Biologie 4, 2014/2015, I. Literák
pralesnička drobná Dendrobates pumilio Kostarika, 2004
GEN → PROTEIN
>10 LET JE ZNÁM LIDSKÝ GENOM 2000 – Bill Clinton, Tony Blair: ukončení „hrubého sekvenování lidského genomu (= známo pořadí nukleotidů 83 % lidského genomu) 2003 (Nature, 2004): dokončení „kompletního genomu“ 2010… známo pořadí 93 % nukleotidů, 100 % kódujících oblastí, odolávají některé repetitivní sekvence, centromery, telomery geny kódující proteiny … 20 000 geny kódující RNA … několik (málo) tisíc
? počtu modifikací jednotlivých genů (alternativní sestřih) 2 lidé sdílejí 99,5 % genetické informace, 0,5 % se liší Project ENCODE: do RNA se přepisuje i cca 75 % negenové DNA (!), hlavně regulační oblasti před ale i za (!) genem a z obou (!) řetězců DNA Jen u několika lidí je známá kompletní sekvence celého genomu (např. u J.D. Watsona – spoluobjevitele struktury DNA)
PAMĚŤOVÝ SYSTÉM BUŇKY BUNĚČNÁ PAMĚŤ PAMĚŤ - zaznamenání, uchování a předání informace (kniha, flash disk, DNA, lidský mozek) DĚDIČNOST = schopnost předávat soubor informací ve sledu po sobě jdoucích generací (buněk, mnohobuněčných organismů) BUNĚČNÁ PAMĚŤ (vnitřní paměť buňky) - zpracovává informaci pro - udržování buňky (struktura a funkce) - reprodukci - u jednobuněčných - u mnohobuněčných + informace o vývoji, funkci a chování celého jedince
NUTNÉ VLASTNOSTI BUNĚČNÉ PAMĚTI 1. velká kapacita 2. dlouhodobost 3. stabilita 4. snadná dostupnost a transformovatelnost do konkrétní vlastnosti buňky 5. zdvojitelnost (pro 2 dceřiné buňky) 6. schopnost doplňování (evoluce) TYPY - informace genová (genetická) nesená genofory hlavní médium ... NK exprese genetické informace = kódování, vyzvedávání a vyjadřování (exprimace) do konkrétních vlastností - informace negenová (epigenetická) - část vnitřní informace buňky zprostředkovaná jinak – ovlivňuje vyjádření genů (metylace DNA, acetylace histonů, sbalování chromatinu) UNIVERZÁLNOST GENETICKÉ INFORMACE každá genetická informace je zapsána v primární struktuře NK - DNA (většinou), RNA (RNA viry)
GEN MENDEL (1865) - „diskrétní elementy“ odpovědné za vytvoření znaků JOHANSSEN (1909) - gen = jednotka dědičnosti MORGAN (1911) - geny jsou lokalizovány na lokusech chromozomů BEAGLE, TATUM (1941) - jeden gen - jeden protein (enzym) WATSON, CRICK (1953) - gen je část molekuly DNA kódující jeden protein GEN = úsek polynukleotidového řetězce obsahující genetickou informaci pro strukturu polypeptidu jako translačního produktu (gen strukturní) nebo informaci pro strukturu RNA, která nepodléhá translaci (geny pro rRNA a tRNA) GENY STRUKTURNÍ: informace o primární struktuře polypeptidu (bílkovině strukturní, enzymové, signální) - složené: z exonů (kódující sekvence genů) z intronů (nekódující sekvence genů) primární transkript podléhá posttranskripčnímu sestřihu mRNA, která se na ribosomu „překládá“ do molekuly polypeptidu (eukaryota) -jednoduché: „přepisují“ se celé bez sestřihu (prokaryota) GENY PRO RNA: (rRNA, tRNA, …)
NEGENOVÁ DNA: REGULAČNÍ OBLASTI (regulační sekvence) - úseky molekuly NK, které nesou informaci pro navázání specifických proteinů např. signalizace zahájení nebo ukončení transkripce (na DNA) TRANSPOZONY, RETROELEMENTY = endogenní retroviry, SINE, LINE, u člověka 42 % DNA, REPETITIVNÍ DNA (mikrosatelity, minisatelity) PROKARYOTA - jen malá část DNA je negenová EUKARYOTA - větší část DNA je negenová (u savců 90 %)
GENOM soubor všech molekul DNA v buňce (genová i negenová DNA)
GENOFORY: CHROMOZOMY PLAZMIDY
Některé známé kompletní GENOMY ORGANISMUS
POČET BAZÍ (Mb)
bakteriofág X174 (1977)
5386 b
POČET GENŮ
ssDNA
10
FPV (fowlpoxvirus) (2000)
0.288 dsDNA
min. 65
Haemophilus influenzae (1995)
4.6
Mycoplasma genitalium
0.58
Escherichia coli
4.6
1 743
516 2 350
13
6 420
Arabidopsis thaliana
100
25 498
Caenorhabditis elegans
100
19 099
Drosophila melanogaster
180
13 601
Homo sapiens
3 000
20 000
Triticum aestivum
17 000
(120-160 000)
Saccharomyces cerevisiae
EXPRESE GENETICKÉ INFORMACE F. CRICK:
DNA RNA PROTEIN
CENTRÁLNÍ DOGMA MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE 1. stupeň DNA RNA TRANSKRIPCE - na základě komplementarity bazí vznikají RNA kopie (transkripty) - postranskripční úprava 2. stupeň RNA PROTEIN TRANSLACE - nukleotidy AK - postranslační úprava přesná regulace (!!!): KVALITATIVNÍ KVANTITATIVNÍ ČASOVÁ
Od DNA k proteinu
© Espero Publishing, s.r.o.
TRANSKRIPCE transkripční jednotka = definovaný úsek DNA pro transkripci složení: - promotor - sekvence DNA (40 bp) pro navázání RNA-polymerázy (prostřednictvím proteinu sigma faktor) - sekvence strukturního genu (strukturních genů) - terminátor
1. INICIACE - po navázání RNA-polymerázy na promotor se rozvinou oba řetězce DNA - od místa startu (1. přístupného nukleotidu) na matricovém vláknu se přiřazují RNA nukleotidy, začíná syntéza RNA - po dosažení délky 9 nukleotidů se odštěpuje sigma faktor prokaryota
eukaryota
RNA-polymeráza
Bacteria - 1 typ Archea - mnoho typů
3 typy (I, II, III)
vazby RNA-polymerázy na promotor
prostá
vyžaduje transkripční faktory TF (regulační proteiny TFIID, TFIIB se váží na TATA box – součást promotoru s 25 bp)
2. ELONGACE - RNA-polymeráza se posunuje podél molekuly DNA - vzniká vlákno RNA v orientaci 5´3´
3. TERMINACE terminátor - sekvence DNA, po jejíž transkripci se RNA zdvojí (zdvojení je signál pro oddělení RNA polymerázy od DNA) jiná možnost terminace - vazba rho faktoru (specifický protein) na molekulu RNA REVERZNÍ TRANSKRIPCE ... RNA DNA pomocí reverzní transkriptázy (RNA- závislé DNA-polymerázy) u retrovirů
DNA je transkribována enzymem RNA-polymerázou
směry transkripce genů v krátkém úseku bakteriálního chromosomu
POSTTRANSKRIPČNÍ ÚPRAVA RNA (RNA PROCESSING) mRNA prokaryota - přímo translace eukaryota: pre-mRNA (hnRNA heterologní nukleární RNA) mRNA 1. navázání 7-metylguanozinu na 5´konec (vznik tzv. čepičky) 2. polyadenylace (připojení 100-200 adenosinnukleotidů) na 3´konec (vznik tzv. polyA přívěsku) důvody 1. a 2.: - ochrana před účinkem nukleáz - nutné pro rozpoznání ribozomem - umožňuje přechod z jádra do cytoplazmy 3. splicing ponechání exonů (kódujících sekvencí k exprimování) průměrný gen má asi 1000 nukleotidů vystřižení intronů (často delších než exony) [– ribozym endonukleáza P] 4. RNA silencing (RNAi, siRNA, miRNA)
rRNA syntéza v jadérku 70-80 % RNA pre-rRNA rRNA prokaryonta - 3 druhy rRNA (pro ribosomální podjednotky) eukaryonta - 4 druhy rRNA (pro ribosomální podjednotky)
tRNA syntéza v jadérku pre-tRNA tRNA 1. odstranění zaváděcí sekvence 2. chemické modifikace (metylace) bazí 3. vystřižení intronů 4. přidání trojice nukleotidů CCA (u všech funkčních molekul tRNA)
TRANSLACE (PROTEOSYNTÉZA) = překlad z jazyka nukleotidů (4-písmenná abeceda) do jazyka AK (21-písmenná abeceda) - v cytoplazmě, - na ribosomech GENETICKÝ KÓD 1966 - Nirenberg, Khoran, Ochoa (1968 - Nobelova cena) kombinace tří nukleotidů kóduje 1 AK 64 variant (61 je využito pro AK) tripletový kód triplet nukleotidů v mRNA ... kodon (5´3´) genetický kód je univerzální (stejný u všech organismů) je nepřekryvný (5´ 3´) je degenerovaný, redundantní
Degenerovaný genetický kód Genetický kód je degenerovaný, resp. redundantní, což znamená, že dva či více kodónů může kódovat jednu a tutéž aminokyselinu. Degenerované kodóny se obvykle liší ve své třetí pozici, viz kodony GAA a GAG, které oba kódují glutamin. Tato degenerace genetického kódu umožňuje existenci tzv. tichých mutací. Degenerovanost genetického kódu a z ní plynoucí existence tichých mutací značně zvyšuje toleranci substitučních mutací v degenerovaných kodonech. Např. kodony kódující alanin (GCG, GCA, GCU, GCC) mohou po libosti mutovat na své třetí pozici, aniž by došlo k záměně aminokyseliny, kterou kódují. Naproti tomu aminokyselina histidin je kódována pouze dvěma kodony, takže bez změny aminokyseliny je pouze jedna z možných tří mutací na třetí pozici.
PROTEOSYNTETICKÝ APARÁT mRNA ribosomy - místa syntézy proteinů tRNA - řadí AK podle tripletů volné AK ATP, GTP (zdroje energie) řada enzymů a tzv. pomocných faktorů
mRNA prokaryota - nese informaci pro několik polypeptidů (polycistronická RNA) operon = skupina genů přepisovaných do 1 molekuly RNA eukaryota - nese informaci 1 genu
RIBOSOMY tělíska z rRNA a bílkoviny (1:1) v cytoplazmě prokaryotních i eukaryotních buněk v matrix mitochondrií a stromatu chloroplastů - volné - vázané na membrány (ER, vnější membrána jaderného obalu) v buňce 104 - 105 ribosomů velikost ribozomů v Svedbergových sedimentačních jednotkách prokaryota (+ mitochondrie a chloroplasty)
eukaryota
Celý ribosom
70
80
Větší podjednotka
50
60
Menší podjednotka
30
40
4 specifická vazebná místa: - místo pro vazbu mRNA - A (aminoacyl) místo vazba tRNA s AK (aminoacyl-tRNA) - P (peptidyl) místo (vazba peptidyl-tRNA) - E (exit) místo (místo, kde t-RNA opouští ribosom) polysom - řetízek ribosomů, na nichž probíhá translace proteinů (prokaryota i eukaryota)
komponenty eukaryontního ribosomu
RIBOZOMY – VELIKOST VE SVEDBERGOVÝCH SEDIMENTAČNÍCH JEDNOTKÁCH S celý ribozom
LSU
rDNA
EUKARYOTA
80
60
28
5.8
PROKARYOTA
70
50
23
CHLOROPLASTY 70
50
23
MITOCHONDRIE
45
16
60
SSU
rDNA
40
18
5
30
16
5
4.5 30
16
35
12
5
vazebná místa pro RNA na ribosomu
polyribosom
tRNA rameno antikodonové rameno aminokyselinové vazbu tRNA a AK zajištuje specifická aminoacyl-tRNA-syntetáza 20 syntetáz pro 20 AK (21. AK selenocystein vzniká kotranslační modifikací až po navázání AK na tRNA) energie uvolněná rozštěpením této vazby se použije k tvorbě peptidové vazby nového polypeptidu Izoakceptorové t-RNA - stejná AK/jiný antikodon
PRŮBĚH TRANSLACE 1. INICIACE - připojení iniciačních faktorů na menší podjednotku ribosomu - vazba iniciační tRNA (tRNAf-met – formylmethionin -eubakterie, tRNAmet – methionin –archea, eukaryota) na menší podjednotku ribosomu - vazba mRNA na menší podjednotku ribosomu - připojení větší podjednotky ribosomu tj. vznik translačního komplexu energie z GTP (GTP GDP) 2. ELONGACE - na startovací kodon mRNA se váže antikodon tRNA a další tRNA (A místo P místo E místo, tzv. translokace) nutné elongační faktory (EF-Tu, EF-Ts, EF-G) + energie z GTP spojování AK je katalyzováno peptidyltransferázovou aktivitou 23S rRNA (RNA s enzymovou aktivitou, ribozym)
3. TERMINACE - elongace končí dosažením stop kodonu: UAA, UAG, UGA stop kodony - nejsou rozeznávány tRNA - jsou rozeznávány proteiny (uvolňovací faktory, terminační faktory), které se na tyto stop kodony váží - oddělení polypeptidu - rozpad translačního komplexu
POSTTRANSLAČNÍ MODIFIKACE PROTEINŮ k zajištění biologické funkčnosti polypeptidů postranslační modifikace kotranslační (začínající již během translace) modifikace - deformylace (odstranění formylové skupiny z methioninu) - odštěpení AK - vyštěpení peptidů - chemické modifikace AK (metylace, fosforylace) - tvorba disulfidových můstků - připojení cukerných zbytků (glykoproteiny) - odstranění signálních sekvencí řada postranslačních modifikací se uskutečňuje specifickými enzymy (peptidázy, deformylázy, ...) tj. produkty jiných strukturních genů vznik SEK., TERC. a KVART. STRUKTURY - spontánně - asistovanou autoagregací pomocí chaperonových proteinů (chaperonů), které se vážou na některé funkční skupiny vznikajících proteinů a nedovolí vznik nežádoucích vazeb (např. HSP heat shock proteins)
REGULACE GENOVÉ EXPRESE důvody pro regulaci genové exprese genové produkty - proteiny - jsou pro buňku potřebné: - v určité koncentraci - v určitém čase - na určitém místě
A.
PROKARYOTA
B.
EUKARYOTA
A.
PROKARYOTA
GENY KONSTITUTIVNÍ - produkce konstitutivních (trvale potřebných) proteinů - bez regulace
GENY ADAPTIVNÍ - produkce adaptivních proteinů regulace na úrovni transkripce (geny zapínány a vypínány) katabolické enzymy - indukce substrátem anabolické enzymy - represe konečným produktem OPERONOVÉ GENY- skupina genů řízených promotorem a operátorem operátor je sekvence nukleotidů, na kterou se váže represor (protein kódovaný regulačním genem) tj. alosterický protein represor zastavuje transkripci genu, po jeho uvolnění transkripce probíhá Nedávné objevy: mRNA může vázat různé nízkomolekulární látky (aptamerová funkce) a regulavat genovou expresi s ribozymovým zprostředkovatelem (regulace enzymovou aktivitou ribozymu bez ribozymového zprostředkovatele (regulace změnou konformace mRNA)
B. EUKARYOTA mnohem složitější regulační mechanismy na více úrovních 1. regulace na úrovni genomu - dekondenzace a kondenzace chromozomů EPIGENETICKÁ - acetylace (a deacetylace) histonů AKTIVACE - metylace (a demetylace) DNA (geny s metylovanými nukleotidy nejsou transkribovány) INHIBICE - přestavba genomu pomocí transpozonů (zkopírování určitých sekvencí a jejich včlenění do určitých lokusů, např. spuštění odlišných diferenciačních programů u kvasinek) - amplifikace určitých úseků genomu - genově specifické regulátory diferencující mezi transkripcí a replikací 2. regulace na úrovni transkripce - působení transkripčních faktorů: TFIID, TFIIB (vazba na promotorové části sekvence inr, TATA box) zesilovače transkripce - enhancery tlumiče transkripce - silencery
Regulace prostřednictvím RNA (RNAi, siRNA, miRNA)
RNA – SILENCING 90. léta 20. st. shutting down genes (= SILENCERs) = tlumicí postranskripční geny (PTGS) houby, rostliny, živočichové RNAi – RNA interference = proces sekvenčně specifického umlčování genů pomocí homologní dsRNA (nekódující úseky z 21-23 nukleotidů) siRNA (short interferring RNA) - malé interferující duplexy – uplatňují se v obranném procesu proti transkripci cizorodé RNA (evolučně starobylý obranný mechanismus proti virům a transpozonům)
miRNA (microRNA) – uplatňují se v regulaci běžné genové výbavy buňky (platí odhadem pro 1/3 lidských genů)
NEDÁVNÉ OBJEVY další krátké RNA piRNA (Piwi-interacting RNA) snoRNA (small nucleolar RNA)
… dlouhé nekódující RNA lncRNA (long non-coding RNA, ˃ 200 nukleotidů)
(u savců desítky až tisíce, ? funkce) cirkulární
cirkulární RNA (miR-7) – váže na sebe miRNA, siRNA (má regulační a ochrannou funkci)
EFEKT: degradace mRNA, tj. ukončení genové aktivity „knockdown“ efekt obvykle: ds DNA → ss mRNA → translace
s si(mi)RNA: ds DNA → ss mRNA + komplementární si(mi)RNA s nukleázou (RISC komplex) → degradace mRNA → blokace translace výhledově velké terapeutické využití: ovlivnění genetických chorob, kontrola virových infekcí: specifická dsRNA se dá se vyrobit in vitro a použít in vivo 2004 - poprvé využití v PRAXI: – spinocerebelární ataxie myší je vyvolávaná toxinem produkovaným mutovanou alelou genu SCA1, nemocná myš byla vyléčena umlčením mutovaného genu po podání specifické siRNA
RNA - SILENCING dsRNA
DICER = specifická RNA endonukleáza
siRNA
RISC (RNA-induced silencing complex) = siRNA + endonukleáza RISC degraduje mRNA
3. regulace na úrovni postranskripčních modifikací - alternativní sestřih RNA (např. produkce IgM)
4. regulace na úrovni translokace - přechod mRNA z jádra do cytoplazmy
5. regulace na úrovni translace - působení iniciačních translačních faktorů 6. postranslační regulace - modulace chemické modifikace proteinů - modulace proteolýzy PROTEASOMY - komplexy proteáz, které degradují bílkoviny (s pomocí ATP jako zdroje energie) molekulární značka - rozeznávající komplex specifických enzymů připojí k bílkovině v místě lyzinu malý protein ubikvitin (terč pro proteasomy)
UBIKVITINACE proces degradace nepotřebných, nadbytečných, poškozených bílkovin v buňce princip: na bílkovinu, která má být zničena, jsou navázány min. 4 molekuly UBIKVITINU a tím je cílová bílkovina předurčena k likvidaci v PROTEASOMU
- probíhá aktivně (za spotřeby ATP), rychle, účinně a regulovaně UBIKVITIN je aktivován enzymem E1(UBA, ubikvitin aktivující) AKTIVOVANÝ UBIKVITIN je připojen enzymem E2 (UBC, ubikvitin cílovou bílkovinu enzym E3 (ubikvitin-ligáza) připojí min. další 3 ubikvitiny ▼ ▼ Degradace bílkoviny v PROTEAZOMU: - proteázy odštěpí ubikvitiny pro další použití - proteázy štěpí bílkoviny na krátké úseky AK pro další použití
konjugující) na
E1 – 1 typ E2 – 10 typů E3 – stovky typů – zajišťují specifitu
PROTEASOMY u všech organismů UBIKVITINACE jen u eukaryot Existují další malé proteiny (např. SUMO proteiny) ovlivňující aktivitu cílových bílkovin (nezpůsobují ale degradaci), někdy soutěží o vazebná místa pro ubikvitin.
INHIBITORY PROTEAZOMU objeveny v 90. létech 20. st.
různá struktura, síla účinku a specifita (hl. přes inhibici nukleárního faktoru kappa B) potenciální využití v medicíně: - léčba nádorů (potlačit růst nádorů, neničit zdravé buňky) - regulace zánětlivých procesů - léčba negativní proteinové bilance (průvodní jev řady patologických stavů)
KONTROLA SPRÁVNÉHO OZNAČENÍ při nesprávném označení se mohou uplatnit DUB – deubikvitinizující enzymy (uchrání protein před destrukcí)
TRANSKRIPTOSOM – multienzymový komplex zajišťující transkripci
SPLICEOSOM – multienzymový komplex zajišťující posttranskripční sestřih snRNP small nuclear ribonucleoprotein particles – umožňují vystřižení intronu = ribozymová ribonukleáza P PROCESOM – komplex v jádře zajišťující vyzrávání rRNA
Geny mohou být exprimovány s různou účinností
© Espero Publishing, s.r.o.
Bakteriální a eukaryontní gen
© Espero Publishing, s.r.o.
Struktura dvou lidských genů ukazující uspořádání exonů a intronů
© Espero Publishing, s.r.o.
Alternativní sestřih α-tropomyosinového genu u krys
Souhrn procesů vedoucích od genu k proteinu
© Espero Publishing, s.r.o.
