Doktori (Ph.D.) Értekezés AZ EXTRACELLULÁRIS MÁTRIX SZEREPE A HUMÁN OSTEOSARCOMA INVAZÍV NÖVEKEDÉSÉBEN ÉS CITOTOXIKUS GYÓGYSZEREKKEL SZEMBENI VÁLASZREAKCIÓJÁBAN
Dr. Harisi Revekka Témavezeto: Prof. Dr. Jeney András D.Sc. Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kar I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet
Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Patológiai Orvostudományok Doktori Iskola Onkológiai Program
Programvezeto: Prof. Dr. Kopper László D.Sc. Szigorlati Bizottság Elnök: Dr. Schaff Zsuzsa, egyetemi tanár, az orvostudomány doktora Tagok: Dr. Kralovánszky Judit, tudományos foosztályvezeto, kandidátus eerew
Dr. Antal Imre, egyetemi adjunktus Ph.D.
Hivatalos Bírálok Dr. Antal Imre, egyetemi adjunktus, Ph.D. Dr. Budai Barna Lajos, tudományos fomunkatárs, Ph.D.
Budapest, 2005
Tartalomjegyzék
1 TARTALOMJEGYZÉK 1 2
TARTALOMJEGYZÉK........................................................................................ 2 BEVEZETÉS ÉS IRODALMI HÁTTÉR............................................................... 5 2.1 AZ OSTEOSARCOMA ................................................................................ 5 2.1.1 Epidemiológia ....................................................................................... 5 2.1.2 Etiológia ................................................................................................ 5 2.1.3 Citogenetika .......................................................................................... 6 2.1.4 Lokalizáció ............................................................................................ 6 2.1.5 Klinikai tünetek ..................................................................................... 7 2.1.6 Laboratóriumi vizsgálatok ..................................................................... 8 2.1.7 Radiológiai vizsgálatok.......................................................................... 8 2.1.8 Szövettan............................................................................................... 9 2.1.9 Terjedés, áttétképzés.............................................................................. 9 2.1.10 Kezelés................................................................................................ 10 2.2 AZ EXTRACELLULÁRIS MÁTRIX (ECM) ............................................. 12 2.2.1 Az ECM szerkezete ............................................................................. 12 2.2.2 Az ECM átrendezodése ....................................................................... 13 2.2.3 Az ECM szerepe a szöveti muködés szabályozásában.......................... 13 2.2.4 A tumoros ECM szerepe a daganatok progressziójában ....................... 14 2.2.5 A proteoglikánok ................................................................................. 15 3 CÉLKITUZÉSEK................................................................................................ 16 4 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK........................................................................... 17 4.1 ANYAGOK ................................................................................................ 17 4.1.1 Szövettenyészeti anyagok és vegyszerek.............................................. 17 4.1.2 Antitestek és vektorok ......................................................................... 17 4.1.3 Daganatellenes gyógyszerek ................................................................ 18 4.2 MÓDSZEREK ............................................................................................ 19 4.2.1 OSCORT sejtvonal kialakítása............................................................. 19 4.2.1.1 Primer humán osteosarcoma ............................................................ 19 4.2.1.2 HTB-2 és HTB-9 xenograftok kialakítása ........................................ 20 4.2.1.3 OSCORT szövettenyészeti sejtvonal kialakítása............................... 20 4.2.1.4 OSCORT sejtvonal humán eredetének igazolása.............................. 20 4.2.2 ECM eloállítása és ECM biopolimerek izolálása.................................. 21 4.2.2.1 ECM eloállítása EHS sarcomából (EHS-ECM) ................................ 21 4.2.2.2 ECM biopolimerek izolálása ............................................................ 22 4.2.2.3 ECM eloállítása OSCORT sejtekbol (OSCORT-ECM) .................... 22 4.2.3 Sejttenyésztési és citosztatikus kezelési módszerek.............................. 22 4.2.3.1 Sejttenyésztés ECM-gél jelenlétében................................................ 22 4.2.3.2 Sejttenyésztés ECM-gél biopolimerek jelenlétében .......................... 23 4.2.3.3 Citosztatikumok hatásának vizsgálata .............................................. 24 4.2.3.4 Sejtek izolálása a háromdimenziós tenyészetbol............................... 24 4.2.4 A sejtproliferáció vizsgálata................................................................. 25 4.2.5 Az invazív növekedés vizsgálata in vitro............................................. 25 4.2.6 Morfológiai vizsgálatok....................................................................... 25 4.2.6.1 Citológiai vizsgálatok ...................................................................... 25 4.2.6.2 Sejtéletciklus vizsgálata ................................................................... 26
2
Tartalomjegyzék 4.2.7 Immunhisztokémia és immuncitokémia ............................................... 26 4.2.7.1 Immunhisztokémia .......................................................................... 26 4.2.7.2 Immuncitokémia .............................................................................. 27 4.2.8 Biokémiai vizsgálatok.......................................................................... 27 4.2.8.1 Sejtmagizolálás, sejtmagi és citoplazmatikus fehérjék eloállítása ..... 27 4.2.8.2 Fehérjek azonosítása immunblot technikával ................................... 28 4.2.8.3 Topoizomeráz aktivitások vizsgálata................................................ 30 4.2.8.4 Metalloproteináz (zselatináz) aktivitás vizsgálata............................. 31 4.2.8.5 A doxorubicin DNS károsító hatásának vizsgálata ........................... 32 4.2.8.6 DNS bontó aktivitás kimutatása ....................................................... 33 4.2.8.7 Proteoglikánok vizsgálata ................................................................ 34 4.2.9 Statisztikai analízis .............................................................................. 35 5 EREDMÉNYEK.................................................................................................. 36 5.1 KLINIKAI HÁTTÉR .................................................................................. 36 5.2 HUMÁN OSTEOSARCOMA SEJTVONAL (OSCORT) JELLEMZÉSE... 38 5.2.1 HTB-2 és HTB-9 xenograftok jellemzése ............................................ 38 5.2.1.1 A xenograftok szövettani jellemzése ................................................ 38 5.2.1.2 A xenograftok immunhisztokémiai jellemzése ................................. 41 5.2.2 OSCORT humán eredetének igazolása................................................. 43 5.2.2.1 LDH izoenzimek kimutatása............................................................ 43 5.2.2.2 Citogenetikai vizsgálatok - Kariotípus analízis................................. 43 5.3 ECM HATÁSA AZ OSCORT SEJTEK NÖVEKEDÉSÉRE ÉS INVAZÍVITÁSÁRA ................................................................................... 44 5.3.1 ECM és biopolimerei hatása az OSCORT sejtek növekedésére ............ 44 5.3.2 ECM és biopolimerei hatása az OSCORT sejtciklusra ......................... 46 5.3.3 ECM és biopolimerei hatása sejtciklushoz társult és tumor szuppresszor fehérjék expressziójára.................................................... 47 5.3.4 Topoizomeráz váltás ECM és biopolimerei hatására ............................ 51 5.3.5 Nem specifikus DNS bontó aktivitás ECM hatására............................. 55 5.3.6 ECM biopolimerek hatása az OSCORT sejtek migrációjára................. 57 5.3.7 ECM és biopolimerei hatása az OSCORT sejtek mátrix metalloproteináz aktivitására ............................................................... 58 5.3.8 ECM és biopolimerei hatása az OSCORT sejtek ß1 integrin expressziójára ...................................................................................... 59 5.4 ECM HATÁSA AZ OSCORT SEJTEK DOXORUBICINNEL SZEMBENI VÁLASZREAKCIÓJÁRA...................................................... 59 5.4.1 ECM hatása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek növekedésére....... 59 5.4.2 ECM hatása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek repopulációjára.... 63 5.4.3 ECM hatása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek sejtciklus fázisaira65 5.4.4 ECM biopolimerek hatása az OSCORT sejtek doxorubicinnel szembeni válaszreakciójára.................................................................. 66 5.4.5 ECM moduláló hatása a doxorubicin indukált DNS károsodásra.......... 68 5.4.6 ECM hatása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek tumor szuppresszor fehérjék expressziójára.................................................... 72 5.4.7 ECM hatása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek topoizomeráz fehérjék expressziójára és aktivitására.................................................. 75 5.4.8 Doxorubicin kezelés hatása OSCORT sejtek proliferációjára és migrációjára......................................................................................... 79
3
Tartalomjegyzék 5.5
6 7 8 9 10 11 12 13
A PROTEOGLIKÁNOK LEHETSÉGES SZEREPE AZ OSTEOSARCOMA KEZELÉSÉBEN......................................................... 81 5.5.1 Proteoglikán expresszió az OSCORT sejtekben és az ECM-ben .......... 81 5.5.2 Doxorubicin és clodronat hatása az OSCORT sejtek növekedésére és proteoglikán termelésére...................................................................... 82 5.5.3 Doxorubicin és clodronat kombinációs kezelés hatása az OSCORT sejtek növekedésére ............................................................................. 85 MEGBESZÉLÉS ................................................................................................. 88 KÖVETKEZTETÉSEK, ÚJ MEGÁLLAPÍTÁSOK és KLINIKAI GYAKORLATI ALKALMAZÁSUK.............................................. 111 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE............................................................................. 113 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ............................................................................ 115 IRODALOMJEGYZÉK..................................................................................... 117 SAJÁT KÖZLEMÉNYEK……………………………………………………….133 ÖSSZEFOGLALÁS……………………………………………………………...142 SUMMARY………………………………………………………………………143
4
Bevezetés
2 BEVEZETÉS ÉS IRODALMI HÁTTÉR
2.1 AZ OSTEOSARCOMA Az osteosarcoma a leggyakoribb primer csontdaganat.1 A WHO-meghatározás alapján az osteosarcoma olyan malignus tumor, amelyre jellemzo a tumorsejtek direkt csontszövet-, illetve osteoidtermelése. Sokféle megjelenési formája van, és igen eltéro lehet a szövettani képe, alapveto azonban a tumorsejtek osteoidtermelo képessége, ennek alapján akkor is osteosarcomáról beszélünk, ha a tumor állományának nagy része porc- vagy kötoszövet.
2.1.1 Epidemiológia Az
osteosarcoma
gyakorisága
évenként
körülbelül
1.5/egymillió
lakos,
ami
Magyarországon 15 új esetet jelent évente.1 Az incidenciája kétszer gyakoribb a férfiaknál. Bármely életkorban elofordulhat, de a 60%-a az elso két évtizedben keletkezik. Az elofordulás csúcsa a 20. év a férfiaknál, a noknél a 17. év és a gyermekkori és fiatal felnottkori összes daganatos megbetegedés 8%-át képezi. Mindazonáltal 70 év körül ismételt kiugrás észlelheto, amely azonban lényegesen kisebb a serdülokorinál. 2 A
0-14 év közötti fiatal populációban a csonttumorok az összes malignus
daganatoknak az 5%-át alkotják, ebbol az 52%-a az osteosarcoma, ezért az osteosarcoma a legfontosabb primer csonttumor gyerek és serdülokorban.3 Elofordulása gyakoribb a fiúknál, fiú-leány arány 1.4:1.2,4,5
2.1.2 Etiológia Az osteosarcoma eredete ismeretlen. Közismert azonban, hogy a retinoblastoma és a Li -Fraumeni szindróma gyakran társulnak osteosarcomával, ami a RB és TP53 szuppresszor gének deléciójának vagy mutációjának a szerepére utalnak az osteosarcoma kialakulásában. 6,7,8,9,10,11 A retinoblastomában a 13q14, a Li-Fraumeni szindrómában 17p13 kromoszóma rendellenességek mutathatók ki. Az MDM2 (2q1314), a MYC (8q24) és a FOS (14q21) onkogének amplifikációját, valamint RNS és
5
Bevezetés protein
expresszió
fokozódását
is
összefüggésbe
hozták
az
osteosarcomák
kialakulásával. 12,13 Másodlagos osteosarcoma alakulhat ki irradiáció után, valamint Paget kór, fibrosus dysplasia, óriássejtes csonttumor, csontinfarktus és osteomyelitis talaján.
2.1.3 Citogenetika Osteosarcomák citogenetikai vizsgálatáról kevesebb, mint 50 esetben számoltak be az irodalomban, és az extrém módon komplex kariotípusok mellett semmilyen, a lymphomákhoz, illetve leukémiákhoz hasonló, jellemzo citogenetikai elváltozást nem találtak.14 A közölt esetek többségében nagyfokú aneuploidiát és nagyszámú marker kromoszómát észleltek, az 1p, 1q, 3p, 3q, 6q, 7q, 8q, 9q, 11p, 12p, 14p, 17p, 19q és 12q kromoszóma karokon megfigyelt eltérések mellett. A 3, 4, 5, 10, 13, 15 és 22. kromoszómák hiányát, illetve izokromoszómákat, mint i(6p) és i(14q) írtak le legalább két analizált tumorban. Legalább 5 tumorban találtak az 1q11, 1q21, 1q42, 6q15-21, 7q11, 8q24, 9q34, 12p13 és 19q13 sávokban töréspontokat.14 Az RB1 tumor szuppresszor gént hordozó 13q14 sáv,15 illetve a teljes 13. kromoszóma hiányát írták le a vizsgált osteosarcoma esetek felében.16 Osteosarcomákban viszonylag gyakori a TP53 tumor szuppresszor gént hordozó 17p13 locus17 érintettsége. Amplifikációra utaló jelekrol, mint double minute-ok (DM), vagy homogénen festodo régiók, és/vagy esetlegesen az osteogen tumorokra jellemzonek tekintheto onkogéneket érinto átrendezodésekrol nem számoltak be.14 Ugyanakkor parostealis osteosarcomában és néhány más csont és kötoszöveti daganatban egy számfeletti gyuru kromoszóma volt kimutatható.18
2.1.4 Lokalizáció Az osteosarcoma a csontrendszeren, illetve adott csonton belül is jellegzetes predilekciós helyeken alakul ki. A legtöbb daganat a hosszú csöves csontok ízület közeli részein keletkezik (1. ábra). A csöves csontokon belül elsosorban a legaktívabb növekedés helyén, a metaphysisben alakul ki, és csak mintegy 10-15%-ában az epiphysisben, diaphysisben. A gyerek- és serdülokorban a leggyakrabban érintett csontok a femur (44%), a tibia (17%) és a humerus (15%).4,5 A betegség nagyon ritkán a csontrendszeren kívül is elofordulhat, például a mellkasban vagy a hasüregben.
6
Bevezetés
1. ábra. Az osteosarcoma eloszlása Mirra nyomán.19 A nem jelölt csontok az osteosarcomás esetek 4%-át jelentik. Az adatok a közép- és idoskorú osteosarcomás betegekre vonatkoznak. A gyerek- és serdülokorban kevesebb az axialis csontokban eloforduló esetek száma.
2.1.5 Klinikai tünetek Az osteosarcomának meglehetosen jellegtelen tünetei vannak. A kezdetben intermittáló fájdalom, késobb állandósul és fokozódik, terheléstol függetlenné válik, és éjjel intenzívebb. A fájdalom a környezo ízületek felé sugárzik ki, és azt jelzi, hogy az intraossealis tumor áttörte a corticalist és feszíti a periosteumot, majd a lágyrészekbe hatolva nyomja vagy infiltrálja a környezo képleteket. Elorehaladott állapotban a fájdalom csillapíthatatlanná válik. A duzzanat a tumor terjedését jelenti a környezo szövetek felé. Konzisztenciája a daganat tumor-csontképzo intenzitásától függ. A duzzanat felett a bor meleg tapintatú, különösen, ha a tumor terjedelmes és konzisztenciája puha. Elofordulhat hogy a bor a tumor fölött feszes és fénylo. A daganat felett gyakran látható tágult, subcutan vénás hálózat arra mutat, hogy a daganat a corticalist áttörve, a mélyebb vénák nyomásával pangást okoz. A mozgáskorlátozottság a fájdalom és a tumor növekedésének következménye. Ritkán számolnak be a betegek fogyásról, szintén nem gyakori a nagy destrukció miatt, elorehaladott stádiumban az érintett csont patológiás törése (1%).20
7
Bevezetés
2.1.6 Laboratóriumi vizsgálatok A laboratóriumi vizsgálatok gyorsult vörösvértest-süllyedést mutatnak, az esetek 50%ában emelkedik a szérum alkalikus foszfatáz értéke is, a kórosan fokozott osteoblastaktivitás következtében. Ez a vizsgálat jó indikátora a kezelés hatásosságának és a metasztázisok jelentkezésének is: normál alkalikus foszfatáz érték a mutét után, a mutét jó eredményét mutatja, de ismételt emelkedése gyakran elobb figyelmeztet metasztázisképzodésre, mint a mellkas röntgen vizsgálata.21 Osteosarcománál alkalikus foszfatáz a tumorszövetben is található. Ugyancsak gyakran emelkedett értékeket mutat a szérumelektroforézis alfa-2-globulin frakciója is.
2.1.7 Radiológiai vizsgálatok Az osteosarcoma röntgen megjelenése a daganatsejtek érettségi fokától függoen igen változatos: a sclerotizáló formától fokozatos átmenetet találunk egészen az osteolyticus formáig. Az elso röntgen tünet legtöbbször szabálytalan szerkezetu és a tumor infiltratív terjedése miatt elmosódott szélu intraossealis laesio a hosszú csöves csont metaphysisében. Az ép–kóros határ elmosódott, molyrágásszeru. Ezután gyorsan bekövetkezik a corticalis destrukció. A destrukció helyén a tumorszövet a periosteumot elemeli a csontról, és ezen a helyen a periosteum trianguláris új csont képzésével reagál (Codman féle háromszög).20 A corticalis és az elemelt periosteum között a corticalisra meroleges, sugaras spiculumok húzodnak. A tumor exraossealis terjedését a parostealis lágyrészárnyék–többlet jelzi. Nagy segítséget nyújt mind a lágyrész-, mind az intramedullaris kiterjedés megítélésében a CT- és az MR-vizsgálat.22 A daganat kiterjedésének megállapításán túl, a megfelelo mutéti beavatkozás megtervezéséhez elengedhetetlen az érintett régió CT- és / vagy MRI-vizsgálatának elvégzése. A távoli áttétek kizárása céljából csont izotóp, valamint mellkas röntgen, illetve mellkasi CTvizsgálatok elvégzése javasolt. A laboratóriumi vizsgálatok diagnosztikus értéke osteosarcománál korlátozott értéku. A végleges diagnózist a daganatból vett szövettani mintavétel igazolja.
8
Bevezetés
2.1.8 Szövettan Feltételezik, hogy az osteosarcoma mesenchymalis ossejtbol származik, amely kötoszövetté, porc- és csontszövetté képes differenciálódni, és ezeket a szöveteket az osteosarcomában - ha különbözo mértékben is - gyakran meg lehet találni. A centrális (intramedulláris) (93%) és a csont felszínén növekvo (7%) osteosarcomát különböztetik meg. A centrális további altípusai: a klasszikus (87.5%) [osteoblastos (43.75%), chondroblastos (21.875%), fibroblastos (21.875%)], a teleangiectaticus (3%), az intraossealis jól differenciált (low grade) (1.2%), és a kissejtes osteosarcoma (1.3%). A klasszikus centrális osteosarcoma a leggyakoribb típus és így a legnagyobb jelentoségu. Sajnos minden centrális osteosarcoma agresszív, kivétel a jól differenciált. Az osteosarcomák közös jellemzoje, hogy osteoid mátrixot (daganatos csontot) termelnek. A tumoros osteoid kimutatása az osteosarcoma diagnózis feltétele, ennek alapján különítheto el a csontban szintén eloforduló, de ritkább egyéb daganatoktól. A daganatot alkotó stróma rendkívül polimorf, nagy bazofil sejtmagvú, osteoblastszeru tumorsejtekbol áll. Tumoros és osteoclast típusú óriássejtek egyaránt elofordulhatnak. Számos atípusos mitózis is látható, gyakoriak a bevérzések, nekrózisok. Az egyes osteosarcomák igen eltéro mennyiségu osteoidot tartalmaznak, ami általában tumorsejtek körül, az extracelluláris térben, laza hálószeru struktúrát alkotva rakódik le. Sajnos a
meglehetosen eltéro szöveti szerkezetu osteosarcomák között csekély a
prognosztikai különbség.23
2.1.9 Terjedés, áttétképzés Az osteosarcoma progressziója során a környezo szövetek felé közvetlen terjed (pericapsularisan, direkt articularisan), valamint hematogén úton adhat áttétet. A leggyakrabban a pulmonális metasztázisok fordulnak elo.24 A betegek 15-20%-ában szinkron tüdo áttétet lehet kimutatni már a diagnózis idejében,25 20%-ában multiplex metasztázis alakul ki a betegség elorehaladása során.26 Az osteosarcoma egyéb rosszindulatú daganatokhoz képest a nyirokcsomókba ritkábban ad áttétet. Metasztázis ritkán, de elofordulhat: a májban, a vesékben, az agyban, a lágyrészekben és a szívben.4
9
Bevezetés
2.1.10 Kezelés Az elmúlt évtizedekben lényeges változás következett be az osteosarcoma diagnózisában, kezelésében, valamint a túlélési eredményekben. A kezeletlen osteosarcoma a betegek 100%-ában egy éven belül halálhoz vezet. Az 1970-es években kizárólag sebészi kezelést (radikális amputációt) alkalmaztak. A sebészi beavatkozással 15-20%-os ötéves túlélést tudtak elérni a diagnózis idejében szinkron áttétekkel nem rendelkezo betegek eseteiben. A még nem metasztatikus osteosarcomában szenvedo betegek 80%-ában az amputációt követoen 6-9 hónapon belül jelentkeztek a tüdo áttétek.27,28 Az 1970-es évek vége felé a kemoterápia hatásosságát sikerült bizonyítani ebben a daganatos betegségben is, és egyes esetekben végtagmegtartó mutéteket kíséreltek meg. A
kemoterápia
alkalmazása
lényeges
elorelépést
jelentett
az
osteosarcomák
kezelésében, alapvetoen megváltoztatta a kezelési stratégiát, és ezzel a túlélését jelentosen fokozta. Az 1980-as évek második felétol vezették be a preoperatív és postoperatív kombinált kemoterápiát, ami az ötéves túlélést 55-75%-ra emelte a szinkron áttéteket nem kimutatható betegcsoportban.29,30
Az összehangoltabb
kemoterápiás kezelések kidolgozása, a képalkotó eljárások fejlodése, a mutéti technikák fejlesztése, a multicentrikus osteosarcoma munkacsoportok létrejötte (ortopédsebész, radiológus, patológus, onkológus), az eredményeket tovább javította, és az 1990-es évek elejére a korai, alacsony malignitású stádiumokban 75-85%-os ötéves túlélést is sikerült elérni. 31,32,33,34,35,36 A kombinációs kemoterápia alkalmazásával, az idoben felismert esetek 80-85%-ában nyílik lehetoség végtagmegtartó mutétek elvégzésére, és egyre nagyobb számban kerül sor a távoli áttétek metasztazektomiájára is. Európában a legelterjedtebb, nemzetközileg elfogadott kezelési séma, az úgynevezett COSS (Cooperative Osteosarcoma Study) protokoll. 32,33,34,37,38 Az eredmények további javítása céljából a nemzetközi munkacsoportok két újabb kezelés bevezetését tervezik, az EURAMOS (European-American Multicentric Osteosarcoma Study) protokollt, amelyben a kombinált kemoterápiát immunterápiával egészítik ki és az Euro-B.O.S.S (European Bone Over 40. Sarcoma Study) protokollt. Utóbbi egy multicentrikus prospektív study, amelyben a nagy dózisú methotrexat nem szerepel, mivel a 40 év feletti osteosarcomás betegek nehezen viselik a methotrexat súlyos mellékhatásait.39,40
10
Bevezetés A kemoterápiára jól válaszoló esetek ötéves túlélése 91-95% között mozog, a kemoterápiára kevésbé reagáló daganatoknál ez mindössze 50-60%. Utóbbi betegcsoportban szignifikánsan magasabb a relapszus ráta,
28,41,42
a betegek több mint
40%-ában a betegség progrediál és halálhoz vezet a pulmonális metasztázisok kialakulása miatt.43,44 Az osteosarcoma adverz prognosztikai faktorai: a metasztázis jelenléte a diagnózis idejében, a 40 év feletti életkor, a férfi nem, a nem végtagi lokalizáció, a tumor nagy térfogata, az emelkedett szérum laktát dehidrogenáz, alkalikus foszfatáz és a rossz hisztológiai válasz a preoperatív kemoterápiára.45,46 Az osteosarcomás betegek szérumából kimutatott „bone sialoprotein” (BSP) és c-erbB2 expresszió rossz prognózisra utalhat, mivel az esetleges mikrometasztázisokat jelentheti. A c-erbB2 esetleg az osteosarcoma egy kis csoportjában terápiás célpontot is képezhet.47 Abban a betegcsoportban, amelyben a prognosztikai faktorok alapján rosszabb kimenetelre lehet számítani még jelentosebbé válik a hatékony kemoterápia szerepe és a hatékonyságát elorejelzo faktorok keresése. Az osteosarcomában alkalmazott kemoterápia prediktív faktorai egyike a szérum TNFα szint, mivel magas értéke gyenge kemoterápiás válasszal kapcsolódik.48 Továbbá a „reduced folate carrier” (RCF) protein alacsony expressziója
a
diagnózis
idején
rossz
válaszreakciót
eredményezett.49
827
osteosarcomás betegen végzett multicentrikus tanulmány a fibroblastos típusnál, ellentétben a chondroblastos típussal, jobb kemoterápiás választ igazolt.50 A számos kutatás ellenére a kemoterápiára adott csökkent válasz továbbra is egy meg nem oldott probléma az osteosarcomás betegekben. A neoadjuváns kemoterápiára adott hisztológiai válasz a túlélo daganatsejtek mértékétol függoen, azaz a Huvos szerinti klasszifikáció,51 jelenleg is a legmegbízhatobb prognosztikai faktornak tekíntheto a betegségmentes túlélés megitélését illetoen.30,52,53 A Huvos szerinti klasszifikáció hátránya azonban, hogy több hét is eltelik mire értékelhetové válik a preoperatív kemoterápiás kezelésre adott válaszreakció.54 Klinikai vizsgálatok igazolták, hogy a kemoterápiára rosszul reagáló betegek esetében alkalmazott agresszívebb kemoterápia nem járt sikkerel, csak az amugy sem elhanyagolható mellékhatásokat tovább növelte.30
Azon betegek esetében akik rosszul reagálnak a kemoterápiára kiemelkedo jelentoségu, olyan új biológiai faktorok meghatározása, amelyek már a diagnózis idejében,
11
Bevezetés megbízható információkkal szolgáltatnak a kemoterápiás választ illetoen. Ebben a betegcsoportban vállik különösen fontossá a gyógyszerek hatékonyságát meghatározó celluláris és molekuláris események megismerése. A tumoros extracelluláris mátrix lehetséges célpontot jelenthet a daganat terápiában. A közelmúltban több kutató laboratóriumban többek között a mi laboratóriumunkban is beigazolódott, hogy az extracelluláris mátrix mikrokörnyezet jelentosen módosítani képes az egészséges és a malignus sejtek fenotipusát,55,56 a tumorsejtek szaporodását,57 invazív és metasztatikus képességét,56 valamint daganatellenes szerekkel szembeni válaszreakcióját.58, 59
2.2 AZ EXTRACELLULÁRIS MÁTRIX (ECM) 2.2.1 Az ECM szerkezete Az
extracelluláris
mátrix
(ECM)
biopolimerekbol
(fehérjék,
proteoglikánok,
glikoproteinek) felépített hálózat, mely részt vesz a szövetek szerkezetének felépitésében. A funkcionális követelményeknek megfeleloen az ECM szerkezete nagyon eltéro lehet. Strukturális fehérjék (kollagének, elasztin), adhezív fehérjék (fibronektin, tenascin, laminin), proteoglikánok és a glükózaminoglikánok tartoznak az ECM biopolimerek családjához (2. ábra).
2. ábra. Az extracelluláris mátrix felépítése.
12
Bevezetés
2.2.2 Az ECM átrendezodése Az extracelluláris mátrixot a fibroblastok, a máj csillagsejtek, a chondroblastok, az osteoblastok és az endotél sejtek termelik. A mátrix megújulása szövetenként változhat, kötoszövetben viszonylag gyors, ellentétben a csontban nagyon lassú, amelyben a kollagén életideje 10 év is lehet. A mátrix szintézis fo stimulátora a transzformáló növekedési faktor ß1 (TGF β1). Emellett más növekedési faktorok, citokinek, transzformáló növekedési faktor α (TGFα), tumor nekrózis faktor α (TNFα), epidermális növekedési faktor (EGF), bázikus fibroblast növekedési faktor (bFGF), interleukin-1 (IL-1), vérlemezke eredetu növekedési faktor (PDGF) is részt vesznek a szintézis szabályozásában, részben a mátrix fehérjék szintézisének stimulálásával, részben az ezeket termelo sejtek számának növelésével. A mátrix lebontását a proteázok, elsosorban a metalloproteinázok (MMP) végzik, ez utóbbiak fo jellemzoje, hogy katalitikus aktivitásukhoz cink szükséges az enzim aktív centrumában. Zimogén formában szekretálódnak, proteázok, vagy szerves higany vegyületek aktiválják oket. Aktiválásuk során kb. 10 kDa méretu peptid hasad le. cDNA szinten homológiát írtak le a különbözo csoportok között, egy vagy több ECM komponenst hasítanak. A szöveti metalloproteináz inhibitor (TIMP) gátolja oket.60,61
2.2.3 Az ECM szerepe a szöveti muködés szabályozásában Az ECM aktív részese a szöveti muködésnek. A parenhímasejtek és az oket körülvevo ECM és stróma ökoszisztémát alkotnak, mely elengedhetetlen a differenciált és szabályozott muködéshez. Az ECM illetve annak egyes komponensei nemcsak a szövet specifikus szerkezet kialakításáért felelosek és az intercelluláris kapcsolatok megteremtésében vesznek részt, hanem újabb megfigyelések szerint; közremuködnek a sejtek proliferációjában,62 differenciációjában,63,64 szövetspecifikus muködésében,65 életképességének fenntartásában66 valamint a biokémiai és a celluláris szerkezetet szabályozó jelátvitelben.67,68 Az ECM proteinek befolyásolhatnak egyéb biológiai folyamatokat, mint a sejtek letapadása, szétterülése, sejtpolaritása és migrációja.69,70 Bár még csak körvonalaiban jellemezheto az ECM hatásmehanizmusa: az eddigi vizsgálatok arra utalnak, hogy az integrin rendszeren keresztül az ECM több celluláris szabályozó
13
Bevezetés faktor expresszióját és muködését képes megváltoztatni, mint például a ciklin függo kinázokat és azok gátlóit valamint a tumor szupresszor proteineket.71,72
2.2.4 A tumoros ECM szerepe a daganatok progressziójában Az ECM–sejt interakció eltérése több kóros állapot, így a malignus transzformáció és progresszió jellemzoje. Megállapítást nyert, hogy az ECM–sejt kölcsönhatás jelentosen módosul a malignus transzformációt követoen, melynek következtében megváltozik a differenciált szövetek háromdimenziós szerkezete.73 Számos vizsgálati eredmény alapján megállapítható, hogy a tumorsejt egyfelol az ECM-ben raktározott növekedési faktorokat hasznosítja, másfelol a metasztatizáló növekedés igényének megfeleloen alakítja át az ECM-et tumoros extracelluláris mátrixszá. 74 Ennek ellenére, a megváltozott mennyiségu és összetételu tumoros ECM továbbra is felügyeli a sejt muködését.75,76 A daganatsejtek úgynevezett "neostrómát" termelnek, vagy olyan mediátorokat szintetizálnak, melyek a stróma nem tumoros sejtjeit mátrixtermelésre serkentik. A daganatsejtek növekedésük és terjedésük során a már meglévo strómát lebontják. A daganatok strómája eltér a kiindulási szövetben található strómától. A proteoglikán és a fibronektin depozíció a tumoros strómában gyakori. 77 Struktúrfehérjék, mint a kollagének és elasztin, valamint adhezív és antiadhezív molekulák, mint a laminin, fibronektin, entaktin, tenascin és a proteoglikánok egyaránt kimutathatók a daganatos strómában. 78 A stróma sejtes elemei és a mátrixban található fehérjék egyaránt befolyásolhatják a daganat viselkedését.79 Szinte minden mátrixfehérje képes a sejtek biológiai viselkedésének befolyásolására. 80 Az integrinek, mint az ECM mátrixfehérje receptorai kollagént, laminint, fibronektint képesek megkötni, amelyek hatására a sejtfelszíni receptorok citoplazmatikus domain-je foszforilálódik a citoszkeleton átrendezodésével, és egyes jelátviteli intracelluláris szignál útak aktiválódnak.81,82,83 A daganatsejt-mátrix kölcsönhatás rendkívül fontos a daganatinvázió és áttétképzés során,84 elsosorban a mátrix degradáló enzimeknek (MMP), azok gátlóinak (TIMP), adhéziós molekuláknak, motilitási faktoroknak van szerepük.85,86
14
Bevezetés
2.2.5 A proteoglikánok A proteoglikánok (PG) típusosan sejtfelszíni és extracelluláris mátrix (ECM) fehérjék.87,88
Egy
vázfehérjébol
és
savas
karakteru
cukorláncokból,
a
glükózaminoglikánokból (GAG) állnak. Bár a PG-ok és a GAG-ok súlyszerint csak kis százalékát teszik ki az extracelluláris mátrixnak (4-8%), mégis képesek modulálni a sejtek közti információcserét, interakcióba lépve számos ECM és sejtfelszíni komponenssel. 89,90 Aktív szerepet játszanak az intra- és/vagy extracelluláris eseményekben. Különbözo enzimeket, szignálokat képesek kötni, aktiválni vagy inaktiválni.
Részt
vesznek
a
növekedési
faktorok
aktiválásában,
és
azok
lokalizációjának meghatározásában is. 91,92,93 A magba jutó cukorláncok révén a sejtproliferáció szabályozásában is fontosak, amit alátámaszt az a megfigyelés, hogy kulcsfontosságú magi enzimek aktivitását (pl. topoizomeráz) heparinnal gátolni lehet.94,95,96 Fontosak az extracelluláris mátrix proliferációval járó folyamatokban, sejtvándorlással kísért folyamatokban (daganatok inváziója és metasztatizálása), ott, ahol a sejt mikrokörnyezetbeli változása miatt szabályozási zavarok lépnek fel (daganatok autoregulációja).91,97 Gyakran fordul elo a proteoglikánok, ezek közül is elsosorban a kondroitinszulfát proteoglikánok, fokozott depozíciója a daganatos mátrixban.98 Mennyiségük akár a normális szövetben mértnek 10-20-szorosa is lehet.99 A melanómában, hepatocelluláris carcinomában, veserákban a heparánszulfát proteoglikánok is felszaporodnak.100 ? tumorsejtek termelhetnek olyan fehérjéket, melyeket az ép sejt nem szintetizál. A májrákokban megfigyelt heparánszulfát fokozódás elsosorban a perlekán cukorláncait reprezentálja, de az újabb vizsgálatok szerint az agrin a másik heparánszulfát cukorláncú proteoglikán, ami jellemzo a májtumorra.
99,101
Agrint más daganatban még nem detektáltak. Mindezek alapján
látható, hogy a daganatos ECM egyik meghatározó komponense a perlekán, illetve az agrin. Az utóbbi évek számos olyan ismeretet halmoztak fel, amelyek alapján a proteoglikánoknak
egyre
nagyobb
szerepet
progressziójában.
15
lehet
tulajdonítani
a
daganat
Célkituzések
3 CÉLKITUZÉSEK Az osteosarcoma kezelésében elért jelentos eredmények ellenére, marad egy betegcsoport akinél nem, vagy kevésbé lehet terápiás választ elérni a jelenlegi kemoterápiás szerek alkalmazásával. A kezelési eredmények további fokozása olyan daganat elleni vegyületektol várható, amelyek újabb támadási pontra irányulnak. Munkám középpontjába a human osteosarcoma sejtek és az extracelluláris mátrix kölcsönhatását helyeztem, azzal a céllal, hogy megállapítsam az extracelluláris mátrix szerepét az osteosarcoma progressziójában és citoreduktív kezeléssel szembeni válaszreakcióban. Az extracelluláris mátrix hatását a humán osteosarcomára egy háromdimenziós extracelluláris mátrix modell és egy általunk kialakított humán osteosarcoma sejtvonal segítségével vizsgáltam. Részleteiben az alábbi kérdések, feladatok kerültek megfogalmazásra: 1. Kialakítani olyan vizsgálati modellt, amely alkalmas a humán osteosarcoma preklinikai tanulmányozására. 2. Meghatározni az extracelluláris mátrix szerepét a humán osteosarcoma progressziójában. 3. Jellemezni
az
extracelluláris
mátrix
szerepét
az
osteosarcoma
sejtek
szaporodását és invazív viselkedését szabályozó mechanizmusokban. 4. Megvizsgálni az extracelluláris mátrix szerepét a human osteosarcoma citosztatikumokkal szembeni viselkedésében és válaszreakciójában. 5. Kialakítani olyan in vitro modellt, amelyben a tumorsejtek az ECM-be vándorolnak és ezáltal alkalmassá vállik a citosztatikumok proliferációt és invázió gátló hatásának az összehasonlítására. 6. Megállapítani, az extracelluláris mátrix biopolimerek közül, melyiknek van a legnagyobb mértékben szerepe az osteosarcoma sejtek agresszív viselkedésében és citosztatikumokkal szembeni eltéro válaszreakciójában. 7. Megvizsgálni, hogy az ECM biopolimer szintézisének a gátlása hasznosítható-e az osteosarcoma kemoterápia hatékonyságának a növelésében.
16
Anyagok és Módszerek
4 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1 ANYAGOK 4.1.1 Szövettenyészeti anyagok és vegyszerek A szövettenyészeti tápfolyadék (RPMI-1640), a tripszin-EDTA oldat (0.5 g/l tripszin, 0.2 g/l EDTA), a penicillin, a sztreptomicin, a kollagenáz IV, a DN-áz valamint a hialuronidáz I a Sigma (Irvine, Anglia) és a Gibco BRL (Eggenstein, Németország) termékei. A gentamicin a Sanofi-Aventis (Budapest, Magyarország) terméke. A foetalis marhaszérum protein a GMK (Gödöllo, Magyarország) terméke. A nagy tisztaságú vegyszerek a Sigma (St. Louis, MO, USA), a Merck (Darmstadt, Germany) és a Boerhinger Ingelheim (Heidelberg, Németország) termékei. A diszpáz a Boehringer Mannheim-tol (Mannheim, Germany) származott. Az acridinorange-etidium-bromid és a propidium-jodid a Sigma termékei. A 20 MBq [14C]-glükózamin (CBS 109 D-a) a NenTM Life Science Products, Inc (Boston, NY, USA) terméke. A topoizomeráz enzimek a Topogen-tol (Columbus, OH, USA) származtak.
4.1.2 Antitestek és vektorok Antitestek A monoklonális anti-egér osteokalcin Dr. D. Baylink, University Loma Linda, USA ajándéka. A monoklonális anti-egér osteopontin (LF-123 klón), a poliklonális anti-nyúl dekorin IgG (LF-113 klón) és a monoklonális anti-egér kollagén-I-c-peptid Dr. L.W. Fisher, NIH, Washington, USA ajándékai. A monoklonális egér anti-humán p53 (DO-7 klón), Rb (Rb1 klón), PCNA (PC-10 klón), Ki-67 (Ki-67 klón) ellenanyagok a DAKO (Glostrup, Dánia) termékei. A monoklonális egér anti-humán integrin ß1 ellenanyag (JB1a klón) a Chemicon (Temecula, USA), a monoklonális egér anti-humán p34cdc2 ellenanyag (Bcdc2.1 klón) a Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany), a monoklonális egér anti-humán ciklin B1 (7A9 klón), ciklin D1 (P2D11F11 klón) ellenanyagok a Novocastra Laboratories Ltd. (Newcastle Upontyne, UK) termékei. A poliklonális nyúl anti-humán topoizomeráz II alpha ugyancsak a Novocastra Laboratories Ltd. terméke. A poliklonális humán antiszérum anti-humán topoizomeráz I (scl-70, autoimmun IgG) a Topogen-tol (Columbus, Ohio, USA) származott. A
17
Anyagok és Módszerek monoklonális egér anti-humán agrin (7E12 klón) Dr. Kemény Éva27 ajándéka, a monoklonális egér anti-humán perlekán (A7L6 klón) ellenanyag a Chemicon (Temecula, USA) terméke.
Másodlagos reagensek: peroxidáz jelölt anti-nyúl IgG (DAKO) és biotinált antinyúl, anti-egér IgG (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories, USA).
Egyéb reagensek: a sztreptavidin–fluoreszcein az Amersham (Buckinghamshire, UK) terméke. A peroxidázzal jelölt protein a Bio-RAD (Hercules, CA, USA), az ABC (Vectastain Elite ABC) Kit a Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA) termékei. A biotinált tiramin törzsoldatot (7 mM biotinált tiramin törzsbol 1:125 hígításban, 0.033% H2O2 hozzádadásával, 10 perc, 37ºC inkubálással) Merz és munkatársai102 leírása alapján készítettük. Elohívásra használt reagensek: Az elohívást kemilumineszcens 103 luminol (3aminophtalhidrazid) és p-kumársav reagensek (Sigma, St. Louis, MO, USA) segítségével, vagy 3,3’-diaminobenzidin tetrahidroklorid (DAB) (Sigma, St. Louis, MO, USA) segítségével végeztük.
Vektor pBR322: Promega, Madison, USA
4.1.3 Daganatellenes gyógyszerek A methotrexat és a cisplatin a Lachema (Brno, Csehország), a maphosphamid az ASTA Medica (Budapest, Magyarország), a doxorubicin a Pfizer Kft.-tol (Budapest, Magyarország) származtak. A clodronat a Roche Kft. (Budapest, Magyarország) ajándéka volt. A topotecan a Smithkline Beecham (King of Prussia, USA) ajándéka volt, az etopozid a Bristol Myers Squibb Oncology-tól (USA) származott.
18
Anyagok és Módszerek
4.2 MÓDSZEREK 4.2.1 OSCORT sejtvonal kialakítása
3. ábra. OSCORT sejtvonal kialakításának sémája 4.2.1.1 Primer humán osteosarcoma 1996-ban a Semmelweis Egyetem Ortopédiai Klinikán egy 17 éves fiúgyermek bal humerus proximális metaphysisében lévo elváltozás szövettani vizsgálata primer centrális osteosarcomát igazolt. Az osteosarcoma xenograft sejtvonal kialakítása és fenntartása, a beteg írásos beleegyezésével és a Semmelweis Egyetem Etikai Bizottságának szabályai alapján történt. Az állatkísérleteket a Semmelweis Egyetem az állatkísérletekre vonatkozó 100/1999 számú szabályzata szerint végeztük. Az I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben végzett vizsgálatokat a Budapesti Száma:25-20/2001) engedélyezte és ellenorizte.
19
Àllatorvosi Központ (eng.
Anyagok és Módszerek 4.2.1.2 HTB-2 és HTB-9 xenograftok kialakítása A
szövettani
mintavétel
során
eltávolított
tumoros
szövet
fragmentumait
immunszuppresszált CBA/CA egerekbe ültettük subcutan, a gerincoszlop két oldalán. A CBA/CA hím egerek genetikai azonosságát rendszeres bortranszplantációs teszttel ellenoriztük. A mesterséges immunszuppressziót a négyhetes állatok thymectomiájával majd hét nap múlva 0.358 Gy/perc dózisú egésztest besugárzásával értük el Pickard és munkatársai104 módszere alapján. Az állatokat légkondicionált állatházban tartottuk, 25°C homérsékleten és 55%-os relatív páratartalomnál. A daganat megeredt, a tumor szövettanilag stabilizálódott, az 50. passzázst követoen is megtartotta eredeti szövettani szerkezetét. A kialakított xenograftot HTB-2 xenograftnak neveztük el (3. ábra). A HTB-9 xenograftot a preoperatív kemoterápiát követoen, a definitív mutét során eltávolított tumorból az elobb leírtak alapján alakítottuk ki. 4.2.1.3 OSCORT szövettenyészeti sejtvonal kialakítása Az eredeti szövettani szerkezetét megtartó HTB-2 xenograft 3. passzázsból, OSCORT jelzéssel szövettenyészeti sejtvonalat indítottunk. A HTB-2 xenograftból 2x2x2 cm-es tumort eltávolítva, további több 0.5x0.5x0.5 mm-es nekrózis mentes fragmentumokat nyertünk. A fragmentumokat enzimatikus módszerrel emésztettünk (0.0071 g kollagenáz IV, 0.005 g DN-áz, 0.00044 g hialuronidáz I, 10 ml RPMI-1640 tápfolyadékban) 37°C-on, 30 percig enyhe mechanikus keverés mellett. A sejteket steril gézen megszurtük, az életképességüket tripánkék kizárási teszttel105 meghatároztuk és Buerker kamrában megszámoltuk (91% ± 2.16). A primer tenyészetbol alakítottuk ki az OSCORT sejtvonalat, amelyet 37oC-on, 5% CO2 atmoszférában, RPMI-1640 médiumban tartottuk fenn, 10% foetal calf szérum (FCS), penicillin (100 unit/ml médium) és sztreptomicin (100 µg/ml médium) jelenlétében. Az OSCORT sejtek kontaminációját folyamatosan ellenoriztük, és az esetenként eloforduló mycoplasma fertozést sikeresen elimináltuk.
4.2.1.4 OSCORT sejtvonal humán eredetének igazolása A sejtvonal humán eredetét laktátdehidrogenáz (LDH)–izoenzim identifikálásával és citogenetikai vizsgálatokkal igazoltuk.
20
Anyagok és Módszerek Az LDH–izoenzim identifikálást Montes és munkatársai106 módszere alapján végeztük. Röviden: Frissen eltávolított egér májat, humán szívet és májat, illetve tumorszövetet folyékony nitrogénben porítottunk. Az 0.1 gr szövethez 1 ml 0.9% NaCl + 0.66 mM EDTA oldatot adtunk és 15 másodperc ultrahangozást követoen 4°C-on 30 percig inkubáltuk. Az inkubálást, majd a 4°C-on, 12000 rpm-el való 20 perces centrifugálást követoen, a felülúszó 40 µl-éhez 60 µl 1.7%-os folyékony agarózt adtunk és 4°C-on, 30 mA-el 3 óráig futattuk. Az izoenzimek, a reagens puffer [5 mg tetrazolium bluechloride (Sigma T 4375), 5 mg KCN, 10 mg NAD, 0.25 mg phenazin methosulfate (Sigma P 9625), 0.25 M lítium-laktát, 6 ml PBS, pH:7.6] agaróz-gélre való rétegzést követoen váltak detektálhatóvá.
Citogenetikai vizsgálatok: Dr. Major Jeno az alábbiak szerint vizsgálta az OSCORT sejtek kariotípusát. Az OSCORT tenyészetben a mitózisokat 2x10-7 M kolcemiddel Gibco BRL (Eggenstein, Németország) 2 óra hosszat kezeléssel leállította, a sejteket 0.02% EDTA segítségével a felszínrol leválasztotta, és a metafázisokat 30 perces 0.075 M KCl hipotonizálást követoen háromszor fixálta jéghideg jégecet, metanol (4:1) eleggyel, majd jéghideg, nedves tárgylemezre cseppentette. A levegon szárított, háromnapos preparátumokat három óra hosszat, 60°C-on ASG sávozással festette (0.3 M NaCl, 0.03 M Na-citrát, és 2.5% Giemsa, pH:6.8) Comings nyomán. 107 A kromoszómákat 100 metafázisban megszámolta, illetve a szerkezeti elváltozásokat analizálta a CNN VisualMouse (MTA-SZTAKI) számítógépes képelemzo rendszer segítségével.
4.2.2 ECM eloállítása és ECM biopolimerek izolálása 4.2.2.1 ECM eloállítása EHS sarcomából (EHS-ECM) Extracelluláris mátrix izolálási forrásként az ECM-ben gazdag egér Engelbreth–Holm– Swarm (EHS) sarcomát108 használtuk Kramer és munkatársai módszerét követve (EHSECM),109 azonban az állatok lathyrizálása nélkül, így ezzel az izolálási módszerrel kollagén IV-et kis mennyiségben tartalmazó extraktumot kaptunk.110 Az EHS-ECM (ECM-gél) és a kereskedelmi matrigél (Becton Dickinson, Bedford, MA, USA) SDS–
21
Anyagok és Módszerek PAGE és immunoblot analízissel történo összehasonlítása azonos mennyiségu laminint, fibronektint, entaktint és heparánszulfát proteoglikánt mutatott ki. 109
4.2.2.2 ECM biopolimerek izolálása A laminint, entaktint és kollagén IV-et az EHS-ECM-bol izoláltuk Kleinman és munkatársai, 110 valamint Bissell és munkatársai111 leírása alapján. A heparánszulfát proteoglikánt (HSPG), proteoglikán izolálás módszerével állítottuk elo az EHS-ECMbol Lyon és Gallagher módszere szerint.112 A fibronektin a Sigma-tól (St. Louis, MO, USA) vettük.
4.2.2.3 ECM eloállítása OSCORT sejtekbol (OSCORT-ECM) Az OSCORT sejtek által termelt extracelluláris mátrix izolálását (OSCORT-ECM) Fuks és munkatársai113 módszere szerint végeztük. Röviden: 106 OSCORT sejtet tenyésztettünk T-25 sejttenyészto edényben (Sarstedt, Germany) 5 ml RPMI-1640 médiumban. 96 óra múlva, a médiumot eltávolítottuk és a sejteket 0.5% Triton X–100, 20 mM NH4OH (pH 7.4) PBS-ben lizáltuk 3 percig. A sejtmentes OSCORT-ECM-et négyszer mostuk PBS-el, majd 10 mM EDTA-val szolubilizáltuk.
4.2.3 Sejttenyésztési és citosztatikus kezelési módszerek 4.2.3.1 Sejttenyésztés ECM-gél jelenlétében Az OSCORT sejteket 24 lyukú tenyésztoedényben (Greiner, Nürtingen, Germany) inkubáltuk 48 órán át (4. ábra). A sejtek (7x104 sejt/cm2) 48 órás szérumos médiumban történo tenyésztése alatt letapadtak és egyszeri osztódásukkal a sejtszámuk megduplázódott (14x104 sejt/cm2). Vizsgálatainkban ezt a sejtszámot tekintettük kiindulási sejtszámnak és a negyvennyolcadik óra végét kiindulási idopontnak (0. óra). Ezt követoen a médiumot eltávolítottuk és a sejtek felére 200 µl savós médiumot, másik felére 200 µl ECM-extraktumot rétegeztünk (10 mg/ml fehérje koncentráció savós RPMI-1640-ben). Fél órás inkubáció után a gélesedett (polimerizálódott) extraktumra és a médiumot tartalmazó tenyésztoedényekbe is, még 400 µl savós médiumot adagoltunk. A sejteket, amelyekre ECM-gélt rétegeztünk a továbbiakban ECM-gélen tenyésztett sejteknek, nevezzük. A sejteket, amelyeknek csak médiumot adtunk a továbbiakban
22
Anyagok és Módszerek plasztik felszínen vagy monolayerben tenyésztett sejteknek nevezzük. A 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 órás újabb inkubációk alatt sejtproliferációt, sejtviabilitást, tumor szuppresszor és sejtciklus asszociált fehérjék expresszióját, sejtéletciklus paramétereit, topoizomerázok aktivitását, DNS fragmentációt vizsgáltunk, valamint morfológiai megfigyeléseket végeztünk.
4. ábra. Sejttenyésztési és citosztatikus kezelési módszerek sémája
4.2.3.2 Sejttenyésztés ECM-gél biopolimerek jelenlétében Az extracelluláris mátrixot alkotó biopolimerek (laminin, fibronektin, entaktin, kollagén IV, heparánszulfát proteoglikán) hatását külön is vizsgáltuk az OSCORT sejtek sejtbiológiai és biokémiai viselkedésére. A biopolimereket 10 µg/ml, 50 µg/ml és 100 µg/ml fehérje koncentrációban adagoltuk. Sejtproliferációs vizsgálatainkhoz a tumorsejteket 96 lyukú tenyésztoedényben (Greiner, Nürtingen, Germany) tenyésztettük. Az OSCORT sejtek (104 sejt / well) 48 órás szérumos médiumban történo tenyésztése után a sejtszám megduplázódott (2x104 sejt/well) (kiindulási sejtszám és idopont). A médium eltávolítása után a sejtekre 200 µl médiumot, illetve 200 µl ECM biopolimereket rétegeztünk. 72 órás újabb
23
Anyagok és Módszerek inkubációt
követoen
a
proliferációt
a
szukcinát-dehidrogenáz
teszt
(MTT
assay) 114,115,116,117,118 segítségével értékeltük. Az ECM (EHS-ECM, OSCORT-ECM) koncentrációfüggo hatásának vizsgálatához az ECM-gélt több koncentrációban is adagoltuk (10-, 50-, 100 µg/ml) a biopolimerekkel megegyezo módon. A fehérje expressziós és aktivitás, valamint a sejtéletciklus paraméterek vizsgálataihoz a sejteket 24 lyukú tenyésztoedényben tenyésztettük az ECM-géllel végzett kísérleteinkkel hasonló módon. Ebben az esetben az ECM biopolimerek, valamint az OSCORT-ECM fehérje koncentrációja 100 µg/ml volt.
4.2.3.3 Citosztatikumok hatásának vizsgálata Az OSCORT sejteket a 0. órában, az osteosarcoma kezelésében használt különbözo dózisú
(0.01-10
maphosphamid
µg/ml)
citosztatikumokkal
(4-hydroxy-cyclophosphamid,
kezeltük amely
a
[methotrexat,
cisplatin,
cyclophosphamid
aktív
metabolitja és amely, aktív in vitro), doxorubicin (DOX)] 4 illetve 24 órán át mind a 24 mind a 96 lyukú tenyésztoedényekben (4. ábra). A kezelést követoen a sejteket 2x mostuk savó mentes RPMI-1640 médiummal, majd ezt követoen rétegeztük az ECMgélt, illetve az ECM biopolimereket és inkubáltuk az elobb leírt módszer alapján. Az alkalmazott citosztatikumok (a sejtnövekedés 50%-os gátlásához szükséges) IC50 értékekeit nem lineáris közelíto görbe felvételével határoztuk meg a Dose–Effect Analysis software (Elsevier–Biosoft, Cambridge, UK) segítségével.
4.2.3.4 Sejtek izolálása a háromdimenziós tenyészetbol Az ECM-gél jelenlétében tenyésztett sejtek egy része az ECM-gélbe migrált. Az inkubálási ido végén, az ECM-gélt a sejtekkel együtt óvatosan, mechanikusan, elkülönítettük az ECM-gélbe nem migrált sejtektol (monolayer). A sejteket az ECMgélbol 20 perces, szobahomérsékleten lévo 2.5 mg/ml diszpázzal való emésztéssel választottuk el. A diszpáz az ECM-gélt emészti szabaddá téve a sejteket. A diszpázt 53.7 µmol/l EDTA-val állítottuk le, majd háromszor mostuk a sejteket PBS-el. A gél fragmentumainak eltávolítását mikroszkóppal ellenoriztük. A monolayer, plasztikon maradt sejteket, valamint a kezdettol fogva plasztik felszínen tenyésztett sejteket tripszin-EDTA segítségével választottuk le a felszínrol. Morfológiai és biokémiai vizsgálatokat végeztünk a plasztik felszínen tenyésztett sejtek, valamint az ECM-gél
24
Anyagok és Módszerek jelenlétében tenyésztett sejtek (ECM-gélbe migrált + ECM-gélbe nem-migrált). Esetenként külön vizsgáltuk a migráló és a nem-migráló sejtpopulációkat.
4.2.4 A sejtproliferáció vizsgálata A sejtproliferációt több módszerrel tanulmányoztuk. A sejteket megszámoltuk Buerker kamrában vagy az MTT teszttel határoztuk meg a sejtpopuláció nagyságát. A sejtek életképességét tripánkék kizárási teszttel, 105 állapítottuk meg, továbbá az apoptotikus, nekrotikus sejtek mennyiségét fluoreszcens mikroszkópiával (Zeiss Axiolab, Jena, Germany), acridinorange–etidium-bromid kombinált festés (1 µg/ml – 1 µg/ml, 2 percig) után határoztuk meg.119 Az OSCORT sejtek repopulációs kapacitásának a tanulmányozására a plasztik felszínen és ECM-gélen történo 24-168 órás tenyésztés után a sejteket plasztik felszínre vittük (7x104 élo sejt/well) és 24-120 óráig inkubáltuk.
4.2.5 Az invazív növekedés vizsgálata in vitro Az
ECM
biopolimerek
hatását
az
OSCORT
sejtek
invazív
növekedésére
háromdimenziós módszer alapján vizsgáltuk.59 AZ OSCORT sejteket 48 órán át tenyésztettük 50 µg/ml ECM biopolimerek jelenlétében. Az inkubálást követoen a sejtekre 0.75% agaróz-gélt rétegeztünk és a sejteket tovább inkubáltuk még 24 órán át. Az ECM biopolimer hatástól függo arányban az agaróz-gélbe migrált sejteket óvatosan, mechanikusan eltávolítottuk a monolayerben maradt, nem-migrált sejtektol. Mindkét sejtcsoportban, a tripszin-EDTA kezelést és PBS-el való mosást követoen, sejtszámolást végeztünk Buerker hemocitométerben.
4.2.6 Morfológiai vizsgálatok 4.2.6.1 Citológiai vizsgálatok A sejteket 235 g-vel szobahomérsékleten centrifugáltuk 10 percig Haereus kilendülorotoros centrifugában. A sejtüledéket PBS-ben szuszpendáltuk fel [170 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4, 5.9 mM Na2(HPO4)2, pH:7.4], 106 sejt/ml PBS denzitásban. A mintákat 100 µl sejtszuszpenziónként (105 sejt) Shandon citospin segítségével 450
25
Anyagok és Módszerek rpm-el 5 percig tárgylemezre centrifugáltuk. A citospin keneteket vagy hematoxilineozinnal (HE) festettük, a standard festési és víztelenítési protokoll szerint, vagy immuncitokémiai vizsgálatokat végeztünk. Ezzel a módszerrel az elpusztult vagy szétesett sejteket is megfigyelhettük, teljes képet kapva a bekövetkezett morfológiai változásokról.
4.2.6.2
Sejtéletciklus vizsgálata
Az OSCORT sejteket 235 g-vel szobahomérsékleten centrifugáltuk 10 percig Haereus kilendülo-rotoros centrifugában, majd PBS-ben szuszpendáltuk, 106 sejt/ml PBS denzitásban, újra 235 g-vel 10 percig szobahomérsékleten centrifugáltuk, majd C + T pufferben [0.1% citrát, 0.1% triton X-100, 0.05 mg/ml RN-áz, pH:7.3] vettük fel oket, az elozonek megfelelo denzitásban. Az áramlási citometriás méréseket, az elokészítést követoen 24 órán belül végeztük el. Az áramlási citometriás elemzés elott a sejteket 50 µg/ml koncenrációban propidiumjodiddal festettük 20 percig. Az adatok felvétele FACSScan flow citométer készülékkel történt (Becton–Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA), propidium-jodid fluoreszcencia jelt, valamint forward és side scatter paramétereket vettük fel. A sejtciklus elemzést Robinovitch-féle Multicycle (Phoenix Flow Systems Inc., San Diego, CA, USA) szoftverrel végeztük.
4.2.7 Immunhisztokémia és immuncitokémia 4.2.7.1 Immunhisztokémia Az
osteosarcoma
molekuláris
markereinek
kimutatását
Dr.
Battmann
A.
Laboratoriumával (Institute of Pathology, Klinikum of Justus-Liebig-University, Giessen, Germany) eggyüttmuködve végeztük el. Immunhisztokémiára 5 µm vastag fagyasztott mintákat készítettünk kriosztáttal, majd metanolban (10 perc) és acetonban (10 másodperc) -20 ºC-on fixáltuk. A formalinban fixált, paraffinba ágyazott anyagok antigén feltárása a deparaffinálást követoen részben proteáz emésztéssel történt (0.01% tripszin a dekorin antitestnél, 10 perc 37ºC). A dekorinnál a proteáz emésztést megelozoen mikrohullámos antigén feltáró kezelés volt szükséges (0.01 M pH:4.0 citrát pufferben forraltuk a mintákat 3x5 percen keresztül). Ezt követoen az endogén
26
Anyagok és Módszerek peroxidázt 10% H2O2-t tartalmazó metanollal blokkoltuk. Az antitest aspecifikus kötodését 5% BSA inkubálással eloztük meg (60 perc, 37ºC). Az elsodleges antitesteket az alábbi hígításokban használtuk: monoklonális anti-egér osteokalcin 1:800, monoklonális anti-egér osteopontin 1:100, poliklonális anti-nyúl dekorin IgG 1:2000, monoklonális anti-egér kollagén-I-c-peptid 1:200. Másodlagos antitestként peroxidáz jelölt anti-nyúl IgG-t (DAKO) és biotinált anti-nyúl, anti egér IgG-t (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories, USA) használtunk 1:200 hígításban, 30 percig 37ºC-on. Biotinált másodlagos antitestnél ezt ABC inkubálás (45 perc 37ºC-on) követte. Az immunreakció érzékenységét biotinált tiraminnal fokoztuk. Ismételt ABC reakció után az immunreakciót 0.05 mg/ml DAB kromogénnel hívtuk elo. A háttérfestés hematoxilinnel történt.
4.2.7.2 Immuncitokémia A citospin keneteket metanol-aceton módszerrel fixáltuk (15 perc metanol –20°C-on, 3 másodperc aceton), majd egy éjszakán át blokkoltuk 5% marha szérumalbumin – PBS oldattal, amely 0.5% Triton X-100 és 20 mM NH4OH-t tartalmazott (pH:6.5). Másnap primer anti-p53 ellenanyaggal 1:200 hígításban, anti-topoizomeráz II esetén 1:200 hígításban reagáltattuk a keneteket 4oC-on egy éjszakán át. A primer antitestek reakcióit a Vector biotinált univerzális másodlagos antitestével, majd sztreptavidin-fluoreszcein 1:200 hígításával mutattuk ki. A sztreptavidin-fluoreszcein oldat 2 µg/ml propidiumjodidot tartalmazott a sejtmagok kimutatása céljából. A FITC-propidium-jodid tartalmú oldattal történt elohívást mosási lépések követték, a vizsgálandó citospin mintákat citifluorral fedtük és BioRad MRC 1024 konfokális lézer scanning mikroszkóppal vizsgáltuk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), a piros és zöld fluoreszcens képeket és a fáziskontraszt képet is felvettük.
4.2.8 Biokémiai vizsgálatok 4.2.8.1 Sejtmagizolálás, sejtmagi és citoplazmatikus fehérjék eloállítása A sejtmagi fehérjekivonatokat a szövettenyészeti sejtekbol Duguet és munkatársai120 módszere szerint állítottuk elo, Sullivan és munkatársai121 módosításával. Röviden: Potter homogenizátorban a sejteket hipotóniás oldatban homogenizáltunk, amit a sejtmagok 2000 g-vel, 10 percen át, 4ºC-os centrifugálása követett. A felülúszót
27
Anyagok és Módszerek citoplazma extraktként használtunk. A sejtmagi frakciót továbbiakban szacharóz grádiensen tisztítottuk, ezt követoen a 0.35 M NaCl-ban oldható magi fehérjéket a DNS-hiszton komplextol 12000 g-vel, 4ºC-on, 30 percig történt centrifugálással választottuk el.
4.2.8.2 Fehérjek azonosítása immunblot technikával Az OSCORT sejtekbol homogenátumokat készítettünk, amikbol Bradford módszerrel122 fehérje meghatározást végeztünk. A minták 5 µg fehérjetartalmú teljes sejt eredetu aliquotjait, vagy 105 sejtszámra vonatkozó sejtmagi és citoplazma extraktumait Laemlioldattal123 egészítettük ki, és 10%-os standard poliakrilamid gélen futtattuk meg a Bio Rad
MINI
Protean
II
akrilamid
gélelektroforézis
rendszer
segítségével. 124
Proteoglikánok esetén 10 µg fehérje tartalmú EHS-ECM-bol izolált proteoglikánt, valamint 10 µg fehérje tartalmú OSCORT-ECM-et futtattunk meg 4-15% poliakrilamid tartalmú grádiens géleken. Az elektroforézis 35 percig 25 mA/gél áramerosséggel történt. A géleket elektroforézis után: Coomassie Brilliant Blue R250-el festettük, illetve proteoglikánok esetén Alciánkékkel és utána Coomassie-val festettük, vagy tovább blottoltuk. A poliakrilamid gélen elválasztott fehérjéket elektrotranszferrel nitrocellulóz membránra (Bio Rad, Hercules, CA, USA) vagy Millipore (Billerica, MA USA) PVDF membránra blottoltuk. A blottolás 330 mA–rel 90 percig tartó elektrotranszferrel történt. Az antigén-antitest reakciót peroxidázzal jelölt másodlagos antitesttel, illetve a topoizomeráz I esetén peroxidáz jelölt protein A reagenssel kiviteleztük. A legtöbb esetben azonban a biotinált tiraminos erosítéses Vectastain Kit alapú módszert alkalmaztuk.102 Az elohívást kemilumineszcens luminol és p-kumársav reagensek segítségével, vagy DAB kromogénnel végeztük. A kiértékelést Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral (Stratagene, Gebouw, CA, USA) végeztük.
Primer antitest reakciók Anti-humán p53, egér monoklonális: 1:1000, 18 órai reakció, elohívás: Vector ABC Kit, tiramin erosítés. Anti-humán Rb, egér monoklonális: 1:300, 18 órai reakció, elohívás: Vector ABC Kit, tiramin erosítés.
28
Anyagok és Módszerek Anti-humán PCNA, egér monoklonális: 1:500, 18 órai reakció, elohívás: Vector ABC Kit, tiramin erosítés. Anti-humán Ki-67, egér monoklonális: 1:500, 18 órai reakció, elohívás: Vector ABC Kit, tiramin erosítés. Anti-humán integrin ß1, egér monoklonális: 1:300, 18 órai reakció, elohívás: Vector ABC Kit, tiramin erosítés. Anti-humán p34cdc2, egér monoklonális: 1:300, 18 órai reakció, elohívás: Vector ABC Kit, tiramin erosítés. Anti-humán ciklin B1, egér monoklonális: 1:300, 18 órai reakció, elohívás: Vector ABC Kit, tiramin erosítés. Anti-humán ciklin D1, egér monoklonális: 1:200, 18 órai reakció, elohívás: Vector ABC Kit, tiramin erosítés. Anti-humán topoizomeráz II alpha, nyúl poliklonális: 1:200, 18 órai reakció, elohívás: Vector ABC Kit, tiramin erosítés. Anti-humán topoizomeráz I, humán (scl-70, autoimmun IgG) poliklonális: 1:5000, 18 órai reakció, elohívás: 3000x hígított peroxidáz jelölt protein A-val. Anti-humán agrin, egér monoklonális: 1:500, 18 órai, elohívás: Vector ABC Kit, tiramin erosítés. Anti-humán perlekán, egér monoklonális: 1:500, 18 órai reakció, elohívás: Vector ABC Kit, tiramin erosítés.
Tiramin erosítéses elohívás A primer antitest reakciók után a membránokat mostuk, majd amennyiben a primer ellenanyag nyúlban termelt poliklonális vagy egér monoklonális volt, a Vector univerzális
biotinált
antitestét
alkalmaztuk
200x
hígításban,
45
percig
szobahomérsékleten. Mosás után az elore elkészített ABC reagenst raktuk a filterekre 30 percre az A és a B biopolimert 200x hígítva TBS-ben (20 mM TRIS HCl, 150 mM NaCl, pH:7.5). Az inkubálás után megoriztük az ABC reagenst. Ezután újabb mosás következett, majd 10 percre a tiramin reagenst raktuk a filterre szobahomérsékleten (8 µl biotinált tiramin törzs 900 µl TBS-ben + 100 µl 0.3%-os H2O2). Újabb mosás után ismét 30 percre a megorzött ABC reagenst alkalmaztuk. Az elohívás: 0.05% DAB, 0.03% H2O2 tartalmú 0.1 M (pH: 7.1) Tris HCl-ban történt.
29
Anyagok és Módszerek 4.2.8.3 Topoizomeráz aktivitások vizsgálata99 Relaxáció és dekatenáció 2.5x104 OSCORT sejtbol izoláltunk magi extraktumokat topoizomeráz I és II aktivitás meghatározáshoz. A topoizomeráz I enzim katalitikus aktivitását plazmid relaxációs módszerrel vizsgáltuk.125,126 Röviden: A magi extraktumokat 500 ng szuperhélix pBR322 plazmiddal 37ºC-on 30 percig 20 µl standard ATP mentes relaxációs pufferben inkubáltuk [50 mM Tris HCl (pH:7.5), 150 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0.5 mM ditiotreitol, 0.5 mM EDTA, 0.03 mg/ml marha szérumalbumin], majd a reakcióhoz 1 mg/ml végkoncentrációjú proteináz K-t és 3% SDS-t adtunk, és 30 percig 50 ºC-on inkubáltuk. A reakciótermékeket 16 órán át 1%-os agaróz gélen 0.5x TBE pufferben [89 mM Tris-borat, 2 mM EDTA (pH:8.3)], 24 V-on elektroforetizáltuk. A topoizomeráz II aktivitást kinetoplaszt DNS dekatenációjának mértékével határoztuk meg, amihez a következö reakciópuffert [50 mM Tris HCl (pH:7.5), 85 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0.5 mM ditiotreitol, 0.5 mM EDTA, 0.03 mg/ml marha szérumalbumin, 1 mM ATP] használtuk, reakciószubsztrát-ként 200 ng kDNS-t használtuk, illetve a reakciópuffer tartalmazott végkoncentrációban ATP-t is. 127 A reakciótermékeket 4 órán át 1%-os agaróz gélen 0.5x TBE pufferben, 35 V-al elektroforetizáltuk. Az elektroforézist követoen mindkét esetben a géleket 1 µg/ml etidium-bromiddal festettük
és
differenciáltuk
vízben.
A
kiértékelést
Stratagene
Eagle-Eye
II
videodenzitométer képanalizátorral (Stratagene, Gebouw, CA, USA) végeztük.
pBR322 végjelzése A Topo I és II hasítási komplexeinek kimutatására linearizált pBR322 plazmidon a 32P dATP végjelzést hajtottunk végre Klenow DNS polimeráz segítségével. Ehhez eloször Eco RI restrikciós endonukleázzal emésztettük a plazmidot. Az enzim által kialakult ragadós végeket Klenow DNS polimeráz segítségével töltöttük fel (Promega, Madison, WI, USA) a 32P dATP-t használva.126 A polimeráz reakció 15 percig zajlott 30ºC-on, majd 10 perc 75ºC-on történt inkubálással állítottuk le. A be nem épült nukleotidokat Sephadex G50 (Pharmacia) oszlop segítségével, gélszuréssel választottuk el a beépültektol. Ezt BamH1 (Promega) restrikciós enzimmel történt emésztés követte, az
30
Anyagok és Módszerek egyik vég jelzésének eltávolítása céljából. A jelzés után a 100-150 µl plazmid oldat aktivitása 6-8000 cpm/µl volt, és közvetlenül lehetett használni a cleavage reakciókhoz. Hasítási (Cleavage) reakciók 6000 cpm/reakció aktivitású végjelzett, emésztett plazmidot magi extraktummal inkubáltuk unkompetitív gátlók, topoizomeráz I vizsgálata esetén topotecan, topoizomeráz II esetén etopozid és ATP jelenlétében 15 percig, 37ºC-on. A reakciót követoen a mintákat 1 µg/µl proteináz K-val emésztettük 0.5 vegyes % SDS jelenlétében. A topoizomeráz I specifikus hasítás vizsgálata esetén futtatás elott a mintákat NaOH-dal denaturáltuk, majd 0.1% SDS-0.5x TBE futtatópufferben, 1% agaróz gélen, topoizomeráz II specifikus hasítás vizsgálata esetén szokványos 0.5x TBE futtatópufferben futattuk. A mintákat 2 V/cm feszültséggel 12-15 órán át futtattuk, majd a gélt Shandon Speedvac-hoz kapcsolt gélszárítóval szárítottuk. A reakció során keletkezett DNS fragmenteket Kodak X-Omat (Rochester, NY, USA) röntgen film expozícióval mutattuk ki. 126
4.2.8.4 Metalloproteináz (zselatináz) aktivitás vizsgálata A metalloproteináz (zselatináz) izoenzimek kimutatását Heussen és munkatársa,128 valamint Yamagata és munkatársai közleményei alapján, 129 zselatin zymogram módszer segítségével vizsgáltuk. Röviden: 105 OSCORT sejt szérum mentes médiumát koncentráltuk Centricon 31 filteren (Amicon, Millipore, Bedford, MA, USA) keresztül és 2-mercaptoetanolt nem tartalmazó Laemli-oldatban szuszpendáltuk. A 0.75 mm vastag, 0.1% SDS és 300 µg/ml zselatin tartalmú 10%-os poliakrilamid gélen való futtatást követoen, az SDS-t
2.5%-os Triton-X 100 oldattal távolítottuk el. Az
enzimreakcióhoz a gélt 10 mM CaCl2-ot, 0.02% NaN3-t tartalmazó 50 mM-os Tris-HCl (pH:7.4) pufferben inkubáltuk 20 órán át 37oC-on. A zselatinbontó aktivitás kimutatásához 0.2% Coomassie Brilliant Blue R250, 50% metanol, 10% ecetsav tartalmú oldatban festettük a géleket, ami egyben az enzimreakciót is leállította, majd a festést 20% metanolt és 10% ecetsavat tartalmazó oldattal differenciáltuk. A zselatint bontó enzimaktivitás áttetszo csíkként jelent meg a Coomassie R250-nel megfestett gél kék hátterében. A zselatináz zimográfia segítségével az MMP-2 (zselatináz A, 72 kDa kollagenáz IV) és az MMP-9 (zselatináz B, 92 kDa kollagenáz IV) aktivitásokat detektáltunk. A
31
Anyagok és Módszerek kiértékelést Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral (Stratagene, Gebouw, CA, USA) végeztük.
4.2.8.5 A doxorubicin DNS károsító hatásának vizsgálata A doxorubicinnel való kezelést követo 4. és 72. órás tenyésztési ido letelte után DNS károsítást vizsgáltunk agaróz gélelektroforézis és egy-sejt agaróz gélelektroforézis (comet assay) technikákkal. Agaróz gélelektroforézis DNS fragmentek kimutatására A sejteket lecentrifugáltuk, majd 105 sejtenként 10 µl lízis pufferben (5 mM TRIS-HCl, 2 mM EDTA, 0.05% Triton X-100, pH:8.0) vettük fel és 30 percig jégen lizáltuk. A sejtlízist követoen 12000 g, 4oC-on, 30 percig tartó centrifugálás után a fragment DNS-t tartalmazó felülúszót és a nem fragmentált, kromatint tartalmazó csapadékot különválasztottuk és a DNS tartalmat Hoechst festéssel fluoriméteren (DNA Quant. 2OOO fluorimeter, Hoefer) határoztuk meg. A DNS méréshez a csapadékot 1x TBE pufferben (TBE: 10.8 gr TRIS, 5.5 gr borsav, 2 mM EDTA, pH:8.0) vettük fel, majd 15 másodpercen keresztül ultrahangoztuk Braun ultrahang készülékkel. 130 A Hoechst-tel történo DNS meghatározáshoz131 minta 20 µl-es aliquotját hozzáadtuk 2 ml Hoechst pufferhez (0.2 M NaCl, 1 mM TRIS-HCl, 1 mM EDTA, pH:7.4), amely 1 µl festék / 1ml puffer arányban tartalmazza a Hoechst 33342 festéket (Sigma, Németország), majd 15 másodpercen keresztül ultrahangoztuk Braun ultrahang készülékkel és a 15 perces sötétben való tartás után DNS tartalmat mértünk fluoriméterrel. A fragment DNS minták 25 µl-t, 1 mg/ml végkoncentrációjú proteináz K és 0.1 mg/ml végkoncentrációjú RN-áz-al emésztettük 1-1 órát 37oC-on és ezt követoen 5 µl mintapuffert hozzáadva (0.25% bromfenolkék, 30% glicerin, 10x TBE) 1.5%-os TBE agaróz gélen, 1x TBE futtató pufferben 50 V árameroséggel futtattuk meg. A futtatás lejárta után a gélt 1 µg/ml etidium-bromiddal 15 percig festettük és Stratagene EagleEye II videodenzitométer képanalizátorral (Stratagene, Gebouw, CA, USA) értékeltük. Egy-sejt agaróz gélelektroforézis (comet assay) Az OSCORT sejteket 65 µl 1%-os alacsony olvadáspontú (LMP) agarózban (pH:7.4) szuszpendálva 37oC-on maratott-zsírtalanított felszínu üveg tárgylemezre pipettáztuk,
32
Anyagok és Módszerek amelyet elozoleg 1% normál olvadáspontú (NMP) agarózzal fedtünk. Az agarózt 10 percig 4oC-on tartottuk, majd a tárgylemezeket még egy réteg LMP-vel fedtük le és ismét 4oC-ra tettük, amíg az agaróz megdermedt. Ezután a tárgylemezeket 4oC-os lizáló pufferbe (2.5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM TRIS-HCl, 1% Na sarcosinatot, 1%Triton X-100, pH:10) helyeztük 60 percre, eltávolítva ezzel a sejtfehérjéket. A lízist követoen a tárgylemezeket 30 percre horizontális elektroforézis tartályba helyeztük, amely 0.3 M NaOH, 1 mM Na2EDTA, pH: 2.7 puffert tartalmazott, majd 25 V, 300 mA feszültséggel futtattuk 20 percig, 15oC-on. A futtatás befejezése után a tárgylemezeket háromszor 3 percig mostuk 4oC-os neutralizáló pufferrel (0.4 M TRIS-HCl pH:7.5) majd a 25 µl 20 µg/ml etidium-bromiddal való festést követoen fedolemezzel lefedtük. Az etidium-bromiddal megjelölt nukleuszokat Zeiss fluoreszcens mikroszkóp segítségével vizsgáltuk, a mikroszkópos képek kvantitatív kiértékelését IMAN morfometriás software program (KFKI, 1997) segítségével végeztük.132,133,134,135
4.2.8.6 DNS bontó aktivitás kimutatása A 72 órás plasztikon és ECM-gélen történt tenyésztés után a már leírt módon sejtmagi extraktumot izoláltunk, és DN-áz reakciót vizsgáltunk szubsztrát poliakrilamid gélelektroforézissel valamint agaróz gélelektroforézissel. Szubsztrát poliakrilamid gélelektroforézis A minták 2 µg fehérje tartalmú részeit, 10%-os 50 µg/ml calf thymust tartalmazó poliakrilamid gélen futtattuk meg, konstans feszültségen, 200 V-on, 30 percig. Az enzim aktivitás kimutatásához a futtatás befejezése után a gélt 2.5% Triton X-100 oldattal szobahomérsékleten mostuk, majd 20 órán keresztül inkubáltuk 37oC-on a következo oldattal: 10 mM TRIS-HCl, pH:7.4, 10 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 3 mM Mg2Cl, 0.02% NaN3. Az inkubálás befejezése után 1 µg/ml etidium-bromid festo oldattal 30 percig festettük a gélt és az enzimemésztést UV fényben vizsgáltuk. A doxorubicinnel, illetve cisplatinnal kezelt DNS-t tartalmazó 10%-os poliakrilamid elkészítéséhez, a calf thymus DNS-t elozetesen szobahomérsékleten, 2 órán keresztül 10 µg/ml doxorubicinnel illetve cisplatinnal kezeltük.
33
Anyagok és Módszerek Agaróz gélelektroforézis A sejtmagi extraktumban DN-áz reakciót vizsgáltunk 200 ng kDNS felhasználásával, 37 o
C -on, 30 perces inkubálással.127 Az inkubálás után a reakciót 2 µg/µl proteináz K-1%
SDS adásával állítottuk le, a reakciókeverékeket 1%-os agaróz gélen vizsgáltuk 2 V/cm töltéssurusséggel, 1x TBE pufferben.
4.2.8.7 Proteoglikánok vizsgálata A kezelési és jelzési idok letelte után külön gyujtöttük a médiumot és a sejteket a tenyésztoedénybol. Pogány és munkatársai módszere136 alapján proteoglikán frakciót állítottunk elo mind a médiumból, mind a sejtekbol. Proteoglikán izolálás a médiumból 4ºC-on, 48 óráig jelölt (10 µCi/Na2[35S]O4) konfluens tenyészet médiumát dekantáltuk, PBS-el mostuk, majd 7 M urea puffert (10 mM Tris pH:7.4, 0.5% Triton X-100, 0.5 mM N-etilmaleimid, 0.5 mM PMSF, 0.001% tripszin inhibitor, 5% Gordox) adtunk hozzá. Ezt követoen ioncserét végeztünk 0.5 ml-es DEAE-cellulóz oszlopokon, ami urea pufferrel volt „ekvilibrálva”. A frakciók radioaktivitását megmértük, esetenként gélelektroforézissel (SDS-PAGE) ellenoriztük. A proteoglikán frakciót abszolút alkohollal kicsaptuk, lecentrifugáltuk (Eppendorf centrifuga, 12000 rpm, 4oC, 10 perc), 70% alkohollal mostuk és újra centrifugáltuk. Speed Vac-ban történo beszárítás után a proteoglikánt 7.5%-os vagy 3-15%-os gradiens minigélen futattuk meg. A futtatást követoen Alcián kékkel majd Coomassie-val festettük a gélt. Differenciálás és szárítás után (Savant gél dryer, 60oC, 1-2 óra) sötétségben fluorográfiát végeztünk -80oC-on. Proteoglikán izolálás a sejtbol Inhibitorokat (0.5 mM N-etilmaleimid, 0.5 mM PMSF, 0,001%-os tripszin inhibitor, 5%-os Gordox) tartalmazó extraháló pufferrel (4 M guanidin-HCl, 50 mM Na-acetát, 0.5% Triton X-100) távolítottuk el a sejteket a tenyésztoedényrol és 1 éjszakán át rázattuk 4oC-on. A DNS tartalmat Hoechst festéssel fluoriméteren (DNA Quant. 2OOO fluorimeter, Hoefer) határoztuk meg. A mintát centrifugáltuk 12000 rpm-el, 4oC-on, 20 percig, majd a felülúszót dializáltuk az extraháló pufferból a 7 M urea pufferbe. Minden alkalommal megmértük a vezetoképességet és összehasonlítottuk az eredeti 7 M urea puffer vezetoképességével. Amint az eredeti oldat vezetoképessége megegyezett a
34
Anyagok és Módszerek végso oldat vezetoképességével ioncserét végeztünk a proteoglikán elválasztás céljából DEAE-cellulóz oszlopon. A további lépések azonosak voltak a fent említett lépésekkel. Proteoglikán szintézis vizsgálata A plasztikon tenyésztett sejtek doxorubicinnel és clodronattal való kezelés esetén a kezelést követo 24. órában a proteoglikán szintézis vizsgálatához wellenként 16 µCi [14C]-glükózamint (BS 109 D-a
14
C) adtunk metabolikus jelzés céljából 24 órán át. A
proteoglikán frakciók [14C]-re jellemzo ß aktivitását cpm-ben mértük, de dpm-ben is meghatároztuk a Triathler Multilabel Tester (Hidex, Turku, Finnország) scintillációs fotométeren. Fehérjéhez nem kötött glükózaminoglikán (GAG) izolálása A szabad GAG izolálására, a PG izolálás elso lépésében keletkezo homogenizálópufferes felülúszót használtuk, illetve a guanidin-HCl extrahálást követo TCA-val kicsapódó üledéket. A két frakciót összekeverve 0.5 N NaOH-val β-eliminálást végeztünk 4 órán keresztül, majd 1-2 órán át 10% TCA-val kicsapást. A felülúszót dializáltuk 3 napig csapvízben, illetve egy éjszaka desztillált vízben. A következo napon egy éjszakán keresztül 0.5% cetil-piridinium-klorid (CPC) és 0.02 M Na2SO4 oldattal csaptuk ki a negatív töltésu poliszacharidokat. Másnap ezeket 2 M NaCl-96% etanol 100:15 arányú elegyével oldottuk fel, majd 1% K-acetátot és 1% ecetsavat tartalmazó alkoholos kicsapással tisztítottuk tovább a GAG-ot, egy éjszakán keresztül. Mindkét kicsapást 10000g, 4oC-os, 30 perces centrifugálás követett, és mind a CPC, mind az acetátos kicsapás után az üledéket használtuk.
4.2.9 Statisztikai analízis Az ECM-biopolimerek valamint a kezelések hatásának szignifikanciáját Student-féle tpróbával végeztük, az értékek átlagát és a mérések standard hibáját adtuk meg. Statisztikailag akkor tekintettük szignifikánsnak a különbséget, ha a „p” kisebb volt, mint 0.05.
35
Eredmények
5 EREDMÉNYEK 5.1 KLINIKAI HÁTTÉR Tumorbiológiai vizsgálataink klinikai hátterét a Semmelweis Egyetem Ortopédiai Klinikán kezelt 17 éves fiú alkotta. Klinikai vizsgálattal a bal humerus középso harmadában, anterolaterálisan, körülírt, a csonttal összefüggonek látszó, nem mobilis, tömött tapintatú, 3x5 cm-es kiemelkedést tapasztaltunk. Felette a bor elmozdítható, reakciómentes volt. A klinikai kép alapján az osteosarcoma alapos gyanúja merült fel, ezért incisionalis biopsziára került sor 1996. július. 24-én. A biopszia, primer, centrális, magas malignitású osteosarcoma fibroblastos formáját igazolta, 20% alatti tumoros porcállománnyal (5. ábra).
Osteoid
5. ábra. A biopsziás anyag szövettani hematoxilin-eozin (HE) képe A metszetekben rendkívül polimorf, sejtdús primer malignus csonttumor látható. A sejtek többnyire megnyúlt citoplazmával és maggal rendelkezo fibroblastszeru sejtek, gócokban azonban a sejtek osteoblastokra emlékeztetnek, körülöttük halvány eozinofil anyag hálózatos lerakódása (osteoid) figyelheto meg. Nagyobb nagyítással vizsgálva rendkívül sok abnormis oszló alak, tumoros óriássejt látható. 100, 200x nagyítás.
36
Eredmények Betegünk a COSS (Cooperative Osteosarcoma Study) protokoll alapján 9 hetes neoadjuváns kemoterápiás kezelésben részesült (Semmelweis Egyetem II. sz. Gyermekklinika).
A
kemoterápiát
követo
végtagmegtartó
mutét
a
humerus
szegmentrezekcióból, ellenoldali autológ fibula transzplantációból és Wagner készülékkel való rögzítésbol állt. A mutétet követoen 14 hetes adjuváns kemoterápiás kezelés történt. A neoadjuváns, valamint az adjuváns kezelés nagy-dózisú methotrexat, cisplatin, ifosfamid és doxorubicin kombinált adásával történt a protokoll szerint. A definitív mutét során eltávolított tumor HE-os képén, a 12 vizsgált blokk túlnyomórészén, a vitális tumorsejtek 50% feletti arányát figyeltük meg (Huvos grade I), ami az osteosarcoma kemoterápia rezisztens formáját jelentette. A neoadjuváns kemoterápiát követo Rtg felvétel is alátámasztotta az osteosarcoma kemoterápia rezisztens formáját, mivel a tumoros osteoid mineralizációja a kemoterápia során, nem következett be, az elváltozás nem vált szklerotikussá, sot a kemoterápiás kezelés alatt a folyamat tovább progrediált (6. ábra).
6. ábra. A 17 éves fiúgyermek bal oldali humerus diaphysis Röntgen felvétele. a. A diagnózis idopontjában, a neoadjuváns kemoterápia elott. b. A neoadjuváns kemoterápiát követoen, a definitív mutét elott. A röntgen képen megfigyelheto, hogy a neoadjuváns kemoterápia alatt is bekövetkezett tumoros progresszió.
37
Eredmények Betegünkben a diagnózist követo 5. évben a bal oldali csípocsontban, valamint a bal oldali axilláris nyirokcsomóban metasztázis volt kimutatható, és egy évvel késobb a mellkas CT már multiplex tüdo áttéteteket is igazolt. Betegünket 23 éves korában, 2002. 01. 08-án veszítettük el.
5.2 HUMÁN OSTEOSARCOMA SEJTVONAL (OSCORT) JELLEMZÉSE A HTB-2 xenograftból kialakított osteosarcoma sejtvonal (OSCORT) kalcitriollal való stimulálása alkalikus foszfatáz és osteokalcin termelést eredményezett.
5.2.1 HTB-2 és HTB-9 xenograftok jellemzése
5.2.1.1 A xenograftok szövettani jellemzése A biopsziás anyag fragmentumaiból kialakított HTB-2, valamint a definitív mutét során eltávolított daganatból kialakított HTB-9 xenograftok az osteosarcomára jellemzo tumoros osteoid termelo képességüket több átoltás (passzázs) után is megtartották. A HTB-2 xenograft 3. passzázsát követoen készített szövettani metszeteken, kis nagyítással vizsgálva (7.a,b ábra) megállapítottuk, hogy a sejtes összetétel gyakorlatilag megegyezik a biopsziás anyag szövettani metszetén látott sejtes összetétellel. Az egyes biopolimerek aránya mérsékelten változott, egyértelmuen dominál a tumoros csonttermelés (osteoid), osteoblastszeru sejtekkel melyek a tumorállomány 60-70%-át teszik ki. Nagy nagyítással (7.c ábra) változatlanul nagy malignitást tapasztaltunk, nagy atipusos mitózisokkal és sejtmag polimorfiával. Porc irányba történo differenciálódás itt sem volt látható.
38
Eredmények
a.
b.
39
Eredmények
c.
d. 7. ábra. A HTB-2 xenograft 6. passzázs szövettani képei a., b. HE festés, 100x nagyítás, c. HE festés, 200x nagyítás, d. Gömöri festés, amely jól mutatja a tumoros osteoidot.
40
Eredmények 5.2.1.2 A xenograftok immunhisztokémiai jellemzése A HTB-2 és HTB-9 xenograftokban kimutathatóak voltak a csontra jellemzo, vagy a csontban található, nem-kollagén és kollagén csontproteinek. Osteopontint, osteokalcint, dekorint, valamint kollagén-I-c-peptidet detektáltunk mind a két xenograftban (8., 9. ábra). A neoadjuváns kemoterápiát követoen kialakított HTB-9 xenograftban, viszont szembetuno volt az osteopontin kisebb mennyisége, ellentétben a kollagén-I-cpeptiddel, amely expressziója kifejezettebb volt.
8. ábra. A HTB-2 xenograftban található csontproteinek a. Goldner festés, b. HE festés, c. Osteokalcin, d. Dekorin, e. Osteopontin, f. Kollagén-I-cpeptid. c-f: immunhisztokémiai képek, 400x nagyítás
41
Eredmények
9. ábra. A HTB-9 xenograftban található csontproteinek a. Goldner festés, b. HE festés, c. Osteokalcin, d. Dekorin, e. Osteopontin, f. Kollagén-I-cpeptid. c-f: immunhisztokémiai képek, 200x nagyítás
42
Eredmények
5.2.2 OSCORT humán eredetének igazolása Az OSCORT humán eredetét laktát-dehidrogenáz (LDH) izoenzimek kimutatásával, valamint citogenetikai vizsgálatokkal igazoltuk.
5.2.2.1 LDH izoenzimek kimutatása Az LDH izoenzimek segítségével igazoltuk a HTB-2, a HTB-9 és az OSCORT humán eredetét, hiszen szemben az egérben található 2 izoenzimmel, a xenograftokban és az OSCORT sejtekben is kimutatható volt az emberre jellemzo mind a négy LDH izoenzim (10. ábra).
10. ábra. LDH izoenzim identifikálás a HTB-2, HTB-9 és az OSCORT sejtekben a humán eredet bizonyítására.
5.2.2.2 Citogenetikai vizsgálatok - Kariotípus analízis A citogenetikai elemzés igazolta, hogy az OSCORT sejtek humán férfi kariotípusúak. A ploiditás szintjére vizsgált 100 metafázis kromoszóma szám eloszlását az 1. táblázat mutatja be. A mitózisonkénti átlagos kromoszóma szám (±SD) 60.54±0.38 volt, a modális 62, a középérték pedig 61 volt. Mindössze egy diploid mitózist, egy másik hipoliploid sejtet (40 kromoszómával) észleltünk. Extrém poliploidiát (azaz mitózisonként több mint 92 kromoszómát) találtunk a metafázisok 5%-ban. A 20 mintából elvégzett kariotípus vizsgálatkor legalább két analizált metafázisban
43
Eredmények megtaláltuk a 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 19, 21, és a 22. kromoszómák hiányát, illetve az 1, 2, 3, 4, 5, 9, 12, 15, 16, és a 20. kromoszómák triplodiáját. A 13., és 17. kromoszómák teljes hiányát 4, illetve 3 metafázisban, míg mindketto egyideju hiányát csak 1 metafázisban észleltük. Egy, vagy két double minute volt jelen a metafázisok 8%-ban. Számos (4-12) ismeretlen eredetu marker kromoszóma volt jelen minden analizált metafázisban, de az átrendezodések részletes lokalizációja nem volt lehetséges. Legalább két mitózisban találtuk meg az 1p-, 2q-, 6q-, 10q-, illetve a 11q+, 13p+, és 14p+ jellegu átrendezodéseket. A 13. és 17. kromoszómák hiányát 23%-ban, illetve 17%-ban lehetett megfigyelni.
1. táblázat. A kromoszóma szám eloszlása 100 vizsgált OSCORT sejtben.
5.3 ECM HATÁSA AZ OSCORT SEJTEK NÖVEKEDÉSÉRE ÉS INVAZÍVITÁSÁRA
5.3.1 ECM és biopolimerei hatása az OSCORT sejtek növekedésére Az OSCORT sejttenyészet növekedését és életképességét monolayer kultúrában (plasztik felszín), illetve az élo szervezetet jobban megközelíto EHS-ECM jelenlétében (ECM-gél) hasonlítottuk össze. Megállapítható, hogy az ECM-gél hatására fokozódik a sejtek szaporodása, a plasztik és az ECM-gél közötti sejtproliferáció különbség a 72. órától (p < 0.05) kezdve válik egyre kifejezettebbé, mivel a gélen tartott sejtek egyre jobban szaporodnak a plasztikhoz képest (11A. ábra). Az ECM-gél hatását az MTT teszt támasztotta alá (11B. ábra). Ugyanakkor a sejtpopulációk életképessége közel egyenlo volt, 93.37-99.83% között ingadozott. Az EHS-ECM a fehérje koncentrációval egyenes arányban növelte a sejtproliferációt (12. ábra). Szolúbilis EHS-ECM 50 µg/ml koncentrációnál a hatás szignifikánsnak
44
Eredmények bizonyult (p<0.001). Az OSCORT sejtek által termelt extracelluláris mátrix (OSCORTECM) az EHS-ECM-hez hasonlóan növelte a sejtproliferációt (12. ábra). Az extracelluláris mátrix biopolimerek között a fibronektin és a heparánszulfát proteoglikán (HSPG) koncentrációfüggoen minden esetben még az ECM-gélnél is jobban növelte a sejtproliferációt (p<0.001). Ellentétben, a kollagén IV már 10 µg/ml koncentrációban szignifikáns proliferáció gátlást eredményezett (p<0.001). A laminin és az EHS-ECM-ben kis mennyiségben található entaktin, nem befolyásolta a sejtnövekedést, az MTT teszttel mért értékek közel azonosak voltak a plasztik felszínen tartott sejtekhez viszonyítva (12. ábra).
11. ábra. Az ECM-gél hatása az OSCORT sejtek proliferációjára. Az OSCORT sejteket 0-168 óráig tenyésztettük plasztik felszínen, vagy ECM-gélen. A sejtpopuláció növekedését a sejtek számának meghatározásával (11A. ábra), valamint MTT technikával (11B. ábra) vizsgáltuk. A feltüntetett átlag étékek többször elvégzett vizsgálatokból származnak, amelyek egyes adatainak eltérése 20% alatt volt.
45
Eredmények
12. ábra. Az extracelluláris mátrix és biopolimerei hatása az OSCORT sejtek proliferációjára. A plasztik felszínen tenyésztett sejtekhez szolúbilis EHS-ECM-et, OSCORT-ECM-et, vagy ECM biopolimereket adagoltunk 10-, 50-, 100 µg/ml koncentrációban. A sejteket 72 óráig inkubáltuk, majd MTT tesztet végeztünk a sejtpopuláció nagyságának meghatározása céljából. A plasztik felszínen tartott sejtek MTT értékét tekintettük 100%-nak (horizontális tengely), az SD érték 3.77% volt. Az ábrázolt eredmények 3 független vizsgálat átlagát tükrözik.
5.3.2 ECM és biopolimerei hatása az OSCORT sejtciklusra Következokben összehasonlítottuk a plasztik felszínen és az ECM-gélben szaporodó OSCORT sejt életciklusát a tenyészet 72. órájában. A plasztik felszínen tartott OSCORT sejtek 73.4%-a G1-, 9.4%-a S- és 16.7%-a G2-fázisban volt. Az ECM-gélen tartott sejtek között a G1-fázisban és a G2/M-fázisban levok aránya lecsökkent, ugyanakkor az S-fázisban levo sejtek aránya mintegy négyszeresére emelkedett, és az Sfázison belül a sejtek eloszlása egyenletes volt (2. táblázat). A 2. táblázaton az is látható hogy, az ECM biopolimerek közül a fibronektin és a HSPG hasonló hatással volt a sejtek cikluson belüli megoszlására, mint az ECM-gél. A HSPG a plasztikon mért értéknek, több mint négyszeresére növelte az S-fázisban lévo sejtek arányát, a fibronektin hatása ennél kisebb mértéku volt. A laminin nem volt hatással a sejtek cikluson belüli eloszlására, a plasztikon mért értékekhez hasonlókat
46
Eredmények tapasztaltunk. A kollagén IV viszont csökkentette a G1- és S-fázisban lévo sejtek arányát, és csaknem négyszeresére emelte a G2-ben lévo sejtek arányát. Az OSCORT sejtek által termelt ECM, az ECM-gélhez hasonlóan csökkentette a G1- és a G2/M-, és növelte az S-fázisban lévo sejtek arányát. Tenyésztési körülmények
Az OSCORT sejtek százalékos megoszlása G1
S
G2/M
Plasztik EHS-ECM Fibronektin
73.40 ± 2.30 45.90 ± 0.70† 49.77 ± 5.59†
9.40 ± 2.00 36.90 ± 3.10† 34.53 ± 1.95†
16.40 ± 1.40 17.20 ± 1.20 15.70 ± 1.34
HSPG
48.38 ± 5.43†
38.01 ± 2.05†
13.61 ± 1.51
Laminin
74.31 ± 6.40
9.82 ± 0.77
15.87 ± 1.69
Kollagén IV
23.99 ± 2.77†
8.21 ± 1.28
67.80 ± 8.4†
OSCORT-ECM
53.03 ± 7.08†
33.53 ± 1.90†
13.44 ± 1.19
2. táblázat. Az OSCORT sejtek sejtciklus fázisainak megoszlása ECM és biopolimerei jelenlétében. A sejteket 72 órán át tenyésztettük ECM, illetve 100 µg/ml ECM biopolimerek jelenlétében. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket adtuk meg. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják. †: Szignifikánsan különbözik a plasztikon tartott sejtek értékéhez képest (p < 0.05, Student-féle t-próbával.
5.3.3 ECM és biopolimerei hatása sejtciklushoz társult és tumor szuppresszor fehérjék expressziójára Immunoblottal, a tenyésztés 72 órájában a Rb, p53, ciklin D1, PCNA, Ki-67, ciklin B1 és cdc2 expresszióját vizsgáltuk. Megállapítottuk, hogy a 105 kDa-os Rb és az 53 kDa-os p53 tumorszuppresszor fehérjék expressziója csökkent az ECM-gélen tartott sejtekben. Ugyanakkor az ECM fokozta az S-fázis belépését irányító ciklin D1 (13. ábra) és a sejtproliferáció aktivitását jelzo PCNA és Ki-67 (14. ábra) expresszióját. Az egyes ECM biopolimerek eltéroen befolyásolták a sejtéletciklust szabályozó fehérjéket (13. és 15. ábra). A sejtproliferáció aktivitását jelzo, azzal kapcsolatba hozható Ki-67 expresszió emelkedett EHS-ECM, és egyes biopolimerei jelenlétében (14B. ábra). Hasonlóképpen fokozódott a PCNA expressziója is (14A. ábra). A
47
Eredmények sejtéletciklus DNS-t szintetizáló fázisába (az S-fázis) történo belépésben fontos szerepet játszó ciklin D1, ECM és két biopolimere a fibronektin és a HSPG jelenlétében emelkedett a plasztik felszínen tenyesztett sejtekkel összehasonlítva (13. ábra). Ugyanakkor a mitózisba belépést szabalyozó ciklin B1 kisebb mennyiségben mutatható ki a sejtproliferaciót fokozó ECM, HSPG és fibronektin jelenlétében tenyésztett sejtekben (15. ábra). Az OSCORT-ECM jelenlétében tenyésztett sejtek a 36 kDa-os ciklin D1 és még inkább a p36(ciklin D1)-p34(cdk4) komplex expresszióját fokozták, a plasztikon tartott sejtekhez viszonyítva (13. ábra). A 36 kDa-os PCNA expressziót nagyobb mértékben, a 48 kDa-os PCNA expresszióját kisebb mértékben fokozták. A Ki-67 expresszió is magasabb volt a plasztik sejtekhez viszonyítva (14. ábra). A ciklin B1 és a cdc2 expresszióját az OSCORT-ECM jelentosen csökkentette (15. ábra).
13. ábra. ECM és biopolimerei hatása a ciklin D1, valamint a p36(ciklin D1)-p34(cdk4) komplex fehérjék expressziójára. Az OSCORT sejteket 72 órán át tenyésztettük plasztik felszínen, valamint ECM-gél (EHSECM), 100 µg/ml ECM biopolimerek és OSCORT-ECM jelenlétében. A fehérje expressziót 105 OSCORT sejtmagi extraktumából immunoblottal mutattuk ki. Az ECM-gélen tartott sejtek valamint, fibronektin, HSPG, kollagén IV, OSCORT-ECM jelenlétében tenyésztett sejtek ciklin D1, valamint a p36(ciklin D1)-p34(cdk4) komplex fehérjék expressziója szignifikánsan különbözött a plasztikon tartott sejtek ciklin D1 és p36(ciklin D1)p34(cdk4) komplex fehérjék expressziójához képest (p < 0.05, Student-féle t-próbával). Az immunoblotok eredményét a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük (Stratagene, Gebouw, CA, USA). Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket ábrázoltuk. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják.
48
Eredmények
48 kDa 36 kDa
350 kDa
14. ábra. ECM és biopolimerei hatása a PCNA és a Ki-67 fehérjék expressziójára. Az OSCORT sejteket 72 órán át tenyésztettük plasztik felszínen valamint ECM-gél (EHSECM), 100 µg/ml ECM biopolimerek és OSCORT-ECM jelenlétében. A fehérje expressziót 105 OSCORT sejtmagi extraktumából immunoblottal mutattuk ki. A: PCNA fehérje expressziójának kimutatása: Az ECM-gélen tartott sejtek valamint, fibronektin, HSPG, OSCORT-ECM jelenlétében tenyésztett sejtek 36 kDa-os PCNA fehérje expresszió szignifikánsan különbözött a plasztikon tartott sejtek PCNA expressziójához viszonyítva (p < 0.05, Student-féle t-próbával). Az ECM-gélen tartott sejtek valamint, fibronektin, HSPG, kollagén IV, OSCORT-ECM jelenlétében tenyésztett sejtek 48 kDa-os PCNA fehérje expresszió szignifikánsan különbözött a plasztikon tartott sejtek PCNA expressziójához viszonyítva (p < 0.05, Student-féle t-próbával). B: Ki-67 fehérje expressziójának kimutatása: Az ECM-gélen tartott sejtek valamint, fibronektin, HSPG, kollagén IV, OSCORT-ECM jelenlétében tenyésztett sejtek Ki-67 fehérje expresszió szignifikánsan különbözött a plasztikon tartott sejtek Ki-67 expressziójához képest (p < 0.05, Student-féle t-próbával). Plasztikon (1), ECM-gélen (2), Fibronektin (3), HSPG (4), Laminin (5), Kollagén IV (6), OSCORT sejtek által termelt ECM (OSCORT-ECM) (7) jelenlétében tenyésztett sejtek. Az immunoblotok eredményét a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket ábrázoltuk. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják.
49
Eredmények
15. ábra. ECM és biopolimerei hatása a ciklin B1 és a cdc2 fehérjék expressziójára. Az OSCORT sejteket 72 órán át tenyésztettük plasztik felszínen valamint ECM-gél, 100 µg/ml ECM biopolimerek és OSCORT-ECM jelenlétében. A fehérje expressziót 105 OSCORT citoplazma extraktumából immunoblottal mutattuk ki. Az ECM-gélen tartott sejtek valamint, fibronektin, HSPG, OSCORT-ECM jelenlétében tenyésztett sejtek ciklin B1 és a cdc2 fehérjék expressziója szignifikánsan különbözött a plasztikon tartott sejtek ciklin B1 és a cdc2 fehérjék expressziójához viszonyítva (p < 0.05, Student-féle t-próbával). Az immunoblotok eredményét a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket ábrázoltuk. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják.
50
Eredmények
5.3.4 Topoizomeráz váltás ECM és biopolimerei hatására Miután megállapítottuk, hogy az ECM jelenlétében az OSCORT sejtek szaporodása fokozódik, érdeklodésünk a DNS replikációban fontos szerepet játszó topoizomerázok mükodése irányába terelodött. Arra a kérdésre kívántunk válaszolni, hogy az ECM hatására fokozódó sejtproliferáció a topoizomeráz I vagy a II aktivitás változásával hozható kapcsolatba. A monolayer-plasztik felszínen tenyésztett sejtekben (nem-migráló kompartment) jelentosen magasabb topoizomeráz I expresszió és aktivitás volt kimutatható, mint az ECM-gélben szaporodó sejtekben (16.-19. ábra). Az ECM-gélben tartott sejtekben szignifikánsan kisebb expressziót mutattunk ki az immunoblottal (18. ábra). A pBR322 hasítási reakciók alig mutattak aktivitást (17. ábra), továbbá a jóval érzékenyebb pBR322 relaxációs reakciók is rendkívül kicsi topoizomeráz I aktivitást mutattak ki az ECM-gélen tartott sejtekben (19. ábra). Ezzel szemben az ECM-gélen tenyésztett sejtek esetében jelentos topoizomeráz II expressziót és aktivitást mutattunk ki, az immunoblot, a pBR322 hasítási reakció és a kinetoplaszt DNS dekatenációs vizsgálatok során (16.-19. ábra), míg a plasztik felszínen tartott sejtekben topoizomeráz II alig volt kimutatható (16.-19. ábra). A továbbiakban az a kérdés merült fel, hogy az ECM indukált topoizomeráz II dominancia egy meghatározott subpopuláció, a migráló sejtek tulajdonsága, vagy az ECM-sejt kapcsolat következménye. Választ keresve erre a kérdésre a monolayer és az ECM-gélen tartott sejteket a tenyésztés 72. órájában plasztik felszínre transzferáltuk és ott további 7 napot tenyésztettük. Az azt követo topoizomeráz I és II aktivitás meghatározása, újból a plasztik felszínen tenyésztett sejtek topoizomeráz állapotát mutatta, túlnyomórészt a topoizomeráz I aktivitás dominanciájával (16. ábra). Az OSCORT-ECM is az ECM-gélhez hasonló módon változtatta meg a topoizomerázok egymáshoz való viszonyát (20. ábra). Az ábrák alapján megfigyelheto, hogy az alacsony topoizomeráz I és a magas topoizomeráz II a legtöbb ECM biopolimer jelenlétében is mutatkozott (18., 19. ábra). Megemlítendo azonban, hogy a laminin jelenlétében nem csökkent a topoizomeráz I expressziója és aktivitása, a fibronektin jelenlétében pedig nem emelkedett a topoizomeráz II aktivitás és expresszió. A kollagén IV és a HSPG hatására emelkedett a legnagyobb mértékben a topoizomeráz II.
51
Eredmények
16. ábra. Az extracelluláris mátrix hatása a topoizomeráz I és topoizomeráz II aktivitásra. A. Topoizomeráz I aktivitás szuperhélix pBR322 plazmid DNS relaxációs módszerrel kimutatva 2.5x104 OSCORT sejtmagi extraktumából. B. Topoizomeráz II aktivitás kDNS ATP függo dekatenációs módszerrel kimutatva 2.5x104 OSCORT sejtmagi extraktumából. 1: Negatív kontroll, 500 ng plazmid DNS sejtmagi extraktum nélkül. 2: Pozitív kontroll 500 ng plazmid DNS 2 unit topoizomeráz I vagy II-vel (TopoGen, Columbus, Ohio, USA). 3: Topoizomeráz I (A), II (B) aktivitások 72 órát monolayerben tenyésztett OSCORT sejtekben. 4: Topoizomeráz I (A), II (B) aktivitások 72 órát ECM-gél jelenlétében tenyészett sejtekbe. 5: Topoizomeráz I (A), II (B) aktivitások 7 napos monolayer OSCORT sejtekben, amiket plasztikra transzferáltunk a 72 órás monolayerben való tenyésztést követoen. 6: Topoizomeráz I (A), II (B) aktivitások 7 napos monolayer OSCORT sejtekben, amiket plasztikra transzferáltunk a 72 órás ECM-gélben való tenyésztést követoen. MW: molekulasúly. Az ábra tipikus gél képet reprezentál, a kísérletet háromszor ismételtük egymástól függetlenül. Az eredményeket a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük.
52
Eredmények
17. ábra. Topoizomeráz I és II specifikus hasítási aktivitás extracelluláris mátrix jelenlétében. A/1 1.sáv: 5x105, 72 órát plasztikon tartott OSCORT sejtbol készült magi extraktummal. A/1 2.sáv: Az 1. reakcióhoz 100 µM topotecan (TpT) adva. A/2 1.sáv: 5x105 72 órát gélen tartott OSCORT sejtbol készült magi extraktummal. A/2 2.sáv: A 3. reakcióhoz 100 µM TpT adva. B/1 1.sáv: Cleavage aktivitás plasztikon tartott 5x105 sejtben, doxorubicin, nélkül. B/1 2.sáv: 5x105 plasztikon tartott sejt cleavage aktivitása a reakcióelegyhez adott 100 µM végkoncentrációjú doxorubicin mellett. B/2 1.sáv: Cleavage aktivitás gélen tartott 5x105 sejtben, doxorubicin, nélkül. B/2 2.sáv: 5x105 gélen tartott sejt cleavage aktivitása a reakcióelegyhez adott 100 µM végkoncentrációjú doxorubicin mellett.
18. ábra. A extracelluláris mátrix és biopolimereinek hatása a topoizomerázok expressziójára. Az OSCORT sejteket 72 órán át tenyésztettük ECM és 100 µg/ml ECM biopolimerek jelenlétében. 105 OSCORT sejt sejtmag extraktumból topoizomeráz I és II fehérje expressziót vizsgáltunk Az immunoblotokat kemilumineszcens reagensekkel hívtuk elo és az eredményeket a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük. 1 (Plasztik): Plasztik felszínen tenyésztett sejtek. 2 (EHS-ECM): EHS-ECM-ben tenyésztett sejtek. 3 (FN): Fibronektin. 4 (HSPG): Heparánszulfát proteoglikán. 5 (LN): Laminin. 6 (K IV): Kollagén IV. Az ábra tipikus immunoblot képet reprezentál, a kísérletet háromszor ismételtük egymástól függetlenül.
53
Eredmények
19. ábra. A extracelluláris mátrix és biopolimereinek hatása a topoizomerázok aktivitására. Az OSCORT sejteket 72 órán át tenyésztettük ECM és 100 µg/ml ECM biopolimerek jelenlétében. A sejtmag extraktumból topoizomeráz I és II fehérje aktivitást vizsgáltunk. Topoizomeráz I aktivitást szuperhélix pBR322 plazmid DNS relaxációs módszerrel mutattuk ki 2.5x104 OSCORT sejtmagi extraktumából. R: Relaxált DNS. S: Szuperhélix DNS. NK: Negatív kontroll, 500 ng plazmid DNS sejtmagi extraktum nélkül. PK: Pozitív kontroll, 500 ng plazmid DNS 2 unit topoizomeráz I (TopoGen, Columbus, Ohio, USA). 1-6: 500 ng plazmid DNS különbözo tenyésztési körülmények alatt tenyésztett OSCORT sejtmag extraktummal. Topoizomeráz II aktivitást kDNS ATP függo dekatenációs módszerrel mutattuk ki 2.5x104 OSCORT sejtmagi extraktumából. NW: Nagy molekulatömegu összefuzött gyurus kinetoplaszt DNS. Mc: Egyes gyurus kis kör alakú DNS (Minicircles). NK: Negatív kontroll, 500 ng plazmid DNS sejtmagi extraktum nélkül. PK: Pozitív kontroll 500 ng kDNS 2 unit calf thymus topoizomeráz II-vel (TopoGen, Columbus, Ohio, USA). 1-6: 500 ng kDNS különbözo tenyésztési körülmények alatt tenyésztett 2.5 x 104 OSCORT sejtmag extraktummal. 1 (Plasztik): Plasztik felszínen tenyésztett sejtek. 2 (EHS-ECM): EHS-ECM-ben tenyésztett sejtek. 3 (FN): Fibronektin. 4 (HSPG): Heparánszulfát proteoglikán. 5 (LN): Laminin, 6 (K IV): Kollagén IV. A táblázatban a relaxált plazmid DNS/dekatenált kDNS-t adtuk meg az össz DNS/kDNS függvényében. Az ábra tipikus gél képet reprezentál, a kísérletet háromszor ismételtük egymástól függetlenül. Az eredményeket a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük.
54
Eredmények
20. ábra. Az OSCORT-ECM hatása a topoizomeráz I és topoizomeráz II expressziójára és aktivitására. Az OSCORT sejteket 72 órán át tenyésztettük 100 µg/ml OSCORT-ECM jelenlétében. A sejtmag extraktumból topoizomeráz I és II fehérje expressziót és aktivitást vizsgáltunk. Topoizomeráz I aktivitás (A) szuperhélix pBR322 plazmid DNS relaxációs módszerrel kimutatva 2.5x104 OSCORT sejtmagi extraktumából. R: Relaxált DNS. S: Szuperhélix DNS. NK: Negatív kontroll, 500 ng plazmid DNS sejtmagi extraktum nélkül. PK: Pozitív kontroll, 500 ng plazmid DNS 2 unit topoizomeráz I. Topoizomeráz II aktivitás (B) kDNS ATP függo dekatenációs módszerrel kimutatva 2.5x104 OSCORT sejtmagi extraktumából. NW: Nagy molekulatömegu összefuzött gyurus kinetoplaszt DNS. Mc: egyes gyurus kis kör alakú DNS (Minicircles). NK: Negatív kontroll, 500 ng plazmid DNS sejtmagi extraktum nélkül. PK: Pozitív kontroll 500 ng kDNS 2 unit calf thymus topoizomeráz II-vel. 105 OSCORT sejt, sejtmag extraktumból topoizomeráz I (C) és II fehérje expressziót (D) vizsgáltunk. Pl: Plasztik felszínen tenyésztett sejtek. O: OSCORT-ECM jelenlétében tenyésztett sejtek. Az immunoblotokat kemilumineszcens reagensekkel hívtuk elo és az eredményeket a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük.
5.3.5 Nem specifikus DNS bontó aktivitás ECM hatására A topoizomeráz I és II aktivitásainak változását értékelve felvetodött az a kérdés, hogy az ECM más DNS-t hasító fehérje muködését is befolyásolni képes-e. A kérdés eldöntésére összehasonlítottuk a plasztikon és az ECM-en tenyésztett sejtek nukleáz aktivitását. 72 órán át ECM-gélen tartott sejtek magi extraktumaiban 55 kDa-tömegu DNS bontó fehérjét mutattunk ki (21. ábra). A DNS bontó aktivitás a plasztikon tartott sejtek magi
55
Eredmények extraktumaiban nem volt kimutatható. Az ECM-gélen tartott sejtek magi extraktumaiból származó DNS bontó aktivitás nem mutatott különbséget a nem kezelt illetve a 10 µg/ml doxorubicinnel vagy 10 µg/ml cisplatinnal kezelt calf thymus DNS-re (21. ábra). A plasztikon tartott sejtekbol extrahált fehérje DN-áz aktivitás azonban csak a kezelt DNS-re jelent meg (21. ábra). Annak bizonyítására, hogy az ECM-gélen tartott OSCORT sejtek magjaiban kimutatható DNS bontó aktivitás nem szennyezésként került az ECM-gélbol a sejtekbe, megvizsgáltuk a szolubilizált ECM-gélben is a DNS bontó aktivitást. A 22. ábrában látható, hogy az ECM-gélben nincs DNS bontó aktivitás, viszont az ECM-gélen tartott sejtekben van. Megfigyelheto, hogy a kimutatott DNS bontó aktivitású fehérje meglehetosen horezisztenciájú, mert 10 perc hokezelés után csak a kisebb 0.8 µg fehérjetartalmú extraktumban csökkent az aktivitás, míg a nagyobb 2.4 µg fehérjetartalmú extraktumban nem változott az aktivitás.
94 67 43
94 67 43
30
30
21. ábra. Nem specifikus DN-áz aktivitás kimutatása. A. 1-2: DN-áz aktivitás kimutatása OSCORT sejtmagból, calf thymus DNS tartalmú poliakrilamid gélen. 72 órát plasztikon tartott sejtben (1), 72 órát ECM-gélen tartott sejtben (2), 3-4: Doxorubicinnel kezelt DNS tartalmú poliakrilamid gélen. 72 órát plasztikon tartott sejtben (3), 72 órát ECM-gélen tartott sejtben (4), 5-6: Cisplatinnal kezelt DNS tartalmú poliakrilamid gélen. 72 órát plasztikon tartott sejtben (5), 72 órát ECM-gélen tartott sejtben (6). MW: Molekulatömeg-marker. B. DN-áz aktivitás OSCORT sejtmagból, agaróz gélen, 1 kb DNS standard használatával (1), 72 órát ECM-gélen (2), és 72 órát plasztikon tartott sejtben (3).
56
Eredmények
22. ábra. DN-áz aktivitás kimutatása ECM-gélen tartott OSCORT sejtek magi extraktumából. 1: Negatív kontroll, kDNS, 2-5: 72 órát ECM-gélen tartott sejtek DN-áz aktivitása: 0.8µg fehérjetartalmú magi extraktumban (2), 2.4µg fehérjetartalmú magi extraktumban (3), 0.8µg fehérjetartalmú magi extraktumban, hokezelve (4), 2.4 µg fehérjetartalmú magi extraktumban, hokezelve (5), 6-9: ECM-gél + kDNS: 0.8µg fehérjetartalmú ECM-gélben (6), 2.4 µg fehérjetartalmú ECM-gélben (7), 0.8µg fehérjetartalmú ECM-gélben, hokezelve (8), 2.4 µg fehérjetartalmú ECM-gélben, hokezelve (9).
5.3.6 ECM biopolimerek hatása az OSCORT sejtek migrációjára Az ECM biopolimerek hatását az OSCORT sejtek migrációjára háromdimenziós tenyészetben vizsgáltuk.59 A 3. táblázat alapján látható, hogy a HSPG és a fibronektin 31% illetve 20%-os proliferáció fokozódást, a kollagén IV ellentétben 20%-os redukciót eredményezett az OSCORT sejtpopulációban. Tovább vizsgálva az OSCORT sejtek megoszlását a monolayerben és az agaróz gélben, megfigyelheto hogy az OSCORT sejtek migrációs készsége az ECM biopolimerek hatására fokozódott. A migráció leginkább a HSPG hatására fokozódott, de a fibronektin hatása is igen jelentosnek bizonyult.
ECM biopolimerek (50 µg/ml) Kontroll Fibronektin HSPG Laminin Kollagén IV
Sejtszám (x104)
Proliferáció változás az összsejt Nem-migráló Migráló populációban kompartment kompartment (%) 38.57 ± 1.27 9.29 ± 1.50 100 ± 4.70 39.14 ± 2.40 18.86 ± 2.60† 121 ± 12.96† † † 29.57 ± 0.98 33.14 ± 2.48 131 ± 8.97† 38.70 ± 1.50 9.57 ± 1.51 100 ± 7.80 † 26.40 ± 2.23 12.00 ± 1.83 80 ± 10.52†
Változás a migrációs kompartmentben (%) 100 ± 16.14 203 ± 13.95† 356 ± 26.69† 103 ± 16.25 129 ± 19.69†
3. táblázat. Az ECM biopolimerek hatása az OSCORT sejtek agaróz gélbe való migrációjára. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket adtuk meg. †: Szignifikánsan különbözik a plasztikon tartott sejtek értékéhez képest (p < 0.05, Student-féle t-próbával).
57
Eredmények
5.3.7 ECM és biopolimerei hatása az OSCORT sejtek mátrix metalloproteináz aktivitására Megvizsgáltuk, hogy az ECM migrációt fokozó hatása kapcsolatban áll-e az MMP aktivitás emelkedésével, továbbá adatot kívántunk szerezni arról, hogy melyik zselatináz aktivitása változik ECM jelenlétében. Az extracelluláris mátrix (EHS-ECM, OSCORT-ECM) indukálta a 92 kDa MMP-9 (92 kDa kollagenáz IV) és aktív formájának (82 kDa kollagenáz IV) termelodését (23. ábra). Figyelemre méltó, hogy a 72 kDa MMP-2 (72 kDa kollagenáz IV) és aktív formája (62 kDa) nem volt kimutatható az OSCORT sejtekben. Az ECM biopolimerek közül a fibronektin növelte a 92 kDa MMP-9 (92 kDa kollagenáz IV) expresszióját, de aktivációját (82 kDa kollagenáz IV) már kevésbé eredményezte. Ellenben a HSPG és a kollagén IV indukálták mind a 92 kDa, mind a 82 kDa MMP-9 képzodését, a laminin azonban nem indukálta az MMP-9-t.
23. ábra. MMP-9 indukció ECM és biopolimerei hatására. Az OSCORT sejteket 72 óráig tenyésztettük EHS-ECM, OSCORT-ECM és ECM biopolimerek jelenlétében. A metalloproteináz aktivitást a sejtek kondicionált médiumából mutattuk ki. Plasztik: Plasztik felszínen tartott sejtek. EHS-ECM: EHS-ECM jelenlétében tenyésztett sejtek. Fibronektin (FN), Heparánszulfát proteoglikán (HSPG), Laminin (LN), Kollagén IV (K IV): az ECM biopolimereket 100 µg/ml koncentrációban adtuk a sejttenyészethez. OSCORTECM: OSCORT-ECM 100 µg/ml koncentrációban. A metalloproteináz aktivitást a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük. A zselatint bontó enzimaktivitás áttetszo csíkként jelent meg a megfestett gél kék hátterében. Az ábra tipikus zymogrammot reprezentál, a kísérletet háromszor ismételtük egymástól függetlenül.
58
Eredmények
5.3.8 ECM és biopolimerei hatása az OSCORT sejtek ß1 integrin expressziójára A ß1 integrin egy alapveto mediátora az extracelluláris proteinek által közvetített szignáloknak. A ß1 integrin kimutatása egy szoros ECM–OSCORT kapcsolatra utalhat. Immunoblottal kimutattuk, hogy az OSCORT sejtvonal termeli a 130 kDa-os ß1 integrint, amelynek fehérje expressziója fokozódott az EHS-ECM és az OSCORT-ECM jelenlétében (24. ábra). Az ECM biopolimerek is növelték a fehérje expressziót, legnagyobb mértékben a HSPG, legkevésbé a kollagén IV (24. ábra).
24. ábra. ß1 integrin expresszió ECM és biopolimerei hatására. Az OSCORT sejteket 72 óráig tenyésztettük EHS-ECM, OSCORT-ECM és ECM biopolimerek jelenlétében. A fehérje expressziót 105 OSCORT sejt citoplazma extraktumából mutattuk ki. Plasztik: Plasztik felszínen tartott sejtek. EHS-ECM: EHS-ECM jelenlétében tenyésztett sejtek. Fibronektin (FN), Heparánszulfát proteoglikán (HSPG), Laminin (LN), Kollagén IV (K IV): az ECM biopolimereket 100 µg/ml koncentrációban adtuk a sejttenyészethez. OSCORTECM: OSCORT-ECM 100 µg/ml koncentrációban. Az expressziót a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük. Az ábra tipikus immunoblot képet reprezentál, a kísérletet háromszor ismételtük egymástól függetlenül.
5.4 ECM HATÁSA AZ OSCORT SEJTEK DOXORUBICINNEL SZEMBENI VÁLASZREAKCIÓJÁRA 5.4.1 ECM hatása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek növekedésére Irodalmi adatok és saját elozo vizsgálataink arra utaltak, hogy a sejtek citotoxikus hatóanyagokkal szembeni védekezo képességét az ECM növelni képes.58,59 A cisplatinnal, methotrexattal, maphosphamiddal és doxorubicinnel történo kezelést
59
Eredmények követoen az ECM-gélen tenyésztett, növekedési szakaszban levo tumorsejtek proliferációja magasabb volt a plasztik felszínen növekedett kezelt sejtekhez viszonyítva. Az IC50 szignifikánsan nagyobb volt mind a négy citosztatikum esetében, ha a sejteket az ECM-gélen tartottuk. Mivel a legkifejezettebb hatáskülönbség a plasztikon, illetve az ECM-gélen tenyésztett OSCORT sejtek között a doxorubicinnel való kezelés esetében figyeltük meg, további vizsgálatainkban a doxorubicin (DOX) hatástani sajátosságát jelemeztük ECM és biopolimerei jelenlétében. A 25. ábra mutatja, a doxorubicin beáramlását az OSCORT sejtekbe, amely 30 perc alatt a sejtpopuláció egészére terjed ki. A doxorubicin transzport ECM jelenlétében bekövetkezo zavarainak az elkerülésére a plasztik felületen kezeltük az OSCORT sejteket 4 órán át. Ezt követoen rétegeztük az ECM-gélt a monolayer tenyészetre.
25. ábra. Doxorubicin a plasztik felszínen kezelt OSCORT sejtekben. A doxorubicin a kezelést követo 5. percben még nem került a sejtbe. A 30. percben azonban a fluoreszcens mikroszkóppal jól látható a doxorubicin jelenléte szinte az összes OSCORT sejtben.
60
Eredmények Doxorubicin kezelés hatására nagyobb sejtszám csökkenést, valamint kisebb viabilitást lehetett megfigyelni, ha a sejttenyészetre ECM-gélt rétegeztünk, a plasztik felszínen növo OSCORT tenyészethez képest (26., 27. ábra). A hatáskülönbség annál kifejezettebb volt, minél magasabb a doxorubicin kezelés dózisa, valamint minél több ideig tartott az OSCORT sejt-ECM kapcsolat, azaz minél több ideig tenyésztettük az osteosarcoma sejteket az ECM-gélen.
26. ábra. Az ECM-gél hatása a doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek proliferációjára. A 0.1-10 µg/ml doxorubicin kezelés hatását vizsgáltuk az OSCORT sejtek proliferációjára A sejtproliferációt sejtszámolással vizsgáltuk.
61
Eredmények
27. ábra. Az ECM-gél hatása a doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek életképességére. Az OSCORT sejtek életképességére tripánkék kizárási teszttel és sejtszámolással vizsgáltuk.
A doxorubicin kezelésre létrejövo apoptotikus válasz kisebb volt az ECM-gélen tartott sejtek esetében. A 72. órában az ECM-gélen a 0.1 µg/ml doxorubicin hatására az apoptózis harmada volt a plasztik felszínen tenyésztett sejtekhez képest, 10 µg/ml doxorubicin hatására pedig kétszer gyakoribb volt az apoptotikus sejtek száma. A hatáskülönbség annál kifejezettebb volt minél több ideig maradtak a sejtek az ECMgéllel kapcsolatban (28. ábra).
62
Eredmények
28. ábra. Az ECM-gél hatása a doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek apoptózisára. A 0.1-10 µg/ml doxorubicin kezelés hatását az OSCORT sejtek apoptózisára acridinorange – etidium-bromid jelöléssel vizsgáltuk.
5.4.2 ECM hatása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek repopulációjára A következoben arra a kérdésre kívántunk választ kapni, hogy az ECM-gélnek köszönheto fokozott proliferációs kapacitás, valamint doxorubicinnel szembeni védelem tartósnak mondható-e, vagy addig tart ameddig az ECM–OSCORT kapcsolat?
63
Eredmények 7x104 plasztik felszínen kezelt (4 órán át), majd plasztik felszínen vagy ECM-gél jelenlétében tenyésztett élo sejtet a tenyésztés 72. órájában plasztik felszínre vittük át és további 120 órás tenyésztés alatt, megvizsgáltuk a sejtek repopulációs kapacitását. Az ECM-gélrol származó sejtek már kezdettol fogva jobban szaporodtak a plasztikról származó sejtekhez képest. A 120. órában az ECM-gélbol a plasztik felszínre átvitt 5 µg/ml és 10 µg/ml doxorubicinnel kezelt sejtek esetében ki tudtunk mutatni élo sejteket ellentétben a plasztikról származó sejtekkel. A kezelt sejtek esetében az ECM-gélnek egy korai és egy késoi védo hatását figyeltük meg (4. táblázat). Élo sejtszám x 104 (Kontroll %-a)
T (h)
Plasztik felszínrol,
ECM-gélrol,
plasztik felszínre transzferált sejtek
Plasztik felszínre transzferált sejtek
Kontroll
0.5
5.0
10.0
Kontroll
0.5
µg/ml Dox 24
48
72
10.0
µg/ml Dox
11.96±1.3
11.1±1.9
10.8±2.0
20.0 ±2.6
14.9±2.1
13.1±1.8
11.1±1.9
(100)
(67)
(62)
(60)
(100)
(74)
(65)
(55)
27.2±2.2†
10.4±1.5
7.3±2.2
33.4±2.5†
25.0±1.8†
20.3±2.6†
20.9±2.0†
(100)
(38)
(26)
(27)
(100)
(74)
(60)
(62)
12.8±2.4†
11.3±2.3†
70.3±4.1†
54.9±4.3†
41.9±4.0†
35.3±3.7†
(23)
(20)
(100)
(78)
(60)
(50)
111.8±5.3† 31.7±2.2†
10.3±3.3†
3.4±0.8†
137.3±4.9† 102.3±4.6† 87.8±4.5†
61.1±4.1†
(100)
(9)
(3)
(100)
(44)
7.5±3.8†
0.9±0.3
232.5±6.1† 187.6±7.2
129.0±7.1† 85.7±5.5†
(4)
(0.5)
(100)
(55)
17.8±1.2
55.6±3.2† 18.3±2.4† (100)
96
5.0
(32)
(28)
120 175.0±5.7† 27.2±3.9† (100)
(15)
7.4±2.3
(74)
(80)
(63)
(37)
4. táblázat. A plasztik felszínen és ECM-gélen tenyésztett OSCORT sejtek repopulációs kapacitása. T: Tenyésztési ido. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket adtuk meg. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják. †: Szignifikánsan különbözik a kontroll (nem kezelt) sejtek értékéhez képest (p < 0.05, Student-féle t-próbával).
64
Eredmények
5.4.3 ECM hatása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek sejtciklus fázisaira Áramlási citometria segítségével vizsgáltuk az ECM-gél hatását a doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek sejtciklus különbözo fázisaira (29. ábra). ? doxorubicin kezelés növelte az S-fázisban és csökkentette a G1- és G2-fázisban lévo sejtek arányát. A plasztikon tartott sejtek egy része a 0.5 µg/ml doxorubicin kezelést követo 72. órában a kezelés hatására az S-fázisban halmozódott fel, a G2-fázisban levo sejtek száma lecsökkent a kontrollhoz képest. Az ECM-gélen tartott sejtek a doxorubicin kezelés hatására hasonlóan a plasztikon tartott kezelt sejtekhez, az S-fázisban felhalmazódtak, ugyanakkor az S-fázis elején, a DNS replikáció korai szakaszában megjelent egy másik felhalmazódás is. A G2-fázisban ugyanannyi sejt volt, mint a kezelt plasztik esetében, de az S-fázisban még több sejt tartózkodott, mint a csak ECM-gélen kezeletlen sejtek esetében.
Plasztik
ECM-gél
Kontroll
Az OSCORT sejtek százalékos megoszlása G1 S G2 73.4 ± 2.3 9.4 ± 2.0 16.4 ± 1.4
DOX 0.5 µg/ml
55.0 ± 2.1†
37.6 ± 1.5†
7.4 ± 2.4†
Kontroll
45.9 ± 0.7
36.9 ± 3.1
17.2 ± 1.2
DOX 0.5 µg/ml
40.6 ± 1.0†
51.6 ± 2.9†
7.8 ± 0.9†
29. ábra. Az extracelluláris mátrix hatása a doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek megoszlására az életsejtciklus fázisai között.
65
Eredmények A sejteket a 4 órás doxorubicinnel való kezelést követoen, 72 órán át tenyésztettük plasztikon vagy ECM-gél jelenlétében. FACS képek: (1) kontroll plasztik, (2) 0.5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában plasztikon tartott sejtek, (3) kontroll ECM-gél, (4) 0.5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában ECM-gélen tartott sejtek. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket adtuk meg. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják. †: Amennyiben az érték szignifikánsan különbözik a kontroll (nem kezelt) sejtek értékéhez képest (p < 0.05, Student-féle t-próbával).
5.4.4 ECM biopolimerek hatása az OSCORT sejtek doxorubicinnel szembeni válaszreakciójára A szolúbilis EHS-ECM és hasonlóan az OSCORT sejtek által termelt extracelluláris mátrix a koncentrációjukkal egyenes arányban csökkentették a doxorubicin citotoxikus hatását (30. ábra). Azzal a kérdésünkkel kapcsolatban, hogy az ECM biopolimerek között melyik teheto felelossé a doxorubicinnel szembeni védo hatásért, megállapítottuk hogy elsosorban a heparánszulfát proteoglikán és valamivel kisebb, de még így is jelentos mértékben a fibronektin nyújtott védelmet. A laminin és az entaktin nem befolyásolta a doxorubicin citoreduktív hatását, a sejtek hasonló mértékben proliferáltak mint a plasztik felszínen tenyésztett kezelt sejtek. A kollagén IV ezzel szemben egyenesen elosegítette a doxorubicin citotoxikus hatását, a sejtek proliferációjának szignifikáns csökkenését tapasztaltuk (30. ábra).
66
Eredmények
30. ábra. Az ECM és biopolimereinek hatása az OSCORT sejtek növekedésére az 5 µg/ml doxorubicin kezelést követo 72. órában. a. Az ECM biopolimerek fehérje koncentrációjának összefüggése az OSCORT sejtek növekedésével a plasztik felszínen tenyésztett sejtekhez, százalékához viszonyítva. b. Az ECM biopolimerek fehérje koncentrációjának összefüggése az OSCORT sejtek növekedésével a plasztik felszínen tenyésztett sejtekhez, százalékához viszonyítva, 5 µg/ml doxorubicinnel való kezelést követoen. A sejtproliferációt MTT teszt segítségével vizsgáltuk. A sejtproliferációs értékek átlagát valamint a ± SD értéket ábrázoltuk. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják.
67
Eredmények
5.4.5 ECM moduláló hatása a doxorubicin indukált DNS károsodásra A doxorubicinnel végzett sejt károsítást követo 72. óra után Hoechst DNS méréssel, agaróz
gélelektroforézissel
és
egy-sejt
gél
elektroforézissel
(comet
assay)
összehasonlítottuk a doxorubicin okozta DNS károsítást a plasztik felszínen, illetve az ECM-gélen tartott OSCORT sejtekben (31., 32., 33. ábra). Az ECM-gélen tenyésztett sejtek DNS károsítását Hoechst festéssel és fluorométerrel vizsgálva megállapítható, hogy a plasztikon illetve az ECM-gélen tartott kontroll sejtek spontán DNS fragmentációja közel azonos volt, ezzel ellentétben a doxorubicinnel kezelt sejteknél már szignifikáns különbséget tapasztaltunk. A plasztik felszínen tartott tumorsejtek 0.5 µg/ml doxorubicinnel való kezelése a kontroll sejtekre jellemzo DNS fragmentáció 238%-át, az 5 µg/ml doxorubicin kezelés a 244%-át érte el. Ezzel ellentétben az ECM-gélen a DNS fragmentáció kisebb mértéku volt a kontrollhoz képest (p>0.05, Student-féle t-próbával) (31. ábra).
31. ábra. A doxorubicin okozta DNS fragmentáció kimutatása Hoechst-jelöléssel 4 és 72 órával a kezelést követoen plasztik felszínen és ECM-gélen tenyésztett OSCORT sejtek esetében. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket adtuk meg. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát ábrázolják.
68
Eredmények
A fenti eredményeket a fragmentált DNS 1 µg-jának agaróz gélelektroforetikus futtatása is alátámasztja. A doxorubicin okozta DNS károsítás már közvetlenül a 4 órás kezelést követoen megjelent, de a kezelés után 72 órával kifejezettebb volt. Az ECMgélen tartott sejtekben a DNS károsodás szignifikánsan kisebb volt a plasztikon tartott sejtekhez viszonyítva. Kiemelendo, hogy a kisebb doxorubicin dózis esetében a 4 órás károsításhoz képest kisebb DNS fragmentációt tapasztaltunk az ECM-gélen tartott sejtek esetében, ami már a repair folyamat meglétét támasztja alá az ECM-gél hatására (32. ábra).
32. ábra. A doxorubicin okozta DNS fragmentáció kimutatása 1.5%-os agaróz gélelektroforézissel 4 és 72 órával a kezelést követoen plasztik felszínen és ECM-gélen tenyésztett OSCORT sejtek esetében. (1) 4 órás Dox kezelést követoen, (2) kontroll plasztik a tenyésztés 72. órájában, (3) 0.5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában a plasztikon tartott sejtek, (4) 5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában a plasztikon tartott sejtek, (5) kontroll ECM-gél a tenyésztés 72. órájában, (6) 0.5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában az ECM-gélen tartott sejtek, (7) 5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában az ECM-gélen tartott sejtek.
Az egy-sejt gélelektroforézis (comet assay) a DNS károsodást egy-sejt szinten ábrázolja. A sejtek agaróz gélelektroforézisét követoen, a DNS-t etidium-bromiddal jelöltük és fluoreszcens mikroszkóppal vizualizáltuk. A kiértékelésnél a mért paraméterek között a fejet, amely a sejtmagot, és a csóvát, amely a fragmentált DNS-t jelenti, vettük figyelembe (33. ábra). A csóva hossza, amely a maximális átmérobol a fej átmérojének a kivonatával számítható ki, arányos a fragmentált DNS méretével, hiszen
69
Eredmények minél kisebb a fragmentáció annál messzebbre vándorol az elektroforézis során. A csóva százalék a csóva denzitásának a totál denzitásával való elosztását majd 100-al való szorzását jelenti és arányos a fragmentált DNS mennyiségével. A csóva denzitást a fej denzitásnak a totál denzitásból való kivonásával számíthatjuk ki. A csóva momentum a csóva százalék és a csóva hosszának a szorzásából majd 100-al való elosztásával mérheto ki és arányos a fragmentált DNS-nek mind a méretével, mind a mennyiségével azaz a DNS károsodás mértékével. A sejtek DNS fragmentáció nagysága, mennyisége és összességében vett mértéke között nem tapasztaltunk szignifikáns eltérést ha a sejteket plasztik felszínen vagy ECM-gélen tartottuk. Megfigyelhetjük, hogy ellentétben a plasztikon tenyésztett sejtekkel, az ECM-gélen tartott sejtek csóva hossza, csóva denzitása és csóva momentuma kisebb, mind a 0.5 µg/ml doxorubicin mind az 5 µg/ml doxorubicin kezelés esetében. Ez alapján az ECMgélen tenyésztett doxorubicinnel károsított sejtek DNS nagysága, mennyisége és összessége szignifikánsabb kisebb volt a plasztikon tartott sejtekhez viszonyítva. Az ECM-gélen szemmel láthatóan a kezelés hatására kevesebb és nagyobb méretu sejttörmelék volt, mint a plasztikon (33. ábra).
A 33. ábra a doxorubicin okozta DNS fragmentáció kimutatását egy-sejt gélelektroforézissel (comet assay) ábrázolja, 72 órával a kezelést követoen plasztik felszínen és ECM-gélen tenyésztett OSCORT sejtek esetében. A. Az etidium-bromiddal megjelölt sejtmagokat Zeiss fluoreszcens mikroszkóp segítségével vizsgáltuk. Fluoreszcens mikroszkópos képek: (1) kontroll plasztik a tenyésztés 72. órájában, (2) 0.5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában a plasztikon tartott sejtek, (3) 5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában a plasztikon tartott sejtek, (4) kontroll ECM-gél a tenyésztés 72. órájában, (5) 0.5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában az ECM-gélen tartott sejtek, (6) 5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában az ECM-gélen tartott sejtek. B. A mikroszkópos képek kvantitatív kiértékelése IMAN morfometriás software program segítségével történt. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket ábrázoltuk. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják.
70
Eredmények
A.
B. 33. ábra. A doxorubicin okozta gélelektroforézissel (comet assay).
DNS
71
fragmentáció
kimutatása
egy-sejt
Eredmények
5.4.6 ECM hatása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek tumor szuppresszor fehérjék expressziójára Választ keresve arra a kérdésre, hogy az ECM-gél mennyiben módosítja a pRb és a p53 expresszióját, megállapítottuk, hogy az ECM-gélen tartott sejtekben mind a pRb mind a p53 expresszió mértéke kisebb volt a plasztik felszínen tartott sejtekhez képest (34., 35A. ábra). Doxorubicin kezelésre a plasztikon, valamint az ECM-gélen tenyésztett sejtekben dózisfüggo pRb és p53 fehérje expresszió fokozódást tapasztaltunk. Az ECMgélen tenyésztett sejtekben azonban szignifikánsan alacsonyabb volt a pRb és a p53 emelkedése is (p<0.05) (34., 35A. ábra).
34. ábra. Az extracelluláris mátrix hatása az OSCORT sejtek pRb expressziójára a doxorubicin kezelést követo 72 órás tenyésztési idot követoen. Az OSCORT sejteket a 4 órás 0.5 µg/ml és 5 µg/ml doxorubicin kezelést követoen 72 óráig tenyésztettük plasztik felszínen, vagy ECM-gél jelenlétében. A fehérje expressziót 10 5 OSCORT sejtbol mutattuk ki. Az expressziót a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük. Az ábra tipikus immunoblot képet reprezentál. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket ábrázoltuk. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják.
72
Eredmények (MW) molekulasúly, (1) kontroll plasztik a tenyésztés 72. órájában, (2) 0.5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában a plasztikon tartott sejtek, (3) 5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában a plasztikon tartott sejtek, (4) kontroll ECM-gél a tenyésztés 72. órájában, (5) 0.5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában az ECM-gélen tartott sejtek, (6) 5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában az ECM-gélen tartott sejtek.
35. ábra. Az extracelluláris mátrix hatása az OSCORT sejtek p53 expressziójára a doxorubicin kezelést követo 72. órában. Az OSCORT sejteket a 4 órás 0.5 µg/ml és 5 µg/ml doxorubicin kezelést követoen 72 óráig tenyésztettük plasztik felszínen, vagy ECM-gél jelenlétében. A fehérje expressziót 10 5 OSCORT teljes sejtbol (A), illetve 105 OSCORT sejtmagi extraktumából (B) mutattuk ki. Az expressziót a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük. Az ábra tipikus immunoblot képet reprezentál. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket ábrázoltuk. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják. A: (MW) molekulasúly, (1) kontroll plasztik a tenyésztés 72. órájában, (2) 0.5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában a plasztikon tartott sejtek, (3) 5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában a plasztikon tartott sejtek, (4) kontroll
73
Eredmények ECM-gél a tenyésztés 72. órájában, (5) 0.5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában az ECMgélen tartott sejtek, (6) 5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában az ECM-gélen tartott sejtek. B: (MW) molekulasúly, (1) kontroll plasztik a tenyésztés 72. órájában, (2) kontroll ECM-gél a tenyésztés 72. órájában, (3) 5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában a plasztikon tartott sejtek, (4) 5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában az ECM-gélen tartott sejtek.
A p53 immunoblot vizsgálat az ECM-gélen tenyésztett sejtek magjaiban az 5 µg/ml doxorubicin kezelésre szignifikánsan kisebb p53 expresszió fokozódást mutatott (35B. ábra). A p53 immuncitokémiai vizsgálatákor jól látható, hogy az ECM-gélen tartott sejtekben ritkábban fordul elo p53 pozitivitás a plasztik felszínen tartott sejtekhez képest. Emellett a p53 csökkent indukálhatósága figyelheto meg ECM jelenlétében (36. ábra). A konfokális lézer scanning mikroszkóp alátámasztja a ritkább p53 pozitivitást az ECM-gél hatására (37. ábra). Továbbá, a plasztikon tenyésztett sejtekben az 5 µg/ml doxorubicin kezelést követo 72 óra múlva, a p53 túlnyomó része a citosztatikum hatására a citoplazmából a sejtmagba került (37. ábra). Ellenben, az ECM-gél hatására jelentosen kevesebb sejtben volt kimutatható p53 pozitivitás a sejtmagban (37. ábra).
36. ábra. p53 fehérje immuncitokémiai kimutatása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtekben, amelyeket, a kezelést követoen plasztikon, illetve ECM-gélen tenyésztettük. Az OSCORT sejteket a 4 órás 0.5 µg/ml és 5 µg/ml doxorubicin kezelést követoen 72 óráig tenyésztettük plasztik felszínen, vagy ECM-gél jelenlétében. (a) kontroll plasztik a tenyésztés 72. órájában, (b) 0.5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában a plasztikon tartott sejtek, (c) 5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában a plasztikon tartott sejtek, (d) kontroll ECM-gél a tenyésztés 72. órájában, (e) 0.5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában az ECM-gélen tartott sejtek, (f) 5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában az ECM-gélen tartott sejtek. 200x nagyítással, fluoreszcens mikroszkóppal készült képek.
74
Eredmények
37. ábra. p53 fehérje immuncitokémiai kimutatása a doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtekben, amelyeket, a kezelést követoen plasztikon, illetve ECM-gélen tenyésztettük. Az OSCORT sejteket a 4 órás 5 µg/ml doxorubicin kezelést követoen 72 óráig tenyésztettük plasztik felszínen, vagy ECM-gél jelenlétében. A1: Kontroll plasztik. Átnézeti kép, p53 pozitivitás (zöld, vizualizálva sztreptavidin-fluoreszceinnel) a nem osztódó sejtek citoplazmájában. A2: Kontroll plasztik. p53 az osztódó sejtben (sejt anafázisban), a kromatin állományon kívül, a citoplazmában. A3: Átnézeti kép, az 5 µg/ml doxorubicin kezelés hatására p53 megjelenése a sejtmagban (piros festodés propidium-jodiddal). A4: Az 5 µg/ml doxorubicin kezelés hatására p53 megjelenése a sejtmagban. B1: Kontroll ECM-gél. Átnézeti kép, amely mutatja, hogy a p53 pozitivitás ritkán fordul elo. B2: Átnézeti kép, az 5 µg/ml doxorubicin kezelés hatására p53 megjelenése a sejtmagban ritka, nekrobiózisban a p53 vezikulárisan látható. A1, A3, B1, B2: 400x nagyítással, A2, A4: 1000x nagyítással konfokális lézer scanning mikroszkóppal kész ült képek.
5.4.7 ECM hatása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek topoizomeráz fehérjék expressziójára és aktivitására Ismert, hogy a topoizomeráz II a doxorubicin molekuláris célpontja, ezért a topoizomeráz II kimutatása a kezelést követoen a nem-migráló és a migráló kompartmentben fontos jelentoséggel bírt. Vizsgálatunk eredménye arra utal, hogy a doxorubicin mind a két sejtpopulációban gátolta a topoizomeráz II aktivitást (38. ábra).
75
Eredmények A dekatenációs aktivitási méréseinket az immuncitokémiai vizsgálataink is megerosíteni látszanak, a doxorubicin kezelés csökkentette a topoizomeráz II aktivitást (39. ábra). A továbbiakban az a kérdés merült fel, hogy módosulhat-e az ECM indukált topoizomeráz váltás a doxorubicin kezelést követoen. A monolayer-plasztik felszínen maradt sejtekben (nem-migráló kompartment) jelentos topoizomeráz I aktivitást mutattunk ki, ugyanakkor az ECM-gélbe vándorolt sejtekben (migráló kompartment) ez az aktivitást sokkal alacsonyabb volt. Figyelemre méltónak tartható, hogy a doxorubicin kezelés után ez a különbség nem volt megfigyelheto (40. ábra). 1.
2.
3.
4.
38. ábra. Topoizomeráz II dekatenációs aktivitásának összehasonlítása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek nem-migráló és migráló populációjában. Az OSCORT sejteket 48 órán át tenyésztettük plasztik felszínen. A 4 órás 5 µg/ml doxorubicinnel való kezelést követoen ECM-gélt rétegeztünk a monolayerre és tovább inkubáltuk 24 órán át. Az inkubációs ido letelte után a migráló és a nem-migráló sejtekben külön-külön vizsgáltuk a topoizomeráz II aktivitást. A topoizomeráz II aktivitást kDNS ATP függo dekatenációs módszerrel mutattuk ki 2.5x104 OSCORT sejtmagi extraktumából. NW: Nagy molekulatömegu összefuzött gyurus kinetoplaszt DNS. Mc: Egyes gyurus, kis kör alakú DNS (Minicircles). NK: Negatív kontroll, 500 ng plazmid DNS sejtmagi extraktum nélkül. PK: Pozitív kontroll 500 ng kDNS 2 unit calf thymus topoizomeráz II-vel (TopoGen, Columbus, Ohio, USA). 1-4: 500 ng kDNS különbözo tenyésztési körülmények alatt tenyésztett 2.5x104 OSCORT sejtmag extraktummal. Nem-migráló: A plasztik felszínen maradt (nem-migráló) sejtek (kontroll). Migráló: Az ECM-gélbe migrált sejtek (kontroll). Nem-migráló DOX: 5 µg/ml doxorubicinnel való kezelést követoen a plasztik felszínen maradt (nem-migráló) sejtek. Migráló DOX: 5 µg/ml doxorubicinnel való kezelést követoen az ECM-gélbe migrált sejtek. Az aktivitást a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük.
76
Eredmények
39. ábra. Topoizomeráz II fehérje immuncitokémiai kimutatásának összehasonlítása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek nem-migráló és migráló populációjában. Az OSCORT sejteket 48 órán át tenyésztettük plasztik felszínen. A 4 órás 5 µg/ml doxorubicinnel való kezelést követoen ECM-gélt rétegeztünk a monolayerre és tovább inkubáltuk 24 órán át. Az inkubációs ido letelte után a migráló és a nem-migráló sejtekben külön-külön vizsgáltuk a topoizomeráz II jelenlétét. A topoizomeráz II zöldként vizualizálódott, a sejtmag pirosra festodött. 1, 2: Kontroll nem-migráló sejtek. A mitotikus sejtekben nagyon kicsi (1), vagy egyáltalán nincs (2) topoizomeráz II immunreakció. 3: 5 µg/ml doxorubicin kezelés hatására a nemmigráló sejtekben az immunreakció csökkent. 4, 5: Kontroll migráló-sejtek. A mitotikus sejtekben magas a topoizomeráz II immunreakció. 4: „Égo csipkebokor”. 5: Topoizomeráz II a kromoszóma felületén. 6: 5 µg/ml doxorubicin kezelés hatására a migráló sejtekben az immunreakció jelentosen csökkent. 1, 2, 3, 4, 6: 400x nagyítással, 5: 1000x nagyítással konfokális lézer scanning mikroszkóppal készült képek.
77
Eredmények
40. ábra. Topoizomeráz I fehérje relaxációs aktivitás kimutatásának összehasonlítása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek nem-migráló és migráló populációjában. Az OSCORT sejteket 48 órán át tenyésztettük plasztik felszínen. A 4 órás 5 µg/ml doxorubicinnel való kezelést követoen ECM-gélt rétegeztünk a monolayerre és tovább inkubáltuk 24 órán át. Az inkubációs ido letelte után a migráló és a nem-migráló sejtekben külön-külön vizsgáltuk a topoizomeráz I aktivitást. A topoizomeráz I aktivitást szuperhélix pBR322 plazmid DNS relaxációs módszerrel mutattuk ki 2.5x104 OSCORT sejtmagi extraktumából. R: Relaxált DNS. S: Szuperhélix DNS. NK: Negatív kontroll, 500 ng plazmid DNS sejtmagi extraktum nélkül. PK: Pozitív kontroll, 500 ng plazmid DNS 2 unit topoizomeráz I (TopoGen, Columbus, Ohio, USA). 1-4: 500 ng plazmid DNS különbözo tenyésztési körülmények alatt tenyésztett 2.5x104 OSCORT sejtmag extraktummal. Nem-migráló: Kontroll a plasztik felszínen maradt (nem-migráló) sejtek. Migráló: Kontroll az ECM-gélbe migrált sejtek. Nemmigráló DOX: 5µg/ml doxorubicinnel való kezelést követoen a plasztik felszínen maradt (nemmigráló) sejtek. Migráló DOX: 5 µg/ml doxorubicinnel való kezelést követoen az ECM-gélbe migrált sejtek. Az aktivitást a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük.
78
Eredmények
5.4.8 Doxorubicin kezelés hatása OSCORT sejtek proliferációjára és migrációjára A plasztik felszínen tenyésztett OSCORT sejteket különbözo dózisú (0.01-5 µg/ml) és különbözo ideig (4-24 óra) kezeltük doxorubicinnel. A kezelést követoen ECM-gélt rétegeztünk a sejtekre és tovább inkubáltuk 24 órát. A nem-migráló (plasztik felszínen maradt és növekedo sejtek) és a migráló (ECM-gélbe vándorolt és proliferáló sejtek) OSCORT sejteknek eltéro volt a válaszreakciója a doxorubicin kezelésre és összefüggésben volt a kezelési idotartammal (41 ábra). A 4 órás doxorubicinnel való kezelést követoen a kisebb dózisoknál (0.01, 0.05 és 0.25 µg/ml) az összsejtszámot (migráló és nem migráló sejtek) illetoen nem volt eltérés a kontroll értékekhez képest. Azonban a nagyobb dózisoknál (0.5 és 5.0 µg/ml) már csökkenést figyeltük meg. A nagyobb dózisú doxorubicin kezelést követoen a túlélo sejtek többsége, az ECM-gélbe vándorolt, ezért a migráló és a nem migráló sejtkompartment közötti arány megváltozott. Igy a kisebb dózisok esetében (0.01-0.25 µg/ml) a migráció szelektív gátlása, míg a magasabb dózisok esetében a nem migráló sejtek számának a csökkenése jellemezte a doxorubicin hatását (41 ábra). A 24 órás doxorubicinnel való kezelést követoen már a kisebb dózisoknál (0.01, 0.05 és 0.25 µg/ml) is hatékony volt a kezelés, itt is dózisfüggo redukciót tapasztaltunk az összsejtszámot illetoen. A 24 órás doxorubicinnel való kezelést követoen a nagyobb dózinál (5.0 µg/ml) már nem volt túlélo sejt kimutatható. A 24 órás kis dózisú doxorubicin kezelés antimigrációs hatása még kifejezettebbnek bizonyult a 4 órás kezeléssel összehasonlítva (41 ábra). A 4 és a 24 órás kezelést követoen az ECM-gélbe vándorolt sejtek viabilitása 10%-al volt magasabb a plasztikon maradt sejtekhez viszonyítva. Vizsgálataink a doxorubicin proliferáció gátló hatásán kívül, egy dózisfüggo antimigrációs hatását is mutatták.
79
Eredmények
41. ábra. A 4 és a 24 órás doxorubicin hatása az OSCORT sejtek proliferációjára és migrációjára. Az összsejtek, a migráló és a nem-migráló sejtek növekedésének összehasonlítása 0.01 – 5 µg/ml 4 órás, valamint 24 órás doxorubicin kezelést követoen. Az ábrázolt séma mutatja a kísérlet menetét: A sejteket plasztik felszínen tenyésztettük 24 vagy 48 órán át, majd kezeltük 0.01-5 µg/ml dózisú doxorubicinnel 4 órán át, vagy 24 órán át. Ezt követoen a sejtekre ECMgélt rétegeztünk 24 órán át. A nem-migráló (plasztik felszínen maradt és növekedo sejtek) és a migráló (ECM-gélbe vándorolt és proliferáló sejtek) OSCORT sejtek válaszreakcióját együtt és külön-külön is értékeltük.
80
Eredmények Mivel kísérleteink során a proteoglikánok kiemelkedo szerepét tapasztaltuk az OSCORT sejtek biológiai viselkedésében és doxorubicinnel szembeni válaszreakciójában, további vizsgálatainkban a proteoglikánok szintézisét tanulmányoztuk. Továbbá megvizsgáltuk, hogy a proteoglikanok szintézisének gátlása hasznosítható-e a doxorubicin daganat elleni hatásában.
5.5 A PROTEOGLIKÁNOK LEHETSÉGES SZEREPE AZ OSTEOSARCOMA KEZELÉSÉBEN 5.5.1 Proteoglikán expresszió az OSCORT sejtekben és az ECM-ben Megállapíthattuk, hogy az OSCORT sejtek a HSPG mellett dekorint is termelnek és mindkét proteoglikán, még nagyobb mértékben, a médiumban is kimutatható (42. ábra).
A.
B.
C.
42. ábra. OSCORT sejtekbol izolált proteoglikán minták vizsgálata. A. Western blot reakció HSPG antitesttel. B. Western blot reakció dekorin antitesttel. C. Negatív kontroll. MW: Molekulasúly, M: Médiumból izolált PG, S: Sejtbol izolált PG.
A továbbiakban összehasonlítottuk az ECM-gélben és az OSCORT sejtek által termelt extracelluláris mátrixban (OSCORT-ECM) lévo heparánszulfát proteoglikánt. Mind az ECM-gélben, mind az OSCORT-ECM-ben agrin volt kimutatható, ellenben csak az ECM-gélben találtunk perlekánt (43. ábra).
81
Eredmények
43. ábra. HSPG az ECM-gélben és az OSCORT-ECM-ben. A. Az ECM-gélbol és az OSCORT-ECM-bol proteoglikánt izoláltunk és 10 µg fehérjére vonatkoztatva megfuttattuk 10%-os akrilamid gélen. Ezt követoen nitrocellulóz membránra transzferáltuk és reagáltattuk anti-agrin antitesttel. 1.oszlop: OSCORT-ECM-bol izolált proteoglikán. 2.oszlop: ECM-gélbol izolált proteoglikán. B. Az ECM-gélbol és az OSCORT-ECM-bol proteoglikánt izoláltunk és 10 µg fehérjére vonatkoztatva dot blotra vittük fel. A reakció anti-perlekán antitesttel történt.
5.5.2 Doxorubicin és clodronat hatása az OSCORT sejtek növekedésére és proteoglikán termelésére A clodronat koncentrációtól függoen csökkentette az OSCORT sejtek növekedését, 50 µmol/l koncentráció felett a hatás szignifikánsnak bizonyult. Az 50 és az 500 µmol/l clodronat kezelés hatása között szignifikáns különbség nem volt megfigyelheto (p=0.386), ami arra utal, hogy a clodronat OSCORT-sejtekre gyakorolt növekedést csökkento hatása telítodési görbét ír le (44. ábra). 500 µmol/l clodronat a kontrollhoz képest annak 71.22%-ára csökkentette a sejtszámot, összehasonlításképpen 5 µg/ml doxorubicin (8.62 µmol/l) a kontrol 62.54%-ára csökkentette a sejtszámot. A clodronat OSCORT sejtekre gyakorolt sejtszám csökkento hatása figyelemre méltó, de a doxorubicinnel összehasonlítva sokkal jelentéktelenebb.
82
Eredmények
44. ábra. Clodronat hatása az OSCORT sejtek növekedésére. 80x104 OSCORT sejtet kezeltünk plasztik felszínen, 4 órán át 5-500 µmol/l clodronattal. A kezelést követoen a sejteket tovább inkubáltuk még 48 órán át. A sejtproliferációt sejtszámolással vizsgáltuk. A sejtproliferációs értékek átlagát valamint a ± SD értéket ábrázoltuk. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják.
A clodronat egy másik hatása azonban a sejtnövekedés gátlásnál nagyobb jelentoséggel bír. OSCORT sejtekben jelölést
végeztünk
24
órán
át.
14
C-izotóppal jelölt glükózaminnal bioszintetikus
A
glükózamin
a
proteoglikán
molekulák
glükózaminoglükán láncaiba épül be. 4 órán át tartó 500 µmol/l clodronat illetve 5 µg/ml doxorubicin kezelést követoen proteoglikánt izoláltunk az OSCORT sejtekbol és a sejtek által kondicionált médiumból. A radioaktivitás a beépült glükózamint jellemzi, ami a proteoglikán szintézis intenzitásával hozható összefüggésbe. A doxorubicin növelte a sejtszámra vonatkoztatott glükózamin eredetu radioaktivitás mértékét mind a sejtekbol, mind a médiumból izolált proteoglikánokban. A clodronat ezzel szemben csökkentette a radioaktivitást a kontrollhoz képest a médiumból és a sejtekbol izolált proteoglikánokban (45. ábra). A clodronat elsosorban a proteoglikánba épült radioaktivitást gátolta, azonban a médiumba jutott szabad GAG mennyisége is jelentosen kevesebb volt (46. ábra).
83
Eredmények
45. ábra. A doxorubicin és a clodronat hatása az OSCORT sejtek proteoglikán szintézisére. 2x104 OSCORT sejtet kezeltünk plasztik felszínen, 4 órán át 5 µg/ml doxorubicinnel, illetve 500 µmol/l clodronattal. A kezelést követoen a sejteket a 24. órában [14C]-glükózaminnal jelöltük további 24 órán át. A tenyésztési ido letelte után a sejtekbol proteoglikánt izoláltunk. A proteoglikán frakciók aktivitását cpm-ben mértük. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket ábrázoltuk. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják.
46. ábra. A doxorubicin és a clodronat hatása az OSCORT sejtek GAG és proteoglikán szintézisére. 2x104 OSCORT sejtet kezeltünk plasztik felszínen, 4 órán át 5 µg/ml doxorubicinnel, illetve 500 µmol/l clodronattal. A kezelést követoen a sejteket a 24. órában [14C]-glükózaminnal jelöltük további 24 órán át. A tenyésztési ido letelte után a sejtekbol szabad GAG-ot és proteoglikánt izoláltunk. A frakciók aktivitását külön-külön dpm-ben mértük. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket ábrázoltuk. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják.
84
Eredmények További kísérleteink a clodronat dózisfüggo proteoglikán szintézis gátlást igazolták. (47. ábra).
47. ábra. A clodronat hatása az OSCORT sejtek proteoglikán expressziójára. 2x104 OSCORT sejtet kezeltünk plasztik felszínen, 4 órán át, 5-, 50-, és 500 µmol/l clodronattal. A kezelést követoen a sejteket a 24. órában [14C]-glükózaminnal jelöltük további 24 órán át. A tenyésztési ido letelte után a sejtekbol és a megfelelo médiumból proteoglikánt izoláltunk. Az ábra fluorográfiás képet reprezentál. 1. Kontroll sejt médiumából izolált proteoglikán, 2. 5 µmol/l clodronattal kezelt sejt médiumából izolált proteoglikán, 3. 50 µmol/l clodronattal kezelt sejt médiumából izolált proteoglikán, 4. 500 µmol/l clodronattal kezelt sejt médiumából izolált proteoglikán, 5. Kontroll sejtbol izolált proteoglikán, 6. 5 µmol/l clodronattal kezelt sejtbol izolált proteoglikán, 7. 50 µmol/l clodronattal kezelt sejtbol izolált proteoglikán, 8. 500 µmol/l clodronattal kezelt sejtbol izolált proteoglikán. Az eredményt a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük. Megfigyelheto hogy mind a sejtekben, mind a médiumban egy dózisfüggo proteoglikán csökkenés következett be a clodronat kezelésre.
5.5.3 Doxorubicin és clodronat kombinációs kezelés hatása az OSCORT sejtek növekedésére Plasztik felszínen tenyésztett 14x104 sejt/cm2 OSCORT sejtet 4 órán át kezeltünk 5 µg/ml doxorubicinnel. A kezelés után 4 órás inkubálási periódus következett, majd újabb 4 órás kezelés 50 µmol/l clodronattal. A kezelés végén ECM-gélt rétegeztünk az OSCORT sejtekre és további 72 órán át inkubáltuk. Ezzel párhuzamban 4 órás kezelést végeztünk „monoterápiában” csak doxorubicinnel vagy csak clodronattal. A tenyésztési ido lejárta után a sejtek proliferációját és viabilitását vizsgáltuk (48. ábra).
85
Eredmények
Sejtszám
A.
Viabilitás
B.
48. ábra. A doxorubicin és a clodronat kombinációs kezelés hatása az OSCORT sejtek növekedésére A kezelések hatását az OSCORT sejtek proliferációjára (A.) és életképességére (B.) tripánkék kizárási teszttel és sejtszámolással vizsgáltuk. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket adtuk meg. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják.
86
Eredmények Kísérleteinkbol megfigyelheto, hogy a clodronattal való utókezelés a plasztik felszínen tartott sejtek számát csökkentette ugyan, de a csökkenés nem volt szignifikáns a doxorubicinnel kezelt sejtekhez képest. Ellenben az ECM-gél jelenlétében ez a hatás már szignifikánsnak bizonyult: az ECM-gélnek kisebb volt a protektív hatása, a kombinált kezelés további 27.38%-al csökkentette a sejtszámot, mint a doxorubicin önmagában (p<0.05). A sejtek életképességét illetoen a clodronat kezelés nem volt jelentos hatással sem a plasztik, sem az ECM-gélen levo tenyésztés során. Azonban a kombinációs kezelés hatásos volt, az ECM-gélen tenyésztett sejtek esetében további 21.56%-al csökkent a sejtek életképessége a doxorubicin kezeléshez viszonyítva. A különbség szignifikánsak bizonyult (p<0.05). Vizsgálatainkból megfigyelheto, hogy a doxorubicin a viabilitást, a clodronat a növekedést csökentette. Ez alapján a két daganatellenes szer együttes alkalmazása javasolható az osteosarcoma hatékonyabb kezelésért.
87
Megbeszélés
6 MEGBESZÉLÉS Napjainkra az osteosarcoma kezelése összetett kezeléssé alakult, amely preoperatív kemoterápiából,
sebészi
beavatkozásból,
illetve
ezt
követoen
posztoperatív
kemoterápiából áll.34 A kemoterápia bevezetése mérföldes elorehaladást eredményezett az osteosarcomás betegek gyógyításában. A preoperatív kemoterápia általában a nagy dózisú methotrexat, doxorubicin, cisplatin és ifosfamid kombinációból áll,37,38,137 és alkalmazásával lehetoség nyílik a már esetlegesen kialakult mikrometasztázisok kezelésére, valamint a daganat megkisebbedésére és vaszkularizálságának csökkentésére.54 Az eredményes preoperatív
kemoterápia
a
végtagkímélo
mutétek
számának
a
fokozódását
eredményezte. A preoperatív kemoterápia eredményessége Huvos és munkatársai négy csoportot tartalmazó osztályozása alapján értékelheto. Csökkent kemoterápiás válaszra utal (Huvos grade I/II), amennyiben a definitív mutét során eltávolított daganatban, 10% feletti vitális tumorsejtek láthatók mikroszkóposan, a vizsgált látóterekben.30,51 A neoadjuváns kemoterápiára adott hisztológiai válasz a nekrózis mértékétol függoen, jelenleg a legmegbízhatobb prognosztikai faktornak tekíntheto a betegségmentes túlélést illetoen.138 Számos klinikai vizsgálat történt, amely során a rosszabb prognózisú, preoperatív kemoterápiára nem vagy kevésbé reagáló betegek, betegségmentes túlélését egy intenzívebb posztoperatív kemoterápiával probálták fokozni. Ebben a betegcsoportban független klinikai vizsgálatok eredményei nem tudtak kimutatni nagyobb túlélést az agresszívebb kemoterápiás kezeléssel. 50,139,140 A túlélés növelése egy hatékony kemoterápia segítségével az osteosarcomában szenvedo betegek esetében, különös jelentoséggel bír, mivel az osteosarcoma többsége az élet elso két évtizedében keletkezik, így az elofordulás csúcsa a serdülokorra esik. A nemzetközi adatok alapján érthetové válik, olyan tumorbiológiai faktoroknak a kutatása és a kimutatása, amelyek magyarázattal szolgálhatnak a kemoterápia rezisztenciáért az osteosarcomás betegekben, valamint új terápiás célpontokat jelenthetnek az osteosarcoma hatékonyabb kezelésében. Az elmúlt évek vizsgálatai mutattak rá a mikrokörnyezet szerepére a tumorsejtek malignus fenotípusának a kialakításában, amely alapvetoen új irányzatot jelent a
88
Megbeszélés kisérleti
onkológiában
és
nagy
lehetoséget
tár
fel
sejtfelszíni
adhezív
a
klinikai
onkológia
számára.57,58,64,65,66,69 Az
egészséges
szövetekben
a
molekulák
mellett
az
extracelluláris mátrix szabályozza a sejteknek mind a homeotipiás, mind a heterotipiás affinitását, amelyek a malignus progresszióban megközelitoleg hasonló mechanizmus szerint, de kóros következménnyel muködnek. A tumorok heterogenitásának kialakulásában jelentos szerepe van a tumorsejtek és az ECM közötti kapcsolatnak. A malignus transzformáció után a sejtek és a környezetük közötti kapcsolat alapvetoen megváltozik a normális szöveti struktúrához képest. Az ECM molekulái szignált szolgáltathatnak a szöveti struktúra fenntartásához vagy átalakításához, stimulálhatják a sejtproliferációt vagy az apoptózist, és egyéb fontos folyamatokat befolyásolhatnak.141, 142
Marco és munkatársai a SAOS osteosarcoma sejtekben írták le az ECM jelentoségét
a sejtek biológiai viselkedésében. Tanulmányukban az α4 integrin receptorok segítségével létrejött adhézió egy apoptotikus utat indított el az osteosarcoma sejtekben a kaszpáz-3 indukcióján keresztül. 143 A kaszpáz-3 szerepét az osteosarcoma sejtek apoptózisában más tanulmányok is alátámasztották és összefüggésbe hozták a TP53 mutációjával. A TP53 mutációja, amit p53-R175H-nak neveztek el, csökkent doxorubicin indukált apoptotikus választ eredményezett a kaszpáz-3 szupresszióján keresztül. 144 Az ECM tumorbiológiai szerepének a felismerése olyan új daganatterápiai támadási pontok bevezetésére ösztönözhet a gyógyszerfejlesztési kutatásokban, amelyek nem a daganatsejteket célozzák meg, hanem az ECM-tumorsejt kölcsönhatásának a figyelembevételével, ennek az interakciónak a befolyásolását célozzák meg.67 Számos daganat kemoterápiás kezelése nem megoldott probléma, aminek a magyarázata csak részben lehetséges sejten belüli folyamatokkal. Ilyen sejten belüli folyamatok: a multidrog rezisztencia proteinek termelése, vagy a terápiás hatás kialakulásához szükséges proteinben bekövetkezett mutáció (pl. p53 esetén) például ilyen jelenség. A hatás elmaradásának azonban újabb ismeretek szerint számos olyan összetevoje lehet, amit nem lehetséges olyan sejten belüli eseményekkel magyarázni, amik a klasszikus szövettenyészeti módszerekkel modellezhezok.145 A klasszikus szövettenyészet ugyanis nem tudja, vagy csak korlátozottan tudja figyelembe venni a sejtek és a környezetük között kialakuló kapcsolatrendszereket.146 Az in vivo kísérleti rendszerekböl pedig a
89
Megbeszélés dinamizmus hiányzik, mert ezek ugyan élo rendszerben lezajló modelljei a vizsgálni kívánt folyamatnak, viszont egy-egy idopontról csak állóképeket (mRNS expresszió, immunhisztokémiai kép, stb.) tudnak mutatni. Vizsgálatainkban az extracelluláris mátrix hatását tanulmányoztuk a humán osteosarcoma
biológiai
viselkedésében
és
citosztatikumokkal
szembeni
válaszreakciójában, egy háromdimenziós extracelluláris modell és egy általunk kialakított humán osteosarcoma sejtvonal segítségével. Biológiai vizsgálataink klinikai hátterét egy 17 éves fiú hisztológiailag igazolt, és radiológiailag alátámasztott, kemoterápia rezisztens osteosarcomájának biopsziás anyagából kialakított sejtvonala képezte. A biopsziás anyagból kialakított HTB-2 és a definitív mütét során eltávolított daganatból kialakított HTB-9 xenograftok megorizték az osteosarcomára jellemzo szövettani szerkezetet osteoid termeléssel, valamint a csontspecifikus és csontfüggo fehérje expressziós készségüket. A HTB-2 xenograftból kialakított OSCORT sejtvonalon végzett citogenetikai vizsgálat igazolta a sejtek humán férfi eredetét. A számos, különbözo és nem azonosítható marker mellett az OSCORT-ban specifikus átrendezodést nem lehetett kimutatni. A megfigyelt sokféle kariotípusos abnormitás, a mono-és triszómiák gazdag variációja és a legkülönbözobb lokalizációkat érinto sokféle átrendezodés összhangban van az irodalomban, az osteosarcomákra leirt extrém kariotípusos komplexitással. 14 Az észlelt DM-ek feltehetoen génamplifikációra utalnak, ugyanakkor kromoszómális eredetük a nagyszámú egyéb eltérés miatt nem volt megállapitható. A 13. és 17. kromoszómák teljes hiányát a metafázisoknak mindössze 20%-ban, illetve 15%-ban lehetett megfigyelni. A 13. kromoszóma teljes, illetve a 13q14 sávot (az RB1 tumor szuppresszor gén lokalizációját), érinto részleges hiánya, avagy a 17. kromoszóma teljes, illetve a 17p13 sávot (a TP53 tumor szupresszor gén lokalizációját)17 érinto részleges hiánya megfelelhet a Knudson féle két tumor szupresszor gén találat hipotézisnek, és feltehetoen jelentosége van az osteosarcomák legalább felének a kialakulásában.14 Ugyanakkor, az OSCORT sejtek ugyan csökkent mértékben expresszálják mind az RB1, mind a TP53 génterméket, és ezzel egybehangzóan, a citogenetikai eredmények is arra utalnak, hogy mindkét involvált kromoszóma lokalizáció jelen van az OSCORT sejtek nagy többségében. Az Országos Sugárbiológiai
90
Megbeszélés Intézetben elvégzett p53 funkción alapuló 6.3 Gy-el történo besugárzást követo sejciklus-felhamozódás vizsgálata p53 funkciócsökkenésre utalt az OSCORT sejtek esetében. A vizsgálat a vad típusú p53-at tartalmazó MCF-7 sejtekkel való összehasonlításon alapult.147 Mindazonáltal egy késöbbi tanulmány148 értelmében a gamma sugárzásra adott válasz nem hozható direkt összefüggésbe a funkcionális p53 mennyiségével, illetve nem kizárólag a p53-tól függ. A gamma-sugárzásra az OSCORT sejtek MCF-7-tol eltéro válasza utalhat mutáns p53-ra ezt azonban további egyszálú konformációs polimorfizmus vizsgálatok nem erosítették meg. Az OSCORT sejtekkel történt kisérleteink alátámasztották a klinikai tapasztalatot, ugyanis a kemoterápia során kombinációs protokollban használatos citosztatikumok közül (nagy dózisú methotrexat, doxorubicin, cisplatin és ifosfamid) monoterápiában a szövettenyészetekben csak magas dózisokkal lehetett a tumorsejtek szaporodását gátolni. Azonban a jelenleg használatos daganatelleni gyógyszerek eltéro citosztatikus hatást mutatnak a szövettenyészetben, mint a kisérleti vagy a klinikai tumorokon, amely különbség hátterében többek között szerepet játszhat a sejtek intercelluláris kapcsolata, valamint a sejtek és az extracelluláris matrix közötti kapcsolat is.149,150,151 A tumor progresszió, invázió és metasztázis lépéseinek tanulmányozása, megértése valamint gyógyító igényu befolyásolása szempontjából alapveto fontosságú, hogy az eredeti problémát a leheto legjobban megközelíto modellrendszeren végezzük kisérleteinket. Ennek érdekében alakítottuk ki az eredeti kóros folyamatot a leheto legjobban megközelíto in vitro modellrendszert, az EHS sarcomából nyert extracelluláris mátrixgélt (EHS-ECM, ECM-gél), amely segítségével a leheto legpontosabban tudunk betekintést nyerni a szervezetben kialakuló osteosarcoma biológiai sajátosságaiba, valamint az osteosarcoma kemoterápiai hatóanyagokkal szembeni válaszreakciójaira. Jelen adataink bizonyítják, hogy a rekonstituált mátrix egyedülálló háromdimenziós modell az elobb említett folyamatok tanulmányozására. Az OSCORT sejtek esetében az extracelluláris mátrix stimulálta a sejtproliferációt. Minnél tovább tartott a sejt-ECM-gél kapcsolat annál kifejezetebb volt a proliferáció emelkedése. Az ECM-gél a sejtek életképességét nem befolyásolta szignifikáns mértékben. Az ECM-gél fehérjekoncentrációja 5 mg/ml volt, de már a szolúbilis ECMgél is az 50 µg/ml fehérjekoncentrációtól jelentos sejtproliferáció fokozódást eredményezett.
91
Megbeszélés Az ECM-gél 80%-át a laminin, 8%-át az entaktin, 7%-át a fibronektin, 3%-át a kollagén IV és 2%-át a heparánszulfát proteoglikán alkotja.152,153,154,155 Az ECM-gél biopolimerei közül a heparánszulfát proteoglikán (HSPG) és a fibronektin serkentette, a laminin és az entaktin nem befolyásolta, a kollagén IV pedig gátolta az OSCORT sejtproliferációt. A HSPG egy sejtfelszíni és egy extracelluláris molekula, amely központi „váz”-fehérjébol és hozzá kovalensen kapcsolódó glükózaminoglikán láncokból áll. A HSPG irodalmi adatok alapján részt vesz a sejtnövekedésben, az angiogenezisben és a differenciálódásban, mivel fontos szerepet tölt be a szabályozó szignál utakban (fibroblast növekedési faktor, TGFß út). A HSPG koreceptorként szerepel az FGF receptor aktiválódásában és az FGF-2 indukált ERK1/2 aktivációban. 156,157 A sejtproliferációt leginkább fokozó HSPG, proliferáció növelo hatását a váz fehérjéhez kapcsolódó glükózaminoglikánok is okozhatják a növekedési faktorok megkötésével és azok muködésének módosításával, mint például, a perlekán heparánszulfátjai a bFGF növekedési faktort megkötik, és stimulálják annak mitogén és angiogén hatását.158 A heparánszulfát proteoglikán egyedi sajátságot szolgáltathat a tumoros mátrixnak, ami a heparánszulfát láncoknak tulajdonítható. A daganatokban termelodo heparánszulfát láncok szerkezete és funkciója teljesen eltéro az ép szövetétol. Ezt a funkcionális különbséget topoizomeráz I gátlására és transzkripciós faktorok muködésének bizonyították.
befolyásolására 157
májdaganatokban
és
a
környezo
májszövetben
A heparánszulfát struktúra megváltozása olyan funkció kiesést vagy
változást okozhat, amely a daganat proliferációját és progresszióját elosegítheti, mint azt saját vizsgálatainkban is tapasztalhattuk. Ismert, hogy a letapadás függo növekedés az ECM fehérjék és az integrinek közötti kapcsolat szignál transzdukciós hatásán keresztül valósul meg. Az osteosarcoma ß1 integrin komplexeket termel (a2ß1, a3ß1, a4ß1, a5ß1) amelyekrol ismert, hogy kapcsolatba léphetnek az extracelluláris mátrix fibronektinjével, ez a jelenség magyarázhatja az OSCORT sejtek ECM-gélen tapasztalt nagyobb sejtproliferációját.159, 160,161
Kawaguchi és munkatársai részletesen vizsgálták a human osteosarcoma
szövetekre jellemzo sejtfelszíni receptorokat.162 Az általuk vizsgált esetekben igazolták a fibronektint köto integrinek jelenlétét: az a 4ß1–et 100%-ban, az a5ß1–et 75%-ban. Vizsgálatainkkal mi is igazoltuk a ß1 integrin expresszióját az OSCORT sejtvonalban, amely szignifikánsan megemelkedett az ECM-gélen tartott sejtekben, hozzájárulva az
92
Megbeszélés ECM-gélen tapasztalt nagyobb mértéku sejtproliferációhoz. Valószínuleg a ß1 integrin mediálja azt a több lépcsos komplex szignál-útvonalat, aminek a végeredménye a sejtek megnövekedett proliferációja, és az S-fázis markerek kifejezettebb expressziója (Ki-67, PCNA, ciklin D1). Az összes ECM-gél biopolimer fokozta a ß1 integrin termelését. A proliferációt legnagyobb mértékben fokozó HSPG növelte leginkább a ß1 integrin expresszióját. A fibronektin proliferációt fokozó hatása is összefüggést mutatott a ß1 integrin expressziójára kifejtett hatásával. Valószínusítheto, hogy az ECM biopolimerek proliferációt növelo hatása részben a ß1 integrin termelodésére kifejtett hatásukkal lehet kapcsolatban. Kawaguchi és munkatársai azt találták,162 hogy az osteosarcomák a laminin receptorokat csak kis mértékben expresszálják, valószínuleg a mi esetünkben is ez az oka, hogy jóllehet a laminin a ß1 integrin expresszióját fokozta, mégsem volt hatással az OSCORT sejtek proliferációjára. Yudoh és munkatársai magas és alacsony laminin expressziójú osteosarcoma sejteket hasonlítottak össze invazivitás és pulmonális metasztatikus potenciál szempontjából és azt találták, hogy a laminin receptort nagyobb mértékben expresszáló sejteknek nagyobb mértéku volt a migrációs-, kollagenolitikus aktivitása és az áttétképzo tulajdonsága.163 In vivo vizsgálatainkban nem tapasztaltuk az OSCORT sejtek áttétképzését, ami szintén a laminin receptor hiányát támaszthatja alá. Az ECM kapcsolat hatására bekövetkezett OSCORT proliferáció további megértése céljából a sejtéletciklus szabályozásának egyes tényezoit kivántuk közelebbrol tanulmányozni. Az elmúlt években jelentos ismeretanyag halmozódott fel a sejtéletciklusnak a G1/S- és a G2/M-fázishatárok közötti
ellenorzo rendszereirol,
amelyek nemcsak irányítják a sejt továbblépését, hanem biztosítják, hogy csak ép génállományú sejt replikálódjon és osztódjon. Eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy az ECM-gél legalább két ponton avatkozik be a sejtciklus folyamatába. Az egyik beavatkozási pont a G1-S átmenet, a másik a G2 -M átmenet. Az áramlási citometriás méréseink alapján, úgy látjuk, hogy az ECM-gél segíti a sejtek átjutását ezeken az ellenorzési pontokon, mivel az ECM-gélen tartott sejtek között csökkent a G1- és G2fázisban, növekedett az S-fázisban levo sejtek száma. Áramlási citometriás adatainkat a ciklin és ciklin függo kinázok, valamint a tumorszupresszor fehérje expressziós vizsgálataink is alátámasztják, amelyek
93
Megbeszélés egyértelmuen bizonyítják a ciklin D1 indukcióját az ECM-gél hatására. a Rb és p53 fehérje
expresszió
egyideju
csökkenésével,
ami
szintén
a
megnövekedett
sejtproliferációt eredményezheti. Az ECM-gél által csökkentett Rb és p53 expresszióval két olyan tényezo kiesése következett be, aminek kitüntetett szerepe van a sejtciklus gátlásában. Ismert, hogy a Rb fehérje és annak foszforiláltsági állapota kulcsfontosságú tényezoje a sejtek S-fázisba történo bejutásának, a mi esetünkben a fehérje expresszió olyan jelentos csökkenése következett be, ami egyértelmuvé tette a funkció csökkenését. A p53 sejt életciklusát szabályozó szerepére pedig az utal, hogy a p53 ellenanyaggal vagy antiszenz mRNS-el történo kezelés után a sejt nem képes az S-fázisba bejutni. A p53 szekvencia specifikusan kötodik a DNS-hez, egyfelol a p53 kötohelyet tartalmazó gének pozitív transzkripciós regulátoraként muködik, másfelol a TATA–kötofehérjékkel történo interakció eredményeképpen bizonyos gének átírását gátolni képes. 164,165 Genetikai tények határozottan arra utalnak, hogy a p53 gén homozigóta megváltozása fontos
esemény
az
osteosarcoma
kifejlodésében.166,167
A
nem
differenciált
osteosarcomák c-myc amplifikációt, TP53 és RB1 mutációt és autokrin növekedési faktortermelést mutatnak. Az, hogy az OSCORT-ban a p53 fehérje alacsony koncentrációban és csak rövid ideig jelenik meg a magban, illetve az, hogy PCR-SSCP technikával nem tudtuk kimutatni a p53 gén 3-9 exonjainak mutációit, a wt-p53 típust sejteti. A p53, foleg az ECM-gélen jellemzo alacsony expressziójának ezáltal jelentosége van, mert a vad típusú fehérje funkciója esik ki. Az ECM hatására bekövetkezo ciklin D1 indukció több kutatócsoport által már felismert jelenség, Lukashev és munkatársai szerint ez a p70S6K útvonalon következhet be.71 Az ECMgél, illetve annak legtöbb biopolimerének hatására elsosorban a p36(ciklin D1)p34(cdk4) komplex forma képzodése erosödött. Ez az, az aktív forma, ami a sejtek Sfázisba lépéséhez szükséges. Az aktív S-fázis ciklin komplex termelodésének legerosebb fokozódását pontosan a HSPG majd a fibronektin érte el, ami a sejtek proliferációjának legnagyobb mértéku növekedését is okozta, és az áramlási citometriás mérések alapján jelentosen növelte az S-fázisban lévo sejtek arányát. A sejtek Sfázisbeli eloszlása egyenletes volt, ami a proliferáció növekedését jelzi. A proliferációt gátló kollagén IV ugyan csökkentette a sejtek S-fázisba történo belépését irányító ciklin D1 komplex termelodését és növelte a G2/M-fázisra specifikus ciklin B1-cdc2 expressziót, azonban növelte a topoizomeráz II expresszióját és a G2-fázisban levo
94
Megbeszélés sejtek számát is. A ciklin D1 ellen termelt ellenanyag által felismert 70 kDa-os fehérje komplex ugyanakkor a ciklin D1–PCNA-val képzett komplexe is lehet.168 Az ECM-gélen tartott sejtekben kimutatható PCNA és Ki-67 expresszió, is a sejtek megnövekedett proliferációs aktivitására utal. A plasztikon tartott sejtek kevésbé termelték ezen fehérjéket, az ECM-gélen tartott sejtekben a PCNA 36-kDa-os formáján kívül a 48 kDa-os forma expressziója is kimutatható volt. A PCNA ilyen típusú asszociált formáit Takeuchi és munkatársai is kimutatták egyes autoimmun kötoszöveti megbetegedésekben.169 Valószínusítheto, hogy ezek fehérje-komplex formák. A PCNA számos más, a sejtciklust szabályozó fehérjével is asszociálódhat, például a ciklin D1-el, sot több fehérjébol álló quaterner komplexet is alkothat168: a ciklin D1-el, p21-el, és számos protein kinázzal (CDK 2, 4 és 5). A PCNA a repair funkciókban is jelentos szerepet játszik, mint a d-DNS polimeráz és a DNS ligáz I kofaktora.170,171 Az ECM biopolimerek közül legnagyobb mértékben a HSPG növelte a PCNA és Ki-67 expresszióját. A tény, hogy a HSPG növelte legnagyobb mértékben a PCNA expresszióját, valamint a ciklin D1 és a ß1 integrin termelodését, jól alátámasztja a HSPG kezeléssel elért legmagasabb OSCORT sejtproliferációt. Így megerosítheto az a következtetés, hogy a HSPG lehet az ECM olyan biopolimere, ami szembetunoen fokozza a sejtek növekedését. A fibronektin a HSPG-hez hasonlóan, de kisebb mértékben növelte a sejtproliferációt, a PCNA és Ki-67 expressziójának fokozódása is kevésbé következett be. Annak ellenére, hogy a kollagén IV a sejtek proliferációját gátolta, fokozta a Ki-67 termelodését. A kollagén IV hatására bekövetkezo G2-fázisú felhalmozódás magyarázatot adhat arra, hogy miért magas a kollagén IV-el kezelt sejtekben a Ki-67 expresszió, hiszen a kollagén IV kezelésre a sejtek 67.80%-a G2/Mfázisban van, amikor is a Ki-67 termelodése egyben a legmagasabb. 172 Nem zárható ki, hogy a kollagén IV hatására bekövetkezo molekuláris változások a malignus sejtek szabályozási zavaraira utaló jelenség. Az ECM-gél, valamint annak biopolimerei, a G2/M ellenorzési ponton való túljutást is elosegítik, részben a p53, részben pedig a ciklin B1-cdc2 expresszió csökkentésével. Utóbbi expressziója legjobban a HSPG és a fibronektin esetében csökkent. Az ECMgélen tartott sejtek között megfigyelt számos oszló alak is arra utal, hogy ezek a sejtek könnyebben jutnak át a G2/M ellenorzési ponton.
95
Megbeszélés Az ECM-gélen megnövekedett sejtproliferációt a nagyobb topoizomeráz II aktivitás és expresszió is alátámasztotta. Irodalmi adatok szerint a sejt proliferáció fokozódás topoizomeráz II szintézis és aktivitás emelkedéssel jár és a topoizomeráz II ,,a legjobb markerek egyike”, amelyek a sejt proliferációs státuszát tükrözik.173,174 A legmagasabb topoizomeráz II a HSPG és a kollagén IV esetében volt tapasztalható. A kollagén IV kísérleteinkben az OSCORT sejtek proliferáció gátlását eredményezte, ugyanakkor a topoizomeráz expressziót és aktivitást fokozta. Ez utóbbi azonban a kollagén IV hatására bekövetkezo G2/M-fázisban lévo sejt akkumulációval függhet össze. A topoizomeráz II foleg a G2-fázisban termelodik, és az enzimet a sejtek a mitózis metaés anafázisában használják. Más szerzok is tapasztaltak a topoizomeráz II indukcióját kollagén IV hatására és kimutatták, hogy ilyen esetben megnövekedett volt ugyan a DNS szintézis de kevés volt a mitózisban lévo sejtek aránya.175 A topoizomeráz I enzim aktivitása a plasztikon volt magasabb, az ECM-gélen tartott sejtek inkább a topoizomeráz II-t termelték. Bizonyos átfedés mutatkozhat a két enzim aktivitása között, az ECM-gélen a többi proliferációs tényezovel együttesen indukálódik a topoizomeráz II, a topoizomeráz I ettol eltéroen szabályozódhat. Az eredményeink alapján újabb bizonyítókat találtuk, hogy az extracelluláris mátrixnak kiemelkedo szerepe van a tumorsejtek, így az osteosarcoma sejtek fokozott proliferációjában. Ezt követoen az a kérdés vetodött fel, hogy vajon az extracelluláris mátrix részt vesz-e az osteosarcoma további progressziójában és befolyásolhatja-e az inváziót és a metasztatizáló képességet? Ismert, hogy az extracelluláris mátrix a daganatsejtek olyan mikrokörnyezete, amely jelentosen befolyásolja a sejtek biológiai viselkedését valamint a biokémiai szignál utakat.176,177,178 A daganatsejtek invázióját szintén a környezo extracelluláris mátrix proteolitikus remodellingje szabályozza az integrin receptorokon keresztul. 179,180 A malignus transzformáció során az ECM-integrin interakció a proliferáción kívül a sejt motilitását is meghatározza.181,182 Az integrin expresszióban és affinitásában az extracelluláris mátrix biopolimerekkel szemben bekövetkezo változások ellentétes sejtválaszt eredményezhetnek.183 Egyre nagyobb érdeklodés övezi az integrinek specificitását az extracelluláris mátrixhoz való affinitásban.179,181 Az integrineket tartalmazó,
kisebb
fokális
komplexek,
96
a
migráló
sejtek
lamellipódiumában
Megbeszélés helyezkednek el, azt sugallva, hogy a lamellopódium extracelluláris mátrixhoz való letapadásának fontos szerepe van a migráció és az invázió mechanizmusában. 184 A sejtek a migráció során erosen letapadnak az extracelluláris mátrixhoz. A stressz kötegekrol ismert, hogy azok a plazmamembránnál úgynevezett fokális adhéziókban végzodnek.184 A fokális adhéziókban az integrinek azok a kapcsolómolekulák, amelyek elsosorban részt vesznek a sejtek extracelluláris mátrixhoz való lehorgonyzásában. Mivel a stressz kötegek a migráció során folyamatosan lebomlanak és felépülnek feltételezheto, hogy a stressz kábelek turnovere igen intenzív integrin expressziót igényel. Vizsgálatainkban a plasztik felszínen tenyésztett sejtek felé ECM-gélt rétegezve, megfigyelhettük, hogy az osteosarcoma sejtek a plasztik felszínrol az ECMgélbe vándoroltak, miközben a ß1 integrin expresszió négyszeresre emelkedett. Irodalmi adatok alapján az integrin expresszió hosszú ideig fenntartott ERK1/ERK2 aktivitást igényel. 185 Laboratóriumi körülmények között több vizsgálatban nem sikerült az osteosarcoma áttétes modelljét kialakítani, annak ellenére hogy a klinikai kép alapján magas malignitású daganatról volt szó.186,187 A legtöbb tanulmányban a migrációt kétdimenziós kísérleti körülmények között vizsgálták. A sejtek azonban, akár az egyedfejlodésre, akár a metasztázisképzodésre gondolunk, térben mozdulnak el. A daganatsejtek háromdimenziós mozgását vizsgálva, két alapvetoen különbözo mozgásformát írtak le. A polarizált sejtmozgás minden sejtben a foszfatidilinozitol 3kináz aktiválódását, a PI 3-foszfát lokális felhalmazódását és a Rac aktiválódását igényli. Daganatsejtek esetében matrigélben, ez a mozgás a metalloproteinázok gátlásával gátolható volt. Bizonyos sejtek azonban a matrigélben nem polarizáltan mozogtak, henem amöba-szeruen. Ez a fajta mozgás a Rho aktivitását igényelte és a Rho kináz (ROCK) gátlásával volt felfüggesztheto. Megfigyeltek olyan sejteket is, amelyek váltogatni tudták az inváziós mechanizmusukat, és a metallopreoteinázok gátlásakor a ROCK-függo mozgással tovább mozognak.188 Irodalmi adatok alapján tehát a metalloproteinázoknak is jelentoséget tulajdonítanak a migrációban és az invázióban. Kísérleteinkben a plasztik felszínen tartott sejtek esetében nem tudtunk kimutatni metalloproteináz aktivitást, ellenben az ECM-gél hatására az MMP-9 preoteináz és annak aktív formája is kimutatható volt. Mindezek alapján megállapítható hogy, az extracelluláris mátrix elosegítette az osteosarcoma sejtek invázióját.
97
Megbeszélés Hogy megállapítsuk, melyik extracelluláris biopolimer segíti elo az inváziót kidolgoztam egy in vitro háromdimenziós agaróz-gél inváziós modellt. Elonye, hogy a sejtek proliferációját és migrációját egy idoben és egymással összefüggésben lehet tanulmányozni, valamint a sejteket további biokémiai és molekulárbiológiai vizsgálatokra lehet használni. Megfigyelheto volt, hogy a HSPG és a fibronektin a proliferációt fokozó hatásuk mellett, jelentos mértékben fokozták az OSCORT sejtek migrációját is. Ismert hogy összefüggés van a zselatinázok (MMP-2, MMP-9) expressziója és a metasztatikus képesség között és hogy többféle daganat az MMP-9 indukción keresztül fokozza a sejtek invazív tulajdonságát.189,190 Az OSCORT sejtek extracelluláris mátrix és biopolimerei jelenlétében termelték az MMP-9 metalloproteinázt és a 82 kDa-os formáját is. A legmagasabb aktivitást szintén a HSPG eredményezte és kevésbe a fibronektin. A laminin nem befolyásolta az OSCORT sejtek MMP-9 aktivitását. A HSPG szerepéért az invázióban valószínu, hogy a biopolimer glükózaminoglikán része tartható felelosnek.191 A HSPG az egyetlen extracelluláris mátrix biopolimer, amely tumor specifikus változásokon tud keresztülmenni a heparánszulfát szintézis nagy variábilitása révén.112,157,191,192,193 A HSPG elosegítheti a malignus fenotípust és az inváziót, de ugyanakkor gátolhatja is194 az oligoszaharid szekvenciától függoen. 191,195,196,197,198
regulátora.
A HSPG irodalmi adatok alapján a Wnt/ß-katenin szignál út egyik
198,199,200
Ez az út a sejtek migrációjában érintett. A Caenorhabditis unc-52
génjében bekövetkezett mutáció, amely egy heparánszulfát proteoglikánt, a perlekánt, kódolja, a sejtek migrációs defektusát eredményezi, amely részben a Wnt/ß-katenin szignál úttal hozható összefüggésbe.198 A Wnt/ß-katenin szignál út irodalmi adatok alapján, egy másik heparánszulfát proteoglikánnal, az agrin függo szignál kaszkáddal is keresztezodik.199 Kiemelendo, hogy a Wnt/ß-katenin szignál út által indukált transzkripciós faktorok egyik targetje az MMP-9, amelynek aktív szerepe van a szignál útban, mivel a sejtfelszíni E-kadherin emelkedését és a beta-katenin redisztribucióját okozza a plazma membránban. 201 Ezen kapcsolatok ismeretében nem meglepo, hogy az OSCORT sejtekben a HSPG nemcsak a sejtek migrációs és ezzel inváziós készségét növelte, hanem az MMP-9 aktivitását is. Egy másik potenciális targetje a Wnt/ß-katenin szignál útnak a fibronektin. A fibronektin promoter LEF/TCF-kötohelyeket tartalmaz, amelyek szintén a Wnt/ß-
98
Megbeszélés katenin szignál út targetjei. 200 A fibronektin szintén fokozta a migrációt és az MMP-9 aktivitást. A fibronektin MMP-9 expressziót indukáló jelátviteli útjának aktiválásában az elso lépés, valamely növekedési faktor kötodése a sejtfelszíni fibronektinhez, ami aktiválja a Ras onkogént. Az aktiválás a protein kináz kaszkádot indítja be, amelynek kulcsenzime a mitogén aktivált protein kináz (MAPK) család.190,202 A MAPK aktivitásának emelkedése fokozza a transzkripciót, majd a transzlációt, ezek következtében indukálódik és overexpresszálódik az MMP promoter régiója. A kaszkádfolyamat elindításának a pontos okát nem ismerik, de feltételezik, hogy a sejtekbol felszabadult növekedési faktorok, hormonok, citokinek kötodnek a sejtfelszíni fibronektinhez.190,202 A HSPG és a fibronektin esetében is tapasztalt szinkron MMP aktivitás indukció és ß1 integrin expresszió fokozódás szoros összefüggést sejtet a két fehérje között. A két fehérje összefüggésérol és jelentoségérol a daganat progresszióban a humán ovarium adenocarcinoma transzmigrációja során számoltak be az endothel extracelluláris mátrixon keresztül. 203 Vizsgálatunkban elsoként számolunk be a topoizomeráz váltásról extracelluláris mátrix jelenlétében. A topoizomeráz II aktivitás emelkedése egyideju topoizomeráz I csökkenéssel összefüggést mutatott a tumoros extracelluláris mátrix indukált invazív növekedéssel. A topoizomeráz II fokozódás a migráló sejtek esetében egy megnövekedett transzkripciót, DNS szintézist és javító funkciót jelent, mivel a topoizomeráz II a genom stabilitásában is részt vevo enzim. 204 Kísérleteink alapján az extracelluláris mátrix proteinek indukálják a topoizomeráz II-t a daganatsejtekben, amely szükséges az invazív viselkedés kialakulásához. A topoizomeráz II emelkedés leginkább a HSPG hatására volt tapasztalható. A HSPG által indukált topoizomeráz II összefüggést mutathat az integrin mediált outside-in folyamattal a Wnt/ß-katenin szignál útban,200 amely a fokális adhéziós kináz aktiválódásához vezet, azzal a lehetoséggel, hogy stimulálja az extracelluláris szignál-függo kináz kettot (ERK2) és hogy aktiválja a topoizomeráz II-t.205 A laminin csökkent hatása az osteosarcoma sejtek proliferációjában, migrációjában és topoizomeráz aktivitásában megerosíti a laminin specifikus a6ß1 integrin receptorok hiányát az OSCORT sejtekben.161,162
99
Megbeszélés Miután vizsgálataink az extracelluláris mátrix szerepét igazolták az osteosarcoma progressziójában, annak hatását vizsgáltuk az osteosarcoma sejtek citosztatikumokkal szembeni viselkedésében és válaszreakciójában. Annak ellenére, hogy az osteosarcomás betegek jelentos része igen jól reagál a kemoterápiára, kiemelkedoen fontos azoknak a tényezoknek a vizsgálata, amelyek a kemoterápia rezisztenciához vezetnek, mivel a betegek többsége fiatalkorú. Meglepo, hogy annak ellenére, hogy az extracelluláris mátrix szerepe a malignus daganatokban már több éve ismert, a pontos jelentoségét a daganatsejt megváltozott szabályozásában csak az utóbbi években tanulmányozzák71,159,176,177,206 és csak napjainkban vizsgálják jelentoségét a daganatellenes kezelésében.58,207 Az osteosarcoma kezelésében leggyakrabban használt citosztatikumokkal [cisplatin, methotrexat, mafosfamid (4-hidroxi-ciklofosfamid, a ciklofosfamid aktív metabolitja, amely in vitro aktív), doxorubicin] kezeltük az OSCORT sejteket. Megállapítottuk, hogy ECM-gél jelenlétében történo kezelés után az OSCORT sejteknek minden esetben szignifikánsan nagyobb esélyei voltak a túlélésre, mind a sejtproliferáció mind a viabilitás magasabb volt a plasztik felszínen tenyésztett sejtekhez képest. Laboratóriumi eredményeink összhangban voltak a fiatal betegünk esetében tapasztalt klinikai eredményekkel. Mivel a legkifejezetebb különbséget a doxorubicin esetében tapasztaltuk, további vizsgálataink középpontjául a doxorubicint választottuk. Eredményeink alapján az ECM–tumor interakciók kiemelkedo szerepet játszanak a kemoterápia rezisztenciában, ami más szerzok eredményeivel összhangban van.149,150, 151
A doxorubicinnel kezelt ECM-gélen tartott sejtek proliferációja és életképessége
szignifikánsan magasabb volt a monolayer-plasztik felszínen tartott sejtekhez viszonyítva. A daganatok gyógyszeres kezelését követoen kialakuló programozott sejthalálban elengedhetetlen a sejt aktív muködése, amely genetikailag determinált, ATP függo, sejtfelszíni változással és DNS fragmentációval járó összetett celluláris eseményt foglal magába. Az apoptózis indukciójának az eredményessége tehát nem csak az egyes hatóanyagoktól, hanem a sejtek károsodásokkal szembeni eltéro válaszreakcióitól is függ.208 Az ECM jelentosen befolyásolja az OSCORT sejtek citosztatikumokkal szembeni válaszreakcióját, az ECM-hez lehorgonyzott OSCORT sejtek apoptózis rátája a doxorubicin minden dózisa esetén alacsonyabb volt,
100
Megbeszélés köszönhetoen a sejt-ECM kölcsönhatásnak és/vagy az ECM indukálta intercelluláris kapcsolat által létrehozott szociális “apoptózis kontrollnak”. Az ECM-gélen szignifikánsan kisebb apoptózis a doxorubicinnel kezelt sejtekben részben a p53 csökkent expressziójával magyarázható. A hosszabb ECM-gélen lévo tartás kifejezettebb apoptózis-csökkenést eredményezett, amit megmagyaráz az, hogy elég volt az ido a p53 fehérjét is érinto fehérje expressziós változások kialakulásához. A citosztatikus kezélést követoen a Rb és a p53 proteinek, bár igen eltéro mechanizmus útján, fontos szerepet játszanak a sejtciklus szabályozásában, illetve megszakításában és a DNS károsítás kijavításában (repair), vagy ha az nem lehetséges az apoptózis indukcióban.164 A p53 fehérje alacsony koncentrációban és csak rövid ideig jelenik meg a magban, azonban a DNS szintézis megindulása elott, valamint a DNS-t károsító behatások esetén nagyobb mennyiségben van jelen. A p53 muködés szükséges a DNS károsodás utáni G1 blokkhoz, részben amiatt is, hogy maga is kötodik a fragmentált DNS-hez és valamilyen formában felismeri azt.209 Ez az a pont amikor eldol, hogy a sejt képes-e a károsodást helyreállítani vagy apoptózissal elpusztul. A G1fázisban történo ellenörzo funkció (check point) molekuláris mechanizmusában a p53 meghatározó szerepet játszik és ezáltal korlátozza a replikációt. Több tumor esetében megállapították, hogy a kemoterápiás kezelés és az ionizációs sugárzás hatékonyságát a tumorsejtek p53 expressziója jelentosen módósítani képes. Kétségtelen, hogy bizonyos esetekben a p53 muködésének felfüggesztésével az apoptózis indukciója nem következik be, azonban ez nem általánosítható jelenség mert az apoptózis p53 függosége sejttipusonként igen eltéro lehet.210 Az ECM-gél hatására bekövetkezo p53 expresszió csökkenés az OSCORT sejtekben korellált a sejtek megnövekedett túlélésével, valamint a csökkent apoptózissal a doxorubicinnel való kezelést követoen. A repopulációs kísérleteink alapján a megnövekedett túlélés és az apoptózis csökkenés olyan hosszútávú effektusok, amelyek még akkor is fenmaradnak az OSCORT sejtek életében ha már megszünt a sejt-ECM kapcsolat. Az osteosarcoma sejtekben ECM-gél indukált antiapoptotikus effektus egy jelentos részében a p53 indukált apoptotikus útak szupresszióján keresztul valósul meg. Kevés adat található a p53 és a gyógyszer rezisztencia összefüggésérol az osteosarcomára vonatkozóan. Hornicek és munkatársai, valamint Trieb és munkatársai összefüggést találtak a p53 expresszió és a gyógyszerérzékenység között.211,212
101
Megbeszélés Továbbá, más szerzok szerint a doxorubicin indukált apoptotikus válasz a p53 fehérjén keresztul valósul meg stimulálva a mitokondriális membrán protein gén expressziót (pl. BAX).213 Az OSCORT sejtekben a p53 expresszió fokozódása a doxorubicin kezelést követoen, együttjárt a p53 transzlokációjával a citoplazmából a sejtmagba. Mindkét folyamatot az ECM-gél gátolta, ezáltal gátolva két kritikus lépést a kemoterápia sikerességében. Vizsgálataink demonstrálják, hogy az extracelluláris mátrix olyan módon tud módosítani intracelluláris folyamatokat, hogy a TP53 intakt megléte ellenére, p53 funkció vesztés (loss of function) következzen be. Ez tisztán epigenetikai változás. A p53 expresszió változásai mellett az apoptózis mechanizmusában kialakuló változások is hozzájárulnak a csökkent citotoxikus hatáshoz.214 Az apoptózis indukciójának
eredményességébe,
sok
ponton
beleszólhat
az
extracelluláris
mátrix. 215,216,217 Az ECM-gél más szerzok megfigyelése szerint az NFkB perzisztens aktivitását okozza, ami az IkB lebomlásának köszönheto.218 Az NFkB antiapoptotikus tényezo. A fibronektin kapcsolata az osteosarcomákban is kimutatható integrinekkel (a5ß1, a3ß1) elosegíti az ún, sejtadhézió mediált gyógyszerrezisztenciát,213 ami egyes szerzok szerint egy a kaszpáz-3 aktiválódását gátló foszfotirozin kináz aktiválódásával van kapcsolatban.159 Kimutatták, hogy az a5 integrin, az ECM-gélen tenyésztett sejtek esetében, a MAPK kináz (MEK) 1-en keresztul csökkenti a p53 expressziót.219 Ezek a tények azzal a megfigyeléssel eggyütt, hogy az osteosarcomák 75%-a expresszálja az a5 integrint magyarázatot adhatnak a kísérleteinben kimutatott fibronektin által okozott édelemrol
a
kezelést
illetoen.
Vizsgálatainkban
a
fibronektin
koncentráció
növekedésével csökkent a doxorubicin citotoxikus hatása. Az ECM biopolimerek közül a fibronektin és a legnagyobb mértékben a HSPG volt felelos a doxorubicinnel szemben csökkent válaszreakcióért, azaz az ECM-gél által biztosított „védelemért”. Mintz és munkatársai a gén expressziós különbségeket vizsgálták a kemoterápia rezisztens (Huvos grade I és II) és a kemoterápiára reagáló osteosarcomák között.30 A kemoterápia rezisztens ostesarcomák eseteiben megnövekedett képességet mutattak ki az osteoclastogenezis, a tumor progressziós és az extracelluláris mátrix remodelling gének fokozott expressziójában. Az extracelluláris mátrix remodelling gének fokozott expresszióját mutatták ki. Az extracelluláris mátrix remodelling gének között a biglikán és a SPARC-like 1 gén kifejezödésének növekedését írták le. A proapoptotikus BAX
102
Megbeszélés gén csökkent expresszióját találták a Huvos grade I és II mintákban. Vizsgálatuk alátámassza megállapításunkat miszerint egy dinamikus ECM remodelling igen komolyan elosegíti a kemoterápia rezisztenciát. Ez a remodelling az osteoclastogenezis által eloidézett csont degradációt és az újonnani extracellularis biopolimerek szintézisét foglalja magába, amelyek között a proteoglikánoknak van kiemelkedo jelentosége. Mintz és munkatársai tanulmányában az apoptótikus rezisztenciát a Bax expresszió csökkentésével hozták összefüggésbe. Saját vizsgálataink a Bax expresszió csökkenést a p53 sejtmagi lokalizáció elmaradásával magyarázzuk, egy olyan folyamattal, amit maga a tumoros extracelluláris mátrix indukál. Kawaguchi és munkatársai eredménye,162 amely szerint az osteosarcomák a laminin receptorokat csak kis mértékben expresszálják, magyarázatot adhat arra is, hogy a laminin nem volt hatással az OSCORT sejtek doxorubicinnel szembeni válaszreakciójára, ahogy az entaktin sem. Az ECM-gélen a csökkent p53 expresszió a G1-fázisban való kissebb mértéku felhalmazodást vont maga után, a sejtek nemcsak az S-fázis végén de az elején is felhalmozódtak. A sejtek S-fázisban való felhalmozódása, mind a plasztikon, mind az ECM-gélen tartott sejtek esetén megfigyelheto, ami valószínuleg a megemelkedett p53 és Rb expresszió eredménye, de a poly-(ADP)-ribóz polimeráz (PARP) aktivitás fokozódással is kapcsolatban lehet. Ennek az enzimnek is fontos szerepe van a sejtciklus leállításában, és a sejtek adott ponton történt felhalmozódásban. A PARP DNS-polimeráz kapcsolata révén a javító funkciók kivitelezésében is részt vesz.220 Ennek a sejtciklus blokknak a plasztik felszínen tenyésztett sejtek esetén a sejtek apoptózisa lesz a feloldása, az ECM-gélen mivel az apoptózis elenyészo volt, ott valószínuleg a repair oldja fel. Mivel a gélben a doxorubicin kezelés nem volt megvalósítható, mert egyrészt meghatározhatatlan mértékben kötötte meg a gél a doxorubicint, másrészt nem lehetett a gélbol a szert a kezelést követoen eltávolítani, ezért a kezelés idotartama és az alkalmazott szer dózisa sem volt meghatározható. Ezeknek a nehézségeknek a kiküszöbölése céljából a kezeléseket egységesen 4 órán keresztül plasztik felszínen tenyésztett sejtekben végeztük, és csak ezt követoen rétegeztük a sejtekre az ECM-gél. Ez azt jelenti, hogy a kezdeti hatás mind az ECM-gélen mind a plasztik felszínen tenyésztett sejteknél egyforma volt és az ECM-gél hatására tapasztalt protekív hatás nem az esetleges target enzim mennyiségével/aktivitásával hozható összefüggésbe
103
Megbeszélés hanem a repair lehetoségét veti fel. Mint láthatjuk a 4 órás doxorubicin kezelés DNS fragmentációt okozott, ami a plasztikon tartott sejtek esetében a 72. órára tovább erosödött, az ECM-gélen tartott sejteknél pedig szignifikánsan csökkent. Ez arra utal, hogy az ECM-gél hatására javító funkció jelenik meg. A javító funkciót támasztja alá az a megfigyelés is, hogy az OSCORT sejtekben az ECM-gél hatására aktiválódó nukleáz aktivitást mutattunk ki. Ez a nukleáz DNS szubsztrát tekintetében nem mutatott kifejezett specifitást, mind a kinetoplaszt eredetu, mind a Hind III-mal emésztett ?-fág DNS-t (molekulatömeg standardet) hasította. A kinetoplaszt DNS esetén a bontó aktivitás nagyon erosnek mutatkozott, olyannyira, hogy eltunt a szubsztrát a gélbol. A kinetoplaszt DNS egymásba zárt gyurui valószínuleg jó szubsztrátjai a vizsgált nukleáznak, és az elhasított gyuruk további lebontások szubsztrátjait jelenthetik. A topoizomeráz II muködése következtében átmenetileg kovalensen zárt DNS-ek alakulhatnak ki a kDNS-bol, vagy olyan DNS átmeneti termékek, amelyekben szálhasítás van, vagyis 5’OH vagy 3’PO4 csoportok vannak. E két DNS szubsztrát típusra a DN-áz II-nek van kifejezetten nagy affinitása. 221 A topoizomeráz I is kialakít ilyen egyszálon hasított DNS-eket annak a reakcióját az OSCORT magi extraktumokban a DN-áz nem zavarta, ami a topoizomeráz I és topoizomeráz
II
reakciók
esetében
használt
pufferkülönbségbol
adódhat.
A
topoizomeráz II reakcióelegy Mg++-ot és ATP-t tartalmaz. Valószínuleg a DN-áz szempontjából a Mg++ lehet a fontosabb. A talált nukleáz aktivitás sok tekintetben hasonlít Famulski és munkatársai által jellemzett savas nukleázra.222 A mi esetünkben is az enzim a Tris pufferrendszerekben muködik, 7-es pH-n, a mi általunk talált DNS bontó aktivitás is a sejtmagban volt kimutatható. A fehérje méretét a DNS szubsztrát gél elektroforézissel határoztuk meg, 55kDa körülinek mutatkozott, ami méretében nagyon hasonló a fent említett tanulmányban leközölt fehérjéhez. Az általunk jellemzett nukleáz aktivitás is horezisztenciát mutatott. Ezek eredmények alapján feltételezheto, hogy a DN-áz II családba tartozó, fehérjérol van szó, aminek szerepe lehet a repair folyamatokban és az apoptózisban. Az bizonyos, hogy a caspase 3 által aktivált apoptózis DN-áz (CAD) nem azonos az általunk talált fehérjével. 223,224,225 Annak az aktiválódásához ugyanis egy chaperonnak kell elhasadnia, ezért annak az aktivitását csak a DNS szubsztrát gélelktroforézissel látnánk a magi extraktumokban használt reakciókban nem volna kimutatható. Ezt alátámasztja az is, hogy az ECM-gélen tartott
104
Megbeszélés sejtekben kevés apoptózist láttunk. Mindez arra utal, hogy a nukleáznak nem az apoptotikus folyamatokban van jelentosége, hanem a gélen aktiválódó nukleáz valószínuleg a megnövekedo túléléssel függhet össze, esetleg az enzim repair funkciói révén. A sejt védekezo képessége a DNS-t károsító citosztatikum hatásával szemben a sejtciklus G2-fázisában is érvényesül. A sejtek bejutását a mitózisba a p34cdc-2/ciklin B komplex (MPF: mitosis promoting faktor) szabályozza az eukaryota sejtekben. 226 Az ECM mint láthattuk egy kevésbé károsodott DNS-t eredményez, ezáltal nem következik be a p34cdc-2 tirozinjának fokozott foszforilációja, az MPF nem marad inaktív állapotban és a sejtek proliferációja megno a plasztik felszínen tartott sejtekhez képest. Miután az extracelluláris mátrix hatását tanulmányoztuk az OSCORT sejtek doxorubicinnel való kezelést követo proliferációjára, viabilitására, apoptózisára, valamint az OSCORT sejtek válaszreakciójára, a malignus fenotípushoz hozzátartozó invazió témára öszpontosítottuk kísérleteinket. Eredményeink alapján a topoizomeráz II jelentos szerepet játszik az OSCORT sejtek inváziójában. Mivel a doxorubicin egyik célpontja a topoizomeráz II ezért célszerunek láttuk megvizsgálni a kezelés hatását a topoizomeráz kifejezodésre és a sejtek migrációjára. A doxorubicin kezelést követoen a nem-migráló sejtek és a migráló sejtek esetében is csökkent a topoizomeráz II aktivitás és expresszió. Ezek után felvetodött, hogy a topoizomeráz II csökkenéssel egyidoben a sejtek migrációs képessége is csökken-e. Az in vitro háromdimenziós ECM-gél inváziós modell segítségével a doxorubicin igen érdekes hatását tapasztaltuk. A nagy dózisú doxorubicin kezelés szignifikánsan fokozta a citotoxicitást. Ellenben a kis dózisú doxorubicin kezelés antimigrációs effektust mutatott. Kísérleteink során ugyan nem tapasztaltuk, hogy a mozgó daganatsejteknek ki kell lépnie a sejtciklusból, azaz a proliferáció és az aktív mozgás egymást kizáró jelenségek, hiszen az ECM-gél a proliferációt és az inváziót is fokozta, azonban a doxorubicinnel való kezelés során láthattuk, hogy a sejtek osztódásának megállítása nem jár együtt a mozgás (invázió) folyamatának leállításával. 227 Eredményeink új távlatot adhatnak az osteosarcoma doxorubicin kezelését illetoen, miszerint a doxorubicin eltéro antiproliferatív és antimigrációs hatása az osteosarcoma sejtekre eltéro adagolást tehetnek szükségessé: rövidtávú, nagy dózisú doxorubicin kezelést, amely a tumor növekedést célozza és egy hosszútávú, kis dózisú kezelést, amely a tumor inváziót célozza meg.
105
Megbeszélés Az ECM-gélben lévo sejtek esetében bekövetkezett jelentos topoizomeráz II csökkenés természetesen lehetne a doxorubicin gátló hatásának a következménye, esetleg amiatt, hogy a doxorubicin komplexszel kötve izoláljuk a topoizomeráz II aktivitást a kezelt sejtek magjából, ennek azonban egyéb következményeinek is kellene mutatkoznia az ECM-gélen lévo sejtek apoptózisát és proliferációját illetoen. Az ECM-gélen tartott sejtek ezzel szemben nagyobb proliferációt és túlélést mutattak, ami sokkal inkább azt támasztja alá, hogy a topoizomeráz II aktivitás csökkenése védekezo mechanizmus jele. Megvizsgáltuk a topoizomeráz I aktivitást is, ami a topoizomeráz II csökkent muködését képes kompenzálni. 228 A doxorubicin kezelést követoen mind a nemmigráló, mind a migráló sejtek esetében emelkedett az aktivitás, a migráló sejtek esetében a növekedés szignifikáns volt. Eredményeink alapján látható hogy a kezelést követo topoizomeráz II aktivitás csökkenését a topoizomeráz I növekvo aktivitása kompenzálhatja. Az ECM-gélbe migrált sejtek nagyobb topoizomeráz I aktivitása az extracelluláris mátrix védohatásának egyik magyarázata lehet, ami az ECM-gélen tapasztalt doxorubicin kezelést követo nagyobb proliferációhoz járul hozzá. A topoizomeráz I enzim aktivitás növekedése azt is bizonyítja, hogy a topoizomeráz II aktivitás csökkenés nem a sejtek esetleges pusztulásának a következménye, mert akkor a topoizomeráz I aktivitásának is csökkennie kellett volna. A kezelést követo topoizomeráz váltás ezzel egyidoben a topoizomeráz II gátlókkal való kezelést követoen, a topoizomeráz I gátlóknak az alkalmazását veti fel az osteosarcoma terápiában. A tumorok nem csupán daganatsejtekbol épülnek fel. Szövetté szervezodésük alapveto feltétele a daganatos stróma kialakítása. A daganatos extracelluláris mátrix sajátos struktúrával rendelkezik, léte a daganat által meghatározott, növekedési elonyt képes nyújtani a tumor számára, a tumor és gazdaszervezet által ellenorzötten plasztikusan változik. Mai tudásunk szerint a daganatok strómája eltér a kiindulási szövetben megfigyelttol. Ezek a különbségek részben mennyiségiek, részben minoségiek, a különbségek között jellegzetesek a proteoglikánok változásai, cukoroldaláncaik
rendkívül
nagy
variabilitása
révén.
Mintz
és
munkatársai
vizsgálatukban számolnak be az osteosarcoma tumoros extracelluláris remodellingrol. 30 A tumorsejtek különbözo szignál utakon aktiválják a csontlebontásért felelos
106
Megbeszélés osteoclastokat, és egyidoben újonnani extracelluláris biopolimerek szintézisét indukálják. A tumoros mátrix az osteosarcoma növekedését segíti a továbbiakban. A tumoros extracelluláris mátrixban a proteoglikánoknak van kiemelkedo jelentosége. Eloször a mi kísérleteinkben került sor az osteosarcoma sejtek (OSCORT) által termelt saját tumoros extracelluláris mátrix izolálására (OSCORT-ECM) és vizsgálatára. Elemeztük a hatását az OSCORT sejtek biológiai viselkedésében és doxorubicinnel szembeni válaszreakcióban. Továbbá összehasonlítottuk az EHS-ECM (ECM-gél) által kiváltott hatásokkal. Vizsgálataink egy dinamikus extracelluláris mátrix remodellinget feltételeznek az osteosarcomában, ugyanis az OSCORT-ECM igen hasonló hatásokat váltott ki, mind az osteosarcoma sejtek malignus fenotípusában, mind a doxorubicin rezisztencia kialakításában. Az OSCORT-ECM fokozta a sejtek proliferációját, növelte az S-fázisban levo sejtek arányát és az ECM-gélhez hasonló mértékben fokozta a sejtciklus asszociált fehérjék expresszióját. A topoizomeráz II aktivitást és expressziót növelte a topoizomeráz I párhuzamos csökkentéssel, és fokozta az MMP-9 aktivitást és a ß1 integrin expressziót. Az ECM-gélhez hasonlóan az OSCORT-ECM is kivédte a doxorubicin citotoxikus hatását. Eredményeink alátámasztják egyben az ECM-gél létjogosultságát in vitro modellként a daganatkutatásban és a daganatellenes gyógyszerfejlesztésben. Miután az EHS-ECM és az OSCORT-ECM hasonló hatását tapasztaltuk az OSCORT sejtek viselkedésében és doxorubicinnel szembeni válaszreakciójában, és mivel
a
HSPG
kiemelkedo
jelentoségét
tapasztaltuk
kísérleteink
során,
a
következokben a közös HSPG-t azonosítottuk a két extracelluláris mátrixban. Az EHSECM-ben a perlekán jelenléte ismert volt.198,229 Vizsgálatunkban mi is kimutattuk a perlekánt az EHS-ECM-ben azonban az OSCORT-ECM-ben a perlekán hiányát igazoltuk. Ellenben az agrin heparánszulfát proteoglikán jelenlétét mutattuk ki mint közös HSPG az EHS-ECM és az OSCORT-ECM-ben is. Az agrin szerepe a daganatokban
csak
napjainkban
körvonalazódik 199
és
jelenlétérol,
valamint
jelentoségérol az osteosarcoma sejtek által termelt tumoros extracelluláris mátrixban vizsgálatainkban elsoként számolunk be.
107
Megbeszélés A proteoglikánok kiemelt szerepe az osteosarcoma malignus fenotípusának a fenntartásában arra ösztönzött minket, hogy a proteoglikánokat mint lehetséges célpontként vizsgáljuk az osteosarcoma kemoterápia hatékonyságának a növelésében. A klinikai anyagból kialakított HTB-2 és HTB-9 xenograftokból megfigyelheto volt, hogy a neadjuváns kemoterápia hatására a tumorban fokozódott a proteoglikán mennyiség. Kisérleteink alátámasztva a megfigyelést, arra szolgáltattak adatokat, hogy a citosztatikus kezelés következtében az osteosarcoma tumorsejtek körüli extracelluláris mátrix is megváltozhat. Vizsgálataink kimutatták, hogy a doxorubicin kezelés után a sejten belüli, illetve sejtfelszíni proteoglikánok képzodése fokozódott, ami felveti, hogy a citosztatikus kezelésre a tumorszövet komplex módon a sejtek és az extracelluláris mátrix közötti kölcsönhatások révén reagál, és hogy a fokozott proteoglikán képzodés a daganatsejtek egyik jelentos védekezési mechanizmusa. A doxorubicinhez képest a clodronatnak sokkal kisebb sejtszaporodást csökkento hatása volt. A doxorubicin növelte a proteoglikán szintézist, és annak sejten kívüli lokalizációját, a clodronat ugyanakkor foleg az extracelluláris frakcióban csökkentette a glükózamin beépülést. Az extracelluláris mátrix biopolimerekkel végzett vizsgálatok tanúsága szerint az osteosarcoma által termelt extracelluláris proteoglikánoknak kiemelt jelentosége van a doxorubicin kezelésre adott rezisztencia kialakulásában. Az a tény, hogy doxorubicin hatására a proteoglikán termelés fokozódik, és az extracelluláris frakcióban a glükózamin beépülés még no is, mindenképpen arra utal, hogy a doxorubicin maga járulhat hozzá az ellene az osteosarcoma sejtekben kialakult rezisztenciához. Ebbol a szempontból kiemelt jelentoségu, hogy a clodronat csökkentette a proteoglikánba beépült glükózamin mennyiségét, és ez a csökkenés foleg extracellulárisan volt jelentos. Kísérleteink során a clodronattal történo utókezelés hatásos volt a doxorubicinre kialakult rezisztencia ellen. A doxorubicin-indukált glükózamin radioaktivitás-növekedés irodalmi adatok szerint a proteoglikán újrafelvétel (reszorpció), és lebontás csökkenésének köszönheto, a lebontó enzimek mennyiségének csökkenése következtében. 230 Több szerzo is közölt adatokat a bisphosphonatok glükózaminoglikán és proteoglikán szintézis gátlásáról. 231,232 Foleg a kondroitinszulfát láncok szintézisének a gátlását írták le, illetve a bisphosphonat kezelt proteoglikánok agregációs zavarát mutatták ki, amit a hialuronát-köto régió abnormalitásának tulajdonítottak. Másrészt a bisphosphonatok ismert gátlói az osteoclastoknak, amely
108
Megbeszélés sejtek a csontdaganatok növekedés és metasztázis elosegítésében aktívan vesznek részt. 30,233
Mintz és munkatársai a bisphosphonatok alkalmazását javasolják a kemoterápia
rezisztens osteosarcomás betegek indukciós kezelésében.30 Eredményeink alapján a bisphosphonatoknak kiemelkedo szerepe lehet az osteosarcoma kezelésében, mert az osteoclastok gátlásával egyrészt csökkenti a lokális recidíva, távoli csontáttétek kialakulását, másrészt gátolja a tumoros extracelluláris mátrix remodellinget, amely az osteosarcoma progresszióját segíti elo. Ezenkívül a proteoglikán szintézisre gyakorolt gátlásával növeli az osteosarcoma kezelésében használt citosztatikumok hatékonyságát.
Összefoglalásként elmondhatjuk, hogy az osteosarcoma és a tumoros ECM kapcsolatának az elemzése, elméleti és gyakorlati útmutatókat szolgáltathat az osteosarcomás betegek prognózisában és kezelésében. Eredményeink a tumoros ECM meghatározó
szerepét
igazolták
az
osteosarcoma
malignus
fenotípusának
a
fenntartásában, jelenlétében a sejtek proliferációs és inváziós képessége fokozódott. A tumoros ECM számos ponton befolyásolja az osteosarcoma biológiai viselkedését. Továbbá kimutattuk a tumoros ECM szerepét az osteosarcoma kezelésében alkalmazott citosztatikumokkal szembeni csökkent válaszreakcióban is. Az általunk alkalmazott EHS tumorból eloállított ECM-gél használhatóságát az ECM vizsgálatára az bizonyítja, hogy az osteosarcoma sejtek által termelt saját tumoros mátrixszal hasonló hatásokat tapasztaltunk. Az osteosarcoma sejtek olyan mértéku változásokat élnek át a tumoros mátrix jelenlétében, amelyek nem elhanyagolhatóak, és amelyek a klasszikus szövetkultúrás vizsgálatokkal örökre rejtve maradtak volna elottünk. A topoizomeráz váltás a kezelést követoen, a topoizomeráz I inhibitorok alkalmazását is felveti az osteosarcoma hatékony kemoterápiás kezelésében. Eredményeink új távlatot adhatnak az osteosarcoma doxorubicin kezelését illetoen, miszerint a doxorubicin eltéro antiproliferatív és antimigrációs hatása az osteosarcoma sejtekre eltéro adagolást tehetnek szükségessé: nagy dózisú, rövidtávú doxorubicin kezelést, amely a tumor növekedést és egy kis dózisú, hosszútávú kezelést, amely a tumor inváziót célozza meg. Az ECM hatást elsosorban az ECM heparánszulfát proteoglikán biopolimerének és kisebb mértékben a fibronektinnek tulajdoníthatjuk. A heparánszulfát proteoglikán olyan specialitást adhat a tumoros mátrixnak, ami csak arra jellemzo. Vizsgálatainkkal
109
Megbeszélés az agrin heparánszulfát proteoglikán jelenlétét igazoltuk a tumoros extracelluláris mátrixban. Az új, kifejezetten a daganatos mátrixra jellemzo heparánszulfát proteoglikán az osteosarcoma kezelésének új célpontját jelentheti. A bisphosphonátok, a proteoglikán szintézist csökkento hatásuk révén, elosegithetik az osteosarcoma kezelésében jelenleg alkalmazott citosztatikumok hatékonyabb alkalmazását.
Remélhetoleg,
vizsgálataim
segítséget
nyújthatnak,
a
jelenleg
alkalmazott
citosztatikumokkal szembeni rezisztens osteosarcoma hatékonyabb kezelésében.
110
Következtetések, Új megállapítások és Klinikai gyakorlati alkalmazásuk
7 KÖVETKEZTETÉSEK, ÚJ MEGÁLLAPÍTÁSOK és KLINIKAI GYAKORLATI ALKALMAZÁSUK 1. Az általunk kidolgozott in vitro háromdimenziós gél inváziós modell alkalmazásával a sejtek proliferációját és migrációját egy idoben és egymással összefüggésben lehet tanulmányozni, valamint a sejteket további biokémiai és molekulárbiológiai vizsgálatokra lehet használni. 2. Az ECM az OSCORT sejtek invazív növekedését (proliferáció, migráció) serkento hatása kapcolatba hozható a ß1 integrin-, a ciklin D1-, a Ki-67, PCNA expresszió és az MMP-9 aktivitás fokozódásával, valamint a Rb, p53 tumor szuppresszor fehérjék és ciklin B1-cdc2 expresszió csökkenésével. 3. Az OSCORT sejtek invazív növekedését a HSPG és a fibronektin serkenti, a laminin és az entaktin nem folyásolja be, a kollagén IV pedig gátolja. 4. Az ECM jelenlétében a topoizomeráz I csökken, míg a topoizomeráz II emelkedik (topoizomeráz váltás). 5. Az ECM csökkenti a doxorubicin citotoxikus hatását. 6. A doxorubicin alacsony koncentrációban, szelektíven a sejtmigrációt és nem a sejtproliferációt gátolja. 7. Az ECM biopolimerek közül legnagyobb mértékben a heparánszulfát proteoglikán (agrin) serkenti az OSCORT sejtek invazív növekedését és csökkenti a doxorubicinnel szemben válaszreakciót. 8. A doxorubicin kezelést követoen fokozódik a sejten belüli, illetve sejtfelszíni proteoglikánok képzodése. A clodronat gátolja a proteoglikánok szintézisét és elosegíti a doxorubicin tumor gátló hatását.
111
Következtetések, Új megállapítások és Klinikai gyakorlati alkalmazásuk
Vizsgálati
eredményeink
klinikai
gyakorlatban
hasznosítható
következtetései 1. A
kórlefolyás
elorejelzésére
számbaveheto
az
osteosarcoma
stróma
állományának immunhisztokémiai vizsgálata. 2. A topoizomeráz váltás alapján az osteosarcoma kemoterápiás kezelésében, javasolható a topoizomeráz II inhibitorok alkalmazását követoen, második lépésben, a topoizomeráz I inhibitorok használata is. 3. A doxorubicin eltéro antiproliferatív és antimigrációs hatása eltéro adagolást tehetnek szükségessé: nagy dózisú, rövidtávú doxorubicin kezelést, amely a tumor növekedést célozza és kis dózisú, hosszútávú kezelést, amely a tumor inváziót célozza meg. 4. Az osteosarcoma progressziójának megelozésére HSPG-t és fibronektin szintézisét gátló gyógyszerek alkalmazása, illetve fejlesztése javasolható.
112
Röviditések Jegyzéke
8 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ABC
avidin-biotin komplex
ATP
adenozin-trifoszfát
BM
bazális membrán
BSA
marha szérumalbumin
CPC
cetil-piridinium-klorid
DAB
3,3’-diaminobenzidin tetrahidroklorid
DM
double minute
DOX
doxorubicin
DTT
ditiotreitol
ECM
extracelulláris mátrix
ECM-gél
extracelluláris mátrix gél
EDTA
ethylene-diamine-tetraacetic acid
EHS
Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma
EHS-ECM
extracelluláris matrix izolált Engelbreth-Holm-Swarm sarcomából
FACS
fluoreszcenciával segített sejtszeparálás
FCS
foetal calf serum
FITC
fluoreszcein izotiocianát
FN
fibronektin
GAG
glükózaminoglikán
HE
hematoxilin-eozin
HS
heparánszulfát
HSPG
heparánszulfát proteoglikán
IC50
50% inhibiting concentration
IgG
immunglobulin G
K IV
kollagén IV
LDH
laktátdehidrogenáz
LN
laminin
MMP
matrix metalloproteináz
MTT
metil-tetrazólium
113
Röviditések Jegyzéke NAD
nikotin-adenin-dinukleozid
NEM
N-etil-maleimid
NFkB
sejtmagi faktor kappa-beta
OD
optikai denzitás
OSCORT-ECM
OSCORT sejtek által termelt extracelluláris matrix
PBS
phosphate-buffered-saline
PCNA
proliferációs sejtmagi antigen, (DNS-polimeráz kofaktor)
PMSF
fenil metil szulfonil fluorid
PEG
polietilénglikol
PG
proteoglikán
PKC
protein kináz C
PTK
protein tirozin kináz
SD
standard deviation
SDS-PAGE
szodium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gél elektroforézis
TBE
Tris borát EDTA
TBS
Tris-buffered-saline
Topo
topoizomeráz
Tris
tris(hidroximetil)aminometán és tris(hidroximetil)metilamin
114
Köszönetnyilvánítás
9 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Szeretném megköszöni témavezetomnek Dr. Jeney András professzornak, aki mindig nagy türelemmel bíztatott a tudományos munkában való elmélyülésre és aki éveken át figyelemmel irányítja kísérletes munkámat. Köszönettel tartozom Dr. Kopper László tanszékvezeto egyetemi tanárnak, aki lehetové tette, hogy munkámat az I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben végezhessem és mindig támogatott a munkámban. Köszönetet szeretnék mondani Professzoromnak, Dr. Szendroi Miklós tanszékvezeto egyetemi tanárnak, aki mellett tudományos diákkörösként kezdtem foglalkozni a csontdaganatokkal és aki arra ösztönzött, hogy a Ph.D. keretében kutatási munkámat az osteosarcomával folytassam és mindig értékes tanácsokkal látott el. Köszönetet mondok Dr. Szende Béla, Dr. Tímár József és Dr. Kovalszky Ilona egyetemi tanároknak, a sok segítségért, amit a Ph.D. munkám elvégzéséhez kaptam. Külön köszönöm Dr. Dudás Józsefnek, munkatársamnak és jó barátomnak, aki mindig segítségemre volt. Köszönöm Dr. Tímár Ferencnek, Felletár Györgynének, Oláh Lászlónénak, Dr. Bocsi Józsefnek, Dr. Pogány Gábornak, Dr. Németh Attilának, Csorba Gézánénak, Egedi Krisztinának, Dr. Hauser Péternek és Dr. Lásztity Jovánkának a munkámhoz nyújtott segítségért. Továbbá köszönettel tartozom az I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet minden tagjának, akik munkám elvégzéséhez segíto, baráti légkört teremtettek. Köszönettel tartozom Dr. Major Jeno igazgató úrnak a citogenetikai vizsgálatokban és Dr. Battmann A. (Institute of Pathology, Klinikum of Justus-Liebig-University, Giessen, Germany) az immunhisztokémiai vizsgálatokban nyújtott pótolhatatlan segítségért. Köszönöm Füzesi Jánosnak, aki sok értékes tanáccsal látott el a munkám stilisztikáját illetoen. Külön köszönettel tartozom Dr. Weltner János foorvos úrnak bölcs tanácsaiért, mellette tudományos diákkörösként kezdtem ismerkedni a klinikai kutatással és segített a számítogép rejtelmeinek elsajátításában. Köszönöm Dr. Flautner Lajos és Dr. Kupcsulik Péter tanszékvezeto egyetemi tanároknak, akik mindig támogattak a tudományos munkámban.
115
Köszönetnyilvánítás Köszönetet mondok tanáraimnak és kollegáimnak a Semmelweis Egyetem Ortopédia Klinikából, I. sz. Sebészeti Klinikából és II. sz. Pathológiai Intézetbol a sok segítségért, amit a tudományos munkám elvégzéséhez kaptam. Köszönöm Dr. Bodoky György professzornak, aki mellett a klinikai onkológia alapjait sajátíthattam el. Szeretettel gondolok Dr. Staub Mária professzor asszonyra, aki mellett elsoéves orvotanhallgatóként kezdtem foglalkozni a molekuláris biológiai alapkutatással. Köszönöm a Goodwill Research Kft.-nek és a Novartis Hungária Kft.-nek, hogy támogatták tudományos munkámat. Köszönetet mondok a Magyar Oktatási Minisztériumnak, aki „Állami Ösztöndíjat” bocsátott rendelkezésemre.
Végül, de nem utolsósorban hálás vagyok szüleimnek és nagyszüleimnek, akik lehetové tették számomra azt, hogy eljuthassak idáig, mindig mindenben mellettem álltak és biztosították a hátteret a terveim megvalósításában.
116
Irodalomjegyzék
10 IRODALOMJEGYZÉK
1. Szendroi Miklós. A csontdaganatok kezelésének újabb lehetoségei. Doktori értekezés. Semmelweis Egyetem. Budapest,1992. 2. Dorfman H, Czerniak B. Bone cancers. Cancer 75: 203-210, 1995. 3. Miller R, Yound J, Novakovic B. Childhood cancer. Cancer 75: 395-405, 1995. 4. Huvos A. Bone Tumors: Diagnosis, Treatment and Prognosis. Philadelphia: WB Saunders, 1991. 5. Unni K. Dahlin’s Bone Tumors-General Aspects and Data on 11087 Cases. Philadelphia, New York: Lippincott-Raven, 1996. 6. Gilman P, Wang N, Fan S, Reede J, Khan A, Leventhal B. Familial osteosarcoma associated with 13;14 chromosomal rearrangement. Cancer Genet Cytogenet 17: 123-132, 1985. 7. Benedict W, Fung Y, Murphree A. The gene responsible for the development of retinoblastoma and osteosarcoma. Cancer 62: 1691-1694, 1988. 8. Reissmann P, Simon M, Lee W, Slamon D. Studies of the retinoblastoma gene in human sarcomas. Oncogene 4: 839-843, 1989. 9. Wadayama B, Toguchida J, Shimizu T, Ishizaki K, Sasaki M, Kotoura Y, Tamamuro T. Mutation spectrum of the retinoblastoma gene in osteosarcomas. Cancer Res 54: 3042-3048, 1994. 10. Toguchida J, Ishizaki K, Nakamura Y, Sasaki M, Ikenaga M, Kato M, Sugimoto M, Kotoura Y, Yamamuro T. Assignment of common allele loss in osteosarcoma to the subregion 17p13. Cancer Res 49: 6247-6251, 1989. 11. Masuda H, Miller C, Koeffler H, Batifora H, Cline M. Rearrangement of the p53 gene in human osteogenic sarcomas. Proc Natl Acad Sci USA 84: 716-719, 1987. 12. Dome S, Schwartz L. Osteosarcoma. In diagnostic and therapeutic advances in pediatric oncology. Ed: DO Walterhouse and SL Cohn. Kluwer Academic Publishers, Boston, 1997. 13. Ladanyi M, Cha C, Lewis R, Jhanwar S, Huvos A, Healey J. MDM2 gene amplification in metastatic osteosarcoma. Cancer Res 52: 16-18, 1983. 14. Heim, S., Mitelman F. Tumors of bone and soft tissue. (Chapter 21) In: Cancer cytogenetics. Chromosomal and molecular genetic aberrations of tumor cells. Second edition. Wiley-Liss Inc., New york, 1995. 15. Stanbridge EJ. Functional evidence for human tumor suppressor genes: Chromosome and moleculargenetic studies. Cancer Surv 12: 5-24, 1992. 16. Mertens F, Mandahl N, Örndahl C, Baldetorp B, Bauer HCF, Rydholm A, Wiebe T, Willén H, Akerman M, Heim S, Mitelman F. Cytogenetic findings in 33 osteosarcomas. Int J Cancer 55: 44-50, 1993.
117
Irodalomjegyzék
17. Malkin D, Li P, Strong C, Fraumerni F, Nelson CE, Kim H, Kassel J, Gryka A, Bischoff Z, Tainsky A, Friend H. Germ line p53 mutation is a familial syndrome of breast cancer, sarcomas, and other neoplasms. Science 250: 1233-1238, 1990. 18. Sinovic JF, Bridge JA, Neff JR. Ring chromosome in parosteal osteosarcoma. Clinical and diagnostic significance. Cancer Genet Cytogenet 62: 50-52, 1992. 19. Mirra JM. Bone Tumors: Clinical, Radiologic, and Pathologic Correlations. Philadelphia: Lea and Febiger, 1989. 20. Unni KK. Osteosarcoma of bone. J Orthop Sci 3: 287-294, 1998. 21. Bacci G, Picci P, Ferrari S, Orlandi M, Ruggieri P, Casadei R, Ferraro A, Biagini R, Battistini A. Prognostic significance of serum alkaline phosphatase measurements in patients with osteosarcoma treated with adjuvant or neoadjuvant chemotherapy. Cancer 71: 1224-1230, 1993. 22. Murphy WA. Imaging bone tumors in the 1990’s. Cancer 67: 1169-1176, 1991. 23. Schajowicz F, Sissons H, Sobin L. The World Health Organization’s histologic classification of bone tumors. Cancer 75: 1208-1214, 1995. 24. Goorin A, Shuster J, Baker A, Horowitz M, Meyer W, Link M. Changing pattern of pulmonary metastases with adjuvant chemotherapy in patients with osteosarcoma: results from the Multiinstutional Osteosarcoma Study. J Clin Oncol 9: 600-605, 1991. 25. Meyers P, Heller G, Healey J, Huvos A, Applewhite A, Sun M, LaQuaglia M. Osteogenic sarcoma with clinically detectable metastasis at initial presentation. J Clin Oncol 11: 449-453, 1993. 26. Tabone M, Kalifa C, Rodary C, Raquin M, Couanet D, Lemerle J. Osteosarcoma reccurences in pediatric patients previously treated with intensive chemotherapy. J Clin Oncol 12: 2614-2620, 1994. 27. Dahlin DC, Coventry MB. Osteosarcoma: a study of six hundred cases. J Bone Joint Surg 49: 101-110, 1967. 28. Provisor A, Ettinger L, Nachaman J, Krailo M, Makley J, Yunis E, Huvos A, Betcher D, Baum E, Kisker C, Miser J. Treatment of nonmetastatic osteosarcoma of the extremity with preoperative and postoperative chemotherapy: a report from the children’s cancer group. J Clin Onc 15: 76-84, 1997. 29. Bacci G, Picci P, Ruggieri P, Mercuri M, Avella M, Capanna R, Brach DP, Mancini A, Gherlinzoni F, Padovani G. Primary chemotherapy and delayed surgery (neoadjuvant chemotherapy) for osteosarcoma of the extremities. The Instituto Rizzoli Experience in 127 patients treated preoperatively with intravenous methotrexate (higd versus moderate doses) and intraarterial cisplatin. Cancer 54: 2539-2553, 1990. 30. Mintz B, Sowers R, Brown M, Hilmer C, Mazza E, Huvos G, Meyers A, LaFleur B, McDonough S, Henry M, Ramsey E, Antonescu R, Chen W, Healey H, Daluski A, Berens E, MacDonald J, Gorlick R, Stephan A. An Expression Signature
118
Irodalomjegyzék
Classifies Chemotherapy-Resistant Pediatric Osteosarcoma. Cancer Res 65: 17481754, 2005. 31. Aparacio J, Segura A, Montalar J. Long-term results after combined modality treatment for non-metastatic osteosarcoma. Med Oncol 16: 255-260, 1999. 32. Bacci G, Picci P, Ferrari S, Sangiorgi L, Zanone A. Primary chemotherapy and delayed surgery for non-metastatic teleangiectatic osteosarcoma of the extremities. Results in 28 patients. Eur J Cancer 30: 620-626, 1994. 33. Bielack S, Wulf B, Delling G, Gobel U, Kotz R, Ritter J, Winkler K. Osteosarcoma of the trunk by multimodal therapy: experience of the Cooperative Osteosarcoma study group (COSS). Med Pediatr Oncol 24: 6-12, 1985. 34. Rosen G, Caparros B, Huvos G, Kosloff C, Nirenberg A, Cacavio A, Marcove C, Lane M, Mehta B, Urban C. Praeoperative chemotherapy for osteogenic sarcoma. Selection of postoperative adjuvant chemotherapy based on the response of the primary tumor to praeoperative chemotherapy. Cancer 49: 1221-1230, 1982. 35. Rosen G, Marcove C, Caparros B. Nirenberg A, Kosloff C, Huvos A. Primary osteogenic sarcoma. The rationale for preoperative chemotherapy and delayed surgery. Cancer 43: 2163-2177, 1979. 36. Rosen G, Murphy L, Huvos G, Gutierrez M, Marcove RC. Chemotherapy, en block resection and prosthetic replacement in the treatment of osteogenic sarcoma. Cancer 37: 1-9, 1976. 37. Winkler K, Bielack S, Delling G, Jurgens H, Kotz R, Salzer-Kuntschik M. Treatment of osteosarcoma: Experience of the Cooperative Osteosarcoma Study Group (COSS). In Humphrey G (ed.), Cancer Treatment and Research: Osteosarcoma in Adolescents and Young Adults: New Developments and Controversies. Boston: Kluwer, 1993. 38. Winkler K, Bielack S, Delling G. Effect of intraarterial versus intravenous cisplatin in addition to systemic doxorubicin, high-dose methotrexate, and ifosfamide on histologic tumor response in osteosarcoma (Study COSS-86). Cancer 66: 1703-1710, 1990 39. Nathrath M, Schlemmer M, Burdach S. Osteosarcom. MANUAL Knochentumoren und Weichteilsarcome, by Tumorzentrum München und Zuckschwerdt Verlag München, 80-85, 2004. 40. Smeland S, Wiebe T, Böhling T, Brosjö O, Jonsson K, Alvegárd T. Chemotherapy in Osteosarcoma. The Scandinavian Sarcoma Group experience. Acta Orth Scand 75: 92-98, 2004. 41. Glasser DB, Lane JM, Huvos AG. Survival, prognosis and therapeutic response in osteogenic sarcoma. Cancer 69: 698-708, 1982. 42. Philip T, Brunat-Mentigny M. Standard, options and recommendations (SOR) for diagnosis, treatment and follow-up of osteosarcoma. Cancer 86: 159-176, 1999. 43. Saeter G, Hoie J, Stenwig AE, Johansson AK, Hannisdal E, Solheim OP. Systemic relapse of patients with osteogenic sarcoma. Prognostic factors for long term survival. Cancer 75: 1084-1093, 1995.
119
Irodalomjegyzék
44. Kashima T, Nakamura T, Kawaguchi J, Takanashi M, Ishida T, Aburatani H, Kudo A, Fukayama M, Grigoriadis A. Overexpression of cadherins suppresses pulmonary metastasis of osteosarcoma in vivo. Int J Cancer 104: 147-154, 2003. 45. Saeter G. ESMO minimum clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up of osteosarcoma. Ann Oncol 14: 1165-1166, 2003. 46. Bacci G, Ferrari S, Bertoni F, Longhi A, Bacchini P, Giacomini S, Forni C. A comment and update on ,,Does the histological subtype of high-grade central osteosarcoma influence the response to treatment with chemotherapy and does it affect overall survival? A study on 570 patients of two consecutive trials of the European Osteosarcoma Intergroup,,. Eur J Cancer 39: 548-549, 2003. 47. Valabrega G, Fagioli F, Corso S, Madon E, Brach del Prever A, Biasin E, Linari A, Aglietta M, Giordano S. ErbB2 and bone sialoprotein as markers for metastatic osteosarcoma cells. Br J Cancer 88: 396-400, 2003. 48. Zolzer G, Pfandlsteiner H, Blahovec H, Trieb K, Kotz R. Serum levels of TNF-β and sTNF-R in patients with malignant bone tumours. Anticancer Res 23: 30573060, 2003. 49. Ifergan I, Meller I, Issakov J, Assaraf Y. Reduced folate carrier protein expression in osteosarcoma. Cancer 98: 1958-1966, 2003. 50. Smeland S, Müller C, Alvegard TA, Wiklund T, Wiebe T, Björk O, Stenwig AE, Willén H, Holmström T, Follerás G, Brosjö O, Kiviojá A, Jonsson K, Monge O, Saeter G. Scandinavian Sarcoma Group Osteosarcoma Study SG VIII: prognostic factors for outcome and the role of replacement salvage chemotherapy for poor histological responders. Eur J Cancer 39: 488-494, 2003. 51. Rosen G, Marcove RC, Huvos AG, Caparros BI, Lane JM, Nirenberg A, Cacavio A, Groshen S. Primary osteogenic sarcoma: eight-year experience with adjuvant chemotherapy. J Cancer Res Clin Oncol 106: 55–67, 1983. 52. Hoang B, Kubo T, Healey J, Sowers R, Mazza B, Yang R, Huvos A, Meyers P, Gorlick R. Expression of LDL receptor – related protein 5 (LRP5) as a novel marker for vdisease progression in high grade osteosarcoma. Int J Cancer 109: 106-111, 2004. 53. Fellenberg J, Dechant M, Ewerbeck V, Mau H. Identification of drug – regulated genes in osteosarcoma cells. Int J Cancer 105: 636-643, 2003. 54. Meyers P, Heller G, Healey J, Huvos A, Lane J, Marcove R, Applewhite A, Vlamis V, Rosen G. Chemotherapy for nonmetastatic osteogenic sarcoma: the Memorial Sloan-Kettering experience. J Clin Oncol 10: 5-15, 1992. 55. Harisi R, Dudás J, Timár F, Pogány G, Timár J, Kovalszky I, Szendroi M, Jeney A. Invasive growth and topoisomerase-switch induced by tumorous extracellular matrix in osteosarcoma cell culture. Cell Biology Int, 2005 (in press). 56. Pogány G, Timár F, Oláh J, Harisi R, Polony G, Bocsi J, Jeney A, Laurie GW. Basement membrane inuced cell type specific dormancy of tumor cells. Clinical and Experimental Metastasis 17: 756a, 1999.
120
Irodalomjegyzék
57. Kerbel RS. Significance of tumor-host interactions in cancer growth and metastases. Cancer Met Rev 14: 259-262, 1995. 58. Pogány G, Timár F, Oláh J, Harisi R, Polony G, Paku S, Bocsi J, Jeney A, Laurie GW. Role of the basement membrane in tumour cell dormancy and cytotoxic resistance. Oncology 60: 274-281, 2001. 59. Harisi R, Dudas J, Timar F, Pogany G, Paku S, Timar J, Kovalszky I, Szendroi M, Jeney A. Antiproliferative and antimigratory effects of doxorubicin in human osteosarcoma cells exposed to extracellular matrix. Anticancer Res 25: 805-814, 2005. 60. Bodey B, Bodey B Jr, Siegel SE, Kaiser HE. Matrix metalloproteinases in neoplasm-induced extracellular matrix remodeling in breast carcinomas. Anticancer Res 21: 2021-2028, 2001. 61. Morell-Quadreny L, Rubio J, Lopez-Guerrero JA, Casanova J, Ramos D, Iborra I, Solsona E, Llombart-Bosch A: Disruption of basement membrane, extracellular matrix metalloproteinases and E-cadherin in renal-cell carcinoma. Anticancer Res 23: 5005-5010, 2003. 62. Ruoslahti E, Yamaguchi Y. Proteoglycans as modulators of growth factor activities. Cell 64: 867-869, 1991. 63. Hadley MA, Byers SW, Suarez-Quain CA, Kleinman HK, Dym M. Extracellular matrix regulates Sertoli cell differentiation, testicular cord formation, and germ cell development in vitro. J Cell Biol 101: 1511-1522, 1985. 64. Streuli C. Extracellular matrix remodelling and cellular differentiation. Cell Biol 11: 634-340, 1999. 65. Lin CQ, Bissel MJ. Multi – faceted regulation of cell differentiation by extracellular matrix. FASEB J 7: 737-743, 1993. 66. Meredith JE, Fazeli B, Schwartz MA. The extracellular matrix as a cell survival factor. Mol Biol Cell 4: 953-961, 1993. 67. Bissel MJ. Dynamic interplay between ECM, the organization of the nucleous and the epithelial phenotype. Cancer Res 59: 1757-1764, 1999. 68. Davis GE, Bayless KJ, Davis MJ, Meininger GA. Regulation of tissue injury responses by the exposure of matricryptic sites within extracellular matrix molecules. Am J Path 156: 1489-1498, 2000. 69. Lester BR, McCarthy JB. Tumor cell adhesion to the extracellular matrix and signal transduction mechanisms implicated in tumor cell motility, invasion and metastasis. Cancer Met Rev 11: 31-44, 1992. 70. Liotta L, Stetler-Stevenson WG. Metalloproteinases and cancer invasion. Semin Cancer Biol 1: 107-115, 1990. 71. Lukashev ME, Werb Z. ECM signalling: orchestrating cell behaviour and misbehaviour. Trends Cell Biol 8: 437-441, 1998.
121
Irodalomjegyzék
72. Ruoslahti E. Fibronectin and its integrin receptors in cancer. Adv Cancer Res 76: 1-20, 1999. 73. Nelson CM, Bissell MJ. Modeling dynamic reciprocity: Engineering threedimensional culture models of breast architecture, function, and neoplastic transformation. Semin Cancer Biol 5: 342-352, 2005. 74. Liu H, Radisky DC, Bissell MJ. Proliferation and polarity in breast cancer: untying the gordian knot. Cell Cycle 4: 646-649, 2005. 75. Stracke ML, Liotta LA. Multi-step cascade of tumor cell metastasis. In Vivo 6: 309-316, 1992. 76. Boudreau N, Bissell MJ. Extracellular matrix signalling integration of form and function in normal and malignant cells. Curr Opin Cell Biol 10: 586-593, 1998. 77. Nikitovic D, Zafiropoulos A, Tzanakakis GN, Karamanos NK, Tsatsakis AM. Effects of glycosaminoglycans on cell proliferation of normal osteoblasts and human osteosarcoma cells depend on their type and fine chemical compositions. Anticancer Res 25: 2851-2856, 2005. 78. Iozzo RV. Basement membrane proteoglycans: from cellar to ceiling. Nat Rev Mol Cell Biol 6: 646-656, 2005. 79. Maniotis AJ, Valyi-Nagy K, Karavitis J, Moses J, Boddipali V, Wang Y, Nunez R, Setty S, Arbieva Z, Bissell MJ, Folberg R. Chromatin organization measured by AluI restriction enzyme changes with malignancy and is regulated by the extracellular matrix and the cytoskeleton. Am J Pathol 166: 1187-203, 2005. 80. Whitelock JM, Iozzo RV. Heparan sulfate: a complex polymer charged with biological activity. Chem Rev 105: 2745-2764, 2005. 81. Gulubova MV. Collagen type IV, laminin, alpha-smooth muscle actin (alphaSMA), alpha1 and alpha6 integrins expression in the liver with metastases from malignant gastrointestinal tumours. Clin Exp Met 21: 485-494, 2004. 82. Lowrie AG, Salter DM, Ross JA. Latent effects of fibronectin, alpha5beta1 integrin, alphaVbeta5 integrin and the cytoskeleton regulate pancreatic carcinoma cell IL-8 secretion. Br J Cancer 91: 1327-1334, 2004. 83. Korah R, Boots M, Wieder R. Integrin alpha5beta1 promotes survival of growtharrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer Res 64: 4514-4522, 2004. 84. Yamaguchi H, Wyckoff J, Condeelis J. Cell migration in tumors. Curr Opin Cell Biol 9 Aug 2005. 85. Semaan M, Jovenin N, Birembaut P, Menard J, Staerman F. Prognostic value of stromal immunolabelling by MMP-2, MT1-MMP and TIMP-2 in clinically localized prostate cancer. Prog Urol 15: 250-254, 2005. 86. Jiang G, Davies G, Martin A, Parr C, Watkins G, Mason D, Mokbel K, Mansel E. Targeting matrilysin and its impact on tumor growth in vivo: the potential implications in breast cancer therapy. Clin Cancer Res 11: 6012-6019, 2005.
122
Irodalomjegyzék
87. Iozzo RV. Biology of disease: Proteoglycans: Structure, function, and role in neoplasia. Lab Invest 53: 373-396, 1985. 88. Fransson LA. Structure and function of cell-associated proteoglycans. TIBS 12: 406-411, 1987. 89. Gallai M, Kovalszky I, Knittel T, Neubauer K, Armbrust T, Ramadori G. Expression of extracellular mátrix proteoglycan perlecan and decorin in carbontetrachloride-induced rat liver and in isolated liver cells. Am J Pathol 148: 1463-1471, 1996. 90. Yanagishita M. Function of proteoglycans in the extracellular matrix. Acta Pathol Jpn 43: 283-293, 1993. 91. Tímár J, Jeney A, Kovalszky I, Kopper L. Role of proteoglycans in tumor progression. Pathol Oncol Res 1: 85-93, 1995. 92. Rapraeger AC. In the clutches of proteoglycans: how does heparan sulfate regulate FGF binding? Chem Biol 2: 645-649, 1995. 93. Vlodavsky I, Miao HQ, Atzmon R, Levi E, Zimmermann J, Bar-Shavit R, Peretz T, Ben-Sasson SA. Control of cell proliferation by heparan sulfate and heparinbinding growth factors. Thromb Haemost 74: 534-540, 1995. 94. Ishii A, Katase T, Andoh N, Seno N. Inhibition of topoisomerase I. by heparin. BBRC 104: 541-547, 1982. 95. Fedarko NS, Ishihara M, Conrad HE. Control of cell division in hepatoma cells by exogenous heparan sulphate proteoglycan. J Cell Physiol 139: 287-294, 1989. 96. Kovalszky I, Dudás J, Oláh-Nagy J, Pogány G, Tóváry J, Kopper L, Jeney A, Iozzo RV. Inhibition of DNA topoizomerase I activity by heparansulfate and modulation by basic fibroblast growth factor. Mol Cell Biochem 183: 11-23, 1998. 97. Esko JD. Genetic analysis of proteoglycan structure, function and metabolism. Curr Opin Cell Biol 3: 805-816, 1991. 98. Ádány R, Heimer R, Caternoon B, Sorrell JM, Iozzo TV. Altered expression of chondroitin sulfate proteoglycan in the stroma of human colon carcinoma. J Biol Chem 265: 11389-11396, 1990. 99. Dudás J, Kovalszky I, Gallai M, O Nagy J, Schaff Zs, Knittel T, Mehde M, Neubauer K, Szalay F, Ramadori G. Expression of decorin, transforming growth factor beta-1, tissue inhibitor metalloproteinas 1,2 and type IV collagenase in chronic hepatitis. Am J Clin Pathol 115: 725-735, 2001. 100. Droz D, Patey N, Paraf F, Chretien Y, Gogusev J. Composition of extracellular matrix and distribution of cell adhesion molecules in renal cell tumors. Lab Invest 71: 710-718, 1994. 101. Weber IT, Harrison RW, Iozzo RV. Model structure of decorin and implications for collagen fibrillogenesis. J Biol Chem 271: 31767-31770, 1996. 102. Merz H, Malisius R, Mannweiler S, Zhou R, Hartmann W, Orscheschek K, Moubayed P, Feller C. Immuno Max. A maximized immunohistochemical method
123
Irodalomjegyzék
for the retrieval and enhancement of hidden antigenes. Lab Invest 73: 149-156, 1995. 103. DeLuca MA, McElroy WD (eds). Classical reagent for generating luminesence, review. 11th Int Conf Adv Prostagl Leukot Res. New York, 1981. 104. Pickard RG, Cobb LM, Steel GG. The growth kinetics of xenografts of human colorectal tumours in immune deprived mice. Br J Cancer 31: 36-45, 1975. 105. Kaltenbach ZP, Kaltenbach MH, Lyons WB. Nigrosin as a dye for differentiating live and dead ascites cells. Exp Cell Res 15: 112-117, 1958. 106. Gay W, Moore J, Morgan M, Montes F. Anthralin toxicity. Arch Dermatol 105: 213-215, 1972. 107. Comings DE. Methods and mechanisms of chromosome banding. Methods Cell Biol 17: 115-132 , 1978. 108. Orkin W, Gehro P, McGoodwin B, Martin R, Valentine T, Swarm R. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. J Exp Med 145: 204-220, 1977. 109. Kramer RH, Bensch KG, Wong J. Invasion of reconstituted basement membrane matrix by metastatic human tumor cells. Cancer Res 46: 1980-1989, 1986. 110. Kleinman HK, McGarvey MJ, Liotta LA, Robey PG, Tryggvason K, Martin GR. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfateproteoglycan from EHS sarcoma. Biochemistry 21: 6188-6193, 1982. 111. Bissell DM, Arenson DM, Maher JJ, Roll FJ. Support of cultured hepatocytes by a laminin-rich gel. J Clin Invest 79: 801-812, 1987. 112. Lyon M, Gallagher T. Purification and partial characterisation of the major cellassociated heparan sulfate proteoglycan of rat liver. Biochem J 273:415-422, 1991. 113. Fuks Z, Vlodavsky I, Andreeff M, McLoughlin M, Haimovitz-Friedman A. Effects of extracellular matrix on the response of endothelial cells to radiation in vitro. Eur J Cancer 28: 725-731, 1992. 114. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 65: 55-63, 1983. 115. Cole SPC. Rapid chemosensitivity testing of human lung tumor cells using the MTT assay. Cancer Chemoter Pharmacol 17: 259-263, 1986. 116. Carmichael J, De Graff WG, Gazdar AF, Minna JD, Mitchell JB. Evaluation of a tetrasolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res 47: 936-942, 1987. 117. Rubinstein LV, Shoemaker RH, Paull KD, Simon RM, Tosini S, Skehan P, Scudiero DA, Monks A, Boyd MR. Comparison of in vitro anticancer – drug screening data generrated with a tetrasolium assay versus a protein assay against a diverse panel of human tumor cell lines. Z Natl Cancer Inst 82: 1113-1118, 1990. 118. Twentyman PR, Fox NE, Rees JKH. Chemosensitivity testing of fresh leukemia cells using the MTT colorimetric assay. Br J Haematol 71: 19-24, 1989.
124
Irodalomjegyzék
119. Geng J, Hellstrand K, Wennmalm A, Hansson K. Apoptotic death of human leukemic cells induced by vascular cells expressing nitric oxide synthase in response to ?interferon and tumor necrosis factor-a. Cancer Res 56:866-874, 1996. 120. Duguet M, Lavenot C, Harper F, Mirambeau G, De Recondo AM. DNA topoisomerases from rat liver: Physiological variations. Nucleic Acid Res 11: 1059-1075, 1983. 121. Sullivan DM, Latham MD, Rowe TC, Ross WE. Purification and characterization of an altered topoisomerase II from a drug-resistant Chinese hamster ovary cell line. Biochemistry 28: 5680-5687, 1989. 122. Hames BD, Rickwood D (eds). Gel electrophoresis of proteins: A practical approach, 2nd edition, Oxford University Press, New York, 1990. 123. Laemli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685, 1970. 124. Ausubel M, Brent R, Kingston E, Moore D, Seidmen G, Smith A, Struhl K. Current protocols in Molecular biology. John Wily Inc, Massachusets, MA USA, 102-109, 1998. 125. Taudou G, Mirambeau G, Lavenot C, Der Garabedian A, Vermeersch J, Duguet M. DNA topoisomerase activities in concavalin A stimulated lymphocytes. FEBS Lett 176: 431-435, 1984. 126. Larsen AK, Grondard L, Couprie J, Desoize B, Comoe L, Jardillier JC, Riou JF. The antileukemic alkaloid fagaronine is an inhibitor of DNA topoisomerases I and II. Biochem Pharmacol 46: 1403-1412, 1993. 127. Marini JC, Miller KG, Englund PT. Decatenation of kinetoplast DNA by topoisomerases. J Biol Chem 255: 4976-4979, 1980. 128. Heussen C, Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal Biochem 102: 196-202, 1980. 129. Yamagata S, Ito Y, Tanaka R, Shimizu S. Gelatinases of metastatic cell lines of murine colonic carcinoma as detected by substrate-gel electrophoresis. Biochem Bioph Res Communications 151: 158-162, 1988. 130. Jarvis D, Turner J, Povirk F, Taylor S, Grant S. Induction of apoptotic DNA fragmentation and cell death in HL-60 human promyelocytic leukemia cells by pharmacological inhibitors of protein kinase C. Cancer Res 54: 1707-1714, 1994. 131. McCoy WF, Olson BH. Fluorometric determination of the DNA concentration in municipal drinking water. Appl Environ Microbiol 49: 811-817, 1985. 132. Singh P, McCoy T, Tice R, Schneider L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res 175: 184-191, 1988. 133. McKelvey–Martin VJ, Green MHL, Schmezer P, Pool Zobel BL, De Meo MP, Collins A. The single cell gel electrophoresis assay (comet assay). A European review. Mutat Res 288: 47-63, 1993.
125
Irodalomjegyzék
134. Daryl F, Peggy O, Kim O. The comet assay: a comprehensive review. Mutat Res 339: 37-59, 1995. 135. Olive PL, Banath JP. Detection of DNA double – strand breaks thought the cell cycle after exposure to X-rays, bleomycin, etoposide and 125IdUrd. Int J Radiat Biol 64: 349-358, 1993. 136. Pogany G, Hernandez J, Vogel G. The in vitro interaction of proteoglycans with type I collagen is modulated by phosphate.Arch Biochem Bioph 313:102-11, 1994. 137. Miser J, Arndt C, Smithson W: Treatment of high grade osteosarcoma with ifosfamide, mesna, adriamycin, high dose methotrexate with or without cisplatin. Results of two pilot trials. Proc ASCO 13: 421a, 1994. 138. Meyers PA, Gorlick R. Osteosarcoma. Pediatr Clin North Am 44: 973–989, 1997. 139. Bacci G, Forni C, Ferrari S, Longhi A, Bertoni F, Mercuri M, Donati D, Capanna R, Bernini G, Briccoli A, Setola E, Versari M. Neoadjuvant chemotherapy for osteosarcoma of the extremity: intensification of preoperative treatment does not increase the rate of good histologic response to the primary tumor or improve the final outcome. J Pediatr Hematol Oncol 25: 845–853, 2003. 140. Gorlick R, Meyers PA. Osteosarcoma necrosis following chemotherapy: innate biology versus treatment specific. J Pediatr Hematol Oncol 25: 840-841, 2003. 141. Clark EA, Brugge JS. Integrins and signal transduction pathways: the road taken. Science (Washington DC), 268: 233-239, 1995. 142. Petersen OW, Ronnov-Jessen L, Howlett AR, Bissell MJ. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci USA 89: 9064-9068, 1992. 143. Marco A, Diaz-Montero M, Wygant N, Kleinerman S, McIntyre W. Alpha 4 integrin increases anoikis of human osteosarcoma cells. J Cell Biochem 88: 10381047, 2003. 144. Tsang P, Ho Y, Fung P, Kong K, Kwok T. p53-R175H mutant gains new function in regulation of doxorubicin-induced apoptosis. Int J Cancer 114: 331-336, 2005. 145. Petersen OW, Ronnov-Jessen L, Bissell MJ. The microenvironment of the breast: three-dimensional models to study the roles of the stroma and the extracellular matrix in function and dysfunction. Breast J 1: 22-35, 1995. 146. Kramer RH, Bensch KB, Rezaee M, Wong J. Invasion of reconstituted basement membrane matrix by fibrosarcoma cells. J Cell Biol 101: 813a, 1985. 147. O’Connor PM, Jackman J, Bae I, Myers TG, Fan S, Mutoh M, Scudiero DA, Monks A, Kohn KW. Characterization of the p53 tumor suppressor pathway in cell lines of the National Cancer Institute anticancer drug screen and correlations with the growth-inhibitory potency of 123 anticancer agents. Cancer Res 57: 4285300, 1997. 148. Fallis LH, Richards E, O'Connor DJ, Zhong S, Hsieh JK, Packham G, Lu X. The biological response of MCF7 breast cancer cells to proteosome inhibition or
126
Irodalomjegyzék
gamma-radiation is unrelated to the level of p53 induction. Apoptosis 4: 99-107, 1999. 149. Kerbel RS, Rak J, Kobayashi H, Man MS, St Croix B, Graham CH. Multicellular resistance: a new paradigm to explain aspects of acquired drug resistance of solid tumors. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 59: 661-72, 1994. 150. St Croix B, Kerbel RS. Cell adhesion and drug resistance in cancer. Curr Opin Oncol 9: 549-556, 1997. 151. Bissell MJ. The central role of basement membrane in functional differentiation, apoptosis and cancer: a personal account In: JT Tilly, JF Strauss, M Tenniswood (eds.), Cell Death in Reproductive Physiology, pp. 125-140. Serono Symposia USA, 1998. 152. Timpl R, Fujiwara S, Dziadek M, Aumailley M, Weber S, Engel J. Laminin, proteoglycan, nidogen, and collagen IV: structural models and molecular interactions. In: R. Porter and J. Whelan (eds.), Basement Membranes and Movement, pp. 25-74. London: Pitman, 1984. 153. Kleinman K, McGarvey L, Hassell R, Star L, Cannon B, Laurie W, Martin R. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry 25: 312318, 1986. 154. Martin GR, Kleinman HK, Terranova VP, Ledbetter S, Hassell JR. The regulation of besement membrane formation and cell-matrix interactions by defined supramolecular complexes. In: M Bernfield (ed.), Besement Membranes and Movement, pp. 197-212. London: Pitman, 1984. 155. Kleinman HK, McGarvey ML, Hassell HR, Martin GR. Formation of a supramolecular complex is involved in the teconstitution of basement membrane components. Biochemistry 22: 4969-4974, 1983. 156. Mathiak M, Yenisey C, Grant DS. A role for perlecan in the supression of growth and invasion in fibrosarcoma cells. Cancer Res 57: 2130-2136, 2002. 157. Dudas J, Ramadori G, Knittel T, Neubauer K, Raddatz D, Egedy K, Kovalszky I: Effect of heparin and liver heparan sulphate on interaction of HepG2-derived transcription factors and their cis-acting elements: altered potential of hepatocellular carcinoma heparan sulphate. Biochem J 350: 245-251, 2000. 158. Aviezer D, Hecht D, Safran M, Eisinger M, David G, Zazon A. Perlecan, basal lamina proteoglycan, promotes basic fibroblast growth factor-receptor binding, mitogenesis and angiogenesis. Cell 79: 1005-1013, 1994. 159. Sethi T, Rintoul RC, Moore SM, MacKinnon AC, Salter D, Choo C, Chilvers ER, Dransfield I, Donnelly SC, Strieter R, Haslett C. Extracellular matrix proteins protect small cell lung cancer cells against apoptosis: A mechanism for small cell lung carver growth and drug resistance in vivo. Nature Medicine 5: 662-668, 1999. 160. Park CP, Bissel MJ, Barcellos-Hoff MH. The influence of the microenvironment on the malignant phenotype. Molecular Medicine Today 6: 324-329, 2000.
127
Irodalomjegyzék
161. Heino J, Massague J. Transforming growth factor- beta switches the pattern of integrins expressed in MG-63 human osteosarcoma cells and causes a selective loss of cell adhesion to laminin: J Biol Chem 264: 21806-21811, 1989. 162. Kawaguci S, Uede T. Distribution of integrins and their matrix ligands in osteogenic sarcomas. J Orthop Res 11: 386-395, 1993. 163. Yudoh K, Matsui H, Kanamori M, Ohmori K, Yasuda T, Tsuji H. Characteristics of high and low laminin-adherent Dunn osteosarcoma cells selected by adhesiveness to laminin. Correlation between invasiveness trough the extracellular matrix and pulmonary metastatic potencial. Tumour Biol 17: 332-340, 1996. 164. Kern E, Kinzler W, Bruskin A, Jarosz D, Friedman P, Prives C, Vogelstein B. Identification of p53 as a sequence-specific DNA-binding protein. Science 252: 1708-1711, 1991. 165. Mack H, Vartikar J, Pipas M, Laimins A. Specific repression of TATA-mediated but not initiator-mediated transcription by wild-type p53. Nature 363: 281-283, 1993. 166. Grundmann E, Ueda Y, Schneider-Stock R, Roessner A. New aspects of cell biology in osteosarcoma. Pathol Res Pract 191: 563-570, 1995. 167. Letson GD, Muro-Cacho CA. Genetic and Molecular Abnormalities in Tumors of the Bone and Soft Tissues. Cancer 3: 239-249, 2001. 168. Xiong Y, Zhang H, Beach D. D-type cyclins associate with multiple protein kinases and the DNA replication and repair factor PCNA. Cell 71: 505-514, 1992. 169. Takeuchi K, Kaneda K, Kawakami I, Takasaki Y, Hashimoto I. Autoantibodies recognising proteins co-purified with PCNA in patients with connective tissue diseases. Mol Biol Rep 23: 243-246, 1996. 170. Shivji KK, Kenny MK, Wood RD. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) is required for DNA excisoin repair. Cell 69: 367-374, 1992. 171. Tomkinson AE, Mackey ZB. Structure and function of mammalian DNA ligases. Mutation Research 407: 1-9, 1998. 172. Gerdes J, Lemke H, Baisch H, Wacker H-H, Schwab U, Stein H. Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67. J Immunol 133: 1710-1715, 1984. 173. Hsiang YH, Wu HY, Liu LF. Proliferation-dependent regulation of DNA topoisomerase II in cultured human cells. Cancer Res 48: 3230-3235, 1988. 174. Ludvikova M, Holubec L Jr, Ryska A, Topolcan O. Proliferative markers in diagnosis of thyroid tumors: a comparative study of MIB-1 and topoisomerase II-a immunostaining. Anticancer Res 25: 1835-1840, 2005. 175. Cortes F, Mateos S, Pastor N, Dominguez I. Toward a comprehensive model for induced endoreduplication. Life Sci 76: 121-135, 2004. 176. Liotta LA, Kohn EC. The microenvironment of the tumor-host interface. Nature 411: 375-379, 2001.
128
Irodalomjegyzék
177. Bissell J, Radinsky D. Putting tumours in context. Nat Rev Cancer 1: 46-54, 2001. 178. Brenner W, Gross S, Steinbach F. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Lett 155: 199205, 2000. 179. Giannelli G, Bergamini C, Fransvea E. Human hepatocellular carcinoma (HCC) cells require both alpha3beta1 integrin and matrix metalloproteinases activity for migration and invasion. Lab Invest 81: 613-627, 2001. 180. Hood JD, and Cheresh DA. Role of integrins in cell invasion and migration. Nat Rev Cancer 2: 91-100, 2002. 181. Miranti CK, Brugge JS. Sensing the environment a historical perspective on integrin signal transduction. Nature Cell Biology 4: 83-90, 2002. 182. Senoo H, Imai K, Sato M, Kojima N, Miura M, Hata R. Three-dimensional structure of extracellular matrix reversibly regulates morphology, proliferation and collagen metabolism of perisinusoidal stellate cells (vitamin a-storing cells). Cell Biol Int 20: 501-512, 1996. 183. Stupack DG, Puente XS, Boutsaboualoy S. Apoptosis of adherent cells by recruitment of caspase-8 to unligated integrins. J Cell Biol 155: 459-470, 2001. 184. Ridley AJ. Rho GTPases and cell migration. J Cell Sci 114: 2713-2722, 2001. 185. Liang CC, Chen HC. Sustained activation of extracellular signal-regulated kinase stimulated by hepatocyte growth factor leads to integrin alpha 2 expression that is involved in cell scattering. J Biol Chem 276: 21146-21152, 2001. 186. Bacci G, Avella M, Picci P, Briccoli A, Dallari D, Campanacci M. Metastasis pattern in osteosarcoma. Tumori 74: 421-427, 1988. 187. Jia SF, Worth LL, Kleinerman ES. In vivo implantation of human osteosarcoma cells in nude mice induces bones with human-derived osteoblasts and mousederived osteocytes. Lab Invest 75: 707-717, 1999. 188. Webb J, Horwitz F. New dimensions in cell migration. Nat Cell Biol 5: 690-692, 2003. 189. Shibata K, Kikkawa F, Nawa A, Suganuma N, Hamaguchi M. Fibronectin secretion from human peritoneal tissues induces Mr 92,000 type IV collagenase expression and invasion in ovarian cancer cel lines. Cancer Res 23: 5416-5420, 1997. 190. Thant A, Nawa A, Kikkawa F, Ichigotani Y, Zhang Y, Sein T, Amin R, Hamaguchi M. Fibronectin activates MMP-9 secretion via the MEK1-MAPK and the PI3K-Akt pathways in ovarian cancer cells. Clin Exp Met 18: 423-428, 2000. 191. Sasisekharan E, Shriver Z, Venkataraman G, Narayanasami U. Roles of heparansulphate glycosaminoglycans in cancer. Nat Rev Cancer 2: 521-528, 2002. 192. Kemeny E, Fillit HM, Damle S, Mahabir R, Kefalides NA, Gregory JD, Antonovych T, Sabnis S, Zabriskie JB. Monoclonal antibodies to heparan sulfate
129
Irodalomjegyzék
proteoglycan: development and application to the study of normal tissue and pathologic human kidney biopsies. Connect Tissue Res 18: 9-25, 1988. 193. Yamauchi N, Watanabe A, Hishinuma M, Ohashi Ki, Midorikawa Y, Morishita Y, Niki T, Shibahara J, Mori M, Makuuchi M, Hippo Y, Kodama T, Iwanari H, Aburatani H, Fukayama M, Hendriks J, Planelles L, De Jong-Odding J. The glypican 3 oncofetal protein is a promising diagnostic marker for hepatocellular carcinoma; Heparan sulfate proteoglycan binding promotes APRIL-induced tumor cell. Mod Pathol; Cell Death Differ 12: 637-648, 2005. 194. Serra M, Miquel L, Domenzain C, Docampo Mj, Fabra A, Wight Tn, Bassols A. V3 versican isoform expression alters the phenotype of melanoma cells and their tumorigenic potential. Int J Cancer 114: 879-886, 2005. 195. Ishihara M, Fedarko NS, Conrad HE. Involvement of phosphatidylinositol and insulin in the coordinate regulation of proteoheparan sulfate metabolism and hepatocyte growth. J Biol Chem 262: 4708-4716, 1987. 196. Battaglia C, Aumailley M, Mann K, Mayer U, Timpl R. Structural basis of ß1 integrin-mediated cell adhesion to a large heparan sulfate proteoglycan from basement membranes. Eur J Cell Biol 61: 92-99, 1993. 197. Tovari J, Paku S, Raso E, Pogany G, Kovalszky I, Ladanyi A, Lapis K, Timar J. Role of sinusoidal heparan sulfate proteoglycan in liver metastasis formation. Int J Cancer 71: 825-831, 1997. 198. Merz DC, Alves G, Kawano T, Zheng H, Culotti JG. UNC-52/perlecan affects gonadal leader cell migrations in C elegans hermaphrodites through alterations in growth factor signaling. Dev Biol 256: 173-186, 2003. 199. Wang J, Jing Z, Zhang L, Zhou G, Braun J, Yao Y, Wang Z. Regulation of acetylcholine receptor clustering by the tumor suppressor APC. Nat Neurosci 6: 1017-1018, 2003. 200. Schambony A, Kunz M, Gradl D. Cross-regulation of Wnt signaling and cell adhesion. Differentiation 72: 307–318, 2004. 201. Sanceau J, Truchet S, Bauvois B. Matrix metalloproteinase-9 silencing by RNA interference triggers the migratory-adhesive switch in Ewing's sarcoma cells. J Biol Chem 278: 36537-36546, 2003. 202. Reddy KB, Kreuger JS, Kondapaka SB. Mitogen-activated protein-kinase (MAPK) regulates the expression of progelatinase B (MMP-9) in breast epithelialcells. Int J Cancer 82: 268-273, 1999. 203. Leroy-Dudal J, Demeilliers C, Gallet O. Transmigration of human ovarian adenocarcinoma cells through endothelial extracellular matrix involves alphaV integrins and the participation of MMP2. Int J Cancer 2004, E-pub. 204. Boege F. Analysis of eukaryotic DNA topoisomerases and topoisomerase-directed drug effects. Eur J Clin Chem Clin Biochem 34: 873, 1996. 205. Shapiro PS, Whalen AM, Tolwinski NS, Wilsbacher J, Froelich-Ammon SJ, Garcia M, Osheroff N, Ahn NG. Extracellular signal-regulated kinase activates
130
Irodalomjegyzék
topoisomerase IIalpha through a mechanism independent of phosphorylation. Mol Cell Biol 19: 3551-3560, 1999. 206. Timar J, Pogany G, Balazs M, Szollosi J, Ladanyi A, Olah J, Timar F, Lapis K and Jeney A. Modulation of membrane phenotype, matrix adhesion and microinvasiveness of metastatic tumour cells by HudR. Cell Biochem and Funct 8: 211-220, 1990. 207. Mueller MM and Fusenig NE: Friends or foes-bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nat Rev Cancer 4: 839-49, 2004. 208. Fisher TC, Milner AE, Gregory CD, Jackman AL, Aherne GW, Hartley JA, Dive C, Hickman JA. bcl-2 modulation of apoptosis induced by anticancer drugs: resistance to thymidylate stress is independent of classical resistance pathways. Cancer Res 53: 3321-3326, 1993. 209. Yamane K, Katayama E., Sugasawa K., Tsuruo T. Retinoblastoma susceptibility protein, Rb possesses multiple BRCT-Ws, BRCA1 carboxyl–terminus–related W regions with DNA break – binding activity. Oncogene 19: 1982-1991, 2000. 210. Slichenmyer WJ, Kastan MB. Loss of a p53-associated G1 checkpoint does not decrease cell survival following DNA damage. Cancer Res 53: 4164-4168, 1993. 211. Hornicek J, Gebhardt C, Wolfe W, Kharrazi D, Tekeshita H, Parekh G, Zurakowski D, Mankin J. P Glycoprotein Levels Predict Poor Outcome in Patients with Osteosarcoma. Clin Orth Rel Res 373: 11-17, 2000. 212. Trieb K, Kotz R. Proteins expresessed in osteosarcoma and serum levels as prognostic factors. Int J Biochem Cell Biol 33: 11-17, 2001. 213. Dalton WS. The tumor microenvironment as a determinant of drug response and resistance. Drug-Resist Updates 2: 285-288, 1999. 214. Tomida A., Tsuruo T. Drug resistance mediated by cellular stress response to the microenvironment of solid tumors. Anticancer Drug Des 14: 169-177, 1999. 215. Boudreau N, Werb Z, Bissell MJ. Suppression of apoptosis by basement membrane requires three–dimensional tissue organisation and withdrawal from the cell cycle. Proc Natl Acad Sci USA 1993: 3509-3513, 1996. 216. Frisch SM, Fracis H. Disruption of epithelial cell–matrix interactions induces apoptosis. J Cell Biol 124: 619-626, 1994. 217. Meredith JE jr, Schwartz MA. Integrins adhesion and apoptosis. Trends Cell Biol 7: 146-150, 1997. 218. Wand W, Passaniti A. Extracellular matrix inhibits apoptosis and enhances endothelial cell differentiation by a NFκB dependent mechanism. J Cell Biochem 73: 321-331, 1999. 219. Bao W, Stromblad S. Integrin alphav-mediated inactivation of p53 controls a MEK1-dependent melanoma cell survival pathway in three-dimensional collagen. J Cell Biol 167: 745-756, 2004. 220. Dantzer F, Nasheuer P, Vonesch L, de-Murcia G. Functional association of poly (ADP-ribose) polimerase with DNA polimerase a primase complex: a link
131
Irodalomjegyzék
between DNA strand breek detection and DNA replication. Nucleic Acids Res 26: 1891-1898, 1998. 221. Krieser RJ, Eastman A. The cloning and expression of human deoxyribonuclease II. J Biol Chem 273: 30909-30914, 1998. 222. Famulski KS, Liuzzi M, Bashir S, Mirzayans R, Paterson MC. Purification and characterization of a novel human acidic nuclease/intra-cyclobutyl-pyrimidinedimer-DNA phosphodiesterase. Biochem J 345: 583-593, 2000. 223. Counis F, Torriglia A. Dnases and apoptosis.Biochem Cell Biol 78:405-414, 2000. 224. Sakahira H, Enari M, Nagata S. Cleavage of CAD inhibitor in CAD activation and DNA degradation during apoptosis. Nature 391: 96-99, 1998. 225. Enari M, Sakahiran H, Yokoyama H, Okawa K, Iwamatsu A, Nagata S. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature 391: 43-50, 1998. 226. Tsai CM, Perng RP, Chen MH, Jan YH, Hung MC, Ku TY, Chang KT.Greater enhancement of chemosensitivity by caffeine in high-p185neu-expressing human non-small-cell lung cancer cell lines. J Natl Cancer Inst 86: 1018-1020, 1994. 227. Tímár J. A daganatos progresszió molekuláris mechanizmusa. Krompecher emlékeloadás. Magyar Onkológia 48: 3-11, 2004. 228. Van der Zee, A GJ, deJong S, Keith WN, Hollema H, Boonstra H, deVries EGE. Quantitative and qualitative aspect of topoisomerase I and II alpha and beta in untreated and platinum/cyclophosphamide treated malignant ovarian tumors. Cancer Res 54: 749-755, 1994. 229. Castillo GM, Cummings JA, Ngo C, Yang W, Snow AD. Novel purification and detailed characterization of perlecan isolated from the Engelbreth-Holm-Swarm tumor for use in an animal model of fibrillar A beta amyloid persistence in brain. J Biochem 120: 433-444, 1996. 230. Rainsford KD. Doxorubicin is a potent inhibitor of interleukin 1 induced cartilage proteoglycan resorption in-vitro. J Pharm Pharmacol 41: 60-63, 1989. 231. Palmoski M, Brandt K. Effects of diphosphonates on glycosaminoglycan synthesis and proteoglycan aggregation in normal adult articular cartilage. Arthritis Rheum 21: 942-949, 1978. 232. Timar J, Diczhazi C, Bartha I, Pogany G, Paku S, Raso E, Tovari J, Ladanyi A, Lapis K, Kopper L. Modulation of heparan-sulphate/chondroitin-sulphate ratio by glycosaminoglycan biosynthesis inhibitors affects liver metastatic potential of tumor cells. Int J Cancer 62: 755-761, 1995. 233. Boissier S, Ferreras M, Peyruchaud O, Magnetto S, Ebetino FH, Colombel M, Delmas P, Delaisse JM, Clezardin P. Bisphosphonates inhibit breast and prostate carcinoma cell invasion, an early event in the formation of bone metastases. Cancer Res 60: 2949-2 954, 2000.
132
11 SAJÁT KÖZLEMÉNYEK A disszertáció témájával kapcsolatos közlemények G. Pogány, F. Timár, J. Oláh, R. Harisi, G. Polony, S. Paku, J. Bocsi, A. Jeney, G.W. Laurie. Role of the basement membrane in tumor cell dormancy and cytotoxic resistance. Oncology 2001;60:274-281 IF: 3.009 R. Harisi, J. Dudás, F. Timár, G. Pogány, S. Paku, J. Timár, I. Kovalszky, M. Szendroi, A. Jeney. Antiproliferative and antimigratory effects of doxorubicin in human osteosarcoma cells exposed to extracellular matrix. Anticancer Research 2005;25(2A): 805-813 IF: 1.395 R. Harisi, J. Dudás, F. Tímár, G. Pogány, I. Kovalszky, M. Szendroi, J. Timár, A. Jeney. Invasive growth and topoisomerase switch induced by the tumorous extracellular matrix in osteosarcoma cell culture. (Cell Biology International 2005; megjelenés alatt) IF: 1.015 R. Harisi, F. Tímár, G. Pogány, J. Dudás, J. Nagy Oláh, M. Szendroi, A. Jeney. Repopulation of osteosarcoma cells after treatment with doxorubicin in the presence of extracellular matrix biopolymers. (Cancer Chemotherapy and Pharmacology, közlésre elfogadva) IF: 2.216
Egyéb onkológiai tárgyú közlemények Tanyi J., Rigó J. jr., Szabó I., Hariszi R., Szánthó A. Petefészek eredetu cystákkal szövodött terhességek. Orvosi Hetilap 1997;46:2927-2930 Harisi R., Bodoky G., Borsodi M., Flautner L., Weltner J. Rectal cancer therapy: decision making on basis of quality of life? Zentralblatt für Chirurgie 2004;129(2):139148 IF: 0.339 Gy. Ostoros, R. Harisi, G. Kovacs, J. Horti, L. Geczi, K. Szondy, M. Orosz, E. Ferenczi, E. Ruby, B. Dome. Inhibition of EGFR Tyrosine-Kinase in NSCLC Treatment: the Hungarian Experience with Gefitinib in the Context of an Expanded Access Programme. (Anticancer Research 2005; megjelenés alatt) IF:1.395
133
Könyvfejezet R. Harisi, J. Dudás, Gy. Bodoky, J. Weltner, T. Winternitz, P. Kupcsulik, L. Harsányi, B. Járay, L. Flautner. The prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen in colorectal cancer. A prospective study with clinical correlation. In Proceedings of the 37th Congress of the European Society for Surgical Research, 23-25 May, 2002, Szeged, Hungary. Ed. M. Boros. Bologna, Italy: Monduzzi Editore, 2002,175-179
A disszertáció témájával kapcsolatos eloadások Jeney A., Lasztity J., Harisi R., Pogany G., Timar F., Olah J., Szendroi M. Molecular targets for antiproliferative and antimetastatic agents in human osteosarcoma cells.10th NCI-EORTC Symposium on New Drugs in Cancer Therapy, 1998, Amsterdam. The Netherlands. Annals of Oncology 1998;9(S2):549 IF: 2.867 Harisi R., Jeney A. Az osteosarcoma kemoterápiás kezelés hatékonyságát befolyásoló tényezok. Korányi Frigyes Szakkolégium III. Tudományos Fóruma, április 21-22, 1999, Budapest. Avatron díj (Molekuláris Biológiai Módszerek Onkológiai Alkalmazása) Harisi R., Jeney A. Az extracelluláris mátrix szerepe az osteosarcoma sejtek adriamycinnel szembeni válaszreakciójában. SOTE Ph.D. Tudományos Napok, május 31június 1, 1999, Budapest. Absztrakt könyv: 31. oldal Harisi R., Tímár F., Lásztity J., Szendroi M., Pogány G., Jeney A. Az adriamycin rezisztens osteosarcoma és az extracelluláris mátrix. A Magyar Kemoterápiai Társaság XIV. Konferenciája, június 2-4, 1999, Hajdúszoboszló. Absztrakt könyv: 83. oldal Harisi R., Pogány G., Tímár F., Lásztity J., Szendroi M., Jeney A. Multicelluláris rezisztencia kialakulása osteosarcoma sejtekben. A Magyar Élettani Társaság LXIV. Vándorgyulése, július 5-8, 1999, Budapest. Absztrakt könyv: 49. oldal Harisi R., Lásztity J., Tímár F., Pogány G., Timár J., Jeney A. Az extracelluláris mátrix (ECM) szerepe az osteosarcoma sejtek adriamycinnel szembeni multicelluláris rezisztencia kialakulásában. Magyar Onkológusok Társasága XXIII. Kongresszusa, november 11-13, 1999, Budapest. Magyar Onkológia 1999;43(4):295 Poszter díj Harisi R., Timár F., Szendroi M., Jeney A. Az extracelluláris mátrix korlátozó szerepe a citosztatikumok sejtproliferációt gátló hatásában. Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola, Ph.D. Tudományos Napok, február 16-17, 2000, Budapest . Absztrakt könyv: 50.-51. oldal Pogány G., Tímár F., Oláh J., Harisi R., Polony G., Bocsi J., Jeney A., G.W. Laurie. Role of microenvironment in the antiproliferative action of DNA damaging agents. A Magyar Kemoterápiai Társaság XV. Konferenciája, június 7-9, 2000, Hajdúszoboszló.
134
G. Pogány, F. Tímár, J. Oláh, R. Harisi, G. Polony, J. Bocsi, A. Jeney, G.W. Laurie. Basement membrane induced cell type specific dormancy of tumor cells. 8th International Congress of the Metastasis Research Society, 24–27 September, 2000, London, U.K. Clinical and Experimental Metastasis 1999;17(9):756 IF: 2.522 R. Harisi, J. Dudás., G. Pogány, F. Tímár, A. Jeney. Importance of the microenvironment in the biological behaviour and cytostatic treatment of human osteosarcoma. Semmelweis Symposium-Oncology, November 9-10, 2000, Budapest. Abstract book: p. 76-77 G. Pogány, F. Tímár, J. Oláh, R. Harisi, G. Polony, J. Bocsi, A. Jeney, G.W. Laurie. Basement membrane induced cell type specific dormancy of tumor cells. Semmelweis Symposium-Oncology, November 9-10, 2000, Budapest. Abstract book: p. 82-83 R. Harisi, A. Jeney. The importance of the microenvironment in human osteosarcoma biological behaviour and cytostatics treatment. Korányi Frigyes Szakkollégium VI. Tudományos Fóruma, április 19-20, 2001, Budapest. Absztr. sz:6 I. díj és Dékáni Dicséret R. Harisi, G. Pogány, M. Szendroi, A. Jeney. A human osteosarcoma malignus fenotípusának in vivo és in vitro modellezése. Magyar Onkológusok Társasága XXIV. Kongresszusa, november 22-24, 2001 , Budapest. Magyar Onkológia 2001;45(3):267 Harisi R., Dudás J., Timár F., Bocsi J., Szendroi M., Jeney A. Az extracelluláris mátrix szerepe a human osteosarcoma malignus fenotipusában. Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola, Ph.D. Tudományos Napok, június 7-8, 2002, Absztrakt könyv: 47. oldal R. Harisi, J. Dudás, M. Szendroi, J. Lásztity, J. Bocsi, F. Tímár, A. Jeney. Az extracelluláris mátrix komponensek szerepe a human osteosarcoma proliferációjában. A Magyar Ortopéd Társaság 45. Kongresszusa, június 20-22, 2002, Pécs. Magyar Traumatológia, Ortopédia 2002;XLV(S):29 R. Harisi, J. Dudás, G. Pogány, F. Timár, J. Bocsi, M. Szendroi, A. Jeney. Role of extracellular matrix in human osteosarcoma proliferation. 12thAnnual Meeting of the German Society of Cytometry (DGfZ), 15th Heidelberg Cytometry Symposium, 17-19 October, 2002, Heidelberg, Germany. Abstract book: p. 46 R. Harisi, J. Dudás, G. Pogány, F. Timár, J. Bocsi, I. Kovalszky, M. Szendroi, A. Jeney. Extracellular matrix of human osteosarcoma as a potential new therapeutic target.14th EORTC-NCI-AACR Symposium on Molecular Targets and Cancer Therapeutics, 19-22 November, 2002, Frankfurt, Germany. European Journal of Cancer 2002;38(S7):102 IF: 3.562 Harisi R., Dudás J., Szendroi M., Jeney A. Role of extracellular matrix in proliferation of human osteosarcoma. 16th Annual Meeting of the European Musculoskeletal Oncology Society, 7-9 May, 2003, Budapest, Hungary. Sarcoma 2003;7(2):127–128 II. díj R. Harisi, J. Dudás, M. Szendroi, A. Jeney. Role of extracellular matrix in proliferation of human osteosarcoma. A Magyar Ortopéd Társaság 46. Kongresszusa, június 19-21, 2003, Budapest, Magyar Traumatológia, Ortopédia 2003;XLVI(S1),78-79
135
R. Harisi, J. Dudás, F. Timár, I. Kovalszky, M. Szendroi, A. Jeney. Extracellular matrix biopolymers as new targets in the therapy of human osteosarcoma. International Conference on Applied Genomics, 9th ESACP/16th ISDQP Meeting, 1-4 October, 2003, Amsterdam, The Netherlands. Analytical Cellular Pathology 2003;25(5,6):259 IF: 1.255 R. Harisi, J. Dudás, F. Timár, M. Szendroi, A. Jeney. Role of extracellular matrix biopolymers in proliferation of osteosarcoma cells. 13th Annual Meeting of the German Society of Cytometry (DGfZ), 16th Heidelberg Cytometry Symposium (HCS), 16-18 October, 2003, Heidelberg, Germany. Abstract book: p. 28-29 Jeney A., Tímár F., Harisi R., Oláh J., Kenessey I., Babó I., Ötvös L., Süliné Vargha H. A daganatok áttét képzése gyógyszeres kezelésének kísérleti modellezése. Magyar Onkológusok Társasága XXV. Kongresszusa, november 12-15, 2003, Budapest. Magyar Onkológia 2003;47(3):268 Kenessey I., Tímár F., Harisi R., Polony G., Paku S., Oláh J., Kovalszky I., Jeney A. Az extracelluláris mátrix biopolimerjeinek módosító hatása a tumorsejtek vándorlására. Magyar Onkológusok Társasága XXV. Kongresszusa, november 12-15, 2003, Budapest. Magyar Onkológia 2003;47(3):273 R. Harisi, J. Dudás, J. Bocsi, M. Szendroi, A. Jeney. Role of extracellular matrix biopolymers in proliferation of human osteosarcoma. 39th Congress of the European Society for Surgical Research, 12-15 May, 2004, Athens, Greece. European Surgical Research 2004;36(S1):134-135 IF: 0.750
Egyéb onkológiai tárgyú eloadások Piróth Zs., Harisi R. Egy új antileukémiás purin származék hatása a pirimidin nukleotid anyagcserére humán limfocitákban. SOTE TDK Konferencia, február 10-11, 1993, Budapest. Absztrakt könyv: 70. oldal Harisi R., Münch Z. A colorectalis carcinoma klinikai és patológiai klasszifikációjának összehasonlítása. SOTE, TDK Konferencia, február 14-15, 1996, Budapest. Absztrakt könyv: 49. oldal II. díj Harisi R., Szendroi M. Fibrosus dysplasiás betegek sebészi eredményeinek hosszú távú utánkövetése. A Magyar Ortopéd Társaság Kongresszusa, június 20-22, 1996, Nyíregyháza. Harisi R. Fibrosus dysplasia miatt operált betegek hosszútávú utánkövetése. SOTE, TDK Konferencia, február 12-13, 1997, Budapest. Absztrakt könyv: 72. oldal II. díj Münch Z., Harisi R. Vastagbélrák miatt operált betegek utánkövetése. SOTE, TDK Konferencia, február 12-13, 1997, Budapest. Absztrakt könyv: 122. oldal Rektori dicséret
136
Harisi R., Münch Z. Vastag- és végbéldaganat miatt mutött betegek életminoségének vizsgálata. I. Korányi Frigyes Tudományos Fóruma, április 24-25, 1997, Budapest . I. díj Harisi R. Mutéti eljárások hosszú távú eredményei a fibrosus dysplasia kezelésében. I. Korányi Frigyes Tudományos Fóruma, április 24-25, 1997, Budapest. Harisi R. A korai diagnózis és a differenciáldiagnózis szerepe a fibrosus dysplasia kezelésében. SOTE, TDK Konferencia, február 11-12, 1998, Budapest. Rektori dicséret Harisi R., Münch Z. Vastag- és végbéldaganat miatt mutött betegek életminoségének vizsgálata. SOTE, TDK Konferencia, február 11-12, 1998, Budapest. Absztrakt könyv: 65.oldal Harisi R. Colorectalis tumor miatt operált betegek életminoségének vizsgálata egy illetve három évvel a mutétet követoen. Korányi Frigyes Szakkollégium II. Tudományos Fóruma, április 22-23, 1998, Budapest. Különdíj Harisi R. A korai diagnózis és differenciáldiagnózis szerepe a fibrosus dysplasia kezelésé-ben. Korányi Frigyes Szakkollégium II. Tudományos Fóruma, április 22-23, 1998, Budapest. Harisi R., Münch Z., Weltner J., Németh Zs. Vastag- és végbéldaganat miatt mutött betegek életminoségének vizsgálata. Magyar Gasztroenterológiai Társaság 40. Nagygyulése, június 9-13, 1998, Balatonaliga. Absztrakt könyv: 103. oldal Poszter díj Harisi R., Weltner J. Colorectalis tumor miatt operált betegek utánkövetése különös tekintettel az életminoség változására. A Magyar Belgyógyász Társaság 37. Nagygyülése, november 19-21, 1998, Budapest. Magyar Belorvosi Archivum 1998;(S3) :235 Harisi R., Weltner J. Colorectalis tumor miatt operált betegek utánkövetése különös tekintettel az életminoség változására. Korányi Frigyes Szakkolégium III. Tudományos Fóruma, április 21-22, 1999, Budapest. Harisi R., Weltner J., Németh Zs., Bursics A., Morvay K., Flautner L. Analysis of the clinical and surgical staging and their predictive values using the TNM method at colorectal cancer. 41st Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology, 812 June, 1999, Balatonaliga, Hungary. Z. Gastroenterologie 1999;37:420 IF: 0.887 Harisi R., Weltner J., Németh Zs., Flautner L. Colorectalis tumor miatt mutött betegek életminoségének vizsgálata. A Magyar Onkológusok Társaságának XXIII. Kongresszusa, november 11-13, 1999, Budapest. Magyar Onkológia 1999;43( 4):255 Németh Zs., Winternitz T., Kupcsulik P., Weltner J., Harisi R., Flautner L. Intraoperative ultrasound in the management of liver cancer. A Magyar Onkológusok
137
Társaságának XXIII. Kongresszusa, november 11-13, 1999, Budapest. Magyar Onkológia 1999;43(4):257 Harisi R., Weltner J., Flautner L. Predictive value using the TNM method at colorectal carcinoma patients. European Association for Cancer Research Conference XVI, 30 May-5 June, 2000, Halkidiki, Greece. EACR Proceedings Book: p.120 Harisi R., Weltner J., Jeney A., Flautner L. TNM classification and type IV collagenase activity as prognostic factors in colorectal carcinoma patients. 42nd Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology, 6-10 June, 2000, Balatonaliga, Hungary. Z. Gastroenterologie 2000;38:407 Poszter díj IF: 0.887 Harisi R., Flautner L., Weltner J. A TNM rendszer mint prognosztikai faktor colorectalis carcinomában. Pathologus Kongresszus, szept. 21-24, 2000, Eger. Absztr. könyv: 52. oldal Harisi R., Weltner J., Jeney A., Flautner L. A TNM klasszifikáció és a kollagenáz IV aktivitás - prognosztikai faktorok a vastagbélrákos betegeken. Az MGT Colon szekció 12. Tudományos Ülése, október 27-28, 2000, Veszprém. Ferring-díj Harisi R., Flautner L., Schaff Zs., Bodoky Gy., Weltner J. A TNM klasszifikáció mint prognosztikai faktor colorectalis carcinomában. Magyar Klinikai Onkológiai Társaság I. Kongresszusa, november 10-11, 2000 Budapest. Lege Artis Medicinae 2001;11(S1):9 Harisi R., Bodoky Gy., Flautner L., Weltner J. Az életminoség vizsgálata colorectalis tumor miatt kezelt betegeken. Magyar Klinikai Onkológiai Társaság I. Kongresszusa, november 10-11, 2000, Budapest. Lege Artis Medicinae 2001;11(S1):18 Harisi R., Dudás J., Winternitz T., Járay B., Bodoky Gy. Az Irinotecan hatékonyságának elojelzése colorectalis rákban. Magyar Klinikai Onkológiai Társaság I. Kongresszusa, november 10-11, 2000, Budapest. Lege Artis Medicinae 2001;11(S1):13 Harisi R., Jeney A., Flautner L., Weltner J. A TNM rendszer és a matrix metalloproteáz IV szerepe a colorectalis carcinoma diagnosztikájában és terápiájában. A Magyar Belgyógyász Társaság XXXVIII. Naggyulése, november 16-18, 2000, Budapest. Magyar Belorvosi Archivum 2000;(S3):85 Harisi R., Dudás J.,Winternitz T., Járay B., Bodoky Gy. Prediction of irinotecan efficiency in colorectal cancer. 37th Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology, 12-15 May, 2001, San Francisco, CA. ASCO Proceedings 2001;20:Abstract number: 2243 Harisi R., Bodoky Gy., Flautner L., Weltner J. Investigation of the quality of life of patients treated for colorectal cancer. 43rd Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology, 5-9 June, 2001, Balatonaliga, Hungary. Z. Gastroenterologie 2001; 39:394 IF: 0.803
138
Harisi R., Flautner L., Weltner J., Bodoky Gy. Az életminoség mint a kemoterápia hatékonyságát meghatározó tényezo colorectalis tumor miatt kezelt betegekben. A Magyar Onkológusok Társaságának XXIV. Kongresszusa, november 22-24, 2001, Budapest. Magyar Onkológia 2001;45(3):266 Bodoky Gy., Nagy T., Tamás K., Harisi R. Raltitrexed szerepe az elorehaladott vastagbéldaganat kezelésében. A Magyar Onkológusok Társaságának XXIV. Kongresszusa, november 22-24, 2001, Budapest. Magyar Onkológia 2001;45(3):252 R. Harisi, J. Dudás, Gy. Bodoky, T. Winternitz, L. Flautner, J. Weltner. The prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen in colorectal cancer. A prospective study with clinical correlation. 37th Congress of the European Society for Surgical Res., 23-25 May, 2002, Szeged, Hungary. European Surgical Research 2002;34(Sl ):45 IF: 0.903 R. Harisi, J. Dudás, Gy. Bodoky, T. Winternitz, B. Járay, L. Flautner, J. Weltner. Evaluation of clinicopathological variables and proliferating cell nuclear antigen in patients with resected adenocarcinoma of the colorectum. 44th Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology, 4-8 June, 2002, Balatonaliga, Hungary. Z. Gastroenterologie 2002;40:336 IF: 0.837 T. Winternitz, P. Kokas, P. Kupcsulik, R. Harisi, L. Flautner. The role of endoscopic ultrasound examinations of submucosal and extraluminar lesions of upper gastrointestinal tract. 44th Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology, 4-8 June, 2002, Balatonaliga, Hungary. Z. Gastroenterologie 2002;40:365 IF: 0.837 R. Harisi, J. Dudás, J. Weltner, Gy. Bodoky, B. Járay, L. Flautner. Expression of proliferating cell nuclear antigen during colorectal tumorigenesis. 12th World Congress of the International Association of Surgeons and Gastroenterologists, 30 October-2 November, 2002, Istanbul, Turkey. Hepato-Gastroenterology 2002;49(S2):CCXXXI IF: 0.833 Bodoky Gy., Hariszi R., Nagy T., Tamás ? . Elorehaladott vastagbéldaganat elso illetve másodvonalbeli Campto kezelésének eredményessége. A Magyar Klinikai Onkológiai Társaság II. Kongresszusa, november 21-23, 2002, Budapest. Magyar Onkológia 2002; 46/3(S1):23 Harisi R., Bodoky Gy., Flautner L., Weltner J. Colorectal cancer therapy: decision making on basis of quality of life? 6th Annual Meeting of the European Society of Surgery, 28-30 November, 2002, Budapest, Hungary. Abstract book: p. 211-212 Harisi R., Járay B., Dudás J., Bodoky G., Flautner L., Weltner J. Rectal mucosal proliferation and the risk of colorectal adenomas. 45th Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology, 3-7 June, 2003, Balatonaliga, Hungary. Z. Gastroenterologie 2003;4:438 IF: 1.076 Harisi R., Járay B., Dudás J., Bodoky Gy., Morvay K., Friedman G., Flautner L., Weltner J. Proliferation in colorectal adenoma–carcinoma sequence. 19th Congress of the
139
Experimental Surgical Section of Hungarian Surgical Society, 11-13 September, 2003, Siofok, Hungary. Magyar Sebészet 2003;56(3-4):146 R. Harisi, J. Dudás, T. Winternitz, B. Járay, L. Flautner, G. Bodoky. Prognosis for irinotecan efficiency in advanced colorectal cancer. International Conference on Applied Genomics, 9th ESACP / 16th ISDQP Meeting, 1-4 October, 2003, Amsterdam, The Netherlands, Analytical Cellular Pathology 2003;25(5,6):268 IF: 1.255 Bodoky Gy., Hariszi R., Tamás ? . The efficiency of first and second line irinotecan treatment in advanced colorectal cancer. 25th Congress of the Hungarian Cancer Society, 12-15 November, 2003, Szeged, Hungary. Magyar Onkológia 2003;47(3):240 R. Harisi, B. Járay, J. Dudás, Gy. Bodoky, K. Morvay, G. Friedman, L. Flautner, J. Weltner. Proliferative activity in colorectal adenoma–carcinoma sequence. 13th World Congress of the International Association of Surgeons and Gastroenterologists, 3-6 December 2003, Estoril, Portugal. Hepato-Gastroenterology 2003;50(S1):CIXVI IF: 0.837 R. Harisi, B. Járay, K. Morvay, G. Bodoky, L. Harsányi, G. Friedman, J. Dudás, L. Flautner, J. Weltner. Proliferative activity in colorectal adenoma-carcinoma sequence. 12th Congress of the European Society of Surgical Oncology, 31 March-3 April, 2004, Budapest, Hungary. EJSO 2004;30(2):148 Legjobb poszter díj IF: 1.882 R. Harisi, J. Dudás, K. Morvay, J. Weltner, L. Flautner, L. Harsányi, B. Járay, P. Kupcsulik. Changes in distribution pattern of proliferating cells associated with progression of human colorectal benign and malignant tumor. 39th Congress of the European Society for Surgical Research, 12-15 May, 2004, Athens, Greece. European Surgical Research 2004;36(S1):125-126 IF: 0.750 Harisi R., Weltner J., Morvay K., Dudás J., Bodoky G., Harsányi L., Járay B., Kupcsulik P. Relationship between cell proliferation pattern and the adenoma-carcinoma progression sequence of human colorectum. 46th Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology, 1-5 June, 2004, Balatonaliga, Hungary. Z. Gastroenterologie 2004;42:414-415 IF: 1.000 R. Harisi, L. Flautner, J. Weltner. General and specific quality of life: measures of outcome in rectal surgery. 20th Biennial Congress of the International Society of University Colon and Rectal Surgeons. 6-10 June, 2004, Budapest, Hungary. Diseases of the colon and rectum 2004;47(6):100 IF: 2.343 R. Harisi, K. Morvay, J. Dudás, Gy. Bodoky, L. Harsányi, J. Weltner, P. Kupcsulik. Relationship between cell proliferation pattern and the adenoma-carcinoma progression sequence of human colon and rectum. 6th World Congress on Gastrointestinal Cancer, 16-19 June, 2004, Barcelona, Spain. Abstract number:132
140
R. Harisi, J. Weltner, K. Morvay, J. Dudás, L. Harsányi, P. Kupcsulik. The prognostic value of cell proliferation in colorectal adenomas. 144th Falk Symposium, Gastroenterology Week, Gastroenterology Yesterday-Today-Tomorrow: A Review and Preview, 16-17 October, 2004, Freiburg, Germany. Abstract number: 180 Legjobb poszter díj Harisi R., Dudás J., Weltner J., Morvay K., Harsányi L., Járay B., Kupcsulik P. Relationship between the distribution of proliferating cells and the progression of colorectal polyps, adenomas and tumors. 40th Congress of the Hungarian Society of Internal Medicine, 11-13 November 2004, Budapest, Hungary. Magyar Belorvosi Archivum 2004;(S2):67 Németh Zs., Winternitz T., Harisi R., Weltner J., Kupcsulik P. The value of intraoperative ultrasound in the management of primary and metastatic liver malignancies. 47th Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology, 7-11 June, 2005, Balatonaliga, Hungary. Z. Gastroenterologie 2005;43(Abstract number: 92) IF: 1.000 Harisi R., Schaff Z., Winternitz T., Németh Z., Harsanyi L., Morvay K,. Jaray B., Kupcsulik P., Weltner J. TNM staging at colorectal cancer. 47th Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology, 7-11 June, 2005, Balatonaliga, Hungary. Z. Gastroenterologie 2005;43:489 IF: 1.000
141
12 ÖSSZEFOGLALÓ Az osteosarcoma a legfontosabb primer csonttumor a gyerek és serdülo korcsoportban. A kemoterápiára rosszul reagáló betegek (Huvos grade I-II) esetében alkalmazott agresszívebb kemoterápia sem járt sikerrel, ebben az esetben új kemoterápiás célpont meghatározására van szükség, amit vizsgálataink tanúsága szerint az extracelluláris mátrix komponensekben lehet keresni. Vizsgálatainkban az extracelluláris mátrix (ECM) hatását tanulmányoztuk a humán osteosarcoma biológiai viselkedésében és citosztatikumokkal szembeni válaszreakciójában, egy háromdimenziós extracelluláris mátrix modell és egy általunk kialakított humán osteosarcoma sejtvonal (OSCORT) segítségével. Az OSCORT sejtek esetében az ECM stimulálta a sejtproliferációt: az ECM komponensei közül ezért a hatásért foleg a heparánszulfát proteoglikán (HSPG) és a fibronektin a felelos. Az ECM, és a legnagyobb mértékben a HSPG, emellett növelte a ß1 integrin fehérje, a p36(ciklin D1)-p34(cdk4) komplex, a PCNA és a Ki-67 termelodését, valamint a topoizomeráz II aktivitását. Az OSCORT sejtek az ECM és komponensei jelenlétében termelték a mátrix metalloproteináz 9-et és annak aktív formáját is. A legmagasabb aktivitást a HSPG eredményezte. A doxorubicinnel kezelt, ECM-gélen tartott sejtek proliferációja és életképessége szignifikánsan magasabb volt a monolayer-plasztik felszínen tartott sejtekhez viszonyítva, az ECM-hez lehorgonyzott OSCORT sejtek apoptózis rátája a doxorubicin minden dózisa esetén alacsonyabb volt, és javító funkciót is feltételeztünk. Az ECM-gélen szignifikánsan kisebb apoptózis a doxorubicinnel kezelt sejtekben részben a p53 csökkent termelodésével és annak sikertelen sejtmagi lokalizációjával magyarázható. A javító funkciót támasztja alá az a megfigyelés, hogy az OSCORT sejtekben az ECM-gél hatására aktiválódó nukleázt mutattunk ki. Eredményeim új távlatot adhatnak az osteosarcoma doxorubicin kezelését illetoen: a nagy dózisúrövidtávú doxorubicin kezelés a tumor növekedést célozza, a kis dózisú-hosszútávú kezelés a tumor inváziót. Vizsgálatunkban elsoként mutattuk ki az agrin heparánszulfát proteoglikán jelenlétét az OSCORT-ECM-ben. Megállapítottuk hogy a doxorubicin növelte a proteoglikán szintézist, és annak sejten kívüli lokalizációját, a clodronat ugyanakkor foleg az extracelluláris frakcióban csökkentette a glükózamin beépülést. További vizsgálatok igazolták, hogy a clodronat az osteosarcoma sejtek doxorubicin elleni védekezését, a proteoglikán szintézisre kifejtett hatása révén csökkenteni tudta. Vizsgálataim alapján az újonnan leírt, kifejezetten az osteosarcoma daganatos mátrixra jellemzo heparánszulfát proteoglikán az osteosarcoma kezelésének új célpontját jelentheti.
142
13 SUMMARY Osteosarcoma is the most common primary malignancy of the bone in childhood and adolescence. In case of chemotherapy resistant (Huvos grade I-II) patients even the more aggressive chemotherapy was not successful, which indicated the search for new therapeutical targets, outside of the cells, in the extracellular matrix. In this work it was investigated: how the three-dimensional extracellular matrix (ECM) may influence the biological features and response to cytostatic treatments of a self-established osteosarcoma cell line (OSCORT). The ECM induced cell proliferation in OSCORT cells, among the ECM-components: this effect was mainly due to the heparan sulphate proteoglycan (HSPG) and fibronectin. The ECM, and mainly HSPG increased the synthesis of: ß1 integrin, p36(cyclin D1)-p34(cdk4) complex, PCNA and Ki-67, and the activity of topoisomerase II. In the presence of the ECM components the OSCORT cells produced matrix metalloproteinase 9 and its´ active form, the main induction was observed for HSPG. The proliferation and viability of doxorubicin-treated and in the ECM cultured cells were significantly higher than that of the on plastic monolayer cultured cells. The apoptosis rate in the to ECM-attached OSCORT cells was lower by all doses of doxorubicin than in cells cultured on plastic monolayer, moreover, a repair induced by ECM was assumed. The significantly lower apoptosis rate could be explained by the decreased p53 synthesis and cell nuclear localization. The repair might be confirmed by the fact that a nuclease was found in OSCORT cells induced by ECM. The results shown in my dissertation might give new aspects to the doxorubicin therapy of osteosarcoma: a high dose - short-term therapy against tumor growth, and a low dose - long-term therapy against tumor invasion. A novel HSPG, agrin, was detected in the OSCORT-ECM, and was described at the first time. It was found that the doxorubicin increased the proteoglycan synthesis, and its extracellular localization, while the clodronat – mainly in the extracellular fraction – decreased the glycosamin incorporation into the proteoglycan molecules. Further investigation proved that clodronat could abrogate the resistance of osteosarcoma cells against doxorubicin, by its effects on proteoglycan synthesis. The detected novel especially for the osteosarcoma tumorous extracellular matrix characteristic proteoglycans might serve as potent therapeutic targets of osteosarcoma in the future.
143
