyagok és módszerek ................................................................................................10. V. Preventív PACAP kezelés hatásának vizsgálata fokális cerebrális ischaemiában ...........22. VI. 6-OHDA indukálta egyoldali substantia nigra lézió vizsgálata különbözı nemő és korú patkányokban ............................................................................................................29. VII. PACAP kezelés hatásának vizsgálata Parkinson-kór modellben .................................41. VIII. PACAP kezelés hatásának vizsgálata Huntington-chorea modellben.........................54. IX. PACAP kezelés hatásának vizsgálata monosodium glutamát kezelés következtében kialakuló retinális degenerációban..............................................................60. X. Megbeszélés .................................................................................................................63. XI. Az új eredmények összefoglalása ................................................................................70. XII. Irodalom ....................................................................................................................71. XIII. Rövidítések...............................................................................................................88. XIV. Köszönetnyilvánítás..................................................................................................89. XV. A dolgozatban felhasznált publikációk .......................................................................90. XVI. Egyéb publikációk ....................................................................................................91.
3
I. BEVEZETÉS Az idegrendszeri károsodást modellezı állatkísérleteket széles körben használják az egyes klinikai kórképek etiológiájának, patomechanizmusának és terápiás lehetıségeinek vizsgálatára. Az egyes anyagokat a klinikai gyakorlatban csak akkor lehet alkalmazni, ha korábban in vivo állatkísérletben is bizonyítják védı hatásukat. Kutatócsoportunk célja a hypophysis adenilát-cikláz aktiváló polipeptid (PACAP) neuroprotektív hatásának széleskörő megismerése, ezért hatását különbözı állatkísérletes modellekben vizsgáljuk. Értekezésem a fokális cerebrális ischaemia, Parkinson-kór, Huntington-chorea és monosodium glutamát okozta retinális degeneráció modellekben elért eredményeket foglalja össze. A cerebrovascularis elváltozások következményeképpen kialakuló súlyos kórképek és ezek komplikációi képezik fejlett országokban az egyik leggyakoribb halálokot a daganatos és a cardiovascularis betegségek mellett. Az ischaemiás károsodás egyik leggyakoribb oka az a. cerebri media vagy ágainak elzáródása embolisatio miatt (az összes agyi embólia 82%-a), ezért a kutatások során is az egyik gyakran alkalmazott fokális ischaemia modell, az a. cerebri media okklúzió, vagy angol neve alapján mozaikszóval MCAO. Ezen eljárás során az a. carotis communis kipreparálása után egy apró nyíláson keresztül vékony filamentumot vezetnek az a. cerebri media eredéséig [Longa és mtsai, 1989]. A megfelelıen elvégzett mőtét után mind a striatum, mind az azt körülvevı agykéreg idegsejtjei elpusztulnak. Vizsgálataink elsı részében arra kerestük a választ, hogy a PACAP csökkenti-e az infarktus nagyságát és javítja-e a neurológiai jeleket akkor, ha preventíven az okklúzió elıtt adjuk. Korábbi kísérletekben már bebizonyították, hogy a PACAP védı hatást fejt ki globális és tranziens fokális ischaemiában [Ohtaki és mtsai, 2003; Reglıdi és mtsai, 2000a,b; Uchida és mtsai, 1996], ezért mi permanens ischaemiában vizsgáltuk a peptid hatását. A neurodegeneratív megbetegedésekre, mint például a Parkinson-kór és a Huntigtonchorea, egy-egy sejtcsoport progresszív pusztulása jellemzı. A sejtelhalás pontos mechanizmusa nem ismert, de szerepet játszanak benne az inflammatorikus hatások, az oxidatív stressz és a különbözı toxikus léziók [Martin és Gusella, 1986; Mokrey, 1995; Obeso és mtsai, 2000; Roberts és mtsai, 1993]. A legtöbb állatkísérletben különbözı excitotoxikus anyagok segítségével roncsolják a betegségben érintett agyterületeket, és így különbözı neuropatológiai eltérések és biokémiai változások hozhatók létre [Giordano és mtsai, 1990]. A toxinokat alkalmazhatjuk szisztémásan és intracerebrálisan is. A szisztémás toxin kezeléssel az agy mindkét féltekéjét érintı szimmetrikus lézió hozható létre, és ugyanilyen eredmények érhetık el a kétoldali toxin injectióval is, azonban így
4
kiküszöbölhetıek az esetleges szisztémás hatások. Más kísérletekben azonban az egyoldali intracerebrális kezelést részesítik elınyben, ugyanis így csak féloldali károsodás alakul ki. A féloldali lézió könnyebbé teszi mind a magatartásbeli eltérések, mind a hisztológiai változások vizsgálatát, mivel az ép oldal egyidejőleg kontrollként is alkalmazható. Kísérleteink során a Parkinson-kór modellben 6-hydroxidopamin (6-OHDA) segítségével a bal oldalon roncsoltuk a substantia nigra dopaminerg sejtjeit, míg a Huntington-chorea modellben a bal oldali striatumot károsítottuk lokálisan adott quinolinsav injekcióval. A Parkinson-kór ismeretlen eredető progresszív neurodegeneratív megbetegedés, melynek hátterében a substantia nigra pars compacta dopamin tartalmú sejtjeinek pusztulása áll. A nigrostriatalis rendszer dopamin szintjének csökkenése felelıs a betegséghez kapcsolódó különbözı motoros rendellenességekért. A betegség vezetı klinikai tünetei a hipokinézis, a rigor és a tremor, késıbbi stádiumban a tartási instabilitás. A jelenleg alkalmazott terápia célja a dopamin szint normalizálása, azonban ez nem tudja kivédeni a degeneratív folyamatok progresszióját. Jól ismert, hogy a betegség gyakrabban fordul elı az idısebb korosztályban, és a betegség progressziója is gyorsabb ebben az életkorban [Bennet és mtsai, 1996; Fearnley és Lees, 1991; Gerstenbrand és Ransmayr, 1986]. Az is jól ismert, hogy a betegség nagyobb számban érinti a férfiakat, de a betegség progressziójának nemi különbségeirıl számos ellentmondásos adat létezik [Cyr és mtsai, 2002; Diamond és mtsai, 1990]. A legtöbb állatkísérletben, melyben a dopaminerg sejtpusztulás mechanizmusát és az esetleges neuroprotektív szerek hatását vizsgálják, fiatal hím állatokat használnak a betegség modellezésére, és csak kis százalékában használnak idıs állatokat [Collier és mtsai, 1999; Connor és mtsai, 1996; Sortwell és mtsai, 2001]. Az elmúlt években néhányan már hangsúlyozták az idıs állatok alkalmazásának jelentıségét a Parkinson-kór preklinikai kutatásában, mert a korosodó állatokon végzett kísérletek relevánsabban modellezik az embereknél is elsısorban idıs korban jelentkezı betegséget [Date és mtsai, 1990; Lindner és mtsai, 1999]. Számos kísérletben vizsgálták az öregedés hatását a dopaminerg rendszer mőködésére, több irodalmi adat van arról, hogyan befolyásolja a kor a dopamin szintézisét, metabolizmusát, felvételét, receptoriális érzékenységét és a dopaminerg rendszer egyéb neurokémiai sajátosságait [Araki és mtsai, 1997; Dluzen és mtsai, 1991; Dobrev és mtsai, 1995; Friedemann és Gerhardt, 1992; Kametani és mtsai, 1995; Marshall és Rosenstein, 1990; Shimizu és Prasad, 1991; Stoessl és mtsai, 1989; Yurek és mtsai, 1998]. Az életkoron kívül számos egyéb körülmény is befolyásolja a dopaminerg rendszer érzékenységét különbözı károsító hatásokkal szemben, mint pl. nem- és speciesbeli különbségek [Schwarting és Huston, 1997; Sedelis és mtsai, 2000; 2001; 2003; Voronina és mtsai, 1990]. Nagyon kevés
5
olyan kutatási eredmény áll rendelkezésünkre, amely az öreg állatok komplex viselkedési mintázatát értékeli a dopaminerg rendszer neurotoxikus károsodását követıen, és emellett a nıstény állatokra vonatkozóan is csak korlátozott számú adattal rendelkezünk. Vizsgálataink második részének célja az öreg és fiatal, hím és nıstény állatok részletes összehasonlító magatartási vizsgálata a substantia nigra 6-OHDA lézióját követıen [Deumens és mtsai, 2002; Mokrey, 1995]. Korábbi kísérletekben már bebizonyították, hogy a PACAP kezelés megvédi a mesencephalicus sejtkultúrákat a 6-OHDA neurotoxikus hatásával szemben [Takei és mtsai, 1998], ezért vizsgálataink harmadik szakaszában célul tőztük ki a különbözı dózisú PACAP hatásának vizsgálatát 6-OHDA léziót követı neurológiai változásokra, és a substantia nigrában és a ventralis tegmentalis areában észlelt morfológiai eltérésekre. A Huntington-chorea egy örökletes neurodegeneratív betegség, melyet a choreiform mozgások mellett pszichológiai és kognitív zavarok is jellemeznek [Martin, 1984]. Állatkísérletekben különbözı toxikus anyagokkal roncsolják a striatumot, és így hozzák létre a Huntigton-chorea modellt [Borlongan és mtsai, 1995a,b]. A striatális neuronok károsodása számos magatartásbeli eltérést okoz az állatokban. A léziót követıen fokozódik az aktivitásuk, csökken a haloperidol indukálta katalepszia mértéke, ezen kívül károsodnak a kognitív funkciók is [Giordano és mtsai, 1990]. Nagymértékben sérülnek a memória és a tanulási folyamatok, és súlyos deficitek alakulnak ki az önfenntartó mőködésekben, mint pl. a táplálkozásban és az ivásban [Tulipan és mtsai, 1988]. A számos neurotoxikus anyag közül a quinolinsav lézió az, ami legjobban modellezi a betegséget. Neuropatológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a Huntington-choreában szenvedı betegek striatumában a közepes mérető tüskés neuronok száma nagyobb mértékben csökken a toxikus hatás következtében, mint a tüske nélküli sejtek száma. A quinolinsav injectióval is hasonló hisztológiai változást tudunk létrehozni a striatumban [Roberts és mtsai, 1993], ezért használtuk a quinolinsav léziót. Korábban döntıen kétoldali léziót alkalmaztak különbözı dózisokkal, és a hiperaktivitást vizsgálták [Sanberg és mtsai, 1989], vagy a katalepsziás tüneteket detektálták [Giordano és mtsai, 1990]. A katalepszia teszt során a dopamin antagonista haloperidol segítségével blokkolhatjuk a dopaminerg nigrostriatalis pályákat, így létrehozhatjuk a basalis ganglionok sérülése esetén kialakuló rigiditási tüneteket [Field és mtsai, 2000]. Azok az állatok, amelyek striatalis sejtjei már károsodnak, nem mutatnak olyan súlyos katalepsziás jeleket, mint a normál patkányok, így lehetıséget nyújtanak terápiás szerek hatásának tesztelésére [Giordano és mtsai, 1990]. Más esetekben pedig egyoldali léziót követıen hisztológiai vizsgálatokat végeztek magatartás vizsgálat nélkül [Beal és mtsai, 1991]. Az egyoldali léziót azért
6
választottuk, mert korábbi kísérleteink során sok tapasztalatot győjtöttünk az aszimmetrikus magatartásjelek detektálásában és kiértékelésében. Korábbi kísérletekben kimutatták, hogy a PACAP védı hatását fejt ki a neurodegeneratív sejtpusztulásért felelıs folyamatokkal szemben (pl.: oxidatív stressz, inflammatorikus folyamatok és különbözı toxikus hatások), ezért vizsgálataink negyedik részében a PACAP kezelés hatását Huntington-chorea modellben is megvizsgáltuk. A leggyakrabban alkalmazott excitotoxikus anyagok közé sorolhatjuk a glutamát analógokat. Már régóta ismert, hogy a szisztémás monosodium glutamát (MSG) kezelés újszülött patkányokban, és intravitreális kezelés felnıtt patkányokban a retina belsı rétegeinek súlyos degenerációjához vezet [Chambille és Serviere, 1993; Rigdon és mtsai, 1989; Seress és mtsai, 1984; Sisk és mtsai, 1985; van Rijn és mtsai, 1986]. Eddig még nagyon kevés kísérletben vizsgáltak neuroprotektív szereket retinális károsodásban, és mivel a PACAP védı hatását már több neuronális károsodást modellezı állatkísérletben leírták, vizsgálataink ötödik részében a PACAP védı hatását vizsgáltuk MSG kezelés következtében kialakuló retinális károsodásban.
II. HYPOPHYSIS ADENILÁT-CIKLÁZ AKTIVÁLÓ POLIPEPTID (PACAP)
A hypophysis adenilát-cikláz aktiváló polipeptidet, vagy angol neve alapján mozaikszóval PACAP-ot, 1989-ben izolálták birka hypothalamusból a hypophysisben kifejtette adenilát-cikláz aktiváló hatása segítségével [Miyata és mtsai, 1989]. A PACAP tagja a szekretin/glukagon/vazoaktív intestinalis polipeptid (VIP) peptidcsaládnak [Arimura, 1998]. Szerkezete 67%-ban megegyezik VIP struktúrájával, de adenilát-cikláz aktiváló hatása 100010 000-szer nagyobb a VIP hatásánál. A PACAP génje a 18. kromoszómán helyezkedik el és 2681 nukleotidból áll. A szervezetben két, biológiailag aktív amidált formában fordul elı, ennek kb. 90%-át a 38 aminosavból álló PACAP-38, a kisebb részét a 27 aminosavat tartalmazó PACAP-27 teszi ki [Arimura és mtsai, 1991]. A peptidek szekvenciája azonos birkában, patkányban és emberben, a békában is csak egy aminosaveltérés található [Köves és Vincze, 2001]. A 38 aminosavból álló primér molekula egyaránt megtalálható az alacsonyabb rendő gerinces és elıgerinchúros állatokban, a struktúrájuk csak 1-4 aminosavban térnek el az emberben található PACAP-tól [Arimura, 1998]. Ezen adatok azt bizonyítják, hogy a filogenetikai fejlıdés során szinte változatlanul konzerválódott molekula alapvetı élettani funkcióval rendelkezik.
7
A. A PACAP elıfordulása a szervezetben
Megjelenését és funkcióját tekintve, az ún. „brain-gut” (neurointestinalis) peptidek közé sorolható, vagyis megtalálható nemcsak a központi és perifériás idegrendszerben, hanem más szövetekben is, többek között az endokrin mirigyekben és a gastrointestinalis tractus teljes hosszában. A PACAP a központi idegrendszerben legnagyobb mennyiségben a hypothalamusban mutathatók ki, de más extrahypothalamikus struktúrában, így az agykéregben, a középagyban, a nyúltvelıben, a bazális ganglionokban, a thalamusban, a hypophysisben, a septumban, a hippocampusban, az amygdala centrális magjában, a cerebellumban is vannak immunhisztokémiával kimutatható PACAP tartalmú sejtek [Arimura, 1998; Köves és mtsai, 1990, 1991]. Elhelyezkedésük eltér minden más eddig ismert neuropeptid központi idegrendszeri eloszlásától [Palkovits és mtsai, 1995]. A perifériás idegrendszerben a spinális ganglionok kis érzıidegsejtjei, valamint a vegetatív prae- és postganglionális neuronok tartalmaznak PACAP-ot [Sundler és mtsai, 1996]. Mivel kísérleteink során a PACAP hatását retinális degenerációban is vizsgáltuk ezért fontos kiemelni, hogy már számos fajban vizsgálták a PACAP eloszlását a retina rétegeiben [Józsa és mtsai, 2001; Onali és Olianas, 1994; Seki és mtsai, 2000]. Patkány retinában immunhisztokémiai módszerrel kimutatható a PACAP az amakrin és a horizontális sejtekben, a belsı rostos rétegben (IPL), a ganglion sejtek rétegében (GCL) és az optikus rostok rétegében [Hannibal, 2002; Seki és mtsai, 2000]. Az agyalapi erekben, az agyszöveten belül kisebb artériákban, valamint a perifériás szervek ereinek falában is vannak PACAP-pozitív idegrostok [Köves és mtsai, 1993]. A nem idegi struktúrákat tekintve jelentıs koncentrációban mutatható ki a herékben, a mellékvesevelı chromaffin-sejtjeiben, a pancreas Langerhans-szigetsejtjeiben, az exokrinmirigyekben, de közel az összes szervben (szív, tüdı, máj, vese, nyirokszervek) detektálták már, bár ezen szervekben található PACAP nagyrészt az idegelemekbıl származik [Arimura és mtsai, 1991; Köves és mtsai, 1993; Köves és Vincze, 2001].
B. A PACAP in vitro és in vivo neurotrofikus és neuroprotektív hatása
A PACAP felfedezése óta széles körben vizsgálják, és számos kísérletben bebizonyították már neurotrofikus és neuroprotektív hatását [Arimura, 1998; Vaudry és mtsai, 2000a]. In vitro, stimulálja a neuronok növekedését, elısegíti túlélésüket, antiapoptotikus hatással rendelkezik, és védi a neuronokat a különbözı neurotoxikus hatásokkal szemben,
8
ezenkívül segíti a neuronok differenciálódását és proliferációját a fejlıdés közben, és segíti más trofikus faktorok expresszióját és hatását [Arimura, 1998; Somogyvári-Vígh és Reglıdi, 2004; Vaudry és mtsai, 2000a; Waschek, 2002]. A PACAP antiinflammatorikus hatását is bebizonyították már mind in vivo, mind in vitro kísérletekben [Ganea és Delgado, 2002; Delgado és mtsai, 2003; Somogyvári-Vígh és Reglıdi, 2004]. In vivo, a PACAP védi a hippocampus CA1 sejtjeit globális ischaemiában [Uchida és mtsai, 1996] és a cholierg neuronokat a fornix átmetszése után [Takei és mtsai, 2000]. A PACAP patkányban csökkenti a károsodott agyterület nagyságát, és javítja a neurológiai jeleket fokális cerebrális ischaemiát követıen [Reglıdi és mtsai, 2000a,b]. Nemrégiben bebizonyították, hogy a PACAP neuroprotektív tranziens fokális ischaemiában [Ohtaki és mtsai, 2003], és más neuronális károsodások esetén, mint például a gerincvelı, a nervus facialis sérülése esetén [Katahira és mtsai, 2003; Kimura és mtsai, 2003] és a nervus opticus átmetszése után patkányban [Seki és mtsai, 2003]. A különbözı neuropatológiás elváltozásokat követı PACAP upregulációból arra következtethetünk, hogy fontos szerepe lehet a posttraumás regenerációs folyamatokban [Skoglosa és mtsai, 1999].
9
III. CÉLKITŐZÉSEINK
Kísérleteink során célul tőztük ki a PACAP neuroprotektív hatásának széleskörő megismerését, ezért a PACAP kezelés hatását különbözı idegrendszeri károsodásokat modellezı állatkísérletekben vizsgáltuk. 1., Elıször a preventív intracerebroventricularis PACAP kezelés hatását vizsgáltuk a. cerebri media okklúziót követı fokális cerebrális ischaemiában. A vizsgálat során a léziót követıen neurológiai és orientációs tesztet végeztünk a kialakuló magatartási eltérések detektálására. Az elhalt terület kimutatásához 2,3,5-triphenyltetrazolium chloridot (TTC) használtunk. Ezen kívül vizsgáltuk a PACAP hatását a szisztémás vérnyomásra és a lokális agyi keringésre. 2., Ezt követı vizsgálatainkban az egyik gyakran használt Parkinson-kór modellt alkalmaztuk, ahol a substantia nigra sejtjeit lokálisan adott 6-OHDA injekcióval roncsoltuk az egyik oldalon. Mivel a legtöbb kísérletben a Parkinson-kór modellezéséhez fiatal hím állatokat alkalmaznak, ezért a PACAP-pal folytatott kísérleteink elıtt a 6-OHDA lézió hatását különbözı nemő és korú állatokon vizsgáltuk. A lézió után értékeltük a motoros aktivitási jeleket és a féloldali lézió következtében kialakuló aszimmetrikus tüneteket, majd tirozinhidroxiláz immunhisztokémia segítségével jelöltük a substantia nigra és a ventralis tegmentalis area dopaminerg sejtjeit a lézió nagyságának megállapításához. 3., Ezen kísérleteket követte a lokális PACAP kezelés hatásának vizsgálata fiatal hím állatokban, ahol a korábban részletezett vizsgálatokat végeztük a 6-OHDA lézió után, de ezt apomorfin rotációs teszttel is kiegészítettük. 4., Ezután egy gyakran alkalmazott Huntington-chorea modellben, a quinolinsav indukálta egyoldali intrastriatalis lézióban vizsgáltuk a lokális PACAP kezelés hatását. A léziót követıen a Parkinson-kór vizsgálata során is használt magatartási teszteket katalepszia teszttel egészítettük ki, és NADPH-diaforáz festéssel jelöltük a striatalis sejteket. 5., Végül az egyoldali intravitreális PACAP kezelés hatását vizsgáltuk szisztémás glutamát kezelés indukálta retinális degenerációban. A léziót követıen Nissl festéssel festettük meg a retina sejtjeit, és a rétegek vastagságának elemzésével állapítottuk meg a lézió mértékét.
10
IV. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
A. Állatok elıkészítése
Az állatok elhelyezése, gondozása és felhasználása a Pécsi Tudományegyetem ellenırzött
protokollja
(No:
BA02/2000-31/2001)
szerint
az
intézeti
ajánlások
figyelembevételével történt. Ezt a protokollt követtük minden állatkísérletben. Az állatokat 12 órás világos-sötét ciklusban tartottuk, táplálékot és folyadékot folyamatosan biztosítottunk számukra. Az állatokat a kísérlet elıtt aklimatizáltuk, azaz ott helyeztük el a ketreceiket, ahol késıbb a mőtétet végeztük. A patkányokat a mőtét elıtti éjjel éheztettük, de vizet kaptak.
B. Állatkísérletes modellek
a. A fokális cerebrális ischaemia modell
A vizsgálatokat 200-340 gramm súlyú felnıtt hím Wistar patkányokon végeztük. A mőtét során elzártuk az a. cerebri mediát Longa [Longa és mtsai, 1989] módszere szerint (IV.1., 2. ábra). A beavatkozás elıtt a kb. 4-5 cm-es filamentumok végét kis láng segítségével megolvasztva gömbszerően megvastagítottuk (a gömb átmérıje kb. 0,5 mm volt), majd a végétıl 18-19 mm-re megjelöltük. Az operáció során középsı nyaki behatolással feltártuk a bal a. carotis communist, majd lekötöttük. Ezt követte az a. carotis externa lekötése az a. occipitális eredése alatt (IV.3., 4. ábra). Az a. carotis interna alá fonalat vezettünk, majd az éren kis nyílást készítettünk, amin bevezettünk egy 4-0-ás nylon monofilamentumot 18-19 mm mélyre, amíg enyhe rezisztenciát nem éreztünk (IV.5., 6. ábra). Ez jelezte az a. cerebri media eredésének elzárását. Ezután a filamentumot az aláhurkolt fonál segítségével rögzítettük (IV.7. ábra), a sebet sebészi kapoccsal zártuk. A mőtét megközelítıleg 10 percet vett igénybe. Az altatáshoz pentobarbitált alkalmaztunk (35 mg/kg), amit intraperitonealisan adtunk be.
11
A. cerebri anterior
A. cerebri media A. cerebri posterior
A. pterygopalatina
A. carotis interna A. carotis externa A. carotis communis
IV.1. ábra. Az MCAO során a filamentum segítségével elzárjuk a bal a. cerebri mediát.
M. praetrachealis A. carotis externa
M. omohyoideus A. carotis interna
A. carotis communis M. sternocleidomastoideus
IV.2. ábra. A carotisoszlás anatómiai elhelyezkedése patkányban.
12
3.
4.
5.
6.
7. IV.3. ábra. A m. omohyoideust elvágva feltárjuk a bal carotis régiót. IV.4. ábra. Az erek lekötése. IV.5. ábra. Metszés az a. carotis internán. IV.6. ábra. A filamentum felhelyezése. IV.7. ábra. Az a. carotis interna lekötése, a filamentum rögzítése.
13
b. A Parkinson-kór modell
A Parkinson-kór modellezéséhez 200-300 gramm súlyú 3 hónapos hím (n=46) és nıstény (n=10) és 18-20 hónapos 350-450 gramm súlyú hím és nıstény (n=8 mindkét csoportban) Wistar patkányokat használtunk. Az állatok bal substantia nigráját 2 µl 4 µg/µl koncentrációjú 0,2% aszkorbinsavat is tartalmazó 6-OHDA-nal roncsoltuk [Deumens és mtsai, 2002; Schwarting és mtsai, 1991; Schwarting és Huston, 1996a,b]. Az stereotaxiás mőtét során az altatáshoz pentobarbitált használtunk intraperitonealisan (35mg/ttkg), az anyagbeadás helyét Paxinos és Watson stereotaxiás atlasza segítségével határoztuk meg [Paxinos és Watson, 1982]. A koponyán 1 mm átmérıjő nyílást fúrtunk a bregma ponttól 3 mm-re caudalisan és 2 mm-re balra, majd a kemény agyhártyától 8,5 mm-re az agyalap felé vezetve a Hamilton fecskendı tőjének hegyét a 6-OHDA-t a bal substantia nigrába juttattuk. A stereotaxiás mőtétek során az anyagok bejuttatása 5 percig tartott, majd a tő további 5 percig a beadás helyén maradt. Normál kontroll csoportként csak 2 µl fiziológiás sóoldattal kezelt állatokat használtunk.
c. Huntington-chorea modell
A Huntington-chorea modellezéséhez 200-250 gramm súlyú hím Wistar patkányokat használtunk (n=22). Az állatok bal oldali striatumát 180 nmol/ 2 µl koncentrációjú quinolinsavval roncsoltuk. A stereotaxiás mőtét koordinátái: bregma ponttól 1,3 mm-re caudalisan, 3 mm-re balra és a kemény agyhártyától 5 mm-re az agyalap felé.
d. A monosodium glutamát indukálta retinális degeneráció modell
A vizsgálatsorozatot 1 napos Wistar újszülött patkányokon végeztük. Az újszülött hím és nıstény patkányokba szubkután juttattuk be a fiziológiás sóoldatban feloldott MSG-t 2 mg/testsúly dózisban. Korábbi kísérleteink során kétféle szisztémás glutamát kezelés hatását vizsgáltuk. Az egyik vizsgálatban az állatok 5 alkalommal részesültek MSG kezelésben, a születés utáni 1., 3., 5., 7. és 9. napon, míg a másikban csak 3 alkalommal 1., 5. és 9. napon. Mindkét kezelés megközelítıleg hasonló mértékő retinakárosodást okozott, de az 5-ször kezelt állatoknál szignifikánsan nagyobb mortalitást észleltünk. Emiatt jelen vizsgálatunkban az állatok csak 3 alkalommal kaptak MSG-t.
14
C. PACAP kezelés módja
a. PACAP kezelés módja fokális cerebrális ischaemia modellben
A vizsgálat során a különbözı dózisú PACAP-ot stereotaxiás készülék segítségével intracerebroventricularisan adtuk be. A stereotaxiás mőtét koordinátái: a bregma ponttól 0,5 mm-re caudalisan, 1,5 mm-re balra és a kemény agyhártyától 3,5 mm-re az agyalap felé. A különbözı dózisú PACAP-ot fiziológiás sóoldattal 2 µl-re hígítottuk és ezt a mennyiséget lassan, 30 másodperc alatt adtuk be közvetlenül az érelzárás elıtt. A vizsgálat elsı felében az állatokat 0,25 µg (n=8), 0,5 µg (n=10), 1 µg (n=10), 2 µg (n=9) valamint 4 µg (n=8) PACAPpal kezeltük, és 12 órával az operáció után vizsgáltuk az infarktus nagyságát. A kontroll csoport állatai 2 µl fiziológiás sóoldatot kaptak (n=10). Mivel az alkalmazott dózisok közül csak a 2 µg PACAP bizonyult hatékonynak, ezért vizsgálatunk második felében csak ezen dózissal kezeltük az állatokat (n=12), és 24 órával az operáció után vizsgáltuk az infarktus nagyságát. A kontroll csoport 2 µl fiziológiás sóoldatot kapott (n=12). Végezetül vizsgálatunk harmadik szakaszában az állatokat 2 µg PACAP-pal (n=18) kezeltük a mőtétet megelızıen 7 napig. A PACAP-ot naponta egy alkalommal megegyezı idıpontokban (13.00 és 15.00 óra között) adtuk be. A kontroll állatok itt is 2 µl fiziológiás sóoldatot kaptak (n=18).
b. PACAP kezelés módja Parkinson-kór modellben
A PACAP kezelés során a 200-250 gramm súlyú 3 hónapos hím Wistar patkányokat négy csoportba osztottuk. Az egyik csoport 0,01 µg (n=8), a második 0,1 µg (n=8), a harmadik 1 µg (n=12) PACAP kezelésben részesült a 6-OHDA lézió elıtt, a negyedik csoport állatai 2 µl fiziológiás sóoldatot kaptak (n=8). A PACAP-ot 2 µl fiziológiás sóoldatban oldottuk fel, és Hamilton fecskendı segítségével juttattuk be a subtantia nigrába, a lézióval megegyezı korábban megadott koordinátákat alkalmazva.
c. PACAP kezelés módja Huntington-chorea modellben
A PACAP kezelés során az állatokat három csoportba osztottuk. Az egyik csoportot 0,2 µg (n=7), míg a másik csoport állatait 2 µg PACAP-pal kezeltük a quinolinsav lézió elıtt (n=8), a harmadik csoport állatai 2 µl fiziológiás sóoldatot kaptak (n=7). A PACAP-ot 2 µl
15
fiziológiás sóoldatban oldottuk fel, és Hamilton fecskendı segítségével juttattuk be a striatumba, a lézióval megegyezı korábban megadott koordinátákat alkalmazva.
d. PACAP kezelés módja monosodium glutamát indukálta retinális degeneráció modellben
A PACAP kezelés során az állatokat két csoportba osztottuk. Az elsı csoport állatainak egyik oldalon intravitreálisan 1 pmol (n=8) PACAP-ot adtunk postnatális 1., 5., és 9. napon az MSG kezeléssel egyidıben, míg a másik csoport egyedei 100 pmol (n=8) PACAP kezelésben részesültek. Mindkét esetben a PACAP-ot 5 µl fiziológiás sóoldatban oldottuk fel. A korábbi megfigyeléseink során azt tapasztaltuk, hogy az intravitreálisan befecskendezett fiziológiás sóoldat nem okoz morfológiai elváltozást az MSG kezelt kontroll szemhez képest [Gábriel és mtsai, 1993]. Vizsgálatunk során ugyanazon patkány jobb (PACAP kezelt) szeméhez bal (csak MSG kezelt) szemét kontrollként használtuk. A PACAP dózisának kiválasztásához alapul vettük azt a kísérletet, amelyben a PACAP hatását nervus opticus lézióban vizsgálták [Seki és mtsai, 2003].
D. Magatartásvizsgálatok
a. Magatartásvizsgálat fokális cerebrális ischaemia modellben
1. Neurológiai jelek vizsgálata Az agy ischaemiás károsodása következtében kialakult neurológiai jeleket a mőtét után 12 illetve 24 óra elteltével vizsgáltuk. Mivel az okklúzió a bal oldalon volt, az állatok jobb oldalán észleltük a paretikus jeleket. A tüneteket egy 16 eltérı vizsgálatból álló viselkedési teszt segítségével osztályoztuk [Reglıdi és mtsai, 2003b]. Az egyes megfigyelésekhez tartozó szigorú pontozási szabályok lehetıséget nyújtottak arra, hogy az okklúzió következtében kialakult viselkedésbeli eltéréseket objektíven rögzíteni lehessen. A 16 pontból álló neurológiai tesztet korábbi kutatások alapján állítottuk össze [Garcia és mtsai, 1995; Petullo és mtsai, 1999; van der Stay és mtsai, 1996; Zausinger és mtsai, 2000]. Kísérletünk során arra kerestük a választ, hogy a mőtét elıtt beadott különbözı dózisú PACAP javítja-e az ischaemiás károsodás következtében kialakuló neurológiai jeleket, de mivel vizsgálataink során nem találtunk szignifikáns eltérést a kontroll csoport és PACAP-pal kezelt csoport egyedei között, az értekezésben a vizsgálat eredményeit nem részletezzük.
16
2. Orientációs teszt
Annak érdekében, hogy még pontosabban vizsgáljuk az ischaemia után kialakuló neurológiai eltéréseket és szenzoromotoros változásokat, orientációs teszteket is végeztünk. A kísérlet során az elsı csoport 2 µl fiziológiás sóoldatban oldott 2 µg PACAP-ot (n=8), a második csoport 2 µl fiziológiás sóoldatot kapott (n=6) intracerebroventricularisan, majd elzártuk az a. cerebri media eredését. A harmadik és negyedik csoport egyedei hasonló kezelést kaptak (PACAP n=6, kontroll n=6), de itt csak áloperációt végeztünk. A mőtét minden lépését elvégeztük, de nem zártuk el az eret. Az állatok különbözı szenzoros stimulusokkal kiváltott orientációját két nappal az operáció után vizsgáltuk. A normál állatok az inger hatására fejüket az inger felé fordították, vagy fülüket, bajszukat vagy végtagjaikat mozgatták [Lénárd és mtsai, 1982; Marshall és mtsai, 1971]. A vizsgálat során a következı stimulusokat alkalmaztuk: 1., az állatok bajszát, elülsı és hátulsó testfelét mindkét oldalon kis vattaszállal érintettük; 2., vizuális ingerként egy 4x4 cm-es fekete-fehér csíkos kártyát mozgattunk a szemek elıtt; 3., végül akusztikus ingerként mindkét fül mellett kopogtattunk. A kísérlet során mértük az állatok reakcióidejét másodpercben.
b. Magatartásvizsgálat Parkinson-kór modellben
1. Motoros aktivitás és aszimmetrikus jelek vizsgálata
A Parkinson-kór ezen modelljében a legjellemzıbb tünetek a hipokinézia és az egyoldali
roncsolás következtében
kialakuló
aszimmetrikus
neurológiai jelek.
Az
aszimmetrikus jelek dominálnak a léziót követı napokban, de néhány nap múlva spontán részleges javulás észlelhetı [Mokrey, 1995; Nikolaus és mtsai, 1997]. Emiatt a magatartási vizsgálatokhoz több idıpontot is választottunk. Open-field tesztet végeztünk 1 nappal a lézió elıtt, 1 és 10 nappal a léziót követıen. Az operációt megelızı elsı napon végzett vizsgálatok eredményei szolgáltatták a normál, kezeletlen állatok értékeit. A magatartási vizsgálat során az állatokat egy 45x45 cm-es falhosszúságú és 50 cm-es falmagasságú nyitott dobozba helyeztük, amit infravörös lámpával világítottunk meg. Az állatok mozgását 15 percen keresztül videokamerával rögzítettük, mindig ugyanabban a napszakban délután 13-15 óra között. A munkánk során kettıs vak vizsgálatot végeztünk, a videofelvételeket értékelı vizsgáló nem ismerte a kapott kezelést.
17
A magatartási jeleket két fı csoportba osztottuk, vizsgáltuk a hipokinetikus jeleket valamint a féloldali lézió kövekezményeképpen kialakuló aszimmetrikus jeleket. A motoros aktivitás értékelése során mértük a mozgással eltöltött idıt és a 15 perc alatt megtett távolságot. Aktív mozgásnak számított, amikor az állat a horizontális síkban elıre vagy hátra mozgott olyan sebességgel, hogy 5 másodpercen belül minden végtagjával lépett, vagy legalább felemelte azokat [van Oosten és Cools, 2002]. Motoros aktivitási jelként vizsgáltuk az ágaskodó magatartást, amely során értékeltük a szabad ágaskodások és a falhoz támaszkodások számát, valamint a szabad ágaskodás százalékos arányát az összes ágaskodás számához viszonyítva. A teljes nyugalmi idınek számítottuk azt az idıt, ami alatt az állatok semmilyen aktivitást nem mutattak, nem mozgatták fejüket, végtagjaikat, és tisztálkodó mozgást sem végeztek. Mindezen tünetekbıl a hipokinézia súlyosságára tudtunk következtetni [van Oosten és Cools, 2002]. Az aszimmetrikus jelek értékelése kapcsán vizsgáltunk a spontán jobbra és balra irányuló forgásokat (egy forgásnak az számított, ha az állat 90 fokot fordult a megadott irányba) [Nikolaus és mtsai, 1997; Schwarting és Huston, 1996a,b]. Ezen kívül számoltuk az ágaskodások számát, amikor az állat bal vagy jobb mellsı végtagjaival a falnak támaszkodott [Lundblad és mtsai, 2002]. Továbbá értékeltük az aktív thigmotaxist, azaz a fal melletti (5 cm-nél közelebb a falhoz) mozgások számát (egy egységnek számítottuk, ha az állat az egész fal hosszában végigment), figyelembe véve azt, hogy az állat jobb vagy bal oldala érintkezett a fallal [Schwarting és Huston, 1996a,b; Steiner és mtsai, 1988; Sullivan és mtsai, 1994]. A substantia nigra féloldali 6-OHDA lézióját követıen az állatok az elsı napokban kifejezett aszimmetriát mutattak. Az aszimmetrikus tünetek közül a legdominánsabb jel az állatok spontán aszimmetrikus forgása volt, ami csaknem kizárólag a lézió oldalára irányuló mozgást jelentett [Nikolaus és mtsai, 1997]. Ezen kívül az ágaskodó magatartás során dominált az ipsilateralis végtaggal való kitámasztás [Lundblad és mtsai, 2002], és az ipsilateralis oldallal a fal mellett eltöltött idı [Sullivan és mtsai, 1994].
2. Apomorphin-teszt
A mőtét utáni 2. héten apomorfinnal indukált forgási tesztet végeztünk. Az egyoldali roncsolás miatt oldalkülönbség alakult ki a dopamin receptor agonista apomorfinnal szembeni érzékenységre [Mokrey, 1995]. Az állatok 0,1 mg/kg apomorfint kaptak szubkután, mely a lézióval ellentétes oldalra irányuló forgó mozgást váltott ki. Ezt a beadást követıen 30 percig
18
ellenıriztük, számoltuk a 360 fokos jobbra irányuló forgások számát. Mindezen motoros tesztekbıl a lézió súlyosságára, illetve a javulási tendenciára tudtunk következtetni.
c. Magatartásvizsgálat Huntington-chorea modellben
1. Motoros aktivitás és aszimmetrikus jelek vizsgálata A Huntington-chorea ezen modelljében a legjellemzıbb tünetek a hiperkinézia és az egyoldali roncsolás következtében kialakuló aszimmetrikus neurológiai jelek. A magatartási vizsgálatot a Parkinson-kór modellnél részletezett protokoll alapján végeztük, de itt 30 nappal a lézió után is megvizsgáltuk az állatokat. Az értékelés során vizsgáltuk az állatok aktív mozgással eltöltött idejét és az összes forgások számát. Mindezekbıl a hiperkinézia súlyosságára tudunk következtetni. Az aszimmetrikus jelek közül értékeltük az aszimmetrikus forgást, ágaskodó magatartást és thigmotaxist.
2. Katalepszia teszt A mőtét után 3 héttel haloperidol indukálta katalepszia tesztet végeztünk. Az állatokat 0,5 mg/kg haloperidollal kezeltük intraperitonealisan és két órával a beadást követıen végeztük el a teszteket. A katalepszia teszt során az állatokat egy nehezített testhelyzetbe állítottuk be, és mértük a mozdulatlansággal eltöltött idıt [Sanberg és mtsai, 1988]. A katalepszia teszt során három különbözı nehezített testtartásban vizsgáltuk az állatokat. Az elsı két tesztben az állatok mellsı mancsait egy 7 cm magasan elhelyezkedı és 3 cm átmérıjő, és egy 10 cm magasan elhelyezkedı és 4 cm átmérıjő rúdra helyeztük úgy, hogy a hátsó végtagjai a földön maradtak, és ebben a pozícióban mértük azt az idıt, amit mozdulatlanul töltöttek. A harmadik helyzetben egy 7 cm átmérıjő, oldalára fektetett befıttes üvegre helyeztük az állatok mellsı mancsait, és így mértük a mozdulatlanság idejét. A három teszt különbözı nehézségő fokozatot jelentett, hiszen a magasabb rúdon nehezebb megkapaszkodni és mozdulatlanul maradni, valamint ennél is nagyobb erı kell az állatoknak ahhoz, hogy az oldalára fektetett mozgó üvegen megtartsák helyzetüket, ezért itt is kevesebb idıt tudtak az állatok mozdulatlanul tölteni.
19
E. Morfológiai vizsgálatok
a. A károsodott agyterület értékelése fokális cerebrális ischaemia modellben
A vizsgálattól függıen 12, 24 órával a mőtét után éter narkózisban dekapitáltuk az állatokat. Az agyat 1 percen belül eltávolítottuk, 98%-os isoamyl alkoholban –20 fokosra fagyasztottuk, majd az agyból szeletelı mátrix (Braintree) segítségével 6 db 2 mm-es szeletet készítettünk. Az elhalt területek és az épen maradt részek arányának pontos megállapításához 2%-os fiziológiás sóoldatban oldott 2,3,5-triphenyltetrazolium chloridot (TTC) használtunk, amibe kb. 20 percig bele tettük a szeleteket, majd 10%-os formalinban fixáltuk. A festék a mitokondriális reduktázok kimutatására alkalmas, melyek az ép sejtekben a tetrazolium sót egy sötétvörös vegyületté alakítják át. Az elhalt sejtekben ez az enzim nem mőködik, ezért a terület nem festıdik, fehér marad [Bederson és mtsai, 1986]. A festett agyszeleteket digitális kamerával lefényképeztük, majd a digitális képeket NIH Image program segítségével analizáltuk. Az elhalt terület nagyságát az egész agyterület százalékában adtuk meg, így lehetıség nyílt az egyes infarktusok nagyságának összehasonlítására.
b. Szövettani vizsgálat Parkinson-kór modellben
A viselkedési teszteket követıen az állatokat intracardialisan 100 ml fiziológiás sóoldattal, majd ezt követıen 100 ml 4%-os paraformaldehiddel perfundáltuk. A fixálás után az agyat eltávolítottuk, az utófixálás egy éjszakán át tartott. Vibratom segítségével 50 µm-es frontális metszeteket készítettünk a mesencephalon substantia nigrát tartalmazó területébıl. A dopaminerg neuronokat tirozin-hidroxilázzal (TH), a dopamin szintézis enzimjének immunhisztokémiai kimutatásával azonosítottuk TH elleni monoklonális egér antitestet (1: 1000) használva. A metszeteket 48 órán át 4oC-on TH antiszérummal, majd ezt követıen 1 órán keresztül biotinált anti-egér IgG-vel inkubáltuk, ezek után adtuk hozzá az avidinbiotinált-peroxidáz komplexet az ABC kit leírását követve. A színreakciót diaminobenzidinnel (DAB) váltottuk ki (10 mg DAB/100 ml TRIS pufferben, pH: 7,5-7,6; 10 µl H2O2). Mikroszkópos kontroll mellett átlagosan 10 percig inkubáltuk a metszeteket. A metszeteket digitalizáltuk Nikon FXA fotómikroszkóphoz rögzített digitális kamera segítségével, majd a Scion Image számítógépes programmal mind a contralateralis, mind az ipsilateralis oldalon a substantia nigra pars compacta területén (A9 sejtcsoport) és a ventralis
20
tegmentalis areában (A10 sejtcsoport) megszámoltuk a TH-pozitív sejteket. Mivel a metszetek vastagsága 50 µm és a pozitív sejtek átlag mérete 30 µm volt, ezért a vastag metszetekben a léziós oldalon talált sejtszámot elfogadtuk az ugyanolyan módszerrel a kontroll oldalon számolt sejtszámhoz való összehasonlításhoz. A sérült oldal sejtszámát az ép oldal százalékában adtuk meg.
c. Szövettani vizsgálat Huntington-chorea modellben
A quinolinsav intrastriatális injectiója szelektív neuronális károsodást hoz létre a striatumban. Az aktivitási tesztek befejezése után az állatokat 4%-os paraformaldehidben fixáltuk, és az agy striatumot tartalmazó részébıl metszeteket készítve, NADPH-diaforáz festéssel megfestettük [Roberts és mtsai, 1993]. A korábban leírt módszer szerint mind a contralateralis, mind az ipsilateralis oldalon a striatum területén megszámoltuk a NADPHdiaforáz pozitív sejteket. Ezután a sérült oldal sejtszámát az ép oldal sejtszámának százalékában adtuk meg.
d. Szövettani vizsgálat monosodium glutamát indukálta retinális degeneráció modellben
A patkányokat 3 hetes korukban dolgoztuk fel. Altatás után a patkányokat 4%-os paraformaldehiddel fixáltuk, és mindkét szemüket eltávolítottuk. Miután feltártuk a corneat és az irist, a szemlencsét eltávolítottuk, és a szem hátsó részét tovább fixáltuk egy éjszakán át. Ezután két félre vágtuk, dehidráltuk, majd Durcupan gyantába ágyaztuk. Reichert Supernova mikrotóm segítségével félvastag (2 µm) metszeteket készítettünk, majd ezeket zselatinnal elıkezelt tárgylemezre helyeztük. Ezután a metszeteket Nissl szerint megfestettük, majd lefedtük. Digitális kamerával felszerelt Nikon FXA fotómikroszkóp segítségével a metszetet lefényképeztük. A retinarétegek vastagságának értékeléséhez NIH Image 1.55 programot alkalmaztunk, ahol a különbözı rétegek vastagságát azonos területrıl készült metszetben mértük le. Vizsgálatunk során lemértük a belsı sejtes réteg (INL) és a belsı rostos réteg (IPL) vastagságát, valamint a külsı és a belsı határhártya közti távolságot (ILM-OLM távolság), ily módon kizártuk a külsı fotoreceptorok nagyfokú variabilitása miatt kialakuló különbségeket.
21
F. A testhımérséklet, a szisztémás vérnyomás és lokális agyi keringés vizsgálata
A mőtét alatt az állatok hımérsékletét rectalis hımérıvel ellenıriztük, ugyanis korábbi vizsgálatok során megfigyelték, hogy az infarktus következményeképpen kialakuló magas hımérséklet befolyásolja a nekrotikus terület nagyságát [Reglıdi és mtsai, 2000a,b]. A keringés nagymértékben befolyásolja az ischaemiás károsodás mértékét, ezért kísérleteink során regisztráltuk a patkány artériás vérnyomásának változását PACAP kezelés után. Medián laparotomiával feltártuk az aorta abdominalist, majd az érbe kanült (Vasculon 18G) vezettünk és azt rögzítettük. A véralvadás gátlására 0,1 ml Na-Heparint alkalmaztunk 24 ml-re feloldva, és ezzel folyamatosan átmostuk a csapot. Emellett az állat végtagjaira EKGelektródokat helyeztünk, így pulzusát is mérni tudtuk. A 2 µg PACAP-ot a mérés során intracerebroventricularisan adtuk be. A beadást követıen 1, 5, 10, 15, 20, 25 perccel rögzítettük a vérnyomást. Egy másik kísérletben (n=6) pentobarbitál anesztézia alatt a parietalis cortex keringését mértük lézer dopplerrel. Ezt a mőszert gyakran használják a lokális agyi keringés akut változásainak detektálására [Dirnagl és mtsai, 1989]. A bregma mögött 1 mm-re, 5 mmre balra 1 mm átmérıjő nyílást fúrtunk, majd a detektort az ép dura felszínére helyeztük. Fiziológiás sóoldatot fecskendeztünk a detektor és a dura közé, hogy a vizsgálat során a direkt kontaktus fennmaradjon. Az állatok bal oldalkamrájába 2 µg PACAP-ot valamint fiziológiás sóoldatot injektáltunk, és a lokális agyi keringés változását 1 órán keresztül mértük. Az értékeket a beavatkozás elıtt mért értékek százalékában adtuk meg.
G. Statisztika
Az eredményeket átlag±SEM formában adtuk meg. A magatartásvizsgálatok parametrikus adatait ANOVA teszttel hasonlítottuk össze, melyet Neumann-Keul post-hoc analízis követett. A tesztek nonparametrikus adatait, valamint a forgások számát Dunn posthoc analízissel értékeltük a nonparametrikus ANOVA tesztet követıen. Az aszimmetria fokát egy csoporton belül Mann-Whitney teszttel vizsgáltuk. A TH-pozitív sejtek számát Dunn post-hoc analízissel hasonlítottuk össze a varianciaanalízist követıen. A NADPH-diaforáz pozitív sejtek számát a léziós és az ép oldalon Student-t teszttel hasonlítottuk össze. A különbözı retinális rétegek vastagságának összehasonlításához ANOVA tesztet alkalmaztunk, majd ezután Neumann-Keul`s posthoc analízis követett. A P <0,05 eredmények esetén az eltérést szignifikánsnak tekintettük.
22
V. PREVENTÍV PACAP KEZELÉS HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA FOKÁLIS CEREBRÁLIS ISCHAEMIÁBAN
A. Eredmények
a. Orientációs teszt
Az orientációs tesztben nem találtunk szignifikáns eltérést a csoportok között az operáció elıtt. Az áloperált állatok értékei a mőtét után sem változtak szignifikánsan. Ezzel szemben az a. cerebri media elzárása után a contralateralis oldalon mért reakcióidık szignifikánsan növekedtek mind a kontroll, mind a PACAP kezelt csoportoknál. A kontroll és a PACAP-pal kezelt léziós állatok értékei közt csak egy tesztben találtunk szignifikáns eltérést. A PACAP-pal kezelt állatok szignifikánsan rövidebb idı alatt reagáltak a hátsó testrész érintésére, mint a kontroll állatok (V.1. ábra).
3
áloperált kontroll áloperált PACAP
2,5
MCAO kontroll
Reakcióidı (sec)
MCAO PACAP 2
1,5
1
* 0,5
0 bajusz
elülsı testfél
hátulsó testfél
vizuális inger
akusztikus inger
V.1. ábra. Az ábra a különbözı orientációs tesztekben mért reakcióidıt jelölik másodpercben (átlag±SEM) az áloperált kontroll és PACAP-pal kezelt, valamint az a. cerebri media okklúzión átesett kontroll és PACAP-pal kezelt csoportokban. Bal oldali oszlopok az operációt megelızı, a jobb oldaliak a mőtét utáni értékeket mutatják.*P<0,05.
23
b. Károsodott agyterület nagyságának értékelése
A kísérletünk elsı felében az állatokat 12 órával a léziót követıen dolgoztuk fel, ugyanis ebben az idıben az infarktus nagysága megközelítıleg már 10%-a a teljes agyterületnek. Mivel korábban in vivo kísérletekben pmol-os koncentrációjú folyamatos infúzióval biztosították a PACAP állandó vérszintjét [Reglıdi és mtsai, 2000a,b], ezért mi is alacsony dózissal 250 ng-mal kezdtük vizsgálatainkat. Ezekben az állatokban az infarktus nagysága 15,93±3,4%-a volt a teljes agyterületnek, ami nem tért el szignifikánsan a kontroll csoportnál mért 14,85±7,2%-tól. Mivel ez a dózis nem bizonyult hatékonynak, a dózist 500 ng-ra, 1 , 2 illetve 4 µg-ra emeltük. Az elızıhöz hasonlóan az 500 ng-os, 1 µg-os és 4 µg-os dózissal sem értünk el szignifikáns eredményt, az 500 ng-os csoportban az infarktus nagysága 14,87±3%-a, az 1 µg-os csoportnál 11,70±2,3%-a volt a teljes agyterületnek. Ezzel szemben a 2 µg-os csoportban a mőtét elıtt intracerebroventricularisan beadott PACAP szignifikánsan csökkentette az infarktus nagyságát, ugyanis az infarktus területe 5,85±3,2%-ra csökkent (V.2. ábra). Ezek után azt vizsgáltuk, hogy a PACAP hogyan befolyásolja az infarktus végsı nagyságát, ami az okklúzió után 24 órával mérhetı. Ezért a következı csoportot 24 órával a mőtétet követıen dolgoztuk fel. A 2 µg PACAP itt is hatásosnak bizonyult, ugyanis a kontroll álltokban mért 21,53±9,4%-os agykárosodást 10,25±5,3%-ra csökkentette (V.3. ábra). Az infarktus mérése során külön kiszámoltuk, hogy a teljes infarktusnak mekkora részét teszi ki a striatumban található nekrózis. A vizsgálat során 12-20% közötti értékeket kaptunk mind a kontroll, mind a PACAP kezelt csoportoknál. A nekrózis a legtöbb esetben a striatum laterális részét és az ezt körülvevı cortexet érintette. Ezen vizsgálatok után a preventív kezelés kivitelezésére került sor. Az állatokat 7 napon keresztül kezeltük 2 µg PACAP-pal, és az infarktus nagyságát 24 óra múlva vizsgáltuk. Kísérleteink során hasonló eredményt értünk el, mint az egyszeri dózissal, hiszen az infarktus nagysága 10,6±2,1%-a volt az egész agyterületnek, ami nem különbözött szignifikánsan az egyszeri dózisnál mért 10,25±5,3%-os értéktıl (V.3., 4. ábra).
24
Infarktus nagysága (%)
25 20 15 10
*
5 0
kontroll
250 ng
500 ng
1000 ng
2000 ng
4000 ng
V.2. ábra. Az ábra az infarktusok nagyságát mutatja az egész agyterület százalékában kifejezve 12 órával az operációt követıen a különbözı dózisú PACAP-pal kezelt csoportokban (átlag±SEM). *P<0,05.
Infarktus nagysága (%)
35
kontroll
30
PACAP
25 20
* 15
*
10 5 0
akut
krónikus
V.3. ábra. Az ábra az infarktusok nagyságát mutatja a teljes agyterület százalékában kifejezve 24 órával az operációt követıen 2 µg PACAP egyszeri (akut) és ismételt (krónikus) beadását követıen (átlag±SEM). *P<0,05.
25
V.4. ábra. Az ábrák egy reprezentatív kontroll állat (A) és egy preventív PACAP kezelésben részesült állat (B) ischaemiás károsodását (szürke terület) mutatják különbözı coronalis metszeteken. A szaggatott vonalak egy-egy variációt jelölnek.
26
c. A testhımérséklet, a szisztémás vérnyomás és a lokális agyi keringés vizsgálata
Az állatok hımérsékletét a mőtét után minden esetben ellenıriztük, és nem találtunk szignifikáns eltérést a kontroll állatokéhoz viszonyítva. A kísérlet során elpusztult állatok számában sem volt szignifikáns eltérés az egyes kísérleti csoportok között. Az artériás vérnyomás vizsgálata során nem találtunk szignifikáns eltérést a 2 µg PACAP intracerebroventricularis beadása után. Az artériás vérnyomás értéke 101,6±3,6, 102,1±4,3, 97,6±4,7, 98,2±4,5 és 103,1±3,9 Hgmm volt a beadás elıtt, 1 perccel, 10 perccel, 30 perccel és egy órával a beadást követıen. A corticalis agyi keringést a PACAP intracerebroventricularis beadását követıen 11 idıpontban mértük. Az ábrán jól látható, hogy a corticalis agyi keringés a PACAP beadást követıen emelkedik az elsı 15 percben, 20 perc múlva eléri a maximális értéket, amely szignifikánsan magasabb a kiindulási értéknél, majd fokozatosan visszatér az eredeti szintre. A kontroll állatok esetében nem észleltünk változást
Lokális agyi keringés (%)
az agyi keringésben (V.5. ábra).
140
*
130 120 110 100 90 80 0
1
2
5
10 15 20 25 30 40 50 60 Percek
V.5. ábra. Az ábra a lokális agyi keringés változását mutatja intracerebroventricularis PACAP kezelés után a kezelés elıtt mért érték százalékában kifejezve (átlag±SEM). *P<0,05.
27
B. Az eredmények értékelése Kísérletünkben kimutattuk, hogy a lézió elıtt intracerebroventricularisan beadott 2 µg PACAP szignifikánsan csökkenti a károsodott agyterület nagyságát, és nem találtunk szignifikáns különbséget az egyszeri és a preventív kezelés hatékonysága közt. A PACAP neuroprotektív hatásának lehetséges mechanizmusát az utolsó fejezetben tárgyaljuk. A neurológiai vizsgálat során nem találtunk szignifikáns eltérést a PACAP-pal kezelt és a kontroll állatok között, ezzel ellentétben az orientációs tesztben a hátsó testfél érintését követı reakcióidı szignifikánsan csökkent a PACAP-pal kezelt állatokban a kontroll csoporthoz képest. Számos neuroprotektív anyag vizsgálata során volt már példa arra, hogy az anyag csökkentette a lézió nagyságát, de nem javította a neurológiai jeleket [Campbell és mtsai, 1997; Yamaguchi és mtsai, 1995]. A neurológiai tünetek kialakulásáért felelıs agyterületek az infarktus centrumában találhatók, emiatt a neuroprotektív szerek, amelyek a penumbra területének csökkentésével fejtik ki hatásukat, nem képesek javítani szignifikánsan ezen jeleket [Campbell és mtsai, 1997]. Emiatt van szükség olyan finom tesztekre, mint például az orientációs teszt, amely segítségével kis eltérések is kimutathatók. Vizsgálataink során kimutattuk, hogy a PACAP-pal kezelt állatok gyorsabban reagáltak a hátsó testfél érintésre, mint a kontroll állatok. Az jól ismert, hogy míg az elülsı testfél reprezentációja az infarktus centrumában, addig a hátsó testfélé a dorsomediális cortexben található, ami a penumbra területéhez tartozik, és a legtöbb PACAP-pal kezelt csoportban épen maradt [Reglıdi és mtsai, 2000a,b]. Korábbi kutatásokhoz hasonlóan jelenlegi vizsgálatunk során mi is azt találtuk, hogy az azonos módszerrel történı okklúzió ellenére az állatokban különbözı nagyságú agyterület pusztul el. Az eltérı eredményeket okozhatja az erek anatómiai variabilitása [Cai és mtsai, 1998; Fox és mtsai, 1993], vagyis az eltérı kollaterális keringés. A speciális anatómiai eltérések néhány kísérletben az intraluminális filamentum megfelelı felhelyezését is nehezítették. Az infarktus nagyságát befolyásolja ezen kívül a patkányok kora és mérete is. Egyes kísérletekben kimutatták, hogy a nagyobb 300-400 gramm súlyú állatokban az infarktus nagysága a fejlettebb kollaterális keringés miatt kisebb mérető [Longa és mtsai, 1989], míg mások szerint az öregebb állatokban az azonos módszer nagyobb mérető infarktust okozott [Oliff és mtsai, 1995]. Ábrahám és mtsai kimutatták, hogy a korábban felsorolt tényezık mellett a filamentum mérete is befolyásolja a végleges infarktus nagyságát [Ábrahám és mtsai, 2002]
28
Az MCAO elvégzése során komplikációk is felléphetnek. Elıfordulhat vérzés mind a mőtét alatt, mind pedig a mőtétet követıen egyaránt. Újabb kísérletek során bizonyossá vált, hogy a subarachnoidális vérzés sokkal gyakoribb komplikáció, mint azt korábban hitték [Schmid-Elsaesser és mtsai, 1998]. A mőtétet követıen a nem megfelelı rögzítés miatt ritkán a filamentum is elmozdulhat, amely következményeképpen nem jön létre megfelelı okklúzió. Ezen okok miatt mind a kontroll mind a PACAP kezelt csoportban közel azonos számú állat hullott el, tehát a PACAP nem változtatott a mortalitáson. Az elhullt állatok mellett, azon patkányokat is kizártuk a vizsgálatból, ahol a feldolgozás során nem találtunk infarktust. Ezen állatok a neurológiai vizsgálat során alacsony pontszámot szereztek, ezért már ebbıl következtethettünk arra, hogy a mőtét nem volt sikeres. A PACAP nagy mennyiségben megtalálható az agy és a pia mater artériáinak falában, és az agyi erekben vasodilatációt hoz létre [Seki és mtsai, 1995; Uddmann és mtsai, 1993]. Esetünkben a corticalis keringés a PACAP beadást követıen az elsı 20 percben szignifikánsan emelkedett, majd fokozatosan visszatért az eredeti szintre. Hasonló eredmények születtek korábbi kísérletekben, ahol kutyákban vizsgálták a lokális agyi keringést PACAP adása után [Seki és mtsai, 1995]. Másik kísérletekben csak 0,5-5 µg dózisú PACAP emelte szignifikánsan a lokális agyi keringést [Uddmann és mtsai, 1993], és in vitro kísérletekben, ahol izolált kutya és patkány cerebrális ereken kísérleteztek, szintén csak a nano-mikromoláris koncentrációval értek el vasorelaxációt [Anzai és mtsai, 1995]. Bár a PACAP effektív vasodilatátora az agyi ereknek, hatását csak magasabb koncentrációban képes kifejteni.
29
VI. 6-OHDA INDUKÁLTA EGYOLDALI SUBSTANTIA NIGRA LÉZIÓ VIZSGÁLATA KÜLÖNBÖZİ NEMŐ ÉS KORÚ PATKÁNYOKBAN
A. Eredmények
a. Magatartásvizsgálat
A fiatal hím és nıstény állatok a 6-OHDA kezelést megelızıen szignifikánsan többet mozogtak, mint az öreg állatok, de az azonos korú nıstények és hímek között nem volt szignifikáns különbség (VI.1.A. ábra). 1 nappal az operáció után az aktivitás szignifikánsan lecsökkent az összes állatcsoportban. Az öreg hímek sokkal súlyosabb hipokinetikus tüneteket mutattak, mint a fiatal hímek, de nem találtunk szignifikáns eltérést a fiatal és öreg nıstények aktivitásában 1 nappal az operációt követıen. Bár az aktivitáscsökkenés sokkal súlyosabb volt a fiatal nıstény állatoknál, mint a fiatal hímeknél, az aktivitás mind a fiatal, mind az öreg nıstények esetében 10 nappal az operációt követıen visszatért a normál szintre, míg a hím állatok még 10 nappal késıbb is szignifikánsan kevesebbet mozogtak a 0 napos értékekhez képest. A megtett távolság értékelése során az aktív mozgáshoz hasonló eredményeket kaptunk (VI.1.B. ábra). Az öreg állatok szignifikánsan kisebb utat tettek meg az operáció elıtt, és nem volt különbség az azonos korú hím és nıstény állatok között. A megtett távolság az öreg nıstény állatok kivételével szignifikánsan csökkent 1 nappal a 6-OHDA léziót követıen minden állatcsoportban. Az öreg hím állatoknál tapasztaltuk a legsúlyosabb hipokinetikus jeleket. A fiatal és az öreg nıstények által megtett távolság között egyik idıpontban sem volt szignifikáns eltérés, és mindkét csoport értékei a 10. napra visszatértek a normál szintre, míg a fiatal és öreg hím állatok 10 nappal a léziót követıen is szignifikánsan kisebb utat tettek meg. A normál öreg állatok az operáció elıtt a többi aktivitási jelhez hasonlóan szignifikánsan
kevesebbet ágaskodtak a fiatal állatokhoz viszonyítva (VI.1.C. ábra). Az
ágaskodások száma szignifikánsan csökkent az operációt követıen mindegyik csoportban. A legsúlyosabb csökkenés az öreg hímeknél volt, amik az operációt követı napon nem is ágaskodtak. Az ágaskodások száma egyik csoportnál sem tért vissza a normál szintre 10 nappal az operáció után, de a nıstény állatok szignifikánsan többet ágaskodtak a hím állatokhoz képest.
30
0 nap 1 nap 10 nap
350
Mozgási idı (sec)
300 *
250
##
*
200
###
+
+
150
*
***
***
##
100
***
50 0 fiatal hím
A
fiatal nıstény
öreg hím
öreg nıstény
0 nap 1 nap 10 nap
2500 +
Megtett út (cm)
2000
++ ###
1500
*
**
++
###
*
**
1000
*** 500
#
0 B
fiatal hím
fiatal nıstény
öre g hím
öre g nıstény
50
0 nap 1 nap 10 nap
Ágaskodások száma
45 40 +
35
**
30
# # +
25 20 15
***
** **
10
++
*** #
5
***
***
***
0 C
fiatal hím
fiatal nıstény
öreg hím
öreg nıstény
VI.1. ábra. Az ábrák a fiatal és idıs, hím és nıstény állatok mozgással töltött idejét (A), mozgás során megtett távolságát (B), ágaskodásaik számát (C) jelölik (átlag±SEM) a 6OHDA lézió elıtt (0 nap), valamint 1 és 10 nappal a léziót követıen. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 vs 0 napos értékek egyazon csoporton belül; #P<0,05, ##P<0,01, ###P<0,001 vs azonos nemő fiatal csoport ugyanazon idıpontban; +P<0,05, ++P<0,01 vs azonos korú hím csoport ugyanazon idıpontban.
31
A motoros aktivitás csökkenésével párhuzamosan az idıs hímek kivételével minden állatcsoportban szignifikánsan megnıtt a mosakodó magatartással eltöltött idı mindkét vizsgált idıpontban. A teljes inaktivitással eltöltött idı, amikor az állat semmilyen mozgást nem végzett, közel nulla volt az operáció elıtt. A mosakodó magatartással töltött idı növekedése mellett a teljes inaktivitással töltött idı is szignifikánsan emelkedett a léziót követıen minden állatcsoportban (VI.2. ábra). Az idıs hím állatok 1 nappal az operáció után több idıt töltöttek mozdulatlanul, mint a fiatal hímek és az idıs nıstények, míg a fiatal és az idıs nıstények között szignifikáns eltérést nem találtunk. A 10. napra minden csoport javulást mutatott, de egyik csoport sem érte el az operáció elıtti értékeket.
#
300
0 nap
Te lje s ny uga lm i idı (s e c )
***
1 nap
250 200
10 nap
*** ++
150
***
*** *** ++
100
***
*** ++
50
* 0 fiatal hím
fiatal nıstény
öreg hím
öreg nıstény
VI.2. ábra. Az ábra a fiatal és idıs, hím és nıstény állatok teljes nyugalomban töltött idejét jelöli (átlag±SEM) a 6-OHDA lézió elıtt (0 nap), valamint 1 és 10 nappal a léziót követıen. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 vs 0 napos értékek egyazon csoporton belül; # P<0,05, ##P<0,01, ###P<0,001 vs azonos nemő fiatal csoport ugyanazon idıpontban; +P<0,05, ++ P<0,01 vs azonos korú hím csoport ugyanazon idıpontban.
32
Az operáció elıtt az állatok közel azonos számban forogtak mindkét irányban. 1 nappal a 6-OHDA léziót követıen az állatok szignifikánsan többet forogtak a bal oldalra (VI.3. ábra). Az aszimmetria mind a fiatal mind az idıs hímeknél 10 nappal az operációt
Forgások száma
követıen is fennállt, míg a nıstény állatoknál eltőnt a bal oldali túlsúly. 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
bal jobb
0 A
Forgások száma
***
***
1
10
Napok
50
bal
40
jobb
30 20 **
10 0
0
B
1
10
Napok
bal jobb
Forgások száma
50 40 30 20 ***
10
***
0
0 C
1
10
Napok
bal
Forgások száma
25
jobb
20 15 10 **
5 0
0 D
1
10
Napok
VI.3. ábra. Az ábrák a fiatal hímek (A) és nıstények (B), valamint az idıs hímek (C) és nıstények (D) forgásainak számát ábrázolják (átlag±SEM) a lézió elıtt (0 nap), valamint 1 és 10 nappal a léziót követıen.*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.
33
1 nappal az operáció után az állatok ágaskodó mozgása is aszimmetrikus volt, a patkányok szignifikánsan többet támaszkodtak bal mellsı végtagjukkal, pedig a lézió elıtt az ágaskodó magatartás során mindkét végtagjukat egyformán használták (VI.4. ábra). Ezen jeleket az idıs hím állatoknál nem tudtuk értékelni, mert az öreg hímek nem ágaskodtak egyet sem a megfigyelés ideje alatt (V.4.C. ábra). A 10. napra az ágaskodásban csökkent a bal oldali dominancia, de a javulás csak a fiatal nıstényeknél volt szignifikáns, mivel itt az aszimmetria
Ágaskodások száma
teljesen eltőnt. bal jobb
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
*
0
Ágaskodások száma
A
bal jobb
8 7 6 5 4 3 2 1 0
*
0
Ágaskodások száma
1
10
Napok
6
bal
5
jobb
4 3 ***
2 1 0
0 C
Ágaskodások száma
10
Napok
B
1
10
Napok
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
bal jobb
*
**
0 D
1
*
1
10
Napok
VI.4. ábra. Az ábrák a fiatal hímek (A) és nıstények (B), valamint idıs hímek (C) és nıstények (D) ágaskodásainak számát ábrázolják (átlag±SEM) a lézió elıtt (0 nap), valamint 1 és 10 nappal a léziót követıen.*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.
34
Hasonló eredményeket kaptunk a thigmotaxis vizsgálata során. Az állatok szignifikánsan többet támaszkodtak bal oldalukkal a falnak mozgás közben 1 nappal a lézió
Fal melletti mozgás
után, de csak a fiatal nıstényeknél szőnt meg az aszimmetria 10 nappal késıbb (VI.5. ábra). 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
bal jobb
* *
0
1
Fal melletti mozgás
bal
20
jobb 15 10
*
5 0 0
1
10
Napok
B
Fal melletti mozgás
10
Napok
A
14
bal
12
jobb
10 8 6
**
4
*
2 0
0
Fal melletti mozgás
C
10
30
bal
25
jobb
20 15
**
10
**
5 0
0 D
1 Napok
1
10
Napok
VI.5. ábra. Az ábrák a fiatal hímek (A) és nıstények (B), valamint idıs hímek (C) és nıstények (D) fal melletti mozgásainak számát ábrázolják (átlag±SEM) a lézió elıtt (0 nap), valamint 1 és 10 nappal a léziót követıen.*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.
35
b. Szövettani vizsgálat
TH-immunhisztokémia segítségével vizsgáltuk a dopaminerg sejtek számát a substantia nigra pars compactájában mind a léziós, mind az ép oldalon. Az intakt oldalon található dopaminerg sejtek száma megegyezett minden állatcsoportban. A 6-OHDA léziót követıen a hím állatokban szignifikánsan csökkent a substantia nigra pars compactájában található dopaminerg sejtek száma. A dopaminerg sejtek közel 94%-a pusztult el a léziós oldalon a hím állatokban, de szignifikáns különbséget nem találtunk a fiatal és az öreg hím állatok sejtpusztulása között (VI.6., 7. ábra). Ezzel szemben a nıstény állatoknál szignifikánsan kisebb mértékő sejtpusztulást találtunk, ami megközelítıleg 60-70%-a volt az époldali sejtszámnak. Bár az öreg nıstényeknél vizsgálataink során 10%-kal több sejt pusztult
A dopaminerg sejtek száma a léziós oldalon
el a fiatal nıstényekhez viszonyítva, ez a különbség nem volt szignifikáns.
70
+++ 60 50
++
40 30 20 10 0
fiatal hím
fiatal nıstény
öreg hím
öreg nıstény
VI.6. ábra. A TH-immunpozitív sejtek száma a substantia nigra pars compactájában a léziós oldalon az ép oldalon található sejtszám százalékában kifejezve (átlag±SEM). ++ P<0,01, +++P<0,001.
36
A
200 µm
B
200 µm
C
200 µm
D
200 µm VI.7. ábra. Egy reprezentatív fiatal hím (A) és nıstény (B), valamint idıs hím (C) és nıstény (D) állat substantia nigra pars compactája TH-immunhisztokémiával jelölve a 6OHDA léziót követıen. A hím állatokban (A,C) szignifikánsan csökkent a dopaminerg sejtek száma a léziós oldalon (bal), ezzel szemben a nıstény állatoknál (B,D) kisebb mértékő sejtpusztulást találtunk. Az azonos állatból készült felvételekhez egyforma nagyítást használtunk.
37
B. Az eredmények értékelése Vizsgálatunkban kimutattuk, hogy a 6-OHDA léziót követıen a nıstény állatoknál kevesebb dopaminerg sejt pusztult el a substantia nigrában, és a lézió következtében kialakuló magatartási eltérések is jóval enyhébbek voltak, mint a hím egyedeknél. Ebbıl arra következtethetünk, hogy a nıstény állatok kevésbé érzékenyek a 6-OHDA károsító hatására, mint a hím állatok. Bár az idıs állatok magatartásbeli eltérései sokkal súlyosabbnak bizonyultak, a szövettani vizsgálat során nem találtunk nagyobb sejtpusztulást az öreg állatoknál, mint a fiatal patkányoknál. Jelenleg széles körben vizsgálják az öregedés hatását a dopamin rendszerre, és az általa szabályozott magatartási jelekre, de a legtöbb esetben csak hím állatokon végeznek kísérleteket. Korábban már kimutatták, hogy a motoros aktivitás nagymértékben csökken az idıs állatoknál [Emborg és mtsai, 1998; Emerich és mtsai, 1993; Hebert és Gerhardt, 1998; Jezek és mtsai, 2003; Schulz és mtsai, 2002; 2004; Stoessl és mtsai, 1989; Willig és mtsai, 1987; Yurek és Fletcher-Turner, 2001], de az irodalomban közölt adatok közt számos ellentmondás van azzal kapcsolatban, hogy melyik aktivitási paraméter érintett jobban. Ezen ellentmondásra több példa is található, miként a sztereotíp mozgás csökkenését [Emerich és mtsai, 1993] és növekedését [Stoessl és mtsai, 1989] is leírták már idıs patkányoknál. Azt is kimutatták már, hogy az idıs állatok aktivitása csak éjszaka csökken, és csak egyszerő, és nem komplex környezetben [Willig és mtsai, 1987]. Yurek és munkatársai [Yurek és Fletcher-Turner, 2001] azt találták, hogy a középkorú állatoknak csak a horizontális mozgása csökken, míg mások szerint az összes olyan paraméter csökken, ami a lokomotoros aktivitást jelöli, és ezek nem is romlanak tovább az életkor növekedésével [Hebert és Gerhardt, 1998]. Az ellentmondások hátterében az állhat, hogy a kísérletek során más állattörzseket használtak, ami miatt a lokomotoros aktivitást befolyásoló faktorok szintje is eltérı lehetett [Amoroso és mtsai, 1987; Hendley és Fan, 1992; Takasugi és mtsai, 2003]. Az ellentmodásos adatok ellenére azt az általános következtetést, hogy az idıs állatok motoros aktivitása csökken, a mi kísérletünk is megerısítette. Ezen felül azt is kimutattuk, hogy az idıs nıstények és hímek motoros aktivitása egyenlı mértékben csökken. Korábban már számos olyan korfüggı neurokémiai változást leírtak a dopaminerg rendszerben, ami az idıs és a fiatal állatok közötti eltérésekért felelıs lehet. A stimulált dopamin kibocsátás csökken középkorú és idıs állatokban, és emellett a kor elırehaladtával a D2 receptor aktivációja is csökken [Gould és mtsai, 1996]. A mi eredményeinkhez hasonlóan a legtöbb szerzı nem talált különbséget a substantia nigra TH-immunpozitív sejtjeinek
38
számában a fiatal és az idıs állatok között [Bowenkamp és mtsai, 2000; Emerich és mtsai, 1993], bár más eredmények az idıs állatoknál kevesebb sejtet mutattak [Lindner és mtsai, 1999]. Az állatok különbözı neurotoxikus hatásokkal szembeni érzékenységét számos faktor befolyásolja, mint például genetikai faktorok, egyedi endogén variabilitás és a kor [Schwarting és Huston, 1997; Sedelis és mtsai, 2000; 2001; 2003; Voronina és mtsai, 1990]. Az már ismert tény, hogy az idıs állatok sokkal érzékenyebbek a különbözı neurotoxikus károsító tényezıkkel szemben, mint a fiatal állatok. Az idıs egerekben az 1-methyl-4-phenyl1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) sokkal nagyobb degenerációt okoz, mint a fiatal egyedekben [Ali és mtsai, 1993; Date és mtsai, 1990; Ricaurte és mtsai, 1987], de a 6-OHDAnal végzett kísérletek eredményei ellentmondásosak. Ricaurte és munkatársai [Ricaurte és mtsai, 1988] kimutatták, hogy a 6-OHDA károsító hatás nem fokozódik az idıs egerekben, míg Marshall munkacsoportja szerint a dopamin szint csökkenése 6-OHDA lézió után sokkal nagyobb az idıs állatokban, mint a fiatal egyedekben, különösen abban az esetben, amikor kis mennyiségő toxint adnak az állatnak [Marshall és mtsai, 1983]. Továbbá azt is kimutatták, hogy a 6-OHDA léziót követıen egy kompenzatórikus változás figyelhetı meg a neuropeptidek eloszlásában a fiatal állatokban, de az idıs egyekre ez nem jellemzı [Yurek és Fletcher-Turner, 2001]. Egyéb biokémiai és magatartási vizsgálatok is igazolták a középkorú és az idıs állatok nagyobb fokú érzékenységét a 6-OHDA károsító hatására [Cass és mtsai, 2002; Lindner és mtsai, 1999]. Saját kísérletünk során azt találtuk, hogy a sejtpusztulás azonos mértékő volt az öreg és a fiatal állatoknál, de a magatartási eltérések sokkal kifejezettebbek voltak az idıs állatoknál. Hasonló eredményt írt le Linder munkacsoportja is [Lindner és mtsai, 1999]. Az idıs állatok motoros aktivitása nagymértékben csökkent, amit a mozgással töltött idı, és a megtett távolság csökkenése is igazolt, ráadásul az öreg állatok nem is ágaskodtak 1 nappal az operációt követıen. Kísérleteink során azt az érdekes eredményt kaptuk, hogy az idıs és a fiatal hím állatok egyformán javultak a 10. napra, aminek az oka az lehet, hogy a substantia nigrában azonos mennyiségő sejt pusztult el. Korábbi kísérletekben a magatartási jelek vizsgálata során számos eltérést találtak a nıstény és a hím állatok között. A nıstény állatok általában sokkal aktívabbak, még gonadectomiát követıen is, ami azt igazolja, hogy a nagyobb aktivitás hátterében nem csak a gonadális hormonok állnak [Blizard és mtsai, 1975]. Vizsgálatunk során mi nem találtunk szignifikáns különbséget a fiatal nıstény és hím állatok aktivitása közt az operáció elıtt, de 10 nappal az operáció után feltőnı különbség volt a két nem között: mind a fiatal és az idıs
39
nıstények szignifikánsan aktívabbak voltak, mint a hím állatok, vagyis a nıstények hipokinetikus jelei sokkal gyorsabban javultak. Mint azt már korábban említettük, a neurotoxikus hatásokkal szembeni érzékenységet számos faktor befolyásolja. Néhány kísérletben a nemi különbségeket is vizsgálták, de ezen eredmények száma nagyon kevés. Az egerekben nem találtak nemi különbséget a MPTP érzékenységben [Sedelis és mtsai, 2000]. Korábbi kísérletekben kimutatták, hogy az ösztrogénkezelés egyformán csökkenti az MPTP károsító hatását ivartalanított hím és nıstény egerekben [Dluzen és mtsai, 1996], és csökkenti a 6-OHDA toxikus hatását ovariectomizált nıstényekben, de ebben a vizsgálatban az eredményeket hím állatokkal nem hasonlították össze [Dluzen, 1997]. Ezzel szemben Disshon és munkatársai azt találták, hogy patkányban az ösztrogén kezelés az MPTP toxicitást csak ovariectomizált nıstény állatokban csökkenti, míg a kasztrált hímekben nincs ilyen hatása [Disshon és Dluzen, 2000]. A mi eredményeink is alátámasztották ezen korábbi megfigyeléseket, ugyanis a nıstény állatok léziós oldali substantia nigrájában szignifikánsan több TH-immunpozitív sejtet találtunk 6-OHDA léziót követıen, mint a hím állatokban. Ráadásul ezen eltérést az idıs nıstény és hím állatok között is ki tudtuk mutatni. A magatartási vizsgálatok azt mutatták, hogy a fiatal nıstények szignifikánsan jobban javultak az operációt követıen, és az idıs nıstények kezdeti hipokinetikus jelei sem voltak olyan súlyosak, mint a többi csoportban. Korábbi irodalmi adatokból ismert, hogy az aszimmetrikus jelek a posztoperatív idıszakban részleges javulást mutatnak [Fornaguera és mtsai, 1994; Mokrey, 1995; Nikolaus és mtsai, 1997; Pritzel és Huston, 1981; Pritzel és mtsai, 1983; Schwarting és mtsai, 1991; Schwarting és Huston, 1997; Tolwani és mtsai, 1999], és a javulás dinamikáját nagymértékben befolyásolja a károsodott dopaminerg sejtek száma. Azok az állatok, amelyek dopaminerg sejtjei súlyosan károsodtak, nem mutatnak javulást az operációt követı elsı héten, míg a kisebb lézióval rendelkezı állatok részlegesen vagy teljesen megjavulnak [Pritzel és Huston, 1981; Schwarting és Huston, 1996a,b]. Kísérletünk során azt találtuk, hogy a hím állatoknál a dopaminerg sejtek 90%-a pusztult el a léziós oldalon, míg a nıstény állatoknál a károsodás csak 50-60%-os volt. A szövettani vizsgálattal észlelt szembetőnı különbség magyarázatot adhat arra, hogy miért javultak sokkal gyorsabban a nıstény állatok hipokinetikus és aszimmetriás jelei. Az idıs nıstények aszimmetrikus jelei az aszimmetrikus forgás kivételével azonban nem tőntek el teljesen 10 nappal az operáció után, aminek hátterében a kissé súlyosabb sejtkárosodás és a kompenzatórikus mechanizmusok ineffektív mőködése állhat.
40
Jelenlegi kísértünkkel további adatokat szolgáltattunk arra, hogy 6-OHDA indukálta substantia nigra károsodás eltérı magatartási és szövettani eltéréseket okoz különbözı nemő, és korú állatoknál. Ezzel a vizsgálattal is bizonyítottuk azt, hogy az egyes betegségek preklinikai kutatásában fontos szerepet töltenek be a nemi és az életkori különbségeket vizsgáló munkák, hiszen ezek nagy segítséget nyújthatnak a betegségek hatékonyabb klinikai terápiájának kidolgozásában.
41
VII. PACAP KEZELÉS HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA PARKINSON-KÓR MODELLBEN
A. Eredmények
a. Magatartásvizsgálat
A mozgási idı vizsgálata során a Parkinson-kórra jellemzı hipokinetikus jeleket találtunk a kontroll, csak 6-OHDA-nal kezelt állatcsoportban mindkét vizsgált idıpontban (VII.1.A. ábra). Ezzel szemben nem találtunk szignifikáns eltérést a PACAP-pal kezelt csoportok, és a normál illetve a fiziológiás sóoldattal kezelt állatok eredményei között egyik idıpontban sem. Legtöbbet a 0,1 µg PACAP-pal kezelt állatok mozogtak a léziós csoportok közül. Az 1 µg PACAP-pal kezelt csoport kivételével hasonló eredményeket kaptunk a megtett út értékelése során (VII.1.B. ábra). Az 1 µg PACAP-pal kezelt állatok nem tettek meg több utat, mint a 6-OHDA-nal kezelt csoport, de értékeik szignifikánsan javultak 10 nappal az operáció után. A kisebb PACAP dózissal kezelt állatok már 1 nappal az operációt követıen jobb jeleket mutattak, és szignifikáns különbséget nem találtunk ezen állatcsoport és a normál vagy csak fiziológiás sóoldattal kezelt állatok között. Az inaktivitással eltöltött idı a megfigyelési periódusban fokozatosan csökkent, ami szintén bizonyíték a motoros aktivitás javulására (VII.1.C. ábra). A 6-OHDA-nal és az 1 µg PACAP-pal kezelt állatok szignifikánsan több idıt töltöttek mozgás nélkül, és tüneteik a 10. napra sem javultak szignifikánsan. Ezzel szemben a 0,1 és 0,01 µg PACAP-pal kezelt állatok nem töltöttek szignifikánsan több idıt teljesen mozdulatlanul, mint a normál vagy csak fiziológiás sóoldattal kezelt állatok egyik vizsgált idıpontban sem.
42
450
1 nap
400
10 nap
Mozgási idı (sec)
350
#
# #
#
300 250
* *
200 150 100 50 0
normál
A
fiz. sóoldat
6-OHDA
PACAP 1
PACAP 0.1
3000
##
PACAP 0.01
1 nap 10 nap
Megtett út (cm)
2500 # 2000 *
1500
*
** 1000 500 0
normál
B
fiz. sóoldat
Teljes nyugalmi idı (sec)
200
6-OHDA
PACAP 1
PACAP 0.1
PACAP 0.01
1 nap
*
10 nap
180 *
160 *
140
*
120 100 80 60
#
#
40 20 0
normál
C
fiz. sóoldat
6-OHDA
PACAP 1
PACAP 0.1
PACAP 0.01
VII.1. ábra. Az ábrák a normál állatok, fiziológiás sóoldattal, 6-OHDA-nal és a lézió mellett 1, 0,1 valamint 0,01 µg PACAP-pal kezelt állatok mozgással töltött idejét (A), mozgás során megtett távolságát (B), teljes nyugalomban töltött idejét (C) jelölik (átlag±SEM) 1 és 10 nappal a léziót követıen. *P<0,05, **P<0,01 vs fiziológiás sóoldattal kezelt állatok; #P<0,05, ## P<0,01 vs kontroll, 6-OHDA-nal kezelt állatok.
43
Az ágaskodások száma az operációt követıen minden kezelt csoportban a fiziológiás sóoldattal kezelt állatokat is beleértve szignifikánsan csökkent a normál állatokhoz viszonyítva (VII.2.A. ábra). A 10. napra azonban a fiziológiás sóoldattal kezelt csoport és a 0,1 µg PACAP-pal kezelt csoport a normál állatokkal azonosan ágaskodott, az 1 és 0,01 µg PACAP-pal kezelt állatok pedig részleges javulást mutattak. Hasonló tendenciát figyelhettünk meg a szabad ágaskodások százalékos arányát tekintve. Minden operált állatcsoportban 1 nappal az operáció után szignifikánsan csökkent a szabad ágaskodások százalékos aránya a normál állatokhoz viszonyítva (VII.2.B. ábra). A fiziológiás sóoldattal kezelt állatok és minden PACAP kezelt állat 10 nappal az operáció után szignifikánsan javult, míg a 6-OHDAnal kezelt állatok értékei késıbb sem mutattak szignifikáns javulást. 1 nap
##
50
10 nap
Ágaskodások száma
45 40 35
# #
30 25 *
20 15
***
**
*
***
10 5 0
normál
A
fiz. sóoldat
6-OHDA
PACAP 1
Szabad ágaskodások %-a
90
PACAP 0.1
PACAP 0.01
1 nap
##
80
10 nap
70 #
#
60 *
*
50
* *
40
*
*
30 20 10 0
B
normál
fiz. sóoldat
6-OHDA
PACAP 1 PACAP 0.1
PACAP 0.01
VII.2. ábra. Az ábrák a normál állatok, fiziológiás sóoldattal, 6-OHDA-nal és a lézió mellett 1, 0,1 valamint 0,01 µg PACAP-pal kezelt állatok ágaskodásainak számát (A) és szabad ágaskodásainak százalékos arányát (B) jelölik (átlag±SEM) 1 és 10 nappal a léziót követıen. *P<0,05, **P<0,01 vs normál állatok; #P<0,05, ##P<0,01 vs kontroll, 6-OHDA-nal kezelt állatok.
44
b. Aszimmetrikus jelek vizsgálata
Az aszimmetrikus jelek vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy a 6-OHDA lézión átesett állatok szignifikáns balra irányuló forgó mozgást végeztek 1 nappal az operáció után (VII.3.A. ábra). A 10. napra ezen aszimmetria teljesen eltőnt a PACAP-pal kezelt csoportoknál, míg a kontroll csoport egyedei késıbbi idıpontban is szignifikáns bal oldali túlsúlyú aszimmetriát mutattak (VII.3.B. ábra). Eredményeink értékelése során a balra irányuló forgások számát az összes forgás százalékában is kifejeztük, így azt kaptuk, hogy az összes léziós állat balra irányuló forgásának száma az összes forgásnak kb. 90%-a volt 1 nappal az operációt követıen (VII.3.C. ábra). Minden kezelt állat szignifikáns javulást mutatott a 10. napra, de a kontroll állatok balra irányuló forgásának aránya 80% maradt, ami szignifikánsan különbözött a normál és csak fiziológiás sóoldattal kezelt állatok értékeitıl. A PACAP kezelt állatoknál a 10. napra megközelítıleg azonos számban forogtak mindkét irányba, a bal oldali forgások százaléka megközelítette az ideális 50%-ot. Hasonló eredmények születtek az aszimmetrikus ágaskodás vizsgálata során (VII.4. ábra). A normál és csak fiziológiás sóoldattal kezelt állatoknál nem találtunk szignifikáns eltérést a bal és a jobb mellsı végtag használata között, míg a léziós állatok szignifikánsan többet ágaskodtak bal mellsı végtagjukkal 1 nappal az operáció után (VII.4.A. ábra). Ez az aszimmetria a PACAP kezelt csoportokban teljesen eltőnt a 10. napra, de a kontroll csoportban továbbra is észlelhetı volt (VII.4.B. ábra). Abban az esetben, amikor a bal mellsı végtaggal történt ágaskodások számát az összes ágaskodás számának százalékában adtuk meg, azt az eredményt kaptuk, hogy 1 nappal az operációt követıen minden léziós állat 8090%-ban használta a bal végtagját (VII.4.C. ábra). A kontroll és az 1 µg PACAP-pal kezelt állatok még 10 nappal az operáció után is aszimmetrikusan használták végtagjaikat ágaskodás közben, míg a 0,1 és 0,01 µg PACAP-pal kezelt állatcsoport egyedei szignifikánsan javultak, és végtagjaikat megközelítıleg 50-50%-ban használták. A thigmotaxis vizsgálata során a léziós állatok szignifikánsan több idıt töltöttek bal oldalukkal a falnak támaszkodva 1 nappal az operáció után (VII.5.A. ábra), de a 10. napra nem volt szignifikáns különbség a két oldal között egyik állatcsoportnál sem (VII.5.B. ábra). Abban az esetben, amikor annak a mozgásnak a százalékos arányát néztük, amikor az állat a bal oldalával támaszkodott a falnak, csak a kontroll állatoknál és az 1 µg PACAP-pal kezelt állatoknál találtunk szignifikáns eltérést a fiziológiás sóoldattal kezelt állatokhoz viszonyítva (VII.5.C. ábra). A legjobb javulást itt is a 0,1 µg PACAP-pal kezelt állatcsoportban találtuk,
45
ahol az állatok mindkét oldalukkal egyformán támaszkodtak a falnak a 10 nappal az operáció után. 140
bal
Forgások száma
120
jobb
100 80 60 40
***
***
***
**
20 0
normál
A
fiz. sóoldat
6-OHDA
PACAP 1
PACAP 0.1
PACAP 0.01
60
bal jobb
Forgások száma
50
40
30 ***
20
10
0
B
fiz. sóoldat
6-OHDA
PACAP 1
***
PACAP 0.1 PACAP 0.01
***
100 90
Balra forgások %-a
1 nap ***
***
10 nap
***
80 #
70 60
##
50 40 30 20 10 0
normál
C
fiz. sóoldat
6-OHDA
PACAP 1
PACAP 0.1
PACAP 0.01
VII.3. ábra. Az ábrák a normál állatok, fiziológiás sóoldattal, 6-OHDA-nal és a lézió mellett 1, 0,1 valamint 0,01 µg PACAP-pal kezelt állatok jobbra és balra irányuló forgásainak számát jelölik (átlag±SEM) 1 (A) és 10 nappal (B) a léziót követıen. **P<0,01, ***P<0,001. A 3.C. ábra a balra irányuló forgások százalékos arányát mutatja. ***P<0,001 vs fiziológiás sóoldattal kezelt állatok; #P<0,05, ##P<0,01 vs kontroll, 6-OHDA-nal kezelt állatok. A pontozott vonal a normál 50%-os arányt jelöli.
46
bal
12
Ágaskodások száma
jobb 10 8 6 4
*
*
**
**
2 0
normál
A
fiz. sóoldat
6-OHDA
PACAP 1
PACAP 0.1
PACAP 0.01
Ágaskodások száma
12
bal jobb
10
8
6 4 * 2
0
fiz. sóoldat
Bal végtaggal ágaskodás %-a
B
6-OHDA
PACAP 1
PACAP 0.1 PACAP 0.01
***
100
**
***
90
1 nap
** **
80
10 nap
* #
70 60
#
50 40 30 20 10 0
C
normál
fiz. sóoldat
6-OHDA
PACAP 1
PACAP 0.1
PACAP 0.01
VII.4. ábra. Az ábrák a normál állatok, fiziológiás sóoldattal, 6-OHDA-nal és a lézió mellett 1, 0,1 valamint 0,01 µg PACAP-pal kezelt állatok a bal és jobb mellsı végtaggal végzett ágaskodásainak számát jelölik (átlag±SEM) 1 (A) és 10 nappal (B) a léziót követıen. *P<0,05, **P<0,01. A 4.C. ábra a bal mellsı végtaggal végzett ágaskodások százalékos arányát mutatja. *P<0,05, **P<0,01 ***P<0,001 vs fiziológiás sóoldattal kezelt állatok; # P<0,05 vs 6-OHDA-nal kezelt állatok. A pontozott vonal a normál 50%-os arányt jelöli.
47
30
bal jobb
Fal melletti mozgás
25 20 15 * 10
*
* **
5 0
normál
A
fiz. sóoldat
6-OHDA
PACAP 1
PACAP 0.1
PACAP 0.01
bal
30
Fal melletti mozgás
jobb 25 20 15 10 5 0
fiz. sóoldat
6-OHDA
PACAP 1
PACAP 0.1
Bal oldallal a fal mellett mozgás %-a
B
100
PACAP 0.01
1 nap
*** ***
90
10 nap
80 70 60 50 40 30 20 10 0
normál
C
fiz. sóoldat
6-OHDA PACAP 1
PACAP 0.1
PACAP 0.01
VII.5. ábra. Az ábrák a normál állatok, fiziológiás sóoldattal, 6-OHDA-nal és a lézió mellett 1, 0,1 valamint 0,01 µg PACAP-pal kezelt állatok az aszimmetrikus thigmotaxisát jelölik (átlag±SEM) 1 (A) és 10 nappal (B) a léziót követıen. *P<0,05, **P<0,01. Az 5.C. ábra a bal oldallal a falnak támaszkodva végzett mozgás százalékos arányát mutatja. ***P<0,001. A pontozott vonal a normál 50%-os arányt jelöli.
48
c. Apomorfin indukálta forgó mozgás vizsgálata
A fiziológiás sóoldattal kezelt állatoknál apomorfinnal nem tudtunk rotációs mozgást indukálni. A 6-OHDA-nal kezelt kontroll csoportban a forgások átlag mennyisége 30 perces megfigyelés alatt 186,5±33,4 volt. A PACAP-pal kezelt csoportok egyedei szignifikánsan kevesebbet forogtak, a forgások átlag száma 65,0±26,8, 17,06±6,9 és 14,5±9,5 volt az 1, 0,1 és 0,01 µg PACAP-pal kezelt csoportokban. Bár az 1 µg PACAP-pal kezelt állatok átlaga magasabb volt, mint a másik két PACAP-pal kezelt állatcsoport értéke, az eltérés nem bizonyult szignifikánsnak.
d. Szövettani vizsgálat eredménye
A kontroll állatcsoportban TH-immunohisztokémia segítségével súlyos dopaminerg sejtkárosodást találtunk a substantia nigra pars compactájában. A dopaminerg sejtek megközelítıleg 90%-a pusztult el a kezelés hatására a lézió oldalán (VII.6., 7. ábra). A PACAP-pal kezelt csoportoknál szintén szignifikáns mértékő sejtkárosodást észleltünk a lézió oldalán a normál állatokhoz viszonyítva, de a sejteknek itt csak az 50%-a pusztult el a kezelés hatására. A PACAP-pal kezelt egyedek sejtkárosodása szignifikánsan kisebb mértékő volt a kontroll csoport sérüléséhez képest. Ezen eredmények azt mutatják, hogy a PACAP a dopaminerg sejtek majdnem 50%-át megvédte a 6-OHDA neurotoxikus hatásával szemben. A különbözı dózisú PACAP kezelés között azonban nem találtunk szignifikáns eltérést. A ventralis tegmentalis areában a sejtek kevésbé sérültek a 6-OHDA kezelés hatására, mint a substantia nigra sejtjei. A kontroll csoportban a dopaminerg sejtek 60%-a pusztult el a léziós oldalon, ami szignifikáns különbségnek bizonyult a fiziológiás sóoldattal kezelt állatok sejtpusztulásához képest (VII.6., 8. ábra). Minden PACAP kezelt csoportban a sejtpusztulás aránya csak 10% volt, ami szignifikánsan kevesebb, mint a kontroll csoport sejtpusztulásának mértéke.
Dopaminerg sejtek %-a a sérült oldalon
49
140
substantia nigra ventral tegmental area
120
#
#
#
100 #
80
*
# *
60
#
*
*
40 * 20 0
fiz. sóoldat
6-OHDA
PACAP 1
PACAP 0.1 PACAP 0.01
VII.6. ábra. Az ábra a normál állatok, fiziológiás sóoldattal, 6-OHDA-nal és a lézió mellett 1, 0,1 valamint 0,01 µg PACAP-pal kezelt állatok bal oldali substantia nigrájában és ventralis tegmentalis areában található TH-immunpozitív sejtek számát jelöli az ép oldal százalékában kifejezve (átlag±SEM).*P<0,05 vs fiziológiás sóoldattal kezelt állatok, #P<0,05 vs kontroll, 6-OHDA-nal kezelt állatok.
50
A
200 µm
B
200 µm
C
200 µm
D
200 µm
VII.7. ábra. TH-immunhisztokémiával készült felvételeken egy-egy reprezentatív 6OHDA-nal (A) és a lézió mellett 1 (B), 0,1 (C) valamint 0,01 µg (D) PACAP-pal kezelt állat jobb és bal oldali subtantia nigrája látható. A kontroll (A) állatcsoportban súlyos dopaminerg sejtkárosodást találtunk a léziós oldalon (bal), azonban a PACAP-pal kezelt egyedek (B,C,D) sejtkárosodása szignifikánsan kisebb mértékő volt. Az azonos állatból készült felvételekhez egyforma nagyítást használtunk.
51
A
200 µm
B
200 µm
VII.8. ábra. TH-immunhisztokémiával készült felvételeken egy-egy reprezentatív 6OHDA-nal (A) és a lézió mellett 0,1 µg (B) PACAP-pal kezelt állat jobb és bal oldali ventralis tegmentalis areája látható. A ventralis tegmentalis areában a sejtek kevésbé sérültek a 6-OHDA kezelés hatására, mint a substantia nigra sejtjei. A kontroll csoportban a dopaminerg sejtek 60%-a pusztult el a léziós oldalon, míg a PACAP-pal kezelt csoportban a sejtpusztulás aránya csak 10% volt. Az azonos állatból készült felvételekhez egyforma nagyítást használtunk.
52
B. Az eredmények értékelése
A leírt eredményeink arra engednek következtetni, hogy a PACAP képes kivédeni a 6OHDA neurotoxikus hatása következtében kialakuló hipokinéziát és elısegíti a kialakuló tünetek mielıbbi javulását. A legjobb eredményeket a 0,1 µg PACAP-pal kezelt állatoknál találtuk. Szövettani vizsgálataink azt mutatták, hogy a PACAP koncentrációjától függetlenül a substantia nigra pars compactájában található dopaminerg sejtek kb. 50%-át megvédi a neurotoxikus hatással szemben. Korábbi megfigyelésekhez hasonlóan mi is azt tapasztaltuk, hogy a klinikai tünetek megjelenéséhez a dopaminerg sejtek legalább 90%-ának károsodnia kell [Mokrey, 1995]. A szomszédos ventralis tegmentalis area dopaminerg neuronjai is gyakran érintettek a 6-OHDA indukálta lézió esetén [Moore és mtsai, 2001], emiatt ezen terület TH-immunpozitív sejtjeit is megszámoltuk vizsgálatunk során. A PACAP kezelt állatoknál nem találtunk szignifikáns eltérést, míg a kontroll csoportban a ventralis tegmentalis area dopaminerg sejtjeinek megközelítıleg 40%-a pusztult el. Bár a neurológiai tünetek jelentıs részének kialakulásáért a substantia nigra károsodása a felelıs, de a ventralis tegmentalis area károsodás is szerepet játszik súlyosabb tünetek kialakulásában [Moore és mtsai, 2001]. Kísérletünk során kimutattuk, hogy a PACAP kezelés mindkét agyterületben nagy mennyiségben megvédte a dopaminerg sejteket, és a neurológiai tünetekben észlelt szignifikáns javulás e két területben észlelt védı hatás együttes következménye lehet. Korábbi kísérletekben mások kimutatták, hogy az intracerebroventricularis PACAP kezelés képes fokozni a patkányok spontán motoros aktivitását és az ágaskodásaik számát [Masuo és mtsai, 1995]. A PACAP-pal 67%-os szerkezeti homológiát mutató VIP is növeli nagy dózisban a lokomotoros aktivitást [Itoh és mtsai, 1985]. A kutatók elgondolása szerint a VIP és a PACAP az agyi dopaminerg és a noradrenerg rendszer stimulálásával képesek fokozni a motoros aktivitást [Masuo és mtsai, 1995]. A PACAP kezelés után az újszülött patkányok motoros aktivitása is növekedett open-field tesztben [Reglıdi és mtsai, 2003a]. Ezen korábbi megfigyelések alapján feltételezhetjük, hogy a PACAP motoros aktivitásra kifejtett hatása is ellensúlyozni képes a dopaminerg károsodás következtében kialakuló magatartásbeli eltéréseket. Az általános aktivitási jelekkel ellentétben, amiben a PACAP-pal kezelt állatok javulást mutattak már az elsı napon, az aszimmetrikus jelek mindegyik csoportban egyforma súlyossággal jelentkeztek a kezelést követıen. Korábbi vizsgálatok során már kimutatták, hogy az állatok aszimmetriás jelei pár nap elteltével spontán javulást mutatnak [Mokrey, 1995]. Bár a kontroll állatok is szignifikánsan javultak, csak az aszimmetrikus thigmotaxis
53
tőnt el teljesen, míg a forgásban és a támaszkodó mozgásban megmaradt a bal oldali túlsúly. Ezzel ellentétben a PACAP-pal kezelt állatok aszimmetrikus tünetei teljesen eltőntek 10 nappal a kezelés után. A 6-OHDA lézió krónikus szakaszában súlyos egyoldali sejtkárosodás esetén apomorphin injectióval aszimmetrikus forgás indukálható [Mokrey, 1995]. A PACAPpal kezelt állatok szignifikánsan kevesebbet forogtak apomorphin injekció hatására, és a 0,1 és 0,01 µg PACAP-pal kezelt állatok felénél contralateralis forgást nem is lehetett kiváltani. Eredményeink azt mutatják, hogy bár a PACAP-pal kezelt állatok is súlyos aszimmetrikus jeleket mutattak a mőtét után, de ezek a jelek a 10. napra teljesen eltőntek. Ezen megfigyelések
szoros összefüggésben
állnak
az épen
maradt dopaminerg sejtek
mennyiségével. Kísérletünk során kimutattuk, hogy a 3 különbözı dózisban alkalmazott PACAP csökkenti a dopaminerg sejtpusztulást a substantia nigra és a ventralis tegmentalis area területén. Bár szignifikáns eltérést nem találtunk a TH-immunpozitív sejtek mennyiségében a három különbözı dózissal kezelt állatcsoport között, a magatartási jelek legnagyobb mértékben a 0,1 µg PACAP-pal kezelt csoportban javultak. A kísérleteink során fennálló szöveti koncentrációt pontosan nem ismerjük, azon megfigyeléseink, mely szerint a kisebb dózisú PACAP hatásosabbnak bizonyult, megegyeznek más kutatások eredményeivel [Arimura, 1998; 2003]. Számos kísérletben kimutatták a PACAP dózis függı hatását [Morio és mtsai, 1996a,b], melynek hátterében az állhat, hogy a különbözı dózisú PACAP más jelátviteli utakon keresztül fejti ki hatását [Arimura, 2003]. A 6-OHDA lézió következtében kialakuló sejtlézió pathogenezisében mind állatkísérletes modellben, mind emberben fontos szerepet töltenek be az oxidatív stressz indukálta apoptotikus és az inflammatorikus hatások [Hartmann és mtsai, 2000; Mokrey, 1995]. Korábban már számos kísérletben bizonyították a PACAP védı hatását ezen károsító faktorokkal szemben [Delgado és mtsai, 2003; Ganea és Delgado, 2002; Leker és Shohami, 2002], de a védı hatás pontos mechanizmusa azonban még nem ismert a kísérletünk során alkalmazott modellben. A PACAP neuroprotektív hatásának lehetséges mechanizmusai az utolsó fejezetben olvashatók.
54
VIII. PACAP KEZELÉS HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA HUNTINGTON-CHOREA MODELLBEN
A. Eredmények
a. Magatartásvizsgálat
A quinolinsav indukálta egyoldali striatalis károsodás következtében az állatok spontán motoros aktivitása megnövekedett, hiperkinetikusak voltak. A féloldali lézió következtében a mőtétet követı napokon az állatok jellegzetes aszimmetrikus jeleket mutattak, amelyek a 10. napra spontán javultak, de késıbb a mőtétet követı 30. napon további javulást nem tapasztaltunk. A PACAP kezelés hatására az állatok neurológiai tünetei sokkal enyhébbek voltak, ezen felül a PACAP csökkentette a striatalis sejtek károsodását is. A motoros aktivitás vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy a quinolinsav léziós kontroll állatok hiperkinetikusak voltak, szignifikánsan többet mozogtak 1 nappal az operációt követıen a normál állatokhoz képest, de a mozgással töltött idı a 10. napra a normál szintre csökken (VIII.1.A. ábra). A 2 µg PACAP-pal kezelt állatok szintén szignifikánsan többet mozogtak, mint a normál állatok 1 és 10 nappal az operáció után. Ezzel szemben a 0,2 µg PACAP kezelésben részesült állatok egyik vizsgált idıpontban sem mozogtak szignifikánsan többet, mint a normál állatok. A motoros aktivitás vizsgálata során számoltuk az összes forgás számát is (VIII.1.B. ábra). A quinolinsav léziós kontroll állatok a 2 µg PACAP-pal kezelt állatokkal együtt szignifikánsan többet, majdnem dupla annyit forogtak 1 nappal az operációt követıen, mint a normál állatok, de a forgások száma 10 nappal a mőtét után újra visszatért a normál szintre mindkét csoportnál. Ezzel szemben nem volt szignifikáns különbség a forgások számát tekintve a normál állatok és a 0,2 µg PACAP-pal kezelt állatok között egyik vizsgált idıpontban sem.
55
kontroll
Mozgási idı (sec)
PACAP 0.2
*
350
PACAP 2
*
300
*
250 200 150 100 50 0 0
A
1
10
30
Napok
kontroll PACAP 0.2
Forgások száma
250
*
PACAP 2
*
200 150 100 50 0
B
0
1
10
30
Napok
VIII.1. ábra. Az ábrák a kontroll quinolinsavval, és a lézió mellett 0,2 valamint 2 µg PACAP-pal kezelt állatok mozgással töltött idejét (A) és forgásainak számát (B) jelölik (átlag±SEM) a lézió elıtt (0 nap), 1, 10 és 30 nappal a léziót követıen. *P<0,05.
56
A forgási aszimmetria rendkívül szembetőnı volt a quinolinsavval kezelt kontroll állatoknál és a 2 µg PACAP-pal kezelt állatoknál 1 nappal az operációt követıen, ami részlegesen javult a 10. napra, de további javulást nem mutatott. Ezzel szemben a 0,2 µg PACAP-pal kezelt állatok bár szignifikáns aszimmetriát mutattak 1 nappal a kezelés után, ez az aszimmetria teljesen eltőnt a 10. napra (VIII.2.A. ábra). A quinolinsavval kezelt kontroll állatok támaszkodó mozgásának vizsgálata során nagyfokú bal oldali aszimmetriát találtunk mind 1, mind 10 nappal a lézió után, ami a 30. napra enyhe javulást mutatott. A különbözı dózisú PACAP-pal kezelt állatok között nem találtunk szignifikáns különbséget, ezek az állatok a jobb mellsı végtagjukat gyakrabban használták támaszkodás közben, így az aszimmetria jóval enyhébb volt már 1 nappal az operáció után (VIII.2.B. ábra). Az elıbbi aszimmetrikus jelhez hasonlóan a sérült állatok szignifikánsan nagyobb utat tettek meg bal oldalukkal a falnak támaszkodva, mint a normál állatok. Aszimmetrikus thigmotaxist figyeltünk meg minden léziós állatnál a vizsgálat egész ideje alatt. Bár a 0,2 µg PACAP-pal kezelt állatok is szignifikáns aszimmetriát mutattak, a bal oldal dominanciája mégsem volt annyira kifejezett, mint a többi csoportban (VIII.2.C. ábra).
57
kontroll
Balra forgások %-a
PACAP 0.2 ***
110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
A
PACAP 2
*** *** **
**
** **
0
1
10
30
Napok
Bal végtaggal ágaskodás %-a
kontroll 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
B
PACAP 0.2
***
PACAP 2
*** *
*
** **
*
* *
0
1
10
30
Napok
Bal oldallal a fal mellett mozgás %-a
kontroll PACAP 0.2 100
**
**
90 80
PACAP 2
** *
*
**
**
*
**
70 60 50 40 30 20 10 0
C
0
1
10
30
Napok
VIII.2. ábra. Az ábrák a kontroll quinolinsavval, és a 0,2 valamint 2 µg PACAP-pal kezelt léziós állatok aszimmetrikus forgó mozgását (A), aszimmetrikus ágaskodását (B), aszimmetrikus fal melletti mozgását (C) jelölik (átlag±SEM) az operáció elıtt (0 nap), 1, 10 és 30 nappal a léziót követıen. *P<0,05 ,**P<0,01, ***P<0,001. A pontozott vonal a normál 50%-os arányt jelöli.
58
c. Katalepszia teszt
A rigiditási jelek vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy a kontroll léziós állatok és a 2 µg PACAP-pal kezelt állatok szignifikánsan kevesebb idıt töltöttek mozdulatlanul mindhárom tesztnél, mint a normál állatok. Azonban nem találtunk szignifikáns eltérést a 0,2 µg PACAP-pal kezelt állatok és a normál állatok között a magas rúd tesztben, és az üveg tesztben, hiszen mindkét csoport egyedei hosszú ideig képesek voltak megtartani abnormális
Mozdulatlansággal töltött idı (sec)
helyzetüket (VIII.3. ábra). 200
normál
180
kontroll PACAP 0.2
160
PACAP 2
*
140
*
*
120
*
100 80
* *
60 40 20 0
magas rúd
alacsony rúd
üveg
VIII. 3. ábra. Az ábra a normál, kontroll quinolinsavval, és a lézió mellett 0,2 valamint 2 µg PACAP-pal kezelt állatok mozdulatlansággal töltött idejét ábrázolja a 3 különbözı katalepszia tesztben (átlag±SEM). *P<0,05. d. Szövettani vizsgálat
A szövettani vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy a léziós oldalon a kontroll állatoknál a NADPH-diaforáz pozitív neuronok száma kb. 20%-al kevesebb volt, mint az ép oldalon, míg a PACAP-pal kezelt állatoknál a sejtelhalás csak 10%-a volt az ép oldalnak
NADPH-d pozitív sejtek %-a a sérült oldalon
(VIII.4. ábra).
25 20 15
**
10
*
*
5 0 kontroll
PACAP 0.2
PACAP 2
VIII.4. ábra. Az ábra a kontroll quinolinsavval, és a lézió mellett 0,2 valamint 2 µg PACAP-pal kezelt állatok bal oldali striatumában található NADPH-diaforáz pozitív sejtek számát jelöli az ép oldal százalékában kifejezve (átlag±SEM).*P<0,05.
59
B. Az eredmények értékelése
Kísérletünkben bebizonyítottuk, hogy a quinolinsav léziót megelızı PACAP kezelés felére csökkentette a károsodott sejtek számát a striatumban, megakadályozta a hiperaktivitás kialakulását, és elısegítette a féloldali lézió következtében kialakuló aszimmetrikus jelek gyors javulását. A kísérlet során észlelt sejtkárosodás mértéke nagymértékben eltért korábban a Parkinson-kór modellben a substantia nigra területén észlelt közel 80%-os sejtpusztulástól [Mokrey, 1995; Schwarting és Huston, 1996a,b]. Ez azzal magyarázható, hogy kísérletünk során a NADPH-diaforáz festést alkalmaztuk, amely a közepes mérető tüske nélküli neuronokat festi, amelyek relatíve megkíméltebbek a quinolinsav lézió során [Beal és mtsai, 1986; Roberts és mtsai, 1993]. Azért választottuk mégis ezt a léziót, mert az így létrejött striatalis károsodás modellezi legjobban az emberi Huntington-chorea pathomorfológiai sajátosságait. A NAPDH-diaforáz pozitív tüske nélküli sejtek somatostatint és neuropeptid Yt tartalmaznak. Ezen sejtek károsodásának hátterében az állhat, hogy az állatmodellben alkalmazott excitatoros aminosav túlingerli a neurotraszmittereket termelı sejteket, ami a sejtek pusztulása után a betegségre jellemzı tünetegyüttest hoz létre [Beal és mtsai, 1986; Roberts és mtsai, 1993]. PACAP kezelés hatására megközelítıleg fele annyi sejt pusztult el a lézió után, mint a kontroll állatokban, ezzel magyarázhatóak a PACAP-pal kezelt állatok szignifikánsan jobb neurológiai tünetei. A Parkinson-kór modellben elért eredményekhez hasonlóan itt is az alacsonyabb dózis volt a hatékonyabb, míg a nagyobb dózis esetében a kontroll állatokhoz hasonló hiperaktivitást találtunk a motoros aktivitás vizsgálata során. Mint ahogy azt már a korábbi fejezetekben részletesen leírtuk ezen eredmények hátterében a PACAP dózisfüggı hatása [Arimura, 2003; Morio és mtsai, 1996a,b], valamint a magasabb koncentrációjú PACAP aktivitást fokozó hatása állhat [Masuo és mtsai, 1995]. A PACAP védı hatásának pontos mechanizmusa a Parkinson-kórhoz hasonlóan a Huntington-chorea modellben sem ismert. Mégis ismerve a betegségek pathomechanizmusát, és a PACAP korábban in vitro kísérletekben kimutatott védı hatásait számos lehetséges mechanizmus számításba jöhet. Ezeket az utolsó fejezetben tárgyaljuk.
60
IX. PACAP KEZELÉS HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA MONOSODIUM GLUTAMÁT KEZELÉS KÖVETKEZTÉBEN KIALAKULÓ RETINÁLIS DEGENERÁCIÓBAN
A. Eredményeink
Az újszülött patkányokban MSG kezelést követıen súlyos retinadegeneráció alakult ki. A kezelt állatok retinájának ILM-OLM távolsága megközelítıleg fele akkora volt (79.7±4.5 µm), mint a kezeletlen állatokban mért távolság (163.7±5.4 µm). A károsító hatások leginkább a belsı retinális rétegeket érintették (IX.1., 2. ábra). A MSG kezelt állatoknál a fotoreceptor rétegben, a külsı sejtes és rostos rétegben szignifikáns elváltozást nem találtunk, de a belsı sejtes réteg és a ganglion sejtek rétege a háromszori MSG kezelést követıen teljesen összeolvadt. Ezen rétegek vastagsága több mint felére csökkent, a köztük elhelyezkedı belsı rostos réteg eltőnt. Az MSG kezelés mellett 1 pmol PACAP-pal is kezelt állatok retinája nem különbözött szignifikánsan a kontroll, a csak MSG-vel kezelt állatok retinájának szerkezetétıl (IX.1., 2.C. ábra). Ezzel szemben a 100 pmol intravitreális PACAP kezelés szignifikánsan csökkentette az MSG kezelés indukálta retinális károsodást (IX.1., 2.D. ábra). Bár ezen csoport állatainak retinái szignifikánsan vékonyabbak voltak, mint a normális retina vastagsága, a belsı rétegek nem szenvedtek olyan súlyos károsodást, mivel mindhárom belsı réteg (INL, IPL és GCL) jól láthatóan elkülönült egymástól. A belsı rétegek szignifikánsan szélesebbek voltak, mint az MSG kezelt kontroll állatok belsı retinális rétegei, és a retina szerkezete a normális retina struktúráját mutatta. 180
ILM-OLM távolság
*
INL 160
IPL
*
Rétegvastagság (um)
140
*
* 120
*
100
*
80 60 40 20
*
0 normál
MSG
* *
* *
MSG+1pmol PACAP
*
MSG+100 pmol PACAP
IX.1. ábra. Az ábra a kezeletlen állatok, MSG-vel kezelt és a lézió mellett intravitreálisan 1 és 100 pmol PACAP-pal kezelt állatok retinális rétegeinek vastagságát ábrázolja (átlag±SEM). Az ILM-OLM távolság: külsı és a belsı határhártya közti távolság, INL: belsı sejtes réteg; IPL: belsı rostos réteg. *P<0,05.
61
IX.2. ábra. Egy-egy reprezentatív kezeletlen (A), MSG-vel kezelt (B) és a lézió mellett intravitreálisan 1 (C) és 100 pmol PACAP-pal (D) kezelt állat retinájának morfológiája Nissl festéssel. ONL: külsı sejtes réteg; OPL: külsı rostos réteg; INL: belsı sejtes réteg; IPL: belsı rostos réteg; GCL: ganglion sejtek rétege. A különbözı retinából készült felvételekhez egyforma nagyítást használtunk.
62
B. Az eredmények értékelése
Az elızıekben leírt kísérletünkben kimutattuk, hogy az intravitreális PACAP kezelés szignifikánsan csökkenti az MSG kezelés következtében kialakuló retinális károsodás mértékét. Az ismételt magas dózisú MSG kezelés rendkívül súlyos retinális degenerációt okozott legfıképpen a retina belsı rétegeiben. Az még pontosan nem ismert, hogy milyen sejtek élik túl az MSG kezelést. A belsı rétegek sejtjei az ON bipoláris sejtek kivételével egyaránt rendelkeznek ionotrop glutamát receptorokkal [Thoreson és Witkowsky, 1999], emiatt ezek a sejtek egyaránt lehetnek az MSG toxicitás célpontjai. Azonban a sejtek hasonló eloszlásban rendelkeznek PACAP receptorokkal is [Seki és mtsai, 1997], ami magyarázhatja ezen sejtek ellenállását az exitotoxikus károsodással szemben. A belsı rostos réteg nagymértékben degenerálódott MSG hatására, de a PACAP kezelt állatoknál a károsodás jóval kisebb volt. Ezen eredmény hátterében az feltételezhetı, hogy az OFF bipolar sejtek rendelkeznek non-NMDA ionotropic glutamát receptorokkal, de PACAP receptor nincs a felszínükön, és emiatt lehetnek érzékenyebbek a károsító hatásokkal szemben [Thoreson és Witkowsky, 1999]. Kísérletünk során elsıként mutattuk ki in vivo kísérletben a PACAP védı hatását patkány retinában glutamát indukálta neurotoxicitással szemben. A pathomechanizmus pontos megismeréséhez még további kísérletek szükségesek. A PACAP neuroprotektív hatásának lehetséges mechanizmusai az utolsó fejezetben olvashatók.
63
X. MEGBESZÉLÉS
Kísérleteink során kimutattuk, hogy a PACAP neuroprotektív hatású fokális cerebrális ischaemiában, Parkinson-kór modellben, Huntington-chorea modellben és glutamát okozta retinális károsodásban. Ezen idegrendszeri elváltozások pathomechanizmusában más-más folyamatok vesznek részt, de végül minden kórképben a neuronpusztulás fı oka az oxidatív stressz és a glutamát indukálta apoptotikus sejthalál. Ezen léziókon kívül a fokális cerebrális ischaemiában és a neurodegeneratív megbetegedésekben mind állatkísérletes modellben, mind emberben az inflammatorikus hatások is fontos szerepet töltenek be [Mokrey, 1995; Hartmann és mtsai, 2000; Delgado és mtsai, 2003]. Ezzel magyarázható az antiapoptotikus és antiinflammatorikus hatással rendelkezı PACAP neuroprotektív hatása ezen léziókban [Kim és mtsai, 2001]. Az ischaemiás és a neurodegeneratív elváltozások mellett a retina patológiás elváltozásainak hátterében is számos esetben a glutamát indukálta idegkárosító folyamatok állnak. Mivel több kísérletben bebizonyították már a PACAP védı hatását a glutamát indukálta neuropatológiás folyamatokban, ezért ez magyarázatul szolgálhat arra, hogy kísérleteinkben az ischaemiás és a neurodegeneratív modelleken kívül, a glutamát indukálta retinális degenerációban is csökkenteni tudtuk a lézió nagyságát.
A. A PACAP neuroprotektív hatása in vitro kísérletekben
A PACAP felfedezése óta számos bizonyíték született neurotrofikus és neuroprotektív hatására vonatkozóan. Ezen megfigyelések zömmel in vitro kísérletekbıl származnak. A PACAP in vitro kísérletekben neurotrofikus és erıs antiapoptotikus hatással rendelkezik, védi a neuronokat különbözı károsító hatásokkal szemben, antiinflammatorikus hatása van [Delgado és mtsai, 2003; Ganea és Delgado, 2002] és stimulálja az astrocyták protektív anyagainak szekrécióját [Gottschall és mtsai, 1994].
a. A PACAP in vitro neurotrofikus hatásai
Az idegrendszer fejlıdése során és az idegrendszeri károsodásokat követı regenerációs folyamatokban fontos szerepet töltenek be a különbözı neurotrofikus faktorok (pl.: idegi növekedési faktor (NGF), agyi eredető növekedési faktor (BDNF), neurotrophin 3, 4 és 6) [Dechant és Neumann, 2002]. Ezen faktorok trofikus és protektív hatását bizonyították
64
neurodegeneratív betegségekben, ischaemiában, epilepsziában és különbözı pszichiátriai elváltozásokban [Lindvall és mtsai, 1994; Moller és mtsai, 1996]. A PACAP és a neurotrofikus faktorok számos egymással megegyezı, és egymást hatását kiegészítı tulajdonságokkal rendelkeznek [Grumolato és mtsai, 2003; Yuhara és mtsai, 2003]. Az NGF fokozza a PACAP [Hashimoto és mtsai, 2000; Jamen és mtsai, 2000; Jongsma és mtsai, 2003], míg a PACAP fokozza az NGF receptorok upregulációját [Lazarovici és Fink, 1999; Lee és mtsai, 2002], és kiváltja a neurotrophin receptorok által vezérelt jelátviteli folyamatokat [Lee és mtsai, 2002; Vaudry és mtsai, 2000b]. A PACAP stimulálja a BDNF mRNS expressióját neuronkultúrában [Pellegri és mtsai, 1998] és meggátolja az excitotoxikus hatások következtében kialakuló BDNF csökkenést [Frechilla és mtsai, 2001]. A fejlıdı idegrendszer sejtjeinek differenciálódásában, és egyes sejtek túlélésében fontos szerepet töltenek be a PACAP receptor mediálta folyamatok [Waschek és mtsai, 1998]. A PACAP és receptora nagy mennyiségben expresszálódik az embrionális és az újszülött patkányagyban [D’Agata és mtsai, 1996; Lindholm és mtsai, 1998; Tatsuno és mtsai, 1994], és korán megjelenik a csirke, egér és nem emlıs idegrendszerben is [Erhardt és mtsai, 2001; Hu és mtsai, 2001; Sheward és mtsai, 1998]. A PACAP stimulálja a neurogenesist, a neuroblastok túlélését, az idegsejtek és az astrocyták proliferációját, differenciálódását [Deutsch és Sun, 1992; DiCicco-Bloom és Deutsch, 1992; Vallejo és Vallejo, 2002; Waschek és mtsai, 1998; Zupan és mtsai, 1998].
b. A PACAP in vitro antiapoptotikus hatása
Az apoptózis jelentıs szerepet tölt be az idegrendszer fejlıdése során, és késıbb a különbözı
idegrendszeri
károsodások,
pl.:
ischaemia,
traumás
agykárosodás
és
neurodegeneratív megbetegedések következtében indukálódott apoptotikus folyamatok is az idegsejtek pusztulását okozzák. A PACAP antiapoptotikus hatását korábban számos in vitro kísérletben bizonyították mind kontroll körülmények között, mind különbözı proapoptotikus anyagokkal szemben [Shioda és mtsai, 1998; Vaudry és mtsai, 2000c,d; 2002]. Védi a PC12 sejteket és a szimpatikus neuroblast sejteket az NGF megvonással indukált apoptózissal szemben [Chang és Korolev, 1997; Tanaka és mtsai, 1996; 1997], ezenkívül megakadályozza a kisagyi szemcsesejt kultúrában szérumdepriváció és alacsony K+ szint következtében kialakuló sejtpusztulást is [Canonico és mtsai, 1996; Chang és mtsai, 1996; Gonzalez és mtsai, 1997; Kienlen Campard és mtsai, 1997; Villalba és mtsai, 1997]. Ezen modellekben neuroprotektív hatás hátterében a mitogén aktiválta protein kináz (MAPK) jelátviteli út
65
aktivációja feltételezhetı. Az is bizonyított, hogy a PACAP segíti a túlélést és a differenciálódást mind hátsó gyöki ganglion, mind cholinerg neuron sejtkultúrában [Lioudyno és mtsai, 1998; Yuhara és mtsai, 2001]. Az idegrendszeri sejtkultúrákon kívül egyéb sejttenyészetben is kimutatták a PACAP protektív hatását, pl.: hipofízis adenoma kultúrában, petefészek follikuráris sejtkultúrában, prosztata tumorsejtekben [Gutierrez-Canas és mtsai, 2003; Lee és mtsai, 1999; Oka és mtsai, 1999].
c. A PACAP in vitro neuroprotektív hatása neurotoxikus károsodásokban 1.A PACAP védı hatása glutamát indukálta toxikus folyamatokban A
PACAP
neuroprotektívnek
bizonyult
különbözı
neurotoxikus
hatások
következtében kialakuló apoptotikus és nekrotikus folyamatokban. Ezek közül az egyik legjelentısebb a glutamát indukálta toxikus folyamatok, amelyek fontos szerepet töltenek be az általunk is vizsgált neurológiai kórképek (pl: ischaemia, neurodegeneratív betegségek) kialakulásában.
A
glutamát
jól
ismert
excitatoros
neurotranszmitter
a
központi
idegrendszerben, amely a körülményektıl függıen trofikus vagy toxikus hatással rendelkezik. A agykérgi neuronokra a glutamát a metabotrop receptorokon keresztül protektív hatást fejt ki µM-os koncentrációban, míg mM-os koncentrációban az ionotrop receptorokon keresztül apoptózist indukál [Gillessen és mtsai, 2002; Leker és Shohami, 2002; Trotti, 2002]. Patkány agykérgi neuronjaiból és hippocampalis sejtjeibıl készült sejtkultúrában a PACAP védi a sejteket a glutamát indukálta neurotoxicitástól [Morio és mtsai, 1996a,b]. Vizsgálataink során glutamát okozta retinális degenerációban is vizsgáltuk a PACAP neuroprotektív hatását, mivel a retina patológiás elváltozásainak hátterében számos esetben a glutamát indukálta idegkárosító folyamatoknak állnak. Retinális ischaemiában fokozódik a glutamát felszabadulás, ami a cascade rendszer aktiválásával a retinális sejtek pusztulásához vezet [Osborne és mtsai, 1999; Sucher és mtsai, 1997]. Emellett az is bizonyított, hogy glaukómás betegben az emelkedett glutamát szint további károsodásokat hoz létre. Az emelkedett glutamát szint következtében kialakuló súlyos excitotoxikus hatást ezen felül más esetben is kimutattak, például opticus neuritisben, a. centrális okklúzióban és nervus opticus lézióban [Sucher és mtsai, 1997]. Retinális sejtkultúrában a PACAP-27 és a PACAP-38 dózisuktól függıen egyaránt csökkentette a glutamát indukálta neuronkárosodást [Shoge és mtsai, 1999]. Ezen kívül képes fokozni az astrocyták glutamát felvételét a glutamát transzporter expressziójának elısegítésével, és növeli a glutamin szintáz expresszióját is, ami
66
a glutamát glutamin átalakulás legfıbb enzime [Figiel és Engele, 2000]. A fenti mechanizmusok játszhatnak szerepet abban, hogy vizsgálatainkban a PACAP csökkentette a glutamát indukálta retinális degeneráció mértékét. A különbözı patológiás folyamatok során felszabaduló glutamát nagymértékben fokozza a neuronális NO-szintáz (nNOS) mőködését, és a nagy mennyiségben felszabaduló NO további károsodásokhoz vezet [Arimoto és Bing, 2003; Iravani és mtsai, 2002; Leker és Shohami, 2002]. A PACAP a nNOS mőködésének szabályozásával képes csökkenteni a glutamát indukálta NO felszabadulást és fokozni a PC12 sejtek túlélését [Onoue és mtsai, 2002a,b,c]. Kevert neuron-glia sejtkultúrában a lipopoliszacharid hatására fokozódó NO szintézist is gátolni képes a PACAP [Kong és mtsai, 1999].
2. A PACAP védı hatása 6-OHDA indukálta toxikus folyamatokban A 6-OHDA a dopaminerg sejtek apoptózisát váltja ki mind in vitro, mind in vivo körülmények között [Walkinshaw és Waters, 1994; Zuch és mtsai, 2000]. Az egyik gyakran alkalmazott Parkinson-kór modellben a dopaminerg sejteket 6-OHDA-nal roncsolják, és így hozzák létre a betegségre jellegzetes neurodegeneratív elváltozást [Mokrey, 1995], kísérleteink során mi is ezt a modellt alkalmaztuk. A dopaminerg sejtek a magas affinitású felvevı rendszernek köszönhetıen a lokális injekciót követıen gyorsan akkumulálják a 6OHDA-t. A 6-OHDA oldat rendkívül instabil, és emiatt gyors autooxidáción megy keresztül, ami reaktív szabadgyök képzıdéséhez vezet, az oxidatív stressz pedig a dopaminerg sejtek apoptózisát okozza [Walkinshaw és Waters, 1994; Zuch és mtsai, 2000]. A PACAP növeli a tirozin-hidroxiláz immunpozitív sejtek számát mesencephalicus sejtkultúrában, és csökkenti a PC12 sejtek károsodását 6-OHDA kezelést követıen [Takei és mtsai, 1998]. A 6-OHDA indukálta apoptózis és a Parkinson-kór egyaránt caspase-3 aktivitással jár együtt, ami a végsı apoptotikus proteáz a sejtelhalás során [Dodel és mtsai, 1999; Hartmann és mtsai, 2000], a PACAP pedig gátolni képes a caspase-3 mőködését [Vaudry és mtsai, 2000d].
3. A PACAP védı hatása egyéb neurotoxikus folyamatokban A PACAP egyéb neurotoxikus hatásokkal szemben is védi a sejteket. Segíti a sejtek túlélését alkohol [Vaudry és mtsai, 2002]; ceramid [Hartfield és mtsai, 1998], β-amiloid [Gui és mtsai, 2003]; HIV envelope protein [Brenneman és mtsai, 2002; Dibbern és mtsai, 1997] indukálta neurotoxikus folyamatokban. Ezen kívül a PACAP képes kivédeni az anisomycin
67
indukálta sejtpusztulást retinális explantátumok neuroblast rétegében és a thapsigarginindukálta fotoreceptor károsodást is [Silveira és mtsai, 2002].
B. A PACAP neuroprotektív hatása in vivo kísérletekben
a. A PACAP in vivo neurotrofikus hatásai
Az elmúlt években folyamatosan gyarapodott azon kutatások száma, ahol in vivo kísérletben vizsgálják a PACAP neurotrofikus és neuroprotektív hatását. In vivo kísérletben a PACAP hatását a kisagy fejlıdésében 8 napos patkányokon vizsgálták [Vaudry és mtsai, 1999]. A cerebellum felszínére injektált PACAP hatására a szemcsesejtek száma megnövekedett a külsı és belsı szemcsés rétegben, valamint a molekuláris rétegben. Ez a hatás PACAP antagonista kezeléssel megakadályozható. A PACAP antagonista önmagában enyhe sejtszám csökkenést okozott a belsı granularis rétegben. Ez azt bizonyítja, hogy az endogén PACAP-nak fontos szerepe van a cerebellum kifejlıdésében. Munkacsoportunk mutatta ki azt, hogy ha az újszülött patkányok 2 héten keresztül PACAP kezelésben részesülnek a születést követıen, akkor az gyorsítja azok idegrendszeri fejlıdését, míg a PACAP antagonistával kezelt állatok fejlıdése elmarad a normál állatokétól [Reglıdi és mtsai, 2003a].
b. A PACAP hatása cerebrális ischaemiában
Az idegrendszeri károsodásokat modellezı állatkísérletek közül elıször globális cerebrális ischaemiában mutatták ki a PACAP protektív hatását, ahol csökkentette a károsodott
hippocampus
CA1
sejtek
számát,
amelyek
legérzékenyebbek
globalis
ischaemiával szemben [Uchida és mtsai, 1996]. Ezen kívül a PACAP hatásosnak bizonyult fokális cerebrális ischaemiában is, ahol az a. cerebri media okklúziójával hoztak létre fokális léziót. Bebizonyították, hogy a 2 órás tranziens ischaemia után 4 órával kezdıdı szisztémás PACAP kezelés szignifikánsan csökkentette az infarktus nagyságát [Reglıdi és mtsai, 2000a,b]. Hasonló eredményeket értek el egér modellben, ahol az 1 órás tranziens fokális ischaemiát követı PACAP kezelés szintén csökkentette a lézió nagyságát [Ohtaki és mtsai, 2003].
68
c. A PACAP hatása idegrendszeri sérülésekben
A PACAP segíti az idegregenerációt nervus facialis átvágása után [Kimura és mtsai, 2003], nervus opticus átvágását követıen [Seki és mtsai, 2003], és növeli a septalis cholinerg sejtek túlélését fornix átvágása után [Takei és mtsai, 2000]. A PACAP expressziója emelkedik perifériás axotomia után [Zhang és mtsai, 1995], mivel a PACAP emelkedés gyorsan egyéb más peptidhez képest korábban megtörténik, ezért úgy gondolják, hogy a PACAP-nak fontos neuromodulátor szerepe is van a traumát követı korai adaptációs folyamatokban [Zhang és mtsai, 1995]. Ez valószínősíti, hogy a PACAP-nak fontos szerepe van a traumát követı regenerációs folyamatokban [Wallin és mtsai, 2001]. A gerincvelı traumás károsodását követıen a PACAP csökkenti az apoptotikus sejtek számát [Katahira és mtsai, 2003], és gátolja a cytokinek felszabadulását [Kim és mtsai, 2000]. Munkacsoportunk diffúz axonális károsodás modellben kimutatta, hogy a trauma után közvetlenül intracerebroventricularisan beadott PACAP szignifikánsan csökkenti a β-amiloid precursor protein immunpozitív axonok számát a corticospinalis traktusban [Farkas és mtsai, 2004].
C. Az endogén PACAP szerepe a központi és perifériás idegrendszerben
A
különbözı
idegrendszeri
sérüléseket
követıen
számos
protektív
faktor
upregulálódik. Ezek közé sorolhatók a növekedési faktorok, antiinflammatorikus cytokinek, endogén antioxidánsok és a heat shock proteinek [Leker és Shohami, 2002]. Az elmúlt években számos kísérletben kimutatták, hogy a felsorolt faktorokon kívül az endogén PACAP is upregulálódik idegrendszeri károsodást követıen. Nervus ischiadicus lézió és az ideget érintı inflammatorikus folyamatok során a PACAP szint gyorsan emelkedik a hátsó gyöki ganglion szenzoros neuronjaiban [Zhang és mtsai, 1995; 1996]. Hasonló eredményeket találtak az agytörzsben a nucleus mesencephalicus nervi trigeminiben a nervus massetericus átvágása után [Oemar és mtsai, 1997]. A perifériás sérülések mellett az endogén PACAP és receptorának expressziója fokozódik központi idegrendszeri sérülések esetében, pl.: globális [Shin és mtsai, 2001], fokális ischaemiában [Gillardon és mtsai, 1998], traumás agysérülésekben [Skoglosa és mtsai, 1999]. A kísérletek eredményei alapján arra következtethetünk, hogy a különbözı sérüléseket követı regenerációs folyamatokban fontos szerepe lehet a szervezetben megtalálható endogén PACAP-nak.
69
D. Eredményeink gyakorlati alkalmazása, klinikai jelentısége
Összefoglalásként elmondhatjuk, hogy a PACAP hatásosnak bizonyult az általunk vizsgált idegrendszeri károsodást modellezı állatkísérletben, így tovább gyarapítottuk azon kísérleti eredményeket, amely a PACAP jövıbeli klinikai alkalmazásának alapjai lehetnek. A PACAP azonban csak egyike azon számos neuroprotektív hatású anyagoknak, melyek in vivo kísérletekben csökkentik a károsodás mértékét különbözı idegrendszeri sérülésekben. Bizonyították már többek között az ösztrogén [Merchenthaler és mtsai, 2003] és a hypothermia [Barone és mtsai, 1997] neuroprotektív hatását cerebrális ischaemiában, de a glutamát
antagonisták,
Ca2+-csatorna
blokkolók,
antioxidánsok,
antiinflammatorikus
készítmények az ischaemián kívül a különbözı neurodegeneratív és egyéb toxikus károsodások terápiájában is fontos szerepet töltenek be [Grunblatt és mtsai, 2000]. A gyógyszerkísérletek középpontjában álló szerek többsége a klinikai kipróbálásban egyelıre nem bizonyult hatékonynak részben a mellékhatások, részben a nagyon szők terápiás ablak miatt. Ezenkívül egyes szerek toxikus mellékhatásokkal rendelkeznek, és nem képesek átjutni a vér-agy gáton, ami szintén nagy problémát jelent ezen anyagok szisztémás alkalmazásában [Dyker és Lees, 1998]. A PACAP klinikai alkalmazását elısegíti az, hogy endogén peptidként az emberi szervezetben számos helyen megtalálható, így a fiziológiás koncentráció exogén alkalmazása során toxikus hatásokat nem fejt ki. Ezenkívül nemcsak lokális kezelésre nyújt lehetıséget, hanem szisztémásan is alkalmazható, mivel intravénás beadását követıen képes átjutni a véragy gáton [Banks és mtsai, 1993; Somogyvári-Vígh és mtsai, 1998], azonban a PACAP koncentrációja a vérben hamar csökken, ezért a folyamatos infúziós kezelés hatásosabbnak bizonyult egyes kísérletekben, mint az egyszeri dózis [Reglıdi és mtsai, 2000a,b]. Kísérleteink további célja a PACAP hatásmechanizmusának még részletesebb vizsgálata, és olyan biológiailag aktív fragmentumok elıállítása, ami könnyebbé tenné a klinikai alkalmazást, hogy a PACAP egy ígéretes terápiás lehetıség legyen az idegrendszeri sérülések klinikai ellátásában.
70
XI. AZ ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA 1., Kimutattuk, hogy az a. cerebri media elzárása elıtt intracerebroventricularisan beadott PACAP szignifikánsan csökkenti a károsodott agyterület nagyságát, és nem találtunk szignifikáns különbséget az egyszeri és a 7 napig tartó kezelés hatékonysága közt. A neurológiai vizsgálat során nem volt szignifikáns eltérést a PACAP-pal kezelt és a kontroll állatok között, ezzel ellentétben az orientációs tesztben a hátsó testfél érintését követı reakcióidı szignifikánsan csökkent a PACAP-pal kezelt állatokban a kontroll csoporthoz képest. A PACAP intracerebroventricularis beadása után a szisztémás vérnyomásban nem észleltünk változást, míg a corticalis agyi keringés a PACAP beadást követıen az elsı 20 percben szignifikánsan emelkedett, majd fokozatosan visszatért az eredeti szintre. 2., Adatokat szolgáltattunk arra, hogy 6-OHDA indukálta substantia nigra károsodás eltérı magatartási és szövettani eltéréseket okoz különbözı nemő, és korú állatoknál. Azt találtuk, hogy mind a fiatal, mind az idıs hím állatok sokkal érzékenyebbek a 6-OHDA lézióra, mint a nıstény állatok, mivel a nıstényeknek szignifikánsan kevesebb dopaminerg sejtje károsodott, és emiatt szignifikánsan jobban javultak magatartási tüneteik is az operációt követıen. A szövettani vizsgálat során nem találtunk nagyobb sejtpusztulást az öreg állatoknál, mint a fiatal patkányoknál, pedig az idıs állatok magatartásbeli eltérései sokkal súlyosabbnak bizonyultak. 3., Bizonyítottuk a PACAP neuroprotektív hatását 6-OHDA indukálta substantia nigra lézióban. Kimutattuk, hogy a neurotoxikus lézió elıtt lokálisan beadott 0,01-1 µg dózisú PACAP megvédi a dopaminerg sejtek nagy részét a substantia nigrában, és majdnem a sejtek 100%-át a ventralis tegmentalis areában. A PACAP kezelt állatok szignifikánsan jobban teljesítettek a magatartási tesztekben, nem mutattak súlyos hipoaktivitási jeleket, és az aszimmetrikus jeleik is szignifikánsan gyorsabban javultak, mint a kontroll csoport tünetei. 4., Bebizonyítottuk, hogy a quinolinsav léziót megelızı PACAP kezelés felére csökkentette a károsodott sejtek számát a striatumban, megakadályozta a hiperaktivitás kialakulását, és elısegítette a féloldali lézió következtében kialakuló aszimmetrikus jelek gyors javulását, ezen kívül a PACAP-pal kezelt állatok a normál állatokhoz hasonlóan teljesítettek a katalepszia tesztben is. 5., Elsıként mutattuk ki a PACAP glutamát indukálta neurotoxikus károsodással szembeni védı hatását patkány retinában in vivo körülmények között.
71
XII. IRODALOM
Ábrahám H, Somogyvári-Vígh A, Maderdrut JL, Vigh S, Arimura A. Filament size influences temperature changes and brain damage following middle cerebral artery occlusion in rats. Exp Brain Res 2002; 42: 131-138. Ali SF, David SN, Newport GD. Age-related susceptibility to MPTP-induced neurotoxicity in mice. Neurotoxicology 1993; 14: 29-34. Amoroso S, Di Renzo GF, Maurano F, Maida P, Taglialatela M, Annunziato L. Lack of evidence for an impairment of tuberoinfundibular dopaminergic neurons in aged male rats of the Sprague-Dawley strain. Exp Aging Res 1987; 13: 85-87. Anzai M, Suzuki Y, Takayasu M, Kajita Y, Mori Y, Seki Y, Saito K, Shibuya M. Vasorelaxant effect of PACAP-27 on canine cerebral arteries and rat intraceberal arterioles. Eur J Pharmacol 1995; 285: 173-179. Araki T, Kato H, Shuto K, Fujiwara T, Itoyama Y. Effect of aging on dopaminergic receptors and uptake sites in the rat brain studied by receptor autoradiography. J Neurol Sci 1997; 148: 131-137. Arimoto T, Bing G. Up-regulation of inducible nitric oxide synthase in the substantia nigra by lipopolysaccharide causes microglial activation and neurodegeneration. Neurobiol Dis 2003; 12: 35-45. Arimura A, Somogyvári-Vígh A, Miyata A, Mizuno K, Coy DH, Kitada C. Tissue distribution of PACAP as determined by RIA: highly abundant in the rat brain and testes. Endocrinology 1991; 129: 2787-2789. Arimura A. Perspectives on pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the neuroendocrine, endocrine, and nervous systems. Jpn J Physiol 1998; 48: 301-331. Arimura A. Perspectives on the development of a neuroprotective drug based on PACAP. Regul Peptides 2003; 115: 40 (abstract). Banks WA, Kastin AJ, Komaki G, Arimura A. Passage of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide1-27 and pituitary adenylate cyclase activating polypeptide1-38 across the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Therap 1993; 267: 690-696. Barone FC, Feuerstein GZ, White RF. Brain cooling during transient focal ischemia provides complete neuroprotection. Neurosci Biobehav 1997; 21: 31-44. Review. Beal MF, Kowall NW, Ellison DE, Mazurek KJ, Swartz KJ, Martin JB. Replication of the neurochemical characteristics of Huntington's disease by quinolinic acid. Nature 1986; 321: 168-171. Beal MF, Ferrante RJ, Swartz KJ, Kowall NW. Chronic quinolinic acid lesions in rats closely resemble Huntington's disease. J Neurosci 1991; 11: 1649-1659.
72
Bederson JB, Pitts LH, Germano SM, Nishimura MC, Davis RL, Bartkowski HM. Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats. Stroke 1986; 17: 1304-1308. Bennett DA, Beckett LA, Murray AM, Shannon KM, Goetz CG, Pilgrim DM, Evans DA. Prevalence of parkinsonian signs and associated mortality in a community population of older people. N Engl J Med 1996; 334: 71-76. Blizard DA, Lippman HR, Chen JJ. Sex differences in open-field behavior in the rat: the inductive and activational role of gonadal hormones. Physiol Behav 1975; 14: 601-608. Borlongan VC, Randall TS, Cahill DW, Sanberg PR. Asymmetrical motor behavior in rats with unilateral excitotoxic lesions as revealed by the eleveted body swing test. Brain Res 1995a; 676: 231-234. Borlongan VC, Shytle RD, Ross SD, Shimizu T, Freeman TB, Cahill DW, Sanberg PR. (-)Nicotine protects against systemic kainic acid-induced exitotoxic effects. Exp Neurol 1995b; 136: 261-265. Bowenkamp KE, Ujhelyi L, Cline EJ, Bickford PC. Effects of intra-striatal GDNF on motor coordination and striatal electrophysiology in aged F344 rats. Neurobiol Aging 2000; 21: 117-124. Brenneman DE, Hauser JM, Spong C, Phillips TM. Chemokine release is associated with the protective action of PACAP-38 against HIV envelope protein neurotoxicity. Neuropeptides 2002; 36: 271-280. Cai H, Yao H, Ibayashi S, Uchimura H, Fujishima M. Photothrombotic middle cerebral artery occlusion in spontaneously hypertensive rats. Influence of substrain, gender and distal middle cerebral artery patterns on infarct size. Stroke 1998; 29: 1982-1987. Campbell CA, Mackay KB, Patel S, King PD, Stretton JL, Hadingham SJ, Hamilton TC. Effects of isradipine, an L-type calcium channek blocker on permanent and transient focal cerebral ischemia in spontaneously hypertensive rats. Exp Neurol 1997; 148: 4550. Canonico PL, Copani A, D'Agata V, Musco S, Petralia S, Travali S, Stivala F, Cavallaro S. Activation of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide receptors prevents apoptotic cell death in cultured cerebellar granule cells. Ann NY Acad Sci 1996; 805: 470-472. Cass WA, Harned ME, Bailey SL. Enhanced effects of 6-hydroxydopamine on evoked overflow of striatal dopamine in aged rats. Brain Res 2002; 938: 29-37. Chambille I, Serviere J. Neurotoxic effects of neonatal injections of monosodium L-glutamate (L-MSG) on the retinal ganglion cell layer of the golden hamster: anatomical and functional consequences on the circadian system. J Comp Neurol 1993; 338: 67-82.
73
Chang JY, Korolev VV, Wang JZ. Cyclic AMP and pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) prevent programmed cell death of cultured rat cerebellar granule cells. Neurosci Lett 1996; 206: 181-184. Chang JY, Korolev VV. Cyclic AMP and sympathetic neuronal programmed cell death. Neurochem Int 1997; 31: 161-167. Collier TJ, Sortwell CE, Daley BF. Diminished viability, growth, and behavioral efficacy of fetal dopamine neuron grafts in aging rats with long-term dopamine depletion: an argument for neurotrophic supplementation. J Neurosci 1999; 19: 5563-5573. Connor B, Kozlowski DA, Schallert T, Tillerson JL, Davidson BL, Bohn MC. Differential effects of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) in the striatum and substantia nigra of the aged Parkinsonian rat. Gene Ther 1996; 6: 1936-1951. Cyr M, Calon F, Morissette M, Di Paolo T. Estrogenic modulation of brain activity: implications for schizophrenia and Parkinson`s disease. J Psychiatry Neurosci 2002; 27: 12-27. D’Agata V, Cavallaro S, Stivala F, Travali S, Canonico PL. Tissue-specific and developmental expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) receptors in rat brain. Eur J Neurosci 1996; 8: 310-318. Date I, Felten DL, Felten SY. Long-term effect of MPTP in the mouse brain in relation to aging: neurochemical and immunocytochemical analysis. Brain Res 1990; 519: 266276. Dechant G, Neumann H. Neurotrophins. Adv Exp Med Biol 2002; 513: 303-334. Delgado M, Leceta J, Ganea D. Vasoactive intestinal peptide and pituitary adenylate cyclaseactivating polypeptide inhibit the production of inflammatory mediators by activated microglia. J Leukoc Biol 2003; 73: 155-164. Deumens R, Blokland A, Prickaerts J. Modeling Parkinson`s disease in rats: an evaluation of 6-OHDA lesions of the nigrostriatal pathway. Exp Neurol 2002; 175: 303-17. Deutsch PJ, Sun Y. The 38-amino acid form of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide stimulates dual signaling cascades in PC12 cells and promotes neurite outgrowth. J Biol Chem 1992; 267: 5108-5113. Diamond SG, Markham CH, Hoehn MM, McDowell FH, Muenter MD. An examination of male-female differences in progression and mortality of Parkinson`s disease. Neurology 1990; 40: 763-766. Dibbern DA, Glazner GW, Gozes I, Brenneman DE, Hill JM. Inhibition of murine embryonic growth by human immunodeficiency virus envelope protein and its prevention by vasoactive intestinal peptide and activity-dependent neurotrophic factor. J Clin Invest 1997; 99: 2837-2841.
74
DiCicco-Bloom E, Deutsch PJ. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) potently stimulates mitosis, neurit genesis and survival in cultured rat sympathetic neuroblasts. Regul Pept 1992; 37: 319-323. Dirnagl U, Kaplan B, Jacewicz M, Pulsinelli W. Continuous measurement of cerebral cortical blood flow by laser-doppler flowmetry in a rat stroke model. J Cereb Blood Folw Metab 1989; 9: 589-596. Disshon KA, Dluzen DE. Estrogen reduces acute striatal dopamine responses in vivo to the neurotoxin MPP+ in female, but not male rats. Brain Res 2000; 868: 95-104. Dluzen DE, McDermott JL, Ramirez VD. Changes in dopamine release in vitro from the corpus striatum of young versus aged rats as a function of infusion modes of L-DOPA, potassium, and amphetamine. Exp Neurol 1991; 112: 153-160. Dluzen DE, McDermott JL, Liu B. Estrogen as a neuroprotectant against MPTP-induced neurotoxicity in C57/BL mice. Neurotoxicol Teratol 1996; 18: 603-606. Dluzen D. Estrogen decreases corpus striatal neurotoxicity in response to 6hydroxydopamine. Brain Res 1997; 767: 340-344. Dobrev D, Bergstrasser E, Fischer HD, Andreas K. Restriction and functional changes of dopamine release in rat striatum from young adult and old rats. Mech Ageing Dev 1995; 80: 107-119. Dodel RC, Du Y, Bales KR, Ling Z, Carvey PM, Paul SM. Caspase-3-like proteases and 6hydroxydopamine induced neuronal cell death. Mol Brain Res 1999; 64: 141-148. Dyker AG, Lees KR. Duration of neuroprotective treatment for ischemic stroke. Stroke 1998; 29: 535-542. Erhardt NM, Fradinger EA, Cervini LA, Rivier JE, Sherwood NM. Early expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide and activation of its receptor in chick neuroblasts. Endocrinology 2001; 142: 1616-1625. Emborg ME, Ma SY, Mufson EJ, Levey AI, Taylor MD, Brown WD, Holden JE, Kordower JH. Age-related declines in nigral neuronal function correlate with motor impairments in Rhesus monkeys. J Comp Neurol 1998; 401: 253-265. Emerich DF, McDermott P, Krueger P, Banks M, Zhao J, Marszalkowski J, Frydel B, Winn SR, Sanberg PR. Locomotion of aged rats: relationship to neurochemical but not morphological changes in nigrostriatal dopaminergic neurons. Brain Res Bull 1993; 32: 477-486. Farkas O, Tamás A, Zsombok A, Reglıdi D, Pál J, Büki A, Lengvári I, Povlishok JT, Dóczi T. Effects of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in a rat model of traumatic brain injury. Regul Pept 2004; 123: 69-75. Fearnley JM, Lees AJ. Ageing and Parkinson`s disease: substantia nigra regional selectivity. Brain 1991; 114: 2283-2301.
75
Field EF, Whishaw IQ, Pellis SM. Sex differences in catalepsy: evidence for hormonedependent postural mechanisms in haloperidol-treated rats. Behav Brain Res 2000; 109: 207-212. Figiel M, Engele J. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP), a neuronderived peptide regulating glial glutamate transport and metabolism. J Neurosci 2000; 20: 3596-3605. Fornaguera J, Carey RJ, Huston JP, Schwarting RK. Behavioral asymmetries and recovery in rats with different degrees of unilateral striatal dopamine depletion. Brain Res 1994; 664: 178-188. Fox G, Gallacher D, Shevde S, Loftus J, Swayne G. Anatomic variation of the middle cerebral artery in Sprague-Dawley rat. Stroke 1993; 24: 2087-2092. Frechilla D, Garcia-Osta A, Palacios S, Cenarruzabeitia E, Del Rio J. BDNF mediates the neuroprotective effect of PACAP38 on rat cortical neurons. Neuroreport 2001; 12: 919923. Friedemann MN, Gerhardt GA. Regional effects of aging on dopaminergic function in the Fischer-344 rat. Neurobiol Aging 1992; 13: 325-332. Gábriel R, Zhu BS, Straznicky C. Synaptic contacts of serotonin-like immunoreactive and 5,7-dihydoxytryptamine/accumulating neurons in the anuran retina. Neuroscience 1993; 54: 1103-1114. Ganea D, Delgado M. Vasoactive intestinal peptide (VIP) and pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) as modulators of both innate and adaptive immunity. Crit Rev Oral Biol Med 2002; 13: 229-237. Garcia JH, Wagner S, Liu KF, Hu XJ. Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke 1995; 26: 627-635. Gerstenbrand F, Ransmayr G. Nosography of Parkinson`s disease. J Neural Transm 1986; (Suppl) 22: 119-128. Gillardon F, Hata R, Hossmann KA. Delayed up-regulation of Zac1 and PACAP type I receptor after transient focal cerebral ischemia in mice. Mol Brain Res 1998; 61: 207210. Gillessen T, Budd SL, Lipton SA. Excitatory amino acid neurotoxicity. Adv Exp Med Biol 2002; 513: 3-40. Giordano M, Ford LM, Shipley MT, Sanberg PR. Neural graft and pharmacological intervention in a model of Huntington’s disease. Brain Res Bull 1990; 25: 453-465. Gonzalez BJ, Basille M, Vaudry D, Fournier A, Vaudry H. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide promotes cell survival and neurite outgrowth in rat cerebellar neuroblasts. Neuroscience 1997; 78: 419-430.
76
Gould TJ, Stromberg I, Bickford PC. Decline in striatal dopamine D1 and D2 receptor activation in aged F344 rats. Neurobiol Aging 1996; 17: 877-883. Gottschall PE, Tatsuno I, Arimura A. Regulation of interleukin-6 (IL-6) secretion in primary cultured rat astrocytes: synergism of interleukin-1 (IL-1) and pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP). Brain Res 1994; 637: 197-203. Grumolato L, Louiset E, Alexandre D, Ait-Ali D, Turquier V, Fournier A, Fasolo A, Vaudry H, Anouar Y. PACAP and NGF regulate common and distinct traits of the sympathoadrenal lineage: effects on the electrical properties, gene markers and trasncription factors in differentiating PC12 cells. Eur J Neurosci 2003; 17: 71-82. Gui LR, Zhou Y, Zhang BL, Li WB. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide protects neuro-2a cells from beta amyloid protein cytotoxicity by modulating intracellular calcium. Sheng Li Xue Bao 2003; 55: 42-46. Grunblatt E, Mandel S, Youdim MB. Neuroprotective strategies in Parkinson's disease using the models of 6-hydroxydopamine and MPTP. Ann N Y Acad Sci 2000; 899: 262-73. Review. Gutierrez-Canas I, Rodriguez-Henche N, Bolanos O, Carmena MJ, Prieto JC, Juarranz MG. VIP and PACAP are autocrine factors that protect the androgen-independent prostate cancer cell line PC-3 from apoptosis induced by serum withdrawal. Br J Pharmacol 2003; 139: 1050-1058. Hannibal J. Neurotransmitters in the retinohypothalamic tract. Cell Tissue Res 2002; 309: 7388. Hartfield PJ, Bilney AJ, Murray AW. Neurotrophic factors prevent ceramide-induced apoptosis downstream of c-Jun N-terminal kinase activation in PC12 cells. J Neurochem 1998; 71: 161-169. Hartmann A, Hunot S, Michel PP, Muriel MP, Vyas S, Faucheux BA, Mouatt-Prigent A, Turnel H, Srinivasan A, Ruberg M, Evan GI, Agid Y, Hirsch EC. Caspase-3: a vulnerability factor and final effector in apoptotic death of dopaminergic neurons in Parkinson`s disease. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 2875-2880. Hashimoto H, Hagihara N, Koga K, Yamamoto K, Shintani N, Tomimoto S, Mori W, Koyama Y, Matsuda T, Baba A. Synergistic induction of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) gene expression by nerve growth factor and PACAP in PC12 cells. J Neurochem 2000; 74: 501-507. Hebert MA, Gerhardt GA. Normal and drug-induced locomotor behavior in aging: comparison to evoked DA release and tissue content in Fischer 344 rats. Brain Res 1998; 797: 42-54. Hendley ED, Fan XM. Regional differences in brain norepinephrine and dopamine uptake kinetics in inbred rat strains with hypertension and/or hyperactivity. Brain Res 1992; 586: 44-52.
77
Hu Z, Lelievre V, Rodriguez WI, Tam J, Cheng JW, Cohen-Cory S, Waschek JA. Embryonic expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide and its selective type I receptor gene in the frog Xenopus laevis neural tube. J Comp Neurol 2001; 441: 266275. Iravani MM, Kashefi K, Mander P, Rose S, Jenner P. Involvement of inducible nitric oxide in inflammation-induced dopaminergic neurodegeneration. Neuroscience 2002; 110: 4958. Itoh S, Katsuura G, Yoshikawa K. Hypermotility induced by vasoactive intestinal peptide in the rat: its reciprocal action to cholecystokinin octapeptide. Peptides 1985; 6: 53-57. Jamen F, Laden JC, Bouschet T, Rodriguez-Henche N, Bockaert J, Brabet P. Nerve growth factor upregulates the PAC1 promoter by activating the MAP kinase pathway in rat PC12 cells. Ann NY Acad Sci 2000; 921: 390-394. Jezek K, Schulz D, De Souza Silva MA, Muller HW, Huston JP, Hasenohrl RU. Effects of chronic intraventricular infusion of heparin glycosaminoglycan on learning and brain acetylcholine parameters in aged rats. Behav Brain Res 2003; 147: 115-123. Jongsma Wallin H, Pettersson LME, Verge VMK, Danielsen N. Effect of anti-nerve growth factor treatment on pituitary adenylate cyclase activating polypeptide expression in adult sensory neurons exposed to adjuvant induced inflammation. Neuroscience 2003; 120: 325-331. Józsa R, Somogyvári-Vígh A, Reglıdi D, Hollósy T, Arimura A, Distribution and daily variations of PACAP in the chicken brain. Peptides 2001; 22: 1371-1377. Kametani H, Iijima S, Spangler EL, Ingram DK, Joseph JA. In vivo assessment of striatal dopamine release in the aged male Fischer 344 rat. Neurobiol Aging 1995; 16: 639-646. Katahira M, Yone K, Arishima Y, Nagamine T, Komiya S, Iwata S. The neuroprotective effects of PACAP on spinal cord injury (SCI) in rats. Regul Pept 2003; 115: 49. Kienlen Campard P, Crochemore C, Rene F, Monnier D, Koch B, Loeffler JP. PACAP type I receptor activation promotes cerebellar neuron survival through the cAMP/PKA signaling pathway. DNA Cell Biol 1997; 16: 323-333. Kim WK, Kan Y, Ganea D, Hart RP, Gozes I, Jonakait GM. Vasoactive intestinal peptide and pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide inhibit tumor necrosis factor-α production in injured spinal cord and in activated microglia via a cAMP-dependent pathway. J Neurosci 2000; 20: 3622-3630. Kim DH, Jang YY, Han ES, Lee CS. Protective effect of harmaline and harmalol against dopamine- and 6-hydroxydopamine-induced oxidative damage of brain mitochondria and synaptosomes, and viability loss of PC12 cells. Eur J Neurosci 2001; 13: 18611872.
78
Kimura H, Kawatani M, Ito E, Ishikawa K. Effects of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide on facial nerve recovery in the guinea pig. Laryngoscope 2003; 113: 10001006. Kong LY, Maderdrut JL, Jeohn GH, Hong JS. Reduction of lipopolysaccharide-induced neurotoxicity in mixed cortical neuron/glia cultures by femtomolar concentrations of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide. Neuroscience 1999; 91: 493-500. Köves K, Arimura A, Somogyvári-Vígh A, Vígh S, Miller J. Immunohistochemical demonstration of a novel hypothalamic peptide, pituitary adenylate cyclase activating polypeptide, in the ovine hypothalamus. Endocrinology 1990; 127: 264-271. Köves K, Arimura A, Görcs TG, Somogyvári-Vígh A. Comparative distribution of immunoreactive pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) and vasoactive intestinal polypeptide in rat forebrain. Neuroendocrinology 1991; 54: 159169. Köves K, Arimura A, Vígh S, Somogyvari-Vígh A, Miller J. Immunohistochemical localization of PACAP in the ovine digestive system. Peptides 1993; 14: 449-455. Köves K, Vincze E. A hypophysis adenilát-cikláz aktiváló polipeptid szerkezete, elıfordulása és szerepe az élettani mőködésekben. Orvosi Hetilap 2001; 142: 491-496. Lazarovici P, Fink D. Heterologous upregulation of nerve growth factor-TrkA receptors in PC12 cells by pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP). Mol Cell Biol Res Commun 1999; 2: 97-102. Lee J, Park HJ, Choi HS, Kwon HB, Arimura A, Lee BJ, Choi WS, Chun SY. Gonadotropin stimulation of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) messenger ribonucleic acid in the rat ovary and the role of PACAP as a follicle survival factor. Endocrinology 1999; 140: 818-826. Lee FS, Rajagopal R, Kim AH, Chang PC, Chao MV. Activation of Trk neurotrophin receptor signaling by pituitary adenylate cyclase activating polypeptides. J Biol Chem 2002; 277: 9096-9102. Leker RR, Shohami E. Cerebral ischemia and trauma-different etiologies yet similar mechanisms: neuroprotective opportunities. Brain Res Rev 2002; 39: 55-73. Lénárd L, Karádi Z, Szabó I, Hahn Z. Pallidal mechanisms in the organizations of feeding and sensorimotor integration. In: Lissak K, editor. Recent development of neurobiology in Hungary. Budapest: Akadémiai Kiadó 1982. Lindholm D, Skoglosa Y, Takei N. Developmental regulation of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) and its receptor 1 in rat brain: function of PACAP as a neurotrophic factor. Ann NY Acad Sci 1998; 865: 189-196. Lindner MD, Cain CK, Plone MA, Frydel BR, Blaney TJ, Emerich DF, Hoane MR. Incomplete nigrostriatal dopaminergic cell loss and partial reductions in striatal
79
dopamine produced akinesia, rigidity, tremor and cognitive deficits in middle-aged rats. Behav Brain Res 1999; 102: 1-16. Lindvall O, Kokaia Z, Bengzon J, Elmer E, Kokaia M. Neurotrophins and brain insults. Trends Neurosci 1994; 17: 490-496. Lioudyno M, Skoglosa Y, Takei N, Lindholm D. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) protects dorsal root ganglion neurons from death and induces calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in vitro. J Neurosci Res 1998; 51: 243-256. Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, Cummins R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke 1989; 20: 84–91. Lundblad M, Andersson M, Winkler C, Kirik D, Wierup N, Cenci MA. Pharmacological validation of behavioral measures of akinesia and dyskinesia in a rat model of Parkinson`s disease. Eur J Neurosci 2002; 15: 120-132. Marshall JF, Turner BH, Tetelbaum PH. Sensory neglect produced by lateral hypothalamic damage. Science 1971; 174: 523-525. Marshall JF, Drew MC, Neve KA. Recovery of function after mesotelencephalic dopaminergic injury in senescence. Brain Res 1983; 259: 249-260. Marshall JF, Rosenstein AJ. Age-related decline in rat striatal dopamine metabolism is regionally homogeneous. Neurobiol Aging 1990; 11: 131-137. Masuo Y, Noguchi J, Morita S, Matsumoto Y. Effects of intracerebroventricular administration of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) on the motor activity and reserpine-induced hypothermia in murines. Brain Res 1995; 700: 219-236. Martin JB. Huntington's disease: new approaches to an old problem. The Robert Wartenberg lecture. Neurology 1984; 34: 1059-1072. Review. Martin JB; Gusella JF. Huntington's disease. Pathogenesis and management. N Engl J Med 1986; 315: 1267-1276. Merchenthaler I, Dellovade TL, Shughrue PJ. Neuroprotection by estrogen in animal models of global and focal ischemia. Ann N Y Acad Sci 2003; 1007: 89-100. Review. Miyata A, Arimura A, Dahl RR, Minamino N, Uehara A, Jiang L, Culler MD, Coy DH. Isolation of a novel 38 residue-hypothalamic polypeptide which stimulates adenylate cyclase in pituitary cells. Biochem Biophys Res Commun 1989; 164: 567-574. Mokrey J. Experimental models and behavioural tests used in the study of Parkinson`s disease. Physiol Res 1995; 44: 143-150. Moller JC, Sautter J, Kupsch A. Potential of neurotrophic factors in therapy of Parkinson’s disease. J Neural Transm 1996; [Suppl]48: 103-112.
80
Moore AE, Cicchetti F, Hennen J, Isacson O. Parkinsonian motor deficits are reflected by proportional A9/A10 dopamine neuron degeneration in the rat. Exp Neurol 2001; 172: 363-376. Morio H, Tatsuno I, Hirai A, Tamura Y, Saito Y. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide protects rat-cultured cortical neurons from glutamate-induced cytotoxicity. Brain Res 1996a; 741: 82-88. Morio H, Tatsuno I, Tanaka T, Uchida D, Hirai A, Tamura Y, Saito Y. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) is a neurotrophic factor for cultured rat cortical neurons. Ann NY Acad Sci 1996b; 805: 476-481. Nikolaus S, Huston JP, Korber B, Thiel C, Schwarting RKW. Pretreatment with neurokinin, substance P but not with cholecystokinin-8S can alleviate functional deficits of partial nigrostriatal 6-hydroxydopamine lesion. Peptides 1997; 18: 1161-1168. Obeso JA, Rodriguez-Oroz MC, Rodriguez M, Lanciego JL, Artieda J, Gonzalo N, Olanow CW. Pathophysiology of the basal ganglia in Parkinson's disease. Trends Neurosci 2000; 10: S8-19. Oemar LJ, Hannibal J, Knudsen SM, Fahrenkrug J. Expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the mesencephalic trigeminal nucleus of the rat after transection of the masseteric nerve. Mol Brain Res 1997; 46: 109-117. Ohtaki H, Dohi K, Yofu S, Nakamachi T, Kudo Y, Endo S, Aruga T, Goto N, Watanabe J, Kikuyama S, Shioda S. Neuroprotective effects of PACAP38 through IL-6 after focal ischemia in mouse. Regul Pept 2003; 115: 53. Oka H, Jin L, Kulig E, Scheithauer BW, Lloyd RV. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide inhibits transforming growth factor-1-β induced apoptosis in a human pituitary adenoma cell line. Am J Pathol 1999; 155: 1893-1900. Oliff HS, Weber E, Miyazaki B, Marek P. Infarct volume varies with rat strain and vendor in focal cerebral ischemia induced by transcranial middle cerebral artery occlusion. Brain Res 1995; 699: 329-331. Onali P, Olianas MC. PACAP is a potent and highly effective stimulator of adenylyl cyclase activity in the retinas of different mammalian species. Brain Res 1994; 641: 132-134. Onoue S, Endo K, Yajima T, Kashimoto K. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide and vasoactive intestinal peptide attenuate glutamate-induced nNOS activation and cytotoxicity. Regul Pept 2002a; 107: 43-47. Onoue S, Endo K, Yajima T, Kashimoto K. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide regulates basal production of nitric oxide in PC12 cells. Life Sci 2002b; 71: 205-214. Onoue S, Ohshima K, Endo K, Yajima T, Kashimoto K. PACAP protects neuronal P12 cells from the cytotoxicity of human prion protein fragment 106-126. FEBS Lett 2002c; 522: 65-70.
81
Osborne NN, Ugarte M, Chao M, Chidlow G, Bae JH, Wood JP, Nash MS. Neuroprotection in relation to retinal ischemia and relevance to glaucoma. Surv Ophthalmol 1999; 43: S102-128. Palkovits M, Somogyvári-Vígh A, Arimura A. Concentrations of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in human brain nuclei. Brain Res 1995; 699: 116-120. Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. Academic Press 1982. Pellegri G, Magistretti PJ, Martin JL. VIP and PACAP potentiate the action of glutamate on BDNF expression in mouse cortical neurones. Eur J Neurosci 1998; 10: 272-280. Petullo D, Masonic K, Lincoln C, Wibberley L, Teliska M, Yao DL. Model development and behavioral assessment of focal cerebral ischemia in rats. Life Sci 1999; 64: 1099-1108. Pisegna JR, Wank SA. Cloning and characterization of the signal transduction of four splice variations of the human pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide receptor. Evidence for dual coupling to adenylate cyclase and phospholipase. C J Biol Chem 1996; 271: 17267-17274. Pritzel M, Huston JP. Neural and behavioral plasticity: crossed nigro-thalamic projections following unilateral substantia nigra lesions. Behav Bran Res 1981; 3: 393-399. Pritzel M, Huston JP, Sarter M. Behavioral and neuronal reorganization after unilateral substantia nigra lesions: evidence for increased interhemispheric nigrostriatal projections. Neuroscience 1983; 9: 879-888. Reglıdi D, Somogyvári-Vigh A, Vigh S, Kozicz T, Arimura A. Delayed systemic administration of PACAP38 is neuroprotective in transient middle cerebral artery occlusion in the rat. Stroke 2000a; 31: 1411-1417. Reglıdi D, Somogyvári-Vigh A, Vígh S, Maderdrut JL, Arimura A. Neuroprotective effects of PACAP38 in a rat model of transient focal ischemia under various experimental conditions. Ann N Y Acad Sci 2000b; 921: 119-128. Reglıdi D, Kiss P, Tamás A, Lengvári I. The effects of PACAP and PACAP antagonist on the neurobehavioral development of newborn rats. Behav Brain Res 2003a; 140: 131139. Reglıdi D, Tamás A, Lengvári I. Examination of sensorimotor performance following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res Bull 2003b; 59: 459-466. Ricaurte GA, Irwin I, Forno LS, DeLanney LE, Langston E, Langston JW. Aging and 1methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced degeneration of dopaminergic neurons in the substantia nigra. Brain Res 1987; 403: 43-51. Ricaurte GA, DeLanney LE, Finnegan KT, Irwin I, Langston JW. The dopamine-depleting effect of 6-hydroxydopamine does not increase with aging. Brain Res 1988; 438: 395398.
82
Rigdon GC, Boyes WK, Dyer RS. Effect of perinatal monosodium glutamate administration on visual evoked potentials of juvenile and adult rats, Neurotoxicol Teratol 1989; 11: 121-128. Roberts RC, Ahn A, Swartz KJ, Beal MF, DiFiglia M. Intrastriatal injections of quinolinic acid or kainic acid: differential patterns of cell survival and the effects of analysis on outcome. Exp Neurol 1993; 124: 274-282. Sanberg PR, Calderon SF, Giordano M, Tew JM, Norman AB. The quinolinic acid model of Huntington′s disease: locomotor abnormalities. Exp Neurol 1989; 105: 45-53. Schmid-Elsaesser R, Zausinger S, Hungerhuber E, Baethmann A, Reulen HJ. A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laserDoppler flowmetry. Stroke 1998; 29: 2162-2170. Schulz D, Huston JP, Jezek K, Haas HL, Roth-Harer A, Selbach O, Luhmann HJ. Water maze performance, exploratory activity, inhibitory avoidance and hippocampal plasticity in aged superior and inferior learners. Eur J Neurosci 2002; 16: 2175-2185. Schulz D, Sergeeva OA, Ianovskii E, Luhmann HJ, Haas HL, Huston JP. Behavioral parameters in aged rats are related to LTP and gene expression of ChAT and NMDANR2 subunits in the striatum. Eur J Neurosci 2004; 19: 1373-1383. Schwarting RKW, Bonatz AE, Carey RJ, Huston JP. Relationship between indices of behavioral asymmetries and neurochemical changes following mesencephalic 6hydroxydopamine injections. Brain Res 1991; 554: 46-55. Schwarting RKW, Huston JP. Unilateral 6-hydroxydopamine lesions of meso-striatal dopamine neurons and their physiological sequelae. Prog Neurobiol 1996a; 49: 215266. Schwarting RKW, Huston JP. The unilateral 6-hydroxydopamine lesion model in behavioral brain research: analysis of functional deficits, recovery and treatments. Prog Neurobiol 1996b; 50: 275-331. Schwarting RK, Huston JP. Behavioral and neurochemical dynamics of neurotoxic mesostriatal dopamine lesions. Neurotoxicology 1997; 18: 689-708. Sedelis M, Hofele K, Auburger GW, Morgan S, Huston JP, Schwarting RK. MPTP susceptibility in the mouse: behavioral, neurochemical, and histological analysis of gender and strain differences. Behav Genet 2000; 30: 171-182. Sedelis M, Schwarting RKW, Huston JP. Behavioral phenotyping of the MPTP mouse model of Parkinson`s disease. Behav Brain Res 2001; 125: 109-122. Sedelis M, Hofele K, Schwarting KW, Huston JP, Belknap JK. Chromosomal loci influencing the susceptibility to the parkinsonian neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6tetrahydropyridine. J Neurosci 2003; 23: 8247-8253.
83
Seki Y, Suzuki Y, Baskaya MK, Kano T, Saito K, Takayasu M, Shibuya M, Sugita K. The effects of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide on cerebral arteries and vertebral. Eur J Pharmacol 1995; 275: 259-266. Seki T, Shioda S, Ogino D, Nakai Y, Arimura A, Koide R. Distribution and ultrastructural localization of a receptor for pituitary adenylate cyclase activating polypeptide and its mRNA in the rat retina. Neurosci Lett 1997; 238: 127-130. Seki T, Shioda S, Izumi S, Arimura A, Koide R. Electron microscopic observation of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP)-containing neurons in the rat retina. Peptides 2000; 21: 109-113. Seki T, Izumi S, Shioda S, Arimura A. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) protects ganglion cell death against cutting of optic nerve in the rat retina. Regul Peptides 2003; 115: 55 (abstract). Seress L, Lázár G, Kosaras B, Robertson RT. Regional effect of monosodium-L-glutamate on the superficial layers of superior colliculus in rat. Cell Tissue Res 1984; 235: 453-457. Sheward WJ, Lutz EM, Copp AJ, Harmar AJ. Expression of PACAP, and PACAP type 1 (PAC1) receptor mRNA during development of the mouse embryo. Dev Brain Res 1998; 109: 245-253. Shimizu I, Prasad C. Relationship between [3H]mazindol binding to dopamine uptake sites and [3H]dopamine uptake in rat striatum during aging. J Neurochem 1991; 56: 575-579. Shin CM, Chung YH, Kim MJ, Cha CI. Spatial and temporal distribution of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide in gerbil global cerebral ischemia. Neurosci Lett 2001; 309: 53-56. Shioda S, Ozawa H, Dohi K, Mizushima H, Matsumoto K, Nakajo S, Takaki A, Zhou CJ, Nakai Y, Arimura A. PACAP protects hippocampal neurons against apoptosis: involvement of JNK/SAPK signaling pathway. Ann NY Acad Sci 1998; 865: 111-117. Shoge K, Mishima HK, Saitoh T, Ishihara K, Tamura Y, Shiomi H, Sasa M. Attenuation by PACAP of glutamate-induced neurotoxicity in cultured retinal neurons. Brain Res 1999; 839: 66-73. Silveira MS, Costa MR, Bozza M, Linden R. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide prevents induced cell death in retinal tissue through activation of cyclic AMP-dependent protein kinase, J Biol Chem 2002; 277: 16075-16080. Sisk DR, Kuwabara T. Histologic changes in the inner retina of albino rats following intravitreal injection of monosodium L-glutamate. Graefe`s Arch. Clin Exp Ophtalmol 1985; 223: 250-258. Skoglosa Y, Lewen A, Takei N, Hillered L, Lindholm D. Regulation of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide and its reseptor type 1 after traumatic brain injury:
84
comparison with brain-derived neurotrophic factor and the induction of neuronal cell death. Neuroscience 1999; 90: 235-247. Somogyvári-Vígh A, Svoboda-Teet J, Vígh S, Arimura A. Is an intravenous bolus injection required prior to initiating slow intravenous infusion of PACAP38 for prevention of neuronal death induced by global ischemia? The possible presence of a binding protein for PACAP38 in blood. Ann NY Acad Sci 1998; 865: 595-600. Somogyvári-Vígh A, Reglıdi D. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide: A potential neuroprotevtive peptide. Curr Pharm Des 2004; 10(23): 2861-2889. Review. Sortwell CE, Camargo MD, Pitzer MR, Gyawali S, Collier TJ. Diminished survival of mesencephalic dopamine neurons grafted into aged hosts occurs during the immediate postgrafting interval. Exp Neurol 2001; 169: 23-29. Steiner H, Bonatz AE, Huston JP, Schwarting R. Lateralized wall-facing versus turning as measures of behavioral asymmetries and recovery of function after injection of 6hydroxydopamine into the substantia nigra. Exp Neurol 1988; 99: 556-566. Stoessl AJ, Martin-Iverson MT, Barth TM, Dourish CT, Iversen SD. Effects of ageing on the behavioural responses to dopamine agonists: decreased yawning and locomotion, but increased stereotypy. Brain Res 1989; 495: 20-30. Sucher NJ, Lipton SA, Dreyer EB. Molecular basis of glutamate toxicity in retinal ganglion cells. Vision Res 1997; 37: 3483-3493. Sullivan RM, Fraser A, Szechtman H. Asymmetrical orientation to edges of an openfield: modulation by striatal dopamine and relationship to motor asymmetries in the rat. Brain Res 1994; 637: 114-118. Sundler F, Ekblad E, Hannibal J, Moller K, Zhang YZ, Mulder H, Elsas T, Grunditz T, Danielsen N, Fahrenkrug J, Uddman R. Pituitary adenylate cyclase-activating peptide in sensory and autonomic ganglia: localization and regulation. Ann NY Acad Sci 1996; 805: 410-428. Takasugi Y, Kawata K, Okuda T, Koga Y, Mizuguchi N, Yamanaka S, Watanabe S. Strain differences to effects of aging on concentrations of amino acids in cerebrospinal fluid between Sprague Dawley rat and Wistar Kyoto rat. Exp Anim 2003; 52: 429-432. Takei N, Skoglosa Y, Lindholm D. Neurotrophic and neuroprotective effects of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) on mesencephalic dopaminergic neurons. J Neurosci Res 1998; 54: 698-706. Takei N, Torres E, Yuhara A, Jongsma H, Otto C, Korhonen L, Abiru Y, Skoglösa Y, Schütz G, Hatanaka H, Sofroniew MV, Lindholm D. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide promotes the survival of basal forebrain cholinergic neurons in vitro and in vivo: comparison with effects of nerve growth factor. Eur J Neurosci 2000; 12: 22732280.
85
Tanaka J, Koshimura K, Murakami Y, Kato Y Stimulatory effect of PACAP on neuronal cell survival. Ann NY Acad Sci 1996; 805: 473-475. Tanaka J, Koshimura K, Murakami Y, Sohmiya M, Yanaihara N, Kato Y. Neuronel protection from apoptosis by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. Regul Pept 1997; 72: 1-8. Tatsuno I, Somogyvári-Vígh A, Arimura A. Developmental changes of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) and its receptor in the rat brain. Peptides 1994; 15: 55-60. Thoreson WB, Witkovsky P. Glutamate receptors and circuits in the vertebrate retina. Prog Retin Eye Res 1999; 18: 765-810. Trotti D. A role for glutamate transporters in neurodegenerative diseases. Adv Exp Med Biol 2002; 513: 225-248. Tolwani RJ, Jakowec MW, Petzinger GM, Green S, Waggie K. Experimental models of Parkinson`s disease: insight from many models. Lab Anim Sci 1999; 49: 363-371. Tulipan N, Luo SQ, Allen GS, Whetsell WO. Striatal grafts provide sustained protection from kainic and quinolinic acid-induced damage. Exp Neurol 1988; 102: 325-332. Uchida D, Arimura A, Somogyvári-Vígh A, Shioda S, Banks WA. Prevention of ischemiainduced death of hippocampal neurons by pituitary adenylate cyclase activating polypeptide. Brain Res 1996; 736: 280-286. Uddmann R, Goadsby PJ, Jansen I, Edvinsson L. PACAP, a VIP-like peptide: immunohistochemical localization and effect upon cat pial arteries and cerebral blood flow. J Cereb Blood Flow Metab 1993; 13: 291-297. Vallejo I, Vallejo M. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide induces astrocyte differentiation of precursor cells from developing cerebral cortex. Mol Cell Neurosci 2002; 21: 671-683. van der Stay FJ, Augstein KH, Horvath E. Sensorimotor impairments in Wistar Kyoto rats with cerebral infarction, induced by unilateral occlusion of the middle cerebral artery: recovery of function. Brain Res 1996; 715: 108-188. van Rijn CM, Marani E, Rietveld WJ. The neurotoxic effect of monosodium glutamate (MSG) on the retinal ganglion cells of the albino rat. Histol Histopathol 1986; 1: 291295. van Oosten RV, Cools AR. Differential effects of a small, unilateral, 6-hydroxydopamineinduced nigral lesion on behavior in high and low responders to novelty. Exp Neurol 2002; 178: 245-255. Vaudry D, Gonzalez BJ, Basille M, Fournier A, Vaudry H. Neurotrophic activity of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide on rat cerebellar cortex during development. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 9415-9420.
86
Vaudry D, Gonzalez BJ, Basille M, Yon L, Fournier A, Vaudry H. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide and its receptors: from structure to functions. Pharmacol Rev 2000a; 52: 269-324. Vaudry D, Gonzalez BJ, Basille M, Pamantung TF, Fournier A, Vaudry H. PACAP acts as a neurotrophic factor during histogenesis of the rat cerebellar cortex. Ann NY Acad Sci 2000b; 921: 293-299. Vaudry D, Gonzalez BJ, Basille M, Pamantung TF, Fontaine M, Fournier A, Vaudry H. The neuroprotective effect of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide on cerebellar granule cells is mediated through inhibition of the CED3-related cystein protease caspase-3/CPP32. Proc Natl Acad Sci USA 2000c; 97: 13390-13395. Vaudry D, Gonzalez BJ, Basille M, Pamantung TP, Fontaine M, Fournier A, Vaydry H. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) promotes cerebellar granule cell survival through inhibition of caspase-3 activity (Abstract). FEN2000, Fédération of European Neuroscience Societies, 2000d; Brighton, UK Vaudry D, Rousselle C, Basille M, Falluel-Morel A, Pamantung TF, Fontaine M, Fournier A, Vaudry H, Gonzalez BJ. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide protects rat cerebellar granule neurons against ethanol-induced apoptotic cell death. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 6398-6403. Villalba M, Bockaert J, Journot L. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP-38) protects cerebellar granule neurons from apoptosis by activating the mitogen-activated protein kinase (MAP kinase) pathway. J Neurosci 1997; 17: 83-90. Voronina TA, Nerobkova LN, Kutepova OA, Gugutcidse DA. Pharmacological correction of CNS functional disorders and parkinsonian syndrome in old animals. Ann Ist Super Sanita 1990; 26: 55-59. Walkinshaw G, Waters CM. Neurotoxin induced cell death in neuronal PC12 cells is mediated by induction of apoptosis. Neuroscience 1994; 63: 975-987. Waschek JA, Casillas RA, Nguyen TB, DiCicco-Bloom EM, Carpenter EM, Rodriguez WI. Neural tube expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) and receptor: potential role in patterning and neurogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 9602-9607. Waschek JA. Multiple actions of pituitary adenylyl cyclase activating peptide in nervous system development and regeneration. Dev Neurosci 2002; 24: 14-23. Wallin HJ, Danielsen N, Johnston JM, Gratto KA, Karchewski LA, Verge VMK. Exogenous NT-3 and NGF differentially modulate PACAP expression in adult sensory neurons, suggesting distinct roles in injury and inflammation. J Neurosci 2001; 14: 267-282. Willig F, Palacios A, Monmaur P, M`Harzi M, Laurent J, Delacour J. Short-term memory, exploration and locomotor activity in aged rats. Neurobiol Aging 1987; 8: 393-402.
87
Yamaguchi T, Suzuki M, Yamamoto M. YM796, novel muscarinic agonist, improves the impairment of learning behavior in a rat model of chronic focal cerebral ischemia. Brain Res 1995, 669: 107-114. Yuhara A, Nishio C, Abiru Y, Hatanaka H, Takei N. PACAP has a neurotrophic effect on cultured basal forebrain cholinergic neurons from adult rats. Dev Brain Res 2001; 131: 41-45. Yuhara A, Ishii K, Nishio C, Abiru Y, Yamada M, Nawa H, Hatanaka H, Takei N. PACAP and NGF cooperatively enhance choline acetyltransferase activity in postnatal basal forebrain neurons by complementary induction of its different mRNA species. Biochem Biophys Res Commun 2003; 301: 344-349. Yurek DM, Hipkens SB, Hebert MA, Gash DM, Gerhardt GA. Age-related decline in striatal dopamine release and motoric function in Brown Norway/Fischer 344 hybrid rats. Brain Res 1998; 791: 246-256. Yurek DM, Fletcher-Turner A. Differential expression of GDNF, BDNF, and NT-3 in the aging nigrostriatal system following a neurotoxic lesion. Brain Res 2001; 891: 228-235. Zhang Q, Shi TJ, Ji RR, Zhang YZ, Sundler F, Hannibal J, Fahrenkrug J, Hokfelt T. Expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide in dorsal root ganglia following axotomy: time course and coexistence. Brain Res 1995; 705: 149-158. ZhangYZ, Hannibal J, Zhao Q, Moller K, Danielsen N, Fahrenkrug J, Sundler F. Pituitary adenylate cyclase activating peptide expression in the rat dorsal root ganglia: upregulation after peripheral nerve injury. Neuroscience 1996; 74: 1099-1110. Zausinger S, Hungerhuber E, Baethmann A, Reulen HJ, Schmid-Elsaesser R. Neurological impairment in rats after transient middle cerebral artery occlusion: a comparative study under various treatment paradigms. Brain Res 2000; 863: 94-105. Zuch CL, Nordstroem VK, Briedrick LA, Hoernig GR, Granholm AC, Bickford PC. Time course of degenerative alterations in nigral dopaminergic neurons following a 6hydroxydopamine lesion. J Comp Neurol 2000; 427: 440-454. Zupan V, Hill JM, Brenneman DE, Gozes I, Fridkin M, Robberecht P, Evrard P, Gressens P. Involvement of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide II vasoactive intestinal peptide 2 receptor in mouse neocortical astrocytogenesis. J Neurochem 1998; 70: 2165-2173.
88
XIII. RÖVIDÍTÉSEK
6-OHDA
=
6- hydroxidopamin
AC
=
adenilát-cikláz
BDNF
=
agyi eredető növekedési faktor
GCL
=
ganglion sejtek rétege
ILM
=
belsı határhártya
INL
=
belsı sejtes réteg
IPL
=
belsı rostos réteg
MAPK
=
mitogén aktiválta protein kináz
MCAO
=
a. cerebri media okklúzió
MPTP
=
1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin
MSG
=
monosodium glutamát
NADPH
=
nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát
NGF
=
idegi növekedési faktor
nNOS
=
neuronális nitrogén monoxid szintáz
NO
=
nitrogén monoxid
OLM
=
külsı határhártya
ONL
=
külsı sejtes réteg
OPL
=
külsı rostos réteg
PACAP
=
hypophysis adenilát-cikláz aktiváló polipeptid
PC12
=
pheocromocitoma sejtvonal 12
TNF
=
tumor nekrózis faktor
VIP
=
vasoaktív intestinalis polipeptid
89
XIV. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Ezúton szeretnék köszönetet mondani témavezetıimnek Dr. Reglıdi Dórának és Dr. Lengvári Istvánnak, valamint programvezetımnek Dr. Csernus Valér professzornak, valamint Dr. Lázár Gyula professzornak, akik diákkörös korom óta támogatják tudományos tevékenységemet. Ezúton szeretném megköszönni munkacsoportunk tagjainak Dr. Lubics Andreának és Szelier Mártának a szövettani munkában nyújtott segítséget. Továbbá köszönetet mondok az Élettani Intézetbıl Dr. Lénárd László professzornak és munkacsoportjának a magatartásvizsgálatokban nyújtott segítségért, az Általános Állattani és Neurobiológiai Tanszékrıl Dr. Gábriel Róbert professzornak és munkacsoportjának a retinális degeneráció vizsgálatában nyújtott segítségért, valamint a Sebészeti Klinikáról Dr. Szántó Zalánnak a lézer doppleres vizsgálatban és a grafikus ábrák elkészítésében nyújtott segítségért.
90
XV. A DOLGOZATBAN FELHASZNÁLT PUBLIKÁCIÓK Tamás A, Reglıdi D, Szántó Z, Borsiczky B, Németh J, Lengvári I. Comparative neuroprotective effects of preischemic PACAP and VIP administration in permanent occlusion of the middle cerebral artery in rats. Neuroendocrinol Lett 2002; 23(3): 249254. IF.: 1,278. Tamás A, Gábriel R, Rácz B, Dénes V, Kiss P, Lubics A, Lengvári I, Reglıdi D. Effects of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide in retinal degeneration induced by monosodium-glutamate. Neurosci Lett 2004; 372(1-2)pp: 110-113. IF.: 2,019. Tamás A, Lubics A, Szalontay L, Lengvári I, Reglıdi D. Age- and gender differences in behavioral and morphological outcome after 6-hydroxydopamine-induced lesion of the substantia nigra in rats. Behav Brain Res 2005; 158(2)pp: 221-229. IF.: 2,992. Tamás A, Lubics A, Lengvári I, Reglıdi D. Protective effects of PACAP in excitotoxic striatal lesion. Ann NY Acad Sci (in press) IF.: 1,789. Tamás A, Lubics A, Lengvári I, Reglıdi D. Effects of age, gender, and gonadectomy on neurochemistry and behavior in animal models of Parkinson`s disease. Endocrine (in press) IF.: 1,515. Reglıdi D, Tamás A, Somogyvári-Vígh A, Szántó Z, Kertes E, Lénárd L, Arimura A, Lengvári I. Effects of pretreatment with PACAP on the infarct size and functional outcome in rat permanent focal cerebral ischemia. Peptides 2002; 23: 2227-2234. IF.: 2,635. Reglıdi D, Tamás A, Lengvári I. Examination of sensorimotor performance following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res Bull 2003; 59: 459-466. IF.: 2,609. Reglıdi D, Lubics A, Tamás A, Szalontay L, Lengvari I: Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide protects dopaminergic neurons and improves behavioral deficits in a rat model of Parkinson`s disease. Behav Brain Res 2004;151: 303-312. IF.: 2,992. Reglıdi D, Tamás A, Lubics A, Szalontay L, Lengvári I. Morphological and functional effects of PACAP in a 6-hydroxydopamine-induced lesion of the substantia nigra in rats. Regul Pept 2004; 123(1-3)pp: 85-95. IF.: 2,531. Reglıdi D, Tamás A, Somogyvári-Vigh A. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide in animal models of neurodegenerative disorders - implications for Huntington and Parkinson`s diseases. Lett Drug Des Disc 2005; 2: 311-315. Reglıdi D, Tamás A, Lengvári I, Tóth G, Szalontay L, Lubics A. Comparative study on the effects of PACAP in young, aging, and castrated males in a rat model of Parkinson`s disease. Ann NY Acad Sci (in press) IF.: 1,789.
91
XV. EGYÉB PUBLIKÁCIÓK Németh J, Jakab B, Reglıdi D, Lubics A, Józsa R, Hollósy T, Tamás A, Lengvári I, Görcs T, Szolcsányi J. Comparative distribution of VIP in the central nervous system of various species measured by a new radioimmunoassay. Regul Pept 2002; 109: 3-7. IF.: 3,205. Reglıdi D, Kiss P, Tamás A, Lengvári I. The effects of PACAP and PACAP antagonist on the neurobehavioral development of newborn rats. Behav Brain Res 2003; 140: 131139. IF.: 2,817. Jakab B, Reglıdi D, Józsa R, Hollósy T, Tamás A, Lubics A, Lengvári I, Oroszi G, Szilvássy Z, Szolcsányi J, Németh J. Distribution of PACAP-38 in the central nervous system of various species determined by a novel radioimmunoassay. J Biochem Biophys Meth 2004; 61(1-2)pp: 189-198. IF.: 1,302. Reglıdi D, Fábián Zs, Tamás A, Lubics A, Szeberényi J, Alexy T, Tóth K, Márton Zs, Borsiczky B, Rıth E, Szalontay L, Lengvári I. Effects of PACAP on in vitro and in vivo neuronal cell death, platelet aggregation, and production of reactive oxygen radicals. Regul Pept 2004; 123(1-3)pp: 51-59. IF.: 2,531. Farkas O, Tamás A, Zsombok A, Reglıdi D, Pál J, Büki A, Lengvári I, Povlishok JT, Dóczi T. Effects of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in a rat model of traumatic brain injury. Regul Pept 2004; 123(1-3)pp: 69-75. IF.: 2,531. Lubics A, Reglıdi D, Tamás A, Kiss P, Szalai M, Szalontay L, Lengvári I. Neurological reflexes and early motor behavior in rats subjected to neonatal hypoxic/ischemic injury. Behav Brain Res 2005; 157(1)pp: 157-165. IF.: 2,992. Józsa R, Hollósy T, Tamás A, Tóth G, Lengvári I, Reglıdi D. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide plays a role in olfactory memory formation in chicken. Peptides 2005 (in press) IF.: 2,511. Kiss P, Tamás A, Lubics A, Szalai M, Szalontay L, Lengvári I, Reglıdi D. Development of neurological reflexes and motor coordination in rats neonatally treated with monosodium glutamate. Neurotox Res 2005 (in press) Gasz B, Rácz B, Rıth E, Borsiczky B, Ferencz A, Tamás A, Cserepes B, Lubics A, Gallyas F Jr, Tóth G, Lengvári I, Reglıdi D. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide protects cardiomyocytes against oxidative stress-induced apoptosis. Peptides 2005 (in press) IF.: 2,511. Tamás A, Zsombok A, Farkas O, Reglıdi D, Pál J, Büki A, Lengvrái I, Povlishock JT, Dóczi T. Postinjury administration of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) attenuates traumatically induced axonal injury in rats. J Neurotrauma (in press) IF.: :2,866. Rácz B, Tamás A, Kiss P, Tóth G, Gasz B, Borsiczky B, Ferencz A, Gallyas F Jr, Rıth E, Reglıdi D. Involvement of ERK and CREB signalling pathways in the protective effect of PACAP on monosodium glutamate-induced retinal lesion. Ann NY Acad Sci (in press) IF.: 1,789.
92
Kiss P, Tamás A, Lubics A, Lengvári I, Szalai M, Hauser D, Horváth Zs, Rácz B, Gábriel R, Babai N, Tóth G, Reglıdi D. Effects of systemic PACAP treatment in monosodium glutamate-induced behavioral changes and retinal degeneration. Ann NY Acad Sci (in press) IF.: 1,789. Babai N, Atlasz T, Tamás A, Reglıdi D, Kiss P, Gábriel R. Degree of damage compensation by various PACAP treatments in monosodium glutamate-induced retina degeneration. Neurotox Res 2005 (in press) Babai N, Atlasz T, Tamás A, Reglıdi D, Tóth G, Kiss P, Gábriel R. Search for the optimal monosodium glutamate treatment schedule to study the neuroprotective effects of PACAP in the retina. Ann NY Acad Sci (in press) IF.: 1,789. Molnár L, Pollák E, Boros Á, Reglıdi D, Tamás A, Lengvári I, Arimura A, Lubics A. Comparative anatomy of PACAP-immunoreactive structures in the ventral nerve cord ganglia of lumbricid Oligochaetes. Ann NY Acad Sci (in press) IF.: 1,789. Németh J, Tamás A, Józsa R, Horváth JE, Jakab B, Lengvári I, Arimura A, Lubics A, Reglıdi D. Changes in PACAP levels in the central nervous system after ovariectomy and castration. Ann NY Acad Sci (in press) IF.: 1,789. Atlasz T, Kıszegi Zs, Babai N, Tamás A, Reglıdi D, Kovács P, Hernádi I, Gábriel R. Microiontophoretically applied PACAP blocks excitatory effects of kainic acid in vivo. Ann NY Acad Sci (in press) IF.: 1,789.
