A KRÓNIKUS URTICARIA PATOGENETIKAI TÉNYEZOI Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei
Dr. Hidvégi Bernadett
Az „Elméleti és Klinikai Immunológia” címu program keretében
Készült a Semmelweis Egyetem Központi Immunológiai Laboratóriumában Témavezeto: Dr. Gergely Péter egyetemi tanár
Budapest, 2003. 1
A KRÓNIKUS URTICARIA PATOGENETIKAI TÉNYEZOI Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei
Dr. Hidvégi Bernadett
Az „Elméleti és Klinikai Immunológia” címu program keretében
Készült a Semmelweis Egyetem Központi Immunológiai Laboratóriumában Témavezeto: Dr. Gergely Péter egyetemi tanár
Budapest, 2003. 2
ÖSSZEFOGLALÁS A krónikus urticaria hat héten túl naponta, vagy majdnem mindennap jelentkezo urticaria forma. Az egyes csalánkiütések életideje a 24 órát nem haladja meg, a fizikai faktorok kizárhatók. A populáció 0,1 %-át érinti. Polietiológiás kórkép, melynek hátterében ételintolerancia, infekció állhat; ill. a nagy affinitású IgE receptor (Fc ?RI), vagy IgE elleni autoantitestek patogenetikai szerepe merült fel. Az infekciók közül az utóbbi idoben egyre több adat szól a Helicobacter pylori (Hp) kóroki szerepe mellett. Munkám során az OBNI Allergológiai Ambulancián megjeleno és a Semmelweis Egyetem Bor- és Nemikórtani Klinikán hospitalizációra került krónikus urticariában szenvedo betegek klinikai adatait gyujtöttem össze, különös tekintettel az autoimmun eredetu és a Helicobacter pylori infekcióhoz társult esetekre. Elsosorban azt vizsgáltam, hogy klinikai és immunológiai jellemzoit tekintve megkülönböztetheto-e az autoimmun és a nem-autoimmun alcsoport. Az autoimmun alcsoportot meghatározozó anti-Fc?RI specifikus antitestek kimutatását Western blot módszerrel, és autológ szérum borteszttel (ASZT) végeztem, majd vizsgáltam a celluláris, illetve
humorális
immunreaktivitás
eltéréseit
az
egyes
alcsoportokban. Vizsgáltam továbbá, hogy a van-e patogenetikai kapcsolat a Helicobacter pylori, mint antigén és a krónikus urticaria között, és ha igen, ennek mi a mechanizmusa. Az ASZT a vizsgált betegcsoport 76 %-ában volt pozitív, betegeink 34 %-ában tudtunk Western blot módszerrel IgG típusú
3
anti-Fc ?RI? -specifikus autoantitestet kimutatni. Az autoimmun krónikus
urticaria
csoportba
sorolt,
immunoblot
vizsgálattal
autoantitest pozitív betegek szérumai, in vivo hisztam-felszabadító hatásúak
voltak.
A
két
betegcsoport
klinikai
jellemzoit
összehasonlítva az autoimmun és nem-autoimmun mechanizmusú csoport nem különböztetheto meg. A cellularis immunreaktivitást vizsgálva, a krónikus urticariás betegek phytohaemagglutinin (PHA) stimuláció
hatására,
egészségeseknél
fokozottabb
lymphocyta
reaktivitást, emelkedett szérum sIL-2R és triptáz koncentrációt mutattak, amely fokozott T-sejt és hízósejt aktivitásra utal. A T-sejt aktivitás mértéke a mért sIL-2R szint alapján nem különbözött az autoimmun és nem-autoimmun alcsoportokban, de a szérum triptáz koncentráció
nagyobb
értékeket
mutatott
az
autoimmun
alcsoportban, amely azt jelzi, hogy az autoimmun típusú urticariában a betegség súlyosabb formában zajlik. A sIL-2R és a triptáz értékek korrelációja azt jelzi, hogy a T-sejt és hízósejt aktiváció egymás függvénye, és ez a kapcsolat a legszorosabb mértéku az autoimmun alcsoportban volt. A Hp antigénekkel végzett vizsgálatok során, a krónikus urticariás betegek lymphocytái szignifikáns proliferatív választ
mutattak,
proliferatív
válasz
szemben mértéke
az
egészséges
nagyobb
volt
kontrollokkal. a
A
Hp-szeropozitív
urticariásokban, szemben a szeronegatívokkal, de a különbség nem volt szignifikáns. Kísérleteinkben a krónikus urticariás betegekben észlelt alapvetoen fokozott T-sejt reaktivitást a Hp antigének tovább növelték, ami bizonyítékul szolgál amellett, hogy a Hp trigger faktora a krónikus urticariának.
4
BEVEZETÉS A krónikus urticaria hat héten túl naponta, vagy majdnem mindennap jelentkezo urticaria forma. Az egyes csalánkiütések életideje a 24 órát nem haladja meg, fizikai faktorok kizárhatók. A populáció 0,1 %-át érinti. Polietiológiás kórkép, melynek hátterében ételintolerancia, infekció állhat. Az utóbbi idoben egyre több klinikai vizsgálat eredménye szólt a Helicobacter pylori (Hp) kóroki szerepe mellett.
Ismert,
hogy
a
baktérium
által
keltett
gyulladás
következtében megnövekedett vaszkularis permeabilitás nagyobb táplálkozási allergén expozícióhoz vezet. Másrészrol az évtizedekig perzisztáló infekció extraintesztinalis manifesztációk patológiai alapját teremti meg, a proinflammatorikus cytokinek folyamatos keringésbe áramlásával. A Hp-val fertozött gyomor mucosát és a krónikus urticariás betegek borlézióinak infiltrátumát egyaránt döntoen mononuklearis sejtek alkotják, így a krónikus urticariás betegek perifériás mononukleáris sejtjei Hp antigének kiváltotta proliferációjának vizsgálata választ adhat a klinikai vizsgálatok alapján felmerülo patogenetikai kapcsolatra. Az elmúlt 10-20 év krónikus urticaria kutatásának egyik fo vonalát képviseli a nagy affinitású IgE receptor (Fc?RI) elleni antitestek patogenetikai szerepének vizsgálata. Az Fc?RI? -specifikus autoantitest, sejtfunkciót stimuláló hatású, tehát urticariásokban fokozott hisztamin felszabaduláshoz vezet, melynek in vivo és in vitro bizonyítékai vannak, tehát krónikus urticariában patogén
5
autoantitesteknek tekintheto. Különbözo módszerekkel vizsgálva az Fc?RI? -specifikus autoantitestek elofordulását egyes szerzok 29-46 %-osnak
találták.
Az
autoantitest
meghatározására
irányuló
vizsgálatok, újabb terápiás lehetoségek reményét keltették az autoimmun alcsoportban.
CÉLKITUZÉSEK 1.
Az OBNI Allergológiai Ambulancián és a Semmelweis Egyetem
Bor- és Nemikórtani Klinikán kezelt krónikus
urticariában szenvedo betegek klinikai adatainak összegyujtése 2.
Alcsoportképzés. Az autoimmun és nem-autoimmun alcsoport meghatározása autológ szérum borteszttel és Western blot módszerrel.
Klinikai
jellemzok,
cellularis
és
humoralis
immunreaktivitás összehasonlítása az egyes alcsoportokban 3.
A Helicobacter pylori, mint antigén és a krónikus urticaria közötti patogenetikai kapcsolat vizsgálata
BETEGEK ÉS MÓDSZER Betegek 50 krónikus urticariás beteget vizsgáltunk meg (11 férfi és 39 no, átlagéletkor 54.3, 20-71évig terjedo) akiknél az urticaria fennállása 2-240 hónapig terjedo, az idotartamok átlaga 24.2 hónap. Minden esetben rutin laboratóriumi vizsgálatokat, immunszerológiai vizsgálatokat (szérum IgE szint, antinuklearis antitest, anti-
6
thyreoglobulin ill. antimikroszomalis antitest, összkomplement, C3, C4) végeztünk. A gyomorpanaszokat említo ill. a jellegzetesen gasztrointesztinalisként
értékelt
éjszakai-reggeli
megjelenésu
urticaria eseteiben a betegeknél gasztroszkópia történt és minden beteg esetében elvégeztük az ureáz kilégzési tesztet. Részletesebb immunológiai vizsgálatok? ASZT, Fc?RI? -specifikus antitest, Hp specifikus IgG antitest, sIL-2R és szérum triptáz koncentráció (50 esetben),
szérum
Lymphocita
neopterin
transzformációs
(18
esetben)
vizsgáltra
24
mérések
történtek.
beteg
heparinos
vérmintája került. A 24 betegbol 13 Hp szeropozitív, 11 szeronegatív volt. A szeropozitív betegeknél a Hp fertozést gasztroszkópiával (5 beteg) vagy ureáz kilégzési teszttel (8 beteg) is megerosítettük A fent részletezett vizsgálatokon kívül, ezen betegcsoportban a bakterialis fókuszok jelenlétét (fogászati, gégészeti, urogenitalis) is kizártuk.
Lymphociták proliferációjának vizsgálata A betegekbol és kontrollokból származó heparinizált vérmintákból
Ficollon
perifé riás
mononuklearis
sejteket
szeparáltunk. A mononuklearis sejteket különbözo koncentrációjú hoinaktivált Hp antigének (8x105 , 8x106 , 8x107 baktérium/lyuk) és/vagy mitogének, PHA és PWM jelenlétében vagy hiányában tenyésztettük. A Hp antigének összetétele a kísérlet során állandó volt. A DNS szintézis mértékének meghatározására további 8 óráig a sejtekhez 0.4 ? Ci
3
H-thymidint adtunk. A thymidin beépülés
mértékét szcintillációs számlálóval mértük. Az eredményeket átlagos
7
percenkénti beütésszámban cpm (count per minute)/kultúra ? SD (standard deviáció) fejeztük ki.
Autológ szérum teszt (ASZT) Az alkar csalánkiütésektol mentes borébe 50 ?l higítatlan szérumot fecskendeztünk be intrakutan. Negatív kontrollként azonos mennyiségu
fiziológiás
sóoldatot
használtunk.
A
keletkezett
csalánkiütés nagyságát a maximális átméro és az erre meroleges átméro átlagaként adtuk meg a beadás utáni 30. percben mérve. A próbát pozitívként értékeltük, ha a szérum indukálta csalánkiütés legalább 1.5 mm-rel nagyobb volt a kontrollnál.
Fc? RI? -specifikus
autoantitestek
kimutatása
Western
blot
módszerrel Antigénként tisztított rekombináns technikával eloállított humán szérum albuminhoz kovalensen kötött szolubilis Fc?RI? -t használtunk. A tisztított protein 35 kD-os csík formájában jelent meg a gélen. A rekombináns Fc?RI? -t illetve a BSA kontrollt 10-13% -os gradiens poliakrilamid gélen futtattuk. A géleket PVDF membránra blottoltuk. Az Fc ?RI? -tartalmú PVDF membránokat a betegek szérumaival, illetve pozitív kontrollként használt kimérikus IgE–vel, illetve
ismert
pozitív
beteg
kontrollal
inkubáltuk.
Negatív
kontrollként IgG2a monoklonalis antitestet használtunk, mint izotípus kontrollt. A membránhoz kötodo autoantitesteket torma peroxidázzal jelzett
nyúl
anti-humán
IgG
és
IgE
felhasználásával
ECL
8
rendszerben tettük láthatóvá, és Kodak X-Omat típusú filmre exponáltuk.
Szérum triptáz szint mérése A szérum triptáz-szintet UniCap Tryptase Fluoroenzyme-immunoassay módszerrel mértük.
Szérum sIL-2R, neopterin, össz-IgE és Hp-specifikus IgG antitestek koncentrációjának mérése A szolubilis IL-2R, a szérum neopterin, szérum össz IgE szintet, és a Hp–specifikus IgG antitesteket kereskedelmi forgalomba lévo ELISA kitekkel mértük, a gyártó leírásának megfeleloen.
Statisztikai analízis A
csoportok
és
alcsoportok
között
statisztikailag
szignifikáns különbségeket ANOVA/MANOVA teszttel és StudentNewman-Keuls post tes zttel számoltuk. A korreláció számításához Spearman Rank tesztet használtunk.
EREDMÉNYEK és MEGBESZÉLÉS Krónikus urticariás betegek perifériás mononukleáris sejtjeinek proliferációs válasza Hp és mitogén stimuláció hatására A teljes hoinaktivált Hp antigénpreparátumra a krónikus urticariás betegek perifériás mononuklearis sejtjei proliferatív választ adtak, szemben az egészséges kontrollokkal. A különbség a Hp két
9
koncentrációja
(8x106
8x105
és
baktérium/lyuk)
esetén
is
szignifikáns volt (p=0,0045, p=0,01). Az urticariás betegek PHA stimulációra egészségeseknél nagyobb proliferatív választ mutattak, de a különbség nem volt szignifikáns. A Hp antigének mitogének kiváltotta blasztosodásra kifejtett hatását vizsgálva, a proliferatív válasz dózis -dependens gátlását tapasztaltuk, mind urticariásokban, mind egészségesekben. A sejtek viabilitása nem csökkent a kísérlet során. A betegcsoporton belül a szeropozitív urticariások erosebb proliferatív válaszra mutattak tendenciát mind a Hp, mind a mitogén stimuláció után a szeronegatív urticariásokhoz képest. Vizsgálataink
alapján
feltételezzük,
hogy
krónikus
urticariás
betegekben a Hp-antigének kiváltotta nagyobb proliferatív válasz a krónikus urticariában alapvetoen fokozott lymphocyta reaktivitás következménye
és
nem
a
Hp-specifikus
memória
T-sejtek
aktivációja okozza. Mindezek alapján úgy tunik, hogy a Hp urticaria patogenezisében betöltött szerepe arra korlátozódik, hogy triggereli a krónikus urticaria alapveto immunológiai sajátosságát, a fokozott lymphocyta reaktivitást. Elképzelheto, hogy az autoreaktív T sejtek és a Hp specifikus T sejtek keresztreagálnak, a szeronegatív urticariások Hp antigénekre létrejövo fokozott válaszkészségét okozva. Eredményeink bizonyítékul szolgálnak amellett, hogy a Hp trigger faktora a krónikus urticariának.
10
A celluláris (sIL-2R, neopterin, triptáz) és humorális (össz-IgE, Hp-specifikus IgG antitestek) immunreaktivitás vizsgálata krónikus urticariában. Az autoimmun/nem-autoimmun alcsoportok összehasonlítása Egy másik kísérleti rendszerben a celluláris és humorális immunreakciók
különbségeit
vizsgáltuk
krónikus
urticariás
betegekben, majd az autoimmun és nem-autoimmun alcsoportokban. A monocyta-makrophag rendszer aktivitásának meghatározására szérum neopterin, a T-sejt aktivitás mé résére sIL-2R, a mastocyta aktiváció jellemzésére szérum triptáz koncentrációt mértünk. A triptáz neutrális proteáz, szelektíven koncentrálódik a mastocytákban és
a
hisztaminnal
együtt
a
degranulációval
szabadul
fel,
komplement-aktiváción keresztül leukocyta infiltrációt indukál. A szérum neopterin a celluláris aktiváció markere. Aktivált monocyták és macrophagok termelik CD4 pozitív T-sejtek termelte IFN-? hatására A sIL-2R proteolitikus fragmentje a membránon lévo IL-2R molekulának, amely a T-sejt aktivációt jelezve számos gyulladásos és autoimmun betegségben fokozott mértékben expresszálódik. Vizsgálataink során a krónikus urticariás betegeknek szignifikánsan nagyobb volt a sIL-2R és triptáz koncentrációja, mint az egészséges kontrolloknak (p=0,000257, p=0,000166). A szérum IgE és neopterin szintekben, akárcsak a Hp specifikus IgG antitest koncentrációban nem volt szignifikáns különbség. A sIL-2R és triptáz
értékek
között
szignifikáns
korrelációt
mutattunk
ki
(Spearman rho=0,53, p=0,00007)
11
A betegek 76 %-a (38/50) mutatott in vivo hisztaminfelszabadító aktivitást ASZT-tel vizsgálva. A betegek 34 %-ában (17/50), de az egészséges kontrollok egyikében sem (0/9) tudtunk Western
blot
módszerrel
IgG
típusú
anti-Fc?RI? -specifikus
autoantitestet kimutatni. Az autoimmun krónikus urticaria csoportba sorolt, immunoblot vizsgálattal autoantitest pozitív betegek (17/50), ASZT-je is pozitív volt. Az
autoimmun
alcsoportban
a
szérum
össz-IgE
koncentráció szignifikánsan alacsonyabb volt, szemben a nemautoimmun csoporttal (p=0,000836), de nem mértünk szignifikáns különbségeket a két alcsoportban a sIL-2R, neopterin és Hp specifikus
IgG
antitest
koncentrációkban.
Az
autoimmun
alcsoportban tendencia mutatkozott magasabb szérum triptáz értékekre. A szérum triptáz és a sIL-2R koncentrációk közötti legerosebb korrelációt is az autoimmun alcsoportban tudtuk kimutatni (Spearman rho=0,69, p=0,0022) Ha
a
betegeket
az
ASZT-re
adott
válasz
alapján
osztályoztuk, az ASZT pozitív csoportban szignifikánsan magasabb triptáz értékeket mértünk, mint a borteszt negatív urticariásokban (p=0,0107). Kísérleteink alapján igazolódott, hogy a fokozott cellularis aktivitás nem függvénye az autoreaktív T-sejtek jelenlétének vagy hiányának hiszen a sIL-2R (aktivált T-sejtek markere) szint nem tért el az Fc ?RI? antitest pozitív illetve negatív csoportban. Azonban a sIL-2R szint szoros korrelációt mutatott a triptáz (mastocytaspecifikus faktor) aktivitással, vagyis krónikus urticariás betegekben
12
a T-sejt és hízósejt aktiváció egymás függvénye, és ez a kapcsolat a legszorosabb mértéku az autoimmun alcsoportban volt. Az autoimmun és nem autoimmun alcsoport a klinikai jellemzok alapján nem különböztetheto meg. Bár az autoantitest meghatározásra, gyakorlatban
alcsoportképzésre törekedni
kell,
a
mindennapi
függetlenül
attól,
klinikai hogy
az
autoantitestes/nem-autoantitestes csoport kialakításának egyelore terápiás konzekvenciái nincsenek. Legújabb, több laboratóriumi módszert összehasonlító tanulmány konklúziója értelmében, az autoantitest
meghatározására
alkalmazott
vizsgálat
a
helyi
laboratóriumi lehetoségek függvénye, nincs olyan módszer, amely egyértelmuen javasolható. Vizsgálataink alapján, az ASZT jó globalis aktivitási marker, a Klinikánk beteganyagában észlelt 76 %os pozitivitás egybevág hospitalizált betegeink súlyos urticariájával. Vizsgálatainkban, a szérum triptáz értékkel meghatározott mastocyta aktivitás nagyobb értéket mutatott az autoimmun alcsoportban, amely azt jelzi, hogy az autoimmun típusú urticariában a betegség súlyosabb formában zajlik.
A SAJÁT EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA 1.
A vizsgált betegek 34 %-ában (autoimmun krónikus urticaria) tudtunk Western blot módszerrel IgG típusú anti-Fc?RI? specifikus
autoantitestet
kimutatni,
in
vivo
hisztamin-
felszabadító aktivitással. Az autoimmun és nem-autoimmun alcsoport klinikai jellemzok alapján nem különböztetheto meg.
13
2.
A
krónikus
urticariás
betegek
PHA
stimulációra
egészségeseknél fokozottabb lymphocyta reaktivitást mutattak, a fokozott T-sejt aktivitást alátámasztotta az emelkedett szérum sIL-2R koncentráció is. Ez utóbbi koncentrációjában azonban nem volt különbség az autoimmun és a nem-autoimmun urticariások között, tehát a T-sejt aktiváció mértéke nem az autoantitestek jelenlétének a függvénye. 3.
A hízósejt aktiváció jeleként a szérum triptáz koncentráció szignifikánsan magasabb értékeket mutatott krónikus urticariás betegekben, egészséges kontrollokhoz viszonyítva. Az aktiváció kifejezettebb
volt
az
autoimmun
alcsoportban,
amely
bizonyítékul szolgál amellett, hogy az autoimmun típusú urticariában a betegség súlyosabb formában zajlik. 4.
A sIL-2R és a triptáz értékek korrelációja azt jelzi, hogy a T-sejt és hízósejt aktivitás egymás függvénye, és ez a kapcsolat a legszorosabb az autoimmun alcsoportban.
5. Kísérleteinkben a hovel inaktivált Hp antigének nem aktiválták egészséges
kontrollok
perifériás
mononuklearis
sejtjeit
függetlenül szerológiai státuszuktól, ezzel szemben a krónikus urticariás betegek lymphocytái, különösen a Hp-szeropozitívak esetében,
szignifikáns
proliferatív
választ
mutattak.
Az
alapvetoen fokozott T-sejt reaktivitást a Hp antigének tovább növelték, ami a Hp trigger szerepe mellett szól.
14
