Doktori (PhD) értekezés SEJTVONAL SPECIFIKUS MONOKLONALITÁS VIZSGÁLATOK MIELODISZPLÁZIÁBAN ÉS MIELOPROLIFERATÍV BETEGSÉGEKBEN

Doktori (PhD) értekezés

SEJTVONAL SPECIFIKUS MONOKLONALITÁS VIZSGÁLATOK MIELODISZPLÁZIÁBAN ÉS MIELOPROLIFERATÍV BETEGSÉGEKBEN

Jáksó Pál

Doktori iskola: Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola vezetője: Dr. Komoly Sámuel Program: Molekuláris pathomorfológia Programvezető, témavezető: Dr. Pajor László

Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar Pathologiai Intézet Pécs, 2009.

1

TARTALOMJEGYZÉK

BEVEZETÉS ...........................................................................................................4 CÉLKITŰZÉSEK ....................................................................................................7 Sejtvonal specifikus klonalitás vizsgálatok X kromoszóma inaktivációs esszével ...8 Sejtvonal specifikus mikroszatellita-PCR vizsgálatok ..............................................11 Sejtvonal specifikus JAK2V617F mutációs vizsgálatok ...........................................13 VIZSGÁLATI MINTÁK ÉS ALKALMAZOTT MÓDSZEREK .......................14 Vizsgálati minták........................................................................................................14 Áramlási citometriás sejtszortírozás ..........................................................................15 DNS izolálás ..............................................................................................................17 Humán androgén receptor esszé – HUMARA...........................................................18 Mikroszatellita-PCR vizsgálatok ...............................................................................22 JAK2V617F mutációs vizsgálatok.............................................................................25 EREDMÉNYEK.......................................................................................................27 A HUMARA kiértékelési kritériumainak, specifitásának és szenzitivitásának meghatározása ............................................................................................................27 HUMARA – klonalitás eredmények ..........................................................................33 Mikroszatellita-PCR eredmények ..............................................................................36 Párhuzamos HUMARA és mikroszatellita-PCR eredmények ...................................40 Párhuzamos JAK2V617F mutáció és HUMARA eredmények .................................42 MEGBESZÉLÉS .....................................................................................................44 Irodalmi áttekintés .....................................................................................................44 Saját eredmények értékelése ......................................................................................47 Összefoglalás .............................................................................................................53 ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA ..........................................................55 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS .................................................................................57 2

IRODALOMI HIVATKOZÁSOK..........................................................................58 AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZŐ PUBLIKÁCIÓK ..................................70 EGYÉB PUBLIKÁCIÓK........................................................................................72 RÖVIDÍTÉSEK........................................................................................................77

3

BEVEZETÉS

A neoplasztikus hematológiai betegségek patomechanizmusának megértéséhez, megfelelő diagnosztikájához, valamint prognosztikus és terápiás szempontból is fontos szempont, hogy az adott lézió a hemopoézis mely pontjáról indul ki. Vagyis, hasznos annak megállapítása, hogy a betegség pluripotens, vagy elkötelezett őssejt eredetű-e. A molekuláris patogenezisre vonatkozó ismereteket a WHO klasszifikációja is alapelvként használja a neoplasztikus hematológiai betegségek besorolásában. A tumor kiindulópontjának meghatározása segíthet annak a kérdésnek a megválaszolásában, hogy a tüneti kezelésen túli, valódi gyógyulási lehetőséget nyújtó, kuratív terápiaként alkalmazható-e kemoterápia, vagy csak az allogén csontvelő transzplantáció jelentheti-e az egyedüli megoldást. Elkötelezett őssejt eredetű betegség esetén a kemoterápia is eredményezhet teljes gyógyulást, mivel ha a terápiával sikerül elpusztítani a tumoros elkötelezett őssejteket, akkor a pluripotens őssejtekből még regenerálódhat a normális hemopoézis. Ezzel szemben, ha pluripotens őssejt szintről indul ki a betegség, akkor célzott terápia hiányában a teljes gyógyulás valószínűleg csak a összes hemopoetikus sejt elpusztításától várható, amit viszont a terápia utáni idegen donoros csontvelő transzplantációnak kell követnie a hemopoézis helyreállítása érdekében. A különböző sejtvonalak érintettségének vizsgálatával, következtethetünk arra, hogy a tumor a hemopoézis mely pontjáról indulhatott ki. Az egyes sejtvonalak érintettségét igazolhatjuk többféle módszerrel. Egyrészt vizsgálhatunk betegségre jellemző molekuláris eltéréseket (pl. pontmutációk, deléciók), másrészt használhatunk klonalitás vizsgálatokat, amelyek egyúttal segíthetik a diagnózist is, mivel a monoklonalitás kimutatása egyéb marker hiányában is a tumoros folyamat lehetőségét támasztja alá. A mielodiszpláziák (MDS) betegségcsoportja olyan klonális hematológiai betegségeket foglal magába, amelyeket klinikai és morfológiai szempontból ineffektív hemopoézis jellemez1-5. Ezek a betegségek egy krónikus jellegű monoklonális proliferációval járó preneoplasztikus fázis után gyakran akut leukémiás fázisba kerülnek. A WHO osztályozás6-7 a következő típusokat definiálja: refrakter anémia (RA), RA ringed szideroblasztokkal (RARS), RA ringed szideroblasztokkal4

trombocitózissal (RARS-t), refrakter citopénia több sejtvonal diszpláziájával (RCMD), refrakter citopénia több sejtvonal diszpláziájával és ringed szideroblasztokkal (RCMD-RS), RA blaszt szaporulattal (RAEB-I. és RAEB-II.), 5qszindróma, és nem klasszifikálható MDS (MDS-u). A nemzetközi irodalom az MDSt hemopoetikus őssejt eredetű betegségnek tartja. Egyértelmű az álláspont abban a tekintetben, hogy a hemopoézis mieloid vonala érintett és monoklonális proliferációval jellemezhető. Ezzel szemben ellentmondóak az adatok abban a tekintetben, hogy a limfoid vonal mennyire érintett a neoplasztikus folyamatban8-17 . A mieloproliferatív neopláziák (MPN) a mieloid tumorok másik nagy csoportját képezik. Ezekre a betegségekre a csontvelői sejtek abnormális, fokozott proliferációja jellemző. Morfológiailag a különböző típusokban más-más sejtvonal dominál, de bizonyított, hogy több csontvelői sejtvonal is érintett az abnormális proliferációban kisebb-nagyobb mértékben. A WHO osztályozás6-7 szerinti altípusok a következők: krónikus mieloid leukémia (CML) (Ph-kromoszóma pozitív), elsődleges mielofibrózis (PMF), policitémia vera (PV), esszenciális trombocitémia (ET), hízósejtes betegség (MCD), krónikus neutrofil-sejtes leukémia (CNL), nem kategorizálható krónikus eozinofil-sejtes leukémia (CEL-NOC), hipereozinofiliás szindróma (HES) és a nem klasszifikálható mieloproliferatív betegségek (MPN-u). A korábbi, 2001-es WHO besorolás szerint még a mieloproliferatív betegségek közé sorolt és molekuláris eltéréssel rendelkező eozinofíliákat új csoportként definiálták: eozinofíliával járó mieloid neopláziák PDGFRA, PDGFRB, vagy FGFR1 abnormalitással. Az MPN-eket is elsősorban őssejtbetegségnek tarják, de az egyes sejtvonalakat érintő molekuláris klonalitási vizsgálatok az MDS-hez hasonlóan ebben a betegség csoportban sem egyértelműek a limfoid vonal érintettsége szempontjából8-10, 18-26. A hagyományos morfológiai, citológiai vizsgálatok nagy segítséget nyújtanak az egyes sejtvonalak érintettségének meghatározásában, de egyértelmű bizonyítékot nem tudnak szolgáltatni morfológiai jelek hiánya esetén. A tumorokra jellemző genetikai aberrációk vizsgálatához citogenetikai, illetve molekuláris genetikai módszerek szükségesek. Ezen technikák segítségével a daganatos betegségek kiváltó okainak közvetlen vizsgálata lehetséges. Különböző genetikai aberrációk ismertek mindkét fenti betegségcsoportban6-7, de ezek előfordulása alacsony, így ezekben a 5

betegségekben kevés jól használható patognomikus genetikai markert ismerünk. Kivételt képez a CML, amely esetében a jelenlévő Philadelphia-kromoszóma diagnosztikus kritérium, illetve a JAK2V617F pontmutáció, amely 50-95%-ban fordulhat elő MPN-ken belül PV-ben, PMF-ben és ET-ben, ill. a mielodiszpláziák egy altípusában, RARS-t-ben.27-29. Az eddigi irodalmi adatok alapján egyéb genetikai rendellenességek is ismertek ezen betegségek de novo formájában, pl. a 20-as kromoszóma hosszú karjának deléciója, ami mindössze az esetek kb. 10-15 %-ában fordul elő policitémia vera-ban, valamint hasonló előfordulást mutat az 5q deléció MDS-ben. A többi genetikai aberráció ezekben a betegségekben ritkábban fordul elő, mint pl. a 8-as, 9-es, 1-es kromoszómák triszómiája, 7-es monoszómia és még ritkábbak a del(13q), del(11q), del(12p), -Y, +6, +13, +21. Kivételt képez a terápiaindukált MDS-ek csoportja, ahol a del(5q) az 50%-os gyakoriságot is elérheti6,7,30. Az újabban felfedezett molekuláris eltérések közé tartoznak 5% alatti előfordulással a JAK2V617F negatív PV-ben a JAK2 gén 12-es exonjában előforduló pontmutációk, valamint PMF-ben és ET-ben az MPLW515L/K mutációk 31-35.

6

CÉLKITŰZÉSEK

Vizsgálataink elsődleges célja az volt, hogy az egyes sejtvonalak érintettségének vizsgálatán keresztül megállapítsuk, hogy MDS-ben és MPN-ben a betegség a hemopoézis melyik stádiumából indulhat ki. Feltételeztük, hogy ha csak mieloid érintettséget találunk, akkor valószínűleg mieloid irányban elkötelezett őssejtből indul ki a betegség. Ha viszont limfoid érintettség is előfordul, akkor pluripotens őssejt eredet lehet a háttérben. A sejtvonal érintettség megállapításához három módszert használtunk fel. Elsőként, genetikai markertől független, klonalitás vizsgálatára alkalmas HUMARA (human androgen receptor assay) X kromoszóma inaktivációs esszét használtunk fel, áramlási citometriásan szortírozott limfoid és mieloid sejteken. A második módszer a del(20q) és del(5q) vizsgálata volt mikroszatellita-PCR (MS-PCR) technika segítségével, szintén szortírozott sejtvonalakon. A sejtvonal érintettségen túl az MS-PCR vizsgálatokkal arra is választ kerestünk, hogy a hagyományos metafázis citogenetikánál jóval kisebb deléciók kimutatására alkalmas MS-PCR technikával sikerül-e a fent említett előfordulási arányoknál magasabb százalékban kimutatni ezeket a deléciókat. Végül szintén sejtvonal specifikusan vizsgáltuk a JAK2V617F pontmutáció jelenlétét MPN-es betegekben mutáció-specifikus PCR technika segítségével.

7

Sejtvonal specifikus klonalitás vizsgálatok X kromoszóma inaktivációs esszével

A nőkben bekövetkező X kromoszóma inaktiváció (XI) folyamata jól ismert jelenség. Ennek során az ún. Lyon hipotézis36-39 szerint a korai embriogenezis során, feltehetően a késői blasztociszta stádiumban, komplex szabályozási mechanizmusok hatására az X kromoszóma inaktiváció sejtenként véletlenszerűen érinti a két X kromoszóma egyikét. A későbbi mitózisok alkalmával az utódsejtekben az inaktivációs mintázat stabilan továbbadódik. Ennek következtében a női szervezet sejtjei mozaicitást mutatnak abban a tekintetben, hogy a testi sejtekben felváltva hol az anyai, hol az apai X kromoszóma inaktivált. Ideális esetben a két X kromoszóma 50-50%-ban aktív ill. inaktív. Monoklonális proliferáció esetén azonban, pl. tumorokban, az összes sejt a kiindulási klón inaktivációs mintázatát fogja hordozni. Ennek a jelenségnek a legelső felhasználása klonalitás vizsgálatára tumorokban, Gartler és Linder nevéhez fűződik40, akik az X kromoszómán kódolt glükóz-6-foszfát dehidrogenáz (G6PD) izoenzimek expresszióját használták fel a két X kromoszóma megkülönböztetésére. Ugyanezzel a módszerrel mutatták ki Fialkow és munkatársai, hogy a CML, PV és ET klonális betegségek és hemopoetikus őssejtből indulnak ki41-43. Később jóval elterjedtebbé vált az ún. short tandem repeat polimorfizmusok (STRP) és restrikciós fragment hosszúság polimorfizmusok (RFLP) használata, valamint ezek metilációs mintázatának vizsgálata. Elsőként Vogelstein és munkatársai írták le a hipoxantinguanin foszforiboziltranszferáz (HPRT) gén ilyen irányú felhasználását, majd további lókuszok is bekerültek az X kromoszóma inaktivációs vizsgálatok repertoárjába: a foszfoglicerát kináz (PGK) gén; egy nem expresszálódó lókusz a DXS225 (más néven: M27β); a palmytoilated membrane protein (p55) génben és az iduronát-2-szulfatáz (IDS) génben előforduló polimorf szakaszok; legújabban pedig a humán androgén receptor gén8,

44-48.

Mivel ezek a polimorf szekvenciák az

inaktivációnak megfelelően metilálódnak, ezért metilációs státuszuk vizsgálatával következtetni lehet arra, hogy a két X kromoszóma egyenlő arányban inaktiválódik-e vagy sem. Metodikai szempontból a különböző módszereknek vannak előnyei és hátrányai is. Az egyik legfontosabb szempont a módszer kiválasztásánál a polimorfizmus mértéke, ami az informatív vizsgálatok arányát határozza meg. Ebből 8

a szempontból a PGK és HPRT gének vizsgálatán alapuló tanulmányok együttesen is csak 50%-ban informatívak. Sokkal jobb ebből a szempontból az M27β, amely 90%ban ad informatív eredményt, viszont tumorokban gyakran hipermetilált, így nem megbízható markere az X-inaktivációnak. A leghasználhatóbb módszer ebből a szempontból a humán androgén receptor génre épülő HUMARA, amely közel 90%ban informatív és metilációja megbízhatóan tükrözi az X-inaktivációt. Mindezek a módszerek a DNS metiláció-szenzitív restrikciós emésztését használják fel a metilációs státusz vizsgálatához, amely azonban magában hordozza a részleges emésztés lehetőségét. Az ebből adódó bizonytalanságot küszöbölik ki az RNS alapú módszerek, amelyek a valódi X-inaktivációt mutatják. Ilyen, expresszió alapú vizsgálatokat dolgoztak ki a p55, IDS, és PGK esetében, amelyek esetében azonban heterozigozitás alacsony (50% alatti), így csak az esetek kis részében használhatók44, 48,49.

Leírták a HUMARA expressziós változatát is47,49, amelynek azonban az

alkalmazhatóságát nagyban befolyásolja a gén expressziója, ami tumoronként és szövetenként is igen változó, így ma, a leggyakrabban alkalmazott X inaktivációs vizsgálati módszer mégis a DNS alapú HUMARA. A HUMARA módszer esetében, azonban több tanulmány felveti egy bizonytalansági tényező jelenlétét. Ez pedig a nem véletlenszerű X-inaktiváció (nonrandom X-inactivation - fNRXI). Ez azt jelenti, hogy egészséges nőkben is előfordul az elméleti 50-50%-os inaktivációs arányoktól való eltérés, amely utánozhatja a monoklonalitást. Champion és munkatársai tanulmányában50 egészséges nők vizsgálata során ezt elsősorban idősebb nők esetében találták jellemzőnek. Mivel az MPN és MDS elsősorban idős korban jelentkező és manifesztálódó betegségek, ezért arra hívják fel a figyelmet, hogy ezekben a betegségekben a HUMARA használata megfelelő óvatosságot igényel. Ezzel szemben olyan közlemény is van, amelyben nagyszámú egészséges nő vizsgálata során nem találtak összefüggést az életkor és az NRXI között51. Több tanulmány veti fel, hogy az esetleges NRXI kiküszöbölésére, valamilyen kontroll szövet alkalmazása lenne hasznos, amihez viszonyítani lehetne a két androgén receptor allél inaktivációjának arányát45,46,52,53. Ebben a kérdésben sincs konszenzus. Alapvetően olyan kontroll szövetre lenne szükség a beteg személytől, amely biztosan nem érintett a hematológiai tumorban. A kérdést tovább bonyolítja, hogy Gale és munkatársai46 arról számolnak be, hogy a NRXI jelensége nem 9

egyformán jelentkezik a különböző szövetekben. Ezért több kutató azt javasolja, hogy minél “közelebbi rokonságban” lévő szövetet lenne célszerű alkalmazni kontrollként. El-Kassar és munkatársai53 ET-s betegek sejtvonal érintettségének tanulmányozása során T-limfocitákat javasolják kontroll céljára. Azonban ez a megközelítés alapvetően kizárja annak a lehetőségét, hogy feltételezzük a T-sejtek involvációját a tumoros folyamatban. Vizsgálatainkhoz a fentiekben ismertetett előnyök és hátrányok mérlegelése után, a DNS alapú HUMARA-t használtuk fel klonalitás megállapítására áramlási citometriával szortírozott limfoid és mieloid sejtekben. A HUMARA eredmények megfelelő értékeléséhez kontrolltól független, sejtvonal specifikus kritériumokat dolgoztunk ki. Továbbá teszteltük módszer korlátait a specificitás és érzékenység tekintetében.

10

Sejtvonal specifikus mikroszatellita-PCR vizsgálatok

A genomban előforduló mikroszatellita régiók (<200bp) 1-4 bázispárnyi ismétlődésekként fordulnak elő. Az ismétlődések száma általában nagyon változó, vagyis a mikroszatellita szakaszok nagyon polimorfak. Egy ilyen mikroszatellita régiót tartalmazó szekvencia PCR technikával történő amplifikációja és elektroforézise után, elkülöníthető egy adott allél apai és anyai változata az ismétlődés-számok eltérése alapján. Tumorok vizsgálata során, a genomban ismert helyzetű mikroszatellita régiók felhasználhatók az adott lókusz deléciójának, ill. amplifikációjának vizsgálatára, ugyanis a mikroszatellita régiók PCR amplifikációját követően a termékek mennyiségének kvantitálásával következtetni lehet a két allél előfordulására 54,55. Ennek megfelelően deléció esetén, ha a vizsgált sejtek mindegyikében bekövetkezik a deléció és a homológ kromoszómapárnak csak egyik tagját érinti, akkor csak egy allélt detektálhatunk. Ha a deléciót hordozó sejtek mellett normál sejtek is vannak a mintában, vagy az egyik allél amplifikációja következik be, akkor a két allél mennyiségi aránya (gyakorisága) megváltozik a normál 1-1 arányhoz képest és allélikus kiegyensúlyozatlanságot (allelic imbalance AI) okoz. Természetesen ilyen vizsgálatok esetében mindig szükség van ugyanazon személy egészséges szövetéből származó kontrollra, amihez a tumorból kapott allél arányokat viszonyítani lehet. A tanulmányban az MPN-ben leírt, leggyakoribb genetikai aberrációnak tartott 20q deléciót56-60, illetve MDS-ben szintén a leggyakoribb defektusok közé tartozó

5q deléciót61-63 vizsgáltuk áramlási citometriával szortírozott limfoid és

mieloid sejteken MS-PCR technikával. Mindkét deléciónál az irodalmi adatoknak megfelelően választottuk ki az alkalmazott mikroszatellita markereket, úgy hogy azok a leggyakrabban deletált szakaszokon (common deleted region - CDR) helyezkedjenek el. Green58 és Le Beau59 munkacsoportja végeztek úttörő munkát a deletálódó 20q régió minél pontosabb feltérképezésében és a CDR-t kb. 250 kb-ra szűkítették le. A del(20q) CDR területén több gén és ismeretlen funkciójú expresszálódó szekvencia is található, köztük pl. a KRS2 gén, amely egy szerintreonin kinázt kódol és apoptózis szabályozásban játszik szerepet. Egy ilyen gén defektusa vezethet apoptózis deregulációhoz, amelynek sok tumor kialakulásában 11

bizonyított szerepe van. Hasonló vizsgálatok zajlottak az del(5q) CDR feltérképezésével kapcsolatban is. Horrigan és munkatársai61 kb. 700 kb-ra szűkítették le a régiót, amelyben 9 gént és 5 ismeretlen funkciójú expresszálódó szekvenciát azonosítottak. Vizsgálatainkban a két CDR-ből a 20q11.2-q13.2 régiót vizsgáltuk a D20S607, D20S170, D20S110, D20S96 és D20S119 lókuszokon, valamint az 5q31 régióban a D5S476 és D5S414 lókuszokat.

12

Sejtvonal specifikus JAK2V617F mutációs vizsgálatok

2005-ben több egymástól független publikációban írták le először a JAK2 gén V617F mutációját krónikus mieloproliferatív betegségekben64-68. A JAK2 fehérje a kulcsszerepet tölt be a sejtnövekedést és differenciációt szabályozó JAK-STAT jelátviteli folyamatokban. A mutáció következtében a 9-es kromoszóma rövid karján elhelyezkedő, tirozin-kinázt kódoló JAK2 gén 14-es exonjában egy G>T báziscsere következik be (1. ábra). A pontmutáció a JAK2 fehérjében valin-fenilalanin aminosav cserét okoz a 617-es pozícióban, a protein pszeudokináz doménjében. A mutált JAK2 fehérje konstitutív tirozin-kináz aktivitást, ill. hiperszenzitivitást mutat az őt aktiváló szignálokkal szemben29,32,69-74.

1. ábra. A JAK2 gén szerkezete. A piros nyíl mutatja a pontmutáció helyét.

A JAK2V617F mutáció a szakirodalom szerint MPN-eken belül PV-ben 90-95%, PMF-ben 55-60% és ET-ben 50% gyakorisággal, illetve a mielodiszpláziák egy ritka szubtípusában RARS-t-ben, 50% körüli gyakorisággal fordul elő 74 . 2007ben a Clinical Advisory Committee for the revision of the WHO Classification of the Myeloid Neoplasms azt javasolta, hogy a JAK2V617F mutáció előfordulása szerepeljen major kritériumként a krónikus mieloproliferatív betegségek diagnosztikájában31. Végül a legfrissebb 2008-ban kiadott WHO klasszifikációba ezt a javaslatot be is építették 7. Áramlási citometriásan szortírozott MPN-es betegek mintáiban megvizsgáltuk a JAK2V617F mutáció jelenlétét sejtvonal specifikusan limfoid és mieloid sejtekben. A vizsgálatokat a JAK2V617F mutációra specifikus primert alkalmazó PCR segítségével végeztük. 13

VIZSGÁLATI MINTÁK ÉS ALKALMAZOTT MÓDSZEREK

Vizsgálati minták

A vizsgálati minták MDS-sel és MPN-nel diagnosztizált betegek EDTA-val alvadásgátolt perifériás vér és csontvelő aspirátum mintái voltak. Az eseteket a WHO klasszifikáció alapján, a klinikai és patológiai diagnózis egybevetése után soroltuk be a megfelelő betegségcsoportba. Az MS-PCR vizsgálatokhoz egészséges szövetből származó kontroll mintaként szájnyálkahártya kaparékot gyűjtöttünk a betegektől. A HUMARA kiértékelési kritériumainak meghatározásához 27 egészséges nő és 4 Bsejtes krónikus limfoid leukémiás (B-CLL) nő EDTA-val alvadásgátolt perifériás vér mintáját is felhasználtuk. MS-PCR és JAK2V617F mutációs vizsgálatokhoz a fenti női mintákon túl férfi betegekből is gyűjtöttünk mintát. A HUMARA-hoz 143 nőbetegtől gyűjtöttünk mintákat és végeztük el a vizsgálatokat. Százhárom MPN-es betegből 34 nem volt informatív, a vizsgált androgén receptor allélek homozigozitása, vagy a két allél túl kicsi méretkülönbsége miatt. A 69 informatív eset betegség típus szerinti megoszlása a következő volt: 34 ET, 10 PV, 2 PMF és 15 MPN-u, 8 HES. Negyven MDS-es betegből 11 nem volt informatív. A 29 informatív eset megoszlása 6 MDS-RA, 3 MDS-RAEB, 3 MDS-ből transzformálódott AML és 17 MDS-u volt. 35 esetben végeztünk MS-PCR-t, amiből 20 esetben párhuzamos HUMARA vizsgálatok is készültek. Hét MDS-u, 4 MDS-RA, 1 MDS-RAEB, 2 MPN-PV, 2 MPN-PMF, 9 MPN-ET, 5 MPN-u, 4 MPN-HES, és 1 MPN/MDS-CMML volt az MS-PCR vizsgálatokban a betegség szerinti megoszlás. 27 MPN esetben készült JAK2V617F mutáció vizsgálat, amiből tizenkettőt párhuzamosan végeztünk a HUMARA-val. Hat PMF, 9 PV, 12 ET és 1 MPN-u volt a betegség szerinti megoszlás. Az összes vizsgálatot áramlási citometriásan szortírozott sejteken végeztük. A betegek életkora 12 és 82 év közé esett.

14

Áramlási citometriás sejtszortírozás

A vér és csontvelő mintákból áramlási citométerrel szortíroztunk limfoid és mieloid sejteket. Az HES esetekben a limfoid és mieloid sejteken kívül eozinofil sejteket is szortíroztunk. Egy MDS-RAEB esetben blasztokat is szortíroztunk. A szortírozás alapja a sejtek CD45 expressziójának intenzitása és granularitása volt. Ezen két paraméter alapján egy kétdimenziós diagrammon jól meghatározott mintázat szerint elkülöníthetők a limfoid sejtek (magas CD45 expresszió és kismértékű granularitás), mieloid sejtek (közepes CD45 expresszió és közepesmagas granularitás), eozinofil sejtek (magas autofluoreszcencia a zöld FL1 és narancs FL2 csatornában, valamint magas granularitás) és a blasztok (közepes CD45 expresszió és alacsony-közepes granularitás). A 2. ábrán példaként a mieloid sejtek szortírozás előtti és utáni áramlási citometriás diagrammja látható. A HUMARA módszer szenzitivitásának meghatározásához, B-CLL-es betegekből CD5/CD23, vagy CD5/CD19 kettős pozitív monoklonális limfóma sejtek és poliklonális mieloid sejtek meghatározott arányú keverékeit szortíroztuk egy lépésben: 100% CLL, 75-80% CLL + 20-25% mieloid, 50% CLL + 50% mieloid, 20-25% CLL + 75-80% mieloid and 100% mieloid. A keverési arányt a limfóma és mieloid kapuk pozícionálásával állítottuk be a szortírozás kezdetekor, majd a áramlási citométert vezérlő programban szortírozás közben folyamatosan ellenőriztük.

15

2. ábra. Mieloid sejtek áramlási citometriás szortírozása. A különböző színnel jelzett régiók mellett a bennük előforduló sejtek százalékos aránya van feltüntetve.

A CD5, CD19, CD23 és CD45 immunjelöléseket CD5-FITC, CD23-RPE, CD19-RPE-Cy5 és CD45-RPE-Cy5 (DAKO A/S, Denmark) antitestekkel végeztük a gyártó instrukcióinak megfelelően. A szortírozást BD FACSort típusú áramlási citométerrel végeztük (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA). Betegenként általában 105 sejtet szortíroztunk sejtvonalanként. A szortírozott minták tisztasága a szortírozni kívánt sejtek tekintetében áramlási citometriás visszamérés alapján 95%-nál nagyobb volt. A szortírozott sejteket 500 µl TE8 pufferben, ill. 200 µl PBS-ben –20°C-on lefagyasztva tároltuk a DNS izolálásáig.

16

DNS izolálás

A szortírozott sejtekből proteináz-K-s emésztés és fenol-kloroformos extrahálás módszerével, illetve Qiagen Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) segítségével nyertünk DNS-t. A fenol-kloroformos izolálás során 500 µl TE8 pufferben lefagyasztott sejtekhez 10mg/ml koncentrációban adtunk proteináz-K-t és SDS-t (1% végkoncentráció), majd 56°C-on éjszakán át emésztettük. Ezután azonos térfogatú fenollal, majd kloroformmal extraháltuk a DNS-t, végül a vizes fázisból 2,5-szeres térfogatú 100%-os etanollal kicsaptuk, majd centrifugálás és szárítás után TE8 pufferben oldottuk fel úgy, hogy a szortírozott sejtszámot figyelembe véve kb. 3000 sejtnek megfelelő DNS legyen 1 µl-ben. A PBS-ben lefagyasztott szortírozott sejtminták esetében a DNS izolálást a Qiagen Blood Mini kittel végeztük a gyártó előírásának megfelelően és végül a DNS-t 50 µl AE pufferben tároltuk. A DNS mintákat +4°C-on tároltuk felhasználásig, majd -20°C-on archiváltuk.

17

Humán androgén receptor esszé – HUMARA

Az esszé az egyik X kromoszóma inaktivációjan alapul és nők esetében alkalmas specifikus genetikai marker néküli monoklonalitás vizsgálatra45. A módszer egy metiláció-szenzitív restrikciós emésztést és egy PCR reakciót kombinál. A vizsgált androgén receptor szekvencia egy mikroszatellita régiót tartalmaz, amelyben CAG trinukleotid ismétlődések vannak. Az ismétlődések száma változó és kb. 90%os a valószínűsége, hogy az apai és anyai X kromoszómán a CAG ismétlődések száma eltér. Az eltérő ismétlődésszám következtében a vizsgált androgén receptor allél heterozigozitást mutat. Az X kromoszóma inaktivációja metilációval történik, aminek megfelelően az aktív X kromoszóma hipometilált, míg az inaktív hipermetilált. A vizsgált szekvencia tartalmaz metilációs pontokat, amelyeket metilációs státusztól függően metiláció-szenzitív HhaI, ill. HpaII restrikciós enzimekkel hasítani lehet, vagy sem. Heterozigóta nőkben, metiláció-szenzitív hasítás nélkül két eltérő hosszúságú androgén receptor szekvenciát (kb. 220 bp) amplifikálunk PCR-rel, míg a homozigóta nők mintái nem informatívak, mert nem különíthető el az apai és az anyai X kromoszómának megfelelő allél egymástól, ezáltal a poliklonális és monoklonális minták sem – ezt szemlélteti az alábbi 3. ábra.

3. ábra. Androgén receptor PCR metiláció-szenzitív hasítás nélkül.

18

Normál női szövet poliklonális sejtjeiben az X-inaktiváció véletlenszerű, vagyis elvileg a sejtek 50-50%-ban egyik, vagy a másik X kromoszómát hordozzák aktív (metiláció-szenzitív enzimekkel hasítható) formában. Ha egy heterozigóta nő, poliklonális szöveti sejtjeiből végezzük el a metiláció-szenzitív hasítást és ezt követően a PCR amplifikációt, akkor kétféle mólsúlyú terméket fogunk látni a gélen, mivel mindkét X kromoszómából marad nem hasított, amplifikálható templát. Monoklonális proliferáció esetén a tumoros klónból származó sejtek azonos metilációs mintázatot hordoznak, tehát minden sejtben ugyanaz az X kromoszóma hasítódik a metiláció-szenzitív enzimekkel. A hasítás után a PCR csak az egyik allélt tudja amplifikálni, ennek következtében csak egy sávot kapunk az elektroforézis után. Ez alapján a mintát monoklonálisnak tekinthetjük. A 4. ábra szemlélteti a restrikciós emésztéssel kombinált PCR reakciót monokonális és poliklonális minták esetén.

4. ábra. HUMARA: metiláció-szenzitív emésztés és PCR. A PCR reakciót az Allen és munkatársai által leírt protokoll45 alapján dolgoztuk ki, néhány ponton módosítva azt. Első lépésben kb. 10000 sejtnek megfelelő DNS-t emésztettünk 10U HhaI enzimmel Multi-Core pufferben (Promega, Madison, WI, USA) 0,1mg/ml BSA jelenlétében 20µl térfogatban. Az emésztést 37°C-on, éjszakán át történő inkubálással végeztük. Emésztés után a DNS-t 2,5-

19

szeres térfogatú etanollal kicsaptuk és szárítás után 10 µl desztillált vízben feloldva vittük a PCR reakcióba. A 20 µl térfogatú PCR reakcióelegy 10 µl vízben oldott DNS-en túl tartalmazott 200 µM-t minden dNTP-ből (GibcoBRL, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA), 0,5 egységnyi RedTaq DNS polimerázt (Sigma, St. Louis, Missouri, USA), RedTaq puffert és 10 pmol-t mindegyik primerből (5' GCT GTG AAG GTT GCT GTT CCT C 3', 5' AGA GGC CGC GAG CGC AGC ACC TC 3'). Az amplifikációt MJR Minicycler (MJ Research, Watertown, Massachusetts, USA), ill. BioRad iCycler (BioRad Laboratiories, Hercules, CA, USA) PCR készülékkel végeztük a következő programot használva: elődenaturáció: 94°C 5 perc; 40 ciklus denaturació: 94°C 40 mp., primer kapcsolódás: 68°C 40 mp., extenzió: 72°C 1 perc; végső elongáció: 72°C 5 perc. Amplifikáció után a teljes 20 µl PCR elegyet felvittük 8%-os, nem denaturáló poliakrilamid gélre és 120V-on, 25 mA mellett éjszakán át futtatuk, addig amíg a jelzőfestékként használt xilén-cianol a 24 cm hosszú gél aljára nem ért. A gélt SYBR Gold DNS festékkel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) festettük a gyártó által előírt koncentrációban, végül UV transzilluminátort használva polaroid, vagy digitális kamerával lefényképeztük. Polaroid képek esetén a fotót szkenner segítségével digitalizáltuk. Azokban az informatív esetekben, ahol az emésztést követően mindkét allélről történt amplifikáció, a gélfotókat az ImageJ 1.4 program segítségével denzitometráltuk. Azokat a mintákat, amelyekben a PCR 100%-ban csak az egyik allélt tudta amplifikálni és így a fotón csak az egyik allélnek megfelelő sáv volt jelen, denzitometrálás nélkül is monoklonálisnak fogadtuk el.

20

A

B

5. ábra. HUMARA gélfotók. L: limfoid, M: mieloid, +: HhaI-gyel emésztett minta, -: HhaI-gyel nem emésztett minta.

Az 5. ábrán látható gélfotókon az A esetben csak az M+ mintában csökkent jelentősen az egyik allél mennyisége, így csak a mieloid sejtek tekinthetők monoklonálisnak. A B esetben az L+ és M+ mintákban is csak az egyik allélnek megfelelő sáv látható, ezért mindkét sejtvonal sejtjei monoklonálisak. A minták jelentős részében azonban nem egyértelmű az egyik allél arányának nagy mértékű csökkennése, ezért ezeket a mintákat csak denzitometriás analízis alapján tudtuk besorolni poliklonális, ill. monoklonális kategóriákba. A nemzetközi irodalomban gyakran alkalmazott kritérium szerint, ha a két allél aránya legalább 3:1, vagy ennél jobban eltérő, akkor a minta monoklonálisnak tekinthető44,52,75. Viszont több tanulmányban is kimutatták, hogy egészséges nőkben is eltérhetnek az allélarányok az 1:1-től és a 3:1 arány sem mindig jelent megbízható kritériumot a monoklonalitás megállapítására37,44,51. Annak érdekében, hogy megfelelően specifikus legyen a módszerünk, saját kritériumokat dolgoztunk ki a HUMARA eredmények kiértékelésére, amihez egészséges nők véréből szortírozott limfoid és mieloid sejteken is elvégeztük a HUMARA-t. A módszer szenzitivitásának megállapításához a HUMARA-t teszteltük B-CLL-es betegekből szortírozott monoklonális limfóma sejtek és poliklonális mieloid sejtek ismert arányú keverékein is, hogy megállapítsuk mi az a minimális monoklonális sejtarány, aminél a HUMARA még ki tudja mutatni a monoklonalitást.

21

Mikroszatellita-PCR vizsgálatok

Ezeket a vizsgálatokat 1999-2000-ben kollaborációban végeztük a Heidelbergi Egyetemen Prof. Dr. Kovács Gyula laboratóriumában. A PCR amplifikációk MJR PTC-100 és PTC-200 típusú (MJ Research, Watertown, Massachusetts, USA) PCR készülékeken történtek a következő programot használva: elődenaturáció: 94°C 2 perc; 35 ciklus denaturáció: 94°C 40 mp., primer kapcsolódás: 55°C 30 mp., extenzió: 72°C 40 mp.; végső elongáció: 72°C 5 perc. A PCR reakcióelegy tartalmazott kb. 10000 sejtnek megfelelő DNS-t, 0,5 egységnyi Taq polymerase-t (GibcoBRL, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA), 50mM KCl-ot, 10 mM TRIS-t (pH:8,3), 1,5mM MgCl2-ot, 200 µM-t mindegyik dNTP-ből, és 5-5 pmol primert. Az egyik primer mindig jelölve volt Cy5 fluoreszcens festékkel (MWG-BIOTECH AG, Ebersberg, Germany). A következő primereket használtuk: D20S607: AAA ATG TCC AGG CAA CAG AG és ATT GAC AAA TTT CTG GGC TG; D20S170: TTC TCA GGC TCC TGG C és GGG GGC TTC CAT GAG T; D20S96: CAC TGC AAC TCT AAC CTG GG és CCT GTA TGC TGC ATT TCC TG; D20S119: CTG ACA CAG TTT CAG TAT CTC TAT C és TTT CCA GAT TTA GGG GTG TAT G; D20S110: TTG ACA GCC AAA TGA ATT TA és CTA GAC TTA GGT TGA CAT TCT CG; D5S414: GGC CAG TTC AGT CAA GTG és TGG TTC CAG CAT ATA GCG; D5S479: GCA ATA GCA AGA CTC TGA CC és TTC CTG TGT GCC TTA CAG TT. A primer szekvenciákat a Whitehead Institute Center for Genome Research (http://www-genome.wi.mit.edu/) és a The Genome Database (http://gdbwww.dkfz-heidelberg.de/) web-es adatbázisából választottuk. A fenti mikrolszatelliták adatai jelenleg ellenőrizhetők a http://www.ensembl.org/ Homo_sapiens/Info/Index címen, elhelyezkedésük pedig 6. ábrán látható.

22

D20S607

D20S170

D5S476

D5S414

D20S110

D20S96

D20S119

6. ábra. A vizsgált mikroszatellita lókuszok elhelyezkedése a kromoszómákon.

A PCR reakciók termékeinek detektálását és kvantitálását ALFexpress DNA Analysis System (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, USA) típusú automata DNS szekvenáló készülékkel végeztük 5%-os denaturáló poliakrilamid gélen futtatva a termékeket, 1500 V, 38 mA, 15W, 55°C paraméterek mellett. A kiértékelést a készülék szoftvere által készített denzitometriás görbék alapján végeztük. Az egyes alléleknek megfelelő csúcsok jelenléte, illetve területe alapján (7. ábra) értékeltük a mintákat, majd megtartott (retained-R), deletált (D), és allélikus kiegyensúlyozatlanságot (allelic imbalance-AI) kategóriákba soroltuk. A kategóriákba soroláshoz egy 0-tól 4-ig terjedő skálát használtunk. Nulla értéket, vagyis R besorolást kaptak a kontroll szájnyálkahártyával megegyező minták. Négyes, vagyis D besorolást azok a minták, amelyekben az egyik allél teljesen

23

elveszett. Az AI kategóriában kettes értéket kapott egy minta, ha a kontrollban látható csúcshoz képest a mintában a deletálódó allélnek megfelelő csúcs relatív aránya kb. 50%-ra csökkent a kotrolléhoz képest. Ezt a következőképpen számoltuk ki: 1. egy mintán belül a csúcsok százalékos arányát az egyes csúcsok területe és két csúcs területének összegének hányadosával kaptuk meg. 2. A vizsgált mintákban kontrollhoz képest csökkenő csúcs (deletálódó allél) százalékos arányát elosztottuk a kontrollban ugyanezen allél százalékos arányával. Hármas AI értéket adtunk egy mintának, ha 50%-nál jelentősen nagyobb volt a relatív allélarány eltolódás, de nem volt teljes deléció. Egyes AI értéket kapott a minta, ha 50%-nál jelentősen kevesebb volt az allélarány eltolódás. A PCR reakció és a fluoreszcens detektálás pontatlansága miatt az AI 1-es besorolást, csak akkor tekintettük egy mintában elfogadhatónak, ha legalább 2 lókuszon is előfordult párhuzamosan. A fenti MS-PCR értékelési rendszert Langbein és munkatársai cikke nyomán alkalmaztuk76.

7. ábra. MS-PCR görbék. Az A és B ábrákon két beteg mintái láthatók. Mindkét esetben felül van a kontroll szájnyálkahártya (SZ), középen a limfoid (L) és alul a mieloid (M) sejtek görbéje. Az A ábrán a limfoid és mieloid sejtvonalban is megtartott (R) a mikrolszatellita allélek aránya. A B ábrán a limfoid sejtek allélikus kiegyensúlyozatlanságot (AI) mutatnak, míg a mieloidokban teljes deléció (D) látható. 24

JAK2V617F mutációs vizsgálatok

Baxter és munkatársai67 leírása alapján a következő PCR primereket használtuk (8. ábra): mutáns allélre specifikus forward primer (5’AGC ATT TGG TTT TAA ATT ATG GAG TAT ATT3’), belső kontrollként alkalmazott forward primer (5’ATC TAT AGT CAT GCT GAA AGT AGG AGA AAG3’), és egy közös reverz primer (5’CTG AAT AGT CCT ACA GTG TTT TCA GTT TCA3’). A két forward és egy reverz primer két PCR termék egyidejű amplifikációját teszi lehetővé. A belső kontrollként szereplő primer és a reverz primer egy 364 bázispár hosszúságú terméket ad, amely kontrollként alkalmas a DNS templát minőségének megítélésére. Ha a vizsgált DNS mintában nincs jelen a mutáció, akkor csak a belső kontroll terméket kapjuk meg. Amennyiben a DNS templát tartalmazza a JAK2V617F mutációt, akkor a mutációra specifikus primer is PCR terméket eredményez és egy második, 203 bázispárnyi amplikont is kapunk a 364 bázispárnyi kontroll mellett.

8. ábra. JAK2V617F mutáció-specifikus PCR sematikus ábrázolása. Kék színű sáv a templát DNS-t jelöli. A G/T a mutáció helye. P1: kontroll forward primer. P2: reverz primer. P3: mutáció-specifikus forward primer. A sárga sáv a kontroll terméket, a rózsaszín sáv a mutáció-specifikus terméket jelzi.

A PCR reakció komponensei 25 µl végtérfogatban a következők voltak: kb. 10000 sejtnek megfelelő DNS TE8, vagy AE pufferben, 1 egységnyi Sigma Genomic RedTaq DNS polimeráz (Sigma, St. Louis, MO, USA), 3 mM MgCl2, 200µM dNTP, 25

12.5 pmol reverz primer, 6.25 pmol belső kontroll forward primer, 6.25 pmol mutáció-specifikus forward primer, valamint Sigma Redtaq puffer. A PCR reakció a következő program szerint futott: 95°C elődenaturálás 5 perc; 40 ciklus 95°C denaturálás 30 mp., 53°C primer kapcsolódás 30mp., 72°C extenzió 1perc; 72°C végső elongáció. Néhány esetben, ahol kevés DNS maradt a HUMARA vizsgálatok elvégzése után és biztosak akartunk lenni a JAK2V617F mutáció vizsgálat sikerességében, teljes genom amplifikációt végeztünk a maradék DNS-ből Qiagen REPLI-g Kit-tel (Qiagen, Hilden, Germany) a gyártó által ajánlott protokoll szerint, majd 1 µl amplifikált DNS-t használtuk a JAK2V617F PCR-hez. A PCR termékeket 2%-os agaróz gélen szeparáltuk, SYBR Gold DNS festés után, UV megvilágítás mellett és digitális fénykép formájában dokumentáltuk. A kiértékelés során a fényképen szemmel látható termék megléte, ill. hiánya alapján soroltuk a mintákat JAK2V617F mutációra pozitív és negatív kategóriába (9. ábra).

9. ábra. JAK2V617F mutáció-specifikus PCR gélfotója. A bal szélső minta a molsúly marker. Középen egy negatív minta látható a 364 bázispár hosszúságú kontroll termékkel. A jobb szélső minta a mutációra pozitív, mert a kontroll termék mellett megtalálható benne a 203 bázispárnyi mutációra specifikus amplikon is.

26

EREDMÉNYEK

A HUMARA kiértékelési kritériumainak, specifitásának és szenzitivitásának meghatározása

A 10. ábrán egy HUMARA gélelektroforézis fotó és ennek denzitometriás görbéi láthatók. A két AR allél inaktivációjának aránya a denzitometriás görbén látható csúcsok alatti területek arányával jellemezhető. Az arány kiszámításához az egyes csúcsok területét elosztottuk a két csúcs összterületével. Az X kromoszóma inaktiváció számszerű jellemzéséhez a kisebb molsúlyú allél százalékos arányát használtuk fel, amely értéket X inaktivációs számnak neveztünk el - XISZ. A XISZ értéke 0% és 100% mozoghat. Teljesen véletlenszerű XI-t feltételezve a XISZ értékének 50%-nak kell lennie. Azonban nem véletlenszerű XI esetén a XISZ eltér az 50%-tól. Homogén monoklonális mintában a XISZ értéke 0%, vagy 100%.

10. ábra. HUMARA gélfotó és denzitometriás görbék. Az a és b, ill a’ és b’ a két allélt jelöli a denzitometriás görbéken és a gélen. M: mieloid. L: limfoid. NE: metiláció-szenzitív enzimmel nem emésztett minta. E: metiláció-szenzitív enzimmel emésztett minta.

27

Huszonhét egészséges nő mintáit megvizsgálva 21-et találtunk heterozigótának és így a vizsgálatra alkalmasnak. Az 1. táblázatban a 21 informatív egészséges nő XISZ értékei láthatók a szortírozott limfoid és mieloid sejtvonalakban.

1. táblázat. Egészséges nők HUMARA eredményei. minta azonosító 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 átlag+S.D.

L M (XISZ) (XISZ) 37 90 78 40 60 61 50 83 83 57 51 39 40 34 55 62 63 82 60 70 56 37 30 49 22 85 86 50 67 73 55 39 38 32 73 75 39 5 56 80 100 32 100 75 51 71 59 63 71 55 30 59 37 50 59 73 23 87 85 48 56 82 44,5 65,2±20.0 64,1±22,4 L: limfoid, M: mieloid. kor (év)

Az 1. táblázat adatai szerint gyenge eltolódás mutatkozik a kisebb molsúlyú allél javára a XISZ értékekben, ami nem véletlenszerű XI-re utalhat. A XISZ átlaga 65,2% és 64,1% a limfoid és mieloid sejtvonalakban, jelentős mértékű sztenderd deviáció (S.D.) mellett (20,0%, ill. 22.4%). Az 50%-nál magasabb XISZ-nek a nem véletlenszerű XI-n kívül lehet technikai jellegű magyarázata is, ugyanis a magas PCR ciklusszám (40) miatt a kisebb allél előnyre tehet szert az amplifikáció során. Ezt okozhatja, hogy az amplifikált szakasz magas GC tartalma miatt viszonylag stabil másodlagos struktúrák alakulhatnak ki, ami jobban érinti a nagyobb CAG 28

ismétlődés számot tartalmazó allélt, így annak amplifikációjára negatív hatással lehet77. Annak érdekében, hogy megfelelően értékeljük a betegmintákat, amelyekben monoklonális sejtek okozhatják a nem véletlenszerű XI-t, olyan XISZ határértékeket kellett meghatároznunk amelyek még elfogadható álpozitivitást adnak a kontrollként vizsgált egészséges nők poliklonális mintáiban, vagyis elegendően specifikusak (2. táblázat). 1. Megvizsgáltuk, hogy milyen specificitást adnak a XISZ átlag ± 1 S.D. és a XISZ átlag ± 2 S.D. határértékek. A XISZ átlag ± 1 S.D. kritérium specificitását alacsonynak találtuk (80%, 76%). A XISZ átlag ± 2 S.D. kritérium túl szigorúnak bizonyult, mert az elvi 100%-os maximum XISZ értéket is meghaladó határértékeket adott. 2. Az irodalmi adatok szerint gyakran alkalmazott 3:1-es allélarány kritériumot megvizsgálva a limfoid sejtekben 70%, mieloidokban 52% volt a specificitás. Tehát ez a klonalitás kritérium bizonyult a leggyengébb specificitásúnak. 3. Annak érdekében, hogy megfelelően specifikus kritériumokat kapjunk meghatároztunk egy olyan poliklonális XISZ tartományt alsó és felső határértékekkel a limfoid és a mieloid sejtek esetében is, amely magában foglalta kontroll minták 90%-át, vagyis ezen a tartományon belül kisebb, mint 10%-os az álpozitivitás, ami legalább 90%-os specificitást jelent. A tartomány határétékeit úgy határoztuk meg, hogy egyenlő arányban hagytuk el mind az alsó, mind a felső extrém XISZ értékeket a kontroll nőkben mért XISZ értékek közül.

2. táblázat. Különböző határértékeket használó klonalitás kritériumok specificitása. Limfoid sejtek XISZ tartomány specificitás átlag ±1S.D 80% 45,2-85,2 átlag ±2S.D. 100% 25,2-105,2 3:1 arány 70% 34-90 90%

Mieloid sejtek XISZ tartomány specificitás átlag ±1S.D 76% 41,7-86,5 átlag ±2S.D. 95% 19,3-108,9 3:1 arány 52% 37-86 90%

29

4. Végül mivel mérsékelten erős korrelációt (korrelációs koefficiens=0.646) találtunk a limfoid és a mieloid XISZ értékek között, megvizsgáltuk, hogy vajon lehet-e őket használni kölcsönösen, egymás kontrolljaként abban az esetben, ha csak az egyik sejtvonalban alakul ki monoklonális proliferáció. Amennyiben csak az egyik sejtvonal monoklonális, akkor annak XISZ értéke feltehetően jelentősen el fog térni a másik, poliklonális sejtvonal XISZ értékétől. Megkerestük azt a XISZ különbség értéket az egészséges, kontroll nők limfoid és a mieloid sejtei között, amelynél nagyobb érték nem fordult elő az esetek 90%-ában. Ez a különbség érték 26-nak adódott. Ennél nagyobb különbség a limfoid és mieloid sejtek XISZ értékei között a kontroll nők kevesebb, mint 10%-ban fordult elő, ezért ezt a típusú kritériumot is legalább 90%-os specificitásúnak fogadtuk el. Meg kell azonban jegyezni, hogy csak ezt a kritériumot használva egyértelműen nem lehet megállapítani, hogy a két sejtvonal közül melyik a monoklonális.

A HUMARA szenzitivitásának meghatározásához monoklonális limfóma sejtek és poliklonális mieloid sejtek ismert arányú keverékeit vizsgáltuk meg 4 BCLL-es beteg mintáiban. A 3. táblázat adatai és a 11. ábra azt mutatja, hogy ha a vizsgált mintában legalább 75% volt a monoklonális sejtek aránya, akkor a monoklonalitás egyértelműen meghatározható, mivel a XISZ értéke 0%, vagy 100%. Kevesebb mint 75% monoklonális sejt esetén alkalmazhatóak a fentiekben meghatározott kritériumok (3. és 4. pont). A 3. táblázatban az 1-es minta esetében 50-60%-nyi monoklonális sejt esetén 53% a XISZ értéke, ami a limfoid sejtekre érvényes poliklonális tartomány (XISZ=34-90%) szerint a poliklonális tartományba esik, viszont a limfoid-mieloid XISZ különbséget figyelembe vevő kritérium alapján a keverék mintát az ismert XISZ értékű (8%) poliklonális mieloid sejtekhez viszonyítva, a két XISZ érték különbsége több mint 26% és így ez a minta is monoklonálisnak tekinthető. A 3. táblázatban 2,3,4-es minták monoklonálisnak tekinthetők (XISZ=30%, 23%, 27%), mert kívül esnek a 34-90%-os poliklonális tartományon, habár a 2-es mintában a XISZ különbség kritérium nem teljesül. A 20-25% CLL-es sejtet tartalmazó keverékekben az 1-es esetben a 19%-os XISZ érték 30

alapján monoklonálisnak kéne tekinteni a mintát, de a XISZ különbséget figyelembe vevő kritérium szerint nem, mert a keverék minta és a poliklonális minta XISZ különbsége csak 8%. A 2,3,4-es mintákban egyik kritérium alapján sem igazolható a monoklonalitás. Ezen adatok alapján megállapítható, hogy az 50-60% monoklonális sejtet tartalmazó minták mindegyikében legalább 1 kritérium alapján monoklonalitás volt igazolható. Ezzel szemben a csak 20-25% monoklonális sejtet tartalmazó mintákban a 4 esetből csupán az egyikben és ott is csak az egyik kritérium alapján merült fel a monoklonalitás lehetősége.

3. táblázat. XISZ értékek a monoklonális CLL + poliklonális mieloid sejt keverékekben. XISZ értékek a CLL + mieloid keverékekben (%) minta 100%CLL 75-80%CLL 50-60%CLL 25-20%CLL 0%CLL azonosító 1 100 100 53 19 8 2 0 30 41 52 3 0 0 23 63 82 4 0 0 27 47 70

11. ábra. HUMARA a monoklonális+poliklonális keverék mintákban. A XISZ értékek és a monoklonális sejtarány viszonya a keverék mintákban (A). A különböző keverékek gélfotója (B) és a denzitometriás görbéi (C). A denzitometriás görbéken az NE a metiláció-szenzitív enzimmel nem emésztett mintát jelöli, az E pedig az emészett mintákat.

31

Végül megvizsgáltuk a korrelációt, az ismert arányú monoklonális sejtet tartalmazó keverékekben a valódi és a mért XISZ értékekből számított monoklonális sejtarányok között. Az alábbi algoritmus alapján az tisztán monoklonális (XISZM) és tisztán poliklonális minták XISZ értéke (XISZP), valamint a keverék mintában mért XISZ értéke (XISZmért), alapján számítható ki a mintában lévő monoklonális sejtek aránya (M%).

M% 100 − M% × XISZ M + × XISZ P = XISZmért 100 100

€

M%:

a mintában lévő monoklonális sejtek százalékos aránya

XISZM:

a tisztán monoklonális minta XISZ értéke (100% CLL)

XISZP:

a tisztán poliklonális minta XISZ értéke (100% mieloid)

XISZmért:

keverék minta mért XISZ értéke (CLL + mieloid)

A vizsgált 20-60% monoklonális sejteket tartalmazó mintákban, a számított és a valódi monoklonális sejtarányok között erős korrelációt találtunk (r=0.86), ami alátámasztja a módszer kvantitatív jellegét és alkalmasságát keverék minták vizsgálatára (4. táblázat).

4. táblázat. Valódi és számított monoklonális sejtarányok korrelációja, különböző arányú monoklonális sejtet tartalmazó keverékekben. minta azonosító 1 2 3 4 1 2 3 4 korreláció

valódi számított monoklonális monoklonális sejtarány (%) sejtarány (%) 25 20 20 20 50 60 60 60

12 32.8 21.2 23.2 48.9 61 42.3 72 r=0.86

32

HUMARA – klonalitás eredmények

A vizsgálatok sikerességét tekintve a következő eredményeket kaptuk. A 143ból 98 (69%) eset volt heterozigóta és informatív. Negyvenöt eset (31%) a két androgén receptor allél homozigozitása, vagy a gél feloldóképességénél kisebb méretkülönbsége miatt, ill. gyenge PCR reakció miatt nem volt informatív. Az összes informatív HUMARA eredményt foglalja össze az 5. táblázat. Az informatív esetek közül 29 volt MDS. Hat eset volt MDS-RA, amelyekből 2-ben mindkét sejtvonal monoklonálisnak bizonyult, míg 4 esetben csak mieloid monoklonalitást tapasztaltunk limfoid poliklonalitás mellett. Három MDS-RAEB-ből 2 monoklonalitást mutatott mindkét sejtvonalban, 1 esetben, ahol blasztokat is tudtunk izolálni, csak a blasztok voltak monoklonálisak. Tizenhét MDS-u esetből 4 esetben mind a limfoid, mind a mieloid vonalat monoklonálisnak találtuk, 6 esetben csak a mieloid sejtek voltak pozitívak, 3 esetben csak a limfoidok voltak monoklonálisak, 2 esetben nem sikerült kimutatni monoklonalitást és 1 esetben a csak a mieloid sejtek monoklonalitása volt kimutatható, a limfoidokból technikai okok miatt nem kaptunk eredményt. Három MDS-ből transzformálódott AML-ben, 1 esetben kettős monoklonalitást, 1 esetben csak mieloid monoklonalitást találtunk és 1 esetben mindegyik sejtvonal poliklonálisnak bizonyult. Az MPN-es betegek közül 69 volt informatív a HUMARA vizsgálatra. Ezen esetek közül 34 volt ET. Tíz ET-ben találtuk monoklonálisnak mindkét sejtvonalat, 14 ET-s esetben csak a mieloid sejtek voltak monoklonálisak. Két ET-s esetben poliklonálisnak bizonyult mindkét sejtvonal. 5 ET-s esetben csak a mieloid sejtekből tudtuk elvégezni a vizsgálatot, amelyekben ezek monoklonálisak bizonyultak. Tíz PV-s esetből 5-ben mindegyik sejtvonal monoklonális volt, 4 esetben csak a mieloidok voltak monoklonálisak és egy esetben csak a mieloid sejtekből sikerült elvégezni a vizsgálatot, ahol azok monoklonálisak voltak. Nyolc HES esetből mindegyikben vizsgáltuk az eozinofil granulocitákat is. Két HES-ben mindhárom sejtvonal monoklonális volt. Egy HES-ben limfoid-mieloid monoklonalitást találtunk poliklonális eozinofilek mellett, egy másikban mieloid-eozinofil monoklonalitás volt kimutatható poliklonális limfocitákkal. Két HES-ben a 3 sejtvonalból csak a mieloidok voltak monoklonálisak. Szintén 2 HES-ben mindhárom sejtvonal 33

poliklonálisnak bizonyult.

Két PMF esetből az egyikben mindkét sejtvonal, a

másikban csak a limfoid sejtek voltak monoklonálisak. Tizenöt MPN-u-ból 5-ben mindegyik sejtvonal monoklonális volt, 6 esetben csak a mieloidok, 1 esetben csak a limfoidok voltak monoklonálisak, 1 esetben mindkét sejtvonal poliklonális volt és 2 esetben a limfoidok sikertelen vizsgálata mellett találtunk monoklonális mieloidokat.

5. táblázat. Az egyes betegség típusokban kapott HUMARA klonalitás eredmények. Eset szám

L+ M+

MDS-RA

6

2

MDS-RAEB MDS-u MDS-AML MDS összes

3 17 3 29

2 4 1 9

Klonalitás a sejtvonalakban LL+ LM+ MM-

Lnk M+

4 6 1 11

3 3

B+:1 2 1 4

MPN-ET 34 10 13 6 MPN-PV 10 5 4 MPN-PMF 2 1 1 MPN-u 15 5 6 1 1 Eo+: 2 MPN-HES 8 Eo-: 1 Eo+:1 Eo-: 2 Eo-: 2 MPN összes 69 24 26 2 9 L+: limfoid monoklonális, L-: limfoid poliklonális, Lnk: limfoidokból nem

2 2 5 1 2 8 készült

vizsgálat, M+: mieloid monoklonális, M-: mieloid poliklonális, B+: blaszt monoklonális, Eo+: eozinofil monoklonális, Eo-: eozinofil poliklonális

Összességében MDS-ben és MPN-ben hasonló arányokat kaptunk monoklonalitás tekintetében. A kettős limfoid-mieloid monoklonális esetek aránya 31% volt MDS-ben és 35% MPN-ben. A csak mieloid monoklonalitást mutató esetek aránya mindkét betegség csoportban 38% volt. Kizárólag limfoid monoklonális esetek 10%-ban fordultak elő MDS-ben és 3 %-ban MPN-ben. Az MDS-ek 18%-a, az MPN-ek 13%-a volt poliklonális. Mieloid monoklonalitás 76%-ban fordult elő MDS-ben és 85%-ban MPN-ben. A limfoid monoklonalitás aránya 41% volt MDSben és 38% MPN-ben. Bármilyen sejtvonalban jelentkező monoklonalitás az MDS ek 82%-ára, az MPN-ek 87%-ára volt jellemző. 34

Az MDS átlag értékektől valamelyest eltértek az MDS-RA esetek arányai, ahol 8%-kal kisebb arányú limfoid (33%) és jelentősen, 24%-kal magasabb arányú mieloid (100%) monoklonalitást találtunk. Azonban az MDS-RA eredmények mindössze 6 esetből származnak, így ezek az eltérések nem tekinthetőek statisztikailag megbízhatónak. Az átlagos MPN értékektől szintén eltértek az ET-s és PV-s esetek. ET-ben 9%-kal volt alacsonyabb (29%), PV-ben 12%-kal volt magasabb (50%) a limfoid monoklonális arány az MPN átlaghoz képest. A mieloid sejtek monoklonalitása tekintetében csak a PV mutatott jelentősebb eltérést az átlagtól, ugyanis 100%-ban monoklonálisak voltak mieloid sejtek. PMF-ben csak 2 esetet vizsgáltunk, így ezek jelentős eltérését az átlagtól nem tartjuk megbízhatónak.

35

Mikroszatellita-PCR eredmények

Harmincöt esetben készültek MS-PCR vizsgálatok. Ezen vizsgálatok segítségével a szortírozott limfoid és mieloid populációkban előforduló 5q és 20q deléciókat vizsgáltuk. Tizenkettő vizsgált MDS esetből 1 MDS-RA esetében (8%) mutattunk ki teljes 5q deléciót az D5S476 lókuszon, amely csak a mieloid sejteket érintette. Egy MDS-u-ban (8%) 20q deléciót találtunk a D20S96 és AI 1-et a D20S110 lókuszokon a mieloid sejtekben (6. táblázat).

6. táblázat. MDS-es betegek MS-PCR eredményei. diagnózis MDSRAEB MDS-RA MDS-RA MDS-RA MDS-RA MDS-u MDS-u MDS-u MDS-u MDS-u MDS-u MDS-u

minta D20S607 D20S170 D20S110 D20S96 D20S119 D5S476 D5S414 azonosító 2M

R

R

NI

NI

R

R

NI

12L 12M 13L 13M 16L 16M 52L 52M 11L 11M 14L 14M 19L 19M 23L 23M 27L 27M 31L 31M 55L 55M

R R NI NI NI NI ND R R R NI NI R R NI NI R R R R R R

NI NI NI NI NI NI ND R R R NI R R R R R R R R R NI NI

R R R R NI NI ND R NI NI NI NI NI NI NI NI R R R AI 1 R R

R R R R NI NI ND R NI NI NI R NI NI R R NI NI NI D R R

R R R R R R ND R NI NI R R R R R R R R R R R R

R R R R 0 D ND R R R R R NI NI NI NI NI NI R NI NI NI

NI NI NI NI NI NI ND NI R R NI NI R R NI NI R R R R R R

A vizsgált lókuszok a 20q-n: D20S607, D20S170, D20S110, D20S96, D20S119. A vizsgált lókuszok az 5q-n: D5S476, D5S414. A minta azonosítóknál a szám az esetet, az L a limfoid, az M a mieloid mintákat jelenti. A szürkével jelölt cellák mutatják a delécióra utaló eredményeket. R: megtartott, AI: allélikus kiegyensúlyozatlanság, D: deléció, NI: nem informatív, ND: nem készült vizsgálat

36

Huszonhárom MPN-es esetet vizsgáltunk MS-PCR-ral az 5q és 20q deléció szempontjából (7. táblázat). Hat MPN-ben (26%) mutattunk ki 20q deléciót, vagy allélikus kiegyensúlyozatlanságot. Ezek közül 3 esetben (13%) a limfoid és mieloid sejtvonal egyaránt érintett volt, míg a másik 3 MPN-ben (13%) csak a limfoid sejtek voltak érintettek. Huszonkét MPN-ből 3 esetben (13%) találtunk 5q érintettséget. Mindhárom esetben érintett volt a mieloid vonal, míg a limfoidok csak egy esetben. Egy esetben (4%) fordult elő egyszerre 20q és 5q érintettség egy HES-es betegben, azonban a 20q deléció csak limfoidokban, az 5q AI csak mieloidokban volt kimutatható.

37

7. táblázat. MPN-es betegek MS-PCR eredményei minta D20S607 D20S170 D20S110 azonosító 5L NI R NI PV 5M NI R NI 30L R R R PV 30M R R R 6L AI 3 R R PMF 6M R R NI 41L NI R NI PMF 41M NI R NI 9L NI R NI ET 9M NI R NI 25L NI R NI ET 25M NI R NI 33L R R R ET 33M R R R 36L R NI R ET 36M R NI R 40L R R NI ET 40M R R NI 44L R R NI ET 44M R R NI 46L R R R ET 46M R R R 51L NI R AI 1 ET 51M NI R AI 1 54L R R R ET 54M R R R 15L R NI R MPN-u 15M R NI R 18L AI 1 NI ND MPN-u 18M AI 1 NI ND 43L R R ND MPN-u 43M R R R 45L AI 1 AI 1 NI MPN-u 45M D D D 48T NI R R MPN-u 48M NI R R 20T AI 1 NI R HES/CEL 20M NI NI R 20Eo NI NI R 28L R D NI HES 28M AI NI NI 56L R R R HES 56M R R R 56Eo R R R 57L NI AI 2 R HES 57M R R R 57Eo NI R R 7L R R NI MPN/ MDS 7M R R NI CMML 7Mo R R NI diagnózis

D20S96 NI NI R R AI 3 R R R NI NI R R R R R R R R R R R R R AI 1 R R AI 1 R AI 1 AI 1 R R R D R R NI NI NI R R R R R NI R NI R R R

D20S119 D5S476 D5S414 NI NI R R R R R R R R R R R R R AI 1 R R NI NI AI 1 R AI 1 AI 1 R AI 1 R R ND NI R R NI D NI R R R R NI NI NI R R AI 1 AI NI R R R

NI NI R R R R R R NI D ND AI 1 R R R R R R R NI R R NI NI ND ND R R ND ND AI 1 R R R ND ND R R R R AI 1 ND ND ND ND ND ND NI NI NI

NI NI AI 1 R R R R R ND D ND NI R R NI NI R R AI 1 AI 3 NI NI NI NI R R NI NI ND ND ND R ND ND NI NI NI NI NI ND AI 2 NI NI NI NI NI NI R R R

A vizsgált lókuszok a 20q-n: D20S607, D20S170, D20S110, D20S96, D20S119. A vizsgált lókuszok az 5q-n: D5S476, D5S414. A minta azonosítóknál a szám az esetet, 38

L a limfoid, az M a mieloid mintákat jelenti. A szürkével jelölt cellák a normáltól (egészségestől) eltérő eredményeket mutatják. R: megtartott, AI: allélikus kiegyensúlyozatlanság, D: deléció, NI: nem informatív, ND: nem készült vizsgálat

39

Párhuzamos HUMARA és mikroszatellita-PCR eredmények

Húsz esetben készült párhuzamos HUMARA és MS-PCR vizsgálat. Tizenkét MPN-t (8. táblázat) és 8 MDS-t (9. táblázat) vizsgáltunk. Tizenkét MPN-ből 4 esetben (33%), 1 ET-ben, 2 MPN-u-ban és 1 HES-ben fordult elő MS-PCR-rel kimutatható deléció, vagy allélikus kiegyensúlyozatlanság és HUMARA-val kimutatható monoklonalitás párhuzamosan. MS-PCR-rel kimutatható érintettség csak olyan esetekben fordult elő, amelyek HUMARA-val monoklonálisak voltak, fordítva soha.

8. táblázat. Párhuzamos MS-PCR és HUMARA vizsgálatok eredményei MPNben. minta D20S607 D20S170 D20S110 D20S96 D20S119 D5S476 D5S414 HUMARA azonosító 9L NI R NI NI R NI ND P ET 9M NI R NI NI R D D M 25L NI R NI R R ND ND NI ET 25M NI R NI R R AI 1 NI M 40L R R NI R R R R M ET 40M NI R NI R R R R M 46L R NI R R AI 1 R R NI ET 46M R NI R R R R R M 5L NI R NI NI NI NI NI P MPN-PV 5M NI R NI NI NI NI NI M 41L AI R NI R R R R M PMF 41M NI R NI R R R R M 18L AI 1 NI ND AI 1 ND ND ND M MPN-u 18M AI 1 NI ND AI 1 NI ND ND M 43L NI R ND NI R AI 1 ND M MPN-u 43M R R R NI R R R M 45L AI 1 AI 1 NI R NI R ND P MPN-u 45M D D D D D R ND M 48L NI R R R NI NI NI M MPN-u 48M NI R R R NI NI NI M 20L AI 1 NI R R R R NI M 20M NI NI R R NI R NI M HES 20Eo NI NI R R R R NI M 56L R R R R NI NI NI NI 56M R R R R R NI NI M HES 56Eo R R R R R NI NI M 57L NI AI 2 R NI AI 1 NI NI M 57M R R NI R NI NI NI M HES 57Eo NI R NI R NI NI NI M

diagnózis

A vizsgált lókuszok a 20q-n: D20S607, D20S170, D20S110, D20S96, D20S119. A vizsgált lókuszok az 5q-n: D5S476, D5S414. A minta azonosítóknál a szám az esetet,

40

az L a limfoid, az M a mieloid mintákat jelenti. A szürkével jelölt cellák a normáltól (egészségestől) eltérő eredményeket mutatják. R: megtartott, AI: allélikus kiegyensúlyozatlanság, D: deléció, NI: nem informatív, ND: nem készült vizsgálat.

A 8 MDS-ből csak 1 MDS-RA esetben tudtunk kimutatni párhuzamosan 5q érintettséget MS-PCR-rel és monoklonalitást HUMARA-val a mieloid sejtvonalban. A többi esetben nem találtunk MS-PCR-ral eltérést a normál kariotípustól.

9. táblázat. Párhuzamos MS-PCR és HUMARA vizsgálatok eredményei MDSben. diagnózis MDS RAEB MDS-RA MDS-RA MDS-RA MDS-RA MDS-u MDS-u MDS-u

minta D20S607 D20S170 D20S110 D20S96 D20S119 D5S476 D5S414 HUMARA azonosító 2M

R

R

R

NI

R

R

NI

M

12L 12M 13L 13M 16L 16M 52L 52M 19L 19M 23M 23M 55L 55M

R R NI NI NI NI ND R R R NI NI R R

NI NI R R NI NI ND R R R R R NI NI

R R R R NI NI ND R NI NI NI NI R R

R R R R NI NI ND R R R R R R R

R R R R R R ND R R R R R R R

R R R R R D ND R NI NI NI NI NI NI

NI NI NI NI NI NI ND NI R R NI NI R R

P M P M P M NI P M P P M M M

A vizsgált lókuszok a 20q-n: D20S607, D20S170, D20S110, D20S96, D20S119. A vizsgált lókuszok az 5q-n: D5S476, D5S414. A minta azonosítóknál a szám az esetet, az L a limfoid, az M a mieloid mintákat jelenti. A szürkével jelölt cellák a normáltól (egészségestől) eltérő eredményeket mutatják. R: megtartott, AI: allélikus kiegyensúlyozatlanság, D: deléció, NI: nem informatív, ND: nem készült vizsgálat.

41

Párhuzamos JAK2V617F mutáció és HUMARA eredmények

Összesen 28 MPN esetben végeztünk sejtvonal specifikusan JAK2V617F allélspecifikus PCR-t és ezek közül 11-ben párhuzamosan HUMARA is készült. Olyan eseteket vizsgáltunk, amelyekről a rutin patológiai diagnosztikai eljárás során, teljes vérből végzett vizsgálattal kiderült, hogy hordozzák a JAK2V617F mutációt. A JAK2V617F mutáció az összes esetben kimutatható volt a mieloid sejtekben. Hat PMF-ből 5 (83%), 9 PV-ből 8 (89%), 12 ET-ből 8 (67%) és 1 MPN-u esetben a limfoid sejtek is hordozták a mutációt. Az 10. táblázatban összehasonlítottuk, hogy sejtvonal specifikusan végezve a két vizsgálatot, mennyire fedik át egymást a JAK2V617F mutációs és klonalitás eredmények. A 11 esetből 7-ben (64%) egyezést mutatott a két vizsgálat sejtvonal szinten a JAK2V617F mutáció előfordulása és a monoklonalitás szempontjából. Négy esetben (36%) fordult elő, hogy a JAK2V617F mutációt mutató sejtvonalban a HUMARA vizsgálat nem tudott monoklonalitást igazolni. A HUMARA vizsgálat 10 esetben (91%) igazolt mieloid, 4 esetben (36%) a mieloiddal párhuzamos limfoid monoklonalitást és 1 esetben (9%) poliklonalitást mutatott mindkét sejtvonalban.

42

10. táblázat. Párhuzamos JAK2V617F mutáció és HUMARA vizsgálatok eredményei. Diagnózis

minta azonosító

JAK2 L/M

HUMARA L/M

PMF PMF

225 233

+/+ +/+

NI ND

PMF

234

+/+

ND

PMF

235

-/+

ND

PMF

236

+/+

ND

PMF

237

+/+

ND

PV PV

137 152

+/+ +/+

-/+ +/+

PV

163

+/+

+/+

PV

177

+/+

-/+

PV

203

-/+

-/+

PV

218

+/+

+/+

PV

224

+/+

ND

PV

227

+/+

-/+

PV

238

+/+

ND

ET ET

135 136

+/+ -/+

NI -/+

ET

146

-/+

-/+

ET

192

-/+

-/-

ET

222

+/+

ND

ET

239

+/+

ND

ET

240

+/+

ND

ET

241

+/+

ND

ET

242

+/+

ND

ET

243

+/+

ND

ET

244

-/+

ND

ET

245

+/+

ND

MPN-u

217

+/+

+/+

L/M: limfoid és mieloid sejtvonal párhuzamos ereményei. NI: nem informatív, ND: nem készült vizsgálat. HUMARA esetén a negatív eredmény poliklonalitást, a pozitív eredmény monoklonalitást jelent. A JAK2V617F vizsgálatnál a negatív eredmény a mutáció hiányát, a pozitív eredmény a mutáció jelenlétét jelenti. A szürkével jelölt esetek mindkét vizsgálattal egyforma eredményt adtak.

43

MEGBESZÉLÉS

Irodalmi áttekintés

A nemzetközi szakirodalomban nem egyértelműen eldöntött kérdés, hogy MDS-ben és MPN-ben a neoplasztikus folyamat kiindulópontjának a hemopoézis mely stádiuma felel meg. Egyre több adat mutat abba az irányba, hogy őssejt eredetű folyamatokról van szó. A mieloid neopláziák a WHO besorolás szerint is hemopoetikus őssejt betegségek. Viszont nem egyértelműen tisztázott, hogy a tumor mieloid irányban elkötelezett, vagy pluripotens őssejtből indul-e ki, illetve, hogy betegség típusonként vannak-e különbségek. Knuutila9-10 két összefoglaló tanulmányában az egyes hematológiai tumorok sejtvonal érintettségét vizsgálta, amelyben az irodalmi adatokat és saját eredményeit foglalta össze. Ezek szerint MDS esetében bizonyított a mieloid vonal érintettsége, amit különböző citogenetikai eltérésekkel, valamint X-inaktivációs klonalitás vizsgálatok segítségével igazoltak, viszont a limfoid sejtek a legtöbb esetben nem hordoznak kromoszóma eltérést. Néhány beszámolót említ, ahol B-sejtekben is kimutattak genetikai aberrációt, de csak a sejtek kis részében, vagy Epstein-Barr vírussal (EBV) transzformált limfoid sejtvonalakon. Ezen utóbbi adatok a pluripotens eredet lehetőségére irányítják a figyelmet. Konklúzióként megállapítja, hogy az MDS őssejt eredetű betegség és bizonyítottan az összes mieloid vonal érintett, de limfoid érintettség is előfordulhat az esetek kis részében. MPN esetében kevesebb tanulmány lelhető fel, de ezekben is egyértelmű a folyamat mieloid iránya és limfoid érintettséget is leírnak, amely pluripotens eredetre utal. Raskind8 1998-as összefoglaló cikkében a mieloproliferatív betegségek patogeneziséről ír. Ő is kihangsúlyozza, hogy néhány PV és ET esetben az EBV transzformált limfoid sejtek túlnyomó többségében, ugyanazt a G6PD klónt sikerült kimutatni, mint a tumoros mieloid sejtekben. Ezek a megfigyelések is a pluripotens őssejt eredet lehetőségét támogatják, de csak ritka esetekben. Heaney összefoglalójában1 azt emeli ki, hogy MDS-ben a neoplasztikus esemény a legtöbb beteg esetében valószínűleg mieloid irányban elkötelezett 44

őssejtben következik be. Ezt támasztja alá az is, hogy MDS-ben extrém ritkán következik be limfoblasztos transzformáció78. Mindezek mellett létezik olyan álláspont is, amely MDS-ben a pluripotens eredet dominanciáját hangsúlyozza. Ez utóbbit támasztja alá, hogy Tsukamoto és munkatársai13 6-ból 6 MDS esetében demonstrálták a T-limfociták és granulociták együttes monoklonalitását Xinaktivációs módszerekkel. Egy tanulmány Nilsson16 és munkatársaitól szintén a pluripotens őssejt eredetet bizonyítja direkt módszerekkel 5q deléciót hordozó MDSes betegekben. Kimutatták, hogy míg perifériás limfocitákban nem volt jelen az 5q deléció, addig a csontvelőből izolált CD34+/CD38- pluripotens őssejtek szinte 100%-ban pozitívak voltak minden betegben, valamint 5-ből 3 esetben CD34+/ CD19+ pro-B sejtek is hordozták a deléciót, méghozzá nagy arányban. Egy betegben a szortírozott CD34+/CD7+ pro-T sejtek is 5q deléciót mutattak. Annak, hogy MDS esetében a legtöbb tanulmányban nem mutatható ki limfoid érintettség, vagy csak kis arányban, több magyarázata is lehet. Előfordulhat, hogy a tumoros és normál pluripotens őssejtek együtt léteznek a csontvelőben, de amíg a mieloid vonal esetében a tumoros klón differenciálódni képes, addig a limfoid sejtek ebből a klónból nem tudnak differenciálódni, hanem a reziduális normál őssejtekből származnak. Ez magyarázhatja, hogy sok esetben miért nem detektálnak genetikai aberrációt a perifériás limfoid sejtekben. Az a néhány eset, amikor limfoid sejtekben is kimutatható abnormalitás, bizonyítja, hogy pluripotens őssejt érintett a neoplasztikus folyamatban. A vizsgálati módszerek is okai lehetnek annak, hogy a limfoid érintettséget nem lehet kimutatni. A legtöbb esetben ugyanis valamilyen kromoszómális rendellenességet (pl. 20q deléciót) használtak markerként, viszont a tumorfejlődés folyamata során ezek az aberrációk nem feltétlenül jellemzők a tumort megalapozó klónra, lehet, hogy csak később jelentkeznek. A hematológiai tumorok között a CML az egyik klasszikus példája annak, hogy a Philadelphia kromoszóma a tumorgenezisnek csak egy későbbi fázisában jelentkezik, így szerepe van a malignizációban, de az azt megelőző “pre-malignus” proliferációban nincs jelen8,79,80 . Hasonló módon, az MDS-ben és MPN-ben leggyakoribb citogenetikai markerként használt 20q és 5q deléció is megjelenhet a patogenezisnek egy késői lépésében, így nem feltétlenül mutatja ki a tumor valódi sejtvonal reprezentációját. Ezt támogatja Hellström-Lindberg és munkatársai4 tanulmánya, amely szerint az 45

MDS-ben visszatérő citogenetikai aberrációk, amelyeket régebben a betegség primer okaiként tartottak számon, feltehetőleg valójában inkább szekunder események és a betegség többlépcsős genetikai progressziója során később jelentkeznek. A hipotézis szerint a primer lézió(k) citogenetikailag nem észlelhető(k), de a neoplasztikus klón monoklonális proliferációját és expanzióját indukálhatja(-ák), majd a kialakuló genetikai instabilitás eredményezi a később jelentkező szekunder, tercier, stb. aberrációkat, mint pl. a jellemző 5q, 20q stb. deléciókat. Boultwood és munkatársai 2001-es összefoglalójukban17 megállapítják, hogy a legtöbb tanulmányban tapasztalt mieloid restrikció nem zárhatja ki a betegség pluripotens őssejt eredetét az előzőekben tárgyalt okok miatt. Továbbá hangsúlyozzák azon vizsgálatok eredményeit, amelyek pluripotens és elkötelezett hemopoetikus őssejtek direkt vizsgálataiból származnak, amelyek arra utalnak, hogy MDS-ben gyakoribb a pluripotens őssejt érintettség, mint eddig gondolták. A JAK2V617F mutáció felfedezése óta MPN-ben több tanulmányban vizsgálták, hogy a mutáció mely sejtvonalakban fordul elő. Ishii21 PV-ben kimutatta a mutációt az esetek kis részében T és B-limfocitákban is, valamint minden esetben CD34+ őssejtekben. Jamieson és munkatársai81 igazolták a mutációt CD34+CD38CD90+Lin- fenotípusú elkötelezetlen hemopoetikus őssejtekben PV-s betegekben. Bogani23 tanulmányában a vizsgált PMF-es betegek felében kimutatták a mutációt perifériás B és T-limfocitákban, viszont NK-sejtekben és CD34+ sejtekben minden esetben előfordult a mutáció. Delhommeau és kollégái24 PMF-ben szintén jelentős arányú limfocita (B,T,NK), valamint 100%-os limfoid progenitor érintettséget mutattak ki. Larsen cikkében25 10 PV-s betegből 8-ban jelen volt a JAK2V617F mutáció B-, vagy T-limfocitákban.

46

Saját eredmények értékelése

A HUMARA módszer használatával kapcsolatos ellentmondások kiküszöbölése érdekében, kontrolltól független és sejtvonalra jellemző klonalitási kritériumok meghatározását tűztük ki célul. Új klonalitási kritériumokat állítottunk fel a HUMARA X-inaktivációs vizsgálathoz, valamint meghatároztuk a módszer szenzitivitását és teszteltük a módszer kvantitatív jellegét. Az X-inaktiváció mértékét a két androgén receptor allél relatív arányát tükröző X-inaktivációs számmal (XISZ) jellemeztük. Huszonegy informatív egészséges nő perifériás véréből áramlási citométerrel szortírozott limfoid és mieloid sejteken, 4 különböző klonalitási kritériumot tesztelve vizsgáltuk a HUMARA specificitását. Ezekhez a következő vizsgálatokat végeztük el: 1. A XISZ átlagértékét és sztenderd deviációt felhasználva megállapítottuk hogy, ha azokat a mintákat tekintjük monoklonálisnak, amelyekben XISZ értéke kívül esik az egészséges minták XISZátlag±1S.D. tartományán, akkor limfoid sejtekben 80%-os, a mieloidokban 76%-os specificitást kapunk. A XISZátlag±2S.D. kritérium viszont túl szigorúnak bizonyult, mert a jelentős szórás miatt a 100%-os elvi maximumot is meghaladó XISZ határértékeket eredményezett. A fentiek alapján a XISZ átlaga és a sztenderd deviáció alapján képzett klonalitási tartományokat elvetettük a nem elégséges specificitás, vagy a túl szigorú határértékek miatt. 2. A szakirodalomban gyakran használt, monoklonalitás jelének tekintett 3:1es androgén receptor allélarány a limfoid sejteknél csak 70%-os, a mieloidoknál pedig még kisebb, 52%-os specificitást adott az egészséges kontroll mintákban. Így ez a kritérium sem bizonyult megfelelőnek. 3. A fentiek miatt meghatároztunk egy olyan poliklonális XISZ tartományt a limfoid és a mieloid sejtek esetében is, amelyektől legalább 90%-os specificitást, vagyis 10%-nál kisebb álpozitivitást vártunk el. Ehhez az egészséges nőkben mért összes XISZ értéket figyelembe véve, egyenlő arányban elhagytuk a legszélső XISZ értékeket a tartomány mindkét végéről úgy, hogy az egészséges nők 90%-a az alsó és felső határértékek között maradjon. Ez alapján a későbbiekben monoklonálisnak tekintettük azokat a mintákat, amelyek XISZ értéke limfoid sejtek esetében 34-90%, míg a mieloidoknál 37-86% XISZ tartományon kívül esett. 47

4. Az 3. pontban leírt 90%-os specificitást eredményező kritériumon túl felállítottunk még egy monoklonalitást igazoló kritériumot. Ehhez abból indultunk ki, hogy a kontroll egészséges nők mintáiban mérsékelt korreláció volt a limfoid és a mieloid sejtek XISZ értékei között, ezért feltételeztük, hogy ugyanazon egyén limfoid és mieloid sejtjei egymás kontrolljaként szolgálhatnak. Vagyis amennyiben csak az egyik sejtvonal monoklonális a kettő közül, akkor a két sejtvonal XISZ értéke jelentősen el fog térni egymástól. Így megvizsgáltuk a kontroll nőkben a limfoid és mieloid sejtek XISZ értékének különbségét. 90%-os specificitásra törekedve, a legmagasabb XISZ különbség értékeket elhagytuk az összes kontroll minta eredményéből úgy, hogy a kontroll minták 90%-a a határérték alá essen. Eszerint, ha a XISZ különbség nagyobb 26%-nál, akkor a vizsgált limfoid és mieloid vonal közül valamelyik 90%-os valószínűséggel monoklonálisnak tekinthető. Fontos azonban kiemelni, hogy ez alapján nem lehet megmondani, hogy melyik sejtvonal a monoklonális. Így ez a kritérium inkább kiegészítő jellegű lehet az 3. pontban meghatározott kritérium mellett. 5. Az általunk felállított kritériumokkal teszteltük HUMARA módszer érzékenységét is, hogy meg tudjuk mondani milyen arányú reaktív háttér mellett képes kimutatni a monoklonalitást a vizsgálat. Ehhez 4 B-CLL-es beteg leukémiás sejtjeinek (CD5/CD23, vagy CD5/CD19 koexpresszót mutató sejtek) és poliklonális mieloid sejtjeinek áramlási citométerrel szortírozott, meghatározott arányú keverékeit vizsgáltuk. A 75% és 100% arányban leukémiás sejteket tartalmazó keverékekben a XISZ érték 0%, vagy 100% volt, vagyis a HUMARA egyértelműen monoklonalitást mutatott. Az 50-60% monoklonális sejtet tartalmazó mintákból 4ből 3 eset XISZ értékei estek kívül a limfoid sejtekre érvényes 34-90% poliklonális XISZ tartományon és bizonyultak monoklonálisnak. A 4. esetben a XISZ érték a poliklonális tartományba esett, viszont a XISZ különbségeket használó kritérium alapján ebben az esetben is ki tudtuk mutatni a monoklonalitást. A 20-25% monoklonális sejtet tartalmazó mintákban már nem tudtunk monoklonalitást igazolni az általunk felállított kritériumok segítségével. Tehát a HUMARA módszer érzékenységéről elmondható, hogy a legalább 50-60% monoklonális sejtet tartalmazó minták mindegyikében legalább az egyik kritérium alapján képes volt kimutatni a monoklonalitást. 48

6. Kimutattuk, hogy a módszer monoklonális sejteket tartalmazó keverékekben kvantitatív jellegű. Ezt a keverékek ismert monoklonális sejtaránya és a keverékekben mért XISZ értékekből számított monoklonális sejtarányok erős korrelációja igazolta (r=0,86).

Igyekeztünk hozzájárulni az irodalomban látható ellentmondások tisztázásohoz az MDS-ek és MPN-ek sejtvonal érintettségének vonatkozásában. A sejtvonal érintettséget három különböző módszerrel vizsgáltuk: 1. HUMARA klonalitási teszttel, 2. 5q és 20q deléció kimutatásásra alkalmas MS-PCR-rel és 3. JAK2V617F mutációra specifikus PCR-rel.

Áramlási citométerrel szortírozott limfoid és mieloid sejteken végeztünk HUMARA X-inaktivációs klonalitás tesztet, 98 informatív női betegben. A HUMARA X-inaktivációs klonalitás vizsgálatokkal arra kerestük a választ, hogy MDS-ben és MPN-ben szenvedő betegekben érintett-e a limfoid és mieloid sejtvonal a monoklonális proliferációban. Ha csak a mieloid vonal klonális, akkor ez arra utal, hogy a neoplasztikus folyamat mieloid irányban elkötelezett őssejtből indulhatott ki. Mivel azonban csak indirekt következtetésre van lehetőségünk, ezért nem zárható ki a pluripotens őssejt eredet csak mieloid érintettség esetén sem. Előfordulhat például, hogy a tumoros klón gátolt a limfoid irányú differenciációban, vagy hogy a tumort indukáló mutáció(k) csak a mieloid vonalnak biztosítanak proliferációs előnyt, ezért a limfoid sejtek a reziduális egészséges őssejtekből származhatnak. Viszont mindkét sejtvonal egyidejű klonalitása egyértelműen a pluripotens őssejt eredetet bizonyítja. A HUMARA vizsgálataink eredményei MDS esetében az irodalomnak megfelelő adatokat mutatták, ill. a két szélsőséges álláspont közé sorolhatók. Az egyik véglet szerint a limfoid vonal sejtjeiben nem mutatható ki érintettség, vagy csak nagyon ritka esetekben, ami a mieloid irányban elkötelezett őssejt eredetet támogatja. A másik álláspont szerint az MDS-es esetek jóval nagyobb részében fordul elő a limfoidok érintettsége, ami pluripotens kiindulási klónt feltételez. Eseteink 38 %-ában csak a mieloid sejtek bizonyultak monokonálisnak, ami mieloid irányban elkötelezett folyamatot valószínűsít. Viszont az esetek további 31%-ában fordult elő monoklonális HUMARA eredmény mindkét sejtvonalban, ami a betegség 49

egyértelműen pluripotens őssejt eredetére utal. Szintén pluripotens őssejt eredetre utal az is, hogy az MDS-ek 10%-ában csak limfoid monoklonalitás igazolódott, poliklonális mieloidok mellett. Ez utóbbi eredmény magyarázható azzal, hogy a mieloid vonalban a monoklonális sejtek aránya nem érte el a módszer szenzitivitását (50-60%). Mieloproliferatív neopláziákban az irodalmi adatok szerint nagyobb arányban fordul elő limfoid érintettség, mint MDS-ben. Saját vizsgálatainkban 69 MPN esetet vizsgáltunk HUMARA módszerrel. Eredményeink szerint az MDS-hez hasonló gyakorisággal fordul elő MPN-ben a HUMARA-val kimutatható pluripotens őssejt eredetre utaló együttes limfoid-mieloid monoklonalitás. Az összes MPN eset 35%ban találtunk kettős és 38%-ban kizárólagos mieloid monoklonalitást. Egyedül az PV altípus mutatott az átlagnál magasabb arányú (50%) kettős limfoid-mieloid monoklonalitást. Összegezve saját HUMARA klonalitási vizsgálataink eredményeit, feltételezhető, hogy MDS-ben és MPN-ben, több mint az esetek egyharmadában pluripotens hemopoietikus őssejtből indul ki a tumor. Az eredmények és a módszer megbízhatóságát alátámasztja, hogy a klonalitás eredményeink jól megfeleltethetők a két nagy betegségcsoportban felállított patológiai diagnózisnak, MDS-ben 82%-ban, MPN-ben 87%-ban tudtunk igazolni monoklonalitást valamelyik sejtvonalban. Következésképpen az olyan MDS és MPN esetekben, amelyekben egyéb patognomikus marker nem mutatható ki, a HUMARA diagnosztikus szerepű lehet női betegekben.

A sejtvonal érintettséget vizsgáltuk szortírozott limfoid és mieloid sejteken 20q és 5q deléció tekintetében mikroszatellita-PCR technikával a D20S607, D20S170, D20S110, D20S96 és D20S119, D5S476 és D5S414 lókuszokon 35 beteg esetében. Tizenkét MDS-ből 1 esetben mutattunk ki del(5q)-t és 1 másik esetben del(20q)-t csak a mieloid sejtekben. 23 MPN-t vizsgálva az MPN-re nem jellemző del(5q)-t 3 esetben (13%) sikerült kimutatni, kizárólag a mieloid sejtekben. A del(20)-t 6 esetben, 26%-ban sikerült kimutatni, 3 esetben csak limfoidokban és 3 esetben mindkét sejtvonalban.

50

Egy HES esetben megjelent mindkét deléció, viszont a del(20q) csak a limfoid, a del(5q) csak a mieloid sejtekben. A vizsgált minták közül del(5q)-t, vagy del(20q)-t csak a mieloid sejtekben mutattuk ki MDS-ben, ami utalhat arra, hogy a betegség mieloid irányban elkötelezett őssejtből indulhatott ki. Azonban nem zárható ki a pluripotens őssejt eredet sem, mert a deléciók létrejöhettek a tumorfejlődésnek egy későbbi pontján is egy mieloid irányban elkötelezett őssejtben és csak a malignizációban, ill. a betegség manifesztációjában fontosak. Ez jól magyarázná azt is, hogy miért csak a mieloid vonal sejtjeiben jelennek meg morfológiai, citológiai eltérések a normál állapothoz képest. Az MPN-ben kapott MS-PCR eredményeink a del(5q) sejtvonal érintettségének tekintetében hasonlóak az MDS-hez, vagyis a del(5q) csak mieloid sejtekben fordult elő, ami ezekben a betegekben szintén mieloid irányban elkötelezett kiindulású betegségre utalhat. Viszont a del(20q) sejtvonal előfordulása más képet mutatott. A del(20q)-t hordozó esetek fele kettős limfoid-mieloid, másik fele csak limfoid érintettséget mutatott. A kettős érintettség egyértelműen a pluripotens őssejt eredet lehetőségét támogatja. A kizárólagos limfoid érintettség magyarázható az MS-PCR módszer alacsony érzékenységével amely hasonló, mint a HUMARA-é, hiszen ugyanúgy két allél mennyiségi viszonyaiban beálló változást kell kimutatni. Így lehetséges, hogy a mieloid vonalban előforduló, deléciót hordozó sejtek gyakorisága ezen esetekben a módszer érzékenysége alá esett és valójában ezekben az esetekben is pluripotens őssejt eredetről van szó. A HUMARA és MS-PCR vizsgálatok informatív esetei közül 20-ból készültek párhuzamos vizsgálatok. Nyolc MDS-ből 1-ben találtunk párhuzamos del(5q)-t és HUMARA monoklonalitást, további 5 esetben csak a HUMARA mutatott monoklonalitást. Tizenkét MPN-ben az összes esetben igazolható volt HUMARA-val monoklonalitás és 4 eset mutatott párhuzamosan deléciót MS-PCRrel ugyanazon sejtvonalakban. Az a jelenség, hogy feltehetően hasonló kimutatási érzékenység mellett jóval kevesebb esetben jelent meg deléció, mint monoklonális proliferáció tovább erősíti azt a feltételezést, hogy a vizsgált del(5q) és del(20q) a tumorfejlődés egy későbbi lépéseként alakulhatnak ki egy monoklonális proliferáció talaján. 51

Az MS-PCR vizsgálatokkal arra is kerestük a választ, hogy a hagyományos citogenetikai módszereknél jóval kisebb deléciók kimutatására is alkalmas molekuláris technika segítségével esetleg nagyobb arányban kimutatható-e a 20q és 5q deléció MDS-ben és MPN-ben. Eredményeink szerint MDS-ben nem volt gyakoribb egyik deléció sem. MPN-ben viszont sikerült 13%-ban kimutatnunk a del(5q)-t, ami nem jellemző erre a betegség csoportra. Valamint a del(20q) kb. kétszer akkora gyakoriságot mutatott (26%), mint a hagyományos metafázis citogenetikával kimutatható előfordulás.

Sejtvonal specifikus JAK2V617F mutáció vizsgálatokat végeztünk 28 MPN-es betegből, akiknél a rutin diagnosztikai eljárás során a teljes vérből készült vizsgálat mutációt igazolt. Ezek közül 11 esetben a JAK2V617F mutáció sejtvonal szintű előfordulását összevetettük HUMARA-val kimutatható monoklonalitással is. A JAK2V617F mutáció minden esetben kimutatható volt a mieloid sejtekben. A limfoid sejtek érintettsége 80% feletti volt PMF-ben és PV-ben, míg ET-ben is előfordult az limfoidok kétharmadában. Mindez arra utal, hogy a JAK2V617F mutáció az esetek jelentős többségében pluripotens őssejtben következik be. A párhuzamos HUMARA vizsgálatok sejtvonal szintű monoklonalitás eredményei MPN-ben 11-ből 7 esetben (64%) megegyeztek a JAK2 mutációs érintettséggel. A maradék 4 esetben a HUMARA nem tudott monoklonalitást igazolni, valamelyik sejtvonalban, ahol a JAK2 mutációs vizsgálat pozitív volt. Ez magyarázható azzal, hogy a JAK2V617F PCR érzékenysége magasabb, mint a HUMARA-é, amelynél a pozitív eredményhez 50-60% monoklonális sejt szükséges a mintában. Ez utóbbi arra utal, hogy JAK2V617F pozitív esetekben a JAK2V617F mutációs vizsgálat hatékonyabban alkalmazható sejtvonal érintettség vizsgálatra, mint a HUMARA.

52

Összefoglalás

A HUMARA X-inaktivációs vizsgálathoz új, 90%-os specificitású kritériumokat dolgoztunk ki, valamint meghatároztuk a módszer érzékenységét. A HUMARA vizsgálatok a patológiai diagnózissal összhangban, a vizsgált esetek több, mint négyötödében monoklonalitást igazoltak, így a HUMARA az általunk használt új kritériumokkal a diagnosztikában is alkalmazható monoklonalitás tesztnek bizonyult. A sejtvonal specifikus HUMARA X-inaktivációs vizsgálatok eredményei alapján arra lehet következtetni, hogy az MDS és az MPN esetek több mint egyharmadában pluripotens őssejt eredetű a betegség. Szintén sejtvonal specifikus MS-PCR segítségével kimutattuk, hogy a del(5q) mindkét betegségcsoportban elsősorban mieloid sejtekben jelentkezik, míg a del(20q) megtalálható a perifériás limfoid sejtekben. A del(20q) limfoid megjelenése a del(5q)-nál korábbi, pluripotens őssejt szintjén bekövetkező delécióra utal. Mivel a HUMARA-val kimutatható monoklonalitás gyakorisága nagyobb, mint az MS-PCRrel kimutatható deléciók gyakorisága, ezért feltételezzük, hogy a del(5q) és del(20q) a tumorfejlődés egy későbbi lépéseként jelenik meg, egy már fennálló monoklonális proliferáció talaján. A deléciók előfordulási gyakorisága szempontjából az MS-PCR módszer nem mutatott különbséget hagyományos citogenetikához képest MDS-ben. Azoban MPN-ben, ahol a del(5q) ritkán fordul elő, 13%-ban találtuk meg az eltérést. MPN-ben a del(20q) esetében a hagyományos citogenetikával kimutatott előfordulási arányoknál magasabb, kb. 2-szeres gyakoriságot (26%) mutattunk ki. A sejtvonal specifikus JAK2V617F mutációs vizsgálatok PMF-ben és PV-ben 80% feletti arányban, ET-ben az esetek kétharmadában a mutáció pluripotens őssejt eredetét igazolták mindkét sejtvonal érintettsége révén.

Konklúzióként elmondható, hogy 3 különböző vizsgálati módszerrel, illetve ezek kombinációjával is sikerült igazolnunk, hogy az MDS-ek és MPN-ek jelentős része - betegség típustól függően 31-89% arányban - pluripotens őssejt eredetű betegségeknek tekinthetők. Valószínűsíthető, hogy a JAK2V617F mutáció az esetek többségében a betegség korai, pluripotens őssejtet érintő stádiumában jelenik meg. A del(20q), ahol előfordul, ott szintén pluripotens őssejtben jelentkezik az MPN-ekben. 53

Az MPN-ek nagyobb részében a del(20q) és del(5q) jelenléte nélkül is kimutatható a HUMARA-val monoklonalitás, ezért valószínű, hogy ezek a deléciók szekunder elváltozásként jelennek meg a tumorfejlődésben.

54

ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA

1. Új, 90%-os specificitású, kontroll szövetet nem igénylő, limfoid és mieloid sejtvonalra specifikus klonalitási kritériumokat határoztunk meg a HUMARA Xinaktivációs vizsgálathoz. Meghatároztuk a HUMARA szenzitivitását, mely szerint a módszer legalább 50-60% monoklonális sejtet tartalmazó mintákban alkalmas klonalitás vizsgálatra. Teszteltük és igazoltuk a HUMARA módszer kvantitatív jellegét poliklonális és monoklonális sejteket tartalmazó keverék mintákon.

2. HUMARA klonalitási eredményeink alapján, kettős limfoid-mieloid monoklonalitás kimutatásával igazoltuk, hogy MDS-ben és MPN-ben egyaránt, a vizsgált esetek több, mint egyharmadában pluripotens hemopoetikus őssejtből indult ki a tumor.

3. MS-PCR segítségével kimutattuk, hogy az del(5q) mindkét betegségcsoportban elsősorban mieloid sejtekben jelentkezik, míg a del(20q) megtalálható a perifériás limfoid sejtekben is. A del(20q) limfoid megjelenése a del(5q)-nál korábbi, pluripotens őssejt szintjén bekövetkező delécióra utal. A HUMARA-val kimutatható monoklonalitás gyakorisága nagyobb volt, mint az MS-PCR-rel kimutatható deléciók gyakorisága, ezért feltételezzük, hogy a del(5q) és del(20q) a tumorfejlődés egy későbbi lépéseként, addícionálisan jelennek meg, egy már fennálló monoklonális proliferáció talaján.

4. A vizsgált 5q és 20q deléciók előfordulási gyakorisága szempontjából az MS-PCR módszer nem mutatott különbséget hagyományos citogenetikához képest MDS-ben. Sikerült azoban kimutatni 13% arányban a del(5q)-t MPN-ben, amely csak ritkán fordul elő ebben a betegségcsoportban. MPN-ben a del(20q) esetében a hagyományos citogenetikával kimutatott előfordulási gyakoriságnál kb. kétszer magasabb, 26%-os gyakoriságot kaptunk.

5. Sejtvonal specifikus JAK2V617F mutációs vizsgálatokkal igazoltuk, hogy PMFben és PV-ben 80% feletti arányban, ET-ben a vizsgált esetek kétharmadában a 55

mutáció pluripotens őssejtben következett be, mivel előfordult a limfoid és a mieloid sejtekben is. Eredményeink alapján a JAK2V617F mutációt hordozó MPN-ek túlnyomó többsége pluripotens őssejt eredetűnek tekinthető.

56

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek, Dr. Pajor László Professzor Úrnak, aki munkám feltételeit megteremtette és az elejétől a végéig támogatta, ösztönözte.

Köszönöm Dr. Kovács Gyula Professzor Úrnak, hogy az MS-PCR vizsgálatok elvégzését a Heidelbergi Egyetemen lehetővé tette.

Köszönettel tartozom Dr. Kereskai Lászlónak a patológiai diagnózisokért.

Köszönöm Radvánszky Lajosnének az áramlási citometriai mérések készítése során nyújtott segítségét, valamint Alpár Donátnak és Lacza Ágnesnek az értékes tudományos konzultációkat.

Végül köszönöm családom sokéves támogatását.

57

IRODALOMI HIVATKOZÁSOK

1. Heaney ML, Golde DW. Myelodysplasia N Engl J Med. 1999 May 27;340(21):1649-60.

2. Anderson JE, Gilliland DG, List AF et. al. Myelodysplastic syndrome. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 1998:296-312.

3. Gilliland DG, Silverstein MN, Anderson JE et. al. Myeloproliferative disorders and myelodysplastic syndromes Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 1997:166-176.

4. Hellström-Lindberg E, Willmann C, Barrett AJ et. al. Achievements in understanding and treatment of myelodysplastic syndromes Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2000:110-131.

5. C Rosenfeld, A List. A hypothesis for the pathogenesis of myelodysplastic syndromes: implications for new therapies Leukemia. 2000 Jan;14(1):2-8.

6. Jaffe ES, Harris NK, Stein H, Vardiman JW eds. World Health Organization, Pathology and Genetics of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. IARC Press, Lyon, 2001

7. Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, Jaffe ES, Pileri SA, Stein H, Thiele J, Vardiman JW eds. World Health Organization, Pathology and Genetics of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. IARC Press, Lyon, 2008

8. Raskind WH, Steinmann L, Najfeld V. Clonal development of myeloproliferative disorders: clues to hematopoietic differentiation and multistep pathogenesis of cancer. 58

Leukemia. 1998 Feb;12(2):108-16.

9. Knuutila S, Teerenhovi L, Larramendy ML, Elonen E, Franssila KO, Nylund SJ, Timonen T, Heinonen K, Mahlamaki E, Winqvist R, et al. Cell lineage involvement of recurrent chromosomal abnormalities in haematological neoplasms. Genes Chromosomes Cancer. 1994 Jun;10(2):95-102.

10. Knuutila S. Lineage specifity in haematological neoplasms. Br J Haematol. 1997 Jan;96(1):2-11.

11. Abrahamson G, Boultwood J, Madden J, Kelly S, Oscier DG, Rack K, Buckle VJ, Wainscoat JS. Clonality of cell populations in refractory anaemia using combined approach of gene loss and X-linked restriction fragment length polymorphism-methylation analyses Br J Haematol. 1991 Dec;79(4):550-5.

12. Culligan DJ, Cachia P, Whittaker J, Jacobs A, Padua RA. Clonal lymphocytes are detectable in only some cases of MDS Br J Haematol. 1992 Jul;81(3):346-52.

13. Tsukamoto N, Morita K, Maehara T, Okamoto K, Karasawa M, Omine M, Naruse T. Clonality in myelodsplastic syndromes: demonstration of pluripotent stem cell origin using X-linked restriction fragment length polymorphisms Br J Haematol. 1993 Apr;83(4):589-94.

14. Anan K, Ito M, Misawa M, Ohe Y, Kai S, Kohsaki M, Hara H. Clonal analysis of peripheral blood and haemopoietic colonies in patients with aplastic anaemia and refractory anaemia using polymorphic short tandem repeat on the human androgenreceptor (HUMARA) gene Br J Haematol. 1995 Apr;89(4):838-44.

59

15. Suzuki H, Asano H, Ohashi H, Kinoshita T, Murate T, Saito H, Hotta T. Cloanlity analysis of refractory anaemia with ringed sideroblasts:simultaneousstudy of clonality and cytochemistry of bone marrow progenitors Leukemia. 1999 Jan;13(1):130-4.

16. Nilsson L, Astrand-Grundstrom I, Arvidsson I, Jacobsson B, Hellstrom-Lindberg E, Hast R, Jacobsen SE. Isolation and characterization of hemapoietic progenitor/ stem cells in 5q-deleted myelodysplastic syndromes: evidence for involvement at the hemapoietic stem cell level Blood. 2000 Sep 15;96(6):2012-21.

17. Boultwood J, Wainscoat JS. Clonality in the myelodysplastic syndromes. Int J Hematol. 2001 Jun;73(4):411-5.

18. Shih LY, Lin TL, Dunn P, Wu JH, Tseng CP, Lai CL, Wang PN, Kuo MC. Clonality analysis using X-chromosome inactivation patterns by HUMARA-PCR assay in female controls and patients with idiopathic thrombocytosis in Taiwan. Exp Hematol. 2001 Feb;29(2):202-8.

19. Reeder TL, Bailey RJ, Dewald GW, Tefferi A. Both B and T lymphocytes may be clonally involved in myelofibrosis with myeloid metaplasia. Blood. 2003 Mar 1;101(5):1981-3.

20. Lasho TL, Mesa R, Gilliland DG, Tefferi A. Mutation studies in CD3+, CD19+ and CD34+ cell fractions in myeloproliferative disorders with homozygous JAK2(V617F) in granulocytes. Br J Haematol. 2005 Sep;130(5):797-9.

21. Ishii T, Bruno E, Hoffman R, Xu M. Involvement of various hematopoietic-cell lineages by the JAK2V617F mutation in polycythemia vera. Blood. 2006 Nov 1;108(9):3128-34.

60

22. Pardanani A, Lasho TL, Finke C, Mesa RA, Hogan WJ, Ketterling RP, Gilliland DG, Tefferi A. Extending Jak2V617F and MplW515 mutation analysis to single hematopoietic colonies and B and T lymphocytes. Stem Cells. 2007 Sep;25(9):2358-62.

23. Bogani C, Guglielmelli P, Antonioli E, Pancrazzi A, Bosi A, Vannucchi AM. B-, T-, and NK-cell lineage involvement in JAK2V617F-positive patients with idiopathic myelofibrosis. Haematologica. 2007 Feb;92(2):258-9.

24. Delhommeau F, Dupont S, Tonetti C, Massé A, Godin I, Le Couedic JP, Debili N, Saulnier P, Casadevall N, Vainchenker W, Giraudier S. Evidence that the JAK2 G1849T (V617F) mutation occurs in a lymphomyeloid progenitor in polycythemia vera and idiopathic myelofibrosis. Blood. 2007 Jan 1;109(1):71-7.

25. Larsen TS, Christensen JH, Hasselbalch HC, Pallisgaard N. The JAK2 V617F mutation involves B- and T-lymphocyte lineages in a subgroup of patients with Philadelphia-chromosome negative chronic myeloproliferative disorders. Br J Haematol. 2007 Mar;136(5):745-51.

26. Hussein K, Bock O, Theophile K, Schlue J, Ballmaier M, Kröger N, Göhring G, Büsche G, Kreipe H. Biclonal expansion and heterogeneous lineage involvement in a case of chronic myeloproliferative disease with concurrent MPLW515L/JAK2V617F mutation. Blood. 2009 Feb 5;113(6):1391-2.

27. Jones AV, Kreil S, Zoi K, Waghorn K, Curtis C, Zhang L, Score J, Seear R, Chase AJ, Grand FH, White H, Zoi C, Loukopoulos D, Terpos E, Vervessou EC, Schultheis B, Emig M, Ernst T, Lengfelder E, Hehlmann R, Hochhaus A, Oscier D, Silver RT, Reiter A, Cross NC. Widespread occurrence of the JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disorders. 61

Blood. 2005 Sep 15;106(6):2162-8.

28. Lippert E, Boissinot M, Kralovics R, Girodon F, Dobo I, Praloran V, BoiretDupré N, Skoda RC, Hermouet S. The JAK2-V617F mutation is frequently present at diagnosis in patients with essential thrombocythemia and polycythemia vera. Blood. 2006 Sep 15;108(6):1865-7.

29. Vainchenker W, Constantinescu SN. A Unique Activating Mutation in JAK2 (V617F) Is at the Origin of Polycythemia Vera and Allows a New Classification of Myeloproliferative Diseases. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2005:195-200.

30. Haase D. Cytogenetic features in myelodysplastic syndromes. Ann Hematol. 2008 Jul;87(7):515-26.

31. Tefferi A, Thiele J, Orazi A, Kvasnicka HM, Barbui T, Hanson CA, Barosi G, Verstovsek S, Birgegard G, Mesa R, Reilly JT, Gisslinger H, Vannucchi AM, Cervantes F, Finazzi G, Hoffman R, Gilliland DG, Bloomfield CD, Vardiman JW. Proposals and rationale for revision of the World Health Organization diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia, and primary myelofibrosis: recommendations from an ad hoc international expert panel. Blood. 2007 Aug 15;110(4):1092-7.

32. Levine RL, Wernig G. Role of JAK-STAT signaling in the pathogenesis of myeloproliferative disorders. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2006:233-9, 510.

33. Skoda R. The genetic basis of myeloproliferative disorders. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2007;2007:1-10.

34. Mesa RA. Navigating the evolving paradigms in the diagnosis and treatment of myeloproliferative disorders. 62

Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2007;2007:355-62.

35. Pardanani AD, Levine RL, Lasho T, Pikman Y, Mesa RA, Wadleigh M, Steensma DP, Elliott MA, Wolanskyj AP, Hogan WJ, McClure RF, Litzow MR, Gilliland DG, Tefferi A. MPL515 mutations in myeloproliferative and other myeloid disorders: a study of 1182 patients. Blood. 2006 Nov 15;108(10):3472-6.

36. Lyon MF. Sex chromatin and gene action in the mammalian X-chromosome. Am J Hum Genet. 1962 Jun;14:135-48.

37. Belmont JW. Genetic control of X inactivation and processes leading to Xinactivation skewing. Am J Hum Genet. 1996 Jun;58(6):1101-8.

38. Diaz-Cano SJ, Blanes A, Wolfe HJ. PCR techniques for clonality assays. Diagn Mol Pathol. 2001 Mar;10(1):24-33.

39. Chen GL, Prchal JT. X-linked clonality testing: interpretation and limitations. Blood. 2007 Sep 1;110(5):1411-9.

40. Linder D, Gartler SM. Glucose-6-phosphate dehydrogenase mosaicism: utilization as a cell marker in the study of leiomyomas. Science. 1965 Oct 1;150(692):67-9.

41. Fialkow PJ, Gartler SM, Yoshida A. Clonal origin of chronic myelocytic leukemia in man. Proc Natl Acad Sci U S A. 1967 Oct;58(4):1468-71.

42. Adamson JW, Fialkow PJ, Murphy S, Prchal JF, Steinmann L. Polycythemia vera: stem-cell and probable clonal origin of the disease. N Engl J Med. 1976 Oct 21;295(17):913-6. 63

43. Fialkow PJ, Faguet GB, Jacobson RJ, Vaidya K, Murphy S. Evidence that essential thrombocythemia is a clonal disorder with origin in a multipotent stem cell. Blood. 1981 Nov;58(5):916-9.

44. Busque L, Gilliland DG. X-inactivation analysis in the 1990s: promise and potential problems. Leukemia. 1998 Feb;12(2):128-35.

45. Allen RC, Zoghbi HY, Moseley AB, Rosenblatt HM, Belmont JW. Methylation of HpaII and HhaI sites near the polymorphic CAG repeat in the human androgenreceptor gene correlates with X chromosome inactivation. Am J Hum Genet. 1992 Dec;51(6):1229-39.

46. Gale RE, Wheadon H, Boulos P, Linch DC. Tissue specificity of X –chromosome inactivation patterns. Blood. 1994 May 15;83(10):2899-905.

47. Zhu J, Frosch MP, Busque L, Beggs AH, Dashner K, Gilliland DG, Black PM. Analysis of meningiomas by methilation- and transcription based clonality assays. Cancer Res. 1995 Sep 1;55(17):3865-72.

48. Harrison CN, Gale RE, Linch DC. Quantification of X-chromosome inactivation patterns using RT-PCR of the polymorphic iduronate-2-sulphatase gene and correlation of the results obtained with DNA based techniques. Leukemia. 1998 Nov;12(11):1834-9.

49. Busque L, Zhu J, DeHart D, Griffith B, Willman C, Carroll R, Black PM, Gilliland DG. An expression based clonality assay at the human androgen receptor locus (HUMARA) on chromosome X. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25;22(4):697-8.

64

50. Champion KM, Gilbert JG, Asimakopoulos FA, Hinshelwood S, Green AR. Clonal haemopoiesis in normal elderly women: implications for the myeloproliferative disorders and myelodysplastic syndromes. Br J Haematol. 1997 Jun;97(4):920-6.

51. Racchi O, Mangerini R, Rapezzi D, Rolfo M, Gaetani GF, Ferraris AM. X chromosome inactivation patterns in normal females. Blood Cells Mol Dis. 1998 Dec;24(4):439-47.

52. Tonon L, Bergamaschi G, Dellavecchia C, Rosti V, Lucotti C, Malabarba L, Novella A, Vercesi E, Frassoni F, Cazzola M. Unbalanced X-chromosome inactivation in haemopoietic cells from normal women. Br J Haematol. 1998 Sep;102(4):996-1003.

53. El-Kassar N, Hetet G, Briere J, Grandchamp B. Clonality analysis of hematopoiesis in essentila thrombocythemia: advantages of studying T lymphocytes and platelets. Blood. 1997 Jan 1;89(1):128-34.

54. Horrigan SK, Westbrook CA, Kim AH, Banerjee M, Stock W, Larson RA. Polymerase chain reaction-based diagnosis of del(5q) in acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome identifies a minimal deletion interval. Blood. 1996 Oct 1;88(7):2665-70.

55. Naidoo R, Chetty R. The application of microsatellites in molecular pathology. Pathol Oncol Res. 1998;4(4):310-5.

56. Asimakopoulos FA, White NJ, Nacheva E, Green AR. Molecular analysis of chromosome 20q deletions assosiated with myeloproliferative disorders and myelodysplastic syndromes. Blood. 1994 Nov 1;84(9):3086-94.

65

57. Asimakopoulos FA, Green AR. Deletions of chromosome 20 and the pathogenesis of myeloproliferative disorders. Br J Haematol. 1996 Nov;95(2):219-26.

58. Bench AJ, Nacheva EP, Hood TL, Holden JL, French L, Swanton S, Champion KM, Li J, Whittaker P, Stavrides G, Hunt AR, Huntly BJ, Campbell LJ, Bentley DR, Deloukas P, Green AR. Chromosome 20 deletions in myeloid malignancies: reduction of the common deleted region, generation of a PAC/BAC contig and identification of candidate genes. Oncogene. 2000 Aug 10;19(34):3902-13.

59. Wang PW, Eisenbart JD, Espinosa R 3rd, Davis EM, Larson RA, Le Beau MM. Refinement of the smallest commonly deleted segment of chromosome 20 in malignant myeloid deseases and development of a PAC-based physical and transcription map. Genomics. 2000 Jul 1;67(1):28-39.

60. Bench AJ, Aldred MA, Humphray SJ, Champion KM, Gilbert JG, Asimakopoulos FA, Deloukas P, Gwilliam R, Bentley DR, Green AR. A detailed physical and trancriptional map of the region of chromosome 20 that is deleted in myeloproliferative disorders and refinement of the commonly deleted region. Genomics. 1998 May 1;49(3):351-62.

61. Horrigan SK, Arbieva ZH, Xie HY, Kravarusic J, Fulton NC, Naik H, Le TT, Westbrook CA. Delineation of a minimal interval and identification of 9 candidates for a tumor suppressor gene in malignant myeloid disorders on 5q31. Blood. 2000 Apr 1;95(7):2372-7.

62. Zhao N, Stoffel A, Wang PW, Eisenbart JD, Espinosa R 3rd, Larson RA, Le Beau MM. Molecular delineation of the smallest commonly deleted region of the chromosome 5 in malignant myeloid diseases to 1-1,5 Mb and preparation of a PACbased physical map. 66

Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Jun 24;94(13):6948-53.

63. Boultwood J, Fidler C, Strickson AJ, Watkins F, Gama S, Kearney L, Tosi S, Kasprzyk A, Cheng JF, Jaju RJ, Wainscoat JS. Narrowing and genomic annotation of the commonly deleted region of the 5q- syndrome. Blood. 2002 Jun 15;99(12):4638-41.

64. Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, Teo SS, Tiedt R, Passweg JR, Tichelli A, Cazzola M, Skoda RC. A gain-of-function mutation of JAK2 in myeloproliferative disorders. N Engl J Med. 2005 Apr 28;352(17):1779-90.

65. Levine RL, Wadleigh M, Cools J, Ebert BL, Wernig G, Huntly BJ, Boggon TJ, Wlodarska I, Clark JJ, Moore S, Adelsperger J, Koo S, Lee JC, Gabriel S, Mercher T, D'Andrea A, Frohling S, Dohner K, Marynen P, Vandenberghe P, Mesa RA, Tefferi A, Griffin JD, Eck MJ, Sellers WR, Meyerson M, Golub TR, Lee SJ, Gilliland DG. Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis. Cancer Cell. 2005 Apr;7(4):387-97.

66. James C, Ugo V, Le Couedic JP, Staerk J, Delhommeau F, Lacout C, Garcon L, Raslova H, Berger R, Bennaceur-Griscelli A, Villeval JL, Constantinescu SN, Casadevall N, Vainchenker W. A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes polycythaemia vera. Nature. 2005 Apr 28;434(7037):1144-8.

67. Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, East C, Fourouclas N, Swanton S, Vassiliou GS, Bench AJ, Boyd EM, Curtin N, Scott MA, Erber WN, Green AR; Cancer Genome Project. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet. 2005 Mar 19-25;365(9464):1054-61. Erratum in: Lancet. 2005 Jul 9-15;366(9480):122. 67

68. Zhao R, Xing S, Li Z, Fu X, Li Q, Krantz SB, Zhao ZJ. Identification of an acquired JAK2 mutation in polycythemia vera. J Biol Chem. 2005 Jun 17;280(24):22788-92.

69. Kralovics R, Teo SS, Buser AS, Brutsche M, Tiedt R, Tichelli A, Passamonti F, Pietra D, Cazzola M, Skoda RC. Altered gene expression in myeloproliferative disorders correlates with activation of signaling by the V617F mutation of Jak2. Blood. 2005 Nov 15;106(10):3374-6.

70. Tefferi A. V617F “JAKs” up myeloproliferative signal. Blood. 2005 Nov 15;106(10):3335-6.

71. Schafer AI. Molecular basis of the diagnosis and treatment of polycythemia vera and essential thrombocythemia. Blood. 2006 Jun 1;107(11):4214-22. Epub 2006 Feb 16.

72. Macdonald D, Cross NC. Chronic myeloproliferative disorders: the role of tyrosine kinases in pathogenesis, diagnosis and therapy. Pathobiology. 2007;74(2):81-8.

73. Malcovati L, Cazzola M. Myelodysplastic/myeloproliferative disorders. Haematologica. 2008 Jan;93(1):4-6.

74. Hellström-Lindberg E, Cazzola M. The Role of JAK2 Mutations in RARS and Other MDS. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2008;2008:52-9.

75. Kopp P, Jaggi R, Tobler A, Borisch B, Oestreicher M, Sabacan L, Jameson JL, Fey MF. Clonal X-inactivation analysis of human tumours using the human androgen receptor gene (HUMARA) polymorphism: a non-radioactive and semiquantitative strategy applicable to fresh and archival tissue. Mol Cell Probes. 1997 Jun;11(3):217-28. 68

76. Langbein S, Szakacs O, Wilhelm M, Sukosd F, Weber S, Jauch A, Lopez Beltran A, Alken P, Kälble T, Kovacs G. Alteration of the LRP1B gene region is associated with high grade of urothelial cancer. Lab Invest. 2002 May;82(5):639-43.

77. Mutter GL, Boynton KA. PCR bias in amplification of androgen receptor allales, a trinucleotide repeat marker used in clonality studies. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25;23(8):1411-8.

78. Pajor L, Matolcsy A, Vass JA, Mehes G, Marton E, Szabo F, Ivanyi JL. Phenotypic and genotypic analyses of blastic cell population suggest that pure Blymphoblastic leukemia may arise from myelodysplastic syndrome. Leuk Res. 1998 Jan;22(1):13-7.

79. Fialkow PJ, Martin PJ, Najfeld V, Penfold GK, Jacobson RJ, Hansen JA. Evidence for a multistep pathogenesis of chronic myelogenous leukemia. Blood. 1981 Jul;58(1):158-63.

80. Raskind WH, Ferraris AM, Najfeld V, Jacobson RJ, Moohr JW, Fialkow PJ. Further evidence for the existence of a clonal Ph-negative stage in some cases of Phpositive chronic myelocytic leukemia. Leukemia. 1993 Aug;7(8):1163-7.

81. Jamieson CH, Gotlib J, Durocher JA, Chao MP, Mariappan MR, Lay M, Jones C, Zehnder JL, Lilleberg SL, Weissman IL. The JAK2 V617F mutation occurs in hematopoietic stem cells in polycythemia vera and predisposes toward erythroid differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Apr 18;103(16):6224-9.

69

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZŐ PUBLIKÁCIÓK

Közlemények Jáksó P, Kereskai L, Molnár L, Pajor L. Lineage-specific clonality analysis of chronic myeloproliferative disorders and myelodysplastic syndrome by human androgen receptor assay. Pathol Oncol Res. 2007;13(2):114-22. IF: 1.241

Pajor L, Lacza A, Kereskai L, Jáksó P, Egyed M, Iványi JL, Radványi G, Dombi P, Pál K, Losonczy H. Increased incidence of monoclonal B-cell infiltrate in chronic myeloproliferative disorders. Mod Pathol. 2004 Dec;17(12):1521-30. IF: 3.643

Jáksó P, Pajor L. Advantages of CD45 vs. side scatter based gating in the course of flow cytometric immuno-phenotyping in malignant hematologic diseases. Orv Hetil. 1998 Oct 18;139(42):2509-13.

Idézhető absztraktok Jáksó P, Pajor L. Sejtvonal specifikus monoklonalitás vizsgálatok myeloproliferatív betegségekben és myelodysplasiában. Magyar Belorvosi Archivum. 2001;54(Supplementum 2001/1):22.

Jáksó P, Pajor L. X-kromoszóma inaktivációs klonalitási tesztek krónikus myeloproliferativ betegségekben és myelodysplasiaban. Hematológia Transzfúziológia. 2005;38(Supplementum 2005/1):34-35.

Jáksó P, Nagy Z, Kereskai L, Alpár D, Kajtár B, Pajor L. Analysis of polycythemia vera and essential thrombocythemia by lineage specific investigation of JAK2V617F mutation and X-linked clonality assay. Blood Reviews. 2007;21(Supplement 1):123 IF: 5.756

70

Kongresszusi poszterbemutatók

Jáksó P, Pajor L. A fényszórás alapján történő kapuzással kapcsolatban felmerülő problémák az áramlási cytometriás immunfenotipizálás során, malignus hematológiai kórképek esetén. Pathológus Találkozó, Lillafüred, 1997 Jáksó P, Pajor L. Sejtvonal specifikus monoklonalitás vizsgálatok myeloproliferatív proliferatív betegségekben és myelodysplasiában. A Magyar Haematológiai és Transzfúziológiai Társaság XVIII. Kongresszusa, Pécs, 2001. Jáksó P, Pajor L. X-kromoszóma-inaktivációs klonalitási tesztek krónikus myeloproliferatív betegségekben és myelodysplasiában. A Magyar Haematológiai és Transzfúziológiai Társaság XX. Kongresszusa, Budapest, 2005. Jáksó P, Nagy Z, Kereskai L, et al. Analysis of polycythemia vera and essential thrombocythemia by lineage specific investigation of JAK2V617F mutation and Xlinked clonality assay. International Society of Haematology, Congress of the European & African Division, Budapest, 2007.

Előadások tudományos kongresszusokon Jáksó P, Pajor L. Sejtvonal specifikus monoklonalitás vizsgálatok myeloproliferatív betegségekben és myelodysplasiában. A Magyar Haematológiai és Transzfúziológiai Társaság XVIII. Kongresszusa, Pécs, 2001.

Jáksó P, Pajor L. X-kromoszóma kötött molekuláris tesztek kelentősége a pathologiai diagnosztikában. 61. Pathologus Kongresszus, Győr, 2002.

71

EGYÉB PUBLIKÁCIÓK

Közlemények Pajor L, Szuhai K, Mehes G, Kosztolányi G, Jáksó P, Lendvai G, Szanyi I, Kajtár P. Combined metaphase, interphase cytogenetic, and flow cytometric analysis of DNA content of pediatric acute lymphoblastic leukemia. Cytometry. 1998 Apr 15;34(2):87-94. IF: 2.317

Tornóczky T, Kálmán E, Hegedűs G, Horváth OP, Sápi Z, Antal L, Jáksó P, Pajor L. High mitotic index associated with poor prognosis in gastrointestinal autonomic nerve tumour. Histopathology. 1999 Aug;35(2):121-8. IF: 1.900

Pajor L, Vass JA, Kereskai L, Szuhai K, Molnár L, Jáksó P. Silent Philadelphia chromosome: a distinct developmental stage in a philadelphia chromosome-positive chronic myeloproliferation? Cancer Genet Cytogenet. 2000 Apr 1;118(1):14-9. IF: 1.625

Pajor L, Vass JA, Kereskai L, Kajtár P, Szomor A, Egyed M, Iványi J, Jáksó P. The existence of lymphoid lineage restricted Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia with heterogeneous bcr-abl rearrangement. Leukemia. 2000 Jun;14(6):1122-6. IF: 3.736

Lacza A, Jáksó P, Kereskai L, Szuhai K, Méhes G, Pajor L. Incidence and distribution of t(12;21) in prognostic groups of pediatric acute lymphoblastic leukemia. Orv Hetil. 2000 Jul 2;141(27):1495-500.

72

Tornóczky T, Kálmán E, Jáksó P, Méhes G, Pajor L, Kajtár GG, Battyány I, Davidovics S, Sohail M, Krausz T. Solid and papillary epithelial neoplasm arising in heterotopic pancreatic tissue of the mesocolon. J Clin Pathol. 2001 Mar;54(3):241-5. IF: 1.866

Pajor L, Lacza A, Jáksó P, Kajtár B. Characteristics of TEL/AML-1 positive acute lymphoblastic leukemia in Hungarian children. Med Pediatr Oncol. 2001 Oct;37(4):409-11. IF: 1.114

Bogar L, Tarsoly P, Jakso P. Characteristics of light and heavy polymorphonuclear leukocytes. Clin Hemorheol Microcirc. 2002;27(2):149-53. IF: 0.623

Pajor L, Kereskai L, Zsdrál K, Nagy Z, Vass JA, Jáksó P, Radványi G. Philadelphia chromosome and/or bcr-abl mRNA-positive primary thrombocytosis: morphometric evidence for the transition from essential thrombocythaemia to chronic myeloid leukaemia type of myeloproliferation. Histopathology. 2003 Jan;42(1):53-60. IF: 2.952

Brittig F, Ajtay E, Jaksó P, Kelényi G. Follicular dendritic reticulum cell tumor mimicking inflammatory pseudotumor of the spleen. Pathol Oncol Res. 2004;10(1):57-60.

Csernus B, Timár B, Fülöp Z, Bognár A, Szepesi A, László T, Jáksó P, Warnke R, Kopper L, Matolcsy A. Mutational analysis of IgVH and BCL-6 genes suggests thymic B-cells origin of mediastinal (thymic) B-cell lymphoma. Leuk Lymphoma. 2004 Oct;45(10):2105-10. IF: 1.147 73

Kajtár B, Méhes G, Jaksó P, Kereskai L, Iványi JL, Losonczy H, Egyed M, Tóth P, Tóth A, Gasztonyi Z, Dömötör M, Pajor L. Cytogenetic and molecular monitoring of chronic myeloid leukemia. Orv Hetil. 2006 May 28;147(21):963-70.

Pajor L, Kajtár B, Jáksó P, Lacza A, László R, Radványi G, Mórocz I, Tóth A, Varga G. Epstein-Barr virus-induced B-cell proliferation of Hodgkin's and ReedSternberg cell pheno- and genotype may develop in peripheral T-cell lymphomas. Histopathology. 2006 Nov;49(5):553-7. IF: 3.216

Alpár D, Kajtár B, Kneif M, Jáksó P, László R, Kereskai L, Pajor L. Automated detection of residual leukemic cells by consecutive immunolabeling for CD10 and fluorescence in situ hybridization for ETV6/RUNX1 rearrangement in childhood acute lymphoblastic leukemia. Cancer Genet Cytogenet. 2007 Feb;173(1):23-30. IF: 1.544

Kajtár B, Jáksó P, Kereskai L, Lacza A, Méhes G, Bodnár MA, Dombi JP, Gasztonyi Z, Egyed M, Iványi JL, Kovács G, Marton E, Palaczki A, Petz S, Tóth P, Sziládi E, Losonczy H, Pajor L. Complex analysis of prognostic factors in chronic lymphocytic leukemia. Orv Hetil. 2007 Apr 22;148(16):737-43.

Alpár D, Hermesz J, Pótó L, László R, Kereskai L, Jáksó P, Pajor G, Pajor L, Kajtár B. Automated FISH analysis using dual-fusion and break-apart probes on paraffin-embedded tissue sections. Cytometry A. 2008 Jul;73(7):651-7. IF: 2.978

74

Idézhető absztraktok Alpár D, Kajtár B, Tóth J, Nagy Z, Jáksó P, László R, Kereskai L, Pajor L. Automated evaluation of dual fusion and breakapart FISH probes on paraffinembedded tissue sections. International Society of Heamatology, Congress of the European & African Division, Budapest, 2007 IF: 5.756

Alpár D, Kajtár B, Hermesz J, Kereskai L, Jáksó P, Pajor G, Nagy Zs, László R, Pajor L. Automated mapping of translocation i-FISH patterns on praffin-embedded samples. XXIV International Congress of the International Society for Analitical Cytology, Budapest, 2008. IF: 5.756

Poszterbemutatók tudományos kongresszusokon Jáksó P, Pajor L. Apoptózis vizsgálatára alkalmas áramlási cytometriás módszerek. Pathológus Találkozó, Lillafüred, 1997

Szanyi I, Szuhai K, Jáksó P, Pajor L. Chromosomális aneuploiditás vizsgálata interpházis cytogenetikával (Gyermekkori acut lymphoid leukémia eseteinek összehasonlító tanulmánya). Pathológus Találkozó, Lillafüred, 1997

75

Jáksó P, Balázs M, Pajor L, Balogh P. A CD45 vs. SSC gating kiegészítése a RAT 1.7 Monoklonális antitest alkalmazásával malignus hematológiai kórképekben. I. Magyar Sejtanalatikai Konferencia, Budapest, 1998. Kálmán E, Jáksó P, Pakodi F, Pajor L. Primér peritoneális mesothelioma. Diagnózis, modern módszertanok igénybevételével. Pathológus Konferencia, Gyula,1998. Jáksó P, Pietsch T, Kovács Gy. Frequent duplication of chromosome 20 in hepatoblastomas. Pathologus Találkozó, Sopron, 1999. Jáksó P, Kálmán E. Megfelelő fluorokróm kiválasztásának jelentősége a flow cytometriában : alacsony CD10 expresszió detektálása limfómák esetén. III. Magyar Sejtanalitikai Konferencia, Budapest, 2002. Kajtár B, Tóth J, Alpár D, Jáksó P, Kereskai L, László R, Nagy Z, Pajor L. Simultaneous appearance of+8 in Ph+ and Ph- cells during imatinib treatment of CML: a report of two cases. International Society of Heamatology, Congress of the European & African Division, Budapest, 2007

Előadások tudományos kongresszusokon Jáksó P, Kereskai L, Pajor L. Antigén-expresszió és fényszórás intenzitások mértékének jelentősége lymphomák flow cytometriás immunphenotipizálása során. Pathológus Találkozó, Lillafüred, 2000.

76

RÖVIDÍTÉSEK

MDS: mielodiszpláziák (Myelodysplastic syndromes) RA: refrakter anémia (Refractory anemia) RARS: refrakter anémia ringed szideroblasztokkal (Refractory anemia with ring sideroblasts) RARS-t: refrakter anémia ringed szideroblasztokkal-trombocitózissal (Refractory anemia with ring sideroblasts - thrombocytosis) RCMD: refrakter citopénia több sejtvonal diszpláziájával (Refractory cytopenia with multilineage dysplasia) RCMD-RS: refrakter citopénia több sejtvonal diszpláziájával-ringed szideroblasztokkal (Refractory cytopenia with multilineage dysplasia and ring sideroblasts) RAEB-I: refrakter anémia blaszt szaporulattal (Refractory anemia with excess blasts, 5-9% blasts) RAEB-II: refrakter anémia blaszt szaporulattal (Refractory anemia with excess blasts, 10-19% blasts) MDS-u: nem klasszifikálható mielodiszpláziák (Myelodysplasia unclassifiable) MPN: mieloproliferatív neopláziák (Myeloproliferative neoplasms) CML: krónikus mieloid leukémia (Chronic myelogenous leukemia) Ph-kromoszóma: Philadephia-kromoszóma PMF: elsődleges mielofibrózis (Primary myelofibrosis) PV: policitémia vera (Polycythemia vera) ET: esszenciális trombocitémia (Essential thrombocythemia) MCD: hízósejtes betegség (Mast cell disease) CNL: krónikus neutrofil sejtes leukémia (Chronic neutrophilic leukemia) CEL-NOC: nem kategorizálható krónikus eozinofil sejtes leukémia (Chronic eosinophilic leukemia, not otherwise categorized) HES: hipereozinofíliás szindróma (Hypereosinophilic syndrome) MPN-u: nem klasszifikálható mieloproliferatív neopláziák (Myeloproliferative neoplasms, unclassifiable)

77

PDGRFA: trombocita növekedési faktor receptor, alfa (Platelet-derived growth factor receptor, alpha) PDGRFB: trombocita növekedési faktor receptor, béta (Platelet-derived growth factor receptor, beta ) FGFR-1: fibroblaszt növekedési faktor 1(Fibroblast Growth Factor Receptor 1) JAK2: Janus kinase 2 JAK2V617F: JAK2 gén V617F mutációja MPL: mieloproliferatív leukémia vírus onkogén (myeloproliferative leukemia virus oncogene) HUMARA: humán androgén receptor gén esszé (Human androgen receptor gene assay) PCR: polimeráz láncreakció (polimerase chain reaction) MS-PCR: mikroszatellita-PCR (microsatellite-PCR) XI: X kromoszóma inaktiváció (X chromosome inactivation) G6PD: glükóz-6-foszfát dehidrogenáz (Glucose-6-phosphate dehydrogenase) STRP: short tandem repeat polimorfizmus (short tandem repeat polimorphism) RFLP: restrikciós fragment hosszúság polimorfizmus (restriction fragment length polimorphism) HPRT: hipoxantin-guanin foszforiboziltranszferáz (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase) PGK: foszfoglicerát kináz (Phosphoglycerate kinase) p55: palmytoilated mebrane protein IDS: iduronát-2 szulfatáz (Iduronate-2 sulfatase) NRXI: nem véletlenszerű X kromoszóma inaktiváció (non-random X chromosome inactivation) AI: allélikus kiegyensúlyozatlanság (allelic imbalance) CDR: leggyakrabban deletált szakasz (common deleted region) EDTA: etiléndiamin-tetraecetsav (ethylenediaminetetraacetic acid) B-CLL: B-sejtes krónikus limfoid leukémia (B-cell chronic lymphocytic leukemia) AML: akut mieloid leukémia (Acute myeloid leukemia) CMML: krónikus mielomonociter leukémia (Chronic Myelomonocytic Leukemia) FITC: fluoreszcein-izotiocianát (Fluorescein isothiocyanate) 78

RPE: R-fikoeritrin (R-phycoerythrin) RPE-Cy5: R-fikoeritrin-cianin-5 (R-Phycoerythrin-Cyanine 5) TE8: 8-as pH-jú TRIS-EDTA puffer SDS: nátrium-dodecil-szulfát (Sodium Dodecil Sulfate) PBS: Phosphate buffered saline mp.: másodperc XISZ: X inaktivációs szám S.D.: sztenderd deviáció EBV: Epstein-Barr vírus

79