Doktori (PhD) értekezés
DOHÁNYZÁS EREDETŰ DNS KÁROSODÁSOK ÖSSZEFÜGGÉSEINEK VIZSGÁLATA BIOMARKEREKKEL HUMÁN TÜDŐDAGANATOS POPULÁCIÓBAN
Anna Lívia Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Orvosi Népegészségtani Intézet
Témavezető: Dr. Schoket Bernadette Programvezető: Professzor Dr. Ember István
2012
Tartalomjegyzék 1. Bevezetés ........................................................................................................................... 4 2. Elméleti háttér .................................................................................................................... 5 2.1. A tüdőrákos megbetegedések nemzetközi és hazai statisztikája ................................... 5 2.2. A tüdőrák kialakulás kockázati tényezői ...................................................................... 8 2.2.1. A dohányzás, mint a tüdőrák elsődleges kóroki tényezője, és a dohányfüst daganatkeltő komponensei.............................................................................................. 8 2.2.2. A tüdőrák kialakulását befolyásoló tényezők a dohányzás mellett ......................... 9 2.2.2.1. Nemi különbségek és egyedi hajlamosító tényezők ........................................ 9 2.2.2.2. Környezeti és életmódbeli hatások ............................................................... 11 2.2.3. A magyarországi tüdőrákos megbetegedések a fő oki tényezők tükrében ............ 13 2.3. A kémiai karcinogenezis molekuláris mechanizmusa és biomarkerei ......................... 13 2.3.1. Karcinogén vegyületek metabolikus aktivációja és inaktivációja ......................... 13 2.3.2. A környezeti karcinogenezis folyamatának főbb biomarkerei.............................. 15 2.4. Biomarkerek molekuláris epidemiológiai alkalmazása ............................................... 19 2.4.1. DNS-addukt vizsgálatok a dohányzással összefüggésben .................................... 19 2.4.2. TP53 tumorszupresszor gén mutáció vizsgálatok a tüdőrákkal összefüggésben ............................................................................................................ 22 2.5. Kutatásaim hazai előzményei, DNS-addukt vizsgálatok............................................. 24 3. Célkitűzés ........................................................................................................................ 25 4. Anyagok és módszerek ..................................................................................................... 27 4.1. A vizsgálati populáció leírása .................................................................................... 27 4.2. Mintakezelés a biomarker vizsgálatokhoz .................................................................. 30 4.2.1. Mintagyűjtés, szövet tárolás ................................................................................ 30 4.2.2. DNS izolálás szövetből fenol–klorforom–izo-amilalkoholos extrakciós módszerrel.................................................................................................................... 30 4.2.3. DNS tárolás ........................................................................................................ 31 4.3. Aromás DNS-addukt meghatározás 32P-utójelöléses módszerrel ................................ 31 4.4. O4-etiltimidin meghatározás 32P-HPLC módszerrel ................................................... 34 4.5. TP53 génmutáció vizsgálati módszerek ..................................................................... 35 4.5.1. PCR .................................................................................................................... 35 4.5.2. Denaturáló Gradiens Gélelektroforézis (DGGE) ................................................. 37 4.5.3. CE-SSCP - Automatizált egyszálkonformáció polimorfizmus vizsgálat .............. 40 4.5.4. Közvetlen szekvenálás ........................................................................................ 41 4.6. Alkalmazott statisztikai módszerek ............................................................................ 42 5. Eredmények ..................................................................................................................... 43 5.1. DNS-addukt vizsgálati eredmények ........................................................................... 43 5.1.1. Aromás DNS-adduktszintek a dohányzási státus függvényében .......................... 43 5.1.2. O4-etT szintek a dohányzási státus függvényében ............................................... 47 5.1.3. O4-etT és aromás adduktok közötti összefüggések .............................................. 49 5.2. TP53 génmutáció vizsgálatok .................................................................................... 51 5.2.1. TP53 génmutáció gyakoriság .............................................................................. 51 5.2.1.1. Génmutáció gyakoriság a nem, a daganattípus és a dohányzási státusz szerint....................................................................................................................... 51 5.2.1.2. TP53 mutáció gyakoriság az összes valaha dohányzónál a dohányzási idő és a napi cigarettaszám függvényében ................................................................. 53 5.2.1.3. A TP53 génmutáció gyakorisági eloszlás a TP53 gén hosszában az exonokon és a kodonokon......................................................................................... 54 2
5.2.2. Mutációs mintázat .............................................................................................. 57 5.2.3. TP53 génmutáció mintázat és az aromás DNS-adduktszintek közötti összefüggések .............................................................................................................. 58 5.2.3.1. Az aromás DNS-adduktszintek mutáció-hordozó és nem hordozók között ....................................................................................................................... 58 5.2.3.2. A TP53 mutáció típusok gyakorisága az aromás DNS-adduktszintek függvényében ........................................................................................................... 59 6. Az eredmények megbeszélése .......................................................................................... 61 6.1.Aromás DNS-addukt és O4-etT szintek, azok összehasonlítása ................................... 61 6.2. TP53 génmutáció gyakoriság, mutációs mintázat és az aromás adduktokkal való összefüggések a vizsgálati anyagban ................................................................................ 67 7. Összefoglalás ................................................................................................................... 72 8. Kiemelt új tudományos eredmények ................................................................................. 74 Irodalomjegyzék .................................................................................................................. 75 Rövidítések jegyzéke ........................................................................................................... 91 Publikációk .......................................................................................................................... 92 Köszönetnyilvánítás ............................................................................................................. 94
3
1. Bevezetés Magyarországon a férfiak tüdőrákos megbetegedési gyakorisága világviszonylatban a legmagasabbak között van, és a nőknél is magas, de ennek pontos okait még nem ismerjük. A tüdőrák kialakulásának elsődleges kockázatnövelő tényezője a dohányzás. Magyarországon az átlagosan elszívott cigarettaszám magas, viszont ez az érték nem tér el jelentősen más sokat dohányzó nemzetek elszívott cigarettamennyiségétől. Az azbeszt és a radon expozíció szempontjából nem sorolják Magyarországot a kiemelten nagy kockázatú országok közé. Ezért a kiugróan magas hazai tüdőrák megbetegedési gyakoriság okainak felderítésére, a betegség összetett molekuláris mechanizmusának feltérképezéséhez további kutatások szükségesek. A molekuláris epidemiológiában használt biológiai markerek (általánosan elfogadott rövidítéssel a biomarkerek) azok a biológiai anyagok, alkotók vagy folyamatok, amelyek az emberi szervezetből kimutathatóak, mérhetőek és a betegség kimenetét befolyásolják, vagy a betegség kialakulás kockázatát jellemzik (Toniolo és mtsai., 1997). Biomarkerek vizsgálatával nyert ismeretek segítségével lehetőség nyílik a betegség gyakoriságának, és az emberre gyakorolt káros hatásának csökkentésére. A daganatképződés többlépcsős folyamatát jellemző fő biomarker csoportok: az expozíciós biomarkerek, mint például a DNS-adduktok*; a hatásmarkerek, mint például a génmutációk; valamint a teljes folyamatot befolyásoló genetikai fogékonysági markerek. A tüdődaganat kialakulás összetett molekuláris folyamatainak a jellemzése lehetséges a különböző csoportokba tartozó egyes biomarkerek és azok összefüggéseinek az együttes vizsgálatával. Doktori disszertációmban az aromás DNS-adduktok és az O4-etiltimidin mint expozíciós biomarkerek, a TP53 génmutációspektrum mint hatásmarker, és a betegség kockázatát leginkább növelő környezeti expozíció, a dohányzás összefüggéseit tanulmányoztam.
*Saját korábbi magyar nyelvű publikációink szóhasználatát követve, az angol „adduct” megfelelőjeként disszertációmban az „addukt” szót használom egyes magyar szakszövegekben előforduló „adduktum” szó helyett. 4
2. Elméleti háttér 2.1. A tüdőrákos megbetegedések nemzetközi és hazai statisztikája A daganatos megbetegedések a leggyakoribb halálokok között szerepelnek világszerte. Az Egészségügyi Világszervezet legfrissebb összesített felmérése szerint 2008. év során 7,6 millió ember halt meg rákban (az összes halálozásnak körülbelül 13%-a), ebből 1,4 millió tüdőrákban (WHO Fact sheet, 2008). A tüdőrák a férfiaknál a leggyakoribb, és összesítésben is a legtöbb halálesetet okozó daganattípus (GLOBOCAN, 2008). Európában évente körülbelül 240 ezer ember hal meg tüdőrákban (Kaiser és mtai., 2008). Magyarországon az európai országokéhoz nagyjából hasonló a daganatos halálozások aránya az összes halálozáson belül, és ugyanazok a daganattípusok a vezető halálokok (tüdőrák, emlőrák, kolorektális daganatok) (European Cancer Observation, IARC, 2008; Ferlay és mtsai, 2010). Ugyanakkor a tüdőrák megbetegedési és túlélési arányokban jelentősek az eltérések az Európai Unió egyes tagállamai között (Kaiser és mtsai., 2008). A legtöbb EU-s országban, beleértve a nemrég csatlakozott közép- és kelet-európai országokat, az 1990-es évektől fokozatosan csökken a tüdőrák halálozás a 35-54 év közötti férfiaknál. Néhány ország viszont nem mutat javulást ebben a tekintetben, köztük van Magyarország, Portugália, Görögország, Spanyolország és Franciaország, sőt Magyarországon emelkedő a tendencia (Tyczynski és mtsai., 2004; Kaiser és mtsai., 2008 ). A férfiakkal ellentétben a nők tüdőrák halálozási gyakorisága a legtöbb EU-s tagállamban még mindig növekszik. A feltehető ok az, hogy régebben a dohányzás elsősorban a férfiak szokása volt, később az emancipáció káros következményeként növekedni kezdett a dohányzó nők száma. A növekedés 1990-2000. között 17 %-os volt.
A
legnagyobb
Magyarországon
és
növekedés
nők
esetében
Dániában,
Németországban,
Lengyelországban
történt.
Lettországban,
Litvániában,
Spanyolországban és Portugáliában a nők tüdőrákos halálozási aránya viszonylag alacsony (Didkowska és mtsai., 2005; Levi és mtsai., 2004).
5
A magyar férfiak tüdőrák incidenciája a világon a legmagasabbak között van, ez 145 eset/100000 fő; és európai viszonylatban a magyar nők is az elsők között vannak 76 eset/100000 fő értékkel (WHO, 2008). Néhány ország, köztük Magyarország tüdőrák incidenciájának alakulása látható az 1. ábrán 1950-2006. között nők és férfiak közötti bontásban. A 2. ábrán 27 országra vonatkozó összehasonlító adatokat találunk a 2008-as évre vonatkoztatva (WHO, 2008). Férfi
Nő Egyesült Államok Spanyolország Japán Finnország Egyesült Királyság Magyarország Kína
100 000 főre jutó arány
Ábra: A tüdőrák halálozási gyakoriság alakulása néhány országban, köztük Magyarországon 1950-2006 között nőknél és férfiaknál (WHO halálozási adatbázis GLOBOCAN 2008). Halálozási év
Halálozási év
1. ábra: A tüdőrák halálozási gyakoriság alakulása néhány országban, köztük Magyarországon 1950-2006. között férfiaknál és nőknél (GLOBOCAN, 2008)
6
A
Magyaro. Dánia Hollandia Norvégia Izland Írország Svédország Ausztria Lengyelo. Finnország Szerbia Olaszország Horvátország Izrael Lettország Bulgária Örményo. Ukrajna Litvánia Fehéroroszo. Moldova Kazahsztán Grúzia Kirgizisztán Azerbajdzsán Albánia Üzbegisztán
B
Magyaro. Dánia Hollandia Norvégia Izland Írország Svédország Ausztria Lengyelo. Finnország Szerbia Olaszország Horvátország Izrael Lettország Bulgária Örményo. Ukrajna Litvánia Fehéroroszo. Moldova Kazahsztán Grrúzia Kirgizisztán Azerbajdzs. Albánia Üzbegisztán
2. ábra: Néhány ország tüdőrák icidenciája 2008-ban férfiak (A) és nők (B) között (Health for all Database, © World Health Organization 2010) 7
2.2. A tüdőrák kialakulás kockázati tényezői 2.2.1. A dohányzás, mint a tüdőrák elsődleges kóroki tényezője, és a dohányfüst daganatkeltő komponensei A tüdődaganat kialakulásának elsődleges kockázatnövelő tényezője a dohányzás (Doll és Peto, 1981; IARC, 1987; Tyczynski és mtsai., 2003). A dohányzási paraméterek közül a dohányzási évek száma befolyásolja leginkább a tüdőrák kockázatát, bár az elszívott cigaretták számának emelkedése is növeli a betegség kockázatot. Doll és Peto 20 éves nyomon követéses tanulmányában statisztikai modell alapján megállapította, hogy a tüdőrák kockázata 100-szorosra nő azoknál a férfiaknál, akik 45 évig dohányoznak, összevetve a 15 évig dohányzókkal (Doll és Peto., 1978; IARC, 2004). A dohányfüst közel négyezer komponenst tartalmaz, ezek közül számos komponens DNS károsító, azaz genotoxikus hatású (IARC, 2004). A főfüstből, amely a cigaretta szájhoz közeli végén szippantás közben kiáramló füst, 69 ismert karcinogén vegyületet mutattak ki (Hecht, 2003; IARC, 2004). A mellékfüstben, ami az egyes szippantások között az égő cigarettaszár végén keletkező és a cigarettapapíron átszivárgó füst (IARC, 2004), a főfüstből kimutatott karcinogének többsége jelen van (Hecht, 2003). A passzív dohányzók által beszívott dohányfüst a fő- és mellékfüst, valamint a kilélegzett dohányfüst levegővel felhígított keveréke (IARC, 2004). A dohányfüstben lévő karcinogén vegyületek között vannak policiklusos aromás szénhidrogének (PAH-ok), heterociklusos szénhidrogének, illékony szénhidrogének, nitrovegyületek, aromás aminok, heterociklusos aminok, N-nitrózaminok, aldehidek, fenolok és szervetlen vegyületek (Hoffmann és mtsai., 2001; IARC, 2004). Ezek között a leggyakrabban vizsgált genotoxikus vegyületek a benz[a]pirén, mely egyúttal a PAH-ok egyik fő modellvegyülete is, az N-nitrózaminok közül az N’-nitrozonornikotin (NNN) és a 4-(Nnitrozometilamino)-1-butanon (NNK), valamint az aromás aminok közül a 4aminobifenil. Kémiai szerkezeti képletük a 3. ábrán látható.
8
Benz[a]pirén
NNN
4-Aminobifenil
NNK 3. ábra: A dohányfüstben lévő néhány jellegzetes genotoxikus vegyület szerkezeti képlete 2.2.2. A tüdőrák kialakulását befolyásoló tényezők a dohányzás mellett 2.2.2.1. Nemi különbségek és egyedi hajlamosító tényezők Nemi különbségek Az epidemiológiai adatok azt mutatják, hogy a két nem között különbségek vannak a tüdőrák kialakulás kockázata és a prognózis tekintetében. A nők fogékonyabbnak tűnnek a tüdőrák kialakulására dohányzóknál és sohasem dohányzóknál egyaránt, viszont a nők között kisebb a mortalitási arány a férfiakhoz viszonyítva (Henschke és mtsai., 2006; Samet és mtsai., 2009). Egy nemrég készült több mint 14 ezer főt számláló felmérésben a nők tüdőrák incidenciája magasabb volt, mint a férfiaké 1,7 esélyhányados értékkel [1,3-2,3], az életkorra és a dohányzási dózisra korrigálva. A tüdőrákkal diagnosztizált nők és férfiak átlagos életkora hasonló volt (67 ill. 68 év), de a nők lényegesen kevesebbet dohányoztak (47 ill. 64 doboz-év, ahol a doboz-év a napi
9
dobozszám (20 cigaretta/doboz) és a dohányzott évek szorzata). Ugyanebben a vizsgálatban viszont kisebb volt a halálos kimenetelű tüdőrákos esetek száma nőknél, mint a férfiaknál (esélyhányados=0,48; [0,25-0,89]) az életkorra és a dohányzásra korrigálva (Henschke és mtsai., 2006). Egyedi hajlamosító tényezők A genetikai
polimorfizmusokból
adódóan a
karcinogének
metabolizmusában
közreműködő enzimeknek nagy az egyének közötti varianciája. Általánosan elfogadott terminológia alapján akkor nevezhető genetikai polimorfizmusnak egy génvariáns, ha a populációban 1%-nál nagyobb annak gyakorisága (Garte, 2008).
A genetikai
polimorfizmusok befolyásolhatják a gén által kódolt enzim katalitikus tulajdonságait, okozhatják az enzim teljes hiányát, az enzim mennyiségének csökkenését vagy növekedését. Az egyes génpolimorfizmusok variánsai önmagukban nem okoznak betegséget, és hatásuk csak a külső, adott esetben környezeti ágens jelenlétében érvényesülhet. Jelentőségük népegészségügyi szempontból van a veszélyeztetett, a betegségre fogékonyabb csoportok meghatározásában (Toniolo és mtsai., 1997; Hirvonen, 2008).
A tüdőrák esetében az egyedi fogékonysági különbségek elsősorban a testidegen vegyületek lebontását katalizáló fázis I, főként aktivációs, és fázis II, főként detoxikációs
enzimek,
valamint
a
DNS
hibajavító
enzimek
genetikai
polimorfizmusaihoz köthető. A tüdőrák kockázattal kapcsolatban vizsgálták különböző fázis I gének polimorfizmusait, mint például a citokróm P450 (CYP) enzim szupercsaládból a CYP1A1, a mieloperoxidáz (MPO), és az epoxid hidroláz 1 (EPHX1) gének polimorfizmusait (Vineis és mtsai., 2003; Taioli és mtsai., 2003; Hung és mtsai., 2003; Timofeeva és mtsai., 2010). A fázis II reakciókban részt vevő gének közül a legjelentősebbek a glutation S-transzferáz (GST) családból a GSTM1, GSTP1 és a GSTT1 gének, az N-acetiltranszferáz (NAT) családból a NAT1 és NAT2 gének polimorfizmusai (Bouchardya és mtsai., 2001; Hung és mtsai., 2003., Romkes és mtsai., 2003; Dalhoff és mtsai., 2005; Wikman és mtsai., 2001). További fontos
10
génpolimorfizmusok az oxidatív stressz folyamatban szerepet játszó NAD(P)H-kinonoxidoreduktáz 1 (NQO1), a nikotin anyagcserében szerepet játszó CHRNA5, és a DNS sérülés érzékelésében szerepet játszó ATM gén polimorfizmusai (Okazaki és mtsai., 2010; Vineis és mtsai., 2007; Hung és mtsai., 2008; Landi és mtsai., 2006). A tüdőrák családi öröklődésével foglalkozó tanulmányok száma viszonylag csekély, és ez idáig nem találtak egyértelműen tüdőrákra hajlamosító genetikai tényezőt. Kimutatták ugyan, hogy léteznek bizonyos gén szakaszok a kromoszóma 6q és 12p régiójában, amelyek a tüdőrákkal függhetnek össze. Ezek az eredmények azonban csak kiinduló pontként szolgálnak további, családi halmozódás hátterét kutató vizsgálatoknak (Schwartz és Ruckdeschel, 2006). 2.2.2.2. Környezeti és életmódbeli hatások Beltéri levegőszennyezők A szén és a biomassza (elsősorban a fa) elégtelen égéséből származó füstök számos karcinogén vegyületet tartalmaznak, többek között benz[a]pirént, formaldehidet és benzolt. A szén égéstermékei tüdőrákot okozhatnak (IARC, 1987). Számos tanulmány, elsősorban kínai háztartásokat vizsgálva, azt mutatta, hogy a nyílt térben széntüzeléssel való főzés vagy fűtés tüdőrákkockázati tényező (IARC, 2008). Radon sugárzás Az 1920-as években Kelet-Európában dolgozó bányászok körében nagy számban fordult elő tüdőrák, és azt feltételezték, hogy ennek kialakulásáért a radon sugárzás a felelős (National Research Council, 1988). A radon daganatkeltő hatása nem kizárólag a bányászokat, hanem a lakosságot is érintheti geológiai eredetű beltéri levegőszennyező gyanánt. A radon alfa részecske kibocsátásával bomlik, amely DNS mutációt, kromoszómaaberrációt okozhat. Kísérletek bizonyították, hogy a radon bármilyen mértékű expozíció esetében növeli a tüdőrák kialakulás kockázatát (Samet és mtsai., 2009).
11
Azbeszt expozíció A krónikus azbeszt expozíció számos légúti megbetegedés mellett a tüdőrák kialakulás esélyét is növeli (O’Reilly és mtsai., 2007; Jamrozik és mtsai., 2011). Ez főleg azbesztszigetelést végző építőipari munkásokat érintett (Kovács és mtsai., 2005). Pszichés és szociális okok A pszichológiai tényezők szerepét a daganatfejlődés folyamatában már régóta vizsgálják. Az elmúlt 30 év epidemiológiai és klinikai vizsgálatai bizonyították, hogy a pszichés faktorok, mint például a krónikus stressz, depresszió és a társadalmi izoláltság befolyásolják a rák progresszióját (Moreno-Smith és mtsai., 2010). A lelki okok és a karcinogén folyamatok elindulása közötti kapcsolat létének erősítésére vagy cáfolására vonatkozóan viszont kevés adat áll a rendelkezésre, megbízható következtetések levonása érdekében további vizsgálatok szükségesek (Dalton és mtsai., 2002; MorenoSmith és mtsai., 2010). Térinformatikai felmérésekkel (Geographical Information System: GIS) kimutatták, hogy a magyarországi tüdőrákos megbetegedések halmozódása és az alacsony szociálisgazdasági státusú térségek földrajzi elhelyezkedése között átfedés van. Az alacsony szociális-gazdasági státussal nagyobb valószínűséggel függ össze a dohányzás és a dohányzás okozta káros egészségi hatások ismeretének hiánya. A rossz szociális helyzet gyakran jár együtt egészségre káros munkakörnyezettel, nem megfelelő táplálkozási szokásokkal, egészségügyi szolgáltatásokhoz való korlátozott hozzáféréssel, rossz lakáskörülményekkel,
szociális
kapcsolatok
hiányával.
Mindezek
ismeretében
kijelenthető, hogy a GIS típusú elemzések hozzájárulnak a tüdőrák kockázati tényezőinek feltárásához (Schoket és mtsai. 2010; Nagy és mtsai., 2011).
12
2.2.3. A magyarországi tüdőrákos megbetegedések a fő oki tényezők tükrében Nemzetközi összehasonlítások szerint a magyarok a sokat dohányzó nemzetek közé tartoznak, 30%-os prevalenciával a 15 év feletti korosztályban (WHO, 2008), de ez nem tér el jelentősen más sokat dohányzó nemzetek dohányzási statisztikájától (Szilágyi, 2004). Magyarországon az 1970-es évek közepétől 1985-ig alkalmaztak azbesztszórásos technológiát
épületek
szigetelésére.
Az
azbeszt
okozta
tüdőrákos
halálozás
Magyarországon 200-300 esetre becsülhető, amely számarányában csekély az összes betegségszámhoz képest (Kovács és mtsai, 2005). Egy 1998-2002. között 6 közép- és kelet-európai országban, közöttük Magyarországon is készült nagy mintaszámú esetkontroll felmérés szerint a nagyszámú tüdőrák megbetegedéshez nem járul hozzá számottevően a munkahelyi azbesztexpozíció (Carel és mtsai., 2007). A radonsugárzás tekintetében sem sorolják Magyarországot a kiemelten nagy kockázatú országok közé (Déri és mtsai., 1992; Mándi és mtsai., 2001; Rodelsperger és mtsai., 2001). 2.3. A kémiai karcinogenezis molekuláris mechanizmusa és biomarkerei 2.3.1. Karcinogén vegyületek metabolikus aktivációja és inaktivációja A karcinogén vegyületek közül néhány közvetlenül fejti ki DNS károsító hatását, mint például az egészségügyben és az iparban sterilezéshez használt etilénoxid (Hecht, 2008), de a daganatkeltő vegyületek többsége kémiai átalakuláson megy keresztül és válik biológiailag aktívvá. A kémiai karcinogén vegyületek biotranszformációja a fázis I és fázis II aktivációt és inaktivációt katalizáló, egymással összetett reakcióegyensúlyi rendszerben működő enzimek részvételével történik (4. ábra). A metabolikus aktiváció során a fázis I enzimek közreműködésével egy oxigénatom épül be a testidegen molekulába, amit többnyire a citokróm P-450 enzimek katalizálnak. Ekkor olyan nagy reakcióképességű molekulák is keletkeznek, amelyek kötődni tudnak a sejtek makromolekuláira, vagyis a DNS-re, az RNS-re és a fehérjékre, és DNS-, RNSés fehérjeadduktok képződnek.
13
A reakcióképes metabolitoknak csak egy kis hányada képez adduktokat, a többségük a fázis II konjugáló enzimek közreműködésével vízoldékony konjugátumokká alakul és kiürül a szervezetből. A fő fázis II enzimcsaládok a glutation S-transzeferáz (GST), az UDP-glükuroniltranszferáz (UDPGT), az N-acetiltranszferáz (NAT), a szulfotranszferáz (SULT) és a peroxidázok. Ezek széles szubsztrátspecifitással rendelkeznek. A hibás DNS szerkezetet összetett javító mechanizmus állítja helyre. Az elsődleges DNS-sérülések, közöttük a DNS-adduktok, nem okoznak szekvenciaváltozást. A DNSadduktok kulcsszerepe a rákiniciáció folyamatában abban áll, hogy ha egy DNS-addukt nem javítódik ki és jelen van a DNS replikációs fázisában, akkor hibás kódhoz, mutációk keletkezéséhez vezethet (Miller és Miller, 1981). Ha ezek mutációk egyes gének kritikus régióiban jönnek létre, akkor onkogének aktiválódhatnak, illetve tumorszupresszor gének, mint például a TP53 gén, inaktiválódhatnak. Ennek következtében fokozódhat a sejtszaporodás, érzéketlenné válhat a sejt a kóros sejtszaporodás megakadályozását célzó jelekre, károsodhat a programozott sejthalál normál folyamata, szöveti inváziót és áttétképződés indulhat (Wogan, 1992; Seo és mtsai., 2000; Berwick és mtsai., 2008). A 4. ábra a metabolikus aktiváció – inaktiváció folyamatát mutatja be vázlatosan.
14
Karcinogén vegyület fázis I és fázis II anyagcserefolyamatok
Reakcióképes metabolit
Inaktív vegyület
Fehérje addukt RNS addukt
DNS addukt DNS hibajavítás
Ép DNS
DNS mutáció
Rák
4. ábra: Karcingén vegyületek aktivációja/inaktivációja, és következményei (Schoket, 2011) 2.3.2. A környezeti karcinogenezis folyamatának főbb biomarkerei A daganatképződés többlépcsős folyamatát jellemző fő biomarker csoportok: az expozíciós biomarkerek, ezen belül a belső dózis és a biológiailag hatásos dózis markerei; a hatásmarkerek, ezen belül a korai biológiai hatás, a megváltozott génszerkezet és a klinikai betegség markerei; valamint a teljes folyamatot befolyásoló fogékonysági markerek, pl. a genetikai polimorfizmusok. A biológiai markerek fő típusait, láncolatát az expozíciótól a betegség kialakulásáig az 5. ábra mutatja be részletesen.
15
Expozíciós biomarkerek
Hatásmarkerek
Fogékonysági markerek, genetikai polimorfizmusok
Expozíció
Belső dózis
Légszennyezés Anya vegyület Ivóvíz Metabolit Táplálkozás Dohányzás
Anyagcsere folyamatok
Biológiailag hatásos dózis
DNS addukt Fehérje addukt DNS száltörés Oxidatív sérülés
Korai biológiai hatás
Megváltozott génszerkezet/ funkció
Kromoszóma aberráció Mutációk Mikronuklesz Onkogénen/ Testvérkromatid-kicserélődés Tumorszupresszor génen/ Riporter génen
Klinikai betegség
Prognózis
DNS metiláció Tumor marker fehérjék
DNS hibajavítás
5. ábra: A biomarkerek kapcsolata az környezeti karcinogenezis folyamatában az expozíciótól a klinikai betegségig (Perera és Weinstein, 1982; Schulte és mtsai., 1993; Vineis és Perera, 2007)
16
Az expozíciós biomarkerek az aktuális és a múltbeli környezeti expozíciót jellemzik. Az ideális expozíciós biomarker expozícióspecifikus, alacsony koncentrációban is kimutatható, és szoros mennyiségi összefüggésben van az expozíció mértékével. A belsődózis-markerek közé tartoznak a könnyen hozzáférhető biológiai mátrixokból, mint például a szérumból és a vizeletből kimutatható anyavegyületek és azok metabolitjai (Toniolo és mtsai., 1997). Ezek általában rövid felezési idejűek, ami akár néhány óra és néhány nap között mozog, ezért a nemrég bekövetkezett környezeti expozíciót jellemzik. A biológiailag hatásos dózis markereinek kiemelt képviselői például a DNS és a fehérje adduktok. Abban az esetben, ha adott karcinogén DNS-addukt kimutatására nincs alkalmas módszer, akkor karcinogén-protein adduktot alkalmazhatnak helyettesítő markerként (Farmer, 2006; Phillips, 2008). Ha az elsődleges DNS hibák kijavítása nem történik meg, permanens mutációk keletkezhetnek a DNS bázissorrendjében. A mutációk lehetnek bázis kicserélődések, deléciók vagy inzerciók. Ezek a változások nemcsak a gént, hanem a továbbiakban a kromoszóma struktúrát is érinthetik, és kromoszóma-transzlokációt, -törést és kromoszómaszám-változást okozhatnak. A hatásmarkerek közé tartoznak a hagyományos citogenetikai markerek, mint például a kromoszómaaberráció (CA), testvérkromatid-kicserélődés (SCE), mikronukleusz (MN); a kromoszóma struktúraváltozások, mint például a restrikciós fragment hossz polimorfizmus, heterozigótaság vesztés, és transzlokációs markerek (Seo és mtsai., 2000; Schoket, 2011). Ha a mutációk bizonyos onkogének, pl. ras vagy myc, vagy tumorszupresszor gének, pl. TP53 vagy CDKN2A gén kritikus régióiban keletkeznek, akkor megváltozik bizonyos fehérjék működése, megszűnik a normális sejtnövekedés-szabályozás és megindul a tumor fejlődése. Az utóbbi néhány évtizedben az egyik leggyakrabban tanulmányozott tumorszupresszor gén a TP53, amely a humán kromoszóma 17-es rövid karján található, 393 aminosavból álló fehérjét kódol. A TP53 gén által kódolt p53 tumor szupresszor 17
fehérjét először 1974-ben azonosították mint egy SV40 T-antigénhez kapcsolódó fehérjét az SV40 által indukált tumorokban (Robins és mtsai., 2005; Holmila, 2010). Az 1980-as évek végén tisztázódott, hogy a p53 normális funkcióját tekintve antionkogén (Ko és Prives, 1996). A p53 fehérje részt vesz a sejtciklus szabályozásban, a DNS hibajavító folyamatokban és az apoptózisban (Guimaraes és Hainaut, 2002). A TP53 minden szövetben kifejeződik alacsony szinten. A sejtet érő stressz, például onkogének aktivációja, sugárzás, nem-genotoxikus stressz (hő, hipoxia) hatására a génexpresszió megnő, és poszt-transzlációs folyamatok során felgyülemlik a p53 fehérje (Guimaraes és Hainaut, 2002). A 6. ábrán a TP53 tumorszupresszor gén funkcióinak sematikus összefoglalása látható.
DNS károsodás UV-, RTG-, γ- sugárzás Karcinogén/Citotoxikus szer
Onkogén aktiváció
Nem genotoxikus stressz TP53
Sejtciklus szabályozás Apoptózis Sejtdifferenciálódás
DNS hibajavítás
6. ábra: A TP53 gén részvétele a sejtfolyamatokban
18
2.4. Biomarkerek molekuláris epidemiológiai alkalmazása A molekuláris epidemiológia fogalma a 80-es évek elején került be a daganatkutatásba. A molekuláris epidemiológia fejlett laboratóriumi és elemző epidemiológiai módszerek kombinálásával tanulmányozza a környezeti és endogén karcinogén expozíció és a szervezet válaszreakciói közötti összefüggéseket molekuláris szinten az expozíciótól a betegségig (Perera és Weinstein, 1982; Wild and mtsai., 2008). Ezzel a tudományággal szemben támasztott nagy elvárások között van az expozíció minél pontosabb mérése illetve becslése, az expozíció által okozott káros korai biológiai hatások észlelése, a betegségre fogékony, nagy kockázatú népességcsoportok minél nagyobb biztonsággal történő azonosítása, és végső soron a betegség kockázatának minél megbízhatóbb becslése (Tompa, 2006a; Schoket, 2011). A rákmegelőzés fontos területe a munkahelyi expozícióbecslés, a foglalkozásuk során rákkeltő anyagokkal exponáltak esetében (Tompa, 2006b). A tudomány jelenlegi állása szerint a molekuláris epidemiológiában használatos biomarkerek csak statisztikai módszerekkel csoport szinten alkalmazhatók expozíció- és kockázatbecslésre. A nagy egyedi biológiai különbségek miatt az egyedi szinten meghatározott biomarkerek az egyénre szabott kockázatbecslést nem teszik lehetővé (Schoket, 2011). 2.4.1. DNS-addukt vizsgálatok a dohányzással összefüggésben A DNS-adduktok sokáig hagyományosan az expozíció becslésére használt biomarkerek voltak. Az addukt mérés lehetővé teszi a DNS-t érő biológiailag hatásos karcinogén dózis mennyiségi jellemzését a vizsgált szövetben. Az adduktszint megmutatja, hogy milyen mértékben abszorbeálódott a karcinogén vegyület a szervezetbe, és milyen mértékben ment keresztül a metabolikus aktiváción, majd kötődött a DNS-hez (Gallo és mtsai., 2008). A 7. ábrán egy tipikus aromás DNS-addukt, a benz[a]pirén 7,8-diol 9,10epoxid DNS-adduktjának a sematikus képe látható.
19
7. ábra: A benz[a]pirén 7,8-diol 9,10-epoxid DNS-adduktja Többféle módszert fejlesztettek ki a DNS-adduktok meghatározásra, amelyek eltérő szubsztrátspecifitással és kimutatási határral rendelkeznek. Egyes módszerek egy-egy specifikus DNS-addukt kimutatására alkalmasak, mások bizonyos addukt csoportokat mutatnak ki. Az egy méréshez szükséges biológiai mintamennyiség széles tartományban változik a kimutatási módszertől függően. A módszerek átlagosan 1 addukt/108 nukleotid és 1 addukt/109 nukleotid közötti kimutatási határral rendelkeznek, amelyek humán táplálkozási és környezeti expozíciós vizsgálatokra már alkalmasak. Az adduktdúsítási lépéssel kombinált
32
P-utójelöléses módszer a leggyakrabban
használt és legnagyobb érzékenységű módszer. Az eljárás során az adduktdúsítást követően a DNS-adduktok egy izotópos jelet kapnak. Az ilyen módon jelölt adduktok elválasztása különböző
kromatográfiás eljárásokkal,
például
nagyhatékonyságú
folyadék kromatográfiával (HPLC) vagy vékonyrétegkromatográfiával történhet. Az immunkémiai eljárások addukt- vagy adduktcsoport-specifikus poliklonális vagy monoklonális antitestet alkalmaznak a DNS-adduktok kimutatására (Farmer, 2006). A tömegspekrometriás
módszer
néhány
DNS-addukt
kémiai
szerkezetspecifikus
mennyiségi meghatározására alkalmas többféle nagyműszeres elválasztástechnikai megoldással kombinálva (Farmer, 2006). Az aromás DNS-adduktok, amelyek közül számos kémiai szerkezet a dohányfüstben lévő PAH-okból keletkezik, a leggyakrabban vizsgált addukt típusok közé tartoznak
20
dohányzási expozíció esetében (Phillips, 2008; Lodivici és Bigagli, 2009). Aromás DNS-adduktokat mutattak ki dohányzóknál perifériás tüdő- és bronchusszövetből, orr és szájnyálkahártyából, és indukált köpetből (van Schooten és mtsai., 1992; Peluso és mtsai., 1997; Zhao és mtsai., 1997; Wiencke és mtsai., 1999; Besaratinia és mtsai., 2000a; Besaratinia és mtsai., 2000b; Phillips, 2002; Győrffy és mtsai., 2004; Peluso és mtsai., 2004; Győrffy és mtsai., 2008). Dohányzók tüdejéből kimutattak még O- és N-alkilált DNS bázisokat, amelyek elsősorban a dohányzás eredetű nitrózaminoktól származnak (Mustonen és mtsai., 1993; Petruzzelli és mtsai., 1996; Hecht, 2003;
Lewis és mtsai., 2004); és más DNS-
adduktokat, pl. 4-aminobifenil (Culp és mtsai., 1997) és malondialdehid (Munnia és mtsai., 2006) származékokat. Godschalk és munkatársai (2002a; 2002b) kis mintaszámú próbavizsgálatban O4-etiltimidint (O4-etT), egy potenciálisan promutagén DNS sérülést (Saffhill és mtsai., 1985; Hall és mtsai., 1983) mutattak ki dohányzók tüdejéből. Az O4etT szerkezeti képlete a 8. ábrán látható.
O
N N HO
O
O
O HO
32P
OH
O
8. ábra: O4-etiltimidin-3’-monofoszfát Ismert, hogy a dohány kis mennyiségben (< 25 ng/cigaretta) tartalmaz dietilnitrózamint (DEN) (IARC, 2004), de a dohányfüstben előforduló etiláló anyagokat még nem azonosították egyértelműen (Godschalk és mtsai., 2002b; Hecht, 2003). Dohányzók vizeletében N3-metiladenint (Kopplin és mtsai., 1995; Prevost és mtsai., 1996; Hecht,
21
1999), N3-etiladenint (Kopplin és mtsai., 1995) és lipid peroxidációből származó 1,N6etenoadenint és 3,N4-etenocitozint (Chen és mtsai., 2007) találtak. 2.4.2. TP53 tumorszupresszor gén mutáció vizsgálatok a tüdőrákkal összefüggésben A TP53 tumorszupresszor génnek gyakori a mutációja környezeti expozíció hatására kialakuló rosszindulatú daganatokban (Hussain és Harris, 1999; Hamroun és mtsai., 2006). A Nemzetközi Rákkutató Ügynökség adatbázisa szerint tüdőrák esetében a tumorszövetek 38%-ában találtak mutációt (9. ábra) (IARC TP53 DATABASE, 2008). A dohányzás emelkedett TP53 mutáció gyakoriságot okoz (Brennan és mtsai., 1995; Kondo és mtsai., 1996) és jellegzetes mutációs spektrum kialakulásával jár együtt (Hainaut és Pfeifer, 2001). A TP53 génmutáció az áttétképződési hajlamot is befolyásolhatja (Quinlan és mtsai., 1992; Chang és mtsai., 1999). Kutatások folynak a TP53 génmutációknak és génexpressziónak a daganatos betegség lefolyására és a túlélésre gyakorolt hatását illetően (Kondo és mtsai., 1996; Tomizawa és mtsai., 1999; Ahrendt és mtsai., 2003; Saffary és mtsai., 2005).
22
NYELŐCSŐ. PETEFÉSZEK. KOLOREKT.. FEJ-NYAK. PANKREÁSZ. TÜDŐ. BŐR. GYOMOR. HÓLYAG. AGY MÁJ. MELL.
Daganat típus
9. ábra: TP53 mutáció gyakoriság tumorokban (%) (IARC TP53 DATABASE, 2008) TP53
mutáció
vizsgálatra
a
Nemzetközi
Rákkutató
Ügynökség
(IARC)
a
génszekvenálás módszerét javasolja, de számos egyéb módszert is alkalmaznak (1. táblázat) (IARC TP53 DATABASE, 2008). 1. táblázat: TP53 génmutáció kimutatásra alkalmazott módszerek TP53 mutáció kimutatási módszerek Szekvenálás Pontmutáció elemzés „melting”, olvadási tulajdonságok alapján APEX mikroarray TTGE (Temporal Temperature Gradient Electrophoresis) SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) CDGE (Constant Denaturant Gel Electrophoresis) DGGE (Denaturing Gradiant Gel Electrophoresis) Genomiális DNS kódolás és szekvenálás DHPLC (Denaturing high pressure liquid chromatography) ddF (Dideoxy fingerprinting) FASAY (Yeast functional assay)
Módszer hivatkozás Russell, 2002. Garritano és mtsai., 2009 Le Calvez és mtsai., 2005a Sorlie és mtsai., 2005; Taniere és mtsai., 2001. Mazars és mtsai., 1991. Borresen és mtsai., 1991 Hamelin és mtsai., 1993 Baker és mtsai., 1990 Keller és mtsai., 2001; Gross és mtsai., 2001 Blaszyk és mtsai., 1995 Smardova és mtsai., 2005; Robert és mtsai., 2000
23
2.5. Kutatásaim hazai előzményei, DNS-addukt vizsgálatok Magyarországon az Országos Környezetegészségügyi Intézetben az 1980-as évek óta folytak a karcinogén DNS-addukt kutatások, kezdetben modellvegyületekkel in vitro modellben, később állatkísérletes modellekkel, majd összetett humán expozíciók kimutatására.
Kutatások folytak i) benz[a]pirénnel májmikroszómás aktiváló
rendszerben (Schoket és mtsai., 1989a); ii) PAH tartalmú összetett anyagokkal állatkísérletes rendszerekben (Schoket és mtsai., 1988; Schoket és mtsai , 1989b; Schoket és mtsai., 1990); iii) szövetkultúrán kátránytermékek metabolikus aktivációja során keletkezett DNS-adduktok vizsgálatára (Schoket és mtsai., 1990); iv) humán vérés szövetmintákból összetett PAH expozíció következtében képződő DNS-adduktok kimutathatóságának vizsgálatára (Phillips és mtsai., 1990; Schoket és mtsai., 1991; Schoket és mtsai., 1993a; Schoket és mtsai., 1999a; Schoket és mtsai., 1999b). Munkacsoportunk az Országos Tudományos Kutatási Alap (OTKA) pályázati projektje (T034616), a Tudomány és Technológia (TéT) Alap (SF-02/01 & SF-14/03), majd az utóbbi években az EU FP6-os ECNIS Network of Excellence (513943 NoE, 2005-2010) pályázati programok keretében folytatta a környezeti PAH expozíció biomarkereivel kapcsolatos kutatásait. Ez magában foglalta a dohányzással és a tüdőrákkal kapcsolatos többvégpontos molekuláris epidemiológiai kutatásainkat, melyekből számos nemzetközi publikáció született (Győrffy és mtsai., 2004; Anna és mtsai., 2009; Anna és mtsai., 2010; Anna és mtsai., 2011; Kovács és mtsai., 2011). Mindezen kívül átfogó szakirodalmi közleményekben rendszereztük a PAH és/vagy dohányzás eredetű expozícióval kapcsolatos biomarker vizsgálatok nemzetközi publikációit, és elemeztük a biomarkerek közötti korrelációkat (Győrffy és mtsai., 2006; Győrffy és mtsai., 2008; Gallo és mtsai., 2008). E kutatások aktív résztvevőjeként végeztem a jelen PhD disszertációm anyagát képező kutatásaimat 10 esztendőn keresztül.
24
3. Célkitűzés Többvégpontos molekuláris epidemiológiai kutatásaim célja a tüdőrák kialakulás molekuláris
hátterének
alkalmazásával
hazai
jobb
megismerése
tüdőrákos
expozíció-
betegpopulációban.
és
hatásbiomarkerek
Kutatásaim
alapjául
munkacsoportunk korábbi aromás DNS-addukt vizsgálatai szolgáltak dohányzási expozícióval összefüggésben. A 10. ábrán a dohányfüst rákkeltő hatásának vázlatos folyamatábrája látható, melybe bejelöltem az általam vizsgált biomarkerek helyét a folyamatban.
DNS-adduktok: DNS adduktok: Aromás AromásDNS-adduktok DNS adduktok DNS hiba4 4-etildimidin OO -etiltimidin javító gének
Metabolizmus gének Dohányzás
Karcinogén expozíció
Metabolizmus
DNS sérülés
Onkogének Tumor szuppresszor gének: gének: Tumorszupresszor TP53 TP53 gén gén Mutáció Progresszió
Rák Metasztázis gének
10. ábra: A dohányfüst rákkeltő hatásának vázlatos folyamatábrája Munkámat nemzetközi együttműködési projektek keretében kiterjesztettem egy alig ismert DNS-sérülés, az O4-etiltimidin vizsgálatára, hogy az vajon alkalmazható-e a dohányzás expozíciós biomarkereként. Munkám egyik célkitűzése tehát az expozíciós biomarkerek körének bővítése célszövetből, jelen munkában humán tüdőszövetből történő meghatározásra. Külön-külön, majd korrelációval elemeztem a két addukttípus expozíciófüggését és eliminációját arra keresve a választ, hogy vajon mennyire kapcsolódnak a kétféle DNS sérülés keletkezési és eliminációs folyamatai. Elsőként vizsgáltam magyar tüdőrákos betegpopulációban a TP53 gén mutáció gyakoriságot és
25
mutáció mintázatot a dohányzási státusszal és a szövettani típussal összefüggésben abból a célból, hogy összehasonlíthassuk a hazai jellemzőket a nemzetközi adatokkal, hogy vajon találunk-e lényeges eltérést. Kutatásaimnak nemzetközi szinten is kiemelkedő újdonsága, hogy humán vizsgálatban összefüggéseket kerestem a dohányzás eredetű aromás DNS-addukt mint elsődleges DNS sérülés és egyes specifikus TP53 tumorszupresszor gén mutáció típusok, mint lehetséges következmény között, hogy vajon humán szövetben kimutatható-e a korábbi kísérletes modellekből feltételezett ok-okozati kapcsolat.
26
4. Anyagok és módszerek 4.1. A vizsgálati populáció leírása A kutatásom során feldolgozott tüdőszövet minták az Országos Korányi TBC és Pulmonológiai Intézet Mellkassebészeti Osztályán (Budapest) tüdőrezekált 104 primér tüdőrákos
betegtől
makroszkóposan
ép
származtak. és
A
műtét
során
tumorszövet-mintavétel
eltávolított
történt,
majd
tüdőlebenyből a
szövetekből
továbbfeldolgozás céljából DNS-t izoláltunk. A vizsgálati populáció 37 laphámrák és 67 adenokarcinóma esetből, a két leggyakoribb nem kissejtes tüdőrák szövettani típusból állt. A nemek közti megoszlás 60% férfi (62 fő) és 40% nő (42 fő) volt. A vizsgálati populáció demográfiai leírása, dohányzási státus szerinti besorolása a 2. táblázatban látható.
27
2. táblázat: A vizsgált populáció demográfiai leírása Valaha dohányzóe
Összes eset n=104
Dohányzóf Dohányzást Aktív nemrégen (≤1év) dohányzóa abbahagyób n =38 n=25
Dohányzást régen (>1 év) Sohasem abbahagyóc dohányzó n=27 n=14
Nem, esetszám (%) Férfi Nő
62 (60) 42 (40)
22 (58) 16 (42)
15 (60) 10 (40)
20 (74) 7 (26)
5 (36) 9 (64)
Daganat típus, esetszám (%) Adenokarcinoma Laphámrák
67 (64) 37 (36)
22 (58) 16 (42)
16 (64) 9 (36)
15 (56) 12 (44)
14 (100) 0
Életkor, év Életkortartomány Átlag ± szórás (SD) Medián
35-79 58±9 58
42-72 56±8 56
35-78 56±10 57
45-79 61±3 60
48-76 59±9 58
2-135 4-60 40±25 35
15-135 12-60 40±21 35
2-120 4-50 40±30 32
3-105 7-60 40±25 35
-
24±12 20 5;3
23±8 20 1;0
22±11 20 2;2
28±15 23 2;1
-
5-60 32±11 30 21 (23) 35 (39) 30 (33) 3
15-52 34±9 35 5 (13) 17 (45) 14 (37) 1
8-60 32±14 30 7 (28) 8 (32) 10 (40) 0
5-42 28±9 30 9 (33) 10 (37) 6 (22) 2
-
Jellemző
Valaha dohányzóe (n=90) Dohányzási dózis Doboz-év, tartomány Cigaretta/nap, tartomány Átlag doboz-évg ± szórás Medián doboz- év Átlag cigaretta/nap ± szórás (SD) Medián cigaretta/nap NDd doboz-év; cigaretta/nap Dohányzási idő Évek száma, tartomány Átlag év ± szórás (SD) Medián év 5-20 év, esetszám (%) 21-35 év, esetszám (%) 36-60 év, esetszám (%) NDd a
Aktív dohányzó, aki a műtétig dohányzott. Dohányzást nemrégen abbahagyó, aki a műtétet megelőző egy éven belül nem dohányzott. c Dohányzást régen abbahagyó, akik a műtétet megelőzően több mint egy éve nem dohányozott. d ND, nem definiált esetek száma. e Valaha dohányzók: az aktív dohányzók, a dohányzást nemrégen abbahagyók és a dohányzást régen abbahagyók összevont csoportja. f Dohányzók: az aktív dohányzók és a dohányzást nemrég abbahagyók összevont csoportja. g Doboz-év, a napi dobozszám (20 cigaretta/doboz) és a dohányzott évek szorzata. b
28
A teljes mintahalmazban a szövettani típusok nemek szerinti megoszlása a következő volt: a férfiak 55%-a (34/62) adenokarcinómás, 45%-a (28/62) laphámrákos eset volt; a nők 79%-a (33/42) adenokarcinómás, 21%-a (9/42) laphámrákos eset volt. A vizsgálati mintahalmaz részben átfedésben volt egy korábban publikált munkánk vizsgálati anyagával (Győrffy és mtsai., 2004). A DNS minták kiválasztása egy kibővített nagyobb mintahalmazból történt, de csak a nevezett két fő szövettani típusból, és a DNS vizsgálatokhoz szükséges elegendő DNS mennyiség szerint. A kutatás az EU FP6 ECNIS (Environmental Cancer Risk, Nutrition and Individual Susceptibility; Network of Excellence operating within the European Union 6th Framework Program, Priority 5: ‘Food Quality and Safety’, Contract No 513943, 20052010), az OTKA (Országos Tudományos Kutatási Alap, T034616), és a magyar-finn TéT (Tudomány és Technológia Alap, SF-02/01, SF-14/03) pályázatok keretein belül történt. A kutatási program végrehajtását az Egészségügyi Tudományos Tanács Tudományos és Kutatásetikai Bizottsága (ETT-TUKEB) és az ECNIS projekt etikai bizottsága engedélyezte. A betegek dohányzási szokásairól egyéni kérdőíves adatfelvétel történt. A dohányzási kategóriákat munkacsoportunk korábbi DNS-addukt kutatásaival összhangban a következő szerint állítottuk fel: i) a műtétig dohányzók vagy másképpen aktív dohányzók; ii) olyan volt dohányzók, akik a műtétet megelőző egy éven belül hagyták abba a dohányzást (a dohányzást nemrégen abbahagyók) ; iii) olyan volt dohányzók, akik a műtétet megelőző több mint egy éve hagyták abba a dohányzást (a dohányzást régen abbahagyók); és iv) sohasem dohányzók (Győrffy és mtsai., 2004; Schoket és mtsai., 1998). A 104 beteg 37%-a (38/104) a műtétig dohányzó, aktív dohányzó volt; 24%-a (25/104) a műtétet megelőző egy éven belül hagyta abba a dohányzást. A betegek 26%-a (27/104) a műtétet megelőzően több mint egy éve hagyta abba a dohányzást; és a betegek 13%-a (14/104) sohasem dohányzott. A TP53 génmutáció vizsgálatok eredményeinek az elemzéséhez a dohányzási státusz szerint kialakítottunk egy összevont csoportot, amelybe az aktív dohányzókat és a dohányzást nemrégen abbahagyókat egyesítettük „dohányzók” elnevezéssel. A „valaha dohányzók” elnevezés magába foglal minden aktív és volt dohányzó személyt.
29
Majdnem mindegyik valaha dohányzó férfi legalább 20 szál cigarettát szívott el naponta (51/55; 93%), és a többségük több mint 20 évig dohányzott (51/55; 93%). A nők több mint fele a férfiakhoz hasonlóan legalább 1 doboz cigarettát szívott el naponta és legalább húsz éven keresztül dohányzott (21/32; 66%). A sohasem dohányzók csoportjában a nők többségben voltak (9/14; 64%). Az aromás DNS-adduktszint meghatározásokat és a TP53 génmutáció analíziseket a teljes mintahalmazon végeztük. Az O4-eT vizsgálatokhoz a teljes mintahalmazból 64 normál tüdőszövet DNS-t dolgoztuk fel. Az O4-etT méréshez felhasznált minták kiválasztásának szempontja az elegendő DNS mennyiség volt (>50 µg). Nem volt szignifikáns különbség a teljes mintahalmaz és az O4-eT vizsgálatokhoz használt rész mintahalmaz demográfiai összetétele között. 4.2. Mintakezelés a biomarker vizsgálatokhoz 4.2.1. Mintagyűjtés, szövet tárolás Rezekált tüdőlebenyből származó ép (100-500 mg) és tumor szövet (20-500 mg) minták kerültek feldolgozásra. A mintákat a kimetszés után legkésőbb két órán belül lefagyasztották és -80oC-on tárolták a DNS izolálásig. 4.2.2. DNS izolálás szövetből fenol–kloroform–izo-amilalkoholos extrakciós módszerrel A DNS izolálás fenol–kloroform–izo-amilalkoholos extrakciós módszerrel történt Schoket és munkatársai által alkalmazott módszer alapján (1990), kis módosításokkal a következők szerint. Szövethomogenizátum készült 500 µl (továbbiakban 1 térfogat egység) 10 mM etiléndiamin-tetraecetsav (EDTA) oldattal, amelyhez 0,1 térfogatnyi (50 µl) 10%-os nátrium-dodecil-szulfát (SDS) oldatot adtunk. Ezt követően a mintát 0,05 térfogatnyi (25 µl) 10 mg/ml-es proteináz K (SIGMA, P-6556) oldat hozzáadása után 1 órán át 37°C-on inkubáltuk. A minták pH-ját ~0,05 térfogatnyi (25 µl) 1 M Tris-HCl
30
pufferrel (pH 7,4) állítottuk be. Ezt követte a fenollal, fenol–kloroform–izoamilalkohollal (25:24:1), majd kloroform–izo-amilalkohollal (24:1) való extrakció, egymást követően 1-1 térfogategységgel (500-500 µl). A felülúszó vizes fázisból a nukleinsav kicsapása 0,1 térfogat (50 µl) 5,0 M NaCl és 1,5 térfogat (750 µl) 96%-os jéghideg etanol hozzáadásával, és egy éjszakán át tartó -20 °C-on való hűtéssel történt. A kicsapódott nukleinsavat lecentrifugáltuk (8100 g, 10 perc), az üledéket 70%-os etanollal mostuk. Az RNS nyomok eltávolításához a mintákat 300 µl 1 mM EDTA-ban oldottuk, a pH-t 50 mM Tris-HCl-lel (pH 7,4) beállítottuk, majd a mintákat 30 percig 37°C-on 10 µg/µl-es RNáz A (SIGMA, R-5500, St Louis, MO) és 50 U/µl-es RNáz T1 (SIGMA, R-1003, St Louis, MO) oldatokkal emésztettük. Végül kloroform - izoamilalkohollal (24:1) extraháltuk a mintákat. A DNS ismételt kicsapása a fent leírt módon történt. 4.2.3. DNS tárolás A DNS mintákat 2-6 évig tároltuk ~300 µl 1,5 mM nátriumklorid-0,15 mM nátrium citrátos oldatban (1/100 SSC oldat, pH 7,0) -100
o
C-on. Mintaszállításhoz a
mutációvizsgálatokhoz és az O4-etT mérésekhez a DNS mintákat vákuumcentrifugában szárazra pároltuk. A minták feldolgozási helyre való szállítása 1-2 nap alatt történt környezeti hőmérsékleten. A szállítást követően a mintákat -80oC-on vagy -100°C-on tároltuk a további feldogozásig (Anna és mtsai., 2011). 4.3. Aromás DNS-addukt meghatározás 32P-utójelöléses módszerrel Az
aromás
tüdőszövetből
DNS-adduktszintek (104),
illetve
meghatározása
tumorszövetből
makroszkóposan ép (57)
izolált
perifériás
genomiális
DNS
felhasználásával történt 32P-utójelöléses módszerrel (Győrffy és mtsai., 2004). A DNS-t (4 µg) egy éjszakán át emésztettük 290 mU micrococcus nukleáz (Sigma, St Louis, MO) és 1,2 mU lép foszfodiészteráz (ICN and MP Biomedicals, Irvine, CA) enzimekkel 3’- mononukleotidokra. Az adduktdúsítás céljából a normál mononukleotidokat a 3’ helyen defoszforiláltuk 0,12 U/minta nukleáz P1 enzimmel (Sigma, St. Louis, USA). A mintákhoz a radioizotópos jelölés céljából 50 µCi hordozó mentes [γ-32P]ATP-t (ICN és
31
MP Biomedicals) és 6 U T4 polinukleotid kinázt (USB Corporation, Cleveland, OH és Fermentáz, Vilnius, Litvánia) adtunk. Egymást követő, más-más irányú vékonyréteg kromatográfiás futtatással történt a reakcióelegy tisztítása és a radioaktívan jelzett DNSadduktok szétválasztása 10 × 10 cm-es poli(etilénimin)cellulóz vékonyréteg lemezen (Macherey-Nagel, Düren, Németország). A kromatográfiás futtatáshoz használt pufferek összetétele a D1-D4 futtatási irányokban a következők voltak: D1, 1 M nátrium-dihidrogénfoszfát, pH 6,0; D2, 3,5 M lítium formiát, 8,5 M urea, pH 3,5; D3, 0,8 M lítium klorid, 0,5 M Tris, 8,5 M urea, pH 8,0; D4, 1,7 M nátriumdihidrogénfoszfát, pH 6,0. A radioaktivitás-mérés elektronikus autoradiográfiával történt (InstantImager, Packard). Az adduktszintek számításához a kromatográfiás képen a mintára jellemző diffúz diagonális sáv és körülhatárolt foltok beütésszám értékeit területarányosan korrigáltuk a a kromatogram háttér-radioaktivitásának értékével. A DNS-adduktszinteket az ismert módosítási fokú benz[a]pirén diol-epoxid-DNS külső standard (111 addukt/108 nukleotid) radioaktivitás értékére vonatkoztatva számoltuk ún. normalizálással (Phillips és Castegnaro, 1999; Kovács és mtsai., 2011). Kettő-négy mérés készült minden egyes DNS mintából, időben független jelölések alkalmával. A 11. ábrán a
32
P-utójelölés
módszer folyamatábrája, a 12. ábrán a vékonyrétegkromatográfia sémája látható.
32
DNS micrococcus nukleáz lép foszfodieszteráz
Np + Xp + Yp + ... nukleáz P1
N + Xp +Yp + ... [γ - 32P]ATP T4 polinukleotid kináz
*pXp + *pYp + ... Vékonyrétegkromatográfia, autoradiográfia 32P-jelzett
DNS adduktok „térképe”
11. ábra: 32P-utójelölés folyamatábrája. Np = normál 3’-mononukleotid; Xp, Yp= adduktot hordozó 3’-mononukleotid; N, normál mononukleozid; *p, 5’-32P-foszfát.
D4 D3
10 cm
10 cm D2
Start pont D1
12. ábra: A vékonyrétegkromatográfiás futtatások irányai
33
4.4. O4-etiltimidin meghatározás 32P-HPLC módszerrel Az O4-etT szint meghatározást immunkémiai adduktdúsítást követő
32
P-utójelöléses
módszerrel, majd HPLC-n történő szétválasztással és radioaktivitás detektálással végeztük Godschalk és munkatársai által kidolgozott módszer alapján (2002a; 2002b). Az O4-etT meghatározás első lépése 25 µg DNS emésztése 3’-monofoszfátnukleozidokra 12 µl micrococcus nukleáz (0,2 unit/µl, Sigma–Aldrich, Heidelberg, Németország) és 10 µl lép foszfodiészteráz (0,025 unit/µl, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ) enzimmel 37°C-on 4 órán át. Ezt követte az etilált timint tartalmazó mononukleotid adduktok elválasztása a normál mononukleotidoktól. Az immunkémiai elválasztás során az O4-etT-3’P nukleotidokat specifikus monoklonális antitesttel (forrás: Dr. P. Lorenz, Uni-Klinikum, University of Essen, Németország) kötöttük meg oly módon, hogy 50 µl immun pufferrel (10 mM pH 7,5 Tris-HCl, 140 mM NaCl, 3 mM NaN3, 1% borjú szérum albumin (BSA), és 0,1% nyúl IgG) és 50 µl (65 µg/µl) tisztított monoklonális antitesttel 1 óra hosszat állandó kevertetés mellett inkubáltuk. Ezt követően az antitest-antigén komplexet telített ammóniumszulfáttal (1300 µl/minta) 30 perces jégbe helyezéssel kicsaptuk, az üledéket lecentrifugáltuk (8100 g, 10 perc), majd 400 µl vízben feloldottuk. A kicsapás után a felülúszóból a normál nukleotidok mennyiségét HPLC-UV módszerrel meghatároztuk az O4-etT mennyiség vonatkoztatási alapjának (O4-etT/108 timidin) kiszámításához. Az adduktot tartalmazó vizes oldatot mikrokon filteres centrifugacsövön (MY-50, molekula szűrés 50.000 Da, Millipore, Bedford, MA) centrifugálással (4°C, 8100 g, 20 perc) átszűrtük. A filtert 5-ször mostuk vízzel (450 µl/mosás), és a felül maradt terméket a filter lefordításával és gyors centrifugálásával (8100 g, 5 perc) gyűjtöttük össze. Az adduktmérést zavaró fehérjét 2x500 µl -20°C-os 70%-os etanollal kicsaptuk és az üledéket lecentrifugáltuk (8100 g, 5 perc). A tisztított a mintákat vákumcentrifugán szárazra pároltuk. Az eljárás következő lépése az O4-etT-3’-monofoszfát és a hozzáadott belső standard, az 1,N6-etenodezoxiadenozin 3’-monofoszfát (0,8 fmol/minta) 32P-foszforilálása volt az 5’ helyen 2 µl (20 μCi) [γ-32P]ATP-vel (>5000 Ci/mM, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Németország), majd defoszforilálása a 3’ helyen 20 U T4 34
polinukleodid kináz (Fermentas, St Leon-Rot, Németország) közvetítésével 6,8-es pHn. A feleslegben lévő [γ-32P]ATP-ot 5 mg polietilénimint (PEI) (J.T. Backer Inc., Phillisburg, NJ) tartalmazó minioszlopon átfuttatva távolítottuk el. A tisztított terméket fordított fázisú HPLC-n (model 1090 Hewlett-Packard, Walsbronn, Németország) (C18-HPLC oszlop, Bishoff Part NC-04, 240x4,0 mm) gradiens elúcióval választottuk szét metanol tartalmú 100 mM-os ammóniumformiáttal (0-12 perc 5% metanol, 12-20 perc 20% metanol, 20-30 perc 50% metanol, 30-50 perc 5% metanol). A kimutatás HPLC-vel kapcsolt radioaktivitásmérő detektorral történt (cell-model Z200-4). A módszer kimutatási határa 0,01 O4-etT/108 timidin 25 µg DNS mintából. 4.5. TP53 génmutáció vizsgálati módszerek A TP53 mutáció elemzéseket az 5-9 és a 11-es exonokon végeztük el. A TP53 génszakasz sokszorozása a DNS-ből polimeráz láncreakció (PCR) technikával történt (Holmila és mtsai., 2006), a TP53 mutációkra a minták előszűrését denaturáló gradiens gélelektroforézis (DGGE) és automatizált egyszál konformáció polimorfizmus vizsgálat (CE-SSCP) módszerrel végeztük (Holmila és mtsai., 2006). A mutációkat közvetlen szekvenálással azonosítottuk.
4.5.1. PCR A PCR-rel történő DNS szakasz sokszorozásához 20 ng genomiális DNS-t használtunk 50 µl reakció elegyben. A reakció elegyben mind a négy dNTP (Pharma Biotech, Espoo, Finnország) koncentrációja 22,5 µM volt; az 5’ és a 3’ primerek (Sigma Genosys, The Woodlands, TX) koncentrációja 1 µM; a HotStarTaq enzimet (Qiagen, Valencia, CA ) 0,0125 U/µl koncentrációban alkalmaztuk 1×Qiagen pufferben (Holmila és mtsai., 2006). A DDGE eljárás során a DNS sokszorozáshoz minden primerből egy 40 bp (5-9 exon), illetve egy 21 bp (11-es exon) hosszú GC bázispárban gazdag kiterjesztést („GC-klamp”) kapcsoltunk (Holmila és mtsai., 2006). A CE-SSCP módszerhez mindkét primer az 5’ helyen fluoreszcens festékkel (6-carboxyfluorescein, 6-FAM, és 4,7,2’,4’,5’,7’-hexachlo-6-carboxyfluorescein, HEX) (Sigma Genosys, The Woodlands, TX) volt jelölve. A PCR primerek szekvenciája a 3. táblázatban található
35
(Holmila és mtsai., 2006). A PCR reakciót (Applied Biosystems termocycler, Foster City, CA) 35 ciklusban végeztük, a következő paraméterek mellett: kettős szálú DNS denaturáció 94 °C 30 s, primer hibridizálás 55-60 °C 30 s, és DNS szintézis 74 °C 1 perc (Holmila és mtsai., 2006).
36
3. táblázat: A TP53 mutáció vizsgálatokhoz használt PCR primer szekvenciák 5-ös exon
„forward” primer
6-os exon
„reverse” primer „forward” primer
7-es exon
„reverse” primer „forward” primer
8-as exon
„reverse” primer „forward” primer „reverse” primer
9-es exon
„forward” primer „reverse” primer
5-ös exon
„forward” primer „reverse” primer „forward” primer „reverse” primer „forward” primer „reverse” primer „forward” primer „reverse” primer „forward” primer „reverse” primer
6-os exon 7-es exon 8-as exon 9-es exon 5-ös exon 6-os exon 7-es exon 8-as exon 9-es exon
„forward” primer „reverse” primer „forward” primer „reverse” primer „forward” primer „reverse” primer „forward” primer „reverse” primer „forward” primer „reverse” primer
„forward” primer „reverse” primer (21 bp „GC clamp”-pel a DGGE-hez)
DGGE 5'- CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC GTT CCT TCT CCT ACA GTA CTC-3' 5'- CTG GGC AAC CAG CCC TGT CGT-3' 5'- CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC GCA CTG ATT GCT CTT AGG TCT-3' 5'- AGT TGC AAA CCA GAC CTC AG-3' 5'-GCG GGC GGC GGC GCG GCG GGC GGG CGG GCG GGC GGG GCG GAG GTC TCC CCA AGG CGC ACT-3' 5'- GAG GCT GGG GCA CAG CAG GC-3' 5'- GGA CCT GAT TTC CTT ACT GC-3' 5'-GCC GCC CGC CGC CGC CCG CCC GCG CCG CCG CCG CCG CCG CCA TAA CTG CAC CCT TGG TC-3' 5'- ACC TTT CCT TGC CTC TTT-3' 5'- GCG CCC GCC GCG CCC CGC GCC CGG CCC GCC GCC CCC GCC CGT GAT AAG AGG TCC CAA GA-3' CE-SSCP 5'-CTGTTCACTTGTGCCCTGAC-3' 5'-AACCAGCCCTGTCGTCTCTC-3' 5'-CCCAGGCCTCTGATTCCTCA-3' 5'-GGCCACTGACAACCACCCTT-3' 5'-GCGCACTGGCCTCATCTTGG-3' 5'-AGTGTGCAGGGTGGCAAGTG-3' 5'-GGACCTGATTTCCTTACTGC-3' 5'-ATAACTGCACCCTTGGTCTC-3' 5'-GCAGTTATGCCTCAGATTCA-3' 5'-TTTCCACTTGATAAGAGGTC-3' Szekvenálás 5'-TTGCTTTATCTGTTCACTTGTGCCCTGACT-3' 5'-CAGAGGCCTGGGGACCCTGGGCAACCAGCC-3' 5'-GACGACAGGGCTGGTTGCCCAGGGTCCCCA-3' 5'-GAGGGCCACTGACAACCACCCTTAACCCCT-3' 5'-TGCTTGCCACAGGTCTCCCCAAGGCGCACT-3' 5'-GCGGCAAGCAGAGGCTGGGGCACAGCAGGC-3' 5'-GGGACAGGTAGGACCTGATTTCCTTACTGC-3' 5'-TGAATCTGAGGCATAACTGCACCCTTGGTC-3' 5'-GACCAAGGGTGCAGTTATGCCTCAGATTCA-3' 5'-GGCATTTTGAGTGTTAGACTGGAAACTTTC-3' 11-exon minden módszernél 5’-CTC-CCT-GAT-TAT-GTC-TCC-3’ 5’-CGC-CCG-CCG-CGC-CCC-GCG-CCC-GTC-CCG-CCG-CCCCCG-CCC-GTC-AGT-GGG-GAA-CAA-GAA-G-3’
4.5.2. Denaturáló Gradiens Gélelektroforézis (DGGE) A mintákat növekvő sűrűségű poliakrilamid gélen futtattuk 1×TAE (Tris-Acetát-EDTA) pufferben 60˚C-on (DCode Universal Mutation Detection System Apparatus, Bio-Rad, Hercules, CA) Holmila és munkatársai módszere szerint (2006). Egy mm vastag
37
gradiens gélt készítettünk 7% akrilamid (Bio-Rad, Hercules, CA) és 0,3% biszakrilamid (Bio-Rad, Hercules, CA) tartalmú 1×TAE pufferrel. Formamid (Merck, Darmstadt, Németország) és urea (Merck) felhasználásával készült különböző koncentrációkban a denaturáló ágens, ahol a 100%-os denaturációt 9 M formamid és 7 M urea elegyével értük el. A gél polimerizációját ammónium perszulfáttal (Bio-Rad) és TEMED-del (N,N,N’,N’-tetramethylenediamide) (Bio-Rad) aktiváltuk. A mintákat perpendikuláris (függőleges elrendezésű) gélen futtattuk 1× TAE pufferrel 60°C-on DCode Univerzális Mutation Detection System Apparatus-on (Bio-Rad). Az elektroforézis ideje 4 óra volt 150 V elektroforézis feszültséggel. A génterméket etídium-bromiddal (Aldrich-Chemie, Steinheim, Németország) jelöltük és UV fény átvilágítással detektáltuk (Stratagene Eagle Eye II). A 13. ábra a DGGE elválasztástechnikai módszer elvét mutatja. A Normál és mutáns
B csak normál
Mintafelvitel
Hetero duplexek Futási irány, növekvő gél sűrűség Mutáns Homo duplexek Vad típus
13. ábra: A DGGE elválasztástechnikai-módszer elve. Az ábrán vad típusú (normál) és mutáns DNS-t is tartalmazó minta PCR reakciójából keletkezett 4-féle termék (A oszlop); és csak vad típusú (normál) DNS minta PCR reakciójából nyert termék (B oszlop) DDGE futattással nyert képe látható. (Szaggatott vonallal jelölve a mutációt hordozó DNS szál, folyamatos vonallal jelölve a vad típusú (normál) DNS szál). A vizsgált DNS minta, amely mutációt is hordozó DNS-t is tartalmaz, a PCR reakció után négy sávval jelenik meg a gélen, mivel a PCR reakció során mutáns-mutáns,
38
mutáns-vad, vad-mutáns és vad-vad DNS szálak duplexet alkotnak. A vad típusú, normál minta (homoduplexe két egyenes vonal) egy bizonyos pozícióban denaturálódik, a minta egy sávval jelenik meg. A két heteroduplex a lassabb futási sebesség miatt mindig a homoduplexek olvadás pontja alatt fekszik. A mutáns homoduplex a vad, normál típusú homoduplex alatt vagy felett fekszik. Az elektroforézis során a kétszálú DNS fragmentek végeit a primerekben található guanin-citozin bázispárokat tartalmazó szakasz tartja össze (ábrán rövid vastag vonallal jelzett szakaszok). A 14. ábrán a TP53 gén 8-as exonjának DGGE-vel végzett mutáció előszűrésére láthatunk egy példát. A vad típusú minta egy sávval jelenik meg. Minden mutációt hordozó minta elvileg négy sávval jelenik meg, ezek a vad típusú és a mutációt hordozó fragmentek homoduplexei és heteroduplexei (2-2 csík). A mutációt hordozó minták PCR termékeként keletkezett duplexek hasonló denaturációs és futási jellemzői miatt viszont előfordulhat, hogy egy mutációt hordozó minta nem négy, hanem csak három sávval jelenik meg a gélen.
m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 m11 vak K+ 30%
wt ►
urea – formamid
60%
14. ábra: Denaturáló gradiens gélelektroforézissel nyert kép a génmutációk előszűrésére. A denaturáló gél sűrűsége a nyíl irányába növekszik 30 %-ról 60 %-ra. A „K+” a pozitív kontroll mintát, az „m1”-„m11” az elemzett mintákat, a „wt” a vad típusú, mutációt nem hordozó minták sávját jelöli. Az 60% „m8” és „m11” minták hordoznak mutációt.
39
4.5.3. CE-SSCP - Automatizált egyszálkonformáció polimorfizmus vizsgálat A PCR-rel történt sokszorozás után a mintákat 1:20 arányban kétszer desztillált vízzel higítottuk. A higított mintaoldatból 1 µl mennyiséget 10,5 μl deionizált formamiddal, 0,5 μl NaOH-dal (0,3 M) és az elúció vizsgálat vonatkozási pontjaként használt 0,5 μl GeneScan 350 TAMRA méret-standarddal (Applied Biosystems) kevertünk össze. A mintákat 95 °C-on 5 percig denaturáltuk, majd a denaturált DNS szálakat azonnali hűtéssel, a reakció csövek jégfürdőbe mártásával stabilizáltuk. A CE-SSCP elemzést ABI PRISM 310 kapilláris szekvenálón (Applied Biosystems, Foster City, CA), illetve ABI PRISM 3100 Avant kapilláris szekvenálón végeztük (Applied Biosystems, Foster City, CA) különböző elemzési hőmérsékeleten (18, 25, 30, 35 és 40°C-on). Az elektroforézis 30 percig tartott mintánként, 13 kV feszültség mellett. A kapillárisban a mintavivő anyag: 1× Tris-Borate-EDTA (TBE) pufferben 10% glicerin, 5% GeneScan Polymer (Applied Biosystem). Az elektroforézis mosó puffere: 1× TBE 10%-os glicerines oldata. A 15. ábrán egy minta TP53 génje 7-es exonjának mutáció előszűrésére szolgáló CE-SSCP elektroferogram látható.
Exon 7
18°C
30 oC
40 oC
Vad
A
B
15. ábra: Egy tipikus CE-SSCP elektroferogram képe. Az „A” minta, melynél a csúcsok helye egyezik a „vad”, referencia minta csúcsaival, nem hordoz mutációt. A „B” minta hordoz mutációt. A mutációval rendelkező szekvenciák okozta csúcsokat nyilak jelölik.
40
4.5.4. Közvetlen szekvenálás A DGGE
és/vagy CE-SSCP
módszerrel kimutatott
mutációk génen belüli
elhelyezkedését és típusát közvetlen szekvenálással határoztuk meg ABI PRISM 310 kapilláris szekvenáló készüléken (Applied Biosystems). A TP53 génszakaszt PCR technikával a korábbiakben leírt módon sokszoroztuk, majd a PCR terméket QIAquick PCR purification Kit-tel (Qiagen, Hilden, Németország) tisztítottuk. A szekvenáláshoz szükséges PCR reakcióelegy a BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) leírása alapján készült. A PCR reakciót 30 ismétlődő ciklusban végeztük, a következő paraméterekkel: kettős szálú DNS denaturáció 95 °C 30 s, primer hibridizálás 50 °C 5 perc, és DNS szintézis 60 °C 4 perc. Amikor a mutációkat nem tudtuk szekvenálással azonosítani, a mutációt tartalmazó mintákat DGGE módszerrel újra kezeltük, a mutáns allélt kivágtuk a gélből, és 0,5 ml desztillált vizet adtuk hozzá. A mintákat ezután egy éjszakán át szobahőmérsékleten tartottuk. Az oldatból 2 µl mennyiséget 10 µl PCR reakció elegyhez adtuk, majd ismételt szekvenálást végeztünk. A TP53 polimorfizmusoknak a mutációktól való megkülönböztetése a tumor és a normál szövetminta párok TP53 szekvenciájának összehasonlításával történt. A mutáció elemzéseket a Finn Munkaegészségügyi Intézetben (Finnish Institute of Occupational Health), Helsinkiben végeztük. A 16. ábrán egy minta 5-ös exonjának szekvencia képe látható.
16. ábra: Egy minta 5-ös exonjának szekvenciaképe. A nyíl A→ G báziscserét jelez.
41
4.6. Alkalmazott statisztikai módszerek A statisztikai elemzéseket a GraphPad Prism 4.0 program (©1992-2005 GraphPad Software, Inc.) alkalmazásával Fisher egzakt teszttel, Mann-Whitney U-teszttel és Spearman korreláció teszttel végeztük. Kétoldali P értékeket közlünk, ahol a statisztikai szignifikancia feltétele: P ≤ 0,05 volt.
42
5. Eredmények A teljes vizsgálat populációban meghatároztuk az aromás DNS-adduktszinteket a makroszkóposan ép szövetmintákban a dohányzási kategóriák és az elszívott cigaretták számának a függvényében. Egy részpopulációban elemeztük az O 4-etT szinteket ugyancsak a makroszkóposan ép szövetben a dohányzási státus, dohányzási dózis, illetve a volt dohányzóknál a dohányzás abbahagyása óta eltelt idő függvényében. Dohányzási kategóriánként összevetettük az O4-etT szinteket az aromás DNSadduktszintekkel, és vizsgáltuk a két biomarker közötti korrelációt (Anna és mtsai., 2011).
Részletesen
tanulmányoztuk
a
TP53
mutációk
jellegzetességeit
a
tumormintákban a teljes vizsgálati anyagban. Összefüggéseket kerestünk a TP53 génmutációk előfordulása és típusa és az aromás DNS-adduktszintek nagysága között (Anna és mtsai., 2009). 5.1. DNS-addukt vizsgálati eredmények 5.1.1. Aromás DNS-adduktszintek a dohányzási státus függvényében Dohányzók DNS mintáiból az aromás DNS-adduktok kimutatására szolgáló
32
P-
utójelöléses módszerrel az autoradiográfiás képeken tipikus diffúz diagonális radioaktív sáv jelenik meg egy-egy jól körülhatárolt folttal. A régóta nem dohányzók és a sohasem dohányzók adduktképein a diagonális sáv radioaktivitása általában gyengébb, mint a dohányzóknál. Nem volt nyilvánvaló különbség az autoradiográfiás képekben a tumoros és ép tüdőszövet között, bár a radioaktivitás intenzitása általában alacsonyabb volt a tumorszövetben, mint az ép szövetben. A tumoros és az ép tüdőszövetből mért adduktszintek között közepes erősségű, szoros pozitív korreláció volt (r=0,65, P<0,0001, n=57) (Győrffy és mtsai., 2004). A kétdimenziós adduktmintázat adduktösszetételét nem ismerjük. A 17. ábra
32
P-utójelöléses módszerrel nyert
autoradiográfiás DNS-addukt képeket mutat be tumor és ép perifériás tüdőszövet mintákból, a 18. ábrán ép perifériás tüdőszövet minták tipikus autoradiográfiás képei láthatók különböző dohányzási kategóriába tartozó esetektől.
43
d
c
17. ábra: 32P-utójelöléses módszerrel nyert autoradiográfiás képek tumor (a,c) és ép tüdőszövet (b,d) mintapárból, két aktív dohányzó személynél (a és b egyik személy, c és d másik személy (Győrffy és mtsai., 2004). a
b
c
e
g
d
f
h
18. ábra: 32P-utójelöléses módszerrel nyert tipikus autoradiográfiás képek ép tüdőszövetből különböző dohányzási kategóriákban. Két-két sohasem dohányzó (a és b), aktív dohányzó (c és d), a dohányzást nemrégen abbahagyó (e és f), és a dohányzást régen abbahagyó (g és h) (Schoket és mtsai, 1998). A teljes vizsgálati anyagban (n=104) az aromás DNS-adduktszintek nagy egyedi eltérésekkel tág határok között, 0,5-24,3 aromás DNS-addukt /108 nukleotid értékek
44
között fordultak elő. Nem volt statisztikailag szignifikáns különbség az aktív dohányzók és a dohányzást nemrégen abbahagyók között, valamint a dohányzást régen abbahagyók és a sohasem dohányzók adduktszintje között. A dohányzóknak (n=63) megközelítőleg kétszer magasabb átlagos aromás DNS-adduktszintje volt, mint a dohányzást régen abbahagyók és a sohasem dohányzók (n=41) összevont csoportjának. A két fő csoport átlagos adduktszintje Mann-Whitney U-teszttel számolva: 10,9 ± 6,5 ill. 5,5 ± 3,4 addukt /108 nukleotid (átlag±SD). A különbség az összevont csoportok között statisztikailag szignifikáns volt (P<0,0001) (4. táblázat). 4. táblázat: Aromás DNS-adduktszintek dohányzási kategóriák szerint a teljes mintahalmazban (n=104); a négy dohányzási kategória szerint, és két-két összevont dohányzási kategória szerint. Aromás DNS-addukszintek
Minimum
Medán
Maximum
Átlag±Szórás (SD)
Aktív dohányzó (38)
2,7
9,9
24,3
11,7±7,0
Dohányzást nemrég abbahagyó (25)
1,6
8,1
21,1
9,7±5,4
Dohányzást régen abbahagyó (27)
0,5
5,7
16,5
5,9±3,4
Sohasem dohányzó (14)
0,8
4,9
9,4
4,9±3,3
Dohányzó (63)
1,6
8,1
24,3
10,9±6,5
Dohányzást régen abbahagyó és a
0,5
5,6
16,5
5,5±3,4
sohasem dohányzó (41)
45
A teljes mintahalmazban vizsgáltuk az aktív dohányzók (n=38) aromás DNSadduktszintjeit a napi dohányzási dózis és a kumulatív dohányzási dózis (Doboz-év, a napi dobozszám (20 cigaretta/doboz) és a dohányzott évek szorzata) függvényében (19. ábra). Nem volt statisztikailag szignifikáns összefüggés sem az aromás DNSadduktszintek és a napi cigarettaszám között, sem az aromás DNS-adduktszintek és a kumulatív dohányzási dózis között. Adott dohányzási dózisoknál az egyének közötti aromás DNS-adduktszint különbségek (legmagasabb, ill. legalacsonyabb) széles sávban szórtak. A 20 cigaretta/nap esetében például a legnagyobb és a legkisebb adduktszint
A Aromás DNS addukt/10 8 nukleotid
Aromás DNS addukt/10 8 nukleotid
között 6-szoros különbség, a 30 doboz-évnél 3,5-szeres különbség volt.
25 20 15 10 5
B 25 20 15 10 5 0
0 0
10
20
30
40
50
60
70
Cigaretta/nap, aktív dohányzók, n=38
0
25
50
75
100
125
150
Doboz-év, aktív dohányzók, n=38
19. ábra: Egyedi aromás DNS-adduktszintek aktív dohányzóknál a napi cigarettaszám (A), illetve a kumulatív dohányzási dózis (B) szerint (Anna és mtsai., 2011).
46
5.1.2. O4-etT szintek a dohányzási státus függvényében Az O4-etT szintek meghatározását belső standard módszerrel végeztük. Az alkalmazott HPLC mérési paraméterek mellett a belső standard elúciós ideje 19 perc, az O4-etT-5’32
P-monofoszfát elúciós ideje 23 perc volt átlagosan. A 20. ábra a normál nukleotidok
HPLC-UV módszerrel nyert képét mutatja be. A 21. ábrán egy radioaktív-sugárzás mérő detektorral kapcsolt HPLC kromatogram látható, ahol a nyilak a belső standard illetve az O4-etiltimidin csúcsát mutatják.
C
G
T
A
UV (mAU)
Idő (perc) 20. ábra : A normál nukleotidok HPLC-vel történő elválasztásakor keletkező nukleotid csúcsok kromatográfiás képe
Radioaktivitás (cpm)
Idő (perc) 4 21. ábra: A belső standard (zöld nyíl) és az O -etiltimidin (kék nyíl) csúcsait ábrázoló HPLC kromatogram Az O4-etT DNS-adduktszintek 0,01-3,91 O4-etT /108 timidin között voltak (n=64). Az aktív dohányzók O4-etT szintjeit a napi cigaretta szám és a doboz-év mint kumulatív dózis függvényében a 22. ábra mutatja. Nem volt nyilvánvaló addukt–dózis összefüggés 47
sem a napi cigarettaszámmal, sem a kumulatív dohányzási dózissal. Adott dohányzási dózisoknál az egyének közötti O4-etT érték különbségek (legmagasabb, ill. legalacsonyabb) széles sávban szórnak. A 20 cigaretta/nap esetében például a legnagyobb és a legkisebb adduktszint között 14-szeres különbség, 30 doboz-évnél 6szoros különbség volt.
Kumulatív dózis
A 2.5
2.0
2.0
O4-etT/108 Timidin
O4-etT/108 Thimidin
Napi dózis 2.5
1.5 1.0
B
1.5 1.0
0.5 Ábra 0.5 ….: Az egyedi O4-etT szintek aktív dohányzóknál a napi cigerettaszám (A) és a
kumulativ dózis (B) függvényében. 0.0 0
10
20
30
40
0.0 0
10
20
4
30
40
50
60
Doboz év
Cigaretta/nap A nulla dohányzási dózis a sohasem dohányzók (n=9) O -etT értékeit mutatja..
22. ábra: O4-etT szintek a napi cigarettaszám (A) illetve doboz-év (B) szerint (Anna és mtsai., 2011) Az O4-etT szintek dohányzási kategóriánként a 23. ábrán láthatóak. Nem volt statisztikailag szignifikáns különbség az aktív dohányzók és a dohányzást nemrég abbahagyók, illetve a dohányzást régen abbahagyók és a sohasem dohányzók adduktszintje között. Az aktív dohányzók és a dohányzást nemrég abbahagyók összevont csoportjának átlagos addukt szintje 1,7-szer magasabb volt, mint a dohányzást régen abbahagyók és a sohasem dohányzók összevont csoportjának átlagos adduktszintje (Mann-Whitney U-teszttel számolva az átlag ± SD: 0,78 ± 0,76 ill. 0,45 ± 0,44 O4-etT/108 timidin, P=0,015).
48
5.1.3. O4-etT és aromás adduktok közötti összefüggések A 23. ábrán O4-etT és az aromás DNS-adduktszintek összehasonlítása látható a dohányzási státusok függvényében ugyanazon mintahalmazban. B
A 4.0
do em Aromás DNS addukt/10 8 nukleotid há ré ny g ab zó ba (2 ha 0) D g oh yó -t (1 ré 7) g ab So ba ha ha se gy m ó do (1 há 8) ny zó (9 )
25
O4-etT/10 8 Timidin
3.5
20
3.0 2.5
15
2.0 1.5
10
1.0
5
0.5
oh
-t n
A kt ív
0
D
D
oh -t
A
kt ne ív do m há ré g ny ab zó ba (2 h 0) D ag oh y ó -t (1 ré 7) g a So bb ha ah se ag m y do ó ( 18 há ) ny zó (9 )
0.0
23. ábra: O4-etT (A) és aromás DNS-addukt (B) szintek az egyes dohányzási kategóriákban, ép tüdőszövetben. A doboz–„bajusz” (boxplot) eloszlási diagramokon a mintahalmaz egyedi adduktértékeinek négy negyedben való eloszlása látható. A doboz közepén lévő vízszintes vonal a medián, a függőleges „bajuszok” a legkisebb, illetve a legnagyobb értékig húzódnak (Anna és mtsai., 2011). Mind az O4-etT szintek, mind az aromás DNS-adduktszintek statisztikailag szignifikánsan magasabbak voltak az aktív dohányzóknál és a dohányzást nemrég abbahagyóknál, mint a dohányzást régen abbahagyóknál és a sohasem dohányzóknál. Az aktív dohányzók és a dohányzást nemrég abbahagyók összevont csoportja, illetve a dohányzást régen abbahagyók és a sohasem dohányzók összevont csoportja közötti különbség szignifikancia értéke az O4-etT-re 0,015, az aromás DNS-adduktokra <0,0001 volt. Nem volt statisztikailag szignifikáns korreláció az O 4-etT és az aromás DNS-addukt adatpárok között sem összességében (Spearman korreláció: r=0,16; P=0,19; n=64), sem külön-külön az egyes dohányzási alcsoportokban.
49
A 24. ábra az O4-etT és az aromás DNS-adduktok perzisztenciáját mutatja be a dohányzást abbahagyóknál a dohányzásmentes évek függvényében. 4.0
A Aromás DNS addukt/108 nukleotid
O4-etT/108 Timidin
3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
B
25
20
15
10
5
0
0.0 0
5
10
15
20
25
30
35
Dohányzás abbahagyásától számított évek
0
5
10
15
20
25
30
35
Dohányzás abbahagyásától számított évek
24. ábra: Adduktszint változás volt dohányzóknál a dohányzás abbahagyásától eltelt idő függvényében. O4-etT (A) és az aromás DNS-addukt (B). A nulladik évnél az aktív dohányzók (n=29) adduktszintjei mint vonatkoztatási alap láthatók. A szaggatott vonal a sohasem dohányzók átlagos adduktszintjét jelzi (0,32 O4etT/108 timidin, illetve 5,5 aromás DNS-addukt/108 nukleotid) (Anna és mtsai., 2011). A dohányzást régen abbahagyók 33%-ának (6 fő a 18-ból) magasabb O4-etT adduktszintje volt, mint a sohasem dohányzók átlagos adduktszintjének kétszerese. A különbség a dohányzást régen abbahagyók és a sohasem dohányzók átlagos adduktszintje között 1,59-szeres volt (0,51, ill. 0,32 O4-etT/108 timidin). Az aromás DNS-adduktszinteket
vizsgálva
azt
találtuk,
hogy a dohányzás
abbahagyásától eltelt idő hosszabbodásával csökkentek az aromás DNS-adduktszintek (24. ábra). A dohányzást régen abbahagyók és a sohasem dohányzók átlagos adduktszintje közel azonos volt (5,3±2,4 ill. 5,5±1,0 aromás DNS-addukt/108 nukleotid, a különbség nem szignifikáns).
50
5.2. TP53 génmutáció vizsgálatok Vizsgáltuk magyar tüdőrákos betegpopulációban a TP53 génmutációs mintázatot mutáció gyakoriság és mutáció típus szerint. A mutáció gyakoriságot az exonokon a nemek, a daganattípus, és a dohányzási szokások szerint; a mutáció típust a génen belüli eloszlás és a dohányzási státus szerint elemeztük. 5.2.1. TP53 génmutáció gyakoriság 5.2.1.1. Génmutáció gyakoriság a nem, a daganattípus és a dohányzási státus szerint A minták negyvenöt százaléka (47/104) hordozott TP53 mutációt, és összesen 51 TP53 mutációt találtunk. Ebből 44 személynél egy mutációt, 2 személynél két mutációt, és egy személynél három mutációt találtunk. Összességében a férfiak statisztikailag több mutációt hordoztak, mint a nők (55% ill. 31%), (P=0,045; 5. táblázat). A mutáció gyakoriság statisztikailag szignifikánsan magasabb volt a laphámrákban (26/37, 70%), mint az adenokarcinómában (21/67, 31%) (P=0,0002). A dohányzóknak körülbelül a fele hordozott mutációt (31/63, 49%), és több mutációt hordozott, mint a dohányzást régen abbahagyók, bár a különbség nem volt szignifikáns (9/27, 33%) (P=0,25).
51
5. táblázat: TP53 génmutáció gyakoriság nem, szövettani típus és dohányzási státus szerint Szövettani típus
Nem
Laphámrák
Adenocc.
Dohányzási státusz a
Dohányzó
Dohányzást régen Sohasem abbahagyób
dohányzó
n (%)
n (%)
n (%)
67
63
27
14
21 (31)
31 (49)
9 (33)
7 (50)
32 (51)
18 (67)
Férfi
Nő
n (%)
n (%)
n (%)
n (%)
62
42
37
34 (55)
13 (31)
26 (70)
28 (45)
29 (69)
11 (30)
Teljes mintahalmaz TP53 mutációt hordozó TP53 mutációt nem hordozó
P=0.045c
46 (69)
P=0.0002d
7 (50)
P=NSe,f
a
Dohányzó, az aktív dohányzók és dohányzást nemrég abbahagyók összevont csoportja. Dohányzást régen abbahagyó, aki a műtétet megelőzően több mint egy éve nem dohányzott. c Különbség a nők és a férfiak között. d Különbség az adenokarcinómás és a laphámrákos esetek között. e NS, Nem szignifikáns, különbség a dohányzók és dohányzást régen abbahagyók között. f NS, Nem szignifikáns, különbség a dohányzók és sohasem dohányzók között. b
Amennyiben tovább bontjuk a vizsgált betegpopulációt daganattípusonként, majd nemek szerint, azt találtuk, hogy laphámrákban közel azonos, kb. 70%-os gyakorisággal fordult elő a mutáció a nőknél és a férfiaknál egyaránt; és laphámrákban szignifikánsan nagyobb volt a mutációt hordozó minták előfordulási gyakorisága, mint az adenokarcinómában nemek szerinti bontásban is (P<0,05). Daganattípus szerinti bontás mellett sem a valaha dohányzóknál, sem a sohasem dohányzóknál nem volt statisztikailag szignifikáns különbség a nemek között. Az adenokarcinóma csoportban a mutáció gyakoriság a sohasem dohányzóknál magasabb volt, mint a valaha dohányzóknál, bár a különbség nem volt statisztikailag szignifikáns. Az összes sohasem dohányzó személy adenokarcinómás eset volt, 50%-a hordozott mutációt (összesen 7/14; férfi 3/5, és nő 4/9).
52
Az 25. ábra a mutációt hordozók előfordulási gyakoriságát mutatja a nemek és a szövettani típusok szerint, valaha dohányzók és sohasem dohányzók csoportosításban.
Nő 13 m / 42 31%
Férfi 34 m / 62a 55%b
Laphámrák 20 m / 28 71%
Valaha dohányzó 20 m / 28 71%
Sohasem dohányzó 0
Adenokarcinóma 14 m / 34 41%
Valaha dohányzó 11 m / 29 38%
Sohasem dohányzó 3m/5 60%
Laphámrák 6m/9 67%
Valaha dohányzó 6m/9 67%
Sohasem dohányzó 0
Adenokarcinóma 7 m / 33 21%
Valaha dohányzó 3 m / 24 13%
m = mutációt hordozók; a esetszám; b mutációt hordozók gyakorisága az alcsoportokban Mutációt hordozók gyakorisága, laphámrák > Mutációt hordozók gyakorisága, adenokarcinóma, P<0,0002
25. ábra: TP53 mutóciót hordozók előfordulása a vizsgálati populációban nem, szövettani típus és dohányzási kategóriák szerint (Anna és mtsai., 2010) 5.2.1.2. TP53 mutáció gyakoriság az összes valaha dohányzónál a dohányzási idő és a napi cigarettaszám függvényében A mutáció gyakoriság a dohányzás időtartamával növekedett. Azoknál, akik legfeljebb 20 évig dohányoztak, a mutáció 14,3%-ban (3/21) fordult elő. A több mint 20 évig dohányzóknak több mint a fele hordozott TP53 mutációt (36/66; 54,5%) (P=0,002). A 21– 35 évig és a 35 évnél hosszabb ideig dohányzók között már nem volt statisztikailag szignifikáns különbség a mutációt hordozó és a mutációt nem hordozó esetek száma között (26. ábra).
53
Sohasem dohányzó 4m/9 44%
Arány az alcsoportokban (%)
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
M WT
n=3 n=18
n=19 n=16
n=17 n=14
≤ 20 év
21-35 év
> 35 év
Dohányzási évek
26. ábra: TP53 génmutációk százalékos gyakorisága a dohányzási idő függvényében. M, mutációt hordozók; WT, mutációt nem hordozók (Anna és mtsai, 2009). A napi cigarettaszám szerint az összes valaha dohányzónál (n=87, cigarettaszám információval) napi ≤15 szál esetén 4 mutáció hordozót találtunk a 15 esetből (26%), >15 szál esetén 35 mutációt hordozó volt a 72 esetből (49%). A dohányzást régen abbahagyóknál a mutációt hordozók arányát magasabbnak találtuk a naponta 15 szálnál többet dohányzóknál, mint az annál kevesebbet dohányzóknál (≤15 szál esetén 0 mutációt hordozó az 5 esetből, >15 szál esetén 8 mutációt hordozó a 21 esetből (38%). Dohányzóknál a napi cigarettaszám kevésbé befolyásolta a mutáció gyakoriságát, mint a dohányzást régen abbahagyóknál (≤15 szál esetén 4 mutációt hordozó a 10 esetből (40%), >15 szál esetén 27 mutációt hordozó az 51 esetből (53%). 5.2.1.3. A TP53 génmutáció gyakorisági eloszlás a TP53 gén hosszában az exonokon és a kodonokon Tüdőrák esetében az 5, 6, 7, 8, 9 és 11 exonok érintettek a TP53 génmutációs esemény szempontjából (IARC TP53 DATABASE, 2008). A teljes mintahalmazunkban a legmagasabb mutációs arány az 5-ös exonon fordult elő (51 mutációból 24), a 11-es exonon nem volt mutáció. Két mintában mutattunk ki két mutációt, az egyik személynél
54
a 6-os és 7-es, a másik személynél az 5-ös és 8-as exonokon. Egy személynél fordult elő egyszerre három mutáció, ebből kettő az 5-ös, egy a 8-as exonon. A teljes populáció mutációs spektrumát összesítve azt találtuk, hogy laphámrák esetében a mutációk 86%-a az 5-ös és a 8-as exonokon fordult elő. Adenokarcinómában a mutációk a gén teljes hosszában, egyenletesebben fordultak elő. A 136-, 146-, 157-, 179-, 248-, 266-os kodonokon két mutáció, a 175-ös kodonon három mutáció fordult elő a teljes mintahalmaz eredményeit összesítve. A sohasem dohányzók más kodonokon hordoztak mutációkat, mint a dohányzók, egy kivétellel. Az exonokon a daganattípus szerint a TP53 mutáció eloszlást a 6. táblázat mutatja be.
55
6. táblázat: TP53 génmutáció gyakoriság (%) a vizsgált exonokon a teljes vizsgálati populációban, illetve külön laphámrákban és adenokarcinómában (Anna és mtsai., 2010). TP53 génmutációk száma Vizsgált exonok
5. exon
6. exon
7. exon
8. exon
9. exon
11. exon
Teljes vizsgálati populáció (n=104, 51 mutáció = 100%)
24 (~47%)
4 (~8%)
8 (~16%)
15 (~29%)
1 (~2%)
0 (0%)
Laphámrák (n=37, 29 mutáció=100%)
16 (~55%)
1 (~3%)
3 (~10%)
9 (~31%)
0 (0%)
0 (0%)
Adenokarcinóma (n=67, 22 mutáció=100%)
8 (~36%)
3 (~14%)
5 (~23%)
6 (~27%)
1 (~5%)
0 (0%)
n=a vizsgált személyek száma 2 személy 2 mutációval (egyik személynél: a 6-os és 7-es; másik személynél: az 5-ös és 8-as exonon) 1 személy 3 mutációval (ebből kettő az 5-ös, egy a 8-as exonon) 56
5.2.2. Mutációs mintázat A mutációk szekvencia azonosítása 43 esetben volt sikeres az 51 mutációból. A teljes vizsgálati anyagot tekintve széles mutációs spektrumot találtunk 9-féle mutációval. A leggyakoribb szekvencia változás a G→A tranzíció volt (8/43 és egy intron mutáció egy régóta nem dohányzónál, együttesen 21%), ezt követte a G→T transzverzió (8/43; 19%), a frameshift vagy kereteltolódási mutáció (7/43; 16%) és a G→C transzverzió (7/43; 16%). A 27. ábra a mutációs mintázatot mutatja be dohányzási kategóriák szerint.
Sohasem dohányzó 7 mutáció/14 fő C>T 14%
C>G 14%
G>C 14%
10 mutáció/27 fő
Ismeretlen 14% Frames. 14%
Dohányzó 34 mutáció/63 fő
Régóta dohányzó Voltnem dohányzó 10 mutáció/27 fő
C>T 10% C>G 10%
Frames. 30%
T>C A>T 3% 6% C>T 3%
T>G 6%
Ismeretlen 21% Frames. 9%
C>G 6% G>C 18%
G>A 29%
G>A 50%
G>A 6% G>T 24%
Frames. = frameshift, vagy kereteltolódási mutáció 27. ábra: TP53 mutációs mintázat különböző dohányzási kategóriákban (Anna és mtsai., 2010). Hasonlóságot észleltünk a sohasem dohányzók, és több mint egy éve nem dohányzók mutációs mintázata között. Ettől lényegesen eltért a dohányzók mutációs mintázata. A G→A tranzíció nagyobb gyakorisággal keletkezett a sohasem dohányzóknál (7 mutációból 2) és a több mint egy éve nem dohányzóknál (10 mutációból 5), mint a dohányzóknál (34 mutációból 2). A C→G transzverzió szintén jellemzőbb volt a sohasem dohányzóknál és a több mint egy éve nem dohányzóknál, mint a dohányzóknál. A C→G mutáció gyakoriságát vizsgálva sorrendben a következő enyhén csökkenő trend volt megfigyelhető: sohasem dohányzók, több mint egy éve nem dohányzók és dohányzók (14%>10%>6%).
57
A C→T tranzíciók esetében közel hasonló mutáció gyakorisági sorrend volt az itt felsorolt dohányzási csoportokban a következő eloszlással 14%>10%>3%. A trendek a kis mintaszám mellett nem voltak statisztikailag szignifikánsak. Sohasem dohányzóknál dominált a missense mutáció. A dohányzók csoportja többféle mutáció típust hordozott, mint a több mint egy éve nem dohányzók és a sohasem dohányzók csoportja. A G→T transzverziót kizárólag dohányzóknál találtuk, ugyanúgy a G→C transzverziók többségét. 5.2.3. TP53 génmutáció mintázat és az aromás DNS-adduktszintek közötti összefüggések Elemeztük a normál tüdőszövetben mért aromás DNS-adduktszinteket az ugyanazon betegektől származó tumor minta TP53 génmutációival összefüggésben. 5.2.3.1. Az aromás DNS-adduktszintek mutáció-hordozó és nem hordozók között Az összes dohányzónak átlagosan közel kétszer magasabb aromás DNS-adduktszintje volt, mint a dohányzást régen abbahagyók és sohasem dohányzók összevont csoportjának (átlag±szórás: 10,9 ± 6,5, ill. 5,5 ± 3,4 addukt /10 8 nukleotid, 7. táblázat). A különbség a két csoport között statisztikailag szignifikáns volt (P<0,0001). Dohányzóknál az aromás DNS-adduktszint hasonló volt a TP53 mutációt hordozók és mutációt nem hordozók között. A dohányzást régen abbahagyók és sohasem dohányzók összesített csoportjában viszont a mutációt hordozók adduktszintje magasabb volt, mint a mutációt nem hordozók adduktszintje, bár a különbség nem volt statisztikailag szignifikáns (P≥0,1).
58
7. táblázat: Aromás DNS-adduktszintek TP53 mutációt hordozókban és nem hordozókban (Anna és mtsai., 2009) Aromás DNS-addukt/108 nukleotid, Átlag ± SD (n)
P-értékc
TP53 mutációt
TP53 mutációt
hordozó
nem hordozó
10,9 ± 6,4 (31)
10,9 ± 6,7 (32)
>0,1
Dohányzást rég abbahagyób
7,6 ± 4,2 (9)
5,0 ± 2,7 (18)
0,10
Sohasem dohányzó
5,7 ± 3,5 (7) *
4,0 ± 3,1 (7) **
>0,1
Dohányzási státus Dohányzóa
a
Dohányzó: aki a műtétig dohányzott, vagy a műtétet megelőző egy éven belül hagyta abba a dohányzást. b Dohányzást rég abbahagyó, aki a műtétet megelőzően több mint egy éve nem dohányzott. c A különbség a TP53 mutációt hordozók és nem hordozók között. *Különbség a TP53 mutációt hordozó dohányzók és sohasem dohányzók között, P=0,065 ** Különbség a TP53 mutációt nem hordozó dohányzók és sohasem dohányzók között, P=0,0008 5.2.3.2. A TP53 mutáció típusok gyakorisága az aromás DNS-adduktszintek függvényében A teljes vizsgálati anyagban az exonokon a leggyakoribb szekvencia változás a G→A tranzíció és a G→T transzverzió volt 8-8 esetszámmal, majd ezt követte a frameshift vagy kereteltolódási mutáció és a G→C transzverzió 7-7 esetszámmal. A G→A tranzíciót hordozók többsége régóta nem dohányzó és sohasem dohányzó volt (8-ból 6). A G→C transzverziót hordozók többsége (7-ből 6), és a G→T transzverziót hordozó összes személy (8-ból 8) dohányzó volt. Az elemzéshez a DNS-adduktszinteket alacsony (< 6 addukt/108 nukleotid), közepes (612 addukt/108 nukleotid) és magas (> 12 addukt/108 nukleotid) kategóriába állítottuk olymódon, hogy az egyes kategóriákban közel megegyezzen az esetszám. A G→T transzverziót hordozóknál többségében magas aromás DNS-adduktszinteket találtunk. Nyolcból öt esetben (62,5%) magasabb, mint 12 addukt/108 nukleotid szintet mértünk, egy esetben volt az adduktszint közepes, és két esetben volt az addukt értéke a legkisebb
59
adduktszint kategóriában. A 28. ábrán a mutáció típusok gyakorisága látható a dohányzási státus és az aromás DNS-adduktszint kategóriák szerint.
Esetszám
A
Dohányzó
Sohasem dohányzó
Esetszám
B
Régóta Volt nem dohányzó dohányzó
Aromás DNS addukt/108 nukleotid
28. ábra: A mutáció típusok gyakorisága a tumorszövetben az exonokon a dohányzási státus (A) és a normál tüdőszövetből mért aromás DNS-adduktszintek (B) szerint (Anna és mtsai., 2009)
60
6. Az eredmények megbeszélése Az első generációs, un. klasszikus biomarkerek nagyban hozzájárultak a genotoxikus karcinogén ágensek, a betegségkockázat, és a fogékonyság közötti összefüggések jobb megértéséhez, és lehetővé tették a magas kockázatú csoportok azonosítását. A kis kockázatú, kis környezeti expozíciójú populációk megfelelő statisztikai megbízhatóságú azonosítása érdekében ugyanakkor számos vizsgálati követelmény merült fel. Ennek megfelelően a közelmúltban megjelent néhány új ígéretes biomarker és biomarker vizsgálati módszer. Ezek többnyire költséghatékony, nagyhatékonyságú, un. „high-throughput” technikák, amelyek nagy-mintaszámú vizsgálatok kivitelezését teszik lehetővé. Az új módszerek között szerepelnek a különböző „omika” technikák, mint például a toxikogenomika, a gén-metiláció és génexpressziós változások vizsgálata, a proteomika, és a metabonomika. A fejlődő technika eredményeként több ezer paraméter párhuzamos vizsgálatára van lehetőség a DNS-lapka (chip) technika segítségével (Tompa, 2006a). Több kis mintaszámú tanulmány összevont statisztikai értékelése lehetséges az un. meta-analízisek elvégzésével. Meta-analíziseknek köszönhetően a kis mintaszámból adódó gyenge statisztikai megbízhatóság miatti értékelési korlátok megszüntethetőek. Az említett módszerek alkalmasak új jelenségek felfedezésére, és hipotézisek tesztelésére is (Vineis és mtsai., 2007; Wogan és mtsai., 1992; Schoket, 2011). 6.1.Aromás DNS-addukt és O4-etT szintek, azok összehasonlítása Az aromás DNS- adduktok és az O4-etT mint a dohányzási expozíció biomarkerei Statisztikailag szignifikánsan magasabb aromás DNS-adduktszinteket mértünk az aktív dohányzók és a dohányzást nemrég abbahagyók összevont csoportjában, mint a dohányzást régen abbahagyók és a sohasem dohányzók összevont csoportjában. Eredményünk összhangban van más mintahalmazok vizsgálati eredményeivel (Phillips és mtsai., 1990; Schoket és mtsai., 1993b; Schoket és mtsai., 1998; Ozawa és mtsai., 1999; Godschalk és mtsai., 2002b).
61
A tumorszövetből és az ép szövetből mért DNS-adduktszintek közötti összefüggések feltárása a testidegen vegyületek anyagcsere folyamatainak és a tumorszövet DNS hibajavító mechanizmusainak jobb megismerését teszi lehetővé (Győrffy és mtsai., 2006; Győrffy és mtsai., 2008). Vizsgálatunkban nem volt nyilvánvaló különbség a 32Putójelöléssel nyert autoradiográfiás képekben a tumoros és a makroszkóposan ép tüdőszövet között, bár a radioaktivitás intenzitása általában alacsonyabb volt a tumorszövetben, mint a normál szövetben. A tumorszövetből és az ép szövetből mért adduktszintek között szignifikáns pozitív korreláció volt. Szyfter és munkatársai (1994) összehasonlították a gége tumor és a körülötte lévő ép szövet aromás DNSadduktszintjét és pozitív korrelációt találtak dohányzóknál és nem dohányzóknál is. Szintén pozitív korreláció volt melldaganatban és normál mellszövetben mért 4aminobifenil-DNS-adduktszintek között (r = 0,72; P = 0,0001; n = 55 ) (Faraglia és mtsai., 2003). Immunhisztokémiai módszerrel mért PAH-DNS-adduktok között korreláció volt májtumorban és a normál májszövetben mért értékek között (r = 0,3; P = 0,01; n = 105) (Peluso és mtsai., 2004). Összesítve a tumoros és az ép szövet adduktszintjei közötti szoros összefüggéseket, a pozitív korreláció a testidegen vegyületek hasonló aktivációs és eliminációs folyamataira utalnak a tumoros és a normál szövetekben. Meg kell jegyezni ugyanakkor azt, hogy a DNS-adduktszintek eltérő nagyságrendűek voltak különböző szervekből származó tumoros és a kapcsolódó nem tumoros szövetekben, ami szövet-specifikus adduktképződésre és eliminációra utal (Győrffy és mtsai., 2006; Győrffy és mtsai., 2008). Korábbi eredményeink szerint dohányzóknál az aromás DNS-adduktszint 1,7-2,0-szer magasabb volt, mint nemdohányzóknál normál tüdő és bronchus szövetben (P=0,02) (Győrffy és mtsai., 2004). A hivatkozott vizsgálati populációban dohányzóknál a perifériás vér limfocita mintákban az aromás DNS-adduktszint 50%-kal alacsonyabb volt, mint a normál tüdő- és bronchusszövetben (P<0,05). Sohasem dohányzók és régóta nem dohányzók összevont csoportjában, viszont a különbség nem volt jelentős vérlimfocita, és a normál tüdő- ill. bronchusszövet között. A teljes populációt vizsgálva szignifikáns pozitív korrelációt kaptunk célszövet és helyettesítő szövet között. Dohányzási státus szerinti bontásban azonban, dohányzóknál nem volt korreláció a normál tüdőszövet és limfocita (r=0,25; P=0,30), valamint a bronchus szövet és vér limfocita adduktszintje között (r=0,31,
62
P=0,20). A dohányzást régen abbahagyók és sohasem dohányzók összevont csoportjában azonban, szignifikáns pozitív korreláció volt a normális tüdőszövet és a vérlimfocita (r=0,55; P=0,023); valamint a bronchus szövet és vérlimfocita (r=0,55; P=0,026) DNS-adduktszintje között (Győrffy és mtsai., 2004). Volt dohányzók aromás DNS-adduktszintjeinek időbeni változását vizsgáltuk ép tüdőszövetből a dohányzás abbahagyásától eltelt idő függvényében és exponenciális csökkenést figyeltünk meg, amely kezdetben gyors, később lassuló ütemű. A féléletidő kb. 1,6 év volt, korábbi, hasonló vizsgálatban 1,7 év (Schoket és mtsai., 1998). Nem volt összefüggés az aromás DNS-adduktszint és a napi cigaretta szám között ebben a vizsgálati populációban. A dózisfüggés hiánya ellentmond korábbi kisebb tanulmányoknak bronhus szövetből (Phillips és mtsai., 1990)
és perifériás
tüdőszövetmintákból mért eredményeknek (Phillips és mtsai., 1988). Dunn és munkatársai (1991) pozitív trendet figyeltek meg a dohányzás mértéke és a DNSadduktszintek között bronhusból, az összefüggés nem volt szignifikáns. Norvégiai nem kissejtes tüdőrákos populációban gyenge szignifikáns összefüggés volt a napi cigarettaszám és az adduktszintek között (Ryberg és mtsai., 1994). A dózisfüggés megléte vagy hiánya függhet az alacsonyabb vagy magasabb külső környezeti expozícióból eredő háttérszinttől is (Schoket és mtsai., 1999a). Utóbbi években végzett nagymintaszámú molekuláris epidemiológiai vizsgálatokban fehérvérsejt mintákból (Peluso és mtsai., 2005; Bak és mtsai., 2006), valamint egy metaanalízis során (Veglia és mtsai., 2003) kimutatták, hogy az emelkedett aromás DNS-adduktszint a tüdőrák kockázati tényezője. Ugyanakkor meg kell jegyezni, hogy az egyedi szinten történő daganatkockázat becslés és megelőzés tekintetében az aromás DNS-adduktszintek meghatározása nem elégséges, önmagában kevés információt nyújt (Phillips., 2008), ezért a tüdőrák kialakulás folyamatának teljesebb megismerésére, valamint a betegség elkerülése és gyógyítása érdekében újabb biomarkerek bevezetése kívánatos.
63
Dohányzás következtében különféle szerkezetű DNS-adduktok keletkeznek (Anna és mtsai., 2011), viszont kevés ismeretünk van az O4-etT addukt szerepéről a mutagenezis és a karcinogenezis folyamatával összefüggésben (Godschalk és mtsai., 2002a; Godschalk és mtsai., 2002b). Kutatásaim új eredményekkel szolgálnak az O4-etT humán szövetben való képződése és a dohányzás közötti összefüggésekről. Eredményeink szerint az O4-etT dohányzás hatására képződik tüdőben, amely megerősíti egy korábbi kismintaszámú próbavizsgálat eredményét, amely szerint emelkedett O4-etT szint volt dohányzók tüdőszövetében (Godschalk és mtsai., 2002a; Godschalk és mtsai., 2002b). Saját munkánkban szignifikáns különbséget, ~1,7-szer magasabb O4-etT szinteket mértünk dohányzók tüdőszövetéből, mint sohasem dohányzók és dohányzást régen abbahagyók összevont csoportjából, amely igazolja, hogy az O4-etT alkalmas dohányzási expozícióbeli különbségek kimutatására csoport szinten. Sohasem dohányzók tüdejéből szintén mutattunk ki O 4-etT adduktot. Ezért arra következtetünk, hogy a dohányzás az elsődleges, de nem az egyetlen forrása az O 4-etT képződésnek, amely származhat még passzív dohányzásból, és más, még nem ismert forrásból is. Kísérletes tanulmányokban alkiláló anyagok hatására az O 4-etT kis hányadban keletkezett más alkilált bázisokhoz képest. Etil-nitro-karbamid hatására elsősorban N7etilguanin (~11%-a a teljes addukt képződésnek), O6-etilguanin (~9%), N3-etiladenin (~4%), O4-etiltimidin (<2%), etil-foszfotriészterek (~56%) és néhány egyéb bázis módosulat keletkezett (Beranek, 1990). Borjútimusz DNS N-[3H]-metil-N-nitrokarbamiddal történő metilálása hatására a teljes metilációnak csak a 0,06%-ban keletkezett O4-metiltimidin, és az O6-metildezoxiguanozin:O4-metiltimidin arány körülbelül 120 volt (Dolan és mtsai., 1985). Dietil-nitrozaminnal (DEN) történt kezelést követően patkánymájban az O4-etT a teljes etiláció 1%-ban keletkezett (Scherer és mtsai., 1980).
Nem találtunk nyilvánvaló dózis-válasz összefüggést O4-etT szintekben dohányzóknál a vizsgált mintaszámok mellett. Dohányzás hatására humán mintákból kimutatva azt találták (Schoket és mtsai., 1998), hogy a növekvő expozíciós dózis hatására a DNS-
64
adduktszint képződésben telítés jellegű plató alakul ki. Dohányfüst-specifikus nitrózamin, 4-(N-nitrozometilamino)-1-butanon (NNK) kezelés hatására 4 nap után patkány tüdőben az O4-metildezoxitimidin egy állandósult un. „steady state” szintet ért el (Belinsky és mtsai., 1986). Eredményeink azt bizonyítják, hogy az O4-etT adduktok humán tüdőben tartósan megmaradnak a dohányzás abbahagyása után, ugyanis a régóta nem dohányzók több mint harmadának magasabb volt az átlagos O4-etT szintje, mint a sohasem dohányzók átlagos adduktszintjének kétszerese. Azt találtuk tehát, hogy az
O4-etT addukt
lényegesen perzisztensebb humán tüdőben, mint az aromás DNS-adduktok, amelynek a becsült félélet-ideje korábbi tanulmány szerint 1,7 év volt (Schoket és mtsai., 1998). A jelen tanulmányban az O4-etT pontos félélet-idejét nem lehetett megbecsülni a tág határok közötti egyedi eltérések miatt. Eddig nem készült olyan tanulmány, amely az O4-alkiltimidin eliminációját vizsgálta volna humán tüdőből. Kísérletes rendszerben mutatták ki, hogy dietil-nitrozamin hatására patkánymájban keletkezett O4-alkiltimidin átlagos félélet ideje 16-24 nap közötti, átlagosan 19 nap volt (Scherer és mtsai., 1980). N-etil-N-nitro-karbamiddal kezelt humán magzati vese nyálkahártya és bőr kötőszöveti sejtekben a kezdeti O4-etdT fele javítódott ki 72 órán belül (Wani és D'Ambrosio, 1987). A DNS alkilációs termékek hibajavító mechanizmusait még nem ismerjük kellőképpen. Emlős sejtvonalakon végzett kísérletek különböző eredményekkel szolgáltak, és néhány tanulmány talált (Wani és mtsai., 1990; O’Toole és mtsai., 1993), más tanulmányok nem találtak összefüggést (Dolan és mtsai., 1985; Bronstein, 1992) az O6-metilguaninDNS metiltranszferáz (MGMT) és az O4-alkiltimidin hibajavítás között. Humán sejtvonalon végzett kísérletben kimutatták, hogy mutáns alkilguanin transzferáz befolyásolta az O4-alkiltimin hibajavítási hatékonyságot (Fang és mtsai., 2009). Az MGMT promoter régiójának metilációja összefüggésben volt a TP53 tumor szupresszor gén mutációjával humán tüdőtumorokban (Nakamura és mtsai., 2001; Wu és mtsai., 2008).
65
Összefüggések az O4-etT és az aromás DNS-addukt szintek között Tanulmányunkban mind a két addukt típus, az O4-etT és az aromás DNS-addukt szintek is egyaránt visszatükrözték a dohányzók, a sohasem dohányzók és a régóta nem dohányzók expozícióbeli különbségét. Ugyanakkor nagy egyedi szórásokat mértünk mind a két addukttípusnál azonos dohányzási expozíció esetén is, amelynek feltételezett oka az egyedi hajlamosító tényezőkből adódó különbségek, és esetleg eltérő háttérexpozíció lehet. Várakozásainkkal ellentétben nem volt statisztikailag szignifikáns korreláció az O 4-etT és az aromás DNS-addukt szintek között a teljes vizsgálati populációban, és az egyes dohányzási alcsoportokban sem. Eredményeink nem egyeznek az első publikált próbavizsgálat eredményeivel, ahol pozitív korreláció volt (r= 0,6; p<0,01) az O4-etT és az aromás DNS-addukt szintek között (Godschalk és mtsai., 2002b). Az eredmények közötti különbség adódhat az eltérő cigaretta típusból, vagy még inkább a különböző földrajzi környezetű vizsgálati populációk környezeti és endogén forrásból adódó háttér adduktszint különbségéből. A más-más háttér szintek befolyásolják az átlagos addukt szinteket dohányzóknál és nem dohányzóknál, ezáltal a relatív különbségeket is a dohányzási
alcsoportok között.
Különböző
kémiai
szerkezető
DNS-adduktok
összehasonlításában nem egyedülálló a jelen tanulmányban kapott eredményünk az egyedi szintű korreláció hiányáról az O4-etT és az aromás DNS-addukt között. Kevés és ellentmondásos irodalmi adat áll rendelkezésünkre az aromás ill. PAH típusú DNSadduktok és egyes specifikus kémiai szerkezetű DNS-adduktok összefüggéseiről (Győrffy és mtsai., 2006; Győrffy és mtsai., 2008). A korrelációt befolyásolhatják az egymáshoz közeli, ugyanakkor egymástól függetlenül működő, eltérő kinetikai paraméterű metabolikus aktivációs-detoxikációs folyamatok, amelyek a különböző testidegen vegyületek anyagcsere-folyamatában, a DNS-adduktok képződésében és eliminációjában játszanak közre. Vizsgálati populációnkban nagyobb humán mintaszámon kimutattuk, hogy mind a két addukt típusnak a fő expozíciós forrása a dohányfüst, de az eredményeink arra utalnak,
66
hogy metabolikus útvonalaik, az addukt képződési reakcióképességük és hibajavító folyamataik különböznek. 6.2. TP53 génmutáció gyakoriság, mutációs mintázat és az aromás adduktokkal való összefüggések a vizsgálati anyagban A magyar vizsgálati populációban mért magas mutációs arány A magyar férfiak tüdőrákos megbetegedési gyakorisága a legmagasabbak között van a világon, és európai viszonylatban a magyar nők az elsők között vannak a megbetegedések számát tekintve. A jelen kutatás során 104 primér laphámrákos és adenokarcinómás hazai tüdőrákos beteg tumor mintáiban vizsgáltuk a TP53 génmutációi eloszlását az 5, 6, 7, 8, 9 és 11-es exonokon. Eredményeink szerint a teljes mintahalmaz 45%-a, a férfiak 55%-a és a nők 35%-a hordozott mutációt. A vizsgált mintahalmazban talált mutáció gyakoriság magasabb számos kaukázusi (Yngveston és mtsai., 1999; Husgafvel-Pursiainen és mtsai., 2000; Gao és mtsai., 2003; Mechanic és mtsai., 2005; Szymanowska és mtsai., 2006), dél-amerikai (HusgafvelPursiainen és mtsai., 2000), és ázsiai (Chang és mtsai., 1999) tüdőrákos populációban kimutatott mutáció gyakorisághoz képest, és a saját anyagunkban kimutatott gyakoriságokhoz képest magasabb értékekről alig számolnak be a szakirodalomban (Fujita és mtsai., 1999; Chang és mtsai., 1999; Chang és mtsai., 2005; Hu és mtsai., 2005; Le Calvez és mtsai., 2005b). Korábbi tanulmányokhoz hasonlóan a mutáció gyakoriság növekedett a dohányzási időtartam hosszabbodásával (Husgafvel-Pursiainen és mtsai., 1996; Le Calvez és mtsai., 2005b). Emlkedett mutációs gyakoriságot találtunk hosszú ideig tartó (>20 év) dohányzás esetében, amely összhangban van korábbi tanulmányokkal (Husgafvel-Pursiainen és mtsai., 1996; Le Calvez és mtsai., 2005b), és azokkal az epidemiológiai felmérésekkel,
67
amelyek a a magas tüdőrák kockázatot a hosszú ideig tartó dohányzással hozták összefüggésbe (IARC, 2004). Sohasem dohányzóknál az esetek fele hordozott mutációt. Ez a gyakoriság masabb számos más populációban mért értéknél (Husgafvel-Pursiainen, 2004), de előfordult hasonló mutáció gyakoriságú populáció is (Le Calvez és mtsai., 2005b). Mutáció
nagyobb
arányban
fordult
elő
a
laphámrákban
(70%),
mint
az
adenokarcinómában (P<0,05), ami összhangban van más tanulmányok eredményeivel (Fujita és mtsai., 1999; Husgafvel-Pursiainen és mtsai., 1995; Gao és mtsai., 2003; Mechanic és mtsai., 2005 Le Calvez és mtsai., 2005b). Ugyanakkor a Nemzetközi Rákkutató Ügynökség összesített adatbázisa az általunk mért értéknél alacsonyabb mutációs arányt közöl laphámrákra (48.7%) (IARC TP53 DATABASE, 2008). Feltehető, hogy a számunkra kedvezőtlen különbség a vizsgálati populációnkat jellemző erős dohányzásból fakad. A laphámrákos betegek mind valaha dohányzók voltak. Az adenokarcinómás esetekben mért 31%-os mutáció gyakoriság hasonló volt az összesített nemzetközi adatbázis R13 Verziójában publikált 30,6% gyakoriság értékhez (IARC TP53 DATABASE, 2008). Az adenokarcinómás vizsgálati mintákat vizsgálva a férfi betegek több mutációt hordoztak, mint a nőbetegek. TP53 génmutáció eloszlása a génen A TP53 gén kodonjain a mutáció eloszlása hasonló volt, mint a nemeztközi tüdőrák adatbázisban bemutatott mutáció mintázat (Husgafvel-Pursiainen, 2004; IARC TP53 DATABASE, 2008). Eredményeink szerint laphámráknál a mutációk 86%-át az 5-ös és 8-as exonokon találtuk, míg az adenokarcinóma esetén a mutációk a gén teljes hosszában viszonylag egyenletesen oszlottak meg. A 136-, 146-, 157-, 179-, 248-, 266os kodonokon két mutáció, a 175-ös kodonon három mutáció fordult elő a teljes mintahalmazban. Irodalmi adatok szerint a 175-ös és 248-as kodon a leggyakrabban mutációt szenvedő kodonok közé tartozik humán daganatokban. A 157-es kodon mutációja gyakori a dohányzással összefüggő tüdőrákban, és kísérletek bizonyítják,
68
hogy ezen a kodonon jellemző a benz [a]pirén adduktjának képződése (Fujita és mtsai., 1999; Hussain és mtsai., 2001). Ezzel összhangban, a 157-es kodonon talált két mutáció dohányzóknál fordult elő. Részletesebb statisztikai elemzést nagyobb mintaszámmal lehetne végezni. Laphámráknál több mutációs forró régióról számolnak be más kutatások, különös tekintettel a 267-es kodonra (Gao és mtsai., 2003). Az adenokarcinómában kimutatott mutációk általában a 7-es exonon fordulnak elő (Husgafvel-Pursiainen és mtsai., 1995; Gao és mtsai., 2003). TP53 mutációs mintázat a vizsgálati anyagban G→T transzverziót kizárólag dohányzóknál mutattunk ki. Ezt a mutációt a cigarettafüstben lévő benz[a]pirén expozíció tipikus következményének tartják (Denissenko és mtsai., 1996). A G→A mutációk nagyobb mértékben fordultak elő sohasem dohányzóknál és a dohányzást több mint egy éve abbahagyóknál, ami összhangban van azokkal a tanulmányokkal, amelyek a G→A mutáció típust a sohasem dohányzóknál észlelték (Husgafvel-Pursiainen és mtsai., 2000; Le Calvez és mtsai., 2005b) A G→A, G→C, C→G, C→T báziscserék, a deléció és az inzerció előfordulási gyakorisága hasonlóan alakult nőknél és férfiaknál. Egy közelmúltban készült tanulmányban hasonló TP53 mutáció típusokról és gyakoriságról számoltak be nők és férfiak esetében (Marrogi és mtsai., 2005). A tüdőrák nemek szerinti kockázatát elemző különböző vizsgálatok a nők és férfiak azonos mértékű, vagy a nők magasabb relatív kockázatáról számolnak be (IARC, 2004; Marrogi és mtsai., 2005). A mi eredményeink szerint a férfiaknál magasabb volt a mutációs ráta, a különbség statisztikailag szignifikáns volt (P=0,03), viszont a férfiak többet is dohányoztak.
69
Összefüggések a dohányzási dózis, a dohányzási idő és a TP53 mutáció gyakoriság között A dohányzási paraméterek és a mutáció gyakoriság közötti összefüggésekről született eredményeink összhangban vannak azokkal az epidemiológiai felmérésekkel, amelyek a dohányzási szokások és a tüdőrákos megbetegedések esélye közötti kapcsolatot elemzik. Saját eredményünk szerint a legalább 20 évig tartó dohányzás több mutációt okozott a 20 évnél rövidebb idejű dohányzáshoz képest (P<0,001). A Nemzetközi Rákkutató Ügynökség (IARC) felmérése szerint a tüdőrák kockázatát befolyásoló legjelentősebb dohányzási paraméter rendszeresen dohányzóknál a dohányzás időtartama (IARC, 2004). Vizsgálatunk szerint azoknál, akik már leszoktak a dohányzásról, a korábban elszívott napi 15 szál cigaretta mutatkozott választóvonalnak a mutáció gyakoriság szempontjából. Az IARC összefoglalójában közöltek szerint, a tüdőrákos megbetegedés kockázata a rendszeres dohányzás éveinek növekvő száma mellett
a
naponta
elszívott
cigaretták
számával
emelkedik
(IARC,
2004).
Vizsgálatunkban azt találtuk, hogy a dohányzás tartós elhagyása kedvezően hat a mutáció gyakoriság csökkenésére, különösen azoknál az egykori dohányzóknál, akik korábban legfeljebb napi 15 szál cigarettát szívtak. A nemzetközi monográfia csökkent tüdőrák kockázatról számol be már 1-4 év közötti dohányzásmentességtől. A kockázat mértéke a dohányzásmentes évek számával tovább csökken (IARC, 2004). A TP53 mutáció típus,a dohányzási státusz és az aromás DNS-adduktszintek összefüggései A vizsgálatunkban az egyik leggyakoribb bázis csere a G→T transzverzió volt, amely kizárólag dohányzóknál fordult elő. Az IARC TP53 mutáció adatbázisa szerint a tüdőrákra jellemző mutációs spektrum 30%-a G→T transzverzió, amely többnyire a gyakran mutációt hordozó kodonokon fordul elő (IARC TP53 DATABASE, 2008). Szintén összefüggés van a benz[a]pirén és más PAH expozícióból származó adduktok és a mutáció típusa között (Hainaut és Pfeifer, 2001; Pfeifer és mtsai., 2002; De Marini, 2004). Elsőként mutattuk ki a nemzetközi szakirodalomban, hogy a vizsgálati anyagra jellemző egyik leggyakoribb mutáció típus, a G →T transzverzió a tumorban magas 70
aromás DNS-adduktszinttel párosult a nem tumoros tüdőszövetben dohányzóknál (Anna és mtsai., 2009). Szakirodalmi közlések arra utalnak, hogy a dohányzókra jellemző specifikus mutációs spektrum a komplex karcinogén expozíció és a mutagén PAH expozíció eredménye (Pfeifer, 2000a; Pfeifer, 2000b; Pfeifer és mtsai., 2002; DeMarini, 2004; Yoon és mtsai., 2004). A régóta nem dohányzókat és sohasem dohányzókat vizsgálva magasabb DNS-adduktszintet mértünk a TP53 mutációt hordozóknál a mutációt nem hordozókhoz képest (P=0,076), míg a dohányzóknál nem volt ilyen különbség. Szintén valószínűsíthető, hogy a PAH-ok mellett más dohányfüst eredetű karcinogén anyagok is hozzájárulnak a mutációs mintázat kialakulásához (Pfeifer és mtsai., 2002; Hecht, 2003; Gabrielson, 2006). A G→T transzverzió mellett gyakori volt a G→A tranzíció, a frameshift vagy kereteltolódási mutáció és a G→C transzverzió ebben a vizsgálati populációban. A G→C transzverziót majdnem kizárólag dohányzóknál találtuk, és a G→A tranzíció gyakoribb volt a régóta nem dohányzóknál és a sohasem dohányzóknál. Korábbi tanulmányok szintén emelkedett G→A tranzíció gyakoriságot mutattak ki sohasem dohányzóknál (Husgafvel-Pursiainen és mtsai., 2000; Hainaut és Pfeifer, 2001; Le Calvez és mtsai., 2005b). A frameshift mutáció főleg azoknál a dohányzóknál fordult elő, akik több mint 35 évig dohányoztak; a legfeljebb 20 évig dohányzóknál nem volt kereteltolódási mutáció. A mutációkeletkezés folyamatát befolyásolhatja a szelektív DNS-hibajavító rendszer (Pfeifer, 2000a; Pfeifer, 2000b; Smith és mtsai., 2000; Pfeifer és mtsai., 2002; Yoon és mtsai., 2004). Vizsgálatunkban összefüggéseket találtunk a dohányzási státus, az aromás DNSadduktok és az O4-etT; a dohányzás és a TP53 génmutációk, valamint a TP53 génmutáció spektrum és az aromás DNS-adduktszintek között. Kimutattuk, hogy a vizsgált hazai populációban sokféle és magas a TP53 génmutációs arány más nemzetekhez képest, amely adódhat a magas dohányfüst eredetű és egyéb környezeti háttér expozícióból, valamint az anyagcserefolyamatokat befolyásoló génpolimorfizmus mintázatból.
71
7. Összefoglalás Magyarországon világviszonylatban igen magas a tüdőrák gyakorisága, de pontos okait még nem ismerjük. A tüdőrák fő kockázatnövelő tényezője a dohányzás. PhD kutatómunkám célja az volt, hogy molekuláris epidemiológiai vizsgálatban a dohányzási státus, két különböző DNS-addukttípus, a TP53 tumorszupresszor génmutációk és a tüdőrák összefüggéseit jobban feltárjam hazai populációban. Munkámban primér laphámrák ill. adenokarcinóma miatti tüdőrezekcióból (n=104) származó makroszkóposan ép és tumor szövetmintákat dolgoztam fel. A dohányzási szokásokról kérdőíves adatfelvétel történt. Az aromás DNS-adduktszint meghatározást a normál tüdőszövet mintákból
32
P-utójelöléses módszerrel, az O4-etiltimidin (O4-etT)
szint meghatározást immunkémiai adduktdúsítást követő
32
P-utójelöléssel és HPLC
elválasztással végeztem. A TP53 génmutáció előszűrést a tumor mintákból denaturáló gradiens gélelektroforézissel és automatizált egyszál konformáció polimorfizmus vizsgálattal végeztem az 5-9 és 11-es exonokon, a mutációkat szekvenálással azonosítottam. Az O4-etT és az aromás DNS-adduktszintek szignifikánsan magasabbak voltak a műtétig dohányzók és a dohányzást a műtét előtt egy éven belül abbahagyók csoportjában, mint a dohányzást több mint egy évvel a műtét előtt abbahagyók és a sohasem dohányzók csoportjában. Az O4-etT hosszú életidejű DNS sérülésnek mutatkozott. Nem volt statisztikailag szignifikáns korreláció az O 4-etT és az aromás DNS-addukt szintek között. A vizsgálati populációban nagyobb TP53 mutáció gyakoriság és többféle mutáció típus fordult elő az IARC összesített adatbázisával összevetve. A minták 45%-a hordozott TP53 mutációt. Szignifikánsan több mutáció fordult elő laphámrákban, mint adenokarcinómában, és a több mint 20 évig dohányzóknál. A leggyakoribb mutáció típusok a G→A (19%), G→T (19%) és G→C (16%) voltak, A mutációs mintázatot befolyásolta a dohányzási státus. G→T transzverzió csak a dohányzóknál fordult elő, és többségében magas aromás DNSadduktszinttel párosult. Eredményeim megerősítik, hogy az O4-etT szint tüdőben a dohányzás következtében emelkedik. Humán tüdőben az O4-etT hosszú életidejű, és az O4-etT és az aromás DNS-adduktok aktivációs és eliminációs útvonala nem szorosan kapcsolt. Alkalmasnak ítélem az O4-etT-t dohányzási expozíció biomarkereként expozíciós
csoportok
közötti
összehasonlításra
molekuláris
epidemiológiai
72
vizsgálatokban. A nemzetközi szakirodalomban elsőként mutattam ki szoros összefüggést a TP53 G→T mutációja és a magas aromás DNS-adduktszint között humán vizsgálatban, ami jelentős tudományos előrelépés a kísérletes modellektől a karcinogén DNS-addukt és a génmutáció közötti ok-okozati kapcsolat feltárásában.
73
8. Kiemelt új tudományos eredmények 1. Eredményeim alapján arra következtetek, hogy a dohányzás az O4-etT képződés fő forrása. Az O4-etT addukt a dohányzási expozíció biomarkereként alkalmazható molekuláris epidemiológiai vizsgálatokban. 2. Eredményeim azt bizonyítják, hogy az O4-etT adduktok humán tüdőben tartósan megmaradnak a dohányzás abbahagyása után. 3. Az aromás DNS-addukt és az O4-etT addukt képződés metabolikus útvonalai és DNS hibajavító folyamatai nagy valószínűséggel nem kapcsolódnak szorosan egymáshoz. 4.
A vizsgált magyar tüdőrákos betegpopulációban a TP53 mutáció gyakoriság
magasabb számos kaukázusi, dél-amerikai és ázsiai tüdőrákos populációban kimutatott mutáció gyakorisághoz képest, és magasabb értékekről alig számolnak be a szakirodalomban. 5. Összefüggést találtam a dohányzási dózis, a dohányzási idő és a TP53 mutáció gyakoriság között. 6. Hasonlóságot mutattam ki a sohasem dohányzók, és a több mint egy éve nem dohányzók TP53 mutációs mintázata között. 7. A nemzetközi szakirodalomban elsőként mutattam ki összefüggést a magas aromás DNS-adduktszint és a G→T mutáció mint a dohányzásra jellemző TP53 génmutáció között.
74
Irodalomjegyzék Ahrendt,S.A., Hu,Y., Buta,M. McDermott MP, Benoit N, Yang SC, Wu L, Sidransky D. (2003) p53 mutations and survival in stage I non-small-cell lung cancer: results of a prospective study. J. Natl. Cancer Inst., 95, 961–970. Anna,L., Holmila,R., Kovács,K., Győrffy,E., Győri,Z., Segesdi,J., Minárovits,J., Soltész,I., Kostic,S., Csekeő,A., Husgafvel-Pursiainen,K., Schoket,B. (2009) Relationship between TP53 tumour suppressor gene mutations and smoking related bulky DNA adducts in a lung cancer study population from Hungary. Mutagenesis,24, 475–480. Anna,L., Holmila,R., Kovács,K., Győrffy,E., Győri,Z., Segesdi,J., Minárovits,J., Soltész,I., Kostic,S., Csekeő,A., Husgafvel-Pursiainen,K., Schoket,B. (2010) TP53 tumorszupresszor génmutáció vizsgálatok magyar tüdőrákos betegcsoportban. Egészségtudomány, 54, 57–69. Anna,L., Kovács K., Győrffy,E., Schoket,B., Nair,J. (2011) Smoking-related O4ethylthymidine formation in human lung tissue and comparisons with bulky DNA adducts. Mutagenesis, 26, 523–527. Bak,H., Autrup,H., Thomsen,B.L. Tjønneland,A., Overvad,K., Vogel,U., RaaschouNielsen,O., Loft,S. (2006) Bulky DNA adducts as a risk indicator of lung cancer in a Danish case-cohort study. Int. J. Cancer, 118, 1648–1622. Baker,S.J., Preisinger,A.C., Jessup,J.M., Paraskeva,C., Markowitz,S., Willson,J.K., Hamilton,S., Vogelstein,B. (1990) p53 gene mutations occur in combination with 17p allelic deletions as late events in colorectal tumorigenesis. Cancer Res., 50, 717–722. Belinsky,S.A., White,C.M., Boucheron,J.A., Richardson,F.C., Swenberg,J.A. and Anderson,M. (1986) Accumulation and persistence of DNA adducts in respiratory tissue of rats following multiple administrations of the tobacco specific carcinogen 4(N-methyl-N-nitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone. Cancer Res., 46, 1280–1284. Beranek,D.T. (1990) Distribution of methyl and ethyl adducts following alkylation with monofunctional alkylating agents. Mutat. Res., 231, 11–30. Berwick,M., Albertini,R.J. (2008) Biomarkers of mutation and DNA repair capacity. In: Wild,C., Vineis,P., Garte,S. (eds.), Molecular Epidemiology of Chronic Diseases. John Wiley & Sons Ltd, West Sussex, pp. 127–139. Besaratinia,A., Maas,L.M., Brouwer,E.M., Kleinjans,J.C., Van Schooten, F.J. (2000a) Comparison between smoking-related DNA adduct analysis in induced sputum and peripheral blood lymphocytes. Carcinogenesis, 21, 1335–1340.
75
Besaratinia,A., Van Straaten,H.W., Godschalk,R.W., Van Zandwijk,N., Balm,A.J., Kleinjans,J.C., Van Schooten,F.J. (2000b) Immunoperoxidase detection of polycyclic aromatic hydrocarbon-DNA adducts in mouth floor and buccal mucosa cells of smokers and nonsmokers. Environ. Mol. Mutagen., 36, 127–133. Blaszyk,H., Hartmann,A., Schroeder,J.J., McGovern,R.M., Sommer,S.S., Kovach,J.S. (1995) Rapid and efficient screening for p53 gene mutations by dideoxy fingerprinting. Biotechniques, 18, 256–260. Borresen,A.L., Hovig,E., Smith-Sorensen,B., Malkin,D., Lystad,S., Andersen,T.I., Nesland,J.M., Isselbacher,K.J., Friend,S.H. (1991) Constant denaturant gel electrophoresis as a rapid screening technique for p53 mutations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 8405–8409. Bouchardya,C., Benhamoub,S., Jourenkovab,N., Dayerc,P., Hirvonen,A. (2001) Metabolic genetic polymorphisms and susceptibility to lung cancer. Lung Cancer, 32, 109–112. Brennan,J.A., Boyle,J.O., Koch,W.M., Goodman,S.N., Hruban,R.H., Eby,Y.J., Couch,M.J., Forastiere,A.A, Sidransky,D. (1995) Association between cigarette smoking and mutation of the p53 gene in squamous-cell carcinoma of the head and neck. N. Engl. J. Med., 332, 712–717. Bronstein,S.M., Skopek,T.R., Swenberg,J.A. (1992) Efficient repair of O6ethylguanine, but not O4-ethylthymine or O2-ethylthymine, is dependent upon O6alkylguanine-DNA alkyltransferase and nucleotide excision repair activities in human cells. Cancer Res., 52, 2008–2011. Carel,R., Olsson,A.C., Zaridze,D., Szeszenia-Dabrowska,N., Rudnai,P., Lissowska,J., Fabianova,E., Cassidy,A., Mates,D., Bencko,V., Foretova,L., Janout,V., Fevotte,J., Fletcher,T., 't Mannetje,A., Brennan,P., Boffetta,P. (2007) Occupational exposure to asbestos and man-made vitreous fibres and risk of lung cancer: a multicentre casecontrol study in Europe. Occup. Environ. Med., 64, 502–508. Chang,M.Y., Chong,I.W., Chen,F.M., Wang,J.Y., Cheng,T.L., Cheng,Y.J., Sheu,C.C., Hung,S.Y., Yang,M.C. and Lin,S.R. (2005) High frequency of frameshift mutation on p53 gene in Taiwanese with non small cell lung cancer. Cancer Lett., 222, 195-204. Chang,Q.P., Willey,J.C., Hei,T.K. (1999) Alterations of p53 in tumorigenic human bronchial epithelial cells correlate with metastatic potential. Carcinogenesis, 20, 1529– 1533. Chen,H.J., Kao,C.F. (2007) Effect of gender and cigarette smoking on urinary excretion of etheno DNA adducts in humans measured by isotope dilution gas chromatography/mass spectrometry. Toxicol. Lett., 169, 72–81. Culp,S.J., Roberts,D.W., Talaska,G., Lang,N.P., Fu,P.P. Lay,J.O.Jr., Teitel,C.H., Snawder,J.E., Von Tungeln,L.S., Kadlubar,F.F. (1997) Immunochemical, 32P-
76
postlabeling, and GC/MS detection of 4-aminobiphenyl-DNA adducts in human peripheral lung in relation to metabolic activation pathways involving pulmonary Noxidation, conjugation, and peroxidation. Mutat. Res., 378, 97–112. Dalhoff,K., Buus Jensen,K., Enghusen Poulsen,H. (2005) Cancer and molecular biomarkers of phase 2. Methods Enzymol., 400, 618–627. Dalton,S.O., Boesen,E.H., Ross,L., Schapiro,IR., Johansen,C. (2002) Mind and cancer. do psychological factors cause cancer? Eur. J. Cancer, 38, 1313–1323. De Marini,D.M. (2004) Genotoxicity of tobacco smoke and tobacco smoke condensate: a review. Mutat. Res., 567, 447–474. Denissenko,M..F., Pao,A., Tang,M., Pfeifer,G.P. (1996) Preferential formation of benzo[a]pyrene adducts at lung cancer mutational hotspots in p53. Science, 274, 430– 432. Déri,Zs., Takács,S., Csige,I., Hunyadi,I. (1992) A case-control study of radon and lung cancer in eastern Hungary. Radiat. Prot. Dosimetry, 45, 695–698. Didkowska,J., Manczuk,M., McNeill,A., Powles,J., Zatonski,W. (2005) Lung cancer mortality at ages 35-54 in the European Union: ecological study of evolving tobacco epidemics. B.M.J. 331, 189–191 Doll,R., Peto,R.(1978) Cigarette smoking and bronchial carcinoma: dose and time relationships among regular smokers and lifelong non-smokers. J. Epidemiol. Community Health, 32, 303–313. Doll,R., Peto,R. (1981) The causes of cancer: quantitative estimates of avoidable risks of cancer in the United States today. J. Natl. Cancer Inst., 1981, 66, 1193–1308. Dolan,M.E., Pegg,A.E. (1985) Extent of formation of O4-methylthymidine in calf thymus DNA methylated by N-methyl-N-nitrosourea and lack of repair of this product by rat liver O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase. Carcinogenesis, 6, 1611–1614. Dunn,B.P., Vedal,S., San,R.H.C., Kwan,W.F., Nelems,B., Enarson,D.A., Stich.,H.F. (1991) DNA adducts in bronchial biopsies. Int. J. Cancer, 48, 485–492. European Cancer Observation, IARC (2008) http://eu-cancer.iarc.fr/country-348hungary.html,en Fang,Q., Kanugula,S., Tubbs,J.L., Tainer,J.A., Pegg,A.E. (2009) Repair of O4alkylthymine by O6-alkylguanine-DNA alkyltransferases. J. Biol. Chem., 285, 8185– 8195. Faraglia,B., Chen,S.Y., Gammon,M.D., Zhang,Y.J., Teitelbaum,S.L., Neugut,A.I., Ahsan,H., Garbowski,G.C., Hibshoosh,H., Lin,D., Kadlubar,F.F., Santella, R.M. (2003)
77
Evaluation of 4-aminobiphenyl-DNA adducts in human breast cancer: the influence of tobacco smoke. Carcinogenesis, 24, 719–725. Farmer,P. (2006) Introduction. In: Farmer,P. and Emeny,J.M. (eds.) Biomarkers of carcinogen exposure and early effect. ECNIS, Nofer Institute of Occupational Medicine, Lodz, Poland, pp. 13–16. Ferlay,J., Parkin,D.M., Steliarova-Foucher, E. (2010). Estimates of cancer incidence and mortality in Europe in 2008. Eur. J. Cancer, 46, 765–781. Fujita,T., Kiyama,M., Tomizawa,Y., Kohno,T. and Yokota, J. (1999) Comprehensive analysis of p53 gene mutation characteristics in lung carcinoma with special reference to histological subtypes. Int. J. Oncol., 15, 927–934. Gabrielson,E. (2006) Worldwide trends in lung cancer pathology. Respirology, 11, 533– 538. Gallo,V., Khan,A., Gonzales,C., Phillips,D.H., Schoket,B., Győrffy,E., Anna,L., Kovács,K., Møller,P., Loft,S., Kyrtopoulos,S., Matullo,G., Vineis,P. (2008) Validation of biomarkers for the study of environmental carcinogens: a review. Biomarkers, 13, 505–534. Gao,W.M., Mady,H.H., Yu,G.Y., Siegfried,J.M., Luketich,J.D., Melhem,M.F., Keohavong, P. (2003) Comparison of p53 mutations between adenocarcinoma and squamous cell carcinoma of the lung: unique spectra involving G to A transitions and G to T transversions in both histologic types. Lung Cancer, 40, 141–150. Garritano,S., Gemignani,F., Voegele,C., Nguyen-Dumont,T., Le Calvez-Kelm,F., De Silva,D., Lesueur,F., Landi,S., Tavtigian,S.V. (2009) Determining the effectiveness of High Resolution Melting analysis for SNP genotyping and mutation scanning at the TP53 locus. BMC. Genet., 10, 1–5. Garte,S. (2008) Individual susceptibility and gene–environment interaction. In: Wild,C., Vineis,P., Garte,S. (eds.), Molecular Epidemiology of Chronic Diseases. John Wiley & Sons Ltd, West Sussex, pp. 55–69. GLOBOCAN 2008 (IARC) Section of Cancer Information (8/9/2011) Godschalk,R., Nair,J., Kliem,H.C., Wiessler,M., Bouvier,G., Bartsch,H. (2002a) Modified immunoenriched (32)P-HPLC assay for the detection of O(4)-ethylthymidine in human biomonitoring studies. Chem. Res. Toxicol.,15, 433–437. Godschalk,R., Nair,J., Schooten, F.J.,. Risch,A., Drings,P., Kayser,K., Dienemann H., Bartsch,H. (2002b) Comparison of multiple DNA adduct types in tumor adjacent human lung tissue: effect of cigarette smoking. Carcinogenesis, 23, 2081–2086. Gross,E., Kiechle,M., Arnold,N. (2001) Mutation analysis of p53 in ovarian tumors by DHPLC. J. Biochem. Biophys. Methods, 47, 73–81.
78
Guimaraes,D.P. and Hainaut,P. (2002) TP53: a key gene in human cancer. Biochimie, 84, 83–93. Győrffy,E., Anna,L., Győri,Z, Segesdi,J., Minárovits,J., Soltész,I., Kostic,S., Csekeő,A., Poirier,M.C., Schoket,B. (2004) DNA adducts in tumour, normal peripheral lung and bronchus, and peripheral blood lymphocytes from smoking and non-smoking lung cancer patients: correlations between tissues and detection by 32P-postlabelling and immunoassay. Carcinogenesis, 25, 1201–1209. Győrffy,E., Anna,L., Rudnai,P., Kovács,K., Schoket,B. (2006) Correlations among biomarkers. In: Farmer,P., Emeny,J.M. (eds.) Biomarkers of carcinogen exposure and early effect. ECNIS, Nofer Institute of Occupational Medicine, Lodz, Poland, pp. 143– 159. Győrffy,E., Anna,L., Kovács,K., Rudnai P., Schoket,B. (2008) Correlation between biomarkers of human exposure to genotoxins with focus on carcinogen–DNA adducts. Mutagenesis, 23, 1–18. Hainaut,P., Pfeifer,G.P. (2001) Patterns of p53 G→T transversions in lung cancers reflect the primary mutagenic signature of DNA-damage by tobacco smoke. Carcinogenesis, 22, 367–374. Hall,J.A., Saffhill,R. (1983) The incorpomaion of O6-methyldeoxyguauosine and O4methyldeoxythymidine monophosphates into DNA by DNA polymerases I and alpha. Nucl. Acids Res., 11, 4185–4193. Hamelin,R., Jego,N., Laurent-Puig,P., Vidaud,M., Thomas,G. (1993) Efficient screening of p53 mutations by denaturing gradient gel electrophoresis in colorectal tumors. Oncogene, 8, 2213–2220. Hamroun,D., Kato,S., Ishioka,C., Claustres,M., Beroud,C. and Soussi,T. (2006) The UMD TP53 database and website: update and revisions. Hum. Mutat., 27, 14–20. Hecht,S.S. (1999) DNA adduct formation from tobacco-specific N-nitrosamines. Mutat. Res., 424, 127–142. Hecht,S.S. (2003) Tobacco carcinogens, their biomarkers and tobacco-induced cancer. Nat. Rev. Cancer, 3, 733–744. Hecht,S.S. (2008) Carcinogen metabolites as biomarkers. In: Wild,C., Vineis,P., Garte,S. (eds.), Molecular Epidemiology of Chronic Diseases. John Wiley & Sons Ltd, West Sussex, pp. 97–110. Henschke,CI, Yip,R, Miettien,OS. (2006) Women’s susceptibility to tobacco carcinogens and survival after diagnosis of lung cancer. JAMA; 296, 180–184.
79
Hirvonen,A., Godschalk,R., Kirsch-Volders,M. (2008) Introduction. In: Hirvonen,A. (ed.) State of the Art of Genotype vs. Phenotype Studies. ECNIS, Nofer Institute of Occupational Medicine, Lodz, Poland, pp. 7–11. Hoffman,D., Hoffmann,I. & El-Bayoumy,K. (2001) The less harmful cigarette: A controversial issue. A tribute to Ernst L. Wynder. Chem. Res. Toxicol., 14, 767–790. Holmila,R., Husgafvel-Pursiainen,K. (2006) Analysis of TP53 gene mutations in human cancer: comparison of capillary electrophoresis single strand conformation polymorphism assay with denaturing gradient gel electrophoresis and direct sequencing. Cancer Detect. Prev., 30, 1–6. Holmila,R. (2010) TP53 tumour suppressor gene and p53 protein (2010) In: Harri,V. (ed.), Exposure-related human cancer: Molecular changes in sinonasal cancer and lung cancer, with focus on TP53 mutations. Juvenes Print, Tampere, pp. 19–20. Hung,R.J., Boffetta,P., Brockmöller,J., Butkiewicz,D., Cascorbi,I., Clapper,M.L., Garte,S., Haugen,A., Hirvonen,A., Anttila,S., Kalina,I., Le Marchand,L., London,S.J., Rannug,A., Romkes,M., Salagovic,J., Schoket,B., Gaspari,L., Taioli,E. (2003) CYP1A1 and GSTM1 genetic polymorphisms and lung cancer risk in Caucasian non-smokers: a pooled analysis. Carcinogenesis. 24, 875–882. Hung,R.J., McKay,J.D., Gaborieau,V., Boffetta,P., Hashibe,M., Zaridze,D., Mukeria,A., Szeszenia-Dabrowska,N., Lissowska,J., Rudnai,P., Fabianova,E., Mates,D., Bencko,V., Foretova,L., Janout,V., Chen,C., Goodman,G., Field,J.K., Liloglou,T., Xinarianos,G., Cassidy,A., McLaughlin,,J., Liu,G., Narod,S., Krokan,H.E., Skorpen,F., Elvestad,M.B., Hveem,K., Vatten,L., Linseisen,J., Clavel-Chapelon,F., Vineis,P., Bueno-de-Mesquita H.B., Lund,E., Martinez,C., Bingham,S., Rasmuson,T., Hainaut,P., Riboli,E., Ahrens W., Benhamou,S., Lagiou,P., Trichopoulos,D., Holcátová,I., Merletti,F., Kjaerheim,K., Agudo,A., Macfarlane,G., Talamini,R., Simonato,L., Lowry,R., Conway,D.I., Znaor,A., Healy,C., Zelenika,D., Boland,A., Delepine,M., Foglio,M., Lechner,D., Matsuda,F., Blanche,H., Gut,I., Heath,S., Lathrop,M., Brennan,P. (2008) A susceptibility locus for lung cancer maps to nicotinic acetylcholine receptor subunit genes on 15q25. Nature, 452, 633–637. Hu,Y., McDermott,M.P., Ahrendt,S.A. (2005) The p53 codon 72 proline allele is associated with p53 gene mutations in non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res., 11, 2502–2509. Husgafvel-Pursiainen,K., Ridanpää,M., Antilla,S., Vainio,H. (1995) p53 and ras gene mutations in lung cancer: implications for smoking and occupational exposures. J. Occup. Environ. Med. , 37, 69–76. Husgafvel-Pursiainen,K. and Kannio,A. (1996) Cigarette smoking and p53 mutations in lung cancer and bladder cancer. Environ. Health Perspect., 104, 553–556. Husgafvel-Pursiainen,K., Boffetta,P., Kannio,A., Nyberg,F., Pershagen,G., Mukeri,A., Constantinescu,V., Fortes,C., Benhamou,S. (2000) p53 Mutations and exposure to
80
environmental tobacco smoke in a multicenter study on lung cancer. Cancer Res., 60, 2906–2911. Husgafvel-Pursiainen,K. (2004) Genotoxicity of environmental tobacco smoke: a review. Mutat. Res., 567, 427–445. Hussain,S.P., Harris,C.C. (1999) p53 mutation spectrum and load: the generation of hypotheses linking the exposure of endogenous or exogenous carcinogens to human cancer. Mutat. Res., 428, 23–32. Hussain,S.P., Amstad,P., Raja,K., Sawyer,M., Hofseth,L., Shields,P.G., Hewer,A., Phillips,D.H., Ryberg,D., Haugen, A., Harris,C.C. (2001) Mutability of p53 hotspot codons to benzo(a)pyrene diol epoxide (BPDE) and the frequency of p53 mutations in nontumorous human lung. Cancer Res., 61, 6350–6355. International Agency for Research on Cancer. IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans. (1987) Vol. 1-47, Suppl. 7, Overall evaluations of carcinogenecity, and updating of IARC monographs. Lyon, France International Agency for Research on Cancer. IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans (2004) Vol. 83, Tobacco smoke and involuntary smoking. Lyon, France International Agency for Research on Cancer. IARC TP53 DATABASE (2008) Data downloads R13 (http://www-p53.iarc.fr/Somatic.html9) International Agency for Research on Cancer. IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans (2008) Vol. 95, Household use of solid fuels and hightemperature frying. Lyon, France Jamrozik,E., de Klerk, N., Musk,A.W. (2011) Asbestos-related disease. Intern. Med. J., 41, 372–380. Kaiser,S., Gommer,A.M. (RIVM). Lung cancer - Mortality. In: EUPHIX (EU Public Health Information & Knowledge System), EUphact. Bilthoven: RIVM,
EUphact\ Health Status\ Diseases, disorders, injuries\ Cancer\ Lung cancer, 28 May 2008. Keller,G., Hartmann,A., Mueller,J., Hofler,H. (2001) Denaturing high pressure liquid chromatography (DHPLC) for the analysis of somatic p53 mutations. Lab. Invest. , 81, 1735–1937. Ko,L.J., Prives,C. (1996) p53: puzzle and paradigm. Genes. Dev., 10, 1054–1072. Kondo,K., Tsuzuki,H., Sasa,M. Sumitomo,M., Uyama,T., Monden,Y. (1996) A doseresponse relationship between the frequency of p53 mutations and tobacco consumption in lung cancer patients. J. Surg. Oncol. , 61, 20–26.
81
Kopplin,A., Eberle-Adamkiewicz,G., Glüsenkamp,K.H., Nehls,P., Kirstein,U. (1995) Urinary excretion of 3-methyladenine and 3-ethyladenine after controlled exposure to tobacco smoke. Carcinogenesis, 16, 2637–2641. Kovács,B., Mátyás,L. , Simon,G. (2005) Azbeszt a házban -. felméréstől a mentesítésig, Levegő Munkacsoport tanulmánya a KVVM megbízásából. http://www.kvvm.hu/cimg/documents/AZBESZTSZAKMAI.pdf. - Letöltés 2011-0705.). Kovács,K., Anna,L., Rudnai,P., Schoket,B. (2011) Recovery of bulky DNA adducts by the regular and a modified 32P-postlabelling assay; influence of the DNA-isolation method. Mutat. Res., 721, 95–100. Landi,S., Gemignani,F., Canzian,F., Gaborieau,V., Barale,R., Landi,D., SzeszeniaDabrowska,N., Zaridze,D., Lissowska,J., Rudnai,P., Fabianova,E., Mates,D., Foretova,L., Janout,V., Bencko,V., Gioia-Patricola,,L., Hall,J., Boffetta,P., Hung,R.J., Brennan,P. (2006) DNA repair and cell cycle control genes and the risk of young-onset lung cancer. Cancer Res., 66, 11062–11069. Le Calvez,F., Ahman,A., Tonisson,N., Lambert,J., Temam,S., Brennan,P., Zaridze,D.G., Metspalu,A., Hainaut,P. (2005a) Arrayed primer extension resequencing of mutations in the TP53 tumor suppressor gene: comparison with denaturing HPLC and direct sequencing. Clin. Chem., 51, 1284–1287. Le Calvez,F., Mukeria,A., Hunt,J.D., Kelm,O., Hung,R.J., Taniere,P., Brennan,P., Boffetta,P., Zaridze,D.G., Hainaut,P. (2005b) TP53 and KRAS mutation load and types in lung cancers in relation to tobacco smoke: distinct patterns in never, former, and current smokers. Cancer Res., 65, 5076–5083. Levi,F., Lucchini,F., Negri,E., La Vecchia,C. (2004) Trends in mortality from major cancers in the European Union, including acceding countries in 2004. Cancer, 101, 2843–2850. Lodivici,M., Bigagli,M. (2009) Biomarkers of induced active and passive smoking damage. Int. J. Environ. Res. Public Health, 6, 874–888. Lewis,S.J., Cherry N.M., Niven R.M., Barber,P.V., Povey A.C. (2004) Associations between smoking, GST genotypes and N7-methylguanine levels in DNA extracted from bronchial lavage cells. Mutat. Res., 559, 11–18. Marrogi,A.J., Mechanic,L.E., Welsh,J.A., Bowman,E.D., Khan,M.A., Enewold,L., Shields,P.G., Harris,C.C. (2005) TP53 mutation spectrum in lung cancer is not different in women and men. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. , 4, 1031–1033. Mazars,R., Pujol,P., Maudelonde,T., Jeanteur,P., Theillet,C. (1991) p53 mutations in ovarian cancer: a late event? Oncogene, 6, 1685–1690.
82
Mándi,A., Posgay,M., Vadász,P., Major,K., Rödelsperger,K., Tossavainen,A., Ungváry, G., Woitowitz,H.-J., Galambos,E., Németh,L., Soltész,I., Egerváry,M., Böszörményi,N.G. (2001) Pleuropulmonalis rosszindulatú daganatok és becsült foglalkozási azbesztexpozíció Magyarországon. Orvosi Hetilap, 141, 9–13. Mechanic,L.E., Marrogi,A.J., Welsh,J.A., Bowman,E.D., Khan,M.A., Enewold,L., Zheng,Y.L., Chanock,S., Shields,P.G., Harris,C.C. (2005) Polymorphisms in XPD and TP53 and mutation in human lung cancer. Carcinogenesis, 26, 597–604. Miller,E.C., Miller,J.A. (1981) Mechanisms of chemical carcinogenesis. Cancer, 47, 1055–1064. Moreno-Smith,M., Lutgendorf,S.K., Sood,A.K. (2010) Impact of stress on cancer metastasis. Future Oncol., 6, 1863–1881. Munnia,A., Bonassi,S., Verna,A., Quaglia,R., Pelucco,D., Ceppi,M., Neri,M., Buratti,M., Taioli,E., Garte,S., Peluso,M. (2006) Bronchial malondialdehyde DNA adducts, tobacco smoking, and lung cancer. Free Radic. Biol. Med., 41, 1499–1505. Mustonen,R., Schoket,B., Hemminki,K. (1993) Smoking-related DNA adducts: 32Ppostlabeling analysis of 7-methylguanine in human bronchial and lymphocyte DNA. Carcinogenesis, 14, 151–154. Okazaki,I, Sugita,M, Matsuki,H, Billah,SM, Watanabe,T. (2010) Additional candidates to conventional genes susceptible for lung cancer and changing trend in Japan. Oncol. Rep. 23, 1493–1500. Nagy,Cs., Juhász,A., Beale,L., Páldy,A. (2011) Mortality amenable to health care and its relation to socio-economic status in Hungary, 2004-08. Eur. J. Public. Health, Sep 30. [Epub ahead of print] Nakamura,M., Watanabe,T., Yonekawa,Y., Kleihues,P. and Ohgaki,H. (2001) Promoter methylation of the DNA repair gene MGMT in astrocytomas is frequently associated with G:C→ A:T mutations of the TP53 tumor suppressor gene. Carcinogenesis, 22, 1715–1719. National Research Council: Report of the Committee on the Biological Effects of Ionizing Radiation: Health risk of radon and other internally deposited alpha-emitters (1988) BEIR, IV. Washington, DC, National Academy Press O'Reilly,K.M, Mclaughlin,A.M., Beckett,W.S., Sime,P.J. (2007) Asbestos-related lung disease. American Family Physician, 75, 683–688. O'Toole,S.M., Pegg,A.E. and Swenberg,J.A. (1993) Repair of O6-methylguanine and O4-methylthymidine in F344 rat liver following treatment with 1,2-dimethylhydrazine and O6-benzylguanine. Cancer Res., 53, 3895–3898.
83
Ozawa,S., Schoket,B., McDaniel,L.P., Tang,Y.M., Ambrosone,C.B., Kostic,S., Vincze,I., Kadlubar,F.F. (1999) Analyses of bronchial bulky DNA adduct levels and CYP2C9, GSTP1 and NQO1 genotypes in a Hungarian study population with pulmonary diseases. Carcinogenesis, 20, 991–995. Peluso,M., Amasio,E., Bonassi,S., Munnia,A., Altrupa,F., Parodi,S. (1997) Detection of DNA adducts in human nasal mucosa tissue by 32P-postlabeling analysis. Carcinogenesis, 18, 339–344. Peluso,M., Neri,M., Margarino,G., Mereu,C., Munnia,A., Ceppi,M., Buratti,M., Felletti,R., Stea,F., Quaglia,R., Puntoni,R., Taioli,E., Garte,S., Bonassi,S. (2004) Comparison of DNA adduct levels in nasal mucosa, lymphocytes and bronchial mucosa of cigarette smokers and interaction with metabolic gene polymorphisms. Carcinogenesis, 25, 2459–65. Peluso,M., Munnia,A., Hoek,G. Krzyzanowski,M, Veglia,F, Airoldi,L, Autrup,H, Dunning,A, Garte,S, Hainaut,P, Malaveille,C, Gormally,E, Matullo,G, Overvad,K, Raaschou-Nielsen,O, Clavel-Chapelon,F, Linseisen,J, Boeing,H, Trichopoulou,A, Trichopoulos,D, Kaladidi,A, Palli,D, Krogh,V, Tumino,R, Panico,S, Bueno-DeMesquita,HB, Peeters,PH, Kumle,M, Gonzalez,CA, Martinez,C, Dorronsoro,M, Barricarte,A, Navarro,C, Quiros,JR, Berglund,G, Janzon,L, Jarvholm,B, Day,NE, Key,TJ, Saracci,R, Kaaks,R, Riboli,E, Vineis,P. (2005) DNA adducts and lung cancer risk: a prospective study. Cancer Res., 65, 8042–8048. Perera,F.P., Weinstein,I.B. (1982) Molecular epidemiology and carcinogen-DNA adduct detection: new approaches to studies of human cancer causation. J. Chronic Dis., 35, 581–600. Petruzzelli,S., Tavanti,L.M., Celi,A., Giuntini,C. (1996) Detection of N7methyldeoxyguanosine adducts in human pulmonary alveolar cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 15, 216–223. Pfeifer,G.P. (2000a) Involvement of DNA damage and repair in mutational spectra. Mutat. Res., 450, 1–3. Pfeifer,G.P. (2000b) p53 mutational spectra and the role of methylated CpG sequences. Mutat. Res., 450, 155–166. Pfeifer,G.P., Denissenko,M.F., Olivier,M., Tretyakova,N., Hecht,S.S., Hainaut,P. (2002) Tobacco smoke carcinogens, DNA damage and p53 mutations in smokingassociated cancers. Oncogene, 21, 7435–7451. Phillips,D.H., Hewer,A., Martin,C.N., Garner,R.C., King,M.M. (1988). Correlation of DNA adduct levels in human lung with cigarette smoking. Nature, 336, 790–792. Phillips,D.H., Schoket,B., Hewer,A., Bailey,E., Kostic,S., Vincze,I. (1990) Influence of cigarette smoking on the levels of DNA adducts in human bronchial epithelium and white blood cells. Int. J. Cancer, 46, 569–575
84
Phillips,D.H., Castegnaro,M. (1999) Standardization and validation of DNA adduct postlabelling methods: report of interlaboratory trials and production of recommended protocols, Mutagenesis, 14, 301–315. Phillips,D.H. (2002) REVIEW, Smoking-related DNA and protein adducts in human tissues. Carcinogenesis, 23, 1979–2004 Phillips,D.H. (2008) Biomarkers of exposure: Adducts. In: Wild,C., Vineis,P., Garte,S. (eds.), Molecular Epidemiology of Chronic Diseases. John Wiley & Sons Ltd, West Sussex, pp. 111–125. Prevost,V., Shuker,D.E. (1996) Cigarette smoking and urinary 3-alkyladenine excretion in man. Chem. Res. Toxicol., 9, 439–444. Quinlan,D.C., Davidson,A.G., Summers,C.L. Warden,H.E., Doshi,H.M. (1992) Accumulation of p53 protein correlates with a poor prognosis in human lung cancer. Cancer Res. , 52, 4828–4831. Robins,H., Elexe,G., Harris,S., Levine,A.J. (2005) The first twenty-five years of p53 research. In: Hanaiut,P., Wiman,K.G. (eds.), 25 Years of p53 Research. Springer, Dordrecht, pp. 1–25. Robert,V., Michel,P., Flaman,J.M., Chiron,A., Martin,C., Charbonnier,F., Paillot,B., Frebourg,T. (2000) High frequency in esophageal cancers of p53 alterations inactivating the regulation of genes involved in cell cycle and apoptosis. Carcinogenesis., 21, 563– 565. Rodelsperger,K., Mandi,A., Tossavainen,A., Bruckel,B., Barbisan,P., Woitowitz,H.J. (2001) Inorganic fibres in the lung tissue of Hungarian and German lung cancer patients. Int. Arch. Occup. Environ. Health, 74, 133–138. Romkes,M., Schoket,B., Seidegard,J., Strange,R.C., Stucker,I., To-Figueras,J., Garte,S.. (2003) Polymorphisms in CYP1A1, GSTM1, GSTT1 and lung cancer below the age of 45 years. Int. J. Epidemiol., 32, 60–63. Russell,P. (2002). iGenetics. Pearson Education ed, San Francisco, pp. 187–189. Ryberg,D., Hewer,A., Phillips,D.H., Haugen,A. (1994) Different susceptibility to smoking-induced DNA damage among male and female lung cancer patients. Cancer Res., 54, 5801–5803. Saffary,B., Bernstein,L., Hong,D.C. Sullivan-Halley,J., Runnebaum,I.B., Grill,H.J., Jones,L.A., El-Naggar,A., Press,M.F. (2005) Association of p53 mutations and a codon 72 single nucleotide polymorphism with lower overall survival and responsiveness to adjuvant radiotherapy in endometrioid endometrial carcinomas. Int. J. Gynecol. Cancer., 15, 952–963.
85
Saffhill,R., Hall,J.A. (1985) The incorporation of O6-methyldeoxyguanosine monophosphate and O4-methyldeoxythymidine monophosphate into polynucleotide templates leads to errors during subsequent in vitro DNA synthesis. Chem. Biol. Interact., 56, 363–370. Samet,M.J., Avila-Tang,E., Boffetta,P., Hannan,L.M., Olivo-Marston,S., Thun,M.J., Rudin,C.M. (2009) Lung Cancer in Never Smokers: Clinical Epidemiology and Environmental Risk Factors, Clin. Cancer Res., 15, 5626–5645. Scherer,E., Timmer,A.P., Emmelot,P. (1980) Formation by diethylnitrosamine and persistence of O4-ethylthymidine in rat liver DNA in vivo. Cancer Lett., 10, 1–6. Schoket,B., Hewer,A., Grover,P.L., Phillips,D.H. (1988) Covalent binding of components of coal-tar, creosote and bitumen to the DNA of the skin and lungs of mice following topical application. Carcinogenesis, 9, 1253–1258.; Schoket,B., Lévay,K., Phillips,D.H., Vincze,I. (1989a) 32P-postlabelling analyis of DNA adduct of benzo(a)pyrene formed in complex metabolic activation system in vitro, Cancer Letters, 48, 67–75. Schoket,B., Hewer,A., Grover,P.L., Phillips,D.H. (1989b) 32P-postlabelling analysis of DNA adducts in the skin of mice treated with petrol and diesel engine lubricating oils and exhaust condensates. Carcinogenesis, 10, 1485–1490. Schoket,B., Horkay,I., Kósa,A., Páldeák,L., Hewer,A., Grover,P.L., Phillips,D.H. (1990) Formation of DNA adducts in the skin of psoriasis patients, in human skin in organ culture, and in mouse skin and lung following topical application of coal-tar and juniper tar. J. Invest. Dermatol., 94, 241–246. Schoket,B., Phillips,D.H., Hewer,A., Vincze,I. (1991) 32P-postlabelling detection of aromatic DNA adducts in peripheral blood lymphocytes from aluminium production plant workers. Mutat. Res., 260, 89–98.; Schoket,B., Phillips,D.H., Poirier,M.C., Vincze,I. (1993a) DNA adducts in peripheral blood lymphocytes from aluminum production plant workers determined by 32Ppostlabeling and enzyme-linked immunosorbent assay. Environ. Health Perspect. 99, 307–309; Schoket,B., Kostic,S., Vincze,I. (1993b) Determination of smoking-related DNA adducts in lung-cancer and non-cancer patients. IARC Sci Publ., 124, 315–319. Schoket,B., Phillips,D.H., Kostic,S. and Vincze,I. (1998) Smoking-associated bulky DNA adducts in bronchial tissue related to CYP1A1 MspI and GSTM1 genotypes in lung patients. Carcinogenesis, 19, 841–846. Schoket,B. (1999a) DNA damage in humans exposed to environmental and dietary polycyclic aromatic hydrocarbons. Mutat. Res., 424, 143–153.
86
Schoket,B., Poirier,M.C., Mayer,G., Török,G., Kolozsi-Ringelhann,A., Bognár,G., Bigbee,W.L., Vincze,I., (1999b) Biomonitoring of human genotoxicity induced by complex occupational exposures. Mutat. Res. , 445, 193–203. Schoket,B. (2004) A dohányzásból származó karcinogenezisben. Magyar Onkológia, 48, 201–205.
DNS-adduktok
szerepe
a
Schoket,B., Juhász,A., Páldy,A. (2010) Geographical inequities in distribution of premature lung cancer mortality at the age of 15 to 64 years in Hungary, ECNIS Newsletter, 1, 6–7. ECNIS, Nofer Institute of Occupational Medicine, Lodz, Poland. Schoket,B. (2011) Biomarkers in Environmental Carcinogenesis. In: Encyclopedia of Environmental Health, Five-Volume Set, Ed-in-Chief: J.O. Nriagu, Elsevier, 378–388. Schulte,P.A., Rothman,N., Schottenfeld,D. (1993) Design considerations in molecular epidemiology. In: Schulte,P.A., Perera,F.P. (eds.), Molecular Epidemiology: Principles and Practices. San Diego (CA): Academic Press, Inc.;. pp. 159 – 198. Schwartz,A.G., Ruckdeschel,J.C. (2006) Familial lung cancer: genetic susceptibility and relationship to COPD. Am. J. Respir. Crit. Care Med., 173, 16–22. Seo,K.Y., Jelinsky,S.A., Loechler,E.L. (2000) Factors that influence the mutagenic patterns of DNA adducts from chemical carcinogens. Mutat. Res., 463, 215–246. Smardova,J, Smarda,J, Koptikova,J. (2005) Functional analysis of p53 tumor suppressor in yeast. Differentiation, 73, 261–277. Smith,L.E., Denissenko,M.F., Bennett,W.P., Li,H., Amin,S., Tang,M., Pfeifer,G.P. (2000) Targeting of lung cancer mutational hotspots by polycyclic aromatic hydrocarbons. J. Natl. Cancer Inst., 92, 803–811. Sorlie,T., Johnsen,H., Vu,P., Lind,G.E., Lothe,R., Borresen-Dale,A.L. (2005) Mutation screening of the TP53 gene by temporal temperature gradient gel electrophoresis. Methods Mol. Biol., 291, 207–216. Szilágyi,T. (2004) Tobacco Control in Hungary. Past, present, future. In: Health 21 Hungarian Foundation (ed.). ISBN 963 214 991 2 Szyfter,K., Hemminki,K., Szyfter,W., Szmeja,Z., Banaszewski,J., Yang,K. (1994) Aromatic DNA adducts in larynx biopsies and leukocytes. Carcinogenesis, 15, 2195– 2199. Szymanowska,A., Jassem,E., Dziadziuszko,R., Borg,A., Limon,J., Kobierska-Gulida, G., Rzyman,W., Jassem,J. (2006) Increased risk of non-small cell lung cancer and frequency of somatic TP53 gene mutations in Pro72 carriers of TP53 Arg72Pro polymorphism. Lung Cancer, 52, 9–14.
87
Taioli,E., Gaspari,L., Benhamou,S., Boffetta,P., Brockmoller,J., Butkiewicz,D., Cascorbi,I., Clapper,M.L., Dolzan,V., Haugen,A., Hirvonen,A., HusgafvelPursiainen,K., Kalina,I., Kremers,P., Le Marchand,L., London,S., Rannug,A., Romkes,M., Schoket,B., Seidegard,J., Strange,R.C., Stucker,I., To-Figueras,J., Garte,S. (2003) Polymorphisms in CYP1A1, GSTM1, GSTT1 and lung cancer below the age of 45 years. Int. J. Epidemiol., 32, 60–63. Taniere,P., Martel-Planche,G., Maurici,D., Lombard-Bohas,C., Scoazec,J.Y., Montesano,R., Berger,F., Hainaut,P. (2001) Molecular and clinical differences between adenocarcinomas of the esophagus and of the gastric cardia. Am. J. Pathol., 158, 33–40. Timofeeva,M., Kropp,S., Sauter,W., Beckmann,L., Rosenberger,A., Illig,T., Jäger,B., Mittelstrass,K., Dienemann,H.; LUCY-Consortium, Bartsch,H., Bickeböller,H., ChangClaude,J., Risch,A., Wichmann,H.E. (2010) Genetic polymorphisms of MPO, GSTT1, GSTM1, GSTP1, EPHX1 and NQO1 as risk factors of early-onset lung cancer. Int. J. Cancer, 127, 1547–1561. Tompa,A. (2006a) Biomarkerek alkalmazása a rákprevencióban, Orvosi Hetilap, 147, 627–636. Tompa,A. (2006b) A rák elsôdleges megelôzésének elmélete és gyakorlata Krompecher emlékelőadás, Magyar Onkológia, 51, 7–21. Toniolo,P., Bofetta,P., Shiker,D.E.G., Nothman,N., Hulka,B., Pearce,N. (1997) Application of biomarkers in cancer epidemiology, Workshop report. In: Toniolo,P, Bofetta,P., Shiker,D.E.G., Nothman,N., Hulka,B., Pearce,N. (eds.), Application of biomarkers in cancer epidemiology. IARC Scinetific Publications, No. 142, International Agency for Research on cancer, Lyon, pp. 1–18. Tomizawa,Y., Kohno,T., Fujita,T., Kiyama,M., Saito,R., Noguchi,M., Matsuno,Y., Hirohashi,S., Yamaguchi,N., Nakajima,T., Yokota,J. (1999) Correlation between the status of the p53 gene and survival in patients with stage I non-small cell lung carcinoma. Oncogene, 18., 1007–1014. Tyczynski,J.E., Bray,F., Parkin,D.M. (2003) Lung cancer in Europe in 2000: epidemiology, prevention, and early detection. Lancet Oncol., 4, 45–55. Tyczynski,J.E., Bray,F., Aareleid,T. (2004) Lung cancer mortality patterns in selected central, eastern and southern European countries. Int. J. Cancer, 109, 598–610. Yoon,J.H., Besaratinia,A., Feng,Z., Tang,M.S., Amin,S., Luch,A. and Pfeifer,G.P. (2004) DNA damage, repair, and mutation induction by (ţ)-Syn and (-)-antidibenzo[a,l]pyrene-11,12-diol-13,14-epoxides in mouse cells. Cancer Res., 64, 7321– 7328. van Schooten,F.J., Hillebrand,M.J.X., Leeuwen,F.E., van Zandwijk, N., den Engelse,L., Kriek,E. (1992) Polycyclic aromatic hydrocarbon-DNA adducts in white blood cells
88
from lung cancer patients: no correlation with adduct levels in lung. Carcinogenesis, 13, 987–993. Veglia,F., Matullo,G., Vineis,P. (2003) Bulky DNA adducts and risk of cancer: metaanalysis, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 12, 157–160 Vineis,P., Veglia,F., Benhamou,S., Butkiewicz,D., Cascorbi,I., Clapper,M.L., Dolzan,V., Haugen,A., Hirvonen,A., Ingelman-Sundberg,M., Kihara,M., Kiyohara,C., Kremers,P., Le Marchand,L., Ohshima,S., Pastorelli,R., Rannug,A., Romkes,M., Schoket,B., Shields,P., Strange,R.C., Stucker,I., Sugimura,H., Garte,S., Gaspari,L., Taioli,E. (2003) CYP1A1 T3801 C polymorphism and lung cancer: a pooled analysis of 2451 cases and 3358 controls. Int. J. Cancer, 104, 650–657. Vineis,P., Veglia,F., Garte,S., Malaveille,C., Matullo,G., Dunning,A., Peluso,M., Airoldi,L., Overvad,K., Raaschou-Nielsen,O., Clavel-Chapelon,F., Linseisen,J.P., Kaaks,R., Boeing,H., Trichopoulou,A., Palli,D., Crosignani,P., Tumino,R., Panico,S., Bueno-De-Mesquita,H.B., Peeters,P.H., Lund,E., Gonzalez,C.A., Martinez,C., Dorronsoro,M., Barricarte,A., Navarro,C., Quiros,J.R., Berglund,G., Jarvholm,B., Day,N.E., Key,T.J., Saracci,R., Riboli,E., Autrup,H. (2007) Genetic susceptibility according to three metabolic pathways in cancers of the lung and bladder and in myeloid leukemias in nonsmokers. Ann. Oncol., 18, 1230–1242. Vineis,P., Perera,F. (2007) Molecular epidemiology and biomarkers in etiologic cancer research: the new in light of the old. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 16, 1954– 1965. Wiencke,J.K., Thurston,S.W., Kelsey,K.T., Várkonyi,A., Wain,J.C., Mark,E.J. and Christiani,D.C. (1999) Early age at smoking initiation and tobacco carcinogen DNA damage in the lung. J. Natl. Cancer Inst., 91, 614–619 Wikman,H., Thiel,S., Jäger,B., Schmezer,P., Spiegelhalder,B., Edler,L., Dienemann,H., Kayser,K., Schulz,V., Drings,P., Bartsch,H., Risch,A. (2001) Relevance of Nacetyltransferase 1 and 2 (NAT1, NAT2) genetic polymorphisms in non-small cell lung cancer susceptibility. Pharmacogenetics, 11, 157–168. Wani,A.A., D'Ambrosio,S.M. (1987) Immunological quantitation of O4-ethylthymidine in alkylated DNA: repair of minor miscoding base in human cells. Carcinogenesis, 8, 1137–1144. Wani,A.A., Wani,G., D'Ambrosio,S.M. (1990) Repair of O4-alkylthymine damage in human cells. Basic Life Sci., 53, 417–435. WHO (2008) The WHO Global InfoBase. European Health for All Database (HFADB): http://data.euro.who.int/hfadb/2009 (letöltés: 2012) WHO Fact sheet No 310 (2008) Top 10 Causes of Death: The 10 leading causes of death by broad income group, www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310_2008.pdf
89
Wild,C., Seymour,S., Vineis,P. (2008) Introduction: Why molecular epidemiology? In: Wild,C., Vineis,P., Garte,S. (eds.), Molecular Epidemiology of Chronic Diseases. John Wiley & Sons Ltd, West Sussex, pp. 1–7. Wogan, G.N. (1992) Molecular epidemiology in cancer risk assessment and prevention: recent progress and avenues for future research. Env. Health Persp., 98, 167–179. Wu,J.Y., Wang,J., Lai,J.C., Cheng,Y.W., Yeh,K.T., Wu,T.C., Cheng,C.Y., Lee,H. (2008) Association of O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) promoter methylation with p53 mutation occurrence in non-small cell lung cancer with different histology, gender, and smoking status. Ann. Surg. Oncol., 15, 3272–3277. Zhao,C., Georgellis,A., Flato,S., Palmberg,L., Thunberg,E., Hemminki,K. (1997) DNA adducts in human nasal mucosa and white blood cells from smokers and non-smokers. Carcinogenesis, 18, 2205– 2208.
90
Rövidítések jegyzéke BPDE–DNS = (±)-7b,8α-dihidroxy-9α,10 α -epoxy-7,8,9,10-tetrahidrobenzo[a]pirén7,8-diol 9,10-epoxid-DNS CE-SSCP = automatizált - egyszál konformáció polimorfizmus vizsgálat DEN = dietilnitrózamin DGGE = denaturáló gradiens gélelektroforézis EDTA = etiléndiamintetraecetsav Frames. = framesift, vagy kereteltolódási mutáció HPLC = nagyfelbontású folyadék kromatográfia IARC = Nemzetközi Rákkutató Ügynökség MGMT = O6-metilguanin-DNS metiltranszferáz n = vizsgált személyek száma ND = nem definiált NNK = 4-(N-metilnitrozamino)-1-(3-piridil)-1-butanon NSCLC = nemkissejtes tüdőrák O4-etT = O4-etiltimidin PAH = policikusos aromás szénhidrogén PCR = polimeráz láncreakció PEI = polietilénimin SCC = laphámrák SDS = nátrium-dodecil-szulfát TAE = Tris-Acetát-EDTA
91
Publikációk Doktori (PhD) munkához kapcsolódó publikációk szakfolyóiratokban illetve szakkönyvben Anna,L., Kovács K., Győrffy,E., Schoket,B., Nair,J. (2011) Smoking-related O4ethylthymidine formation in human lung tissue and comparisons with bulky DNA adducts, Mutagenesis, 26, 523-527. Impakt faktor: 3,98 Anna,L., Holmila,R., Kovács,K., Győrffy,E., Győri,Z., Segesdi,J., Minárovits,J., Soltész,I., Kostic,S., Csekeő,A., Husgafvel-Pursiainen,K., Schoket,B. (2010) TP53 tumorszupresszor génmutáció vizsgálatok magyar tüdőrákos betegcsoportban. Egészségtudomány, 54, 57-69. Anna,L., Holmila,R., Kovács,K., Győrffy,E., Győri,Z., Segesdi,J., Minárovits,J., Soltész,I., Kostic,S., Csekeő,A., Husgafvel-Pursiainen,K., Schoket,B. (2009) Relationship between TP53 tumour suppressor gene mutations and smoking related bulky DNA adducts in a lung cancer study population from Hungary. Mutagenesis, 24, 475-480. Impakt faktor: 3,54 Győrffy,E., Anna,L., Győri,Z., Segesdi,J., Minárovits,J., Soltész,I., Kostic,S., Csekeő,A., Poirier,M.C., Schoket,B. (2004) DNA adducts in tumour, normal peripheral lung and bronchus, and peripheral blood lymphocytes from smoking and non-smoking lung cancer patients: correlations between tissues and detection by 32P-postlabelling and immunoassay. Carcinogenesis, 25, 1201–1209. Impakt faktor: 5,40 Győrffy,E., Anna,L., Kovács,K., Rudnai P., Schoket,B. (2008) Correlation between biomarkers of human exposure to genotoxins with focus on carcinogen–DNA adducts. Mutagenesis, 23, 1–18. Impakt faktor: 3,16 Gallo,V., Khan,A., Gonzales,C., Phillips,D.H., Schoket,B., Györffy,E., Anna,L., Kovács,K., Møller,P., Loft,S., Kyrtopoulos,S., Matullo,G., Vineis,P. (2008) Validation of biomarkers for the study of environmental carcinogens: a review. Biomarkers, 13, 505-534. Impakt faktor: 1,73 Győrffy,E., Anna,L., Rudnai,P., Kovács,K., Schoket,B. (2006) Correlations among biomarkers. In: Farmer,P., Emeny,J.M. (eds.), Biomarkers of carcinogen exposure and early effect. ECNIS, Nofer Institute of Occupational Medicine, Lodz, Poland, pp. 143– 159.
92
További publikációk szakfolyóiratokban, és szakkönyvben Kovács,K., Anna,L., Rudnai,P., Schoket,B. (2011) Recovery of bulky DNA adducts by the regular and a modified 32P-postlabelling assay; influence of the DNA-isolation method. Mutat. Res., 721, 95–100. Impakt faktor: 2,56 Kovács,K., Győrffy,E. Anna,L., Schoket,B. (2006) Környezeti policiklusos aromás szénhidrogén expozíció biomonitorozása vizelet 1-hidroxipirén tartalmának meghatározásával – gyermekekre és felnőttekre vonatkozó szakirodalmi adatok összehasonlítása. Egészségtudomány, 50, 188–193. Georgiadis,P., Kovács,K., Kaila,S., Makedonopoulou,P., Anna,L., Poirier,M.C., Knudsen,L.E., Schoket,B., Kyrtopoulos,S.A. Development and validation of a direct sandwich chemiluminescence immunoassay (SCIA) for measuring DNA adducts of benzo[a]pyrene and other polycyclic aromatic hydrocarbons. Mutagenesis. May 18. [Epub ahead of print] Impakt faktor: 3,98 Kovács,K., Győrffy,E., Anna,L., Schoket,B.: 1-Hydroxypyrene (2007) In: Vineis,P., V. Gallo,V. (eds.), Epidemiological concepts of validation of biomarkers for the identification/quantification of environmental carcinogenic exposures. ECNIS, The Nofer Institute of Occupational Medicine, Lodz, Poland, pp. 75–82.
93
Köszönetnyilvánítás Doktori kutatásaimat az Országos Környezetegészségügyi Intézet (OKI) biológus munkatársaként végeztem. Szeretném megköszönni Dr. Dura Gyulának, az Országos Környezetegészségügyi Intézet megbízott főigazgatójának és Dr. Rudnai Péternek, az Intézet Környezetegészségügyi Hatásvizsgálati Főosztályának vezetőjének és 2008. óta a Molekuláris Környezet-epidemiológiai Osztály vezetőjének mindennemű támogatását és nagyvonalú segítőkészségét, amely lehetővé tette, hogy kutatásaim során az intézmény szellemi és technikai lehetőségeit igénybe vehettem, és doktori fokozatszerzésre felkészülhettem. Kiemelten köszönöm témavezetőmnek, Dr. Schoket Bernadettenek, 2008-ig az Intézet Molekuláris Környezet-epidemiológiai Osztálya, korábban Alkalmazott Biokémiai Osztálya vezetőjének munkám tudományos irányítását a kezdetektől a befejezésig. A kutatásokat az ő koncepciói alapján, az általa sikeresen megpályázott hazai és nemzetközi pályázatok keretében, és azok anyagi támogatásával végeztem. Külön köszönöm a publikációk és az értekezés elkészítésében nyújtott odaadó szakmai és emberi segítségét. Köszönöm a Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Karán Professzor Dr. Ember Istvánnak, az Orvosi Népegészségtani Intézet intézetvezető egyetemi tanárának az értekezés elkészítése során, és a fokozatszerzés folyamatában nyújtott értékes segítséget. Az O4-etiltimidin méréseket a Német Rákkutató Központban (Deutsches Krebsforschungszentrum, DKFZ), Heidelbergben végeztem néhai Dr. Jagadeesan Nair vezetésével. Az általa nyújtott szakmai támogatásért köszönettel adózom emlékének. Köszönetet mondok Dr. Roger Godschalknak (Maastricht University, Maastricht) és Dr. Helmut Bartschnak (Deutsches Krebsforschungszentrum, DKFZ) az O 4-etiltimidin vizsgálati eredményekből készített cikk elkészítéséhez nyújtott értékes szakmai tanácsaiért. Köszönettel tartozom Dr. Kirsti Husgafvel-Pursiainennek a Finn Munkaegészségügyi Intézet (Finnish Institute of Occupational Health, FIOH, Helsinki, Finnország) professzorának a TP53 mutáció vizsgálatok szakmai irányításáért és Dr. Reetta Holmilának a TP53 mutációs vizsgálatok végzésében nyújtott értékes segítségért finnországi kutatómunkám alatt bilaterális projektjeink során. Köszönöm továbbá közreműködésüket az eredményekből készült cikk megírásában. Megköszönöm munkacsoportunk minden tagjának az Országos Környezetegészségügyi Intézetben (OKI) az együttműködésüket a kutatási projektek végrehajtása során. Kiemelten köszönöm Dr. Győrffy Erikának közreműködését és szakmai tanácsait, Kovács Katalinnak az értekezés elkészítésében nyújtott lelkesítő segítségét, Lévay Katalin, Papp Istvánné és Karácsonyi Gáborné asszisztenseknek az értékes és lelkiismeretes technikai közreműködést.
94
Köszönöm Dr. Kostič Szilárdnak, Dr. Csekeő Attilának, Dr. Soltész Ibolyának, és Fleischer Gabriellának (Országos Korányi TBC és Pulmonológiai Intézet, Budapest), valamint Dr. Minárovits Jánosnak, Dr. Győri Zoltánnak és Dr. Segesdi Juditnak (Országos Epidemiológiai Központ, Budapest) a mintagyűjtésben végzett aktív közreműködésüket. Köszönöm Tuula Suitiala-nak (Helsinki, FIOH), és Mayura Meerang-nak (Heidelberg, DKFZ) külföldi tanulmányutaim során nyújtott értékes technikai közreműködést. A kutatást támogatták az EU FP6 ECNIS (Environmental Cancer Risk, Nutrition and Individual Susceptibility; Network of Excellence operating within the European Union 6th Framework Program, Priority 5: ‘Food Quality and Safety’, Contract No 513943), az OTKA (Országos Tudományos Kutatási Alap, T034616), és a magyar-finn TéT (Tudomány és Technológia Alap, SF-02/01, SF-14/03) pályázatok. Az O4-etiltimidin méréseket ECNIS tanulmányi ösztöndíj nyerteseként végeztem a DKFZ-ben Heidelbergben. Köszönöm családomnak és barátaimnak, hogy tudományos munkám során nagy szeretettel és megértéssel támogattak és bátorítottak.
95
