A VÉRKERINGÉSI RENDSZER ADAPTÁCIÓJA GRAVITÁCIÓS TERHELÉSHEZ: SZISZTÉMÁS HEMODINAMIKAI ÉS REGIONÁLIS VASZKULÁRIS VÁLASZOK AKUT, ILLETVE KRÓNIKUS ORTOSZTÁZISRA
Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei Raffai Gábor
Programvezet : Dr. Monos Emil Témavezet : Dr. Monos Emil
Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományi Doktori Iskola Klinikai Kísérleti Kutató– és Humán Élettani Intézet Budapest, 2006.
Bevezetés: okfejtés, kérdésfeltevés A filogenezis legrégebbi élettani adaptációs mechanizmusai a szárazföldi állatokban nagy valószínséggel a gravitációval szemben alakultak ki, mivel az ott ható nehézségi er nagyságrendekkel haladja meg a tengerben érvényesült. Mindemellett, a szárazföldi lét gravitációs stresszhez történ alkalmazkodási kényszere az evolúciós változások egyik legfontosabb szelekciós tényezje lehetett. A felegyenesedett testhelyzet emberben további, az ortosztatikus toleranciát támogató mechanizmusok kialakulását, illetve koordinált mködését tette szükségessé. Ezek adaptív funkciója mind nyugalomban, mind pedig aktivitás során nélkülözhetetlen, mivel az emberi szervezetet különböz gyakorisággal éri fokozott, illetve csökkent gravitációs terhelés helyváltoztatáskor, fenntartott álló testhelyzetben, pozitív, illetve negatív gyorsulással történ földi és légi utazáskor, hosszantartó ágynyugalomban, valamint a súlytalanság állapotában rutazások folyamán. A fentiek miatt, évtizedek óta intenzív kutatás tárgyát képezik a vérkeringési rendszer gravitációs erhatásokat rövid és hosszú távon ellensúlyozó szabályozási mechanizmusai. Ezek megbomlása, vagy teljes hiánya az ortosztatikus intolerancia tüneteihez, így ortosztatikus ödemához, ortosztatikus hipo- és hipertenzióhoz, visszérbetegséghez vezethet. A baroreceptorokból, a vesztibuláris rendszerb l és a szomatikus graviceptorokból kiinduló idegi reflexek, valamint a katekolaminok, a renin-angiotenzin rendszer és a vazopresszin által közvetített hormonális mechanizmusok a kardiovaszkuláris rendszer rövid távú antigravitációs védekez mechanizmusainak jól ismert meghatározó részét képezik. Hosszú távú rutazások, hosszantartó ágynyugalom, vagy civilizációs ártalmak, így a mozgásszegény életmód következtében a fenti szabályozási mechanizmusok mködésének readaptációját igényelhetik, máskülönben elégtelenné válhatnak. Hatékony kompenzáló mechanizmusok hiányában, például álló testhelyzetben, a vér vénás torlódása miatt a vénás visszaáramlás és a szívperctérfogat egyaránt csökken, mely a leggyakoribb orhosztatikus szimptómához, az ortosztatikus hipotenzióhoz, végül ájuláshoz vezethet. A változó gravitációs terhelési körülmények között az ortosztatikus tolerancia biztosításához tehát a gravitációs er hatásainak leginkább kitett alsó végtagi erek – különösen a nagyon tágulékony vénák – tónusának szabályozása is jelentsen hozzájárulhat. Munkacsoportunk a végtagi erek számos, az ortosztatikus toleranciát potenciálisan támogató, különböz – szisztémás, szöveti és szubcelluláris – szint élettani mechanizmusát tárta fel a gravitációs terheléshez történ hosszú távú alkalmazkodás kísérletes tanulmányozása során. A vizsgálatok egy része a humán alsó és fels végtagi vénák adaptív tulajdonságainak összehasonlítására is kiterjedt. Az ortosztatikus életmód okán lényegesen hosszabb ideig terhelt humán saphenális vénákon sikerült kimutatni, hogy – szemben a brachio-cephalikus régió ereivel – azok nyomás indukálta miogén tónusa jelents mérték és feszültség- valamint Ca2+-függ K+ ioncsatornákon keresztül ellenregulálódik. Kéthetes fokozott gravitációs terhelés kísérletes ortosztázis révén patkányok hátsó végtagi oxidatív izmaiban a mikroér denzitást csökkentette; a végtagi vénák hálózati jellemzi közül a véna saphena átmérjét növelte, míg ezen ágrendszer elágazódási szögeit csökkentette. A megnövekedett gravitációs stressz a véna saphenában a simaizom membrán depolarizációjához kapcsolt miogén értónus megkétszerezdését indukálta. E tónusnövekedés a simaizomsejtek számának növekedésével járt együtt a falvastagság változatlansága mellett. Munkacsoportunk legújabb eredményei szerint, patkány krónikus ortosztatikus modellben, a vena és arteria saphena adventitiális innerváció denzitása jelentsen ntt a mells végtagi erekkel, illetve a kontrollokkal szemben. Mindez azt mutatja, hogy a végtagi és ezen belül különösen a saphena régió vaszkuláris szabályozási -1-
mechanizmusainak további tanulmányozása az ortosztatikus toleranciát támogató mechanizmusok mélyebb megismerése céljából egyértelmen indokolt. E területen szerezett újabb tudományos alapismeretek gyakorlati segítséget nyújthatnak a fokozott gravitációs terhelésnek kitett érterületek várható elváltozásainak elrejelzésében, illetve azok kóros következményeit megelz intézkedések kidolgozásához ember esetében is. A PhD tézisem tárgyát képez kutatási programmal az akut és a krónikus ortosztatikus testhelyzethez történ kardiovaszkuláris alkalmazkodás újabb mechanizmusait kívántuk feltárni egyrészt a szisztémás hemodinamikai, másrészt a lokális endothelium szint változások tanulmányozásával éber fej-fel tilt kísérletes modellben. Az ortosztatikus testhelyzet által indukált akut keringési válaszok nyomon követése éber állatokon azért indokolt, mert az eddigi vizsgálatok kevésbé fókuszáltak a kezdeti tranziens változásokra, melyek pontosabb elemzésével a hosszú távú következmények mélyebben megismerhetk s esetleg prognosztizálhatók is lennének. Ugyanekkor a publikált adatok meglehetsen ellentmondásosak, feltehetleg azért, mert a mérések vagy altatásban, vagy pedig teljes mozgás restrikció mellett történtek. E modellekben a tilt testhelyzet az állatok vérnyomását vagy nem változtatta meg, vagy pedig csökkentette. A hosszú távú alkalmazkodás vizsgálata során – a már korábban munkacsoportunk által felismert miogén, lokális neurális és érhálózati mechanizmusokon túl – az endothelium lehetséges szerepét kívántuk feltárni. E hemodinamikai hatásoknak közvetlenül kitett hatalmas felület sejtjeinek szekretoros vezikuláris rendszere, a simaizom tónus és egyéb vaszkuláris funkciók befolyásolásán keresztül, szintén részt vehet a vérkeringés helyi adaptációjában is és ezáltal az ortosztatikus tolerancia támogatásában.
-2-
A fenti okfejtésb l kiindulva specifikus kérdéseinket, s a megfelel kísérletes protokollokat e két témakörre fókuszálva dolgoztuk ki. I. A munkacsoportunk által kifejlesztett eredeti tilt módszer és a korszer telemetriás méréstechnika kombinálásával rövid id tartamú ortosztatikus terhelésnek – 5 és 120 percig – kitett állatok esetében a következ kérdésekre kerestük a választ: I.1. A rövid, 5 perces kísérletes ortosztázis artériás vérnyomásra gyakorolt hatását képes-e kompenzálni a patkány kardiovaszkuláris rendszere? I.2. Különböznek-e a ciklikusan, 5 percenként ismételt, 5 percen át tilt helyzetnek kitett állatok hemodinamikai válaszai az órákon át fenntartott tiltre adott válaszoktól? I.3. Az ortosztatikus szimptómák között kevésbé gyakori ortosztatikus hipertenzó jelensége megfigyelhet-e patkányokban? I.4. Milyen mechanizmussal következnek be a fenntartott ortosztázissal indukált vérnyomás válaszok, azok farmakológiásan befolyásolhatóak-e? I.5. Megváltozik-e a magas vérnyomásos állatok hemodinamikai válasza fej-fel tiltre a normotenzívekéhez képest? I.6. A kísérletesen létrehozott magas vérnyomásos állapot megváltoztatja-e az állatok lokomotoros magatartását a normotenzív állapothoz képest? II. A hosszú id tartamig (2 hét) ortosztatikus terhelésnek kitett állatok esetében – fény és elektronmikroszkópos, immunhiszto- és immuncitokémiai, valamint morfometriai eljárásokat a speciális tilt technikával kombinálva – az alábbi kérdésekre kerestük a választ: II.1. Megváltoztatja-e az in vitro immerziós fixálás, az egész test fixációhoz képest, az endothelium morfológiáját a végtagi vénákban és artériákban? II.2. Az immerziós fixálás során a patkány végtagi vénák endotheliumában képzd világos vakuolumok fiziológiás, pathológiás, vagy arteficiális elváltozásnak tekinthetk-e, változike mennyiségük tartós fej-fel tilt helyzet hatására? II.3. Az általunk felismert endotheliális denz vezikulák lehetnek-e apoptótikus termékek, lehet-e fiziológiás szerepük, tartalmaznak-e bioaktív mediátorokat (endothelin, PDGF)? II.4. Különbözik-e a végtagi erek endotheliumában talált szekretoros típusú denz vezikuláris képletek mennyisége a különböz artériákban és vénákban; változik-e mennyiségük krónikus fej-fel tilt hatására? II.5. Korrelál-e a szekretoros vezikulák krónikus tilt hatására bekövetkez mennyiségi változása a szisztémás vérplazma endothelin szintjeivel?
-3-
Módszerek Ortosztázis modell tilt technikával Feln tt patkányok különböz idtartamokig fenntartott ortosztatikus gravitációs terheléshez történ alkalmazkodását saját fejlesztés, 65cm hosszú, transzparens, cs alakú, dönthet ketrecekben vizsgáltuk. Ezekben az akut, illetve a krónikus tilt kísérletek során az állatok hosszirányú mozgását vagy korlátoztuk, vagy pedig szabadon mozoghattak a ketrec teljes hosszában ad libitum táplálék és víz hozzáférés mellett. Korábbi vizsgálatok során megállapításra került, hogy az állatok sapheno-femorális vénás nyomása a 45°-os fej-fel tilt helyzet gravitációs hatására megduplázódik. Kardiovaszkuláris válaszok telemetriás vizsgálata ismételt és fenntartott akut tilt során Kísérleteink els részéhez 26db (300-350g), telemetriás jeladóval krónikusan instrumentált Wistar patkányt használtunk. Altatás mellett a telemetriás jeladót az állat hasüregében helyeztük el, a csatlakozó nyomásmér kanült az abdominális aortába, míg bipoláris EKG elektródjait II-es pozícióban szubkután rögzítettük. Az állatok 10 napos lábadozását követen az artériás középnyomás (BP), a szívfekvencia (HR), a testh mérséklet (T), valamint a szomatomotoros (LA) jeleket telemetriás antennával vettük és számítógéppel regisztráltuk. Kísérletes magas vérnyomást az ivóvízben adagolt nitrogén monoxid szintáz (NOS) inhibitor NG-nitro-L-arginine-methyl-esterrel (L-NAME, 1mg/ml) idéztünk el. A telemetriás jelekb l, a diurnális vizsgálatok és a tilt tesztek során, 10 másodperces mintákat félóránként, illetve 10 másodpercenként vettünk. A hagyományos ketrecekben normál kontroll (NC), a tilt ketrecek horizontális helyzetében az akkomodációt követen pedig úgynevezett horizontális kontroll (HOR) állatokon is végeztünk méréseket. Ezt követen a felváltva alkalmazott tilt teszteket (45°-os fej-fel tilt, HUT) vagy 5 percenként 5 perc szünetekkel 3-szor ismételtük (3x5min HUT), vagy pedig az ortosztatikus testhelyzetet fenntartottuk 120 percig (120min HUT). A 120min HUT-ra kapott vérnyomás válaszok hátterében álló mechanizmus felderítése céljából a kísérleti állatokat vagy 120 percig vízszintes pozícióban tartottuk, vagy pedig farmakológiásan prazosinnal (10mg/bw, p.o.) illetve szubanesztéziás dózisú chloralose-sal (26mg/kg, i.p.) elkezeltük. Endotheliális vakuolumok és szekretoros vezikulák vizsgálata krónikus ortosztatikus terhelést követen Kísérleteink e másik csoportjában 75db Sprague-Dawley (300-400g) patkányt használtunk fel. A krónikus ortosztatikus testhelyzet (HUT) hatását a fentiekben leírt dönthet csketrecben 2 hétig fej-fel tilt pozícióban tartott állatokon vizsgáltuk, parallel kontrollként vízszintes testhelyzet korlátozott mozgású (CC) és NC patkányok szolgáltak. A ketrecekb l az állatokat napi fél- egy órára eltávolítottuk a fiziológiás „grooming” aktivitás biztosítása céljából, mely id tartam alatt a testsúlyt, valamint a táplálék- és a vízfogyasztást mértük meg, s megtisztítottuk a ketreceket. Az endotheliális vakuólumok és az elektron denz vezikulák vizsgálatához az altatott patkányok egy részében a saphenalis és brachialis artériákat és vénákat (SA, SV, BA, BV) óvatosan kipreparáltuk, majd immerziós technikával fixáltuk. A kísérletek másik részében az állatokat az aortán keresztül fiziológiás nyomásf mellett egész test fixáltuk és a kimetszett érdarabokat posztfixáltuk. A -4-
szövetdarabokat, a fixálást és a beágyazást követen, fény- illetve elektronmikroszkópos vizsgálatokra készítettük el. Az immerziós fixálás termékeként a véna endothelium sejtekben megjelen vakuólumok fénymikroszkópos tanulmányozásához a félvékony metszeteket toluidin kékkel, valamint hematoxylin-eosinnal festettük. Az elektron denz vezikulák elektronmikroszkópos vizsgálatát egész test fixációt, valamint uranil-acetát és ólom-citrát festést követen ultravékony metszetekb l végeztük, melyekben az endotheliális sejtkárosodásra utaló lipid tartalom elektron denz granulumok formájában jelenik meg. A lizozomális és nem lizozomális citoplazmatikus programozott sejthalálra jellemz ultrastruktúrális savanyú-foszfatáz meghatározásához Novikoff és munkatársainak (1971) módosított módszerét alkalmaztuk, mely szerint az ultravékony metszetekben a savanyú foszfatáz elektron denz területek formájában jelentkezik. A fenti preparátumokban a vakuólumok és a denz vezikulák területének kvantitatív meghatározását digitalizált képekb l számítógépes planimetriai program segítségével végeztük. Mindkét esetben elször az endothelium luminális és abluminális kontúrja került körberajzolásra. Ezt követen, e területen belül megmértük a vakuólumok, illetve a denz vezikulák területét és azt a teljes endotheliális keresztmetszeti felület százalékában adtuk meg. A denz vezikuláris struktúrák mediátor tartalmának azonosításához az ér szegmentumokból készült metszeteken immunhiszto- és immuncitokémiai módszereket alkalmaztunk. Az egésztest fixálás után a szövetdarabokat poliklonális nyúl anti-endothelin1, vagy anti PDGF-BB primer antitestekkel inkubáltuk. Az immunfestésre Avidin-Biotin kit-et használtunk standard protokolt követve, majd az ultra vékony metszeteket elektronmikroszkópos technikával értékeltük. Plazma endothelin szintek meghatározása Mindhárom kísérleti csoportban (NC, CC, HUT; n=3x3) az altatott állatokból levett vérminták endothelin plazmaszintjeit specifikus és érzékeny ELISA kit segítségével határoztuk meg. Statisztikai próbák Eredményeinket átlag±SEM formában adtuk meg. Az egyes kísérleti csoportokban a vakuolumok és a denz vezikulák mennyisége közötti szignifikáns különbség meghatározásához egyutas variancia analízis, valamint páronkénti összehasonlításhoz Student–Newman–Keul, vagy Dunnett módszerét alkalmaztuk. A telemetriás kísérletekben a diurnális és ortosztatikus vizsgálatok paramétereinek (BP, HR, T, LA) összehasonlításához kétutas, vagy egyutas ismételt méréses varianciaanalízist, valamint Tukey- illetve Dunnett féle ″post hoc″ teszt került alkalmazásra. Az egyes paraméterek páronkénti (normotenzív vs. hipertenzív) összehasonlításához t-tesztet használtunk. Az eredményeket p<0,05 esetén tekintettük szignifikánsnak.
-5-
Eredmények Ismételt és fenntartott fej-fel tilt hatásai normotenzív és hipertenzív állatokban A normotenzív patkányok behelyezése a tilt ketrecbe vízszintes pozícióban jelentsen megemelte BP-t. Az átlagos BP és HR értékek a horizontális testhelyzetben a 3x5min és 120min HUT kísérleti állatokon 115,4±1,4 Hgmm/386,4±7,0 BPM és 113,7±1,6 Hgmm/377,9±8,8 BPM voltak. Az ismételt és a fenntartott HUT testhelyzet – 3,8 Hgmm hidrosztatikus komponenst magába foglalva – 4,5, illetve 8,4 Hgmm-el reverzibilisen növelte az állatok BP-t, míg a HR és T értéke nem változott szignifikánsan. A NOS gátlása a HOR kontroll id szakában szignifikáns BP emelkedést és HR csökkenést indukált mind a 3x5min HUT (138,4±2,6 Hgmm/342,1±12,0 BPM), mind pedig a 120min HUT (140,3±2,7 Hgmm/346,0±8,3 BPM) teszteket megelzen. A magas vérnyomás állapotában – hasonlóan a normotenzív állapothoz – a rövid ismételt és a fenntartott tilt további 4,2 illetve 9,4 Hgmm vérnyomás emelkedést eredményezett, a HR és a T nem mutatott jellemz változást. A normotenzív állatokban a 120 percig fenntartott vízszintes testhelyzet nem váltott ki szignifikáns vérnyomás emelkedést. A fenntartott tiltre adott hipertenzív válaszok kivédhetk voltak 1-adrenerg receptor antagonista prazosin (10 mg/tskg, 1. ábra) adagolásával, míg szubaneszthetikus dózisú chloralose (26 mg/tskg) hatására e vérnyomásválaszok megduplázódtak (20,6 Hgmm). PEG prazosin
20 ∆BP (Hgmm)
15
*
*
*
*
*
*
*
*
*†
10 5 0 -5
Tilt
105 120 135 150 165 180 195 210 225 Id (perc)
1. ábra A horizontális testhelyzethez képest a 110-dik perctl kezd d 120 perces tilt során bekövetkez artériás vérnyomásválaszok oldószer (PEG), valamint prazosin (biológiai félélet ideje 2-3 óra) elkezelést követen. A statisztikailag szignifikáns növekedést az egyes horizontális kontrollokhoz képest *-al és †-el jelöltük. Mind a normotenzív, mind pedig a hipertenzív állatok BP, HR és T paraméterei hasonló szabályos diurnális változásokat mutattak, a LA kivételével, melynek éjszakai értéke 3,7±0,43 beütés/min-ról 2,8±0,3 beütés/min-ra csökkent a hipertenziósoknál. -6-
Immerziós fixálás mellett a vénákban megjelen endotheliális vakuolumok természete A NC csoportoz tartozó Sprague Dawley patkányok SV és BV endotheliumában nagy számú, 0,1-3 µm átmérj membránnal körülvett világos vakuolumokat találtunk az immerziós fixálást követen. Az endotheliás vakuolizáció ugyanakkor nem volt megfigyelhet az SA és BA szegmentumokban. Az immerziós fixálás módszere helyett az egésztest fixálás módszerét alkalmazva a vakuólum mentes normál vénás endothelium morfológiája volt látható 20-30 nm átmérj pinocitótikus világos, valamint 40-240 nm átmérj granuláris szerkezet elektron denz képletekkel, melyek mind méretben, mind pedig megjelenésükben könnyen megkülönböztethetk egymástól. Az immerziósan fixált vénás endothelium fény és elektronmikroszkópos képei nem mutatták az apoptózis morfológiai jeleit (sejtmag és citoplazma zsugorodása). A vakuolumokban sem ultrastruktúrális savanyú foszfatáz aktivitás, sem pedig lipid tartalom nem volt kimutatható. E vakuolumok a SV és BV endothelium keresztmetszetének 20,6±2,21 % és 18±2,45 %-át foglalták el a Spargue-Dawley állatokban. A krónikusan fenntartott ortosztatikus testhelyzet nem befolyásolta sem a SV, sem a BV endotheliumban a vakuolumok mennyiségét a vízszintes testhelyzethez képest (SV: HOR=17,13±3,21 %, HUT=17,52±1,92 %; BV HOR=20,63±4,37 %, HUT=18,38±2,15 %). Endotheliális denz vezikulák sajátságai a végtagi erekben, krónikus tilt hatása mennyiségükre A fentiekben említett denz bennék, membránnal körülvett struktúrák elektronmikroszkópos képe granuláris szekretoros vezikulákra emlékeztet. Eloszlásuk az endothelium sejt plazmájában nem egyenletes, egy jelents részük az abluminális sejtmembrán közelében látható, különösen a HUT állatokból származó SV minták esetében. E vezikulák bennékében sem volt kimutatható lipid tartalom, vagy savanyú foszfatáz aktivitás. A SV és a SA endothelium denz vezikulái immunrektivitást mutattak endothelin és PDGF antitestekkel történt kezelést követen. A denz szekretoros vezikulák az SV endothélium keresztmetszetének 3,88±0,38 %, illetve 4,92±0,25 %-át foglalták el a NC és CC csoportokban. A saphena vénákhoz képest a megfelel artériák és brachiális erek endotheliuma szignifikánsan kisebb vezikulációt mutatott mindkét parallel kontroll csoportban (SA: NC 0,89±0,06%, CC 1,09±0,47%; BV: NC 0,91±0,13%, CC 0,76±0,28%; BA: NC 0,69±0,22%, CC 0,73±0,06%, p<0,05). Kéthetes experimentális ortosztázis az elektron denz vezikulák mennyiségét jelentsen csökkentette az SV endotheliumban (2,39±0,31%, p<0,05), míg a SA (1,29±0,45 %), BV (0,45±0,12%) és BA (0,59±0,17 %) szegmentumokban nem következett be szignifikáns változás (2. ábra).
-7-
Denz vezikulumok frakcionális területe [%]
6 SV SA BV BA
5 4 3
*†
2 1 0
*†
*† *†
*†
NC
*†
*†
CC
*†
*†
*†
HUT
2. ábra A denz szekretoros vezikulák területe saphena és brachiális erekben (SV, SA, BV, BA) a teljes endotheliális keresztmetszeti felülethez képest a két hétig szabadon mozgó (NC), vagy horizontális (CC), illetve 45°-os fej-fel tilt (HUT) helyzetben tartott patkányokban. A statisztikailag szignifikáns különbségeket az SV NC és az SV CC csoportokhoz képest *-al, illetve és †-tel jelöltük. Vérplazma endothelin szintek kontroll és fej-fel tilt helyzetben tartott állatokban A három kísérleti állatcsoport plazma endothelin szintjeiben nem mutatkozott szignifikáns különbség (NC 0,96±0,02, CC 0,99 ±0,08, and HUT 0,87±0,13 fM/ml).
-8-
Összefogalás: válaszok a feltett kérdésekre I.
Ismételt és fenntartott akut fej-fel tilt hatásai normotenzív és hipertenzív állatokban I.1. A rövid id tartamokig, ismételten ortosztatikus testhelyzetbe hozott éber Wistar patkányok csupán a statikus hidrosztatikus vérnyomás komponensnek megfelel nagyságú abdominális artériás vérnyomás emelkedéssel válaszolnak. E válasz azt jelzi, hogy a patkányok hatékony rövid távú kardiovaszkuláris alkalmazkodási képességgel rendelkeznek fej-fel testhelyzetben, akut ortosztatikus toleranciájuk jól megtartott. I.2. A fenntartott ortosztázis– a hidrosztatikus komponensen túli – tényleges vérnyomás emelkedést okoz, ami e törzs esetében a hosszabb távú vérnyomás szabályozás zavarának lehet a következménye. I.3. A kísérleti állatok ortosztatikus hipotenziót sem az ismételt rövid, sem pedig a fenntartott ortosztázisban nem mutattak, st utóbbi esetben rendszeres artériás vérnyomás növekedést figyeltünk meg. Ezért e protokoll az ortosztatikus hipertenzió kísérletes modellezésére látszik alkalmasnak. I.4. Mivel az állatok vérnyomása a 120 percig fenntartott vízszintes testhelyzetben nem emelkedett szignifikánsan, feltételezzük, hogy a vérnyomás emelkedést nem a restrikció következtében fellép aspecifikus stressz, hanem a testhelyzet változása okozza. Az ortosztatikus hipertenzív válaszok 1-adrenerg receptor antagonista alkalmazásával kivédhetk, míg szubaneszthetikus dózisú chloralose mellett augmentálódnak. Feltételezzük, hogy az elbbi a túlkompenzáció miatt megnövekedett szimpatikus tónust, míg utóbbi a vérnyomás emelkedést gátló mechanizmusokat oldja. I.5. A NOS gátlás következtében megemelkedett artériás vérnyomás szintjén is kiválthatók az ortosztatikus hipertenzív válaszok, tehát a kísérletes magas vérnyomás önmagában nem gátolja meg a tilt helyzetben kapott válaszokat. I.6. Az NO szintézis gátlása a vérnyomás, a szívfrekvencia és a testh mérséklet diurnális változásait nem befolyásolja szignifikánsan, holott az éjszakai lokomotoros aktivitás csökkenését okozza. Ezek alapján helyesen jártunk el, hogy mindig azonos napszakban végeztük az ortosztatikus teszt vizsgálatokat a normotenziós illetve a hipertenziós állatokon.
II.
Vakuoláris és denz vezikuláris képletek az endotheliumban; 2 hetes tilt hatása II.1. Az in vitro immerziós fixálás a vénás endotheliumban – ellentétben a végtagi artériákkal – nagyfokú pathológiás jelleg vakuólum képzdést indukál, míg az egésztest fixálás mellett mindkét értípus hisztológiai képe vakuólum mentes. II.2. A vakuolumok megjelenése nem köthet sem apoptotikus elváltozáshoz, sem pedig más jelleg endotheliális sejtkárosodáshoz, mivel bennékük nem tartalmaz sem savanyú foszfatázt, sem pedig lipid természet anyagokat. A vakuolumok összmennyiségét krónikus ortosztázis nem befolyásolja. Feltételezésünk szerint, immerziós fixálás mellett a vénás endothelium tovább marad funkcióképes, mivel az ér kollabál, lumene záródik, így a fixáló oldat az endothelium sejteket csupán lassú diffúzióval éri el, és az abnormális hipoxiás mili -9-
az endothelium szubcelluláris struktúráinak e sajátos elváltozását indukálja, mieltt a sejtek teljes elhalása bekövetkezik. Eredményeink az endothelium vizsgálata során a fixációs eljárások gondos megválasztásának illetve ellen rzésének szükségességére hívják fel a figyelmet. II.3. Az általunk elsként leírt endotheliális denz vezikulák bennéke sem tartalmaz apoptotikus, vagy pedig egyéb, endotheliális sejtkárosodásra utaló lipid természet anyagot. Ugyanekkor e vezikulákban, a simaizom funkciót jól ismerten rövid illetve hosszú távon befolyásoló endothelin és PDGF mutatható ki. II.4. Kimutattuk, hogy a vena saphena mintegy négyszer annyi endotheliális szekretoros denz vezikulát tartalmaz, mint ugyanezen régió artériái, vagy a brachiális erek. A vena saphena endothelium szekretoros vezikuláinak mennyisége – szemben a többi érterülettel – a krónikus tilt hatására nagymértékben csökken. Feltételezzük, hogy az endothelin és PDGF tartalmú vezikulák az ortosztatikus terhelés hatására, fokozott turnover mellett, abluminálisan ürülnek, ahonnan a simaizomréteghez diffundálva fejtik ki vazokonstriktor és simaizom proliferációt serkent – ortosztatikus toleranciát támogató – hatásaikat. II.5. A denz vezikulák mennyiségének tilt hatására bekövetkez csökkenése nem jár együtt az endothelin plazmaszintjének változásával. E megfigyelés is amellett szól, hogy az endotheliális változások lokális mechanizmusokhoz kötöttek.
- 10 -
Általános konklúzió A gravitációs alkalmazkodás új aspektusait tártuk fel kísérleti állatokban részben a szisztémás hemodinamika, részben pedig az endothelium szubcelluláris szinjén. Az eredmények új kutatási irányokat is sugallnak mind állatkísérletes modelleken, mind humán vonatkozásban. Tervezzük, többek között, a mikrogravitás kardiovaszkuláris rendszerre gyakorolt – dekondícionálódáshoz vezet – hatásának tanulmányozását patkány modellen, valamint a különböz életmódhoz kötött betegek (jellemzen álló testhelyzet munkavégzés, illetve tartós ágynyugalom) végtagereiben az endotheliális szekretoros vezikulák elfordulási gyakoriságának és bennéküknek a vizsgálatát. Ezek az ismeretek hasznos szempontokat nyújthatnak a gyakorlati alkalmazhatóság irányában is, például az ortosztatikus hipertenzó esetleges komplikációinak korai felismeréséhez, hatékony kezelésének kidolgozásához, valamint egyes ortosztatikus intoleranciák és a visszérbetegségek kifejldésének megelzéséhez.
- 11 -
Köszönetnyílvánítás Köszönetemet fejezem ki téma és egyben programvezetmnek Dr. Monos Emil professzornak, aki atyai türelemmel irányította kutatói tevékenységemet. Köszönettel tartozom továbbá az Érfiziológiai laboratóriumból Dr. Nádasy György egyetemi docensnek és kollaborációs partnereinknek Dr. Dézsi László tudományos osztályvezetnek, Prof. Dr. Fehér Erzsébetnek, Prof. Dr. Szende Bélának kutatói munkámban nyújtott támogatásukért. Asszisztensi közremködésükért köszönet illeti Murányi Ildikót, Burka Évát, Hajdú Ferencnét és Szabó Juditot. Köszönetemet fejezem ki továbbá a Klinikai Kísérleti Kutató- és Humán Élettani Intézet igazgatójának, Dr. Kollai Márk professzornak, valamint az intézet valamennyi munkatársának, akik valamilyen módon segítették a munkámat. Kutatási támogatások: OTKA T-030245/1999, T-042670/2003, ETT 240/2003, ETT 149/2000, TP-163/2002, TP-163/2003, TP-163/2004.
- 12 -
Az értekezés alapját képez közlemények: 1. Raffai G, Fehér E, Nádasy G, Paku S, Pogány G, Tímár F, Szende B, Monos E: Formation of Unknown Vesicles in Endothelium of Rat Saphenous Vein. Is it Physiological, Artificial, or Pathological? Jpn J Pathophysiol 2002;11:27-34. 2. Raffai G, Fehér E, Nádasy G, Paku S, Pogány G, Tímár F, Szende B, Monos E: Vacuole formation in the endothelium of rat extremity vessels depends on fixation techniques and vessel type. Path Res Pract 2004;200:41–46 IF:0,681 3. Raffai G, Fehér E, Nádasy G, Paku S, Pogány G, Tímár F, Szende B, Monos E: Selective suppression of an endothelin and platelet-derived growth factor containing vesicular system in endothelium of rat saphenous vein by long-term orthostasis. J Vasc Res 2005;42:157-164 IF:2,486 4. Raffai G, Mészáros M, Kollai M, Monos E, Dézsi L: Experimental orthostasis elicits sustained hypertension, which can be prevented by sympathetic blockade in the rat. J Cardiovasc Pharmacol 2005;45:354-361 IF:1,576 Egyéb tudományos közlemények: Orosz M, Molnárka G, Nádasy G, Raffai G, Kozmann G, Monos E: Validity of viscoelastic models of blood vessel wall. Acta Physiol Hung 1999;86(3-4):265-71. Lóránt M, Raffai G, Nádasy G, Fehér E, Monos E: Influence of long-term head-down body position on innervation density in extremity blood vessels. J Gravit Physiol 2001;8(1):67-8. Monos E, Raffai G, Contney SJ, Stekiel WJ, Cowley AW Jr: Axial stretching of extremity artery induces reversible hyperpolarization of smooth muscle cell membrane in vivo. Acta Physiol Hung 2001;88(3-4):197-206. Lóránt M, Nádasy G, Raffai G, Monos E: Remodeling of the rat saphenous vein network in response to long-term gravitational load. Physiol Res 2003;52(5):525-31. IF:0,984 Lóránt M, Raffai G, Nádasy GL, Fehér E, Monos E: Does chronic experimental head-down tilt alter intramural innervation density of the limb blood vessels? Jpn J Physiol 2005;55:127-135. IF:0,81 Tóth B, Raffai G, Bojtár I: Analysis of the mechanical parameters of human brain aneurysm. Acta Bioeng Biomech 2005;7:3-22 Raffai G, Kocsis L, Mészáros M, Monos E, Dézsi L: Inverse-orthostasis may induce elevation of blood pressure due to sympathetic activation. J Cardiovasc Pharmacol 2006 (In press). IF:1,576
- 13 -
Nemzetközi folyóiratokban megjelent idézhet absztraktok: Orosz M, Nádasy G, Raffai G, Lóránt M, Monos E: Comparison of viscoelasticity of the rabbit aorta measured in vivo and in vitro. J Physiol (London) 2000;526P:149P IF:4,55 Raffai G, Fehér E, Nádasy G, Paku S, Pogány G, Tímár F, Szende B, Monos E: Formation of Unknown Vesicles in Endothelium of Rat Saphenous Vein. Is it Physiological, Artificial, or Pathological? Jpn J Pathophysiol 2002;10/2:25. Raffai G, Fehér E, Nádasy G, Paku S, Tímár F, Szende B, Monos E: Does gravitational stress affect the dense vesicular and clear vacuolar endothelial structures in the extremity veins of the rat? Acta Physiol Hung 2002;87:44 Monos E, Raffai G, Lóránt M, Nádasy G, Fehér E: Influence of long-term head-down gravitational stress of different diurations on innervation density in extremity vessels. Acta Physiol Hung 2002;89:93 Monos E, Raffai G, Dörnyei G, Nádasy Gy, Fehér E: Chronic adaptation mechanisms of veins – role of the gravitation. Acta Physiol Hung 2004;91:335. Mészáros M, Raffai G, Farkas S, Dézsi L: Monitorting the effect of antihypertensive drugs in conscious rats by telemetry assay. Acta Physiol Hung 2004;91:328. Raffai G, Mészáros M, Kollai M, Monos E, Dézsi L: Normo- and hypertensive Wistar rats respond with rise of blood pressure to 45° head-up tilting. Acta Physiol Hung 2004;91:354. Raffai G, Tóth B, Bojtár I, Nyáry I, Monos E: Setup for biaxial biomechanical characterization of small soft tissue samples. Acta Physiol Hung 2005;92:301-302. Nemzetközi kongresszuson elhangzott eladások: Orosz M, Molnárka G, Nádasy G, Raffai G, Lóránt M, Monos E: Strain-dependent viscoelastic behaviour of canine aorta. 3rd World Congress of Biomechanics, Sapporo, Japan, 1998. Orosz M, Nádasy GL, Raffai G, Lóránt M, Monos E: Comparison of viscoelasticity of the rabbit aorta measured in vivo and in vitro. Hungarian Physiological Society Joint Meeting, Budapest, Hungary, 2000. Lóránt M, Raffai G, Nádasy Gy, Fehér E, Monos E: Influence of long-term head-down tilt on innervation density in extremity blood vessels. 22nd Annual International Gravitational Physiology Meeting, Budapest, Hungary, 2001. Raffai G, Fehér E, Nádasy Gy, Paku S, Pogány G, Szende B, Tímár F, Monos E: Vacuolelike structures in the endothelial cells of rat saphenous vein. XXXIV. International Congress of Physiological Sciences, Christchurch, New Zealand, 2001.
- 14 -
Nádasy G, Orosz M, Raffai G, Szekeres M, Tóth M, Monos E: Stoichiometry of biomechanical parameters in different vascular tissues. XXXIV. International Congress of Physiological Sciences, Christchurch, New Zealand, 2001. Raffai G, Fehér E, Nádasy G, Paku S, Tímár F, Szende B, Monos E: Does gravitational stress effect the dense vesicular and clear vacuolar endothelial structures in the extremity veins of the rat? 4th International Congress of Pathophysiology, Budapest, Hungary, 2002. Monos E, Raffai G, Lóránt M, Nádasy G, Fehér E: Influence of long-term head-down gravitational stress of different diurations on innervation density in extremity vessels. 4th International Congress of Pathophysiology, Budapest, Hungary, 2002. Monos E, Raffai G, Fehér E, Nádasy G, Paku S, Pogány G, Tímár F, Szende B: Formation of unknown vesicles in endothelium of rat saphenous vein. Is it physiological, artificial, or pathological? 12th Congress of Japan Pathophysiology Society, Matsuyama, Japan, 2002. Tóth B, Monos E, Raffai G, Bojtár I: Numerical and laboratory analysis of the constructive equations of brain aneurysms. Symposium of Medical Informatics, Budapest, 2003. Dézsi L, Raffai G, Mészáros M, Kollai M, Monos E: Experimental model of substained ortostatic hypertension int he rat. 4th AAPS International Congress, Tangier, Marocco, 2004. Monos E, Raffai G, Dörnyei G, Fehér E, Nádasy Gy: Adaptive responses of extremity blood vessels to long-term ortostatic or inverse-ortostatic gravitational stress. 4th AAPS International Congress, Tangier, Marocco, 2004. Monos E, Fehér E, Raffai G, Dörnyei G, Nádasy Gy: Responses of extremity vessels to long-term gravitational stresses of dirrerent directions. 3rd National Russian Congress of Pathophysiology, Moscow, Russia, 2004. Monos E, Fehér E, Raffai G, Dörnyei G, Nádasy Gy: Physiological mechanisms induced by long-term ortostatic type gravitational loading int he extremity blood vessels. European Space Agency Workshop on „Life Science Research Areas in Hungarian Space Research Program”, Kecskemét, Hungary, 2004. Bojtár I, Tóth B, Raffai G: Analysis of the mechanical parameters of human brain aneurysm. 21st Danubia-Adria Symposium on Experimental Methods in Solid Mechanics, Brijuni, Croatia, 2004. Tóth B, Bojtár I, Raffai G: A three-dimensional finite element model for inhomogenous non linearly elastic behaviour of human arterial walls. First Hungarian Conference on Biomechanics, Budapest, Hungary, 2004. Monos E, Raffai G, Dörnyei G, Nádasy GL, Fehér E: Structural and functional responses of extremity veins to long-term gravitational loading or unloading – lessons from animal systems. 15th IAA Humans in Space Symposium, Graz, Austria, 2005.
- 15 -
Dézsi L, Raffai G, Mészáros M, Kollai M, Monos E: Possible mechanism of orthostasis induced hypertension in the conscious rat. 15th IAA Humans in Space Symposium, Graz, Austria, 2005. Raffai G, Dézsi L, Mészáros M, Kollai M, Monos E: Both sustained orthostasis and inverseorthostasis may elicit hypertension in conscious rat. 15th IAA Humans in Space Symposium, Graz, Austria, 2005. Monos E, Raffai G, Dörnyei G, Fehér E, Nádasy G: Local mechanisms supporting adaptation of extremity vessels to long-term changes in gravitational forces. 1st Congress of Physiological Sciences of Serbia and Montenegro with international participation. “Molecular, cellular and integrative basis of health, disease and therapy” Belgrade, Serbia and Montenegro, 2005. Hazai kongresszuson elhangzott eladások: Raffai G, Csek Cs, Orosz M, Nádasy G, Tóth M, Monos E: Simaizom tónus és relaxáció hatása a nyúlaorta csíkok viszkoelasztikus paramétereire. MÉT LXII. Vándorgylése, Pécs, 1997. Orosz M, Molnárka G, Csek Cs, Raffai G, Nádasy G, Monos E: Érfal viszkoelasztikus viselkedésének és szakadásának matematikai modellezése kísérleti adatok alapján. MÉT LXII. Vándorgylése, Pécs, 1997. Orosz M, Molnárka G, Nádasy G, Raffai G, Lóránt M, Monos E: Érfal viszkoelasztikus viselkedése nyújtás hatására. Neumann János Számítógéptudományi Társaság XXI. Kollokviuma, Veszprém, 1998. Nádasy G, Tóth M, Orosz M, Szekeres M, Raffai G, Monos E: Az artéria fal passzív mechanikai tulajdonságainak csúszó filamentum elmélete. MÉT LXIII. Vándorgylése, Debrecen, 1998. Dézsi L, Nádasy G, Szekeres M, Raffai G, Monos E: Intramurális koronária ágak átmérjét az áramlás változásai nem befolyásolják számotteven. MÉT LXIII. Vándorgylése, Debrecen, 1998. Monos E, Szentiványi M, Dörnyei G, Lóránt M, Raffai G, Nádasy G: Végtagerek alkalmazkorási mechanizmusai orthostaticus gravitációs terheléshez. Magyar rkutatási Iroda tudományos ülése, Kecskemét, 1999. Orosz M, Molnárka G, Nádasy G, Raffai G, Kozmann G, Monos E: Viszkoelasztikus érfal modellek validitása. MÉT LXIV. Vándorgylése, Budapest, 1999. Nádasy G, Szekeres M, Várbíró Sz, Lóránt M, Raffai G, Tkés A, Jekkel M, Kerényi T, Dézsi L, Székács B, Monos E: Patkány intramurális koronária rezisztencia artériák preparálása, in situ perfúziós térképezése és in vitro mikroangiográfia. MÉT LXIV. Vándorgylése, Budapest, 1999. - 16 -
Raffai G, Fehér E, Nádasy G, Paku S, Pogány G, Szende B, Tímár F, Monos E: Vacuolelike structures in the endothelial cells of rat saphenous vein. Semmelweis Symposium, Budapest, 2001. Monos E, Raffai G, Dörnyei G, Nádasy G: Hosszútávú gravitációs alkalmazkodási mechanizmusok a végtagok ereiben. Második Magyar Mikrokeringés Kongresszus, Balatonkenese, 2001. Nádasy G, Orosz M, Tóth M, Raffai G, Szekeres M, Monos E: Sztöchiometriai jelleg összefüggések az érfal egyes in vitro biomechanikai paraméterei között. MÉT LXVI. Vándorgylése, Szeged, 2001. Raffai G, Fehér E, Nádasy G, Paku S, Pogány G, Szende B, Tímár F, Monos E: Sajátos vesiculáris képletek patkány végtagi vénák endothelium sejtjeiben. MÉT LXVI. Vándorgylése, Szeged, 2001. Monos E, Raffai G, Dörnyei G, Nádasy G: Hosszútávú gravitációs alkalmazkodási mechanizmusok a végtagok ereiben. II. Magyar Mikrokeringés Kongresszus, Balatonkenese, 2001. Raffai G, Dézsi L, Kollai M, Monos E: Orthostatikus hypertensio kísérletes modellje. MÉT LXVII. Vándorgylése, Pécs, 2003. Monos E, Raffai G, Nádasy GL: Reverzibilis-e a krónikus kísérletes orthostasissal indukált biomechanikai válasz a vena saphenában? MÉT LXVII. Vándorgylése, Pécs, 2003. Csáki B, Nádasy G, Raffai G, Orosz M, Monos E: Nyúl aorta in vivo nyomás-átmér pulzatil hurok-jelleggörbéinek analízise. MÉT LXVII. Vándorgylése, Pécs, 2003. Tóth B, Monos E, Raffai G, Bojtár I: Agyi aneurizmák anyagmodelljének numerikus és laboratóriumi vizsgálata. Orvosi informatika Magyarországon: képzés és kutatás tudományos ülés, BME, Budapest, 2003 Nádasy G, Szekeres M, Raffai G, Monos E, Dézsi L: In vitro vazomóció intramurális koronária rezisztencia artéria szegmentumokon. III. Magyar Mikrokeringés Kongresszus, Balatonkenese, 2003. Dézsi L, Raffai G, Mészáros M, Monos E: Ortosztatikus hipertenziós model normotenzív és L-NAME indukálta hipertenzív patkányon. Magyar Kardiológusok Társasága Tudományos Kongresszusa, Balatonfüred, 2004. Monos E, Raffai G, Dörnyei G, Nádasy G, Fehér E: Vénák krónikus alkalmazkodási mechnizmusai – a gravitáció szerepe. MÉT LXVIII. Vándorgylése, Debrecen, 2004. Raffai G, Mészáros M, Kollai M, Monos E, Dézsi L: Normo- and hipertenzív Wistar patkányok 45°-os fej-fel billentésre vérnyomás növekedéssel válaszolnak. MÉT LXVIII. Vándorgylése, Debrecen, 2004. - 17 -
Mészáros M, Raffai G, Farkas S, Dézsi L: Monitorting the effect of antihypertensive drugs in conscious rats by telemetry assay. MÉT LXVIII. Vándorgylése, Debrecen, 2004. Monos E, Raffai G, Dörnyei G, Nádasy G, Fehér E: Végtagerek adaptív mechanizmusai – a gravitációs kihívás. IV. Magyar Mikrokeringés Kongresszus, Balatonkenese, 2005. Monos E, Raffai G, Dörnyei G, Fehér E, Nádasy G: Végtagi vénák szerkezeti és funkcionális adaptációja tartós orthosztatikus, valamint inverz-orthosztatikus testhelyzetekhez. X. Korányi Frigyes Tudományos Fórum, Budapest, 2005. Raffai G, Tóth B, Bojtár I, Nyáry I, Monos: Kisméret lágyszövet minták biomechanikai jellemzésére alkalmas biaxiális mérrendszer. MÉT LXIX. Vándorgylése, Budapest, 2005. Raffai G, Tóth B, Bojtár I, Nyáry I, Monos E: Biaxiális mérrendszer kisméret lágyszövet minták biomechanikai jellemzésére. “10 éves az orvosbiológiai mérnökképzés Magyarországon” Doktori szimpózium, BME, Budapest, 2005.
- 18 -
