4. Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii

4. Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Hlavními produkty rekombinantních technologií ve farmacii jsou rekombinantní proteiny, které budeme označovat spíše jako terapeutické proteiny, protože důvodem jejich produkce je terapeutický zásah do organismu. V principu existují dva základní postupy, jak připravit takové proteiny: 1) Zásah fyzikálního nebo chemického mutagenu (mutageneze), kterým dojde ke změně nukleotidové sekvence v genu, který kóduje terapeutický protein. Pokud dojde k takové změně kodónu nebo kodónů, která má za následek změnu sekvence aminokyselin v proteinu, pak může vzniknout protein s novými vlastnostmi. 2) Cílená genetická manipulace, kterou je záměrně změněn sled nukleotidů tak, aby došlo ke změně definovaných aminokyselin ve struktuře terapeutického proteinu. Cílená genetická manipulace ale může probíhat i tak, že je gen pro protein naklonován a protein exprimován v jiném druhu organismu, v tzv. heterologním systému. Geny, které jsou takto klonovány, označujeme jako rekombinantní geny a podobně jimi produkované proteiny jako rekombinantní proteiny. Přípravu rekombinantních genů a proteinů nazýváme genovým inženýrstvím, klonováním genů, genetickými manipulacemi in vitro nebo rekombinantní DNA technologií. Postupy genového inženýrství vycházejí z hlubokých znalostí procesů přenosu genetické informace u živých systémů, řadu těchto procesů využívají a vhodně je kombinují. V důsledku zásahů genových inženýrů vznikají proteiny s výrazně pozměněnou strukturou, vznikají kvalitativně nové druhy proteinů a dochází k naprostému rozbourání bariér mezi druhy, neboť je možné např. produkovat proteiny vyšších obratlovců (člověka) i v bakteriálních buňkách. Co je asi nejdůležitější z hlediska využití genového inženýrství v produkci rekombinantních proteinů, že tyto manipulace umožňují přinutit organismus vytvářet protein, který mu není vlastní. Toho není možné dosáhnout ani klasickou mutagenezou ani klasickými genetickými postupy spojenými s hybridizací. Primárním cílem rekombinantních technologií ve farmaceutickém průmyslu je genetickou manipulací zajistit syntézu komerčně výhodného produktu v takovém organismu, který jej bude produkovat ve velkém množství a levně. V průběhu přenosu (transformace) genetického materiálu z původního organismu do organismu produkčního, v principu do cizí buňky musí být zabezpečeny všechny kroky tak, aby byla transformovaná DNA schopna replikace a geny, které obsahuje, byly v produkčním organismu exprimovány. Po transformaci tedy dochází k pozměnění genetické informace příjemce tak, že se do jejího genomu začlení cizorodá DNA. Jak vyplynulo už z konceptu farmaceutické biotechnologie, který byl popsán v kapitole 1, jsou takové procesy možné, protože jsou genetický základ všech organismů a genetický kód stejné a procesy genové exprese velmi podobné. Proto i zdrojem cizorodé DNA může být jakákoli buňka: živočišná, rostlinná nebo mikrobiální. Klonovat je možné taky geny virů, ať už DNA nebo RNA. V posledních letech vznikla dokonce nová možnost, v přírodě nemyslitelná, a to klonování a přenos synteticky připravených úseků DNA. Podobně na druhé straně se může rekombinantní DNA, bez ohledu na typ zdroje, inkorporovat do buněk bakteriálních, do kvasinek nebo plísní či buněk vyšších, ale taky do buněk rostlinných nebo živočišných či dokonce do celých rostlin nebo živočichů.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii To, že je možné vybrat si zcela konkrétní gen nebo geny a poté je přenést z jednoho organismu do druhého, např. z člověka na mikroorganismus nebo z jednoho druhu rostliny na druhý apod. otevřelo nejen nové směry výzkumu organismů, ale umožnilo i praktické využití takových manipulací v průmyslu, medicíně, zemědělství i jiných oborech. K nejznámějším příkladům patří využití bakterie Escherichia coli k syntéze lidského inzulínu, lidského růstového hormonu, hematopoetických růstových faktorů, cytokinů nebo interferonů. Co se týče praktických aplikací postupů genového inženýrství, můžeme je kategorizovat do těchto dvou základních směrů: 1) Konstrukce organismů, které jsou cíleně určeny k produkci nebo superprodukci technologicky nebo farmaceuticky významných lidských, zvířecích či virových proteinů, jako jsou hormony, enzymy, protilátky, vakcíny, interferony a mnohé další. Existuje celá plejáda výrobních postupů peptidů, proteinů a vakcín. Vakcíny se vyrábějí klonováním genů pro povrchové proteiny virů a výsledné rekombinantní proteiny se využívají k očkování (aktivní imunizace). Nebo jsou proti těmto proteinům produkovány protilátky využívané k pasivní imunizaci. 2) Modifikování jedno nebo i mnohobuněčných organismů takovým způsobem, aby získaly vlastnosti, které se přirozeným způsobem nemohou vytvořit. Připravují se tak průmyslové mikroorganismy se zvýšenou generační schopností, s upravenými nároky na živiny nebo vysokou produktivitou. Tyto mikroorganismy mohou také přeměňovat nízkomolekulární látky, které by chemickými procesy byly upravovány ve dvou nebo více krocích. Konstruují se také mikroorganismy, které se uplatňují v ochraně a čištění životního prostředí.

Manipulace s buňkami vyšších eukaryot jsou složitější a techniky genového inženýrství jsou u eukaryotických buněk rozvinuté méně než v případě klonování do buněk prokaryotických. U mnohobuněčných organismů je nutné vyřešit dvě důležité otázky: 1) Klonovaný gen se musí stát součástí genomu všech buněk mnohobuněčného organismu. Toho je možné dosáhnout, když je gen transformován do embrya, hovoříme o embryonálním inženýrství. Dnes už jsou vypracovány postupy oplodnění vajíček savců v podmínkách in vitro, umíme je taky kultivovat a zajistit podmínky tak, aby se oplodněná vajíčka začala rýhovat. Vnášet geny do oplozeného savčího vajíčka nebo do embrya v časných fázích vývoje už dnes umíme taky. Existuje řada geneticky modifikovaných, transgenních, hospodářských zvířat s výhodnějšími užitnými vlastnostmi a řada takových, které v mléce exprimují farmakologicky významné skupiny látek, růstový hormon, laktoferin, krevní faktory apod. Experimentálně se nahrazují vadné geny zodpovědné za dědičná onemocnění funkčními geny, což je oblast genových terapií, o které píšeme v kapitole 11. 2) Druhým vážným problémem genových manipulací s vyššími eukaryotickými organismy je to, že jsou jejich geny v chromozómech uspořádány specificky. Cizí gen může toto uspořádání narušit, porušit genetický program vývoje a tím ohrozit vývoj mnohobuněčného organismu. Pokud tedy zavedeme do embrya cizí geneticky manipulovanou buňku, může dojít ke vzniku mutantů a malformací. Kromě technických problémů je tedy manipulace s eukaryotickým organismem zatížena nepředpověditelnými riziky, která vyžadují řešit i otázky právní a etické. Některé země proto zakazují experimenty s klonováním cizích genů do savců.


4.1. Základní kroky při klonování genů Klonování genů bylo na počátku prováděno tak, že příjemcem rekombinantní DNA byla bakteriální buňka. K tomu ale bylo zapotřebí překonat několik překážek. První z nich je bariéra, kterou pro vstup DNA představují buněčné obaly, tedy cytoplasmatická membrána a především buněčná stěna. Po překonání této bariéry je třeba se vypořádat se skutečností, že bakterie obsahují nukleázy, které cizorodou DNA nemilosrdně rozloží. I když se podaří zabezpečit, aby k likvidaci cizorodé DNA nedošlo, je nutné zajistit, aby nezůstala v buňce v jediné kopii. Kdyby se cizorodá DNA nereplikovala, znamenalo by to, že i v případě rozmnožování samotných buněk by stále jen jedna obsahovala rekombinantní DNA. To by bylo samo o sobě nedostatečné k produkci významného množství rekombinantního proteinu, nehledě na skutečnost, že exprese genu je další podmínkou úspěšné transformace. Pokud tedy chceme, aby se rekombinantní gen v cizí buňce množil (replikoval), musíme jej začlenit do takové molekuly DNA, která je v dané buňce schopna replikace. Tato molekula musí mít takové nukleotidové sekvence, aby ji replikační enzymy bakterie rozpoznaly. V principu to znamená, aby obsahovala počátek replikace, v případě Escherichia coli lokus označovaný ori (origin). Molekuly DNA, které zajistí vnesení cizorodé DNA do buňky bakteriální, se označují jako vektory. Vektory v novém prostředí recipientní buňky chrání cizorodou DNA, se kterou jsou spojeny a zajišťují samotné její přežití, ale i replikaci a následnou expresi expresi. Jako vektory se používají malé molekuly DNA, a to plasmidy nebo fágy, případně uměle připravené konstrukty označované jako kosmidy. V případě transformace jiných než bakteriálních buněk se využívají vektory na bázi virů. Plasmidy jsou extrachromozomální kružnicové molekuly DNA, které se vyskytují v celé řadě bakteriálních druhů. Nesou pouze geny, které nejsou pro buňku esenciální, ale nesou některé druhotné znaky, např. geny rezistence k antibiotikům. Plasmidy se v buňce často vyskytují v mnoha kopiích, dají se relativně snadno izolovat a opět transformovat do buňky, ve které se opět mohou replikovat, a protože se namnoží do mnoho kopií, zajišťují tím také namnožení kopií klonovaného genu. Fágy jsou bakteriální viry, které jsou schopny se v hostitelské buňce replikovat. Pokud buňku nezahubí, hovoříme o tzv. lyzogenizaci, kdy se fág (a jím nesený rekombinantní gen) začlení do chromozómu hostitele a množí se spolu s tímto chromozómem. Ve vhodných podmínkách je činnost fágových genů zodpovědných za lyzi hostitelských buněk utlumena, kdežto rekombinantní gen je exprimován jako by byl součástí chromozómu. Lyzogenní cyklus je možné změnou podmínek změnit na lytický, při kterém jsou hostitelské buňky lyzovány a exprimované proteiny se z buňky uvolní. Kosmidy jsou uměle připravené vektory, které spojují vlastnosti plasmidů a fágů. Infikují buňku mechanismem, který připomíná fága, ale v buňce se chovají jako plasmid. Mají velkou klonovací kapacitu. Viry, respektive vektory na nich založené jsou vhodné především pro genové manipulace v živočišných nebo rostlinných buňkách, které nemají plasmidy. Virové vektory jsou hojně využívané při genových terapiích – viz kapitola 11.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Při klonování genů se postupuje podle těchto základních kroků (Obr. 4.1): 1) 2) 3) 4) 5) 6)

Izolace deoxyribonukleové kyseliny Rozštěpení DNA na požadovaných místech a úprava konců Spojení produktů štěpení - rekombinace Vnesení produktů rekombinace do buňky – transformace Selekce buněk, které obsahují cizorodý gen Analýza produktů transformace, respektive klonované DNA

Obr. 4.1: Základní kroky při klonování genů


4.1.1. Izolace DNA Jak získat gen, který má být klonován, tedy vložen pomocí vektoru do cílové buňky? Situaci si popíšeme na genu pro lidský růstový hormon. Jaké jsou možnosti? Je možné izolovat celkovou DNA lidské buňky, rozštěpit ji některou z mnoha stovek dostupných restriktáz, např. EcoR I, a poté transformovat získané restrikční fragmenty s využitím vektorů do buněk bakterie Escherichia coli. Po kultivaci získáme množství bakteriálních kolonií. Každá kolonie představuje potomstvo buňky, do které byl vnesen vektor s jedním fragmentem lidské DNA a mezi nimi bude pravděpodobně jedna, která nese požadovaný fragment s genem pro růstový hormon (nezbytným předpokladem je, že právě tento gen není enzymem rozštěpen). Vzhledem k tomu, že restriktáza EcoRI štěpí lidskou DNA asi na 700 000 fragmentů, získáme zhruba stejný počet různých kolonií! Sbírka takových kolonií, které nesou celý genom určitého organismu ve formě fragmentů, se označuje jako genomová knihovna. Jak v genomové knihovně nalézt nositele právě toho genu, který nás zajímá? Najít jedinečnou sekvenci v rozsáhlé genomové knihovně o několika stech tisících různých záznamů je podobné, jako to pověstné hledání jehly v kupce sena! Máme-li tu možnost, a v případě kompletně zmapovaného lidského genu tato možnost většinou existuje, použijeme úsek nukleové kyseliny, který je komplementární k sekvenci hledaného genu, tzv. sondu. K přípravě sondy využijeme skutečnost, že v jednotlivých buňkách organismu dochází k expresi různých genů. Genetický materiál je shodný u všech buněk mnohobuněčného organismu. Ať se jedná o buňku nervovou, svalovou nebo jaterní, každá z nich obsahuje stejnou genetickou informaci. Buňky se liší aktivitou jednotlivých genů, tedy genovou expresí, tím, jaké proteiny vyrábí. Např. buňky pankreatu nemají o nic víc genu pro inzulín než jiné buňky, ale tento gen je v nich aktivně přepisován, a v buňkách pankreatu se proto nachází mnohem více mRNA pro inzulín než v ostatních buňkách. Tuto mRNA můžeme z buněk pankreatu izolovat v čistém stavu. Například ribozómy, které syntetizují příslušný protein, jsou současně připojeny k mRNA, která nese gen pro tento protein. Takové ribozómy s navázanou mRNA lze izolovat pomocí protilátky proti syntetizovanému polypeptidu. Jakmile získáme vhodnou mRNA, nemůžeme ji sice přímo naklonovat do vektoru, který je tvořen DNA, ale mRNA můžeme přepsat do tzv. cDNA. Existuje virový enzym, zpětná transkriptáza, který dokáže mRNA přepsat do jednořetězcové DNA, k níž se DNA polymerázou doplní komplementární DNA-řetězec. Vzniklá komplementární DNA (cDNA) se vloží do vektoru, kterým se transformuje hostitelská buňka. Komplementární DNA obsahuje tu část sekvence genu, která je translací překládána do sekvence aminokyselin příslušného proteinu. Neobsahuje promotory ani introny, ale je to materiál dostatečný pro expresi proteinu a taky pro vyhledání původního genu pro inzulín v genomové knihovně. Vyhledávání v genomové knihovně bakteriálních kolonií se provádí metodou hybridizace kolonií, která je znázorněna na obr. 4.6. Uvedený postup je vhodný pouze u těch genů, pro které lze získat z vhodné tkáně neporušenou čistou mRNA. Pokud to není možné, je třeba postupovat složitějším způsobem. Z fragmentované mRNA se výše uvedeným způsobem připraví klony, které obsahují cDNA, vznikne tak knihovna cDNA. Z primární struktury peptidů (sekvencí aminokyselin) se odvodí možné sekvence nukleotidů v genu (využívá se přitom degenerace genetického kódu), který tyto peptidy kóduje, a zjištěné oligonukleotidy se připraví synteticky. Připravené oligonukleotidy mohou hybridizovat s molekulami cDNA z knihovny cDNA. Jinou možností je připravit sondu s využitím znalostí sekvencí příslušného genu u jiných savců.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii 4.1.2. Rozštěpení DNA na požadovaných místech a úprava konců Rozštěpení DNA se provádí restrikčními enzymy. Restrikční enzymy, restriktázy, jsou enzymy využívané bakteriemi jako obranný systém před napadením bakteriofágy, štěpí molekuly dsDNA ve specifických sekvencích. Tím je zajištěno, že je proces přípravy fragmentů DNA ke klonování reprodukovatelný. Restriktázy se označují podle názvu mikroorganismu, ze kterého byly izolovány, tedy například EcoR I je restriktáza izolovaná z Escherichia coli, kmene R a jedná se o první enzym izolovaný z tohoto kmene. Příklady běžně používaných restriktázy jsou uvedeny v Tabulce 4.1. Přehled všech popsaných restriktáz je možno najít na adrese „www.rebase.neb.com/rebase“. Tabulka 4.1: Příklady běžně používaných restriktáz. Název enzymu/Původ

Rozpoznávaná sekvence

EcoRI Escherichia coli

……G-A-A-T-T-C…… ..…..C-T-T-A-A-G……

HindIII Haemophilus influenzae

……..A-A-G-C-T-T……… ……..T-T-C-G-A-A………

BamHI Bacillus amyloliquefaciens

……..G-G-A-T-C-C…….. ………..C-C-T-A-G-G………..

HaeIII Haemophyllus aegytius

……..G-G-C-C……. ……….C-C-G-G………

Sau3A Staphylococcus aureus

………-G-A-T-C……. ……….C-T-A-G-……..

NotI Nocardia otitidis-caviarum

…….G-C-G-G-C-C-G-C…. ……..C-G-C-C-G-G-C-G…..

Produkty štěpení A-A-T-T-C……….. G……….. ……..G ……...C-T-T-A-A A-G-C-T-T………… A………… ……A ……T-T-C-G-A G-A-T-C-C……….. G……….. ……..G .……..C-C-T-A-G C-C….…..… G-G……..… ………..…G-G …………..C-C G-A-T-C……. …….. …………. …………..C-T-A-G G-G-C-C-G-C……... C-G……... ..……G-C …..….C-G-C-C-G-G

Restriktázy štěpí nejčastěji čtveřice, šestice nebo osmice nukleotidů. Protože se specifická osmice (sekvence 8 bp) vyskytuje s nižší četností než specifická sekvence 4 bp, je zřejmé, že ty enzymy, které rozpoznávají sekvenci 4 bp, budou DNA štěpit častěji, než ty enzymy, které rozpoznávají sekvenci 8 bp. Znamená to tedy, že pokud chceme štěpit DNA na kratší fragmenty, použijeme např. enzymy, které štěpí 4 bp (např. HaeIII, Sau3A), zatímco chceme-li získat delší fragmenty, použijeme např. EcoRI (štěpí šestice bp). Enzym Not I, který rozpoznává a štěpí sekvenci 8 bp, se používá při štěpení lidských chromozómů na menší počet větších fragmentů (mají délku i přes milion párů bazí). Pro tento typ restriktáz je rovněž typické, že jsou rozpoznávané a štěpené sekvence symetrické, tzn., že fragmenty mají po štěpení stejné zakončení. Ke štěpení dochází zpravidla mimo střed symetrie, což vede ke vzniku lepivých neboli kohezivních konců DNA. Takové konce, ať už mají původ v DNA z jakéhokoli organismu, lze následně snadno spojit.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii 4.1.3. Spojení produktů štěpení - rekombinace Do vektoru otevřeného po štěpení restrikční endonukleázou může být vložen fragment dsDNA, a to tehdy, mají-li vektor i fragment na svých koncích komplementární sekvence – kohezivní konce. Kohezivní konce se získají po štěpení vektoru a DNA stejnou restriktázou. Rozštěpený vektor a fragmenty se smíchají za podmínek vhodných k reasociaci komplementárních konců. DNA fragment a vektor je pak kovalentně propojen DNA ligázou. Schéma spojování molekul je zachyceno na Obr. 4.2. Pokud nemají fragmenty DNA a vektor konce kohezivní, ale „tupé“, pak je spojení DNA ligázou asi 1 000x méně účinné. Změnit konce tupé na kohezivní lze použitím tzv. linkerů, což jsou uměle syntetizované řetězce krátkých oligonukleotidů. Linkery nesou rozpoznávací místa pro jednu konkrétní restriktázu. Napojí se ligázou na tupé konce fragmentů DNA. Účinnost spojení linkerů s tupými konci DNA je málo účinné, proto se linkery dávají do reakce v nadbytku. Tím je zabezpečeno, že na každý tupý konec vkládaného fragmentu připadá jeden linker. Štěpením linkeru restriktázou vznikne na fragmentu DNA kohezivní konec. Obr. 4.2: Spojování molekul DNA


4.1.4. Vnesení produktů rekombinace do buňky – transformace Jakmile je úsek DNA vložen do vektoru, je potřeba vnést (transformovat) tento vektor (spolu s oním úsekem DNA zpět do živé, tzv. recipientní buňky. Principiálně není snadné transformaci recipientních buněk provést, k tomu je třeba vystavit buňky extrémním podmínkám. Součástí transformačního procesu je uvedení buněk do stavu tzv. kompetence. Kompetentní buňky lze získat z mladých, rychle rostoucích buněk, tedy z kultury nacházející se v exponenciální fázi růstu. Takové buňky se opracují chloridem vápenatým, který v buněčné stěně nahradí všechny ionty a buňka se stane „kladně nabitým iontem“, na který se snadno váží negativně nabité molekuly deoxyribonukleových kyselin. Teplotním šokem pak dojde k penetraci buněčných obalů a DNA vnikne dovnitř buňky, kde může dojít k její inkorporaci do buněčných struktur a DNA se stane součástí buněčného genomu. Příprava kompetentních buněk a transformace. Aktivně rostoucí buňky se přenesou do prostředí CaCl 2 při 4°C. Přenos se uskutečňuje opakovaným vypíráním biomasy v tomto prostředí. Pozitivně nabité buněčné stěny se pak stávají vysoce propustné pro záporně nabité molekuly. DNA určená k transformaci se nechá v kontaktu s těmito buňkami po dobu asi 30 minut na ledové lázni. Teplotní šok spočívá v přenesení směsi buněk a DNA na 42°C po dobu 30-45 sekund. Poté je k buňkám přidáno regenerační médium a po krátké inkubaci (zpravidla do 1 hodiny) buňka obnoví své funkce včetně exprese genů z transformovaných molekul vektorů s inzerty cizorodé DNA.

Některé druhy bakterií, např. stafylokoky, je možno transformovat až poté, co jsou z nich připraveny sféroplasty, tedy buňky částečně zbavené buněčné stěny. Kromě výše uvedených metod transformace je možné připravit buňky bez náboje v buněčné stěně a takové buňky pak použít k transformaci elektrickými vysokonapěťovými pulsy, tzv. elektroporaci. Elektroporací lze transformovat všechny typy buněk. K transformaci buněk živočišných lze využít také lipozómů nebo ve formě zahušťovadla polyethylenglykolu. Rostlinné buňky jsou transformovány mimo jiné biobalisticky. Při této metodě je DNA nastřelována vysokou rychlostí wolframovými nebo zlatými projektily s navázanou DNA. Zásadní problém transformace je to, že její účinnost je i s použitím nejlepší techniky stále velmi nízká, což znamená, že cizí DNA přijme nakonec pouze malé procento buněk. Proto je nutné po transformaci pečlivě zvolit metodu, kterou je možno jednoznačně určit, které z narostlých buněčných kolonií obsahují buňky nesoucí transformovanou DNA, a které nikoli. Zpravidla se zjišťuje, je-li v buňce přítomen vektor. Protože vektory nesou geny rezistence k antibiotikům, jsou snadno selektovatelné. Příklady běžně vektorů jsou uvedeny v následujících odstavcích.

4.1.5. Selekce buněk, které obsahují rekombinantní gen K selekci transformovaných buněk využívají genoví inženýři celou řadu více či méně sofistikovaných metod. Představíme si alespoň některé z nich, které se používají nejčastěji, a to na úrovni bakteriálních buněk. U eukaryotických buněk lze pak použít metod analogických. Protože jsou recipientní buňky senzitivní k antibiotikům a vektor naopak nese některý z genů pro rezistenci, nejčastěji k ampicilinu nebo kanamycinu, probíhá selekce primárně na základě rezistence

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii k antibiotikům. Transformovaná buňka musí být k antibiotiku rezistentní. Mezi rezistentními klony pak můžeme provést další selekci některou z následujících metod: 1) 2) 3) 4) 5) 6)

Inzerční inaktivace α-komplementace Hybridizace kolonií Restrikční analýza plasmidové DNA Test PCR Sekvenování

Inzerční inaktivace doplňuje primární selekci. Některé vektory, např. na obr. 4.3 uvedený plasmid pBR322 obsahují dva geny pro dvě různé rezistence k antibiotikům. Naklonování fragmentu DNA do některého z těchto genů dojde k jeho inaktivaci a tím tedy ke ztrátě příslušné rezistence. Jestliže tedy recipientní buňky úspěšně transformované kompletním plasmidem bez inzertu ponesou dvě rezistence (v případě pBR322 k tetracyklinu a ampicilinu), pak buňky transformované rekombinantním plasmidem s naklonovaným fragmentem jednu z rezistencí ztratí. Selekce buněk se pak provádí tzv. otiskovou metodou, znázorněnou na obr. 4.4.

Obr. 4.3: Mapa vektoru pBR322. Převzato z http://irfanrahmat.files.wordpress.com/2008/10/mappbr322.gif, bla = gen pro rezistenci k ampicilinu, tet = gen pro rezistenci k tetracyklinu, rep = počátek replikace, rop = regulační sekvence pro zajištění vysokého počtu kopií plasmidu v buňce

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Obr. 4.4: Otisková metoda, selekce na citlivost k tetracyklinu. DNA fragment byl klonován do genu tet. Kolonie transformovaných buněk rostoucích na neselektivním médiu

Otisk kolonií na selektivní média TETRACYKLIN

AMPICILIN

Inkubace 16 hodin/37°C

Pro další práci selektujeme kolonie rezistentní k ampicilinu, ale citlivé na tetracyklin

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Alfa-komplementace. Jedná se o jednoduchý jednokrokový rychlý test, který má odhalit, zdali vektor obsahuje nebo neobsahuje inzert. Test je založen na skutečnosti, že produkt genu lacZ, β-galaktozidáza, je tetramer, sestávající ze dvou částí: lacZ-α a lacZ-ω (omega). Pokud je z buněčného chromozómu recipientní buňky odstraněn gen lacZ-α, kódující fragment α, je zbytek enzymu nefunkční. Chybějící gen pro fragment α je proto transformován vektorem, odtud název α-komplementace. Pokud je recipientní buňka transformována vektorem, vznikají uvnitř ní funkční molekuly β-galaktozidázy, dochází tedy k α-komplementaci. Jestliže je ovšem gen lacZ-α na vektoru porušen naklonovaným DNA fragmentem, pak ke komplementaci nedochází a molekuly β-galaktozidázy jsou nefunkční. Enzym β-galaktozidáza štěpí molekulu laktózy na glukózu a galaktózu. Jestliže je v růstovém médiu namísto laktózy přítomen chromogenní substrát, např. analog laktózy tzv. X-gal (5-bromo-4chloro-3-indolyl-β-D-galaktopyranozid), dojde k rozštěpení této látky a buňky (respektive kolonie takových buněk) se zabarví domodra. Buňky, které ovšem nemají funkční β-galaktozidázu, chromogenní substrát neštěpí a zůstávají zbarveny standardně, tedy v odstínu slonové kosti, zjednodušeně řečeno, zůstávají bílé. A právě na principu modro/bílého zbarvení lze rozpoznat, která recipientní buňka obdržela plasmid bez naklonovaného DNA fragmentu, a která rekombinantní molekulu. Princip selekce na základě α-komplementace je zachycen na obr. 4.5. K obr. 4.5 je třeba doplnit dvě informace 1) Fragment α je poměrně „rezistentní“ k tomu, co je do genu, který jej kóduje naklonováno. Pokud je klonovaný fragment naklonován ve stejném čtecím rámci jako gen lacZ-α a pokud je tento fragment krátký, pak zůstává fragment α funkční, a přestože buňky nesou plasmid s naklonovanou DNA, stejně ke komplementaci dochází a tyto buňky se barví modře. Tento jev je výraznou komplikací selekce na principu α-komplementace, přesto je metoda velmi často v laboratořích využívána pro prvotní screening transformantů. 2) Gen lacZ-α je v běžně používaných vektorech zpravidla pod kontrolou laktózového operónu. Tento operón je indukován laktózou, která je nahrazována molekulou IPTG (isopropyl-β-Dthiogalaktozid). IPTG je tedy při tomto testu běžnou součástí růstového média.

Princip α-komplementace se využívá i při klonování do fágových vektorů. Plaky, které se po takové transformaci vytvářejí, mají modře opaleskující nádech. Takové plaky jsou potomstvem vektorů, které nenesou naklonovaný fragment!

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Obr. 4.5: Selekce na základě α-komplementace

Buňky bez plasmidu na neselektivním médiu (LB médium) = buňky jsou zbarveny „bíle“

Buňky bez plasmidu na selektivním médiu (LB médium + ampicilin + Xgal + IPTG) = buňky nerostou

Buňky s plasmidem bez inzertu na selektivním médiu (LB médium + ampicilin + Xgal + IPTG) = buňky jsou zbarveny „modře“

Buňky s plasmidem s dlouhým inzertem na selektivním médiu (LB médium + ampicilin + Xgal + IPTG) = buňky jsou zbarveny „bíle“

Buňky s plasmidem s krátkým inzertem na selektivním médiu (LB médium + ampicilin + Xgal + IPTG) = buňky jsou zbarveny „modrobíle“

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Metoda, při které je selekce založena na hybridizaci kolonií, je schematicky znázorněna na obr. 4.6. Při této metodě jsou narostlé bakteriální kolonie „otištěny“ na nylonovou membránu. Získané otisky buněk jsou pak lyzovány a podrobeny izolaci genomové DNA. Vznikne tak otisk DNA na nylonové membráně, který odpovídá původní poloze kolonií na kultivační Petriho misce. DNA je podobně jako u metody Southern blot denaturována a vzniklé jednořetězcové molekuly jsou fixovány na membránu. Membrána je pak hybridizována se značenou sondou (cDNA), která nese sekvence komplementární ke klonovanému DNA fragmentu. Pokud došlo k naklonování DNA fragmentu, dojde k hybridizaci sondy a místo, kde se původně nacházela bakteriální kolonie s oním klonem je tak označeno. Tuto bakteriální kolonii je pak možné z původní misky odebrat a použít k další práci. Obr. 4.6: Schématický postup hybridizace kolonií. V prvním kroku je dvouřetězcová DNA denaturována vysokou teplotou nebo alkáliemi, dojde k oddělení jednotlivých řetězců. Komplementární řetězce se pak zase spojí po ochlazení nebo neutralizaci. Ke spojení může dojít u řetězců, které pocházejí ze stejné molekuly nebo (a to je účelem této metody) z různých zdrojů. Pokud se spojí řetězce původem z chromozomálního genu a cDNA, hovoříme o hybridizaci. Tímto postupem je možné prostřednictvím cDNA identifikovat klony, které nesou sledovaný chromozomální gen. nylonová nebo nitrocelulózová membrána

působením NaOH dojde k lyzi buněk, denaturaci DNA a její fixaci na membránu

otisk chromozomální DNA

kolonie z genomové banky narostlé na agaru

obtisknutí kolonií na membránu

fluorescenčně nebo radioaktivně označená denaturovaná cDNA

film

expozice stanovení pozice kolonie nesoucí hledanou sekvenci

inkubace s cDNA (přes noc) – dojde k hybridizaci

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Princip selekce vhodných klonů na základě restrikční analýzy je znázorněn na obr. 4.7. Vycházíme-li ze znalosti fyzikální mapy vektoru, pak můžeme vhodnou volbou restriktázy zjistit, jestli a v jaké orientaci je ve vektoru naklonován gen. Restrikčním štěpením a následnou elektroforézou získáme informaci o délkách fragmentů v rekombinantním plasmidu a z nich můžeme odvodit restrikční mapu, která orientaci odhalí. Zajímá nás především, jestli je gen naklonován ve shodném směru, jako je směr transkripce z promotoru, který je umístěn na vektoru. Správný směr je podmínkou pro následnou úspěšnou translaci. Obr. 4.7: Selekce restrikční analýzou izolovaného rekombinantního plasmidu a) Situace, kdy je gen naklonován ve správné orientaci vzhledem ke směru transkripce směr transkripce šipky značí štěpení restriktázou vektor

ATG

gen

TAA

vektor

produkty štěpení

b) Situace, kdy je gen naklonován v nesprávné orientaci vzhledem ke směru transkripce směr transkripce šipky značí štěpení restriktázou vektor

AAT

gen

GTA

vektor

produkty štěpení

Metodu polymerázové řetězové reakce můžeme k analýze přítomnosti klonovaného DNA fragmentu použít vždy, protože známe sekvenci vektoru. Na všech vektorech jsou k dispozici sekvence určené k sekvenování z obou stran vektoru (viz obr. 4.8). Na tyto sekvence se váží primery a ty je zpravidla možné zkombinovat a použít jako primery pro PCR. Na základě velikosti amplikonů získaných

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii amplifikací z původně sekvenačních primerů je možné odlišit, jestli vektor obsahuje naklonovaný DNA fragment. Jestliže totiž máme k dispozici mapu vektoru, pak známe vzdálenost sekvenačních primerů a pokud známe velikost klonovaného DNA fragmentu, pak dovedeme vypočítat také velikost amplikonů z vektoru, který má tento DNA fragment naklonovaný. Obr. 4.8: Jak lze potvrdit přítomnost inzertu ve vektoru s využitím sekvenačních primerů. Sekvenační primery jsou označeny jako primer 1 a primer 2. a) Vektor bez inzertu primer 1 vektor

vektor

primer 2

délka amplikonů N

b) Vektor s inzertem primer 1 vektor

Inzert délky X

vektor

primer 2

délka amplikonů N + X

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Pokud známe sekvenci nukleotidů na koncích inzertu, popřípadě pokud jsme klonovali produkty PCR, pak můžeme této znalosti využít ke stanovení orientace inzertu ve vektoru. Vysvětlení je možno nalézt na obr. 4.9.

Obr. 4.9: Stanovení orientace inzertu ve vektoru pomocí PCR. Sekvenační primery jsou označeny jako primer 1 a primer 2. Primery, ze kterých vznikl inzert, jsou označeny primer F a primer R.

primer 1

primer F

vektor

Inzert délky X

vektor

primer R

primer 2

Při tomto uspořádání mohou amplikony vznikat v PCR reakcích, ve kterých jsou použity následující kombinace primerů    

sekvenační primer 1 + sekvenační primer 2 (délka amplikonu = N + X) primer F + primer R (délka amplikonu = X) sekvenační primer 1 + primer R sekvenační primer 2 + primer F

Metoda sekvenování je rozhodující metodou, která jediná může potvrdit přítomnost klonované DNA sekvence ve vektoru. Může taky přesně stanovit, zda klonovaná sekvence odpovídá sekvenci původní nebo zda nedošlo k nějakým změnám. V principu je doporučeno sekvenovat každý inzert. Sekvenování je metodou, kterou nejenže potvrdíme přítomnost inzertu ve vektoru, ale také současně klonovanou DNA analyzujeme.

4.1.6. Analýza produktů transformace Jak už bylo uvedeno výše, provádí se analýza klonované DNA sekvenováním. Kromě toho je možné provést také hybridizaci DNA:DNA s využitím metody Southern blotting nebo DNA:RNA pomocí metody Northern blotting. Není předmětem tohoto učebního textu všechny tyto metody popisovat, k tomu autoři odkazují na běžně dostupnou literaturu zabývající se metodami molekulární biologie.


4.2. Rekombinantní proteiny Rekombinantní proteiny jsou takové proteiny, které vznikají expresí umělých (rekombinantních) genů připravených metodami genového inženýrství. Rekombinantní proteiny jsou produkovány v tzv. expresních systémech, což jsou takové buňky nebo jejich části, které jsou používány právě k produkci rekombinantních proteinů. Expresním systémem může být jakákoli živá buňka, tedy jakákoli buňka prokaryotická (nejčastěji je to Escherichia coli, Bacillus subtilis, Mycobacterium smegmatis nebo zástupci rodu Streptomycetes) nebo buňka eukaryotická. Z eukaryot se používají buňky kvasinek (S. cerevisiae, P. pastoris), houby, pseudomonády, hmyzí (systém bakulovirus-Drosophila), savčí (s vektory na bázi adenovirů) nebo rostlinné buňky (vektorem je např. virus polyhedrie). Jako expresní systémy se ale využívají taky in vitro expresní systémy založené na extraktech buněk savčích nebo rostlinných. V souvislosti s expresemi rozlišujeme mezi vektory dva základní typy: transkripční (fúzní) vektory a translační (fúzní) vektory. Transkripční fúzní vektory jsou takové, které nenesou translační signály, především vazebné místo pro ribozom (RBS, ribosome binding site) a kodón AUG. Pokud má být transkripční vektor použit k produkci rekombinantního proteinu, musí být translační signály do takových vektorů naklonovány spolu s klonovaným genem. Příkladem transkripčních vektorů mohou být např. plasmidy pUC18/19 uvedené v kapitole 4.2.1. Naproti tomu translační vektory jsou přímo určené k expresi rekombinantních proteinů a nesou translační signály jako nezbytnou součást základní struktury vektoru. Do translačních vektorů tak mohou být klonovány nejen celé geny, ale také jejich části nebo jakákoli sekvence nukleotidů, která má být podrobena translaci. U translačních vektorů je exprese rekombinantního proteinu plně pod kontrolou tohoto vektoru. K translačním vektorům patří pGEMEX nebo plasmidy řady pET zmíněné v kapitole 4.2.1. U translačních vektorů je zpravidla část rekombinantního proteinu kódována ze sekvencí ležících na samotném vektoru a proto výsledný rekombinantní protein označujeme také jako fúzní protein, tedy rekombinantní protein vznikající fúzí dvou částí – jedna pochází ze samotného proteinu, druhá z vektoru. Z termínu fúzní protein bylo odvozeno označení translační fúzní vektor a následně také transkripční fúzní vektor. Označení translační vektor a transkripční vektor je ale dostatečné. Obecná struktura transkripčního a translačního vektoru je znázorněna na obr. 4.10. Ačkoli jsou fúzní proteiny v podstatě umělé produkty, složené z „přirozené“ části a části dodané vektorem, mají celou řadu výhod, které jim přináší právě ta část, kterou kóduje vektor. Této části se říká fúzní partner. Dnes dostupné komerční vektory nesou dlouhé sekvence kódující fúzní partnery, často jsou to celé geny. Při expresi fúzních proteinů a následně také při jejich purifikaci se využívá právě specifických vlastností fúzních partnerů. Většina dnes produkovaných rekombinantních proteinů má charakter fúzních proteinů. K hlavním výhodám fúzních proteinů patří to, že    

díky vektorové části mají zajištěný počátek translace malé proteiny jsou stabilnější je u nich zajištěna vysoká pravděpodobnost exprese výsledný produkt bývá vysoce rozpustný, tedy správně sbalený

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Obr. 4.10: Obecné schéma transkripčního a translačního vektoru a souvislosti translace a) Transkripční vektor klonovací místo

promotor

inzert s translačními signály

promotor transkripce

RBS, AUG, gen AUG mRNA

translace

rekombinantní protein b) Translační vektor klonovací místo

promotor, RBS, AUG

inzert bez translačních signálů

promotor, RBS, AUG

AUG

gen transkripce

translace fúzní protein

mRNA

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Fúzní partner rekombinantního proteinu může být naklonován jako C-koncová fúze nebo jako N-koncová fúze. Jediný rekombinantní protein může mít současně fúzního partnera na obou koncích. Fúzní partneři mají dvě základní funkce  mohou sloužit jako selekční znak při imunodetekci rekombinantního proteinu protilátkami  mohou být použity při purifikaci rekombinantního proteinu

Příklady fúzních partnerů jsou gen lacZ s jehož funkcí jsme se seznámili v kapitole 4.1.6., gen pro maltose binding protein (MBP), gen pro glutation-S-transferázu, gen pro thioredoxin nebo sekvence kódující oligopeptidy, např. hexahistidin, tzv. HisTag. S pojmem fúzní partner souvisí další termín, tzv. reportérový gen. Termín reportérový gen se používá pro gen kódující fúzního partnera fúzního rekombinantního proteinu, který slouží především k identifikaci tohoto proteinu. Nejčastěji využívanými reportérovými geny jsou kromě již zmíněných genů pro HisTag, β-galaktozidázu, thioredoxin nebo glutation-S-transferázu také gen pro chloramfenikolacetyltransferázu (CAT), secernovanou alkalickou fosfatázu, β-glukuronidázu a především dnes velmi populární gen luc pro luciferázu ze světlušky Photinus pyralis, gen zeleně fluoreskující protein (green fluorescent protein, GFP) kóduje protein, který je příčinou světélkování medúzy Aequorea victoria, gen pro červeně fluoreskující protein (red fluorescent protein, RFP) z korálu nebo řada bakteriálních genů pro proteiny fluoreskující v infraoblasti (infrared fluorescent protein, IFP); jeden z nich pochází z Deinococcus radiodurans. Především geny pro fluoreskující proteiny jsou dnes velmi často využívány při přípravě geneticky modifikovaných vyšších eukaryot pro účely studia exprese a distribuce proteinů v tkáních a orgánech.


4.3. Recipientní buňky Recipientní buňkou je každá, která živá buňka, která přijímá rekombinantní DNA některým z výše popsaných vektorů. Hostitelem rekombinantní DNA může z důvodu podobnosti replikačního aparátu bez ohledu na typ zdroje bakteriální buňka, buňka kvasinky a plísně, buňky rostlinné i živočišné nebo dokonce i celá rostlina nebo živočich (i v případech celých organismů je ale vždy transformovaná konkrétní buňka). Nejčastěji používanými recipientními buňkami jsou ty, které jsou odvozeny od bakterie Escherichia coli. Tato bakterie má malý kružnicový chromozóm o velikosti 3x106 bp, generační dobu 20 minut, ve stacionární fázi dorůstají do koncentrace až 2x109b/ml. V průběhu mnoha desítek let výzkumu na této bakterii byly připraveny tisíce mutantů, většinou na bázi kmene K12. K nejznámějším recipientním kmenům patří DH5α, HB101, BL21, aj. Nejjednodušším eukaryotickým organismem, který je využíván pro účely produkce rekombinantních proteinů je pekařská kvasinka Saccharomyces cerevisiae. Ta obsahuje lineární chromozómy o celkové délce přibližně 13 000 000 bp, které nesou asi 6 275 strukturních genů. Protože se jedná eukaryotický organismus, má shodný transkripční a translační aparát jako vyšší eukaryota, rozdíly jsou ale v posttranslačních procesech. Vedle tohoto druhu se jako recipientní používají také buňky kvasinek druhů Schizosaccharomyces pombe a Pichia pastoris. Hmyzí buňky a jejich parazité, bakuloviry, jsou systémy, které představují klonovací systémy vyšších eukaryot. Využívá se u nich podobných selekčních principů jako u nižších eukaryot či bakterií, používají se i principiálně shodné binární vektory. U vektorů dochází v procesu rekombinace k náhradě sekvence polyhedrinového genu genem rekombinantním. Proteiny jsou secernovány do média a hostitelskou buňkou jsou buňky Drosophila melanogaster. Protože hmyzí viry nenapadají savčí buňky, je klonování do takových vektorů pro výzkumné pracovníky relativně bezpečná technologie. U rostlinných buněk se k transformaci používají typické bakteriální plasmidy, které obsahují tzv. rostlinné expresní kazety. K transformaci těmito plasmidy se využívají bakterie rodu Agrobacterium nebo je možné provést transformaci přímou. Jiné systémy jsou založeny na virových vektorech. Jedná se opět o relativně bezpečnou technologii. Jako recipientní buňky se používají buňky modelových organismů Arabidopsis thaliana nebo Nicotiana tabacum. Technologie transformace rostlinných buněk je už ale propracována pro stovky různých rostlinných druhů. Člověku nejbližší systémy jsou založeny na bázi savčích buněk a jejich virů. Jako recipientní buňky se nejčastěji používají buňky ovarií zlatého křečka, CHO (Chinesse hamster ovary), které jsou transformovány vektory na bázi adenovirů, retrovirů nebo herpesvirů. Technologie manipulace s těmito systémy jsou pro obsluhu nebezpečné!


4.4. Prokaryotické expresní systémy Na bakteriích byly založeny první expresní systémy a i v současnosti jsou to nejrozšířenější producenti rekombinantních proteinů. I expresní systémy eukaryotické v přípravných fázích vyžadují jako mezistupeň bakteriální buňku. Absolutní většina rekombinantních proteinů je produkována v buňkách Escherichia coli upravených metodami genového inženýrství. Využívají se ale také bakterie Bacillus subtilis, Streptomyces, Mycobacterium smegmatis, a jiné. V bakteriálních buňkách byly úspěšně produkovány jak jiné prokaryotické, tak i eukaryotické proteiny a to především jako fůzní proteiny, intracelulární i secernované proteiny do molekulové hmotnosti 50 000. Tyto systémy určitě nejsou vhodné pro produkci secernovaných a povrchových proteinů větších než 50 000. Bakteriální buňky rovněž nemají glykosylační aparát, proto se zpravidla nedoporučují k expresi glykosylovaných proteinů. Ačkoli je exprese jakéhokoli rekombinantního proteinu zpravidla individuální záležitostí a každý nový rekombinantní protein má takové vlastnosti, že jeho exprese je výjimkou z jakýchkoli definovaných pravidel, pro expresi v E. coli obecně platí, že je možné v nich exprimovat proteiny, které    

jsou větší než malé jsou menší než velké nejsou příliš hydrofobní neobsahují příliš mnoho cysteinů

Ideální exprese v E. coli probíhá při splnění následujících vlastností proteinu:     

protein je tvořen jedním polypeptidovým řetězcem není nutná glykosylace velikost proteinu je < 50kDa protein je produkován v rozpustné cytosolické frakci protein je produkován do inkluzních tělísek s vysokou možností opětovného sbalení

K výhodám exprese v Escherichia coli patří především  vysoké výtěžky produktu  purifikovatelné produkty vhodné pro další analýzu  levná produkce

Co se týče vlastností ostatních bakteriálních systémů, jsou specifické a před výběrem příslušného expresního systému je třeba se s nimi podrobně seznámit.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii 4.4.1. Prokaryotické vektory V současné době se pro izolaci, namnožení a expresi klonované DNA v prokaryotických buňkách používají tři typy vektorů - plasmidy, bakteriofágy a kosmidy. Vektory byly upraveny tak, aby vyhovovaly specifickým účelům, např. pro přípravu velkého množství plasmidové DNA, vysokou expresi heterologních proteinů, cílenou mutagenezi, přípravu radioaktivně značených sond či genomových knihoven. Volba vhodného vektoru pro klonování pak závisí na účelu, k němuž má být použit. Plasmidy ve funkci vektorů. Všechny plasmidy, v současné době používané ke klonování, jsou oproti přirozeným plasmidům upravené. Ideální plasmid upravený do podoby vektoru musí být malý, aby se s ním dalo snadno manipulovat, musí se dát snadno izolovat nebo transformovat. Zároveň musí být v buňce stabilní a replikovatelný. Pro každou restriktázu by měl mít jen jedno restrikční místo, aby se účinkem enzymu pouze otevřel, ale nezničil. Měl by obsahovat geny (tzv. selekční geny nebo selekční znaky), které umožňují snadnou selekci transformantů. V přírodě takové plasmidy prakticky neexistují - pokud mají výhodný znak, jsou zase moc velké nebo je restriktázy štěpí na nevhodných nebo více místech. Pokud plasmid malý a obsahuje jediné restrikční místo, pak zase zpravidla nemá selekční znak. V současnosti se používají uměle vytvořené vektory na bázi plasmidů. Jedním z příkladů je plasmid pBR322; tento plasmid byl zkonstruován kombinací různých částí přirozeně se vyskytujících plasmidů. Je využíván k přenášení cizorodé DNA do buněk Escherichia coli. Jedná se o malý plasmid (4 361 bp), obsahuje dva geny rezistence - k ampicilinu a k tetracyklinu, má restrikční místa pro restriktázy EcoRI, BamHI, HindIII, PstI a SalI. Replikuje se nezávisle na hlavním chromozómu, a proto se může v buňce vyskytovat v mnoha kopiích, je v tzv. relaxovaném stavu.

Konstrukce plasmidu pBR322. Tento plasmid byl zkonstruován Bolivarema Rodriguezem na Kalifornské univerzitě v San Francisco v USA. K použití byl schválen v roce 1977 a v tomtéž roce byl využit k vnesení prvního savčího genu do bakterie. Jednalo se o gen pro insulin od potkana vnesený do E. coli.

Na bázi plasmidu pBR322 jsou odvozeny další vektory, které se liší například v rezistenci k antibiotikům a spektrem restrikčních míst. Plasmidy odvozené od pBR322 jsou využívány ke vnášení cizorodé DNA do buněk eukaryotických – kvasinek, rostlin i živočichů. Velmi často používanými jsou vektory odvozené od plasmidu pUC18/pUC19. Tyto dva vektory jsou velmi malé molekuly (2 686 bp), které nesou umělý konstrukt, tzv. mnohočetné klonovací místo multicloning site, MCS), polylinker, který obsahuje v krátké sekvenci několik různých restrikčních míst. Plasmidy pUC18 a pUC19 se liší pouze orientací tohoto klonovacího místa. Oba plasmidy nesou také gen rezistence k ampicilinu a jako selekční znak využívají exprese genu pro β-galaktozidázu. Schéma plasmidů pUC18 a pUC19 je uvedeno na obr. 4.11. Plasmidy pSP64, pSP65 a řada plasmidů pGEM jsou vektory odvozené od plasmidu pVC. Před klonovacím místem obsahují promotory rozpoznávané vysoce účinnými fágovými RNA polymerázami. Transkripcí inzertů vložených do těchto míst lze získat velké množství jednořetězcové RNA.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Obr. 4.11: Struktura plasmidu pUC18/19

Struktura klonovacího místa plasmidů pUC18/19 je znázorněna na obr. 4.12.

Obr. 4.12: Klonovací místo plasmidů pUC18/19

Plasmid pUC18 obsahuje stejnou sekvenci, ale v opačné orientaci.

Komerčně dostupných plasmidů jsou na trhu aktuálně tisíce. Všechny ale obsahují 1) Počátek replikace, který je podmínkou produkce nových kopií 2) Selekční znak, zajišťující zvýhodněný růst transformovaných bakterií 3) Klonovací místo, umožňující vložit do plasmidu fragment cizorodé DNA

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Kromě vektorů, které jsou využívány pro jednoduché klonování DNA fragmentů, existují také vektory zaměřené přímo na expresi proteinu z naklonovaného genu. Jedním z mnoha takových vektorů je plasmidový vektor pGEMEX. Ten slouží k expresi proteinů v E. coli. Tento vektor a z něj odvozené vektory obsahují mimo jiné gen pro RNA polymerázu bakteriofága T7. Tato polymeráza přepisuje geny umístěné za promotorem genu 10 tohoto bakteriofága tak účinně, že ke své činnosti spotřebuje většinu ribonukleotidů v buňce. To vede k dramatickému snížení transkripce ostatních genů hostitelské buňky. Kmeny E. coli, které nejsou infikovány bakteriofágem T7 tento enzym neprodukují. Proto se k expresi používají buňky infikované bakteriofágem nebo vektorem M13 nebo takové buňky, do nichž byl uměle vložen gen pro T7 RNA polymerázu (např. E. coli BL21 (DE3). Tento gen bývá pod kontrolou teplotně indukovatelného promotoru nebo častěji lac promotoru indukovatelného 1aktózou nebo jejími analogy. V tomto případě IPTG tedy indukuje syntézu RNA polymerázy, která specificky přepisuje pouze geny umístěné za T7 promotorem. Vektory řady pGEM obsahují polyklonovací místo obklopené opačně orientovanými fágovými promotory T7 a SP6. Díky tomuto uspořádání je možno získat „sense“ a „antisepse“ transkript klonovaného genu. Příkladem jednoho z celé rodiny vektorů pGEMEX je uveden na obr. 4.13. Jedná se o komerční produkt firmy Promega, na jejichž stránkách (http://www.promega.com)je možné o tomto a podobných vektorech najít další informace. Obr. 4.13: Vektor pGEMEX-2. Převzato ze stránek společnosti Promega.

Jinou rodinu expresních vektorů tvoří vektory pET. Jedním z příkladů této řady je vektor pET22 (obr. 4.14) produkovaný firmou Novagen (http://www.novagen.com). Tento plasmid nese kromě běžných sekvencí jako je T7 promotor, terminátor a polyklonovaci místo také N-terminální pelE signální sekvenci pro periplasmatickou lokalizaci a C-terminální hexahistidinovou sekvenci pro afinitní purifikaci fúzního produktu. Dále je zde úsek f1 ori, který po infekci fágem zajišťuje syntézu jednořetězcové DNA shodné s kódujícím řetězcem, která je vhodná pro jednořetězcové sekvenování.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Z obr. 4.14 je zřejmé, že pasmid pET22b je konstruován tak, aby bylo možno klonovat sledovaný gen ve fázi se sekvencí kódující hexahistidinovou kotvu pro následnou purifikaci genového produktu.

Obr. 4.14: Vektor pET-22. Převzato ze stránek společnosti Novagen.

Vektor λgt11 je založen na fágu lambda. Obsahuje gen pro β-galaktozidázu E. coli, včetně kontrolních sekvencí pro jeho expresi. V části kódující počátek tohoto proteinu je jediné restrikční místo EcoRI, do něhož lze vložit heterologní DNA. Pokud je inzert vložen ve správném čtecím rámci, vznikne proteinová chiméra (obr. 4.15) – produkt fúze klonovaného genu a genu pro β-galaktozidázu. Exprimovaný protein lze detekovat protilátkou.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Obr. 4.15: Proteinová chiméra vzniklá expresí z vektoru λgt11 EcoR I

promotor β-galaktozidáza

inzert

promotor β-galaktozidáza

inzert

AUG

mRNA

fúzní protein

Bakteriofágové vektory: Vektory na bázi plasmidů mají několik omezení. Jsou relativně malé, a proto mohou nést jen malé inzerty. Při inkorporaci delšího úseku DNA vznikne nestabilní produkt, který má tendenci se rozpadat na malé fragmenty. Proto se plasmidy nehodí např. jako vektory pro zacházení s lidským genomem. Některé nevýhody plasmidových vektorů překonávají vektory na bázi bakteriofágů, tzv. fágové vektory. Nejčastěji se fágové vektory odvozují od bakteriofága λ. Bakteriofág λ replikuje svůj genom v hostitelské buňce dvěma způsoby: 1) První způsob začíná přichycením fága na bakteriální buňku, po kterém následuje injekce fágové DNA dovnitř buňky a dochází k replikaci jeho DNA za využití replikačního aparátu hostitele. Replikovaná DNA se pak obalí kapsidovými proteiny, dojde k destrukci hostitelské buňky a uvolnění nových fágových částic do vnějšího prostředí. Tomuto způsobu množení fága říkáme lytický cyklus. 2) Druhý způsob začíná stejně, ale namísto replikace a tvorby nových virových částic se fágová DNA začlení místně-specifickou rekombinací do bakteriální DNA. Stává se tzv. profágem. Hostitelská buňka v tomto případě nezaniká, ale žije dál a množí se, čímž současně množí i fágovou DNA. Proces začlenění fágové DNA do hostitelského genomu a jeho replikaci ve formě profága označujeme jako lyzogenizaci. Změnou podmínek může dojít k opětovnému vyčlenění profága a spuštění lytického cyklu. Vektory odvozené od bakteriofága λ jsou oproti divokému typu modifikovány. Mají neesenciální část genomu odstraněnu nebo nahrazenu úsekem DNA, který je ve vhodném okamžiku nahrazen klonovaným úsekem. Délka úseku, který je možno u fága nahradit, představuje jeho klonovací kapacitu fága, ta se pohybuje mezi 10-23 kbp. Další modifikace spočívají ve změně počtu a uspořádání

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii restrikčních míst, případně přidání reportérových genů. Po otevření fágové DNA v restrikčním místě je do tohoto vložen klonovaný úsek, podobně jako se to děje v případě plasmidových vektorů. Kromě toho lze vzniklou rekombinantní DNA opatřit proteinovým obalem z proteinů kapsidy (tzv. sbalování in vitro - in vitro packaging), takže se DNA dostane do recipientní buňky přímo standardní fágovou injekcí. V tomto případě není třeba provádět transformaci, čímž se zvýší účinnost celého procesu. Jiným typem, často používam, jsou vektory odvozené od vláknitého bakteriofága M13, který obsahuje v některých fázích svého replikačního cyklu jednořetězcovou ssDNA. Výhodou těchto vektorů je to, že umožňují získat jak dsDNA pro restrikční štěpení a klonování, tak ssDNA formy vhodné pro sekvenování či řízenou mutagenezi. Při klonování DNA fragmentů do těchto vektorů se pracuje s dsDNA. Uvnitř buněk E. coli je replikativní dsDNA vláknitých bakteriofágů replikována za vzniku jak dsDNA, tak ssDNA, vzniklé podle jednoho matricového řetězce. Jednořetězcové ssDNA jsou inkorporovány do bakteriofágových částic a opouštějí buňky (pokud je nelyzují). Centrifugací kultury infikovaných buněk lze tedy získat supematant s bakteriofágy obsahujícími pouze jeden řetězec DNA. Mezi běžně používané vektory založené na bázi vláknitých bakteriofágů patří např. M13mpI8, což je genom bakteriofága M13, do nějž byl naklonován gen lacZ-α s polyklonovacím místem pro vložení inzertu. V tomto případě je možné monitorovat inzerční inaktivaci genu pomocí reakce s chromogenním substrátem X-gal, jak bylo popsáno v kapitole 4.1.5. Jedním z problémů při používání vektorů tohoto typu je skutečnost, že se dsDNA získává z infikovaných buněk, které nelze žádným vhodným způsobem selektovat. Druhým problémem je to, že pokud obsahují inzert delší než několik set nukleotidů, dochází při růstu na E. coli k selekci tzv. delečních mutantů. Důvodem je pravděpodobně skutečnost, že buňky infikované fágem s delším genomem rostou pomaleji než kratší, deleční mutanty. Deleční mutanty mají tedy růstovou výhodu.

Kosmidy: Kosmidy jsou umělé konstrukty plasmidů a fága. Kosmidy byly zkonstruovány ke konci 70. let 20. století. Od té doby byl původní konstrukt několikrát vylepšen. Základ kosmidů tvoří plasmidové DNA, obsahující prokaryotický počátek replikace oriV, selekční znak a klonovací místo. Tato DNA nese na svých koncích tzv. sekvence cos původem z bakteriofága λ, které jsou rozpoznávány mechanismy, jež se podílejí na tvorbě proteinové kapsidy fága. Jakmile je do kosmidu vložen nový úsek DNA, je tato rekombinantní DNA opatřena proteinovým obalem a může být vnesena do buňky, kde se chová jako běžný plasmid. Důsledkem replikace kosmidu je lyze buňky a uvolnění částic, které mají zase charakter fága. Klonovací kapacita kosmidů se pohybuje kolem 40-45 kbp. Díky možnosti vstoupit do buňky jako fág je u kosmidů vyřešen problém s transformací velkých molekul, problém nestability ale zůstává. Existují už i binární kosmidy (shuttle cosmids), které jsou replikovány jak v prokaryotické, tak savčí buňce, protože nesou počátek replikace oriV savčího viru SV40 a selekční znak pro savčí buňky.


4.4.2. Charakteristika expresních systémů Escherichia coli Expresní systémy využívající bakteriální buňku E. coli jsou stále nejpoužívanějšími producenty terapeutických proteinů. Je to tyčinkovitá, gramnegativní bakterie, obsahující kružnicový chromozóm o velikosti přibližně 3 x 106 bp. Při růstu v bohatých médiích při 37°C za intenzivního třepání má v exponenciální fázi růstu generační dobu asi 20 minut. Ve stacionární fázi pak dosahuje nárůstu do koncentrace 2 x 109 buněk/ml. Roste však dobře i na minimálních půdách s glukózou jako jediným zdrojem uhlíku a energie. Pro účely klonování byly připraveny mutanty, které mají nefunkční geny pro restrikční endonukleázy. Takové kmeny neničí rekombinantní DNA, která je v nich naopak vysoce stabilní. Dalším z inaktivovaných genů je recA, který zabezpečuje homologní rekombinaci; díky tomu nedochází k porušení integrity klonované DNA. Hostitelské buňky určené pro transformaci bakteriofágy jsou dále selektovány na mutace potlačující některé funkce bakteriofágů, např. lyzi membrány. Při výběru vhodného kmene je rozhodující účel, ke kterému má být hostitel určen, hlavně to, jestli má být použit jen k namnožení DNA nebo i k expresi klonovaného genu. V současné době je na trhu tak široké spektrum kmenů s různými vlastnostmi, že i nejnáročnější požadavky genového inženýra jsou zpravidla uspokojeny. Pro demonstraci uvádíme bližší charakteristiku tří vybraných kmenů. Příklady hostitelských buněk E. coli. Jeden z nejběžněji používaných bakteriálních kmenů E. coli DH5α (genotyp: fhuA2 Δ(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 Φ80 Δ(lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17) byl popsán v práci Taylor RG et al. (1993): E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing. Nucleic Acids Res 21: 1677-1678. Tento kmen je transformován s vysokou účinností. Podobně jako mnoho jiných kmenů určených pro klonování, i tento má několik specifických vlastností, které ho dělají vhodným příjemcem rekombinantní DNA. Mutace v genu endA1 inaktivuje vnitrobuněčnou endonukleázu, která je zodpovědná za degradaci plasmidové DNA při její izolaci. Mutace hsdR17 má za následek eliminaci restriktázy EcoKI restrikčně-modifikačního systému. Pokud DNA nemá metylované místo pro restriktázu EcoKI, pak ji kmen DH5α nebude degradovat. Alela Δ(lacZ)M15 je nezbytná pro tzv. modro-bílý screening, respektive pro komplementaci genu lacZ, který je nesen mnoha různými vektory. Gen recA zabraňuje homologické rekombinaci; to má za následek sníženou tvorbu delecí a nižší podíl multimerních plasmidových molekul. Označení genu glnV44 je systematický název amber supresoru SupE44. -

-

-

Bakteriální kmen E. coli BL21 (genotyp: F dcm ompT hsdS(rB mB )gal). Tento kmen nemá funkční Ion proteázu ani ompT proteázu vnější membrány, což jsou enzymy, které degradují rekombinantní proteiny během purifikace. Jeho deriváty E. coli BL21(DE3) (genotyp: F dcm ompT hsdS(rB mB )gal λ(DE3)) a E. coli R BL21(DE3)pLysS (genotyp: F dcm ompT hsdS(rB mB )gal λ(DE3)[pLysS Cam ]) jsou vhodné pro expresi toxických proteinů. Kmen E. coli TOP10F´ nese plasmid F v epizomálním stavu, tedy začleněný do chromozómu; odtud pochází označení F´. Na plasmidu je umístěn gen rezistence k tetracyklinu. Tento kmen umožňuje produkci q ssDNA z vektorů, které mají počátek replikace z fága f1. Kromě toho nese F´ represor lacI , který reprimuje indukovatelné promotory trc, tac a lac. Represor je možno odstranit pomocí IPTG. Selekce transformantů na bázi TOP10F´probíhá pomocí modro/bílého screeningu.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii 4.4.3. Prokaryotické promotory Součástí vektorů, ze kterých jsou exprimovány rekombinantní proteiny jsou silné promotory. Nejčastěji se používají    

promotor genu pro β-galaktozidázu trp promotor (médium bez tryptofanu) promotor PL bakteriofága λ (termolabilní cI represor, indukce změnou teploty) T3, T7, SP6 promotory bakteriofágů

Charakteristiky některých promotorů byly uvedeny už v kapitole 4.2.1. Pro účely exprese je vhodné se zmínit především o promotoru fága T7. Tento promotor není rozpoznáván RNA polymerázou E. coli, a proto je vhodný pro klonování takových genů, jejichž produkt je pro hostitelskou buňku nějakým způsobem toxický (např. transkripční faktory). Geny umístěné za tímto promotorem nejsou v E. coli exprimovány, pokud k tomu není buňka aktivována nějakým stimulem. To umožňuje v podmínkách, kdy není promotor aktivovaný, získat populaci buněk o vysoké koncentraci, tedy obsahující velké množství kopií příslušného genu. Poté je promotor indukován a populace buněk, předtím než uhyne, zajistí produkci vysokého množství molekul příslušného rekombinantního proteinu. Expresní systém E. coli využívající teplotní indukci. V tomto expresním systému na bázi hostitelského kmene E. coli B jsou geny klonovány za promotor pL, který je blokován působením represoru cI857. Tento represor je termolabilní, funguje pouze při teplotách pod 37°C, k jeho inhibici dochází při 42°C. Exprese rekombinantních proteinů v tomto systému probíhá tak, že se buněčná kultura nechá narůst při 30°C, pak dojde ke krátkodobé inkubaci při 42°C při níž se inaktivuje represor a dojde k indukci exprese z promotoru pL. Výsledkem je produkce velkého množství rekombinantního proteinu. Kultivací při nízké teplotě je taky možno zablokovat expresi produktu, který by byl pro buňku toxický.

Expresní systém E. coli využívající jako induktor IPTG. Na tomto principu funguje např. exprese v hostitelských kmenech E. coli XL1-Blue, JM101, TOP10 nebo BL21/λDE3. Exprese rekombinantních proteinů probíhá pod promotorem lac/tac, jako represor působí lacIq. Funkce represoru je inhibována působením IPTG jako induktoru. Systém není závislý na teplotě, buňky jsou kultivovány při teplotách 30°C nebo 37°C, rovněž indukce může být navozena při těchto teplotách.

Expresní systém E. coli využívající T7 RNA polymerázu. Tento expresní systém je typický např. pro hostitelský kmen E. coli BL21/λDE3. Promotorem je zde fágový promotor pro RNA polymerázu T7, jako induktor slouží IPTG a indukce exprese je nezávislá na teplotě.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii 4.4.4. Reportérové geny Reportérové geny slouží k detekci exprese prostřednictvím výrazných signálů získaných po působení proteinu (reportérového proteinu), který je reportérovým genem kódován. Množství syntetizovaného reportérového proteinu je úměrné síle promotoru za určitých fyziologických podmínek. Jako reportérové geny se využívají takové jejichž produkty neovlivňují samotnou fyziologii buňky.

Chloramfenikolacetyltransferáza (CAT) Tento enzym katalyzuje přenos acetylové skupiny z acetylkonezymu A na chloramfenikol. Jedná se o bakteriální protein, který za přirozených podmínek není v eukaryotických buňkách exprimován. Jeho použití je ale vázáno na radioaktivní substrát (14C značený chloramfenikol), metoda je časově náročná a systémy využívající CAT mají ve srovnání s luminiscenčními metodami nižší citlivost. Navíc je CAT v buňkách velmi stabilní, což může být při studiích indukce nevýhodou neboť přítomnost reportérového proteinu může maskovat vliv efektoru. Transkripce CAT je měřena v buněčných lyzátech jako množství acetylovaného chloramfenikolu. Acetylovanou a neacetylovanou formu chloramfenikolu. Pro lepší kvantifikaci lze skvrny odpovídající mono- a diacetylované formě chloramfenikolu seškrábnout, a radioaktivitu změřit metodou kapalné scintilace.

Luciferáza Luciferáza je enzym ze světlušky Photinus pyralis kódovaný genem luc. Je to první neizotopový reportérový systém pro živočišné buňky. Jako substrát pro luciferázu slouží luciferin, ATP, ionty Mg2+ a molekulární kyslík. Rozklad luciferinu luciferázou má za následek krátkou emisi světelného signálu, který lze detekovat luminometrem.

beta-galaktozidáza Beta-galaktozidáza je kódována genem lac-Z E. coli. Tento enzym katalyzuje hydrolýzu různých β-galaktosidů a to i takových, které byly připraveny synteticky a umožňují snadnou detekci. Jedním z nich je chromogenní 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopyranozid (Xgal). Chemiluminiscenční substráty tohoto typu značně zvyšují citlivost stanovení aktivity β-galaktozidázy. Kromě využití pro zjištění aktivity různých regulačních sekvencí, se v kombinaci s konstitutivním promotorem používá jako interní standard pro normalizaci ostatních reportérových systémů.

Secernované reportérové proteiny Do této kategorie patří např. secernovaná alkalická fosfatáza nebo lidský růstový hormon. Hladiny secerovaných proteinů lze zjistit z kultivačního média, není třeba lyzovat buňky. Tak lze snadno sledovat kinetiku exprese ve frakcích odebíraných v čase. Secernovaná alkalická fosfatáza je jako reportérový protein kodovaná zkrácenou formou genu, postrádá doménu pro zakotvení v membráně, a je tedy exportována jako rozpustný protein ven

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii z buněk. Tento enzym je vysoce termostabilní a je také rezistentní k inhibitoru fosfatáz. Jiné fosfatázy tak mohou být „odstíněny“, pokud detekční reakce secernované alkalické fosfatázy probíhá při 65°C a za přítomnosti inhibitoru. Stanovení se provádí na chromogenním substrátu, metoda je jednoduchá, rychlá a levná. Bioluminiscenčním substrátem lze zvýšit citlivost stanovení. Lidský růstový hormon poskytuje jako reportérový protein podobné výhody jako secernovaná alkalická fosfatáza. Jeho stanovení je prováděno radioimunometodou, je méně citlivé a je k němu zapotřebí protilátka značená radioaktivním jódem 125I. Používá se jako interní kontrola účinnosti transfekce.

beta-glukuronidáza Gen pro bakteriální β-glukuronidázu se používá jako reportérový především u genových manipulací rostlin, ale i v genovém inženýrství živočišných buněk. Nejvhodnější je jeho využití u vyšších rostlin, které nemají endogenní β-glukuronidázovou aktivitu. Vyšší rostliny transformované genem pro β-glukuronidázu jsou zdravé a normálně rostou. Pro stanovení aktivity enzymu je dostupné velké množství substrátů. Jedním ze substrátů je 5-bromo-4-chloro-1H-indol-3-yl β-D-glukopyranosiduronová kyselina (XGluc), která se používá i pro histochemické barvení tkání a buněk exprimujících β-glukuronidázu. O dva řády citlivější metoda využívá luminiscenční substráty.

Zelený fluoreskující protein (GFP - Green tluorescent protein) Světlo produkované některými medúzami vzniká přenosem energie na zelené fluorescenční proteiny. Např. GFP z Aequorea victoria fluoreskuje po přijetí energie z fotoproteinu aequorinu aktivovaného ionty Ca2+. Tento proces probíhá přímým přenosem energie mezi těmito dvěma proteiny bez požadavků na další substrát, kofaktory a zdroj energie. GFP produkovaný jak v prokaryotických tak eukaryotických buňkách, poskytuje zelenou fluorescenci po excitaci modrým nebo ultrafialovým světlem, přičemž nevyžaduje další genové produkty z A. victoria. V současnosti jsou k disposici různé varianty GFP umožňující různě citlivou detekci při posunutých emisních vlnových délkách. Podobně už byly připraveny i reportérové geny na bázi červeného fluoreskujícího proteinu (red fluorescent protein) z korálu Acropora millepora. Modifikace ve struktuře chromoforu (který je součástí struktury fluoreskujícího proteinu) umožnily vývoj reportérových proteinů, které poskytují celé barevné spektrum, tedy nejen červený nebo zelený, ale i modrý, žlutý signál a jejich různé odstíny. Bakteriální geny pro fluoreskující proteiny jsou využívány pro přípravu reportérových proteinů, které „svítí“ v infračervené oblasti.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii 4.4.5. Základní parametry exprese v bakteriích Escherichia coli Pro expresi v bakteriích Escherichia coli obecně platí, že v nich lze exprimovat    

proteiny větší než malé proteiny menší než velké proteiny, které nejsou příliš hydrofobní proteiny, které neobsahují příliš mnoho cysteinů

Ideální protein snadno exprimovaný v E. coli     

je tvořen jedním polypeptidovým řetězcem není nutně glykosylován jeho velikost je < 50kDa je produkován v rozpustné cytosolické frakci je produkován do inkluzních tělísek s vysokou možností opětovného sbalení (refolding)

V případě Escherichia coli je možné expresi rekombinantního proteinu zacílit do tří oblastí: do intracelulárního prostoru, do periplasmatického prostoru a mimo samotnou buňku do vnějšího prostředí. Pro expresi přímo do intracelulárního prostoru se hodí exprimovat přirozeně intracelulární proteiny, ale také proteiny, které by v přirozeném prostředí byly secernovány do vnějšího prostředí. Při extracelulární expresi je třeba rekombinantní protein opatřit signálním peptidem. Signální peptid může být součástí kódující sekvence genu pro extracelulární protein nebo může být dodán jako fúzní partner z vektoru, to v případě přirozeně intracelulárních proteinů. V periplasmatickém prostoru lze s úspěchem exprimovat takové proteiny, které by v redukujícím prostředí buněčné cytoplasmy nemohly vytvářet disulfidické (S-S) můstky. To je případ farmaceuticky významného produktu, inzulínu, který v cytoplasmě bakterií nedokáže (z důvodu přítomnosti S-S můstků) vytvořit správnou konformaci a pokud má být produkován v E. coli, je třeba jeho expresi zacílit do periplasmy, která je prostředím oxidativním.

K výhodám exprese proteinů v E. coli patří především  vysoké výtěžky rekombinantního produktu, které mohou dosáhnout až 40% celkového obsahu buněčných proteinů  obecně levná produkce  a skutečnost, že rekombinantní proteiny lze relativně snadno purifikovat tak, aby byly vhodné pro další použití

Expresní systémy na bázi E. coli jsou nevhodné pro expresi glykosylovaných proteinů, protože tato bakterie nemá glykosylační aparát. Co se týče ostatních „skupin“ proteinů, byly v průběhu let vysledovány následující skutečnosti: 1) Secernované proteiny jsou exprimovány v periplasmatickém prostoru, výtěžek činí méně než 0,5g na litr biomasy a tvoří 0,3 až 4% celkového buněčného proteinu. 2) Intracelulární proteiny exprimované jako rozpustné je možné exprimovat v množství 0,5-5g/l biomasy v podílu 5-25% celkového buněčného proteinu.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii 3)

Intracelulární proteiny exprimované ve formě inkluzních tělísek je možné exprimovat rovněž v množství 0,5-5g/l biomasy a v podílu 5-25% celkového buněčného proteinu. Jedná se o velmi častý případ. 4) Fúzní proteiny jsou nejčastěji exprimovány v množstvích 1-3 g/l biomasy a tvoří 5-25% celkového buněčného proteinu. 5) Membránové proteiny (nejčastěji eukaryotické) lze produkovat v množstvích menších než 1g na litr biomasy a představují méně než 5% celkového buněčného proteinu. Jedním z „nechtěných“ produktů exprese v E. coli jsou tzv. inkluzní tělíska. Jedná se o nerozpustné nefunkční komplexy polypeptidových řetězců, které vznikají v důsledku extrémně účinné exprese proteinů v bakteriálních expresních systémech a také kvůli nedostatečným sbalovacím mechanismům. Protein exprimovaný v konečném důsledku jako inkluzní tělíska je dále nepoužitelný. Vznik inkluzních tělísek je daní za snahu genových inženýrů zajistit co nejvyšší produkci rekombinantních proteinů. Někdy je tedy vhodné naopak intenzitu exprese raději snížit, získat menší množství proteinu, který je ale správně sbalený a má tedy správnou konformaci. Ačkoli je vznik inkluzních tělísek obecně jev nežádoucí, může být naopak někdy využit pro usnadnění purifikace produktu. Inkluzní tělíska totiž tvoří v buňce poměrně kompaktní, snadno purifikovatelnou hmotu. Kromě toho jsou proteiny nahloučené v inkluzních tělískách odolné vůči proteázám. Z inkluzních tělísek je možné získat funkční, správně sbalené proteiny, i dodatečně – po rozpuštění inkluzí a umožnění správného znovu sbalení (refolding) v podmínkách nízko koncentrovaných roztoků proteinů. O mechanismech správného sbalování jsme hovořili v kapitole 2. Na rozpustnosti proteinů se podílí celá řada faktorů. Podíl správně sbaleného proteinu lze zvýšit například expresí při nižší teplotě. Nižší teplota znamená nižší rychlost metabolických procesů a tím i zpravidla nižší hladinu exprese. Zjednodušeně řečeno, při menším počtu molekul vznikajících v dané časové jednotce mají jednotlivé molekuly více času získat správnou trojrozměrnou strukturu. Jinou možností je, jak získat správnou konformaci proteinu, je periplasmatická exprese, která zlepšuje, jak už bylo uvedeno, sbalování proteinů s disulfidickými můstky. Řada fúzních partnerů jsou vysoce rozpustné proteiny, které zlepší rozpustnost celého fúzního proteinu. Takovými partnery jsou například thioredoxin, glutation-S-transferáza nebo HisTag. Naopak intracelulární fúze obecně rozpustnost snižují. Test rozpustnosti intracelulárního proteinu. O tom, jaký podíl tvoří rozpustný, tedy správně sbalený, protein, se můžeme přesvědčit jednoduchým testem. Po provedení exprese intracelulárního proteinu získáme narostlou bakteriální kulturu, ze které izolujeme biomasu například centrifugací nebo filtrací (kapitola 5). Biomasu dezintegrujeme mechanicky nebo chemicky (French press, ultrazvuk, lysozym). Získaný buněčný extrakt pak centrifugujeme při 15 000g po dobu 30min. Supernatant tvoří rozpustné proteiny, v sedimentu jsou inkluzní tělíska. Inkluzní tělíska pak opracujeme některým z denaturačních činidel a získáme denaturované proteiny. Výskyt a zastoupení rekombinantního proteinu pak stanovíme v supernatantu nebo v denaturované frakci.


4.5. Kvasinkové expresní systémy Kvasinky jsou nejjednodušším eukaryotickým expresním systémem, proto se dá očekávat, že eukaryotické (zpravidla lidské) proteiny v nich produkované budou svými vlastnostmi bližší nativním lidským proteinům. Hlavní výhodou je samozřejmě schopnost kvasinek provádět stejné posttranskripční úpravy a podobné postranslační modifikace jako savčí, a především lidské, buňky. Vedle toho je možno s kvasinkami manipulovat stejně snadno a podobnými technikami jako s buňkami bakteriálními. Proto jsou expresní systémy založené na kvasinkových buňkách velmi často využívané a oblíbené. Optimálně jsou v kvasinkách exprimovány intracelulární proteiny o molekulové hmotnosti větší než 8 000 nebo secernované proteiny o M = 8 000 až 50 000. Nejčastější používanou kvasinkou je Saccharomyces cerevisiae, ale zejména pro terapeutické proteiny je vhodná kvasinka Pichia pastoris. K základním výhodám expresních systémů založených na P. pastoris patří  schopnost produkovat rekombinantní proteiny jak intracelulárně, tak extracelulárně, a to ve vysokých koncentracích, které se často pohybují v řádech g/l  posttranslační modifikace se podobají těmto modifikacím u vyšších eukaryot, a to jak N-glykosylace, tak O-glykosylace; glykoproteiny se potom podobají glykoproteinům vyšších eukaryot  schopnost tvořit disulfidické můstky  to, že kvasinka roste na levných médiích

4.5.1. Vektory kvasinek Kvasinkové vektory mohou být replikativní nebo integrativní. Replikativní vektory jsou schopny, jak název napovídá, samostatné replikace uvnitř buňky. Tato replikace může, ale nemusí být vázána na replikaci chromozómů. Transformace replikativními vektory probíhá snadno s vysokou frekvencí, vnesená molekula se liší od přirozených chromozómů, protože vektor je plasmid, který je kružnicový a malý, kdežto chromozómy jsou lineární a velké. Replikativní vektory jsou molekuly bez centromér, jsou tedy v průběhu mitózy a meiózy nestabilní a vyskytují se v dceřiných buňkách v různém počtu kopií. Integrativní vektory se v buňce kvasinky nedokáží replikovat a pokud „chtějí přežít“, musí se začlenit do chromozómu hostitelské buňky. Po integraci se vektor, a části DNA, které nese, stávají stabilní součástí genomu a dědí se stejně jako chromozómy. Počet molekul takového vektoru v buňce je ale závislý na počtu integrací, kterých v počáteční fázi transformace dosáhl. Vektory kvasinek lze rozdělit podle mechanismu jejich replikace v buňce do 5 hlavních skupin: YIp, YRp, YCp, YEp a YLp. S výjimkou YLp se mohou všechny replikovat jak v kvasinkách, tak i v E. coli, a proto jsou označovány jako pendlující (podvojné, binární) vektory. Pendlující plasmidy obsahují dva typy selekčním znaků, gen pro rezistenci k antibiotikům a gen kvasinkový. Oba typy genů se chovají dominantně. V případě genu pro rezistenci k antibiotiku recipientní buňka (v tomto případě bakteriální) gen pro rezistenci k tomuto antibiotiku nemá. V případě kvasinkového genu je tento kopií genu chromozomálního, který však nese v recipientním kvasinkovém kmeni recesívní mutaci. Většinou tyto klonované kvasinkové geny kódují enzymy biosyntetických drah a jsou dokonce schopny doplnit určité mutace v podobných biosyntetických drahách u bakterie. Například kvasinkový gen Ura3 může doplnit Ura3- mutaci v kvasince, stejně jako mutaci genu pyrF u Escherichia coli. Kromě

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii selekčních znaků musí binární vektor obsahovat dva počátky replikace (výjimkou jsou integrativní vektory) a pochopitelně místo, do kterého je začleněna rekombinantní DNA. Selekční znaky pro kvasinkové vektory jsou zpravidla založeny na použití buněk nesoucích recesivní mutace, které umožňují komplementaci. Příkladem může být auxotrofní kvasinkový kmen, který vyžaduje uracil. Tento kmen není schopen růst na minimálním médiu postrádajícím tuto bázi v důsledku mutace genu, který kóduje určitý enzym biosyntetické dráhy pro uracil. Transformujeme-li však buňky plasmidem nesoucím neporušenou alelu tohoto genu vrátíme buňkám schopnost růst na minimálním médiu (v nepřítomnosti uracilu). Z tohoto důvodu jsou kvasinkové markery (na rozdíl od většiny bakteriálních) vázány na použití vhodného kmene pro selekci. Existují také dominantní selekční markery jak pro diploidní tak pro polyploidní kmeny, například CAT (CmR), HYG (hygromycin B fosfotransferáza), NEO/G418- rezistence (Tn903-aminoglykozidfosfotransferáza), bakteriální DHF reduktáza (v přítomnosti methotrexátu za absence thyminu) a copperthionein (v přítomnosti CU2+ iontů). Plasmidy YIp (yeast integrating plasmids), obr. 4.16. Tento typ plasmidů obsahuje selektovatelné kvasinkové geny, ale ztratil sekvence umožňující autonomní replikaci plasmidu v kvasinkách. Začleňují se do chromozómu rekombinací mezi kvasinkovými sekvencemi nesenými na plasmidu a homologickými sekvencemi v genomu kvasinky. Tato rekombinace má za následek tandemovou duplikaci kvasinkových sekvencí a způsobuje i začlenění zbytku plasmidu, jestliže plasmid obsahuje nekompletní část klonovaného genu. Plasmid může být použit pro vytvoření přerušení genu (genová disrupce). K reverzím do původního stavu dochází v nízké frekvenci 0,1-1,0% na generaci. Reverzí se v tomto případě rozumí excize integrovaného plasmidu, ke které dojde rekombinací mezi duplikovanými kvasinkovými sekvencemi. Frekvence transformace plasmidem typu YIp je jen 1-10 transformantů/μg DNA. Může být zvýšena 10-103x po linearizaci plasmidu v té sekvenci, která je homologická s místem na chromozómu kvasinky, místem, do kterého se má integrovat.

Obr. 4.16: Příklad vektoru YIp Vektor YIp5 byl připraven tak, že 1,1 kbp HindIII fragment genu URA 3 ze Saccharomyces cerevisiae byl naklonován do místa AvaI plasmidu pBR322.


Plasmidy YRp (yeast replicating plasmids), obr. 4.17. Tyto plasmidy obsahují sekvence genomu kvasinek, které nesou schopnost autonomní replikace. Tyto tzv. autonomní replikační sekvence (ARS, autonomous replicating sequences) představují vlastně počátky replikace chromozómu. Frekvence transformace těmito vektory je sice vysoká, a to 103 až 104 transformantů/μg DNA, ale transformanti jsou velmi nestabilní. Po mitóze zůstává plasmid zachován pouze u 5 až 10 % buněk. Segregace je jednostranná, tzn. že plasmidy zůstávají v mateřské buňce a nepřenášejí se do buněk dceřiných. Plasmidy jsou v buňce přítomny až ve více než 100 kopiích, průměrný počet kopií je ale 1-10/buňku.

Obr. 4.17: Příklad vektoru YRp Vektor YRp7 byl připraven tak, že 1 453 bp EcoRI fragment obsahující geny TRP 1 a ARS 1 ze Saccharomyces cerevisiae byl naklonován do místa EcoRI plasmidu pBR322.

Plasmidy YEp (yeast episomal plasmids), obr. 4.18. Jsou to, stejně jako dva předchozí typy vektorů, kružnicové molekuly. Obsahují sekvence divokého kvasinkového plasmidu 2μm, které jim zajišťují udržování v extrachromozomálním stavu a vysokou frekvenci transformace, která se pohybuje mezi 104 až 105 transformantů/μg DNA. Jsou velmi stabilní a vyskytují se v počtu 20 až 50 molekul/buňku. Úseky plasmidu 2μm jsou u různých variant vektoru různě dlouhé. U tohoto typu vektorů dochází často k místně specifickým rekombinacím díky přítomnosti obrácených repeticí dlouhých 599 bp, které pocházejí z plasmidu 2μm. Často také tvoří multimerní jednotky.

Obr. 4.18. Příklad vektoru YEp Vektor YEp24 byl připraven tak, že 2,2 kbp EcoRI fragment kvasinkového plasmidu 2μm a 1,1 kbp HindIII fragment genu URA 3 ze Saccharomyces cerevisiae byl naklonován mezi místa EcoRI a HindIII plasmidu pBR322.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Plasmidy YCp (yeast centromeric plasmids), obr. 4.19. Tyto vektory vznikají začleněním segmentů centromer z kvasinkových chromozómů (tzv. CEN elementů) do plasmidů YRp. Tím se extrémně zvýší stabilita plasmidu a plasmidy jsou mezi buňkou mateřskou a dceřinou distribuovány rovnoměrně, při mitóze dochází ke ztrátě s četností 1%. na generaci. V buňkách jsou většinou přítomny v počtu 1-2 kopie a během meiózy se chovají jako chromozómy. Segregují však v poměru 2+ : 2-, tzn., že dvě spory je obsahují a dvě nikoli. Obr. 4.19: Příklad vektoru YCp Vektor YCp50 je derivátem vektorů YIp5 a YCp19. Byl připraven tak, že bylo odstraněno EcoR I místo vektoru YCp19 a fragment PvuIIHindIII (obsahující geny CEN 4 a ARS 1) z tohoto derivátu byl naklonován do místa PvuII plasmidu pYIp5; přitom došlo ke ztrátě místa PvuII.

Plasmidy YLp (yeast linear plasmids), 4.20. Tyto vektory na svých koncích nesou opakované sekvence bohaté na guanin a takové sekvence slouží jako teloméry. Přítomnost telomér umožňuje plasmidům replikaci v lineárním stavu. U kvasinek se teloméry skládají z tandemových repeticí sekvence 5´(dG1-3dT)3´. Velmi krátké plasmidy YLp o velikosti 10-15 kbp, které obsahují sekvenci CEN, jsou nestabilní a vyskytují se v buňce ve velkém počtu kopií. Zvýšením velikosti plasmidu na 50-100 kbp vznikají YLp, které se při mitóze rozcházejí způsobem připomínajícím segregaci chromozómů. Vyskytují se také v počtu 1ks/genom. K jejich ztrátě dochází s četností 10-2 až 10-3/generaci, tzn., že jsou stále ještě 100x méně stabilní než přirozené chromozómy kvasinek. Obr. 4.20: Příklad vektoru YLp


Tab. 4.2: Přehledná tabulka vybraných vlastností vektorů Vlastnost

Vektor Transformantů /μg DNA Autonomní replikace Kopií na buňku Sekvence vektoru Frekvence integrace Esenciální sekvence Ztráty při mitóze (%/generaci) Ztráty při meióze (%/generaci)

Integrace do Genová chromozómu konverze

Replikace epizomální

I 10

I 1

E 10 000

Replikace chromozomální R 10 000

Minichromozóm C 10 000

L 10 000

Ne

Ne

Kružnice

Kružnice

Kružnice

Lineární

1

1

5-40

3-30

1

ANO

NE

ANO

ANO

ANO

1 (5-30) ANO

1

1

variabilní

10-5

10-7

kvasinková DNA 0,1

kvasinková DNA 0

2μm ARS

ARS

ARS, CEN

není známo ARS, TEL

30

30

1

0,1-1

1-10

0

90

90

30

0,1-1

Více si můžete přečíst zde: Kevin Struhl: Maximizing Gene Expression, ed W. Reznikoff and L. Gold, 1986.

Lineární DNA


4.5.2. Základní parametry expresních systémů kvasinek K expresi rekombinantních proteinů v kvasinkách se využívají především Saccharomyces cerevisiae a Pichia pastoris. Nejprostudovanější a nejpoužívanější kvasinkou je bezesporu Saccharomyces cerevisiae, a proto byl tento druh využíván pro produkci rekombinantních proteinů jako první. Výhodou většiny druhů kvasinkových je možnost jejich pěstování jak v haploidním tak v diploidním stavu, což umožňuje jejich křížení vedoucí k získání hybridního potomstva s kombinací genetické výbavy obou rodičovských buněk. Sporulace a analýza výsledných haploidních buněk naopak poskytuje nástroj pro studium rekombinací a genových konverzí. Pěstování kvasinek je snadné a ekonomické. Ve srovnání s tkáňovými buňkami lze použít velmi levná média a jejich generační doba se pohybuje kolem dvou hodin. Přitom kvasinky poskytují celou řadu mechanismů vedoucích k posttrasnslačním úpravám podobným těm v buňkách vyšších eukaryot. Navíc je k dispozici celá řada kvasinkových mutantů, což poskytuje možnost studovat vliv různých enzymů a buněčných faktorů na osud exprimovaných proteinů.

Transkripce u kvasinek Na rozdíl od Escherichia coli, která má jen jednu RNA polymerázu, se u kvasinek Saccharomyces cerevisiae na transkripci genů z jejích 16 chromozómů podílejí, podobně jako u ostatních eukaryot, RNA polymerázy tři. RNA polymeráza I přepisuje jen geny pro rRNA; přitom rRNA představuje asi 70% celkové buněčné RNA. RNA polymeráza III přepisuje geny pro tRNA a gen pro 5S rRNA; tyto druhy RNA představují asi 390% celkové buněčné RNA. RNA polymeráza II přepisuje všechny strukturní geny, kterých je asi 5-10 000; mRNA ovšem představuje jen asi 1% obsahu buněčných RNA. Tak jako u ostatních eukaryot jsou primární transkripty strukturních genů přebudovány do mediátorové RNA postranslačními úpravami, a to připojením čepičky na 5´-konec a polyadenylací na konci 3´. Teprve po těchto úpravách jsou transportovány do cytoplasmy. U genů, které obsahují introny, musí ještě dojít k sestřihu. Kvasinkové mRNA, to jsou, podobně jako mRNA jiných eukaryot, poměrně stabilní molekuly. Průměrný poločas života (rozpadu) je asi 20 minut, což představuje 20% celého buněčného cyklu. Zřejmě nejdůležitějším bodem regulace genové exprese je iniciace transkripce. Předpokládá se, že za normálních růstových podmínek je přepisováno asi 50% genomu. Strukturní geny ovšem nejsou na chromozómu za sebou, ale jsou rozesety po celém genomu. Tomuto pravidlu se vymykají geny, které se účastní utilizace galaktózy (gal7, gal10 a gal1) a geny pro párovací typ (matα1 a matα2). Většina genů je přepisována se stejnou četností, v rovnovážném stavu přibližně 1-2 molekuly na buňku.

Promotory kvasinkových vektorů Ve srovnání s promotory prokaryot jsou promotory kvasinek rozsáhlejší. U všech studovaných promotorů leží důležité sekvence ve vzdálenosti více než 80 bp od počátku transkripce, v některých případech tato vzdálenost činí i přes 450 bp. Mimoto se promotory různých genů značně liší velikostí. Například promotory genů pet56 a matα leží v úseku 100 bp od nukleotidu +1 proti směru transkripce, kdežto promotor genu suc2 se nachází ve vzdálenosti nejméně 450 bp. Naproti tomu

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii všechny promotory Escherichia coli jsou vzdáleny od počátku kódující sekvence méně než 45 bp. Sekvence ležící proti směru transkripce nejsou přímo místy, kam se váže RNA polymeráza II. Části promotorů ležící ve vzdálenosti 15-40 bp proti směru transkripce se u jednotlivých genů značně liší. To znamená, že jsou rozpoznávány různými proteiny a teprve ty pak umožní vazbu RNA polymerázy II. U prokaryot je tato významná sekvence v oblasti -35. Tyto sekvence slouží jako regulační místa. Jsou nezbytná pro regulaci transkripce za specifických fyziologických podmínek. Například sekvence gal1,10 je zodpovědná za vysokou hladinu exprese RNA v médiu, které obsahuje galaktózu, ale ne glukózu. Mnoho genů je však exprimováno na stejné úrovni za všech podmínek. Tzn., že nejsou regulovány a exprimují se konstitutivně. Za takovou konstitutivní expresi jsou zodpovědné sekvence poly(dA-dT). Byly provedeny experimenty, kdy byly sekvence ležící proti směru transkripce převráceny, tzn., že byla změněna jejich orientace vzhledem ke zbytku promotoru. Na hladinu transkripce to však vliv nemělo. Nebyla rovněž ovlivněna regulace těchto promotorů. Tak se zjistilo, že u kvasinek mohou být sekvence promotoru aktivní v obou směrech, a že mohou koordinovaně regulovat dva geny. Příkladem je sekvence gal1,10, která se normálně nachází mezi dvěma geny, které jsou regulovány současně, i když se přepisují každý na jinou stranu. Jinými příklady jsou dvojice genů matα1 a matα2, nebo his3 a pet56. Je nesnadné v těchto případech rozhodnout, zdali jde o 1 sekvenci, která skutečně působí ve dvou směrech nebo o 2 sekvence, z nichž každá působí jen v jednom směru. Experimenty, při kterých byly příslušné sekvence zkráceny a převráceny svědčí ve prospěch modelu dvousměrného působení. Promotory kvasinek působí na dlouhé a různé vzdálenosti, pro jejich funkci není rozhodující velikost oblasti, která se rozkládá mezi promotorem a příslušným genem. To opět znamená, že promotory nejsou rozpoznávány přímo RNA polymerázou II. I když je poloha promotoru značně variabilní, musí v každém případě ležet ve směru proti transkripci genu. Přemístění promotoru do míst v poloze ve směru transkripce má za následek zablokování transkripce. Znamená to, že promotory kvasinek se nechovají jako savčí zesilovače transkripce. Zesilovače transkripce aktivují transkripci i tehdy, jsou-li umístěny do oblasti po směru transkripce. U kvasinek existují sekvence, které mohou zablokovat účinek promotorů. Vyskytují se mezi promotorem a příslušným počátkem transkripce. Součástí kvasinkových promotorů je také sekvence TATA. Její vzdálenost od počátku transkripce je přibližně 60 bp, ale tato poloha je velmi variabilní a může se vyskytovat až ve vzdálenosti 100 bp. U vyšších eukaryot je za to, ze kterého místa začne transkripce, zodpovědný TATA box. U kvasinek naproti tomu existuje tzv. iniciační element, což je sekvence nacházející se po směru od sekvence TATA. Existence iniciačního elementu je hlavním rozdílem mezi promotory kvasinek a vyšších eukaryot. Na iniciační element se váže specifický protein a ten spolu s proteinem, který se váže na sekvenci TATA, umožňuje vazbu RNA polymerázy II. Existence iniciačního elementu vysvětluje, proč u kvasinek nefungují zesilovače transkripce.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii U kvasinek se nejčastěji využívají následující promotory: 1) GAL 1 promotor, který je indukovatelný galaktózou a reprimovatelný glukózou 2) Z konstitutivních promotorů jsou to promotor fosfoglycerát kinázy (pGK), glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenázy (GPD) nebo alkohol dehydrogenázy (ADH1) 3) Promotor pro alkohol dehydrogenázu ADH2 je glukózou reprimovatelný promotor (podobně jako GAL 1, ale není indukovatelný galaktózou), zajišťuje silnou transkripci v přítomnosti nefermentovatelných zdrojů uhlíku 4) CUP 1 promotor metalothioneinového genu, který je indukovatelný měďnatými nebo ionty stříbra, je přítomen až v 8 kopiích 5) Promotor PHO5 je indukovatelný promotor genu kódujícího secernovanou kyselou fosfatázu. Je indukován nízkou koncentrací fosfátu nebo jeho absencí. V tom případě dochází k sekreci fosfatázy, která má zajistit uvolnění fosfátu z vnějších zdrojů.

Regulace genové exprese u kvasinek Většina kvasinkových genů je regulována pozitivně. Sekvence, které se účastní pozitivní regulace transkripce, se nacházejí mimo promotor, protože existuje řada mutací, které omezují bazální hladinu transkripce a přitom nemají vliv na regulační mechanismus a naopak řada mutací eliminuje regulační odpověď a nemění bazální rychlost transkripce. Negativní regulace transkripce u kvasinek byla popsána u genu mat, který je zodpovědný za párovací typ. Tento gen se v genomu nachází ve třech kopiích, z nichž jen jedna je aktivní. Dvě spící kopie mohou být aktivovány po odstranění určitých sekvencí DNA, míst negativní kontroly. Tato místa byla označena jako E-elementy. Jsou umístěna asi 1 000 bp od polohy vlastních genů, které jsou pod jejich kontrolou. To je hlavní rozdíl od negativní regulace u prokaryot, regulační sekvence jsou umístěny daleko od genů, které kontrolují.

Proces transformace Ke genovým manipulacím se častěji využívá tzv. integrativní transformace, tedy případy, kdy se mutovaná forma genu začlení do chromozómu. Zřejmě nejlepší je přesná náhrada divoké formy genu derivátem vytvořeným in vitro. Proces genové náhrady (gene replacement), probíhá dvěma homologickými rekombinacemi (obr. 4.21). V prvním kroku dochází k integraci transformující DNA do chromozómu v místě, kde má nastat genová náhrada. Ve druhém kroku je DNA zase vyčleněna ven. Přitom teoreticky v 50% případů dochází k vyčlenění mutované formy genu a k návratu do původního stavu a v 50% případů k vyčlenění původní alely, tedy k náhradě genu. Při tomto procesu jsou odstraněny všechny nadbytečné sekvence vektorové DNA. Výsledkem je, že mutantní forma genu je v buňce přítomna v jediné kopii a je umístěna ve správném místě.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Obr. 4.21. Schéma genové náhrady na příkladu P. pastoris (převzato z manuálu společnosti Invitrogen)

4.5.3. Expresní systémy na bázi Saccharomyces cerevisiae Vše, co bylo napsáno výše o expresních systémech kvasinek, vychází především ze studia pekařských kvasinek Saccharomyces cerevisiae. Tyto kvasinky mají řadu vlastností, které z nich dělají důležitý nástroj pro přípravu rekombinantních proteinů využitelných ve farmaceutickém průmyslu. Jedná se o buňky, které jsou všeobecně vnímány jako neškodný mikroorganismus využívaný v potravinářském průmyslu, a proto je akceptovatelný i pro farmaceutické aplikace. V kontrastu s tím je třeba zmínit, že buněčná stěna Escherichia coli obsahuje toxické pyrogeny, savčí buňky mohou obsahovat onkogeny nebo virovou DNA, proto je třeba produkty těchto organismů podrobovat rozsáhlým testům. Kvasinky S. cerevisiae rostou rychle na jednoduchých médiích, dosahují vysokých hustot a jejich genetika je probádaná mnohem více než u řady jiných eukaryot, lze s nimi proto manipulovat podobně jako s E. coli. Protože se jedná o eukaryotický organismus, jsou kvasinky vhodným hostitelským organismem pro produkci secernovaných i rozpustných cytosolických proteinů ve velkých množstvích. Transformaci S. cerevisiae předchází enzymatické odstranění buněčné stěny. Vzniklé sféroplasty snadno přijímají DNA v přítomnosti iontů Ca2+ a polyethylenglykolu. Po transformaci musí následovat regenerace buněčné stěny ve vhodném médiu. Kompetenci lze u kvasinek navodit také působením litných iontů, případně doplněných DMSO. Podobně jako v případě všech ostatních typů buněk lze použít elektroporaci. Někdy v důsledku transformace vznikají mutace jak na chromozómech hostitelských buněk, tak i v transformované DNA. Jedním z dobře popsaných případů je vznik pomalu rostoucích mutantů S. cerevisiae. Především v případě transformace vektory na bázi plasmidu 2μm vznikají transformanti, kteří vykazují velkou variabilitu v hladinách exprese rekombinantních proteinů. Příčinou je zřejmě různý počet kopií vektoru v jednotlivých transformantech díky relaxovanému mechanismu replikace plasmidu 2μm. Proto se doporučuje vyhledat mezi transformanty klon s co

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii nejlepšími produkčními vlastnostmi. Prvními a nejběžněji používanými selekčními znaky (markery) jsou geny LEU2, TRP1, URA3 a HIS3, které jsou zodpovědné za auxotrofii k leucinu, tryptofanu, uracilu a histidinu. Kmeny s tímto fenotypem jsou dnes běžně komerčně dostupné, některé mají upravené nerevertující alely a dávají nízké pozadí při transformaci. Selekce transformantů se provádí na minimálním růstovém médiu, které postrádá příslušnou výživovou složku. Vektory se selekčními znaky TRP1 a URA3 lze selektovat také na polodefinovaných médiích v přítomnosti kyselého hydrolyzátu proteinů (tzv. casaminoacids, které neobsahují tryptofan a uracil). Jednou z variant LEU2 je alela LEU2-d, která má porušený promotor. Exprese z tohoto promotoru je velmi nízká, takže selektované dobré produkční kmeny obsahují vysoký počet kopií plasmidu. Marker LEU2-d je používán ve spojení s dalšími markery, např. URA3. Výsledné producenty lze udržovat ve stavu, kdy obsahují vysoký nebo naopak nízký počet kopií vektoru, a to v závislosti na použitém typu selekce. Existuje také promotor-defektní alela URA3-d, která zajišťuje vysoký počet kopií vektoru v buňce v médiu bez uracilu. Alely URA3 a LYS2 se využívají také jako tzv. znaky pro obrácenou selekci (counter-selection markers). Buňky fenotypu uru3- lze selektovat na rezistenci k toxickému antimetabolitu 5-fluoroorotové kyselině, lys2- na rezistenci k α-aminoadipátu. Tyto metody se používají buďto k selekci mutací u prototrofních kmenů nebo k selekci transformantů, kteří ztratili plasmid.

Princip obrácené selekce. Za vhodných růstových podmínek vyvolá naklonovaný gen (tzv. zabíječský gen) smrt hostitelské buňky. Pokud tedy buňka nese takový gen, pak v přítomnosti specifického substrátu neroste a naopak umožní růst transformovaným jedincům, kteří získali nefunkční alelu zabíječského genu. Obrácená selekce probíhá ve dvou krocích: v prvním jsou buňky transformovány standardní zabíječskou formou genu a jsou kultivovány v neselektivním prostředí (v prostředí, ve kterém zabíječský gen nemůže vyjádřit svoji funkci). Poté jsou transformanti re-transformováni nefunkční kopií genu a kultivováni v médiu, kde se může projevit zabíječský fenotyp. Pokud dojde u re-transformantů k náhradě zabíječské formy genu za nefunkční kopii, pak jejich potomstvo na selektivním médiu přežije, kdežto původní buňky nikoli.

Dominantní selekční znaky. Dominantní selekční znaky rozšiřují spektrum hostitelských kmenů, které lze testovat, a to na prototrofní a průmyslové kmeny S. cerevisiae. Mohou být použity pro selekci v bohatém médiu. Protože je většina kmenů citlivá na aminoglykosidové antibiotikum G418, využívá se právě rezistence ke G418 jako selekční znak. Rezistence ke G418 je kódována transpozonem Tn903 E. coli. Nicméně u tohoto znaku není možná přímá selekce, proto se transformanti nejprve inkubují na neselektivním médiu a teprve potom se vysévají na médium selekční s G418. Jako zdroj uhlíku se v selekčním médiu používá glycerol a ne glukóza, což snižuje podíl netransformovaných G418 rezistentních mutantů, které při selekci spontánně vznikají. Z dalších markerů rezistence, které se využívají v biotechnologii kvasinek, je třeba zmínit hygromycin a chloramfenikol. Rezistence k měďnatým iontům je u kvasinek dána přítomností mnohočetných kopií genu CUP1, který dalším využívaným dominantním selekčním znakem. Většího počtu kopií genu v genomu kvasinky lze dosáhnout použitím vektorů, které se replikují nezávisle na replikaci chromozómu. Podobně je tomu v případě použití genu pro thymidin kinázu viru herpes simplex nebo genu pro dihyrofolát reduktázu.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii U některých kvasinkových systémů se využívá tzv. autoselekce. Je to jev, při kterém jsou vektory udržovány bez ohledu na podmínky kultivace. Autoselekce je založena na skutečnosti, že do vektoru je naklonován gen pro toxin nebo gen imunity. Kvasinky nesoucí plasmid jsou před účinkem produktů těchto genů chráněny, buňky bez vektoru jsou z populace eliminovány. Jiný systém využívá genu pro trióza fosfát izomerázu ze Schizosaccharomyces pombe ke stabilizaci plasmidu v buňkách S. cerevisiae, které tento gen ztratily; růst transformantů probíhá v médiu s glukózou. V S. cerevisiae je možné produkovat rekombinantní proteiny jako secernované. Výtěžky takto exprimovaných proteinů se pohybují pod 0,25g/ l biomasy, podíl na celkovém proteinu je pod 1%. Secernované proteiny bývají zpravidla hypermanosylovány. Jinou možností je exprimovat proteiny intracelulárně jako rozpustné. Výtěžky se v takovém případě pohybují mezi 1-4 g/l biomasy, což je 5-20% celkového buněčného proteinu. Je třeba poznamenat, že i takové proteiny, které jsou v E. coli exprimovaný ve formě inkluzních tělísek, mohou být v kvasinkách rozpustné. Poslední, velmi častou možností je exprimovat proteiny jako intracelulární ve formě inkluzních tělísek, tedy nerozpustné. Výtěžky jsou opět mezi 1-4 g/l biomasy, tedy 5-20% celkového buněčného proteinu. Při produkci rekombinantních proteinů v S. cerevisiae může nastat řada problémů. Jedním z nich jsou posttranslační modifikace např. glykosylace, která je v S. cerevisiae nadměrná, a proto dochází k hyperglykosylaci některých produktů. S cerevisiae se také vyznačuje poměrně nízkou schopností secernovat proteiny. Signální sekvence pro sekreci je velmi často odvozena od feromonu produkovaného buňkami kopulačního typu a (a faktor). Pro potlačení degradace produkovaných proteinů lze použít mutanty s defektními proteázami. Někdy může dojít ke komplikaci také rozdílným využitím kodónů. V tom případě je nutno změnit geny pomocí řízené mutageneze.

4.5.4. Expresní systém Pichia pastoris Pichia pastoris je jednoduchý eukaryotický organismus a jako takový používá řadu mechanismů typických pro expresní systémy vyšších eukaryot, např. úpravy proteinů, sbalování proteinů a posttranslační modifikace. Naproti tomu je ale snadno manipulovatelná, podobně jako bakterie Escherichia coli nebo již popsaná kvasinka Saccharomyces cerevisiae. Expresní systémy založené na P. pastoris jsou rychlé, snadno manipulovatelné a levnější než jiné eukaryotické expresní systémy využívající bakulovirů nebo savčích buněk. Rovněž výtěžky proteinů jsou zpravidla vyšší. Obecně se uvádí, že výtěžnost proteinů z P. pastoris je 10-100x vyšší než ze S. cerevisiae. Pichia pastoris je metylotrofní kvasinka, která využívá metanol jako jediný zdroj uhlíku. Prvním krokem metabolismu metanolu je jeho oxidace na formaldehyd pomocí molekulárního kyslíku; jako katalyzátor zde působí alkohol oxidáza. Oxidací metanolu vzniká formaldehyd a peroxid vodíku. Toxickým účinkům peroxidu vodíku je zabráněno oddělením metabolismu metanolu do specializovaných buněčných organel, peroxizómů, kde je odbourán katalázou na kyslík a vodu (obr. 4.22). Alkohol oxidáza má nízkou afinitu k O2 což P. pastoris kompenzuje tvorbou velkých množství tohoto enzymu. Proto byl pro expresní systémy vybrán právě promotor pro alkohol oxidázu.


Příklady kontrolních mechanismů. Kontrola transkripce se děje prostřednictvím proteinů, které se vážou na DNA. Tyto proteiny jsou taky schopné se vázat na signální molekuly, které přinášejí informaci o fyziologickém stavu. Příkladem takového mechanismu je indukce exprese genů gal 7,10,1. Je-li do kultivačního média přidána galaktóza, dochází k indukci transkripce vazbou proteinu Gal 4 do místa, které leží proti směru transkripce genů gal 7,10,1. Signální molekulou je sama galaktóza nebo její derivát. Gal 4 může aktivovat transkripci jen za předpokladu, že je s touto signální molekulou spojen. Gen cyc1 je regulován mechanismem katabolické represe. Při ní je hladina transkripce RNA přibližně 20x vyšší v médiu s laktózou než v médiu s glukózou. Regulace probíhá ve dvou různých oblastech DNA, které mají určitou sekvenční homologii, a které jsou umístěny přibližně 275-210 bp od místa počátku transkripce. V prostředí s laktózou tyto sekvence vyvolávají transkripci genu cyc1. Avšak v prostředí s glukózou probíhá transkripce pod kontrolou místa UAS1 (upstream site); místoUAS2 (downstream site) je méně efektivní. Jako kofaktor je vyžadován hem. Ačkoli jsou obě místa značně homologická, jejich regulační vlastnosti jsou dosti rozdílné. Promotory pro geny his3 a pet56 jsou regulovány konstitutivně. V normálním genomu kvasinek leží oba geny vedle sebe, i když mají odlišné funkce. Jejich transkripce probíhá v opačném směru z iniciačních míst, která jsou oddělena jen 200 bp. Za normálních podmínek jsou oba geny přepisovány na podobné bazální hladině. Ačkoli má každý gen svůj vlastní element TATA, využívají oba oblast polydA:dT dlouhou 20 bp, která se nachází mezi nimi. Tzn., že tento konstitutivní element působí obousměrně a aktivuje transkripci dvou nepříbuzných genů. Podobně jako mnoho dalších genů, jejichž produkty se podílejí na biosyntéze aminokyselin, je transkripce genu his3 indukována za podmínek aminokyselinového hladovění. To je regulováno místem umístěným mezi TATA sekvencemi obou genů. Kupodivu však k transkripci genu pet56 při aminokyselinovém hladovění nedochází. Je to právě proto, že ke spuštění transkripce je zapotřebí TAT sekvence a iniciační element. Na rozdíl od Escherichia coli, kde jsou geny pro jednotlivé biosyntetické dráhy regulovány jednotlivě, dochází u kvasinek ke koordinované syntéze alespoň 30 genů, které se účastní biosyntézy aminokyselin. A to jako odpověď na aminokyselinové hladovění. Tento stav může být navozen různými metabolickými jedy, které inhibují syntézu jedné z aminokyselin. Centrálním faktorem regulačního mechanismu je protein Gcn4, který se váže k promotorům všech koordinovaně regulovaných genů. Rozpoznává sekvenci TGACTC. Na rozdíl od typických eukaryotických genů, které obsahují před iniciačním kodonem AUG krátké vedoucí RNA sekvence, je vedoucí sekvence u gcn4 dlouhá 600 bp. Kromě toho tato vedoucí sekvence obsahuje několik kodonů AUG a to v různých čtecích rámcích. Jak je známo začíná syntéza proteinu na 5´proximálním kodonu AUG (první od 5´-konce) a nemůže být na dalších kodonech AUG znovu iniciována. To znamená, že za normálních okolností nemůže protein Gcn4 vzniknout. Za podmínek aminokyselinového hladovění se však toto pravidlo mění. Co je na tomto způsobu regulace jedinečné, je to, že k regulaci nedochází změnou aktivity proteinu, který se váže k DNA. Změní se množství enzymu, který se k DNA váže. Tento kontrolní mechanismus vysvětluje, jak může být metabolický signál, který se objeví za různých experimentálních podmínek, přenesen na efektorové molekuly, které se přímo účastní regulace transkripce. Ačkoli skutečný signál není znám, je velmi pravděpodobné, že je přímo napojen na proces translace: tímto způsobem hladovění jakoukoli aminokyselinou vyvolá signál.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Obr. 4.22: Metabolismus metanolu u Pichia pastoris cytoplasma metanol alkoholoxidáza

peroxizóm H2O2

formaldehyd

kataláza

dehydrogenázy O2

H2O

HCOOH + CO2

Alkohol oxidázu kódují u P. pastoris dva geny, AOX1 a AOX2. Za většinu alkoholoxidázové aktivity je zodpovědná alkoholoxidáza AOX1. Silný promotor genu AOX1 je indukovatelný metanolem a pokud jsou proteiny exprimovány pod tímto promotorem, pak může jejich množství dosáhnout i více než 30% celkového rozpustného proteinu. Gen AOX2 je homologický s AOX1 z 97%, ale umožňuje kvasinkám růst na metanolu mnohem pomaleji. Kmeny P. pastoris, které nemají funkční kopii genu AOX1 (značí se aox1) se označují jako MutS. Regulace genu AOX1 probíhá dvou krokovým mechanismem: represe/dereprese a indukce (podobně jako v případě genu GAL1 u Saccharomyces). Znamená to, že při růstu na glukóze dochází k represi transkripce genu AOX1 i v přítomnosti metanolu jako induktoru. Pro zajištění optimální exprese se proto doporučuje růst kvasinek v glycerolu. Glycerol zde působí jako derepresor, ale v jeho přítomnosti nedochází k indukci exprese genu AOX1, k tomu je zapotřebí, aby byl v růstovém médiu přítomen metanol. Stručně shrnuto, pro expresi genu AOX1 platí  glukóza = represor  glycerol = derepresor  metanol = induktor Kmeny MutS (methanol utilization slow) jsou ty kmeny, které nemají funkční gen AOX1 a metabolizují metanol jen velmi pomalu. Rostou na něm tedy špatně. Přesto jsou i tyto mutanty k expresi proteinů využívány. V P. pastoris je možné produkovat proteiny jako secernované nebo jako intracelulární. Secernované proteiny produkuje kvasinka s výtěžkem 0,2-4 g/l biomasy, což je asi 0,5-10% celkového buněčného proteinu. Rozpustné intracelulární proteiny jsou získávány v množstvích 0,2-12 g/litr neboli 1-30% celkového buněčného proteinu. Pro sekreci je zapotřebí, aby měl protein signální sekvenci. Signální sekvence může být nativní součástí rekombinantního proteinu nebo lze využít signálních sekvencí kvasinkových secernovaných proteinů. Jedním z takových proteinů je párovací faktor α ze S. cerevisiae nebo signální sekvence z vlastní kyselé fosfatázy. Pro produkci rekombinantních proteinů jako secernovaných hovoří ta skutečnost, že P. pastoris secernuje velmi malé množství vlastních proteinů. Secernovaný rekombinantní protein tak může tvořit dominantní

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii složku celkového secernovaného proteinu v médiu, což lze efektivně využít při purifikaci. Na rozdíl od S. cerevisiae nadměrně neglykosyluje cizorodé proteiny. Má posttranslační modifikace typu N-glykosylace i O-glykosylace, které se podobají modifikacím u lidských proteinů. I proto je P. pastoris systém velmi vhodný k produkci terapeutických proteinů, tedy rekombinantních proteinů pro léčebné účely. Glykosylační místa jsou v sekvencích Asn-X-Ser/Thr. Převažujícím typem je N-glykosylace s vysokým zastoupením manózy. Délka oligosacharidové části je u P. pastoris průměrně 8-14 zbytků, což je kratší než 50-150 zbytků u S. cerevisiae. O-glykosylací je u P. pastoris glykosylovaná jen velmi malá část glykoproteinů. Terminální α-1,3 glykany (pravděpodobný důvod hyper antigenní povahy kvasinkových glykoproteinů u vyšších eukaryot) P. pastoris na rozdíl od S. cerevisiae netvoří. Z hlediska průmyslového využití je výhodou P. pastoris také to, že roste na levných médiích. Při produkci některých heterologních proteinů pomocí P. pastoris dochází k problémům s proteolýzou. Tento negativní efekt je zpravidla možno minimalizovat změnou pH (snížením na 3 nebo naopak zvýšením nad 6), přídavkem směsi aminokyselin a velmi krátkých peptidů získaných kyselou hydrolýzou kaseinu (casaminoacids) nebo albuminu, případně použitím proteázadeficientních mutantů. Pro produkci v P. pastoris se používá více typů vektorů. Dva z mnoha komerčně dostupných jsou vektory pPICZ (obr. 4.23) a pPICZa. První z nich je určen pro intracelulární produkci a druhý pro sekreci (na počátku polylinkeru je sekvence kódující prepro a faktor pro sekreci). Oba jsou dodávány ve třech verzích zajišťující možnost klonování ve fúzi s 6xHis značkou pro afinitní purifikaci ve všech třech čtecích rámcích.

Obr. 4.23. Kvasinkový vektor pPICZ. Převzato z manuálu firmy Invitrogen.

Jako selekční marker se používá zeocin (obr. 4.24). Jedná se o antibiotikum ze skupiny bleomycin/phleomycin, které je účinné na buňky bakteriální, kvasničné i savčí. Zeocin je ve vodě

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii rozpustná látka produkovaná plísní Streptomyces verticillus. Zeocin se váže na DNA a štěpí ji. Je aktivní pouze kolem neutrálniho pH a není účinný ve vysoké koncentraci solí. Gen pro rezistenci kóduje protein, který vazbou na zeocin toto antibiotikum inaktivuje. Pro rekombinaci je plasmid po vložení inzertu linearizován a konce, které jsou komplementární s chromozómovým genem slouží k homologní rekombinaci vedoucí k inzerci do chromozómu.

Obr. 4.24. Struktura zeocinu

Obr. 4.25. Další typy kvasinkových vektorů. Převzato z manuálu firmy Invitrogen. Obecná struktura vektoru


Vektor pHIL-D2 určený k intracelulární expresi nefúzních proteinů, klonování do jedinečného EcoRI místa.

Vektor pHIL-S1 určený k extracelulární expresi fúzních proteinů, klonování do více míst. Sekreční signál PHO1.

Vektor pPIC3.5 určený k intracelulární expresi nefúzních proteinů, klonování do více míst.

Vektor pPIC9 určený k extracelulární expresi fúzních proteinů, klonování do více míst. Sekreční signál α-faktoru.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Jeden z komerčních, běžně používaných expresních systémů P. pastoris využívá dvou kmenů, GS115 a KM71. Oba kmeny jsou mutantní v genu pro histidinol dehydrogenázu (his4). Tato mutace jim brání v syntéze histidinu (jsou tedy His-) a mohou tedy růst pouze na médiu s histidinem. Všechny expresní klonovací vektory nesou standardní funkční kopii HIS4, která nahrazuje his4 hostitelské buňky. Transformanti, nesoucí včleněný gen HIS4, jsou potom detekováni na základě jejich schopnosti růst na minimálním médiu. Divoký kvasinkový kmen KM71 je mutantní také v genu pro arginin-sukcinátlyázu (arg4 ). Tato mutace mu brání v syntéze argininu (je Arg-), musí tedy růst na médiu s argininem. Klonovací vektor byl vytvořen tak, že byl nejdříve z genomu kvasinky Pichia pastoris izolován gen AOX1. Promotor tohoto genu byl klonován do vybraného klonovacího vektoru a za tento promotor byl klonován celý gen AOX1. Do genu AOX1 (naklonovaném v klonovacím vektoru) byl včleněn gen ARG4. Tento konstrukt byl transformován do původního divokého typu kmene KM71 (arg4 his4) a následně byly izolovány a analyzovány Arg+ transformanty (mají fenotyp MutS = methanol utilization slow, utilizují metanol pomalu). Genetická analýza Arg+ transformantů prokázala, že divoký typ genu AOX1 byl nahrazen konstruktem AOX1 :: ARG4. Důvodem, proč je použití kmenu KM71 tak výhodné, je skutečnost, že u vzniklých transformantů není třeba určovat fenotyp na základě růstu na minimálním médiu, protože všichni transformanti mají fenotyp MutS . U kmene GS 115 tyto úpravy provedeny nebyly, a proto mají transformanti, jak bude uvedeno v následujícím odstavci, fenotypový projev MutS nebo Mut+.

Při klonování rekombinantních genů do výše uvedených kmenů P. pastoris mohou vzniknout dva odlišné fenotypy His+ rekombinantů: Mut+ a MutS. Inaktivací AOX1 dojde ke snížení aktivity buněčné alkoholoxidázy a vzniku mutanta, jehož fenotyp je MutS . Ztráta aktivity alkoholoxidázy vede k potlačení schopnosti buněk metabolizovat methanol. Tyto buňky potom velmi špatně rostou na médiu s methanolem. Mut+ (utilizace methanolu pozitivní) je označení pro schopnost divokého typu kmene metabolizovat methanol jako jediný zdroj uhlíku. Transformace kmene GS 115 vede ke vzniku obou typů transformantů ( His+ Mut+ a His+ MutS ). Transformace kmene KM 71 vede pouze k His+ MutS fenotypu, jelikož, jak už bylo uvedeno, je kmen sám o sobě MutS. Oba fenotypy jsou vhodné k produkci rekombinantních proteinů. Protože byla pozorována jistá klonální variabilita, je třeba testovat 6 - 10 rekombinantů každého fenotypu. Neexistuje žádný způsob, jak předem předpovědět, který konstrukt bude žádaný protein nejlépe exprimovat. Doporučuje se také analýza rekombinantních kmenů kvasinky Pichia pastoris, metodou PCR, která potvrdí správnost integrace konstruktu. Zkouška fenotypu kvasinek se provádí inkubací na miskách s minimálním médiem obsahujícím methanol nebo glukózu. Fenotyp Mut+ roste na obou médiích stejně rychle, zatímco MutS roste na minimálním médiu s methanolem mnohem pomaleji, jelikož má porušený gen pro AOX1. Kolonie jsou posuzovány po dvou dnech inkubace při 28°C na miskách s oběma typy minimálního média.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Molekulární mechanismy při vzniku rekombinantních struktur u Pichia pastoris Při začleňování genů do chromozómu kvasinek může docházet k následujícím událostem: 1) K inzerci do genu aox1 nebo konstruktu aox1 :: ARG4 2) K mnohonásobnému včlenění genu do chromozómu 3) K náhradě genu v oblasti aox1 genu (jen u u kmene GS115) Inzerce cizorodého genu do genu aox1 nebo do konstruktu aox1 :: ARG4 K začlenění cizorodého genu dochází na chromozomu kvasinky kmene GS115 do oblasti genu aox1, v případě kmene KM71 do místa konstruktu aox1 :: ARG4. Děje se tak jednoduchým crossingoverem mezi chromozomem kvasinky a jednou ze tří částí genu AOX1na klonovacím vektoru: promotorem AOX1 genu, transkripční terminační oblastí (TT) genu AOX1 nebo se sekvencemi genu AOX1, ležícími ve směru transkripce (3´ konec genu AOX1). Tímto způsobem dochází k začlenění jedné nebo více kopií vektoru (3ÁOX1 koncem vektoru nebo i 5ÁOX1 koncem vektoru). K včlenění 3ÁOX1 koncem vektoru dochází v případě linearizace rekombinantního vektoru v místě, které se nachází v 5ÁOX1 oblasti genu AOX1. K inzerci 5ÁOX1 koncem vektoru dochází tehdy, použije-li se nelinearizovaný plasmid. Na obrázku 4.26 je znázorněn výsledek včlenění plasmidu 3´ koncem do genu aox1 na chromozómu kvasinky a získání expresní kazety, obsahující promotor (PAOX1), cizorodý gen a gen HIS4.

Obr. 4.26. Integrace plasmidu do genu AOX1. Převzato z manuálu firmy Invitrogen.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Mnohonásobné včlenění genu do chromozómu Případ mnohonásobné inzerce genu (obr. 4.27) do jediného místa na chromozomu kvasinky se vyskytuje s jen velmi malou frekvencí (přibližně 1-10% všech vybraných transformantů). Přítomnost mnoha kopií se může objevit v oblasti genu aox1, v místě konstruktu aox1 :: ARG4 a v oblasti genu his4 . Tento případ včlenění genu do genomu kvasinky vede u kmene GS115 k fenotypu Mut+, u kmene KM71 k fenotypu MutS .

Obr. 4.27. Mnohonásobná inzerce genu do chromozómu. Převzato z manuálu firmy Invitrogen.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Náhrada genu v oblasti aox1 genu u kmene GS115 U kvasinkového kmene GS115 dochází k náhradě genu aox1 na genomu kvasinky, a to dvojitým crossing-overem mezi promotorem AOX1 genu, 3´ AOX1 oblastí AOX1 genu na vektoru a oblastí aox1 genu na chromozomu kvasinky (obr. 4.28). Tato inzerce vede k úplnému odstranění kódující sekvence aox1. Výsledný fenotyp je His+ MutS . Výsledkem tohoto typu rekombinace je ztráta sekvence aox1 ( MutS ) a získání expresní kazety, obsahující promotorovou (PAOX1) část, cizorodý gen a HIS4 gen.

Obr. 4.28. Náhrada v genu aox1. Převzato z manuálu firmy Invitrogen.

crossing-over 1

crossing-over 2

4.5.5. Ostatní kvasinkové expresní systémy Mezi další podstatně méně používané kvasinky, patří Hansenula polymorpha. Zde se pro expresi heterologních proteinů používají regulační sekvence (promotor a terminátor) genu MOXl (kódující methanol oxidázu). Dalším druhem je Kluyveromyces lactis, jejíž výhodou je, že roste na levných substrátech. Expresní systém podobný jako P. pastoris má Pichia methanolica, tento systém je ale vhodný jen pro neglykosylované proteiny. Poměrně zřídka se používají k expresi plísně jako Aspergilius nidulans a Thrichoderma reesei. Jimi produkované proteiny jsou vysoce glykosylované, tyto kvasinky secernují lépe než S. cerevisiae. Expresní vektory obsahují promotory glukoamylázy pro expresi v Aspergillus a celobiohydrolázy pro expresi v Trichoderma.


4.6. Expresní systémy na bázi hmyzích buněk Využití hmyzích buněk nebo larev Drosophila melanogaster jako producentů rekombinantních proteinů a bakulovirů jako vektorů představuje bezpečnou technologii, protože bakuloviry mají omezené spektrum hostitelů, a to jen z řad bezobratlých. Tyto systémy jsou vhodné k produkci vysokých hladin rekombinantních proteinů (u intracelulárních až 1 000mg/ml), které jsou správně posttranslačně modifikované (sbalení, tvorba S-S můstků, oligomerizace, glykosylace, acylace, proteolytické štěpení); výsledné rekombinantní proteiny biologicky aktivní a funkční. Rekombinantní proteiny exprimované v hmyzích buňkách jsou většinou rozpustné a snadno se izolují, obsah „kontaminujících“ rodičovských proteinů je nízký, protože exprese probíhá v pozdních fázích infekce. Kromě toho atraktivitu systémů zvyšuje skutečnost, že se hmyzí buňky dobře kultivují v suspenzních kulturách a technologie práce s nimi je snadno převoditelná do biorektorů. Heterooligomerní proteiny lze exprimovat využitím simultánní infekce dvěma nebo více virovými vektory nebo vektorem s více expresními kazetami.

4.6.1. Vektory pro transformaci hmyzích buněk K transformaci hmyzích buněk se používají vektory na bázi tzv. bakuloviru. Jedná se o lytický jaderný virus Autographa californica patřící do čeledi Baculoviridae. Tento velký virus obsahuje dsDNA a je obalený. Jeho životní cyklus se dělí na ranou dřívější, ranou, pozdní a velmi pozdní fázi. Virus vstupuje do hostitelské buňky endocytózou a je transportován až k jaderné membráně, přes kterou uvolní DNA do jádra napadené buňky. Samotná replikace DNA začíná asi 6 hodin po infekci a je následována složením viru v jádře infikované buňky. V průběhu životního cyklu viru se tvoří dva typy virových částic: extracelulární virové částice (neokludované viry), které se tvoří během pozdní fáze a polyhedrinové virové částice (okludované viry) vznikající během velmi pozdní fáze. Extracelulární virové částice se z infikovaných buněk uvolňují pučením asi 12 hodin po infekci a jsou produkovány asi do 20. hodiny po infekci, kdy jejich tvorba klesá. Polyhedrinové virové částice se v jádře infikované buňky začínají objevovat asi 18 hodin po infekci a hromadí se zde až do 72 hodiny po infekci nebo do té doby, než dojde k lyzi buňky. Okludované virové částice jsou v jádře infikované buňky lokalizovány uvnitř proteinové virové okluze (okluzní tělíska), označované jako polyhedra. Hlavní složkou virových okluzních tělísek je polyhedrinový protein (M = 29 000). Tento protein hraje významnou úlohu v přežití a propagaci viru v přírodě. Polyhedrin slouží k ochraně samotných virových částic před proteolytickou aktivací během rozpadu buněk hostitelských. Jakmile jsou virové částice pozřeny novým hostitelem, dojde v alkalickém prostředí střev nového hostitele k rozpuštění polyhedrinu a okludované virové částice se uvolní. Následně pak infikují střevní epitel, kde se replikují a vytvářejí nové neokludované viriony. Ty pak pučí z infikovaných střevních buněk a infikují další buňky. Ačkoliv je polyhedrin nutný pro přežití viru v přírodě, pro přežití a propagaci v buněčné kultuře zapotřebí není. A této skutečnosti využívají genoví inženýři při konstrukci bakulovirových vektorů. Protože je polyhedrin exprimován v pozdní fázi infekčního cyklu viru, tvoří více než polovinu celkového buněčného proteinu. Rekombinantní bakulovirové vektory jsou tedy upraveny tak, že mají gen pro polyhedrin (polh)odstraněn a na jeho místo jsou klonovány cizí geny. Polyhedrinový gen pochopitelně není nutný pro infekci a replikaci. Protože virová částice, která nemá gen pro polyhedrin vykazuje jinou morfologii plaků než je tomu u částic obsahujících tento gen, je možné odlišit

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii rekombinanty na základě rozdílné morfologie plak vizuálně. Samotnému vytvoření rekombinantního viru, který exprimuje příslušný protein předchází klonování genu pro tento protein do tzv. donorového vektoru. Tento vektor je transformován do recipientních buněk spolu s kružnicovou DNA bakuloviru divokého typu. V recipientních buňkách pak dochází k homologní rekombinaci a výměně genu pro polyhedrin za gen z donorového vektoru (obr. 4.29). Výsledný konstrukt pak obsahuje cizí gen klonovaný za silným promotorem pro polyhedrin. Protože je frekvence rekombinace mezi kružnicovou DNA divokého typu viru a přenosovým vektorem velmi nízká (asi 0,1-0,5%), byly zkonstruovány viry, které mají odstraněny esenciální geny pro růst virových částic. Přenosový vektor pak spolu s cizím genem vnáší do recipientní buňky nepoškozené kopie těchto esenciálních genů. Kromě toho je bakulovirová DNA linearizována. Účinnost rekombinace je pak vysoká a spolu se selekcí na růst virových částic se dosahuje vysoké účinnosti transformace. Většina komerčně dostupných bakulovirových vektorů je založena na plasmidu pUC a nese rezistenci k ampicilinu. Dalšími komponentami jsou silný promotor genu pro polyhedrin a klonovací místo pro vložení cizorodého genu. Klonovací místo je ohraničeno virovými sekvencemi, které leží na 5' konci promotoru a na 3' konci vloženého genu. Tyto hraniční sekvence usnadňují homologní rekombinaci mezi vektorem a bakulovirovou DNA. Pro zjednodušení identifikace rekombinantů obsahují komerčně dostupné bakulovirové DNA v polyhedrinovém genu bakteriální gen lacZα. Nerekombinantní viry, které mají aktivní β-galaktozidázu, tvoří na miskách s chromogenním substrátem modré plaky, zatímco rekombinanty, jež tento enzym nemají, vytváří bezbarvé, opaleskující plaky. Princip detekce odpovídá α-komplementaci, která byla popsána v kapitole 4.1.5. Nejčastěji jsou využívány vektory založené na dvou bakulovirech: AcMNPV (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) a BmNPV (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus). Systémy na bázi AcMNPV jsou vhodné pro expresi proteinů jen v buněčných kulturách, pro expresi v larvách jsou vhodné oba typy vektorů. Systémy na bázi AcMNPV mají lepší růstové charakteristiky a exprimují větší množství proteinů. Propagace AcMNPV probíhá v buňkách Spodoptera frugiperda linie SF-21nebo SF-9, které se množí každých 18 až 24 hodin, pro BmNPV se používají buňky BmN4 s generační dobou 4 až 5 dnů. Spektrum plasmidů a virů kompetentních se systémy na bázi AcMNPV je širší, proto je i množství použitelných promotorů aktivních v různých fázích infekce větší, než je tomu v případě BmNPV systémů, které se omezují na expresi jednotlivých genů. Hlavní výhodou systémů na bázi BmNPV je to, že larvy hostitelského organismu, burce morušového (B. mori), jsou přibližně 10x větší než larvy hostitelů pro vektory typu AcMNPV; mohou dosáhnout hmotnosti až 5g. Z takových larev lze získat až 0,5 ml hemolymfy obsahující rekombinantní produkt. Larvy Trichoplusia ni, Heliothis virescens nebo Spodoptera frugiperda mají hmotnost maximálně 300 až 500 mg a lze z nich získat maximálně 50 μl hemolymfy. Expresní systémy na bázi BmNPV jsou atraktivním produkčním systémem především pro proteiny secernované do hemolymfy. Samotné larvy bource morušového mají řadu dalších výhod, především to, že jsou domestikovány už po tisíce let a práce s nimi je velmi dobře propracována. Larvy mohou být chovány ve skupině, nejsou příliš pohyblivé a ani dospělci nemigrují daleko, protože nemohou létat, v polních podmínkách nepřežívají. Vajíčka bource morušového jsou komerčně snadno dostupná. Nevýhodou je potravní závislost na čerstvém listí, které není k dispozici po celý rok. Nevýhodu systémů na bázi AcMNPV týkající se velikosti „živých bioreaktorů“ se výzkumníci snaží překonat použitím gigantických larev

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Manduca sexta, která dorůstají hmotnosti až 10 g.

Pro výběr vektoru jsou rozhodující tyto parametry: 1) Typ použitého promotoru 2) Počet genů, které mohou být do vektoru naklonovány za účelem simultánní transformace a exprese 3) Přítomnost signální sekvence nebo jiné N koncové sekvence pro účely sekrece nebo exprese jako fúzního proteinu 4) Místo v genomu viru, do kterého je heterologní gen zacílen 5) Přítomnost/nepřítomnost genu, který slouží jako marker pro identifikaci rekombinantních buněk

4.6.2. Základní charakteristika expresních systémů hmyzích buněk Bakulovirový expresní systém dokáže nejen exprimovat proteiny, ale také posttranslačně modifikovat podobně, jako k tomu dochází přirozeně v eukaryotických buňkách. Modifikace se podobají modifikacím v buňkách savčích. Bakulovirus lze v hmyzích buňkách rostoucích v suspenzi namnožit do vysokého titru, což umožňuje získat velká množství rekombinantního proteinu. Heterologní proteiny jsou většinou rozpustné. Je možné získat 0,001 až 0,5 g proteinu na litr biomasy, což představuje až 30% celkového buněčného proteinu. Bakuloviry jsou pro obratlovce neinfekční, jejich promotory jsou neaktivní ve většině savčích buněk. Proto je možné v bakulovirech exprimovány onkogeny nebo potenciálně toxické proteiny. Kultivace hmyzích buněk může probíhat ve standardním biologickém inkubátoru, protože nevyžadují zvýšený obsah CO2. Velká množství rekombinantního proteinu lze z bakulovirových expresních systémů získat třemi různými způsoby: 1) Zkombinováním produkce mnoha maloobjemových kultur 2) Vytvořením velkoobjemové buněčné kultury 3) Produkcí proteinu nikoli v buněčné kultuře, ale v larvách hmyzu K výhodám produkce rekombinantního proteinu v buněčné kultuře patří především to, že protein vzniká ve stejném systému, v jakém byl vytvořen primární rekombinantní virus a v systému, kde byl produkt tohoto genu poprvé exprimován a charakterizován. Dá se očekávat, že i po přechodu na velkoobjemovou produkci se bude systém chovat ne-li stejně, tak alespoň podobně. Další výhodou je, že z buněčné kultury lze protein izolovat snadněji než z hmyzí larvy. V buněčné kultuře také vznikají proteiny s jednotným posttranslačním rámcem, protože jsou produkovány jediným klonem. Zásadní nevýhodou produkce v buněčné kultuře je cena, protože odráží náklady na komerčně dostupná kultivační média. Vysoká cena pak značně znevýhodňuje velkoobjemovou produkci. Rovněž náklady na bioreaktor, který je pro hmyzí buněčné kultury nezbytný, jsou vysoké. Další nevýhodou může být, že transformovaný buněčný klon nemusí provádět příslušné posttranslační modifikace. V neposlední řadě je třeba zmínit skutečnost, že u Bombyx mori, jehož larvy se s úspěchem využívají jako „bioreaktory“, není dostupná technologie pro exprese v buněčných kulturách. K výhodám produkce rekombinantních proteinů v hmyzích larvách patří jednak nižší cena a taky

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii větší efektivita některých typů posttranslačních modifikací. Hlavním typem tkáně, ve které dochází k syntéze a sekreci proteinů do hemolymfy (včetně lipoproteinů a glykoproteinů), je tukové těleso. Některé proteiny jsou lépe posttranslačně modifikovány ve specializovaných buňkách larev. Týká se to především procesů glykosylace, štěpení signálního peptidu, acylace mastnými kyselinami a amidace karboxylových skupin. Z nevýhod je třeba zmínit variabilitu v posttranslačních procesech, protože se na nich podílí různé typy buněk. Je třeba také pečovat o larvy, rovněž proces purifikace z komplexních tkání je nepoměrně složitější než práce s čistou buněčnou kulturou. Do procesu purifikace zasahují negativně jako kontaminující složky různé části hmyzího těla, které se bezprostředně neúčastní exprese rekombinantního proteinu, izolát může být znečištěn také obsahem narušené trávicí trubice, především proteázami. Je vhodné zajistit sekreci proteinu do hemolymfy; pokud je larva dostatečně velká, je možné organismus „vykrvit“ a získat tak v prvním kroku purifikace relativně čistý produkt. V některých případech je možné před vlastní izolací orgánu s rekombinantním proteinem operativně odstranit střevo a tím se zbavit i jeho obsahu. Zajímavé můře být srovnání výtěžků proteinů při použití dvou odlišných strategií. Množství proteinu, který lze izolovat z 1 litru buněčné kultury (což je přibližně 2 x 109 buněk) odpovídá přibližně 100 larvám Spodoptera frugiperda nebo Trichoplusia ni (každá o hmotnosti ca 500 mg). Larvy B. mori jsou větší a teoreticky jich je zapotřebí méně než ve výše uvedeném příkladu.

V jedné studii bylo z 22 larev získáno 8 až 9 mg enzymu, přičemž ztráty při purifikaci činily 50%. Výtěžek na jednu larvu byl přepočítán na 1 mg proteinu. Výtěžek stejného proteinu z buněčné kultury činil přibližně 200 mg/l.

4.6.3. Vlastnosti bakulovirů, které je činí vhodnými expresními vektory Je to především prostředí eukaryotické buňky, které z obecného pohledu zajišťuje správné sbalení proteinu, tvorbu disulfidických můstků, oligomerizaci či jiné posttranslační modifikace nezbytné k zajištění biologické aktivity některých eukaryotických proteinů. U hmyzích buněk infikovaných bakuloviry prokazatelně dochází ke štěpení signálního proteinu, proteolytickému štěpení, N-glykosylaci, O-glykosylaci, acylaci, amidaci, fosforylaci, prenylaci a karboxymetylaci. Místa těchto modifikací zpravidla odpovídají pozicím na proteinech produkovaných hmyzími nebo savčími buňkami. Efektivita posttranslačních procesů ale klesá v pozdních fázích infekce, kdy mohou vznikat proteiny s nepatrně odlišnými posttranslačními úpravami. Heterologní geny jsou v bakulovirových systémech exprimovány ve vysokých hladinách, dosahujících až 25-50% celkového buněčného proteinu. To koresponduje s expresí z genu polh a odpovídá množství 1 gram proteinu na 1 litr kultury (neboli 109 buněk). Exprese většiny heterologních proteinů dosahuje ale hladin nižších, mezi 10-100 mg na 109 buněk. Ve srovnání s ostatními eukaryotickými expresními systémy, je ale u bakulovirů dosahováno průměrně nejvyšších výtěžků rekombinantních proteinů. Promotory genů polh a p10 jsou promotory velmi pozdní fáze; jsou aktivovány a silně přepisovány během unikátní okluzní fáze cyklu bakuloviru. Protože se tato fáze nepřekrývá s pozdní fází, kdy dochází k tvorbě virových částic, neinterferuje s ní ani samotná exprese rekombinantních proteinů. Je tak možné efektivně exprimovat velká množství proteinů, které mají neblahý vliv

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii na nezbytné funkce hostitelské buňky. Negativním rysem exprese ve velmi pozdní fázi je ale to, že posttranslačně-modifikační aktivita buňky v této fázi klesá. Kromě toho po této fázi buňky v kultuře umírají a takové expresní systémy tedy nelze využít ke kontinuální kultivaci. Bakuloviry se množí při 27°C, což je permisívní teplota pro většinu teplotně-senzitivních mutantů získaných z organismů normálně kultivovaných při 37°C. Bakuloviry lze tedy využít k produkci proteinů kódovaných teplotně senzitivními alelami genů. To je samozřejmě nemožné v expresních systémech založených na hostitelech kultivovaných při 37°C . Naopak na chlad citlivé proteiny (cold-sensitive proteins) nelze bakulovirové systémy většinou použít. Kapsid bakuloviru může pojmout i více než 100 kbp DNA. Nejdelší naklonovaný úsek tak činil téměř 15 kbp, což ale není prokázané maximum. V jednom vektoru lze naklonovat a pak úspěšně exprimovat i 3 heterologní geny. Vzhledem k fragilitě DNA v podmínkách in vitro je ale přímé klonování takto dlouhých úseků DNA nemožné, proto se takové konstrukty připravují za pomoci pomocných plasmidů. Geny bakulovirů pozdní fáze jsou nesestříhané a přesto se exprimují velmi efektivně. Bakulovirový systém lze tedy použít i k expresi celých genů, tedy genů obsahujících nesestřižení introny. Samotná práce s bakulovirovými vektory je jednoduchá, snazší než příprava a nakládání s konstrukty savčích buněk. Vlastní příprava rekombinantního genu ale trvá déle než je tomu u E. coli. Je to zejména příprava čistých klonálních plak, která zabere dny až týdny, dále pak proces kontransfekce a příprava zásob virionů pro transformaci. Standardní příprava bakulovirového vektoru zabere alespoň 6 týdnů počínaje okamžikem, kdy byl heterologní gen naklonován do donorového vektoru.

4.6.4. Klonování do vektoru typu bacmid. Bacmid je binární vektor, který je schopen se replikovat jak v E. coli, tak v hmyzích buňkách. Pro propagaci v E. coli nese gen rezistence ke kanamycinu. Nese také gen lacZ a proto jím transformované buňky rostou v přítomnosti IPTG modře. Rekombinantní gen je do něj vnášen, jak už bylo řečeno výše, transpozicí z jiného, donorového, vektoru. Protože transpozice směřuje do lacZ, výsledné kolonie rostou bíle. Schéma klonování do bacmidu je znázorněno na obr. 4.29.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Obr. 4.29: Základní schéma klonování do bacmidu Donorový vektor s naklonovaným genem

Kompetentní buňka E. coli

promotor

Tn7L bacmid TRANSFORMACE

Tn7R

SELEKCE

IZOLACE REKOMBINANTNÍ DNA

rekombinantní bacmid

TRANSFEKCE HMYZÍCH BUNĚK

rekombinantní viriony Stanovení titru viru

Virové částice

INFEKCE HMYZÍCH BUNĚK

EXPRESE, VERIFIKACE A NAMNOŽENÍ VIROVÝCH ČÁSTIC


4.7. Rostlinné expresní systémy 4.7.1. Vektory a způsoby transformace rostlinných buněk Metody transformace vyšších eukaryot, včetně rostlin, mají za cíl integraci vektoru a rekombinantní DNA do chromozómu hostitelské buňky. Integrovaná DNA je pak přenášena na potomstvo během mitózy i meiózy. Vlastní transformace cizorodé DNA do rostlinné buňky znamená překonat řadu fyzikálních bariér, v případě rostlinné buňky jsou to buněčná stěna, cytoplazmatická membrána, cytoplasma a jaderná membrána. Teprve potom se DNA může začlenit do chromozómu. Podobně je tomu v případě, že je transformovaná DNA zacílena do genomu chloroplastu nebo mitochondrie. Obecný postup transformace rostlinné buňky lze popsat zjednodušeně takto: Z rostliny, která má být transformována, se odebere vzorek tkáně nebo se použije tkáňová či buněčná kultura udržovaná in vitro. Takový materiál se označuje jako explantát. Explantát je za aseptických podmínek transformován tak, aby došlo k zasažení co největšího počtu buněk. Poraněné tkáňové explantáty jsou inkubovány s buňkami Agrobacterium nesoucími rekombinantní Ti plasmid. Poraněná rostlina uvolňuje fenolické a flavonoidní látky, které aktivují virulentní faktory bakterie uplatňující se na účinnosti přenosu plasmidové DNA. Infikovaná poraněná tkáň je pak přenesena do média obsahujícího kanamycin. Kanamycin, látka používaná k selekci rostlinných transformantů inhibuje růst bakterií, ale i rostlin. Příslušný gen, který slouží jako selekční znak, kóduje enzym fosforylující toto antibiotikum, čímž vzniká inaktivní derivát. Tento jinak bakteriální gen byl pro využití v rostlinách opatřen rostlinným promotorem a terminátorem transkripce. V principu platí, že účinnost transformace je velmi nízká a navíc je každá transformovaná buňka jedinečná – ačkoli je transformována stejná DNA, k integraci dochází v různých místech genomu, a proto jsou transformované buňky geneticky odlišné. Poté, co jsou izolovány transformanty je nutno zajistit regeneraci rostlin, respektive získání diferencovaných tkání – kořenů a výhonů a posléze vznik malé rostlinky. Regenerace by měla probíhat z jediné transformované buňky, respektive z jejího klonu. Po dosažení dostatečné velikosti lze rostlinky přenést do půdy. Tato metoda je široce využívána pro transformaci rostlin, zejména modelových organismů jako tabák, nebo huseníček rolní (Arabidopsis thalliana). Proces transformace je možno považovat za úspěšně ukončený, jakmile získáme plně životaschopnou rostlinu, která v nejlepším případě vytváří geneticky uniformní semena. Na přenosu rekombinantní DNA do rostlinných buněk se podílejí patogeny, napadající rostlinnou buňku. Nejběžněji používaným transformujícím agens jsou bakterie rodu Agrobacterium, což jsou půdní bakterie vyvolávající rostlinné nádory. Tyto bakterie nesou velké plasmidy značené jako Ti (u A. tumefaciens) nebo Ri (u A. rhizogenes), které jsou zodpovědné za vyvolání nádoru. Součástí těchto plasmidů je tzv. T-DNA (transferred DNA), která nese vlastní silné promotory a regulační oblasti fungující v rostlinné buňce. Geny obsažené v T-DNA syntetizují rostlinné růstové hormony – auxiny a cytokiny. Zvýšené hladiny auxinu podporují růst kořenů a cytokinin podporuje růst výhonků. Transformace T-DNA má za následek současné zvýšení produkce obou těchto hormonů, což vede k proliferaci nediferencovaných buněk a vzniku nádorů. T-DNA nese také geny pro enzymy syntézy opinů, sacharidových derivátů aminokyselin. Tyto látky slouží bakteriím rodu Agrobacterium jako zdroj uhlíku a dusíku. Některé další geny Ti plasmidu kódují enzymy pro metabolické využití opinů. Produkce opinů tedy zajišťuje agrobakteriu podmínky pro růst.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Výše uvedené geny nejsou nutné pro přenos DNA z bakterií do rostlin. V T -DNA používaných pro výzkumné účely byly odstraněny geny iaaM, iaaH, ipt a geny pro syntézu opinů. Příslušné geny lze nahradit rekombinantním genem, po transformaci vzniká rostlina bez nádorů, která ale úspěšně exprimuje genetickou informaci z naklonovaného genu. Pro samotný přenos T-DNA do rostlin jsou důležité oblasti, které k ní přiléhají z obou stran; jsou dlouhé přibližně 25 bp a jsou značně homologní u různých typů T-DNA. Typ opinů, který bude transformovaná rostlina produkovat, závisí na kmeni Agrobacterium, respektive na plasmidu, který nese. Tzv. plasmidy nopalinového typu nesou v T-DNA gen pro nopalin syntázu. U takových plasmidů dochází k akumulaci nopalinu v nádorech. Plasmidy oktopinového typu mají gen pro oktopin syntázu a produkují oktopin. Agrobacterium, na rozdíl od jiných bakterií, metabolizuje opiny, což jej zvýhodňuje v kompetici s jinými mikroorganismy v nádorech, jež indukovaly. Při integraci T-DNA do náhodného místa rostlinného chromozómu může dojít k inaktivaci genu důležitého pro transformovanou rostlinu. Místo integrace může mít také vliv na míru transkripce vneseného genu a je běžné, že se míra exprese stejného genu liší v různých transformantech až o dva řády. Určité rozdíly v expresi mohou být způsobeny i různými podmínkami při regeneraci transformantů. Často, ačkoli vycházíme z geneticky uniformního materiálu, kterým byla původně jediná transformovaná buňka tvořící nediferencované pletivo (kalus), získáme rostliny s různými fenotypy. Tento jev se označuje jako tzv. somaklonální variace.

Transformace bakteriemi rodu Agrobacterium není použitelná pro všechny rostliny. Některé rostliny nejsou touto bakterií infikovatelné, jiné druhy zase nelze úspěšně regenerovat. Tyto rostliny je možné transformovat vektory na bázi virů nebo použít některou z fyzikálních či chemických metod. Buňky rostlin mohou být zbaveny buněčné stěny enzymovou degradací, čímž vznikají sféroplasty. Sféroplasty pak mohou být transformovány krátkým elektrickým šokem při vysokém napětí. Při tom na přechodnou dobu vznikají v membráně protoplastů póry, jimiž může procházet DNA, která v některých případech projde až do jádra, kde může být integrována do chromozómu. Elektroporace je pravděpodobně nejúčinnější metodou pro vnesení DNA do protoplastů, ale v praxi jsou používány i některé chemické metody založené např. na použití polyethylen glykolu. Podobně jako v předešlém případě, je po transformaci nutno regenerovat transformanty a selektovat je na základě vnesené rezistence. Další metoda pro vnesení izolované DNA do protoplastů je mikroinjekce pomocí velmi jemných jehel umožňujících vnesení roztoku DNA v objemech řádově nanolitry přímo do jádra protoplastu přidržovaného pod tlakem na konci pipety. Po odstranění jehly se protoplasty regenerují. Výhodou této metody je možnost účinného vnesení DNA přímo do jádra. Limitujícím faktorem je však technická náročnost a malé množství buněk, které je takto transformováno. Práce s tkáňovými kulturami a nutnost regenerace rostliny je eliminována při vnášení DNA do neporušených rostlinných pletiv tzv. biobalistikou, tj. vstřelováním mikroskopických projektilů z wolframu nebo ze zlata (částice o průměru 1 – 2 μm) na jejichž povrchu je precipitovaná DNA. Tyto částice jsou naneseny na povrch plastického projektilu, kterým je nabito "dělo". Po vystřelení dojde u ústí děla k zastavení projektilu a částice nesoucí DNA pokračují ve své dráze k cíli tj. rostlinné tkáni, na níž bylo dělo namířeno. Některé z nich projdou buněčnou stěnou do buněk a určitý podíl DNA se z nich uvolní a po průchodu do jádra může dojít k integraci DNA do jádra. Konstrukce děla pro

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii urychlení makroprojektilu (plastické kulky) se vyvíjela a z původního používání střelného prachu (který poškozoval rostlinnou tkáň), se přešlo k využití stlačeného plynu (nejčastěji helia). Hlavní výhodou bombardování částicemi je neomezený výběr cílových rostlin, neboť částice mohou v zásadě pronikat všemi buňkami a využití této metody bylo rozšířeno i na živočichy.

4.7.2. Promotory a reportérové geny rostlinných vektorů Nejpoužívanějším promotorem pro expresi v rostlinách je promotor kontrolující expresi 35S RNA viru květákové mozaiky (CaMV 35S), což je velmi silný promotor dobře fungující ve dvouděložných rostlinách. Také byly konstruovány pro motory, které jsou indukovatelné tepelným šokem, mědí, glukokortikoidy, alkoholem, antibiotiky a dalšími podněty. Nejrozšířenějším u rostlin používaným reportérovým genem je β-glukuronidáza z E. coli. Jako rostlinný reportérový gen má výhodu v tom, že endogenně má v rostlině zanedbatelnou aktivitu. Glukuronidáza je také buněčně-autonomní tj. nepřechází mezi buňkami. Tento enzym lze snadno detekovat jak histochemicky (in situ), tak in vitro, za použití substrátu X-Gluc (5-Bromo-4-chloro-1Hindol-3yl-β-D-glukopyranoziduronová kyselina) – působením glukuronidázy na tento substrát vzniká modré zbarvení produktu nerozpustného ve vodě či v ethanolu. Další, velmi citlivé, in vitro stanovení využívá jako substrát MUG (4-Methyl-umbeliferyl J1-D-glukuronid) poskytující modrou fluorescenci. Velmi citlivá jsou stanovení luciferázy. Luciferáza je bioluminiscenční enzym, který v přítomnosti ATP a kyslíku přeměňuje substrát luciferin na oxyluciferin za emise fotonů žlutozelené oblasti. Pro účely detekce in situ se používá citlivá kamera. K detekci in vitro lze použít scintilátor. Výhodou luciferázy je ve srovnání s glukuronidázou to, že jak její mRNA, tak i samotný protein, jsou velmi nestabilní. Takže, pokud se zastaví transkripce, dojde rychle k poklesu aktivity, což věrně odráží hladinu transkripce. Green fluorescent protein (GFP) nemá enzymovou aktivitu a je detekován přímo. Jeho detekce je ale méně citlivá. GFP je velmi dobrým reportérem pro sledování intracelulární lokalizace fúzních produktů.


4.8. Expresní systémy savčích buněk Tyto expresní systémy jsou samozřejmě nejvíce podobné přirozenému stavu. Dá se očekávat, že lidské rekombinantní proteiny exprimované v savčích buněčných kulturách nebo kulturách samotných lidských buněk mají všechny vlastnosti takové, jaké vznikají v lidském těle za standardních fyziologických podmínek. Jako expresní systém se nejčastěji používají např. buňky ovárií křečka čínského (Chinesse hamster ovary cell, CHO), buňky ledvin lidského embrya (linie 293, HEK-293). Tyto buňky lze kultivovat za standardních podmínek pro buněčné kultury. Savčí buňky jsou vhodné k expresi všech typů buněk, nepoužívají se pro fúzní proteiny o molekulové hmotnosti do 8 000. Kromě toho, že savčí buněčné kultury produkují proteiny správně posttranslačně modifikované a správně sbalené, je možné je kultivovat v bioreaktorech. Ve farmacii používané rekombinantní proteiny jsou produkované právě v savčích buňkách. K hlavním nevýhodám savčích buněčných kultur patří, že rostou pomalu, jejich kultivace je finančně náročná a i výtěžky rekombinantních proteinů jsou relativně nízké (0,001 až 0,1 g na litr biomasy). Kromě toho mají např. klony CHO buněk odlišné nároky na výživu, proto je náročné optimalizovat pro ně vhodné médium. Vzhledem k tomu, že se jako vektory používají viry, je tato technologie relativně nebezpečná. Kromě virů (nejčastěji adenoviry) je ale k dispozici celá plejáda upravených plasmidových vektorů. Exprese rekombinantních genů v savčích buňkách je rovněž základním nástrojem k pochopení exprese genů, struktury a funkce proteinů a regulačních mechanismů. ¨ Savčí buňky jsou ale využívány také k prosté expresi velkých množství správně sbalených rekombinantních proteinů. Množství a kvalita takto exprimovaných proteinů závisí na celé řadě faktorů, a to na počtu kopií genu kódujícího tento protein, efektivitě transportu, úpravách mRNA, transportu mRNA, stabilitě mRNA a efektivitě translace, úpravách proteinu, jeho transportu a stabilitě. Efektivita exprese různých genů je ovlivněna různými výše uvedenými procesy. Shrnuto, savčí buňky se používají jako hostitelé pro expresi rekombinantních genů zejména z následujících důvodů: 1) Snadněji exprimují geny vyšších eukaryot, protože mají stejné sekvence pro regulaci transkripce, sestřih RNA a translaci. 2) Proteiny jsou v nich exprimovány ve stabilní funkční podobě; je to opět díky tomu, že vyšší eukaryota mají stejné mechanismy pro sbalování proteinů. 3) Správně jsou provedeny posttranslační modifikace, především u secernovaných proteinů 4) Většina proteinů je v savčích buňkách secernována do média, odkud je možno je snadno izolovat. Pokud jsou buňky kultivovány v médiu bez séra, které obsahuje minimální množství jiných proteinů, pak rekombinantní protein v médiu naprosto dominuje.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Savčí buňky se používají jako hostitelé pro expresi rekombinantních genů k: 1) 2) 3) 4) 5)

Potvrzení, že klonovaný gen opravdu kóduje daný protein Studiu vztahu struktura proteinu a jeho funkce Izolaci genů přímou selekcí transfektovaných buněk, které exprimují daný protein Produkci proteinů, které jsou dostupné jen v malých množstvích Zhodnocení fyziologických důsledků exprese určitých proteinů v savčích buňkách pro účely studia buněčných kontrolních mechanismů

Výběr postupu exprese rekombinantního proteinu závisí na tom, co chceme studovat. Kritéria výběru zahrnují: 1) Metodu, kterou je třeba zvolit pro vnesení cizorodého genu do buňky 2) Specifické požadavky buňky, ve které má exprese probíhat 3) Množství proteinu, který je třeba exprimovat, aby bylo dosaženo cíle studie 4) Specifické požadavky indukovatelného vektoru v případě exprese proteinu, který je potenciálně toxický Přesto, že mají savčí buňky řadu výhod, které je předurčují pro expresi rekombinantních proteinů, je podíl buněčného proteinu závislý na velikosti konkrétního typu buněk. V tabulce 4.3 jsou uvedeny údaje o množství DNA, RNA a proteinů. Tato množství jsou 100-1000 větší než v případě E. coli. Dá se odvodit, že jeden gen bude v savčí buňce produkovat přibližně 100-1000x méně produktu jako celkového proteinu ve srovnání s genem v E. coli. Ačkoli jsou v savčích buňkách exprimovány vysoké hladiny proteinů (přibližně 10μg proteinu/106 buněk/den), jsou to jen 2,5% celkového buněčného proteinu. Tab. 4.3: Hlavní makromolekuly v buňkách E. coli a HeLa buňkách. Podle Kaufman R. J. (2000): Overview of Vector Design for Mammalian Gene Expression. Molecular Biotechnology 16, 151-160.

Složka

HeLa buňky

E. coli

Celková DNA

15 pg

0,017 pgb

Celková RNA

30 pg

0,10 pg

Celkový protein

300 pg

0,2 pg

Cytoplasmatické ribozómy

4 x 106

3 x 104

Cytoplasmatické tRNA

6 x 107

4 x 105

Cytoplasmatické mRNAc

7 x 105

4 x 103

Jaderné pre-rRNA

6 x 104

-

1,6 x 105

-

400 pg

0,4 pg

hnRNAd Celková suchá hmotnost

a

a = HeLa buňky jsou tetraploidní, normální diploidní lidská buňka obsahuje asi 5 pg celkové DNA b = rychle rostoucí E. coli obsahuje v průměru 4 genomy, každá genomová DNA má hmotnost 0,0044 pg c = počítáno pro průměrnou délku řetězce 1 500 nukleotidů d = počítáno pro průměrnou délku řetězce 6 000 nukleotidů

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii 4.8.1. Vektory pro transformaci živočišných buněk Pro výběr eukaryotického expresního vektoru je rozhodující, zdali má být exprese dočasná (transient expression) nebo stabilní (stable expression). Dočasná exprese se využívá především pro studie elementů, které regulují transkripci; k navození exprese dochází mezi 12-72 hodinami po transfekci. Po ní následuje prudké snížení exprese v důsledku smrti hostitelských buněk nebo ztráty expresního plasmidu. Optimální dobu exprese je nutno stanovit empiricky v závislosti na typu hostitelské buňky. Účinnost exprese je v takovém případě dána počtem buněk, do kterých byl naklonován vektor s rekombinantním genem. Podíl transformovaných buněk se přitom pohybuje mezi 5-50%. K reportérovým genům využívaným při přechodné expresi patří bakteriální chloramfenikol acetyltransferáza a β-galaktozidáza, luciferáza, alkalická fosfatáza z lidské placenty, β-glukuronidáza a zelený fluoreskující protein. Ve stabilních expresních systémech je možné dosáhnout střední až vysoké hladiny genové exprese. Tyto systémy jsou vhodné k produkci rekombinantních proteinů. Stabilní exprese se dá dosáhnout jak integrací vektoru do chromozómu, tak udržováním rekombinantních molekul v epizomálním extrachromozomálním stavu – v tomto případě musí být buňky pod neustálým selekčním tlakem. Klasickými selektovatelnými znaky, které do hostitelské buňky přináší vektor, jsou tymidin kináza herpes viru, dihydrofolát reduktáza, hypoxantin guanin fosforibosyl transferáza a adenyl fosforibosyl transferáza. Hostitelské buňky musí být v takovém případě pro příslušný enzym deficientní. Jinými selekčními znaky mohou být produkty genů nesoucích rezistence k cytotoxickým látkám. Nejčastěji se využívá gen pro aminoglykosid fosfotransferázu, která propůjčuje rezistenci k antibiotikům – kanamycinu, neomycinu a geneticinu. Používají se také geny kódující hygromycin B fosfotransferázu (HygB), xantin-guanin fosforibosyl transferázu (XGPRT), ZeocinTM (Zeo) nebo blasticidin (Bsd). Selekci transformovaných buněk je možno provádět také na základě exprese povrchových antigenů protilátkami. Pro přechodnou expresi bylo vyvinuto velké množství komerčně dostupných expresních vektorů. Ty zpravidla obsahují následující elementy: 1) Počátek replikace viru SV40, který zajišťuje amplifikaci vektoru do vysokého počtu kopií (u buněk opičí linie COS-1) 2) Účinný promotor nezbytný pro zahájení transkripce 3) Signály pro sestřih hnRNA do mRNA a polyadenylační signály 4) Polyklonovací místo pro začlenění cizorodé DNA 5) Selektovatelné znaky pro detekci stabilně integrované plasmidové DNA Příkladem vektoru pro dočasnou expresi může být plasmid pED (obr. 4.30), který obsahuje sekvence plasmidu pUC18 zajišťující replikaci a selekci na ampicilinu v buňkách E. coli. Dále obsahuje počátek replikace viru SV40 a zesilovač transkripce; jako promotor je u tohoto vektoru využíván hlavní pozdní promotor adenoviru. Na 5´ konci mRNA se nachází trojdílná vedoucí sekvence z pozdní adenovirové mRNA a malá včleněná sekvence. Vektor obsahuje několik restrikčních míst pro klonování cizorodých genů. Na 3´ konci transkriptu je signál pro štěpení a polyadenylaci z časné oblasti viru SV40. Vektor obsahuje kódující sekvenci DHFR na 3´ konci transkriptu. Obsahuje také gen adeno-asociovaného viru, transkripční jednotku přepisovanou RNA polymerázou III, která kóduje malou RNA, jejíž funkcí je inhibovat funkci protein-kinázy PKR aktivované dsRNA (double-stranded RNA activated protein kinase). K aktivaci PKR dochází po transformaci DNA a její funkcí je fosforylovat

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii α podjednotku eukaryotického IF2, čímž dojde k zastavení iniciace translace. Produkt genu z adeno-asociovaného viru zesiluje translaci mRNA, která vzniká transkripcí sekvencí vektoru tím, že inhibuje aktivaci PKR. Vektor pED kóduje dicistronickou mRNA, která obsahuje na 3´ konci přepis genu pro dihydrofolát reduktázu (DHFR). Translace DHFR je vyvolána RBS sekvencí viru encefalomyokarditidy. Exprese dicistronické mRNA z tohoto vektoru může být tedy využita k přímé selekci klonů pro expresi DHFR v buňkách ovarií čínského křečka, které nemají gen pro DHFR. K selekci transformovaných klonů se dá využít řada přístupů. Jedním z nich je sledování fluorescenčního derivátu metotrexátu v živých buňkách fluorescenčním mikroskopem. Jiné metody využívají detekci exprimovaných proteinů monoklonálními protilátkami, využívá se i zelený fluoreskující protein. Indukovaná exprese (inducible expression). Využívá se především při produkci proteinů, které mohou být cytotoxické. V savčích expresních vektorech se využívá celého spektra indukovatelných promotorů, které jsou aktivovány tepelným šokem, steroidními hormony, ionty těžkých kovů, interferonem, železem apod. Vzhledem ke komplikovanému charakteru regulace transkripce u eukaryot obecně je výběr optimálního promotoru pro ten který gen spíše záležitostí empirickou než racionálním výběrem. Specifickou roli hraje pleiotropický efekt několika indukčních signálů. Paradoxně jako velmi vhodné se ukázaly indukovatelné promotory bakteriální, např. promotoroperátor laktózového (lac) operonu E. coli nebo elementy operonu pro rezistenci k tetracyklinu (tet) odvozené od transpozonu Tn10. Konstruují se také fúzní proteiny, např. domény silných aktivátorů (např. virový protein 16 kódovaný genem VP16 viru herpes simplex) a represorů výše zmíněných operónů lac a tet. U těchto systémů brání transkripci IPTG nebo tetracyklin, protože inaktivují aktivátor nezbytný pro transkripci promotoru obsahujícího operátory pro Lac a Tet. Tyto operátory ohraničují počátek transkripce. Nejsou-li IPTG nebo tetracyklin přítomny, pak je transkripce aktivována. Existuje ale také upravený systém, ve kterém je s mutantní formou represoru Tet E. coli fúzována aktivační doména VP16. Tento systém naopak pro aktivaci transkripce vyžaduje tetracyklin. Expresní systémy založené na tomto typu regulací se používají tak, že nejprve se vytvoří stabilní transformovaná buněčná linie, která exprimuje aktivátor. Takové buňky jsou pak transformovány plasmidem s operátorem Tet za kterým je začleněn gen, jehož exprese má být indukována. Většina expresních vektorů je schopna se integrovat do chromozómů hostitelských buněk. Existují ale i vektory, které zůstávají v buňce neintegrované, tzv. epizomální. Příkladem takových vektorů jsou ty založené na viru Epstein-Barrové. Obsahují dva virové elementy, počátek replikace (oriP) a virový gen EBNA1, který zajišťuje udržování vektoru v extrachromozomálním stavu. Tyto vektory jsou udržovány jako extrachromozomální replikony v jádře buněk. Exprese genů z těchto vektorů není závislá na tzv. pozičním efektu, což je jev pozorovaný u integrativních vektorů. Epizomální vektory jsou v buňce často přítomny ve větším počtu kopií. Pro jejich udržení v buňce je ale zpravidla zapotřebí selekční tlak.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Obr. 4.30: Vektor pED, zjednodušená mapa

SV40

PstI SalI XbaI SmaI EcoRI

pED 5 349 bp

β-laktamáza

Vazebné místo pro ribozóm z pikornavirů

DHFR

V tabulce 4.4 je uveden přehled a nejdůležitější vlastnosti základních savčích expresních systémů podle typu virového vektoru. Řada dalších vlastností, které mají tyto vektory a které zde neuvádíme, je popsána v kapitole 11 týkající se genových terapií. Tab. 4.4: Savčí expresní systémy. Podle Colosimo A. et al. (2000): Transfer and Expression of Foreign Genes in Mammalian Cells. BioTechniques 29:314-331. Virový vektor

Vlastnosti

Adenovirus

Široké spektrum hostitelských buněk; vstup dýchacími cestami ale infikuje další orgány; obecně jako jaderný epizom; vysoká hladina exprese; vysoký titr rekombinantního viru; využitelný pro genové terapie; imunogenní

Adeno-asociovaný virus

Široké spektrum hostitelských buněk; pro sbalení potřebuje adenovirus; divoký typ se integruje do specifického místa na lidském chromozómu 19, ale integrace rekombinantního expresního viru je nahodilá; omezená velikost inzertu (kolem 4,5 kbp); nepatogenní; pro malé transgeny využitelný v genových terapiích

EB virus

Udržuje se jako jaderný epizom – platí pro lidské, opičí a psí buňky, obecně ne pro hlodavce; epizom se replikuje autonomně; využitelný pro genové terapie

Herpes simplex virus

Široké spektrum hostitelských buněk; lytický; nese velké fragmenty exogenní DNA (> 5 kbp); sbalovaný virion může přijmout 150 kbp DNA; virové genomy jsou stabilní i po mnoha pasážích


Papillomavirus

Udržuje se jako jaderný epizom u hlodavců (BPV), lidí and opic (HPV); epizomální povaha vektoru/transgenu je nepredikovatelná a musí být vyzkoušena empiricky pro každý transgen; používané ke studiu genové regulace a pro exprese velkých množství rekombinantních proteinů

Polyomavirus

Široké spektrum hostitelských buněk; replikuje se nejlépe v myších buňkách; může se integrovat do genomu

Retrovirus

Rozsah hostitelů závisí na typu virového obalu – ekotropický (druhy, ze kterých byl izolován divoký typ viru) nebo amfotropický (obecně savčí); RNA virus; integruje se do DNA po zpětné transkripci jako provirus; nesnadno se získávají vysoké titry rekombinantního viru; omezená velikost inzertu (kolem 8,5 kbp); využívaný v genových terapiích malých genů

Virus SV40

Široké spektrum hostitelských buněk; ochotně se replikuje v opičích buňkách; může se začlenit do genomu

Virus vakcínie

Široké spektrum hostitelských buněk; infekce zastaví syntézu hostitelských proteinů; lytický; primárně používaný pro nadprodukci rekombinantních proteinů

Lentiviry

Široké spektrum hostitelských buněk; integruje se do genomu; stabilní dlouhodobá exprese; založeny na bázi viru HIV-1

4.8.2. Ovlivnění intenzity genové exprese Intenzita exprese transgenu, respektive hladina exprimovaného rekombinantního proteinu je ovlivněna: 1) 2) 3) 4)

Počtem kopií genu v buňce Rychlostí transkripce genu Stabilitou transkriptů mRNA Polohou integrace s ohledem na prostředí genomu a charakter inzert obklopující DNA

Počet kopií genu v buňce závisí částečně na počtu kopií, které byly do buňky vneseny při transformaci. Hladina exprese může být zvýšena, pokud se současně transformuje gen rezistence k antibiotiku a v médiu je toto antibiotikum přítomno. Selekční tlak obecně zvyšuje počet kopií epizomálních replikonů. Expresi lze zesílit indukcí přes zesilovač transkripce nebo stabilizací mRNA prostřednictvím její 3ńepřekládané oblasti. V tabulce 4.5 jsou uvedeny nejčastěji využívané kontrolní elementy promotor/zesilovač. Vedle těchto elementů lze v některých typech buněk využít i sekvence LCR (locus control region), které jsou umístěny 50 kbp proti směru transkripce genu pro globin; efektivně zvyšují expresi genů v buňkách červené krevní řady.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Tab. 4.5: Nejčastěji využívané kontrolní elementy. Podle Colosimo A. et al. (2000): Transfer and Expression of Foreign Genes in Mammalian Cells. BioTechniques 29:314-331.

Promotor/zesilovač

Vlastnosti

β-aktin

Střední až silný konstitutivní zesilovač transkripce

ITR (inverted terminal repeat) Slabý konstitutivní virový zesilovač transkripce sekvence adenoviru Cytomegalovirus

Silný konstitutivní virový zesilovač transkripce

α-fetoprotein

Tři tkáňově specifické transkripční buněčné zesilovače

γ-globin/β-globin

Tkáňově specifické a s ontogenezí spřažené zesilovače fetálních (γ) červených krvinek a krvinek dospělého jedince (β)

Interferon β

Virem indukovaný; negativně regulovaný zesilovač; silný konstitutivní expresní element, který je dereprimován během indukce exprese

Metalothionein II

Indukovatelný těžkými kovy, forbol estery a glukokortikoidy

MMTV (mouse mammary tumor virus)

Virový zesilovač transkripce indukovatelný glukokortikoidy; slabé až střední hladiny indukce transkripce

LTR viru MuLV (murine leukemia virus)

Střední až silný virový zesilovač transkripce

LTR viru RSV (Rous sarcoma virus)

Silný virový zesilovač transkripce

SV40

Střední až vysoké hladiny exprese navozující konstitutivní virový zesilovač transkripce; indukovatelný forbol esterem

4.8.3. Metody transformace savčích buněk Účinnost transformace nahou DNA je velmi nízká, a proto se k transformaci používají různá vehikula a rozličné chemické nebo fyzikální postupy. Přehled metod transformace podává tabulka č. 4.6. Výběr metody závisí částečně na typu transformované buňky a na počtu buněk, které mají být transformovány a na požadované efektivitě transformace. Existuje velký rozdíl v účinnosti transformace u přisedlých buněk a buněk v suspenzi, když jsou buňky transformovány precipitací v CaPO4. Fibroblasty a epiteliální buňky jsou touto metodou transformovány s účinností kolem 10-1, lymfocyty jen kolem 10-8. Elektroporací lymfocytů lze ale dosáhnout účinnosti až 10-2.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Dalším klíčovým parametrem pro transformaci je růstové stádium recipientních buněk. Nejlepších výsledků transformace lze dosáhnout, pokud se populace buněk nachází v exponenciální fázi růstu. Chceme-li získat stabilní buněčnou kulturu, pak je transformace buněk v exponenciální fázi růstu nezbytnou podmínkou, protože u takových buněk dochází k integraci rekombinantní DNA do chromozómu. V případě dočasné exprese mohou být transformované buňky v klidovém stavu. Pro transformaci je také vhodnější nepoškozená DNA, v případě plasmidu nejlépe ve stavu nadšroubovice. Linearizovaná DNA ale mnohem snadněji podstupuje proces rekombinace a transformace linearizovanou DNA snadněji vede ke vzniku stabilní buněčné linie. V neposlední řadě je otázka transformace spojena s rozhodnutím, má-li dojít k transformaci in vitro nebo in vivo. Virové expresní vektory nepotřebují žádné vehikulum, protože virus dokáže zavést rekombinantní DNA do buňky díky svým přirozeným vlastnostem. Mechanismus vstupu viru do buňky se však liší podle typu viru.

Tab. 4.6: Metody transformace DNA do savčích buněk. Podle Colosimo A. et al. (2000): Transfer and Expression of Foreign Genes in Mammalian Cells. BioTechniques 29:314-331.

Metoda

Typ savčích buněk

Fosfátová metoda

Většina typů savčích buněk; nejefektivnější pro přisedlé buňky; epiteliální buňky jsou citlivější k CaPO4 než k SrPO4

Elektroporace

Primárně používaná pro buňky v suspenzi (např. hematopoetické buňky) a embryonální zárodečné buňky; úspěšně použitá také k transfekci fibroblastů a buněk epitelu dýchacího traktu

Mikroinjekce

Transfekce oocytů a zygot; účinná u embryonálních zárodečných buněk a buněk epitelu dýchacího traktu

Lipozómy

Většina typů savčích buněk; účinnější pro přisedlé buňky než pro buňky normálně rostoucí v suspenzi

Rekombinantní virus

Většina typů savčích buněk; tropismus k určitému typu buňky závisí na produktu genu vneseném do virového obalu

4.8.4. Příprava stabilní linie savčích buněk Jeden z nejúspěšnějších systémů pro selekci stabilních linií savčích buněk je založen na dihydrofolát reduktáze (DHFR). Růst buněk s tímto enzymem probíhá na metotrexátu. DHFR katalyzuje přeměnu folátu na tetrahydrofolát, který je substrátem pro syntézu glycinu ze serinu, pro syntézu tymin monofosfátu z deoxyuridin monofosfátu a syntézu purinu. Metotrexát je analog kyseliny listové, který se váže k DHFR a inhibuje ji; to má za následek smrt buňky. Když roste populace buněk s transformovaným genem pro DHFR v médiu s postupně se zvyšující koncentrací metotrexátu, pak přežívající buňky obsahují zvýšená množství DHFR jako důsledek amplifikace genu pro DHFR. A

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii velmi často odpovídá množství genu pro DHFR také hladinám exprese DHFR. Vysoce rezistentní buňky obsahují několik tisíckrát vyšší koncentrace DHFR než buňky žádným způsobem neaktivované. Jako hostitelské systém pro transformace genem pro DHFR se využívají buňky ovárií křečka (CHO, Chinese hamster ovary cells), které jsou DHFR deficitní. K výhodám CHO buněk jako systému pro expresi heterologních proteinů patří dále: 1) Transformované geny jsou integrovány do hostitelského chromozómu a v buňkách jsou udržovány stabilně i bez selekčního tlaku. 2) Lze v nich exprimovat do vysokých hladin různé typy proteinů 3) Lze je snadno adaptovat na růst i v nepřítomnosti séra a to jak přisedlé, tak ve formě suspenzní kultury 4) Je možné je kultivovat až do objemů větších než 5 000 litrů V savčích expresních systémech se využívají vektory, které produkují tzv. dicistronickou mRNA, která obsahuje transkript selekčního genu a samotného genu, který kóduje studovaný protein. Dicistronická mRNA obsahuje „vazebné místo pro ribozóm“ (internal ribosomal entry site) z pikornavirů. Tato sekvence se vyskytuje v 5´ nepřekládané oblasti genomu pikornavirů a je nezbytná k iniciaci translace. V savčích vektorech pak slouží jako signál pro efektivní translaci selekčních znaků jako je DHFR (např. ve vektoru pED, obr. 4.30), metotrexát rezistentní DHFR (např. pEMC-MTXr), neomycin fosfotransferáza (vektor pZ) nebo adenozin deamináza (vektor pEA). Vektor pED je možné využívat jen v DHFR deficientních buňkách. Vektory pZ, pEA a pEMC-MTXr slouží jako dominantní znaky v různých typech buněk. Buňky transformované těmito vektory vytvářejí stabilní buněčné linie, které exprimují vysoké hladiny rekombinantních proteinů. 4.8.5. Exprese heterologických proteinů s využitím viru vakcínie Savčí viry, podobně jako ostatní viry, přebírají po infekci nadvládu nad buněčnými mechanismy transkripce a translace tak, aby jich využili k produkci vlastních proteinů. Genoví inženýři nahrazují vybrané virové geny rekombinantními, které vkládají pod silné virové promotory a tím zajišťují produkci rekombinantního proteinu, zpravidla inkorporovaného do virových partikulí. Kromě toho je možné využít té skutečnosti, že při replikaci vzniká v buňce velké množství kopií virového genomu. A tak je taky možné získat velké množství kopií rekombinantního genu, což může vést k vysoce účinné transkripci. Nejvhodnější v současné době využívaný systém je založen na viru vakcínie. Virus vakcínie patří mezi poxviry, které se replikují v cytoplasmě savčích nebo ptačích buněk. Mají lineární dsDNA o délce 185 kbp. Virus vakcínie kóduje vlastní transkripční systém a systém pro úpravu RNA. Po infekci dochází k aktivaci asi 100 časných virových genů. Po ukončení replikace, asi 6 hodin po infekci, je exprimováno asi 100 pozdních virových genů. Transkripty viru vakcínie nejsou sestřihovány a proto se do vektorů na bázi tohoto viru musí klonovat cDNA. Virové partikule se tvoří od 6. hodiny po infekci a tento proces trvá asi 2 dny. Genom viru vakcínie je poměrně velký a cizorodá DNA se do něj začleňuje homologní rekombinací. Rekombinantní geny jsou do virového genomu přenášeny z plasmidových vektorů. Tyto vektory obsahují silný promotor obklopený zbytnými oblastmi genomu viru vakcínie. Po transformaci buněk virem vakcínie cizorodá DNA z plasmidového vektoru rekombinuje s genomem viru. K inzerci dochází zpravidla do genu pro tymidin kinázu, výsledný fenotyp je potom TK-. Jako selekční znak lze využít taky β-galaktozidázu (modro-bílý screening plak) nebo xantin guanin-fosforibozyl transferázu

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii E. coli (rekombinanti rostou na kyselině mykofenolové). Rekombinantní viry lze selektovat také hybridizací nebo protilátkami. Jako účinný promotor lze využít i promotor pro T7 RNA polymerázu bakteriofága T7. Na obr. 4.31 je znázorněno schéma expresní kazety vektoru vTF7-3. Tento vektor exprimuje T7 RNA polymerázu. Cizorodá DNA je klonována mezi dva fragmenty DNA fága T7, promotor 010 a terminátor T0 na plasmidovém vektoru, který obsahuje klonovací místa a sekvence genu pro tymidin kinázu viru vakcínie – ty zajišťují homologickou rekombinaci.

Obr. 4.31: Příklad expresní kazety vektoru (pTM-1) na bázi viru vakcínie

pT7

T7

EMCV

inzert

TT7

CCATGG pT7 = část promotoru 010 bakteriofága T7, která tvoří 7 bp vlásenku na 5´ konci mRNA TT7 = terminátor promotoru 010 bakteriofága T7 EMCV = část nepřekládané sekvence viru encefalomyokarditidy inzert = klonovaný gen

Protože mRNA přepisovaná z promotoru T7 by nebyla opatřena čepičkou, nedocházelo by k její účinné translaci. Proto byla do vektoru vnesena sekvence vazebného místa pro ribozóm viru EMC (virus encefalomyokarditidy). Tím byla účinnost translace zvýšena 7x. Např. v případě rekombinantní chloramfenikol acetyltransferázy tvořil tento protein 24 po infekci až 10% celkového buněčného proteinu. Nejběžnější verze tohoto systému má jedinečné restrikční místo NcoI v místě počátku translace, např. u vektoru pTM-1 (obr. 4.31). Klonovaná cDNA je fúzovaná s kodonem AUG v místě NcoI. Vektor pTM-1 obsahuje na 3´ konci polylinker, obsahuje také tymidin kinázu viru vakcínie, ta umožňuje selekci homologních rekombinantů. Verze VOTE2 exprimuje represor lac, systém je tedy regulovatelný IPTG a umožňuje produkovat toxické proteiny. Vektory založené na bázi viru vakcínie a obsahující gen pro T7 RNA polymerázu jsou s úspěchem využívány k transformaci HeLa buněk. Alternativně se využívá ko-transformace dvěma rekombinantními viry, z nichž jeden kóduje RNA polymerázu a další cizorodý gen pod kontrolou T7 promotoru. U takových systémů pak podíl rekombinantní mRNA tvoří až 30% celkové RNA už po 24-48 hod. od infekce. Vektory na bázi viru vakcínie umožňují exprimovat multimerní proteiny.


4.9. In vitro (bezbuněčná) exprese proteinů K expresi rekombinantních proteinů lze využít i pouhé extrakty buněk a to jak živočišných, tak i rostlinných. V principu tyto extrakty obsahují všechny makromolekuly a komplexy nezbytné k transkripci, translaci a posttranslačním modifikacím. Po přidání stavebních složek a RNA nebo DNA matrice dokáží tyto systémy během několika hodin nasyntetizovat příslušný protein. Pro velkoobjemové produkce tyto systémy vhodné nejsou. Oproti buněčným systémům ale mají některé výhody  umožňují rychlou syntézu rekombinantního proteinu bez nutnosti zavádět komplikovanou metodiku práce s buněčnými kulturami,  je možno jimi snadno značit proteiny modifikovanými aminokyselinami,  umí syntetizovat proteiny, které podléhají rychlé proteolýze intracelulárními proteázami  jsou vhodné pro multiplexní analýzy, tj. současné testování více různých proteinů; tímto způsobem lze účinně testovat „mutantní“ formy proteinů exprimované v malých množstvích z různých rekombinantních DNA matric

4.10. Chemicky syntetizované proteiny Terapeutické proteiny lze připravovat také chemickou syntézou. V současné době lze takto připravovat pouze krátké peptidy. Na druhou stranu lze chemicky vnášet do struktury libovolné aminokyseliny nebo produkovat proteiny, které by bylo pro živé expresní systémy toxické. Chemické syntézy ale nejsou předmětem biotechnologie, proto se jimi dále nebudeme zabývat.


4.11. Výběr vhodného expresního systému Expresním systémem pro produkci může být jakákoli prokaryotická nebo eukaryotická buňka, tkáň, pletivo nebo celé mnohobuněčné organismy. Dokonce existují systémy bezbuněčné, které umožňují expresi rekombinantních proteinů v extraktech, a to jak živočišných, tak i rostlinných. Jaký systém vybrat k produkci toho kterého proteinu je rozhodnutí, které vyžaduje dokonalou znalost strukturních vlastností příslušného proteinu, specifických vlastností toho kterého produkčního systému, ale také procesů purifikace. Výběr je závislý také na posouzení nákladů na produkci racionálního množství terapeutického produktu. V principu může být k použití jakéhokoli proteinu zvolen jakýkoli produkční systém, protože procesy translace jsou univerzální napříč všemi biologickými systémy. Ale ne každý protein bude produkován v libovolném systému v biologicky aktivním stavu. Ve většině případů je terapeutický protein přece jenom pro produkční buňku cizí entitou. A na rozdíl od procesu samotné translace jsou posttranslační procesy u jednotlivých skupin organismů často velmi rozdílné. Známe více než 60 různých postranslačních modifikací proteinů a tyto modifikace jsou druhově nebo buněčně specifické. Metabolické dráhy, které vedou k těmto modifikacím, jsou geneticky determinovány hostitelskou buňkou. Takže i v případě, že jsou buňky schopny posttranslačních modifikací, např. glykosylace, může být výsledný glykosylační obrazec odlišný od toho, jak je protein glykosylován v nativním stavu. Proto je strategicky asi nejvhodnější použít k produkci rekombinantního proteinu ten typ buňky, který se nejvíce blíží producentu nativního proteinu v přirozeném stavu. Od prokaryotických buněk například nelze očekávat glykosylaci. A právě lidské proteiny jsou ve více než 50% glykosylovány.     

Obecně lze pro expresní systémy říci, že Mají proměnlivé výhody a nevýhody Jsou typické různými individuálními faktory Proces exprese je empirický, a to i po letech zkušeností Neexistují žádná pevná a spolehlivá pravidla

Pro volbu expresního systému pro určitý rekombinantní protein neexistují žádná pevná a spolehlivá pravidla. Jednotlivé systémy mají proměnlivé výhody a nevýhody, jsou ovlivněny různými individuálními faktory, proces výběru je empirický a to i po letech zkušeností. Zpravidla má nový rekombinantní protein takové vlastnosti, že jeho exprese je výjimkou z jakýchkoli definovaných pravidel. Pří výběru expresního systému se snažíme zohlednit především kvalitativní parametry jako je velikost proteinu, požadovaná čistota (% kontaminance, u bakteriálních expresních systémů především obsah lipopolysacharidu, LPS), postranslační modifikace a rozpustnost proteinu a z kvantitativních parametrů zejména množství biomasy vedoucí k získání dostatečného množství proteinů odpovídající kvality. Parametry kvalitativní

Parametry kvantitativní

Velikost proteinu

Množství biomasy vedoucí k získání dostatečného množství proteinů odpovídající kvality

Stupeň čistoty, podíl kontaminant Posttranslační modifikace Rozpustnost


Obecné vlastnosti proteinů exprimovaných v heterologních systémech jsou uvedeny v Tabulce 4.7. Tabulka 4.7: Obecné vlastnosti proteinů rozdílného biologického původu Vlastnost proteinu

Bakterie

Kvasinky

Savčí buňky

Koncentrace

Vysoká

Vysoká

Nízká

Molekulová hmotnost

Nízká

Vysoká

Vysoká

Disulfidické můstky

Omezené

Bez omezení

Bez omezení

Sekrece

Ne

Ano/ne

Ano

Agregace

Inkluzní tělíska

Ne

Ne

Sbalování

Nesprávné

Správné

Správné

Glykosylace

Ne

Možné

Možné

Retroviry

Ne

Ne

Možné

Pyrogeny

Možné

Ne

Ne

V Tabulce 4.8 je uveden přibližný vztah mezi velikostí rekombinantního proteinu a vhodností určitého expresního systému.

Tabulka. 4.8: Expresní systém versus velikost proteinů. Čím více +, tím vhodnější expresní systém E. coli < 8 kDa Fúzní proteiny > 8 kDa Vnitrobuněčné proteiny 8-50 kDa Secernované proteiny

Kvasinky

Savčí buňky

Hmyzí buňky

+++

+++

+++

+++

++

+++

+++

++

+++

> 50 kDa Secernované a povrchové proteiny

+++


4.12. Cílená mutageneze Enzymy jsou častým produktem biotechnologických výrob. Ve srovnání s průmyslově používanými organickými katalyzátory jsou vysoce specifické a účinkují i za velmi nízkých koncentrací. Nacházejí uplatnění nejen ve farmaceutickém průmyslu, ale také při výrobě speciálních chemikálií, v potravinářském průmyslu, klinických testech a v dalších odvětvích. Použití enzymů v nepřirozených podmínkách mimo buňku ale naráží na řadu problémů. Při zvýšené teplotě a tlaku, nefyziologickém pH nebo v přítomnosti organických rozpouštědel mohou enzymy denaturovat, čímž dojde ke snížení nebo vůbec likvidaci jejich aktivity. Cílem rekombinantních technologií tedy není jen levná nadprodukce přirozeně funkčních molekul, ale také vylepšení vlastností enzymů takovým způsobem, aby je bylo možno výhodně využít v průmyslovém měřítku, zvýšit jejich aktivitu a stabilitu. Strukturu enzymů lze změnit zásahem do sekvence genů, které tyto enzymy kódují. Tradiční techniky využívají procesů mutageneze průmyslových mikroorganismů a následné selekce producenta vhodně „zmutovaného“ proteinu. Tyto zásahy do genomu jsou pouze empirické, přesto dosáhly značných úspěchů a je na nich založena většina současných biotechnologických výrob, včetně těch významných pro farmaceutický průmysl. Vedle procesů nahodilé mutageneze ale existují specifické postupy tzv. „cílené mutageneze“ (site-directed mutagenesis). Tyto postupy umožňují nahradit přirozenou formu genu genem syntetickým s jednoznačně definovanou sekvencí nukleotidů a tedy i s definovaným pořadím aminokyselin v kódovaném proteinu. Změna v sekvenci aminokyselin se může odrazit v terciární struktuře enzymu, ve které se mohou uplatnit např. nově vzniklé disulfidické můstky, změněný počet vodíkových vazeb apod. Terciární struktura má samozřejmě vliv na stabilitu, a další fyzikální a chemické vlastnosti enzymu; mění se katalytická aktivita, afinita k substrátu, je modifikována substrátová specificita, mění se pH optimum, zvyšuje odolnost vůči oxidačním činidlům a těžkým kovům, rezistence k proteázám, stabilita v nevodném prostředí atd. Typickými záměnami aminokyselin jsou náhrady snadno oxidovatelných aminokyselin (Cys, Trp, Met, …) za stericky obdobné, ale k oxidaci méně náchylné aminokyseliny (Ser, Phe, Glu, …). Jiným příkladem je odstranění povrchových karboxylových skupin, což vede ke zvýšení rezistence k těžkým kovům.

4.12.1. Cílená mutageneze oligonukleotidem Záměnu aminokyseliny, kterou experimentátor vyvolá záměnou nukleotidů, je možné provést několika různými způsoby. Jedním z nich je metoda tzv. „cílené mutageneze oligonukleotidem“ (oligonucleotide directed mutagenesis), která je znázorněna na obr. 4.32: 1) Při této metodě je nejprve třeba synteticky připravit oligonukleotid, který je komplementární ke genu, jehož sekvenci chceme změnit; oligonukleotid se od tohoto genu liší pouze v tom místě (může jich být i více), které chceme změnit. 2) Druhou podmínkou úspěšného provedení mutageneze je v tomto případě klon genu ve vektoru, který je schopen vytvářet jednořetězcové molekuly DNA. Takovým vektorem je např. fágový vektor M13. 3) Jednořetězcová DNA fága s naklonovaným genem se hybridizuje s oligonukleotidem.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii 4) DNA polymerázou je z oligonukleotidu dosyntetizován komplementární řetězec k vektorové ssDNA a pomocí ligázy je nově vzniklá kružnicová molekula uzavřena.

Obr. 4.32: Schéma cílené mutageneze oligonukleotidem

téměř komplementární syntetický oligonukleotid (působí jako primer)

mutace hybridizace a komplementární doplnění celé molekuly

ssDNA genu daného enzymu

fágový vektor M13

DNA-polymeráza DNA-ligáza transformace do buněk E. coli

buňky obsahující původní DNA

buňky obsahující zmutovanou DNA replikace

5) Nově vytvořená dsDNA obsahuje v jednom z řetězců mutaci. Poté, co je transformována do buněk E. coli, vzniknou klony obsahující jak původní, tak i mutantní DNA. 6) Po provedení detekce klonu s mutovanou DNA např. hybridizací nebo sekvenováním se DNA vektoru M13 nesoucí mutantní formu genu izoluje a pomocí restrikčních endonukláz se překlonuje do expresního vektoru a produkčních hostitelských buněk.

Metoda cílené mutageneze oligonukleotidem je využívána i k cílenému zavedení specifických sekvencí nebo naopak vytvoření delecí v řetězci DNA. Lze ji využít nejen pro enzymy, ale obecně pro jakýkoli protein, který tak může získat nové vlastnosti. Proteiny pozměněné tímto postupem se někdy označují také jako muteiny. Prvním takto připraveným muteinem byla tyrosyl-tRN-syntetáza v r. 1986 (syntetizuje TyrtRNATyr); u tohoto enzymu změna jediné aminokyseliny vedla k rozdílné specificitě. Podobně byla změněna β-laktamáza, což mělo za následek rozdílnou specificitu tohoto enzymu k různým typům antibiotik. Výrazně klesla

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii schopnost hydrolyzovat peniciliny, naopak některé cefalosporiny byly štěpeny s desetinásobně vyšší účinností. Další enzymy, které se průmyslově využívají a byly změněny mutagenezí, jsou např. trypsin, lysozym, alkoholdehydrogenáza, cytochrom C, signální peptidy, superoxiddismutáza aj.

4.12.2. Mutageneze Pfu DNA polymerázou Pokud nechceme gen nebo jeho fragment po mutagenezi in vitro přenášet zpět do původního nebo nějakého expresního vektoru, můžeme použít techniku (obr. 4.33), jejímž základem je Pfu DNA polymeráza, izolovaná z Pyrococcus furiosus. Substrátem této polymerázy je dsDNA. Pfu polymeráza je přesnější než Taq polymeráza, vykazuje 1,3 x 10-6 chyb oproti 8,0 x 10-6. Přesnost je umožněna opravným mechanismem (tzv. proofreading), který opravuje náhodně vzniklé chyby v průběhu replikace. Při použití Pfu polymerázy k cílené mutagenezi se využívají běžné vektory obsahující gen, který má být modifikován a dva oligonukleotidpové primery, které obsahují požadovanou mutaci. Následuje standardní PCR, při které polymeráza syntetizuje kopie celého vektoru extenzí primerů. Primery jsou s výjimkou „mutovaných“ nukleotidů komplementární k matricové vektorové DNA. Takto vzniká vektor, který má v sobě v místech primerů zabudovanou vhodnou mutaci. Původní matricová DNA, která neobsahuje příslušnou mutaci, je odstraněna pomocí endonukleázy DpnI. To je možné proto, že DNA izolovaná z buněk E. coli je metylována dam metylázou v sekvenci 5'-Gm6ATC-3'. Tuto sekvenci rozpoznává právě endonukleáza DpnI. Nově při PCR vzniklé, tedy mutované, molekuly ale nejsou tímto enzymem rozštěpeny, protože v podmínkách in vitro nejsou metylovány. Získanou DNA, která nese příslušnou mutaci, je pak transformována E. coli, v níž je amplifikována. V izolované DNA je pak mutaci možno prokázat budˇ restrikční analýzou nebo sekvenovánim.

Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii Obr. 4.33. Schéma mutageneze pomocí Pfu DNA polymerázy Plasmid s cílovým místem, které má být změněno mutagenezí

Denaturace DNA a připojení primerů obsahujících požadovanou mutaci

Pfu polymeráza doplní obě vlákna DNA a ponechá pouze zlomy u 3´-konce primerů

Degradace původních (netypovaných vláken) pomocí DpnI. Ke spojení zlomů ligázou dojde až po transformaci E. coli


4.13. Příklady a úlohy k zamyšlení 1) Doplňte základní vlastnosti různých typů hostitelských buněk v níže uvedené tabulce Charakteristika

Bakteriální buňka

Rostlinná buňka

Živočišná buňka

Doména Říše Jádro Genom RNA polymeráza Počáteční aminokyselina Reprodukce Organizace buňky Metabolismus Velikost buněk Buněčné membrány Vnitřní membrány

2) Pro účely cílené mutageneze stanovte možné nukleotidové záměny v sekvenci genu pro standardní lidský inzulín tak, aby po translaci vznikl modifikovaný analog inzulínu označovaný jako Lispro

4. Genové inženýrství ve farmaceutické biotechnologii

Recommend Documents