Novák, A., Vágvölgyi, Cs., Fekete-Forgács, K., Lenkey, B., Emődy, L., Pesti . M.: Candida albicans morfológiai mutánsok hibridjeinek patogenitása, tapadása akrilátfelszínhez és jellemzése RAPD-PCR és izoenzim analízissel. Magyar Mikrobiológiai Társaság Kongresszusa Balatonfüred, 2001. október 10-12. Novák Anita, Pál Tibor, Vágvölgyi Csaba, Nagy Ágnes, Pesti Miklós Candida albicans telepmorfológiai mutánsok és szomatikus hibridjeik kariotipizálása és kétdimenziós gélelektroforézis (SDS-PAGE) vizsgálata. Magyar Mikrobiológiai Társaság Kongresszusa Balatonfüred, 2002. október 8-10.
Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei
Candida albicans telepmorfológiai mutánsok szomatikus hibridizációja, molekuláris biológiai jellemzése és patogenitásvizsgálata
Egyéb cikkek: Marton, A., Debreczeni, J. és Novák, A.: A macskakarmolási betegség és a Bartonellák okozta egyéb kórképek. Lege Artis Medicinae, 7(7-8) 486-4911, 1997 Czinner, A., Novák, A. és Buncsik, I.: A Sumetrolim szerepe a felsőlégúti infekciók kezelésében egy gyermekbelgyógyászati osztály beteganyagában. Pediáter, 3 249-255, 1997 Kiss, A., Csontay, Á., Pirót, L., Nyirády, P., Novák, A., Gorácz, Gy. és Merksz, M.: Vese echinococcus cysta gyermekkorban. Magyar Urológia, 12:1 64-68, 2000
Novák Anita
Egyéb előadások: Tóth, E., Novák, A., Sageyer-Musa, Szabó, T., Berencsi, Gy. és Mezei, I.: Kanyaró, rubeola és poliovírus ellenanyagok vizsgálata gyermekkorcsoportokban Magyarországon. Magyar Higiénés Kongresszus, 1997. Bekő, G., Novák, A., Újhelyi, R., Holics, K. és Szabó, T.: Cysticus fibrosisban szenvedő gyerekek bakteriológiai vizsgálatának lehetőségei és eredményei. Magyar Infektológiai Társaság Kongresszusa, Debrecen 1999. október 7-9.
Témavezető: Dr. Pesti Miklós
Berencsi György, Domonkos Tatjana, Csohán Ágnes, Novák Anita: A 2000. évi szeroepidemiológiai szűrés eredményei a poliovírusok területén. Budapest, OEK Tudományos Ülés, 2001. 03.06. Egyéb poszterek: Novák, A. és Boiskó, K.: Chlamydia trachomatis kimutatása súlyos kórképekkel járó nőgyógyászati megbetegedésekben egy év vizsgálati anyagából. Magyar Laboratóriumi Diagnosztikai Társaság 49. Kongresszusa, 1999. Siófok Kerényi, M., Pál, T., Novák, A., Mestyán, Gy., Brasch , B., Emődy, L.: HLYA és SHEA gének előfordulásának vizsgálata extraintestinalis Escherichia coli törzsekben. Magyar Mikrobiológiai Társaság Kongresszusa Balatonfüred, 2001. október 10-12.
14
Pécsi Tudományegyetem Természettudományi Kar Biológiai Intézet Általános és Környezeti Mikrobiológiai Tanszék 2002
A dolgozat alapjául szolgáló közlemények: M. Pesti, Cs. Vágvölgyi, T. Papp, A. Nagy and A. Novák: Variation of isoenzyme and RAPD patterns in Candida albicans morphological mutants with altered colony ultrastructure. Acta Biologica Hungarica 52 (2-3) 289-298, 2001 A. Novák, Cs. Vágvölgyi, M. Pesti: Characterization of Candida albicans colony morphological mutants and their hybrids. Folia Microbiologica (in press) M. Pesti, J. Hidasi and A. Novák: Complementation analysis of colony morphological mutants of Candida albicans. Folia Microbiologica 45 (1) 65-96, 2000 A. Novák, Cs. Vágvölgyi, K. Fekete-Forgács and M. Pesti: Isoenzyme and RAPD-PCR analysis and adhesion to acrylic of the hybrids of Candida albicans morphological mutants. Folia Microbiologica 46 (3) 235-258, 2001 Előkészületben (a kutatási program folytatásaként): A. Novák, Cs. Vágvölgyi, L. Emődy, M. Pesti: Isoenzyme and RAPD-PCR analysis and pathogenicity of Candida albicans colony morphological mutants and their hybrids. FEMS Yeast Research (submitted) A. Novák, M. Pesti: Morphogenesis of Candida albicans. Acta Microbiol. Immunol. (submitted) A dolgozat alapjául szolgáló előadások: Novák Anita, Vágvölgyi Csaba, Emődy Levente, Pesti Miklós: Candida albicans telepmorfológiai mutánsok és hibridjeik jellemzése.Budapest, MTA Tudományos Ülés, 2002. 02.21. Novák Anita, Pesti Miklós: Candida albicans morfogenezise. Magyar Mikrobiológiai Társaság Kongresszusa Balatonfüred, 2002. október 8-10. A dolgozat alapjául szolgáló poszterek: M. Pesti, J. Hidasi and A. Novák: Complementation analysis of colony morphological mutants of Candida albicans. XXVIII. Annual Conference on Yeasts 2000. may 15-17, Smolenice (Slovakia) A. Novák, J. Hidasi and M. Pesti: Characterization of somatic hybrid of colony morphological mutants of Candida albicans. International Training Course For Young Scientists May 23-27, 2000. Keszthely A. Novák, Cs. Vágvölgyi, K. Fekete-Forgács and M. Pesti: Isoenzyme and RAPD-PCR analysis and adhesion to acrylic of the hybrids of Candida albicans morphological mutants. XXIX. Annual Conference on Yeasts 2001. may 23-25, Smolenice (Slovakia)
13
1. Bevezetés
8. Változások az SDS-PAGE mintázatban: a.) A legtöbb fehérjesávot az ATCC 10261 törzs adta, a legkevesebbel a VI.9S törzs
A
rendelkezett.
Candida
albicans
opportunista
patogén
mikroorganizmus,
amely
b.) A két szülői törzs fehérjesávjainak száma azonos volt.
kommenzalistaként megtalálható az egészséges ember szájüregében, emésztőtraktusában és
c.) A VI.1M törzs fehérjesávjainak száma a szülői törzsekéhez volt hasonló.
20,7 %-ban az egészséges nők hüvelyében is. A gomba számos olyan tulajdonsággal illetve sejtjeinek felszínén számos olyan faktorral rendelkezik, amelyek lehetővé teszik ennek az állapotnak a fenntartását. Csökkent védekezőképességű egyénben ugyanezen tulajdonságok és faktorok virulencia faktorokként szerepelhetnek, felborítva a gazdaszervezet és a gomba között fennálló egyensúlyt, amely akár halálos kimenetelű szepszishez is vezethet. Az általa okozott kórképek sokfélesége miatt az egyik legveszélyesebb humánpatogén gombának tekintik. A Candida albicansban virulencia faktorként tartják számon a dimorfizmust, a morfogenezist, az adhéziós képességet, valamint különböző extracelluláris enzimek termelését. A Candida albicans az antimikotikum terápiára, a szervezet immunválaszára és a szervezetben lezajló változásokra gyors alkalmazkodással válaszol. Ennek alapja a fent említett virulencia faktorok kifejeződése, a virulencia gének expressziója, valamint a gomba különböző megjelenési formáinak (sarjadzó sejt, pszeudohifa, valódi hifa) antigén - variabilitása. A szervezetben lejátszódó, a Candida albicans tulajdonságaiban bekövetkező változás nemcsak a fenotípus, hanem a genotípus szintjén is jelentkezhet az izoenzim és RAPD-PCR mintázatban, a kariotípusban és a virulenciában bekövetkezett változásokat okozva. Az adhézió a kolonizáció előfeltétele és a fertőzés első lépcsőjét jelentheti. A gomba tapadhat epiteliális sejtekhez, endoteliális sejtekhez, szolubilis faktorokhoz, extracelluláris mátrixhoz valamint a gazdaszervezetben előforduló inert felületekhez (implantátumok). A gomba tapadási képessége inert és biológiai felszínekhez szoros korrelációt mutat a virulenciával. A Candida albicans által létrehozott infekciókban fontos szerepe van a gazdaszervezet immunrendszerének illetve olyan tényezőknek, amelyek hajlamosíthatnak az infekcióra. Napjaink transzplantáltak,
8
legveszélyeztetettebb
csoportjai a
HIV fertőzöttek
és
a
akiknél az immunszupresszív állapot megkönnyíti a Candida infekció
5
kifejlődését. A HIV pozitív betegek között több, mint 60 %-ban fordul elő orofaringeális Candida infekció. Csontvelő transzplantált betegekben 12 %-ban fordul elő disszeminált candidiázis.
4. Izoenzim mintázat megváltozása: a.) A vad típusú és a mutagenezissel létrehozott szülői törzsekben nem volt eltérés az izoenzim mintázatban. b.) A két hibrid mintázata különbözött egymástól, és míg a VI.9S törzsé megegyezett a szülői mintázattal, addig a VI.1M törzsé különbözött attól. 5. Változás a kariotípusban: a.) A vad típusú és a két szülői törzs egyaránt 8-8 kromoszómával rendelkezett, tehát a mutagenezis nem volt hatással a kariotípusra. b.) A hibridek kromoszómaszáma több volt, mint a szülőké, azonban nem voltak 4n kromoszómaszámúak, ami a fúzió után létrejövő genetikai instabilitással magyarázható. c.) A VI.1M hibrid kromoszómaszáma nagyobb volt (12), mint a VI.9S hibridé (10). 6. RAPD-PCR mintázatban jelentkező változások: a.) A nyolc primer közül öt nem mutatott különbséget a vad típusú és a két szülői típus mintázata között. b.) A két hibrid mintázata egyetlen esetben sem egyezett
meg sem a szülői
törzsekével, sem egymással. c.) Fúzió után a hibridekben a szülői törzseknél nem detektált sávok jelentek meg. 7. Változások a patogenitásban illetve virulenciában: a.) Minden törzs patogénnek bizonyult, de virulenciájuk eltérő volt. b.) Legvirulensebb a csak blasztospórát tartalmazó vad típusú törzs volt. c.) Legkisebb virulenciával a csak valódi hifát képző telepmorfológiai szülői törzs rendelkezett (M5). d.) A blasztospórát és pszeudohífát tartalmazó telepmorfológiai szülői törzs (M2) virulenciája magas volt, de nem érte el a vad típusú törzsét. e.) A VI.1M törzs virulenciája az M5, a VI.9S törzsé az M2 törzs virulenciájához hasonlított.
8
5
5. Összefoglalás
2. Célkitűzések A külső környezeti tényezők megváltozására a Candida albicans dimorfizmussal és
1. Összefüggés a Candida albicans telepmorfológiája és a sejttípus között: a.) A Candida albicans sima felszínű telepei csak blasztospórát tartalmaztak, míg a
morfogenezissel válaszol. Ezek a környezeti tényezők nemcsak a szervezeten kívül vannak
rögös felszínű telepek vagy csak valódi hifa, vagy a blasztospóra és a pszeudohifa különböző
hatással a mikroorganizmusra, hanem a gazdaszervezeten belül is. A szervezeten belül
arányainak keverékéből álltak.
jelentkező hatások (pl.: pH, szérum, aminosavak) előidézhetik a morfogenezist, amely
b.) A protoplasztfúzió után létrejött új, megnyúlt, átmeneti sejttípus, amely a pszeudohifához hasonlított, szintén rögös telepmorfológiát hozott létre.
megnehezítheti a gomba elleni sikeres védekezést mind a gazdaszervezet mind a terápia szempontjából. Ugyanis a blasztospóra és a pszeudohifa, valamint a hifa felszínén különböző antigén-determinánsok expresszálódhatnak, amelyek befolyásolhatják a virulenciát. Kísérleteinkben modellezni kívántuk a szervezetben lejátszódó morfogenezist, amely
2. Az öröklődés vizsgálata: a.) A sima felszínű és a telepmorfológiai mutánsok - melyek blasztospóra és
nemcsak a sejttípus, hanem a telepmorfológia megváltozásával is együtt jár. Ennek érdekében
pszeudohifa keverékéből álltak – között létrehozott sima telepmorfológiájú hibridek azt
indukált mutagenezissel telepmorfológiai mutánsokat állítottunk elő. Ez lehetőséget teremtett a
bizonyítják, hogy a morfomutációért felelős gének ezekben az esetekben recesszíven
morfogenezis során bekövetkező morfológiai, genetikai és patogenitási változások
öröklődtek. Ha azonban a telepmorfológiai mutáns valódi hifát képzett, a létrejött hibrid rögös
tanulmányozására.
telepmorfológiájú volt, tehát a gének ebben az esetben szemi-domináns módon öröklődtek. b.) Telepmorfológiai mutánsok – ahol az egyik szülő valódi hifát, a másik blasztospórát
és
pszeudohifát
tartalmazott
–
között
létrehozott
hibridek
rögös
Célkitűzéseink a következők voltak:
telepmorfológiájúak voltak, ami arra utalt, hogy komplementáció nem következett be a
1.
morfomutációért felelős gének között. Azonban ennél a fúziónál izoláltunk egyetlen hibridet,
telepmorfológiája és a telepeket alkotó sejttípus közötti összefüggés vizsgálata.
amely sima telepeket képzett, tehát itt bekövetkezett a komplementáció.
2.
c.) Ha mindkét telepmorfológiai mutáns szülő blasztospóra és pszeudohifa keverékét
Az indukált mutagenezissel (MNNG, UV) létrejött Candida albicans mutánsok Telepmorfológiai
szinten
jelentkező
változások
domináns
vagy
recesszív
öröklődésének vizsgálata protoplasztfúzió segítségével.
tartalmazta, a hibridek sima telepmorfológiával jelentek meg azt bizonyítva, hogy
3.
Protoplasztfúzió után változik-e a sejtek mérete, alakja.
komplementáció történt a morfomutációért felelős gének között.
4.
A létrejött mutánsokban illetve létrehozott hibridekben milyen genetikai változások
3. A sejt méretének, alakjának változása:
5.
jelentkeznek a génexpresszió szintjén az izoenzim mintázatban. a.) Csak két fúzió (V-VI) esetében tapasztaltunk változást, mind a sejt méretében,
A külső hatásokra (mutagenezis) létrejött telepmorfológiai változás illetve a
protoplasztfúzió előidéz-e, és ha igen, milyen mértékű kromoszómális újraszerveződést a
mind a sejt alakjában. A létrejött hibrid megnyúlt sejtjeinek átlagos hosszúsága 6 µm volt.
kariotípus szintjén.
Mindkét esetben az egyik szülő valódi hifát képzett.
6.
A morfogenezis és a protoplasztfúzió hatása a RAPD-PCR mintázat szintjén
jelentkező genetikai variabilitásra.
8
5
7.
A telepmorfológia és az ezzel összefüggő egyes sejttípusok hatása a gomba
4.8. Kariotipizálás
patogenitására illetve virulenciájára.
A vad típusú és a két szülői törzs 8-8 kromoszómával rendelkezett. A két hibrid
8.
kromoszómaszáma eltérő volt, nem egyezett sem a szülői törzsekével, sem egymással. A
A mutagenezis és a szomatikus hibridizáció hatása a fehérjeszinten megnyilvánuló
genetikai változásokra az SDS-PAGE mintázatban.
pulzáló gélelektroforézis eredményei alapján igazoltuk, hogy a VI.1M kromoszómaszáma 12, a VI.9S hibridé 10.
8
5
hibrid
4.4. Tapadás inert felszínhez
3. Módszerek
A 16 és 20 órás tapadási eredmények szignifikáns különbséget nem mutattak. A csak fonalas formát képző szülői törzs tapadása akrilátfelszínhez gyenge volt, és a VI.1M hibrid tapadása is
Kísérleteinkben vad típusú csak blasztospórát képezőCandida albicans törzsből (S1) indukált
ehhez hasonló eredményt adott. A másik szülői törzs adhéziója a vad típusú törzséhez
mutagenezissel létrehozott két telepmorfológiai mutánst (szülői törzsek: az M2 blasztospóra és
közelített és ehhez hasonló eredményt mutatott a VI.9S hibrid is.
pszeudohifa keverékét, az M5 csak valódi hifát tartalmazott) illetve a közöttük Ca2+-PEG indukálta szomatikus fúzióval létrehozott hibrideket (VI.1M, VI.9S) vizsgáltuk különböző
4.5. Patogenitásvizsgálat egérben
módszerekkel.
Mind az öt törzs patogénnek bizonyult, bár a törzsek virulenciája nagyfokú különbséget mutatott. Legnagyobb virulenciával az S1 törzs rendelkezett, míg legkevésbé virulens az 6
átmeneti sejttípust képező VI.1M hibrid volt. A vad típusú törzs még 4x10 CFU értéknél is 8
100 %-os elhullást okozott, míg a fonalas szülői törzs és a VI.1M hibrid 10 CFU értéknél sem
3.1. Pásztázó elektronmikroszkóp A 2,5 %-os glutáraldehid, majd 2 %-os ozmium-tetraoxid oldatban fixált sejteket növekvő koncentrációjú etanolban dehidráltuk és a sejteket száradás után arannyal bevontuk.
okozta az állatok teljes pusztulását. Az M5 és a VI.1M, valamint az M2 és VI.9S törzsek virulenciája hasonló volt.
3.2. DNS mennyiségi meghatározás áramlási citométerrel A sejteket egy éjszakán keresztül etanolban fixáltuk, RNáz kezeléssel eltávolítottuk az RNS-t,
4.6. RAPD-PCR vizsgálat
majd propidium-jodid oldattal festettük a DNS-t.
A vizsgált primereknél öt esetben (OPC 02, OPC 05, OPC 18, OPC 19 és OPC 20) a vad típusú és a szülői törzsek azonos mintázatot mutattak. A VI.1M törzs mintázata egyetlen
3.3. Izoenzim vizsgálat
primer esetében sem egyezett meg a másik négy törzs mintázatával, bár hasonlóságot mutatott
A gombasejteket –20 °C-on megfagyasztottuk és folyékony nitrogénben porrá törtük.
az M5 fonalas szülői törzs mintázatával. A VI.9S törzs mintázata egyetlen esetben (R 108)
Extrakciós puffer hozzáadásával feltártuk a fehérjét, amelyhez brómfenolkék oldatot adtunk. A
azonos volt az M2 szülői törzs mintázatával, a többi esetben a két törzs hasonló mintázatot
minták futtatása 120 V-on, egy éjszakán keresztül, 7,5 %-os futtató gélen történt.
mutatott. A legnagyobb mértékű polimorfizmust az R 108 primer használata során tapasztaltuk..
3.4. Tapadás inert felszínhez Inert felszínként akrilátot használtunk. Az akrilát lapokat (0,5x0,5x0,1 cm) 2,5 ml 5x107/ml
4.7. SDS-PAGE vizsgálat
koncentrációjú sejtszuszpenzióban 30 °C-on, 1 órán át „fej-láb” rázattuk. Az inkubálás után a
A legváltozatosabb fehérje mintázat a vad típusú törzsnél lehetett megfigyelni. A két szülői
lapokat steril PBS-sel lemostuk, hogy eltávolítsuk a nem tapadt Candida albicans sejteket,
törzs azonos mintázatot mutatott, azonos mennyiségű fehérje sávval. A VI.1M hibrid
majd az akrilát lapokat 5-5 ml YPD tápoldatba helyeztük és 16 illetve 20 órán keresztül 30 °C-
fehérjesávjainak száma a szülői törzsekéhez volt hasonló. A legkevesebb fehérjesávval a VI.9S
on inkubáltuk. A gombasejtek mennyiségét fotometrálással határoztuk meg (λ=640 nm). Az
hibrid rendelkezett.
adhéziós képesség összehasonlíthatóságának érdekében az optikai denzitást az akrilát lapok felületére (cm2) vonatkoztattuk.
8
5
3.5. Patogenitásvizsgálat egérben
4. Eredmények
A kísérletben 10-12 gramm tömegű nöstény CFLP (Carworth Farm Lane Petter) specifikus patogén mentes egereket használtunk, amelyeket a ketrecekben ötös csoportokban helyeztünk
4.1. Pásztázó elektronmikroszkóp
el.
A vad típusú (S1), 8
a blasztospóra és pszeudohifa keverékét tartalmazó telepmorfológiai
A gombatörzsek sejtszámát 10 /ml-re állítottuk be. A törzsszuszpenzióból 1:5, 1:25 és 1:125
mutáns (M2) és a sima telepeket létrehozó hibrid (VI.9S) blasztospórái hasonló méretűek
hígításokat készítettünk PBS-ben. A szuszpenziókból 500-500 µl-t oltottunk az egerek
voltak; átlagos átmérőjük 2,5 µm volt. A valódi hifát képző telepmorfológiai mutáns szülői
farokvénájába. Törzsenként illetve hígításonként 5-5 egeret oltottunk. Az egerek túlélését 21
törzs (M5) hifáinak átlagos átmérője 2 µm volt (1,5-2,5 µm), hosszúsága 6-20 µm között
napon át követtük napi egyszeri ellenőrzéssel.
változott. A szabályosan-ráncos telepeket képező hibrid (VI.1M) egy teljesen új, a természetben elő nem
3.6. RAPD-PCR vizsgálat
forduló, megnyúlt sejttípust hozott létre, amelyeknek átlagos átmérője 2 µm, hosszúsága 6 µm
A gombasejteklet –20 °C-on megfagyasztottuk és folyékony nitrogénben porrá törtük.
volt.
Centrifugálás után a felülúszóhoz azzal azonos térfogatú jéghideg LETS puffert mértünk és fenol:kloroform:izoamilalkohol (25:24:1) segítségével tártuk fel a DNS-t. A feltárt nukleinsavat TE pufferben vettük fel. A RAPD-PCR mintázat megállapításához nyolc különböző, 10 bázispár hosszúságú oligonukleotid primert használtunk. S1
M5
VI.1M
3.7. SDS-PAGE vizsgálat A sejteket 5 mg/ml koncentrációjú Trichoderma Lysing Enzyme oldatban protoplasztáltuk. 8
4.2. DNS mennyiségi meghatározás áramlási citométerrel
Ozmotikus stabilizátorként 1 M szorbitolt használtunk. 4x10 sejthez 200 µl mintapuffert
Az S1, az M2 és M5 törzsek DNS mennyisége azonos volt. A VI.1M hibrid rendelkezett a
adtunk. 8 µl mintát 12,5 %-os gélen 1 órán keresztül 120 V-on futtattunk. Futtatás után a gélt
legnagyobb mennyiségű DNS-sel, míg a VI.9S hibrid DNS mennyisége nagyobb volt, mint a
egy éjszakán át gyors kimosó oldatban tartottuk, utána 3 órán keresztül festettük, majd kimosó
szülői törzseké, de kisebb, mint a másik hibridé.
és tároló oldatban differenciáltuk. 4.3. Izoenzim vizsgálat 3.8. Kariotipizálás
Az S, az M2, az M5 és a VI.9S törzsek mintázata mind a négyfajta vizsgált izoenzim (glükóz-
A kromoszómális DNS kivonása Doi és munkatársai (1992) módszere alapján történt. A
6-foszfát-dehidrogenáz,
kromoszómákat 1 % agaróz/TBE pufferben választottuk szét.
megegyezett. A VI.1M törzs mintázata minden esetben eltért a többi törzs mintázatától.
8
kataláz,
glutamát-dehidrogenáz,
5
malát-dehidrogenáz)
esetében
