Doktori értekezés. Malignus lymphomában szenvedő betegek komplement funkcióinak vizsgálata az SLE-ben szerzett tapasztalatok felhasználásával

Doktori értekezés

Malignus lymphomában szenvedő betegek komplement funkcióinak vizsgálata az SLE-ben szerzett tapasztalatok felhasználásával

Bányai Anikó

Témavezető: Dr. Pálóczi Katalin

Országos Gyógyintézeti Központ Immunológiai Osztály Budapest 2005 Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola Egyéni fokozatszerzés Rövid értekezés és közlemények forma

Rövidítések AIBL

Angioimmunoblastos lymphadenopathia

AP50

Az alternatív reakcióút összaktivitását jellemző funkcionális paraméter

B-CLL

B-sejtes chronicus lymphocytás leukaemia

BSA

Bovin szérum albumin

C

Komplement

C1-INH

C1 inhibitor

CD

Differenciálódási antigének csoportja (Cluster of differentiation)

CH50

A klasszikus komplement reakcióút összaktivitását jellemző funkcionális paraméter

CMSC

Complement Mediated Immuncomplex Solubilisation

EBV

Epstein-Barr vírus

ELISA

Enzimjelzésen alapuló immunoszorbens módszer (Enzyme-labeled immunosorbent assay)

FDC

Follicularis dendritikus sejt

HIV

Human immundeficiencia vírus

IC

Immunkomplex

IFN

Interferon

IPIC

Immuncomplex Precipitation Inhibition Capacity

MAC

Membrán károsító komplex (membrane attack complex)

MASP

Mannose binding lectin associated serine protease

MBL

Mannóz kötő lektin (mannose binding lectin)

MPS

Mononuclearis phagocyta rendszer

NHL

Non-Hodgkin lymphoma

PBSCT

Perifériás vérőssejt transzplantáció

SLE

Szisztémás lupus erythematosus

Vvs

Vörösvérsejt

2

Tartalomjegyzék Előzmények 1. Bevezetés 1.1. A komplementrendszer felépítése és működése 1.2. Az immunkomplex képződés és a komplementrendszer 1.3. Az SLE és a komplementrendszer 1.4. A malignus lymphomák és a komplementrendszer 2. Célkitűzések 3. Betegek és módszerek 4. Eredmények 5. Megbeszélés 6. Következtetések 7. Új eredmények 8. Az új eredmények klinikai hasznosíthatósága 9. Összefoglalás 10. Summary 11. Köszönetnyilvánítás 12. Irodalom 13. A dolgozat alapját képező saját közlemények jegyzéke (I.-től IX.-ig) 14. A dolgozat témájához nem közvetlenül kapcsolódó saját közlemények jegyzéke

3

Előzmények Az orvostudományban az immunitás fogalmát Erlich óta használják, és kezdetben a fertőzések elleni védettséget értették rajta. Az immunfolyamatok biológiai jelentősége azonban ennél szélesebb körű: az immunrendszer alapfunkciója, hogy különbséget tud tenni saját és nem saját struktúrák között, és azokra eltérő módon reagál. Ebben az értelmezésben az immunrendszer felismerő, információkat továbbító és effektor (végrehajtó, pusztító) funkciókat ellátó rendszer. A sajátként felismert struktúrákat az immunrendszer „megtűri”, azokra toleranciával válaszol. A nem-sajátként felismert struktúrák immunválaszt váltanak ki, ami az azt előidéző antigén (sejt, molekula) semlegesítéséhez, elpusztításához és a szervezetből való eltávolításához vezet. A környezetből a szervezetbe kerülő nem-saját és magában a szervezetben

rendszeresen

képződő

megváltozott-saját

struktúrák

folyamatos

felismerése és a velük szemben kialakult immunreakció képezi a szervezet immunhomeosztázisának az alapját. Az immunhomeosztázis fenntartását a természetes (veleszületett natív), valamint a szerzett („tanult”, adaptív) immunitás elemeinek szoros összefonódása, funkcióinak egymásra épülése teszi lehetővé. A szervezetbe bejutó patogének először a természetes immunrendszer elemeivel találkoznak, az adaptív immunrendszer csak napokkal később aktiválódik. A veleszületett immunrendszernek azonban alapvető szerepe van az antigénspecifikus folyamatok elindításában is. A természetes immunrendszer sejtes elemeinek (dendritikus sejt, makrofág, gamma/delta T-sejt, CD5+ B-sejt, NK-sejt, granulociták) és humorális faktorainak (komplementrendszer, antibakteriális peptidek, citokinek) működése tehát szervesen összefonódik a specifikus immunválasz folyamataival, különösen annak afferens és efferens fázisában (T-limfociták, B-limfociták, limfokinek, ellenanyagok). A természetes védekezés leghatásosabb humorális komponense a komplementrendszer. Vizsgálata nemcsak az immunrendszer egésze működésének megértése szempontjából lényeges,

hanem

az

autoimmun

kórképek,

gyulladások,

fertőző

betegségek

patomechanizmusának megértésében is. Egyes komponenseinek vizsgálata az immunológiai diagnosztika része, azonban az immunválaszt reguláló szerep ma is 4

kutatások tárgya: antigén felvétel, antigén prezentálás, az autotolerancia kialakulásában betöltött szerep, a T-sejtekre kifejtett hatások. Az immunválasz egészére gyakorolt hatás alapján a komplementrendszerre ma már úgy tekintünk, mint az egyik legfontosabb effektor mechanizmusra és az immunregulációval együttműködő szabályozó rendszerre. A komplementrendszernek az immunvédekezésben, a gyulladásokban és autoimmun betegségekben játszott szerepével a Kávai Mária, Erdei Anna, Füst György és Falus András vezette hazai kutatóműhelyek foglalkoztak kiemelten. Az elméleti kutatás területét Erdei Anna és munkacsoportja folytatja. Az immunrendszer daganatai közül a lymphoid leukaemiák és malignus lymphomák összefüggése a komplementrendszerrel kevéssé ismertek. Annak ellenére, hogy ezekben a kórképekben fokozott az infekcióhajlam, gyakoribbak az immunhematológiai kísérőbetegségek és egyéb immunpatomechanizmusú paraneopláziák, kevés adatot ismerünk a komplementrendszerrel való kapcsolatról. Hazánkban az akut leukémiákkal és a chronicus lymphoid leukaemiával kapcsolatos első komplement kutatásokat Füst György és munkacsoportja, közöttük Mód Anna, Varga Lilian végezték. A komplementrendszer vizsgálatával kapcsolatos laboratóriumi kísérleti munkáimat 1978-1996 között a Debreceni Orvostudományi Egyetem (ma Debreceni Egyetem Orvos-

és

Egészségtudományi

Centrum)

III.

Belklinikájának

Immunológiai

Laboratóriumában végeztem. 1987-től kaptam megbízást a klinika non-Hodgkin lymphomában szenvedő betegeinek kezelésére, így laboratóriumi kutatásaim is a lymphomás betegek felé fordultak. 1996-tól autoimmun betegek ellátása mellett folytattam

a

malignus

lymphomával

kapcsolatos

tudományos

célú

klinikai

megfigyeléseket az Országos Haematológiai és Immunológiai Intézet (ma Országos Gyógyintézeti Központ) Immunológiai Osztályán, Budapesten.

5

1. Bevezetés 1.1. A komplementrendszer felépítése és működése A legkorábbi kísérleti eredmények, melyek e komplex rendszer vérben való jelenlétére utalnak, a XIX. század végéről származnak. Fodor József (1843-1901) magyar kutató és később számosan mások, köztük a francia Bordet is igazolta a friss szérum baktericid hatását (1). Ezt a hőérzékeny faktort Erlich nevezte el komplementnek, vagyis olyan anyagnak, ami az antitest jelenléte mellett szükséges a kórokozó líziséhez. Mai ismereteink szerint a komplementrendszer több mint 30 komponensből álló, enzimeket, szabályozó faktorokat, receptorokat és szabályozó membránfehérjéket magába foglaló komplex rendszer. Működésére a láncreakciószerűen bekövetkező, és kaszkádszerűen fokozódó aktiváció a jellemző, mely az aktivációs utak egymásba fonódásával önmagát erősíteni vagy szabályozni képes. A komplement faktorokat meghatározó mennyiségben a máj parenchymasejtjei termelik. Jelentős mértékű a mononukleáris fagocita rendszer (MPS) sejtjei által termelt komplementfehérje mennyiség is, mely főleg a helyi gyulladásos folyamatokban vesz részt. Egyes komponenseket az endotélsejtek is képesek termelni. A komplement komponensek bioszintézise bonyolult, még nem minden részletében tisztázott folyamat. A komplementrendszer aktivációja A komplementrendszer az aktiválását megindító kórokozó lízisét idézi elő, miközben a szervezet saját sejtjei nem károsodnak. A „saját” védelmének ezt a formáját, a láncreakciót szabályozó, illetve gátló fehérjék jelenléte biztosítja, míg a kórokozóknak ilyen védő molekulái általában nincsenek. A komplementrendszer aktiválódása három fő fázisra bontható, és a kaszkád háromféle módon: a klasszikus, az alternatív és a lektin-függő úton indulhat el (a felfedezés sorrendjében). A klasszikus utat elsősorban IgG vagy IgM tartalmú immunkomplexek aktiválhatják. Az alternatív és lektin-indukált aktiváció nem igényli antitest jelenlétét. Az alternatív utat a sziálsavban szegény, szénhidrátban gazdag patogének aktiválják, míg a lektin-függő utat elsősorban a mannóztartalmú mikróbák (2, 3).

6

A

komplementrendszer

aktiválódása

során

nagy

mennyiségben

képződnek

komplementfaktor hasadási termékek, elsősorban a C3-ból származó molekulák, mint a C3b, iC3b, C3d. Feladatuk, hogy az immunrendszer sejtjeihez való kapcsolódás elősegítésére bevonják, opszonizálják a komplementet aktiváló felszíneket, sejteket, molekulákat. A C1q alegységet illetően is feltételeznek hasonló feladatot, melynek során a mannózkötő lektinnel (MBL) együtt aktiválhatja a fagocita sejtek CD91 molekuláját, elősegítve az apoptótikus sejtek eltávolítását (4). Ezek mellett az anafilatoxinoknak nevezett C3a, C5a és C4a komponensek bírnak jelentős biológiai hatással, melyet a gyulladásokban részvevő sejtek - eozinofil és bazofil granulociták, Blimfociták, hízósejtek, ritkán simaizomsejtek - megfelelő komplement receptoraival kapcsolódva fejtenek ki (5). A komplement aktiváció ma ismert három reakcióútját az l. ábra foglalja össze:

Klasszikus út (IgG-t, IgM-t tartalmazó immunkomplexek, pentraxinok) C1-komplex aktivált (C1q, C1r, C1s) C1

C4a

C4+C2 Lektin-függő út (biz. szénhidrátok) MBL-MASP Fikolin-MASP

C4b2a C3-konvertáz

aktivált MBL-MASP aktivált fikolin-MASP

C4b2b3b C5-konvertáz

C3a

C3

C3b

C5a C5

C5b

Alternatív út (“aktivátorfelszínek”) C3

C6 C7 C8 (C9)n

C3b

C3a

C5b-9 MAC

B-faktor D-faktor

C3bBb C3-konvertáz

C3bBb3b C5-konvertáz

+ feedback

1. ábra. A komplement aktiváció útjai. MBL: mannózkötő lektin, MASP: mannózkötő lektinhez kapcsolt szerin-proteáz, MAC: membránkárosító komplex.

7

A klasszikus úton történő aktiváció A klasszikus utat elsősorban az antigén-antitest kapcsolódása során képződő immunkomplexek aktiválhatják, tehát az antigénnel fajlagosan reagáló ellenanyag molekulák (IgG vagy IgM) jelenléte szükséges a folyamathoz. Elsőként kapcsolódik a C1q komponens különleges szerkezete révén, mely felismeri az antitest molekulák Fc részét. Ahhoz, hogy a komplementkaszkád aktivációja elinduljon, a C1q globuláris fejének legalább két, komplexben lévő ellenanyag-molekula Fc részéhez kell kötődnie. Az immunglobulin Fc részéhez kötődő C1q alegység konformációs változást idéz elő a C1r molekulában, mely autokatalízis révén aktív szerin-proteázzá alakul. A C1r ezután a C1s alegységet hasítja, ami szintén szerin-proteázzá aktiválódik. A C1s-nek két szubsztrátja van, a C4 és a C2. A C2, C4 hasításával jön létre a klasszikus C3 konvertáz enzim, a C4b2a. A C3 konvertáz kialakulása az aktiváció központi reakciójához, a C3 hasításához vezet, mely egyben a három reakcióút kapcsolódási pontja. A C3 konvertáz rendkívül hatékony proteáz, képes több száz C3 hasítására, melyből több C5a konvertáz képződik, előidézve az aktiváció kaszkádszerű felfutását. A keletkező C3b többsége a környezet sejtjeihez, felületeihez kapcsolódik, mint opszonizáló faktor. A komplement utak közös, második szakaszán, a C3b beépülésével kialakul a C5 konvertáz enzim. Ezt követően már enzimatikus hasítás nélkül épülnek a C5b mellett a „késői komponensek”, a C6-7-8-és több C9 komponens. Kialakul a jellegzetes szerkezetű membránkárosító komplex (MAC), mely képes perforálni a sejtek vagy a kórokozók felszíni membránjait, előidézve pusztulásukat. A klasszikus utat aktiválhatják még a C1q megkötésére alkalmas akutfázis-fehérjék, a C-reaktív protein (CRP), a szérum amyloid-P (SAP) és a pentraxin-3 (PTX3) is (2, 6, 7, 8). Az alternatív út aktiválódása Az alternatív úton történő aktivációban négy szérumfehérje vesz részt: C3 molekula, Bfaktor, D faktor és a kialakuló C3 konvertáz enzimet stabilizáló properdin. Az alternatív út aktiválódását a szervezetben nagyon kis mértékben, de állandóan hidrolizálódó C3 molekulák (C3H2O) teszik lehetővé, melyek szerkezetileg a C3b-nek felelnek meg. A 8

C3H2O molekula „felismeri” a szervezetbe jutó idegen struktúrákat, és azok felszínére kötődik. Ebben a „felismerési” folyamatban fontos szerepe van a sziálsav jelenlétének, ill. hiányának. Az emlőssejtek membránján nagy mennyiségben van jelen sziálsav, ami az esetlegesen kötődő C3b molekulák gyors inaktiválását eredményezi, és így a szervezet magvas sejtjein való komplement aktivációt megakadályozza. Ezzel ellentétben, a baktériumok, gombák és egyes vírusok felszíni sziálsavat csak kis mennyiségben tartalmaznak, következésképpen a lekötődő C3b hosszabb ideig aktív marad. A klasszikus és a később ismertetendő lektin-függő út aktivációja során, a C3 hasításával nagy mennyiségben képződik C3b, ami a környezetbe kerülve, szintén elindíthatja az aktiváció alternatív útját is. A szabad C3b különböző felszíni struktúrákhoz kötődhet, ezzel az alternatív C3 konvertáz (C3bBb) magjává válhat, melyhez a B és D faktorok, valamint a stabilizáló hatású properdin kapcsolódik. Ettől a ponttól kezdődően, az előzőekhez hasonlóan létrejön a C3 hasítása, kialakul az alternatív C5 konvertáz, és a késői reakcióút is végigfut a MAC komplex kialakításáig. Mivel a C3b saját és idegen felszínre egyaránt kötődik és létrehozhatja az aktiváció teljes sorát, sőt azt kaszkádszerűen felerősítheti, a saját sejtek védelmére gátló mechanizmusok állnak készenlétben. E gátló tényezők a H és I faktorok, melyek a C3bt iC3b-vé inaktiválják, és elejét veszik a reakció kaszkádszerű megsokszorozódásának. A szabályozó faktorok csak a saját struktúrák felszínén képesek a C3b inaktiválására, az idegen mikroorganizmusok nem kerülhetik el a MAC pusztító hatását. Az alternatív C3 konvertáz kialakulása felerősítheti az egyidőben aktiválódott klasszikus út hatásait is (2, 6, 7, 8) A lektin-függő út aktiválódása A lektin-függő aktiválást a különböző szénhidrát molekulákkal reagáló mannózkötő lektin (mannose binding lectin – MBL) és az ahhoz kötődő MASP (mannose binding lectin associated serine protease) enzim komplexe, azaz a mannóztartalmú felszínnel rendelkező mikróbák indukálhatják. Ezeket a mintázatokat ma az un. PAM-okkal (pathogen associated molecular pattern) azonosítjuk. E cukorgazdag felszíni struktúrákat ismerik fel a C1q szerkezetére hasonlító MBL, vagy a fikolinok. A kötődést 9

követően (opszonizáció) kapcsolódik a molekulákhoz a MASP-2 szerin proteáz. A MBL+MASP-2 komplex köti meg és hasítja a C2 és C4 komponenseket, azok aktiválódnak és létrehozzák a C3 konvertázt, mely szerkezetileg a klasszikus C3 konvertázzal azonos. Ezzel a lépéssel a lektin kötődése által elindított reakció a klasszikus út kaszkádjába kapcsolódik. Ezt a reakcióutat a gerincesek szervezetének molekulái nem képesek aktiválni, de baktériumok, gombák és talán vírusok is elindíthatják, ezáltal a kialakuló MAC pusztító hatása e kórokozókat érinti (2, 7, 9). A komplementrendszer működésének szabályozása A komplementrendszer nem képes az antigént fajlagosan felismerni úgy, mint az ellenanyag molekulák, ezért előfordulhat, hogy a szervezet saját sejtjei válnak a támadás célpontjává. Mivel a kaszkád számos pontján megsokszorozódik az aktív molekulák száma, rövid idő alatt sok aktív fragmentum keletkezik. Ezért könnyen fékezhetetlenné válhat a reakció, amit azonban többféle mechanizmus, ill. gátló faktor akadályoz meg. Korlátozza a reakciót egyrészt az, hogy a legtöbb komponens féléletideje nagyon rövid, másrészt számos szabályozó molekula integráns része a komplementrendszernek, melyek

a folyamat

különböző

pontjain

hatva megakadályozzák

a kaszkád

elszabadulását (2, 7, 8). A

komplementrendszer

aktiválódását

szabályozó

szolubilis

molekulák

és

membránfehérjék, valamint főbb funkcióik: -

C1-INH (C1 inhibitor): hatására a C1 komplex disszociál.

-

H és I faktorok: az alternatív út működése során a C3b-t hasítják, inaktiválják.

-

Anafilatoxin inaktivátor: az anafilatoxinok hatását blokkolja.

-

C4b kötő fehérje: A klasszikus úton a C4b-t hasítja, az alternatív úton a I faktor kofaktora.

-

S fehérje (vitronektin) és SP-40: a MAC kialakulását és működését gátolják.

-

Properdin: stabilizálja az alternatív út konvertázait.

-

Komplement-receptor 1 (CR1, CD35): immunkomplexeket köt és elősegíti eliminálásukat.

-

MCP (membrane cofactor protein) CD46: feladata a C3 hasítása. 10

-

DAF (decay accelerating factor) CD55: a sejtfelszínre kötődött C3 konvertázokat bontja meg. Szerzett hiányában a paroxysmalis nocturnalis haemoglobinuria klinikai tünetcsoportja alakul ki.

-

HRF (homológ restrikciós faktor) és CD59: a C9 molekulák kötődését akadályozza autológ sejteken.

A komplement receptorok A komplementrendszer működésének eredményeként keletkező számos aktivációs termék képes a különböző sejtek membránján megjelenő komplement receptorokhoz kötődni (2, 7, 8). E kölcsönhatások a legkülönbözőbb biológiai funkciók kiváltását eredményezik. Szöveti megoszlásukat és ligandumaikat az alábbiakban foglaljuk össze: -

CR1 (CD35): a vörösvérsejtek, neutrophilek, eosinophilek, a MPS rendszer sejtjeinek és a B-limfociták felszínén van jelen, de megtalálható a FDC sejtjein és aktivált T-limfocitán is (5). Ligandja a C3b és a C4b.

-

CR2 (CD21): B limfocitákon található, koreceptorként kapcsolódva a CD19 és CD81 molekulákhoz. FDC és aktivált T-limfocita is hordozza. Ligandjai: C3d, C3dg, iC3b, EBV, IFNα, CD23.

-

CR3 (CD11b/CD18) és CR4 (CD11c/CD18): Hordozzák a MPS sejtek, neutrophilek, NK-sejtek. T-sejteken is előfordulhat. Ligandjai: iC3b, ICAM-I, LPS, fibrinogén.

-

C3a/C4aR: Basophil és hízósejtek, neutrophilek jelenítik meg. Ligandjai a C3a és a C4a.

-

C5aR (CD88): Hordozói: basophilek, hízósejtek, neutrophilek, a MPS sejtjei, a vérlemezkék, endotélsejt, simaizomsejt, idegsejt. Ligandja a C5a.

A

komplementrendszer

működésének

szerepe

az

immunológiai

funkciók

szabályozásában Fontos hangsúlyozni, hogy a komplementrendszer folyamatos kölcsönhatásban működik az immunrendszer egészével. Faktorainak termelődését az immunrendszer a citokinek útján fokozza, ha a feladatokhoz erre van szükség (2, 6, 7, 8). Ilyen hatást fejt ki a gamma-interferon, az IL-6 és TNF-alfa. A komplementrendszer segít az 11

ellenanyagok által megjelölt antigének lízisében, vagy fagocitózis általi elpusztításában. Fontos szerepe van a sejtek apoptózisa során képződő törmelék eltakarításában, miközben opszonizált autoantigéneket adhat át az antigén prezentáló sejteknek. Szerepet játszik a B-limfociták szelekciójában, érésében és differenciálódásában, melyet a legújabb kutatási eredmények is megvilágítanak (5). A csontvelői B-sejt érés során megjelenő receptorok a keresztkötő antigén és komplement komponensek hatására szelektálódnak és szerepet játszanak az immuntolerancia kialakításában. Később a Bsejtek a lépbe és a nyirokszervekbe jutnak, ahol további differenciálódásukban, a funkciójuk elnyerésében és a memória B-sejtek kialakításában is fontos szerepe van komplement receptoraik egyidejű aktiválódásának. A komplementtel kötött saját antigén kapcsolódása fokozza az autoreaktív B-sejtek negatív válaszát, anergiát vagy apoptózist okozva (5). A follicularis dendritikus sejtek (FDC) működésének megismerésével vált lehetővé a komplement szerepének megértése az autotolerancia és autoimmunitás kialakulásában is (4, 5). A FDC sejtek a professzionális antigén prezentáló sejtek közé tartoznak, amelyek in vivo legtöbbször immunkomplex formájában találkoznak a saját és idegen antigénekkel. Toll-szerű receptoraik segítségével különböztetik meg a patogén mintázatot hordozó antigéneket. Komplement (CD21, CD35) és antigén receptoraik egyidejű aktiválása segíti őket a sejtérésben. A másodlagos nyirokszervek centrum germinativumaiba, majd a marginális zónában vándorolva, a regulátor T-sejtekkel együttműködve részt vesznek a B-limfocita érés folyamatában (10). A komplementrendszer és a T-sejtek kapcsolata még kevéssé ismert. A T-sejtek alig vagy nem hordoznak komplement receptorokat, ezért elsősorban közvetett módon hatnak egymásra. Ismert azonban az allergiás asztma állatmodellje, ahol a CD4 T-sejten CR3a receptor jelenhet meg, így közvetlenül reagálhat az anafilatoxin felszabadulására. A CD4 sejtek komplement ligandot kötő CD46 receptorát pedig opszonizált vírusok együtt aktiválhatnak a CD3 receptorral, IL10 felszabadulás fokozódást eredményezve (11, 12). A komplementrendszer legfontosabb funkciói a következők: -

Sejtek, kórokozók lízise;

-

Sejtek, kórokozók opszonizálása, a fagocitózis fokozása; 12

-

Kemotaktikus, anafilaktikus hatás;

-

Hízósejtek és basophil leukocyták aktiválása;

-

Immunkomplexek eltávolítása;

-

Saját sejtek károsodásának megakadályozása.

Komplementrendszer működésének kisiklása, deficienciák A komplementrendszer egyes faktorainak hiánya megakadályozhatja az aktiváció folyamatát, következésképpen nem valósulnak meg a komplementrendszer fontos biológiai funkciói. Ha azonban a szabályozó fehérjék nincsenek jelen a plazmában vagy a különböző sejtek membránján, akkor az ellenkező folyamat, a kaszkád elszabadulása károsítja a szervezetet. Szintén kóros folyamatok közvetítője a komplementrendszer akkor, amikor az aktiváló ágens (kórokozó vagy egyes autoantitestek) állandóan jelen van a szervezetben (7, 8). A komplementhiányos állapot az esetek egy részében genetikai defektusra vezethető vissza, de egyre gyakrabban ki tudjuk mutatni a szerzett defektusokat is. Attól függően, hogy a komplementkaszkád melyik szakaszának komponensei hiányoznak, más-más következményekkel járhat a deficiencia. A klasszikus út korai komponenseinek hiánya immunkomplexbetegséggel és autoimmun folyamatokkal párosulhat, ami arra utal, hogy

e

faktorok

alapvetően

fontosak

az

immunkomplexek

eliminációjának

folyamatában. A C3 molekula hiánya súlyos, gyakran visszatérő gennykeltő baktériumok által okozott fertőzésekhez, a terminális komponensek hiánya szintén bakteriális fertőzés kialakulásához vezethet. A C1-INH veleszületett vagy szerzett hiánya, ill. gátolt működése a klasszikus reakcióút kóros mértékű aktivitás fokozódását eredményezi. A C1-INH működés kiesésének következményként az angioneurotikus oedema klinikai képe alakul ki, amelyben testszerte életveszélyes oedema képződés léphet fel a bradikinin és a C2-kinin, mint mediátorok közvetítésével (6, 7, 8). Nemcsak hiányos képződésük vagy működésük jellemezhet kórfolyamatokat, de a faktorok

génjeinek

természetes

változatossága

is

eltérő

immunreaktivitásban

nyilvánulhat meg. Legismertebb a C4 komponens két genetikai típusa, a C4A és C4B, melynek 35-40 allotípusát ismerjük.(8, 11, 13).

13

A szerzett komplement deficienciák okai összetettek. A komponensek csökkent termelődését okozhatják a májat ért károsító hatások, a komplementrendszer aktivációját kísérő konzumpció, vagy a komponensek működését befolyásoló tényezők, pl. ellenanyagok megjelenése vezethet szerzett komplement deficienciához. Malignus betegségek esetén kimutatható hipokomplementémia hátterében döntően szerzett defektusok állhatnak (7, 8, 66). 1.2. Az immunkomplex képződés és a komplementrendszer Az immunkomplex (IC) képződés a humorális immunválasz élettani következménye. A reakció célja az idegen antigén eltávolítása, elősegítve a fagocita sejtek általi bekebelezést. Az antigének lehetnek korpuszkulárisak, mint a mikroorganizmusok, de lehetnek szolubilis molekulák is, melyek a keringésben találkoznak az ellenanyaggal. Az ellenanyag típusok közül az IgG és IgM jól aktiválják a komplementrendszert (az IgA nem), kiváltva a komplement fragmentumok képződését és a komplex opszonizációját (7, 8). Komplement tartalmú környezetben a szolubilis komplexek a komplement utak aktiválása útján kovalensen megkötik a C3b és C4b-t és nem kovalens módon a C1q molekulát. A keletkező hasadási termékek közül a “b” fragmentumok helyben maradnak, míg a C3a, C5a és C5b-C9 komponenseket a keringés gyorsan tovább sodorja. Ha a keletkező IC-ek túlságosan nagyok, vagy gyorsan, nagy mennyiségben keletkeznek, telíthetik az eltakarító rendszereket és a komplexek a szövetekben rakódnak

le,

súlyos

helyi

gyulladást

eredményezve.

De

keletkezhetnek

immunkomplexek a keringésen kívül, a szövetekben is, ha az antigén a szövetekhez kötött, vagy ha megváltozott saját antigének ellen irányul az ellenanyag válasz. Ha az immunválasz túlságosan erőteljes, a kórokozó vagy károsodott saját struktúra ellen úgynevezett III. típusú túlérzékenységi reakció alakul ki, mely IC-mediált gyulladásban nyilvánul meg (13). A komplementrendszer szerepe az immunkomplex képződés mechanizmusában mesterségesen képzett IC-ek vizsgálata során körvonalazódott. Friss komplement tartalmú szérumok képesek voltak meggátolni a nem-szolubilis immunprecipitátumok kialakulását, szerkezetük, méretük befolyásolásával (14, 15, 16) és a preformált 14

mesterséges immunkomplexeket képesek voltak feloldani (17, 18). Ennek két lehetséges magyarázatát ismerjük: Az első szerint a komplement fehérjék beépülése a komplexbe redukálja az antigén-antitest háló valenciáját, elfoglalva az antigén-antitest komplex interakciós helyeit (19). A második szerint a komplement beépülése a nem kovalens FcFc kötésekkel interferál, ezáltal az IC-ek gyors aggregálódását gátolja (20). A komplementrendszer kapacitása, hogy gátolja a nagyobb IC-ek képződését 10-szer nagyobb, mint a szolubilizáló kapacitás, valószínűsítve, hogy könnyebb megelőzni az Fc-Fc kötések és a hálóképződés kialakulását, mint a már kialakult hálót szétroncsolni (21). A két reakció különbözik a gyulladás kiváltó hatásában is, mivel az aggregáció gátlás alig, míg a szolubilizáció jelentős C5a felszabadulást eredményez (22). Az immunprecipitáció gátlás elsősorban a klasszikus komplement aktiváció eredménye, míg a szolubilizációban az alternatív út aktivációja a nyilvánul meg (21). Élettanilag a precipitáció gátlás az elsődleges folyamat, mely a szervezet számára a veszélytelen IC-ek képződését biztosítja. Az inkomplett módon szolubilizált IC további szolubilizálása másodlagos mentő funkciója az alternatív aktivációnak, melyet azonban súlyos helyi gyulladás kísér (23). Az érpályában képződő vagy oda bejutó immunkomplexek eltakarítása különböző sejtek együttműködését igényli. Az IC-et a feldolgozás helyére az emberi szervezetben a vörösvérsejtek (vvs) szállítják. Felszínükön a CR1 (CD35) receptorok segítségével kötik meg a C3b vagy iC3b tartalmú komplexeket. A CR1 receptor hiánya, polimorfizmusa, számának csökkenése vagy funkciójának defektusa szisztémás lupus erythematosushoz (SLE), vagy SLE szerű immunkomplex betegségekhez vezethet (24). Transzfer funkcióik végén a vvs-ek az MPS rendszer sejtjeinek adják át az IC-ket, úgy, hogy a szállítást végző sejtek ne sérüljenek. Fc receptoraikkal kötik meg, és a szállító sejt CR1 receptorával együtt választják le a komplexeket a vvs-ek membránjáról. A folyamat fiziológiás működése biztosítja, hogy a képződő immunkomplexek ne rakódjanak le a szövetekben, hanem a feldolgozás helyére kerüljenek (25). Az IC feldolgozás és eliminálódás helye emberben a máj és a lép. Az MPS-rendszer és az Fc receptor funkciók defektusa gyakran vizsgált területe az immunkomplex betegségeknek, közöttük az SLE-nek, de a betegséggel való ok okozati kapcsolat még ma sem eléggé tisztázott (13, 26). 15

Az immunkomplexek által kiváltott gyulladás Az immunkomplexek oldott formában a szérum természetes összetevői. Eliminálásukról a komplementrendszer és a MPS rendszer együttműködve gondoskodik. Ha mennyiségük jelentős mértékben megszaporodik, mert képződésük fokozódik, vagy az elimináció mechanizmusai ezzel nem tudnak lépést tartani, a szövetekben lerakódva gyulladást okoznak. Gyulladás az eredménye annak is, ha lokálisan a szövetekben képződnek és aktiválják a komplementrendszert és a gyulladás sejtes komponenseit. Az így fellépő gyulladás számos kórkép tünetcsoportjának része. Az immunkomplexek szövetkárosító hatása főként a komplementrendszer aktiválódásán keresztül valósul meg, melynek fő lépései: -

A komplementfehérjék kovalensen (C3, C4) vagy nem kovalensen (C1q) kötődve az IC-ekhez, ligandumot képeznek a leukociták és limfociták receptorai számára, elindítva a sejtek effektor funkcióinak aktiválódását.

-

A membránkárosító komplex (MAC) képződés direkt sejtkárosító hatású (sejtpusztulás). Ha mégsem következne be a sejtlízis, a MAC jelenléte akkor is stimulálhatja a lokális sejtaktivációt.

-

Az IC okozta komplement aktiváció anafilatoxinok termelődését indítja el.

Az érintett szövet szerkezete is jelentősen befolyásolja az IC által közvetített szöveti károsodást. Erre példa a veseglomerulusok viselkedése, melyben az ép glomerulus bazálmembrán jelenti a barriert a glomeruláris kapillárisokból kilépő fehérvérsejtek számára. Membranosus glomerulopathiákban az IC-ek a szubepitéliumban képződnek, a komplement aktiváció MAC kialakulását hozza létre. A folyamat inflammatorikus fehérvérsejtek nélkül zajlik. Ha azonban a keringésben képződnek az IC-ek és a szubepitéliumban lerakódnak, mint SLE-ben, vagy közvetlenül a bazális membrán ellen képződnek antitestek, mint Goodpasture-szindrómában, a szövetkárosodásban mind a komplement, mind a leukociták részt vesznek (27). Az immunkomplexek és komplementrendszer szerepe betegségekben Számos tanulmány foglalkozott az IC mediált gyulladás, az Fc- és komplementreceptorok összefüggéseivel. A kutatások modellje az Arthus reakción alapszik (13, 28). 16

Az SLE és a malignus lymphomák később tárgyalandó kapcsolatán kívül, a komplementrendszer és az IC–ek számos kórképben játszanak meghatározó szerepet. Az immunkomplexek gyulladást válthatnak ki elsősorban az infekciókban. A fertőző betegségek többsége jól dokumentálható IC képződéssel és következményes betegségekkel jár. Talán a legjobban tanulmányozott a humán C vírus hepatitis és a cryoglobulinaemia kapcsolata (21, 22), a subacut bacterialis endocarditis, a Helicobacter pylori fertőzés és HIV infekció. Mindezek mellett, különösen immunszuprimált vagy immunhiányos állapotokban kell gondolni egyéb szokatlan kórokozókra (gombák, opportunista kórokozók) és az általuk indukált immunkomplex betegségekre. A hematológia és immunológia körébe tartozó betegségek közül, a teljesség igénye nélkül a következőket emelném ki: -

Súlyos aplasticus anaemia

-

Egy vagy két sejtsort érintő sejthiányok (immuncitopéniák)

-

Immunhaemolyticus anaemia

-

Immunthrombocytopenia (ITP)

-

Henoch-Schönlein purpura

-

Egyes vasculitisek, pl.: McDuffie szindróma. ahol az IC-t C1q - anti-C1q képezi (29)

-

Antifoszfolipid syndroma és az alvadási faktorok ellen termelődő anticoagulánsok (26).

Fokozott antitest (köztük autoantitest) képződés kíséri a B-sejtes non-Hodgkin lymphomákat (NHL), melyek IC képződéshez és az IC-ek okozta károsodáshoz vezetnek (30, 31). A T-sejtes lymphomák esetében is kimutatható hipokomplementémia és IC patomechanizmusú paraneoplázia (32). A

vérképző

őssejtekkel

végzett

allogén

transzplantáció

során

kialakuló

szövődményekben, különösen a graft-versus-host betegségben kell számolnunk komplement eltérésekkel, autoantitest és IC képződéssel és az általuk közvetített szövetkárosodásokkal (33, 34).

17

1.3. Az SLE és a komplementrendszer Az SLE, mint szisztémás autoimmun betegség, etiológiája szerint poligénes, multifaktoriális eredetű. Nem a leggyakrabban előforduló autoimmun kórkép, de a kutatásában elért eredmények alapján modellbetegségnek tekinthető. Kialakulásának feltételei között az immunrendszer öröklött és szerzett genetikai defektusai mellett a szervezet és környezet hatásai is igen nagy súllyal érvényesülnek. Az immunrendszer a szervezet egészséges működését autotolerancia kialakításával védi, melyben szerepet játszik az autoantigének felismerése, a természetes autoantitestek hatása és az autoreaktív T-sejtek reguláló szerepe. Ha az autotolerancia bonyolult mechanizmusa sérül, akkor autoimmun betegségek jöhetnek létre (35). Az SLE meghatározója a maganyagok ellen termelődő autoantitestek jellegzetes mintázata. Legjellemzőbb a duplaszálú DNS (dsDNS) elleni autoantitestek megjelenése, melyek kóroki szerepe bizonyított, kimutathatóságuk legtöbbször diagnosztikus. A dsDNS mint antigén, a saját sejtek apoptózisa során válik hozzáférhetővé az antigén prezentáló sejtek számára, melyre azonban a betegek immunrendszere nem toleranciával vagy ignorációval, hanem nagymérvű autoantitest termelődéssel és antigén-antitest komplexek képződésével válaszol. Immunkomplexek képződnek, melyek gyulladásos szervkárosodásokat okoznak, súlyos krónikus betegséget, vagy - ma már ritkábban - a szervezet halálát okozva. Az SLE alapját immunkomplex betegség képezi és mindig kísérője a konzumpció okozta hipokomplementémia, de a komplement hiányos állapotok és az SLE kialakulása közötti kapcsolat is régóta ismert (11). A C1q, C1r, C1s, C4 vagy C2 örökletes homozigóta és heterozigóta hiánya szorosan összefügg az SLE kifejlődésével. A kialakuló betegség iránti fogékonyság és a betegség súlyossága a hiányzó proteinnek a klasszikus komplement aktiválódási útban elfoglalt helyétől függ (11). A C1q homozigóta hiánya több mint 90%-os gyakorisággal vezet SLE kialakulásához, tipikusan

korai

életkorban,

súlyos

bőr,

vese

és

központi

idegrendszeri

betegségtünetekkel, főként anti-Ro, anti-Sm, anti-RNP1, kevéssé anti-dsDNS antitestek révén (36, 37). A C2 deficiens betegek 30%-ában fejlődik ki SLE, és az antitestek közül főként az anti-Ro magas titere jellemző. A betegségtünetek klinikailag a defektusban nem szenvedő betegekéhez hasonlók (38). SLE asszociált antitestek csak ritkán 18

mutathatók ki a C3 deficiens betegekben, bár 25%-ukban mesangiocapillaris glomerulonephritis fejlődhet ki. Az alternatív utat szabályozó két fehérjének az I és H faktornak a hiánya viszont másodlagosan súlyos C3 defektushoz vezet, melynek következménye - a C3 deficienciához hasonlóan – súlyos, gennykeltő baktériumok által okozott infekciók kialakulása (39). Sok tanulmány foglalkozik a fő hisztokompatibilitási komplex (MHC) és az SLE közötti összefüggéssel is. Mind a négy komplement gén (C4A, C4B, C2, és B faktor), mely az MHC III. régióban helyezkedik el, extrém polimorfizmust mutat. A C4A és B esetén ez magába foglalja a Q0 alléleket is, amikor hiányzik a fehérje produktum. A C4A null allélek és az SLE között gyakrabban figyeltek meg kapcsolatot, de az összefüggést egyértelműen megerősítő megfigyelés nem született (40, 41). A komplement receptorok közül a CR1 felelős a vvs-ek IC-transzportjáért. A CR1 receptorok száma a vvs-en genetikusan determinált, SLE-s betegek vörösvérsejtjein receptorszám csökkenést igazoltak (26, 42). Az MPS rendszerben kialakuló defektusok az IC feldolgozás és az antigén prezentáció hibáit okozva szintén fontos elemei a patomechanizmusnak (13, 26). SLE-ben az IC-ek a gyulladások helyén kimutathatók. A bőrben lerakódó IC-ek típusosan a dermo-epidermalis junkcióban igazolhatók, ahol a negatív elektromos töltésviszonyok kedveznek a DNS-anti-DNS komplexek lerakódásának. A savóshártya és izületi gyulladások során képződő folyadékgyülemben is kimutathatók IC-ek és komplement fragmentumok. Gyakoriak a vasculitisek, amikor a véredények falát károsító IC mechanizmus a szervezetben egyidejűleg több helyen fellépő károsodáshoz vezet. Az erek falában lerakódó IC-ek a keringő komplement faktorokat aktiválva és gyulladásos sejteket toborozva károsítják az endotélt, mely átjárhatóvá válva, a környező szövetekre is átterjedő a gyulladást eredményez. A vasculitis, károsítva a szív koszorúsereit, a szívizom vérellátási zavarát, vagy atheroma képződést okozva indirekt módon károsíthatja a szívizmot. A tüdőkben az IC-ek pneumonitist vagy krónikus intersticiális tüdőbetegséget okoznak. A központi idegrendszer károsodását részben a vasculitis helyi hatásai, részben az alvadási faktorok elleni és az anti-foszfolipid antitestek thrombosist előidéző hatása okozza.

19

A SLE súlyosságát és kimenetelét nagyfokban meghatározó nephropathia létrejöttében is fontos szerepet játszik az IC lerakódás és a lokális komplement aktiváció. Újabb megfigyelések szerint a C1q ellen termelődő autoantitestek magas titere és a veseérintettség kimutathatósága között összefüggést figyeltek meg, és ok-okozati kapcsolat lehetősége is felmerül (42). Az SLE és a komplementrendszer kapcsolatáról nyert eredmények szerint mind a betegség kialakulásában, mind a tünetek sokszínűségében és súlyosságában igen jelentős szerepet játszik a komplementrendszer. Összetevője annak a circulus vitiosusnak is, melynek során a hipokomplementémiás környezetben, a B-sejt érést és szelekciót irányító antigénprezentáció mechanizmusban zavar támadhat, és az immuntolerancia károsodhat. A B-sejtek autoantitest képző tevékenysége mindezáltal fokozódik, és nagy mennyiségű IC termelés következhet be. A nagymérvű IC termelés komplement konzumpciót és inkomplett IC szolubilizációt okoz. A folyamat részben hipokomplementémiához, részben gyulladásokhoz vezet. A gyulladások következtében a saját sejtek apoptózisa fokozódik, a felszabaduló autoantigének feldolgozása károsodik és zárul a kör az autoantitest termelődés extrém fokozódásával (43, 44). 1.4. A malignus lymphomák és a komplementrendszer Az immunrendszer malignus daganatai és a komplementrendszer kapcsolata még nem feltárt terület, de egyes jelenségek, melyek lymphoid leukémiákban és lymphomákban megfigyelhetők, felvetik az összefüggések lehetőségét. A malignus lymphomák etiológiája ma még nem ismert. Kialakulásuk többlépcsős folyamatként képzelhető el, melyben ismerünk néhány, az immunsejtek monoklonális burjánzását elősegítő vagy kiváltó tényezőt. A malignus lymphomák közé nagyszámú, eltérő tulajdonságú entitás tartozik. A ma alkalmazott nemzetközi (WHO 2000) osztályozás alapja a kóros sejtek azonosítása a normál partnersejt tulajdonságainak (morfológia, immunfenotípus, molekuláris genetika, molekuláris biológia) ismerete alapján (45, 46). A malignus lymphomák kiindulási sejtjei a limfociták, melyek élettani feladataik betöltése céljából nagymértékű, de szabályozott proliferációra képesek. A gyorsan osztódó sejtek genetikai állománya kevésbé stabil, sérülékeny, melynek következménye 20

genetikai hibák kialakulása. A módosult sejtek többnyire elpusztulnak, de ha a bennük zajló génátrendeződések egyúttal a túlélést és az osztódó képesség fennmaradását is biztosítják,

kialakulhat

a

malignus

lymphoma

alapját

képező

immortalizált

sejtpopuláció. A genetikai változások feltérképezése jelentős mértékben segíti az egyes lymphoma entitások biológiai tulajdonságainak meghatározását, esetleg a betegség osztályozását (47). A genetikai hibák szerepe mellett környezeti faktorok (vírusok, egyéb kórokozók) szerepe is valószínűsíthető. Bizonyított az Epstein-Barr vírus (EBV) és a humán T-sejt leukaemia vírus (HTLV-I) oki szerepe. Az immortalizációt kiváltó exogén faktorok mellett meghatározóan lényeges szerepet tulajdoníthatunk az immunrendszer, főként a T-sejt rendszer deficiens működésének a lymphomák keletkezése hátterében. Nemcsak a veleszületett immunhiányos állapotokban, hanem egyes autoimmun betegségekben és másodlagos immunhiányokban (HIV-fertőzöttek, transzplantáltak, immunszupresszív kezelést kapók stb.) jelentkező lymphomák is alátámasztják az immunvédelem kiemelt szerepét a lymphoma kialakulásban (48, 49). A

lymphomák

klinikai

képéhez

gyakran

társulnak

immunpatomechanizmusú

paraneopláziás tünetek, így vasculitisek, immunhaemolyticus anaemia,

egyéb

immuncitopéniák, paraneopláziás dermatitisek, túlérzékenységi reakciók. A betegség tömeges sejtszéteséssel járó időszakaiban – de főként az alkalmazott kezelés hatására – előfordulhat haemolyticus uraemiás szindróma, felnőttkori respiratórikus distress szindróma (ARDS), vagy a kiserek áteresztő képességének fokozódásával járó „capillary leak” szindróma. E szövődmények kialakulásában a komplementrendszer és a patogén immunkomplex képződés egyaránt szerepet játszhat. Évtizedek óta ismerünk olyan adatokat, melyek lymphomás betegek savójában hipokomplementémiát és magas keringő IC szintet igazoltak (50). Rendszerezett eredmények a B-sejtes krónikus lymphoid

leukaemiában

(B-CLL)

szenvedő

betegek

komplement

funkcióival

kapcsolatban születettek (30). Az immunrendszer daganatait az immunvédelem csökkenése, sokszor igazolt immunhiány

kíséri.

Klinikailag

jellegzetes

a

lymphomás

betegek

nagyobb

fogékonysága a fertőzésekkel szemben. B-sejtes lymphomák esetében a fertőzések a fennálló immunglobulin hiányos állapottal, vagy a védelmi funkciót ellátni nem képes 21

kóros fehérjetermeléssel állhatnak összefüggésbe. A T-sejtes lymphomák esetében a Tsejtrendszer kóros működése áttételesen mind a celluláris, mind a humorális immunitás zavarát jelentheti. Ha a lymphomához komplementdefektus is társul, úgy súlyosbíthatja a zajló fertőzést, az opszonizáció és a MAC komplex képződés deficienciája miatt. A lymphomák korszerű kezelésében alkalmazott egyre hatásosabb, de egyúttal egyre agresszívebb kezelési módok kívánatos hatásának elérésében és mellékhatásaiban is számolnunk kell a komplementrendszer részvételével. A monoklonális antitest kezelések során az antitesttel kötött lymphoma sejtek pusztulása nagyrészt komplement mediálta lízis útján következik be. A komplementrendszer aktiválódása a kezelés folyamán lemérhető, az anafilatoxinok is részt vesznek az első dózisok beadásakor fellépő, gyakran súlyos, citokin reakciókban (51). A betegség gyógyítása céljából, megfelelő lymphoma típusokban és klinikai állapotokban,

autológ

perifériás

haemopoeticus

őssejtátültetést

(auto-PBSCT)

alkalmaznak. A nagydózisú előkészítő (kondicionáló) kezelés hepatotoxikus hatása a komplement faktorok termelődését befolyásolhatja. A citopéniás időszakban fellépő súlyos fertőzések autológ traszplantációk során éppúgy okozhatnak életveszélyes szeptiko-toxikus shock-állapotokat, ennek részeként heveny komplement aktivációt, mint allogén csontvelőátültetés esetén (52). Eddigi ismereteink alapján a malignus lymphomák kutatásában a komplementrendszer komponenseinek és funkcióinak vizsgálata hasznos lehet az etiológia, a tünetek kialakulásának megértésében a betegség lefolyásának jellemzésében, a kezelés hatásainak kifejlődésében és eredményességének lemérésében.

22

2. Célkitűzések Munkámban a következő feladatokat és összefüggések vizsgálatát tűztem ki célul: 2.1.

Új módszerek kidolgozása és felhasználása a komplementrendszer funkcióinak vizsgálatára és a keringő immunkomplexek jellemzésére. Vizsgálni a módszerek hasznosíthatóságát SLE-ben, mint autoimmun modellbetegségben.

2.1.1. Az ELISA technika alkalmassá tétele az immunkomplexek összetételének vizsgálatára: Vizsgálni az összefüggést az összetétel és a komplement paraméterek, valamint az SLE klinikai tünetei között. 2.1.2. Az immunkomplex szolubilizáció és immunprecipitáció gátlás, mint komplement közvetített funkciók mérése és tanulmányozása immunpatológiai kórképekben. 2.2.

A kidolgozott módszerek alkalmazása a komplementrendszer jellemzésére malignus lymphomákban. Összefüggés keresése a klinikai események és a komplement funkciókban megfigyelhető változások között. A kezelések hatására a komplement paraméterekben bekövetkező változások követése.

2.2.1. A komplementrendszer esetleges működési rendellenességeinek feltárása és jellemzése a komplement komponensek, az immunkomplex szintek és a komplement funkciók mérésével. 2.2.2. A malignus lymphomák remissziója, relapszusa, prognózisa és a mérhető komplement funkciók közötti összefüggések meghatározása. 2.3.

A szérum komplement szintek, komponensek és immunkomplex értékek változásainak

jellemzése

malignus

lymphomákban

végzett

autológ

haemopoeticus őssejtátültetés során. 2.3.1. Szövődménymentesen zajló transzplantációkban a komplement változások meghatározása. 2.3.2. Az infekciós és/vagy toxikus szövődmények hatásának mérése a szérum komplement

összetevőkre.

A

komplementszintek

követéses

vizsgálatai,

prognosztikai értékük a korai relapszus és a távolabbi betegségtörténet szempontjából.

23

3. Betegek és módszerek 3.1. Betegek A dolgozat alapját képező közleményekben feldolgozásra került betegek a két munkahelyen végzett tevékenységnek megfelelően oszlanak meg. Az SLE-ben végzett vizsgálatok alapját első munkahelyemen, a Debreceni Orvostudományi Egyetem (DOTE, Debrecen) III. Belklinikáján (jelenleg DEOEC III. Belklinika) 1975-97 között gondozott 530 beteg képezte. Közülük, a kezelőorvosokkal szoros együttműködésben történt a megfelelő számú beteg bevonása a vizsgálatokba (I, II, III, IV). A malignus lymphomás betegek egyik csoportját az általam a DOTE III. Belklinikán 1987-1996 között gondozott 265 non-Hodgkin lymphomában (NHL) szenvedő beteg alkotta. Általános klinikai jellemzőiket az 1. táblázat tartalmazza. A célvizsgálatokba beválasztott betegek adatait a saját közlemények tartalmazzák (VI). 1. táblázat: A non-Hodgkin lymphomás betegek összesített klinikai adatai (1987-1996, DOTE III. Belgyógyászati Klinika) Betegek száma

Összes: 265 fő 1987-ben már korábbi gondozásban volt: 107 1987-1996 közötti új beteg: 158

Nemek szerinti megoszlás

Férfi: 156; Nő: 109 Férfi/nő arány: 1,43:1

Diagnózis szerinti megoszlás

Mérsékelt malignitású NHL: 144 Kifejezett malignitású NHL: 105 Premalignus lymphadenopathia: 16

Életkor szerinti megoszlás

Mérsékelt malignitású NHL: Átlag: 58,89±16,70 év; (37-91év) Kifejezett malignitású NHL: Átlag: 45,84±16,85 év; (16-76 év)

Állapotuk 1996 decemberben

Élt: 103 fő Meghalt: 146 fő Elmaradt a gondozásból: 16 fő 24

A malignus lymphomás betegek másik csoportját későbbi munkahelyemen, az Országos Haematológiai és Immunológiai Intézet Immunológiai Osztályán (OHII, jelenleg OGYK, Budapest) 1997-2004 között ellenőrzött 234 malignus lymphomás beteg képezte. Összefoglaló klinikai adataikat a 2. sz. táblázat mutatja be. A feldolgozott betegek adatai a dolgozat alapját képező saját közleményben szerepelnek (VIII). Az előző, NHL-s betegcsoporttól eltérően, az OHII Immunológiai osztálya által gondozott betegek között Hodgkin-lymphomában és NHL-ben szenvedők egyaránt voltak. A betegcsoport jelentős része szelektált beteganyagnak tekinthető, kezelésük más intézményekben

kezdődött

és

Intézetünkbe

betegségük

súlyossága

transzplantációra való alkalmasság megítélése és előkészítése céljából kerültek. 2. táblázat: Malignus lymphomás betegek jellemző klinikai adatai (1997-2004 december, OHII/OGYK) Betegek száma

Összes: 234 fő Férfi: 119; Nő: 115 Férfi/nő arány: 1,03:1

Mérsékelt malignitású NHL

127 fő; Életkor: Átlag: 58,51±13,31 év; (24-88év)

Kifejezett malignitású NHL

67 fő Életkor: Átlag: 42,51±16,76 év; (16-82 év)

Hodgkin lymphoma

40 fő Életkor: Átlag: 29,36±10,41 (19-53év)

Állapotuk 2004 decemberéig

Él: 141 fő Meghalt: 78 fő Elmaradt a gondozásból: 15 fő

Autológ transzplantáció

49 fő 234 betegből

25

vagy

a

3.2. Módszerek 3.2.1. ELISA módszer Az enzimmel jelzett immunoszorbens meghatározás (ELISA) elvét 1974-ben Pesce és munkatársai írták le (53). Engwall és munkatársai alkalmazták először ezt a technikát szimplaszálú DNS (ssDNS) elleni antitest meghatározására (54). Hazánkban elsőként alkalmaztam az erre az elve épülő mikrotechnikát, először az ssDNS elleni, majd a duplaszálú DNS (dsDNS) elleni antitest szint mérésére (I, II, III). A mérés azon alapszik, hogy a polisztirol alapanyagú mérőlemezek (mikrotitrátor), vagy kis térfogatú (300μl) polisztirol mérőedények fala jól megköti a fehérjéket és néhány egyéb molekulát, ezáltal szilárd fázishoz kötött reakciókat tesz lehetővé, igen kis mennyiségben jelenlévő szérumkomponensek mérésére. A műanyag felszínen megtapadt antigénhez kötődik a mérni kívánt antitest. A következő lépésben enzimmel jelzett anti-humán immunglobulint mérünk a rendszerhez, mely második ellenanyagként kötődik a már lekötött, mérendő ellenanyag molekulákhoz. A reagens: nyúlban termelt anti-humán globulin, melyet torma-peroxidáz enzimmel konjugáltak. A kapcsolódó konjugátum mennyiségét az enzim szubsztrátjának, az 5-amino szalicilsavnak, vagy orto-fenilén-diaminnak a színes termékké bomló oldata tette láthatóvá. A kialakult vörösbarna színt spektrofotométerrel mérjük. Mikro-ELISA

technika

alkalmazása

ssDNS

elleni

antitest

szérumszintjének

mérésére Az antigén denaturált, borjú thymusból nyert DNS volt, mely jól kötődött a polisztirol felszínhez. A savó minták megfelelő hígításainak bemérése és inkubáció után IgGAM peroxidáz enzimmel jelzett konjugátumot adtam a kikötődött ellenanyag kimutatására. Az enzim szubsztrátja 5-amino-szalicilsav volt. A kimutatható anti-ssDNS ellenanyag szérumszintjének mennyiségét μg-ban is meg tudtam adni azáltal, hogy kidolgoztam egy globulin standard görbe egyidejű felvételét. A módszer segítségével 5μg/ml volt a mérhető legkisebb immunglobulin mennyiség. A módszer által mért értékeket addig a színes termék extinkciós értékével jellemezték (I ).

26

Mikro-ELISA technika alkalmazása dsDNS elleni antitest mérésére A módszer kidolgozásakor megoldást találtunk a natív dsDNS megkötésére a polisztirol reakciólemez felszínén azáltal, hogy metilált BSA bevonatot alakítottunk ki. A szérum ellenanyagtartalmát ekkor már az immunglobulin osztályok szerint mértük, IgG, IgA és IgM

ellen

termelt

standardizálásához

antitest

tartalmú

három

immunglobulinból

a

konjugátumokat

használva.

egyaránt

kalibrációs

A

mérés görbéket

készítettünk. A konjugátum enzimkomponense és annak szubsztrátja az előzőekben leírtakkal megegyező volt. – a mérés menetét a 2. ábrán szemléltetem (II ).

standard

minta I

mBSA

II

dsDNS

III

anti-dsDNS IgG /szérum/ E

IV

V

E

Peroxidázzal jelzett anti-humán IgG

IgG

E

szubszrát

Kalibrációs görbe Ext.

IgG

2. ábra: Mikro-ELISA technika alkalmazása dsDNS elleni antitest mérésére, a meghatározás lépései.

27

A mikro-ELISA módszer felhasználása az IC-ek összetételének vizsgálatára

E

polisztirol lemez vályulata

IC

IC

IC tartalmú precipitátum adszorbciója

Konjugátum: anti-humán IgG, IgA, IgM és C3 + peroxidáz enzim

szubsztrát: o-fenilén-diamin

3.a ábra: Immunkomplex összetételének vizsgálata ELISA technikával

E

polisztirol felszín bevonva metiláltBSA-val

IC DNS

IC DNS

ds DNS tartalmú IC-k

Konjugátum: hozzáadása

szubsztrát

3.b ábra: dsDNS tartalmú immunkomplex összetételének vizsgálata ELISA technikával A mérésekhez a szérummintákból polietilén glikol 3,5%-os oldatával készítettünk precipitátumot, az eljárás a savók keringő IC-tartalmának dúsítására szolgált. Az újraoldott precipitátummal inkubáltam a mikrotitrátor lemezek vájulatait. Ezt követően adtam hozzá az anti-humán IgG-t, -IgA-t és IgM-et tartalmazó konjugátumokat valamint anti-humán C3 konjugátumot, amely kapcsolódott a C3 hasadása során keletkező C3b, iC3b és C3dg fragmentumokkal is, de nem a C3a-val. A konjugátum jelző enzime az előzőekben leírtakkal megegyezett, a szubsztát orto-fenilén-diamin volt. A mérések értékeléséhez az immunglobulin standard görbék mellett C3 standard görbét is készítettem. A dsDNS elleni antitest méréséhez kidolgozott módszerrel, másik sorozatban metilált-BSA bevonattal ellátott vájulatokban is megismételtem a mérést, az IC-ben dúsított precipitátum dsDNS-t tartalmazó komplexeinek megkötésére. Az ilyen módon megkötött komplexek esetén az előzőekben leírt módon mértük az anti-human 28

IgG, IgA, IgM és C3 tartalmú konjugátumokat. A megkötött konjugátum mennyisége arányos volt a kitapadt komplexek immunglobulin és C3 fragmentum tartalmával, melyek mennyiségét a standard görbék segítségével határoztam meg. A módszernek nincs irodalmi előzménye, saját ötletem alapján munkatársaimmal terveztük meg a kísérletet, elvét a 3.a és 3.b ábrán mutatom be. A méréseket a precipitátum dsDNS tartalmának mérésével egészítettem ki (III ). 3.2.2. Komplement mediálta immunkomplex szolubilizáció (CMSC) A mérést Miller és Nussenzweig által leírt módszer adaptálásával végeztem (16). J125 izotóppal jelezett bovin szérum-albumin (BSA) és anti-BSA-ból, antitest túlsúlyban, mesterséges IC-eket készítettünk. A precipitátumot tisztítva és megfelelő higításban, friss humán savóval inkubáltuk 37oC-on. Centrifugálással választottuk szét a felülúszóba kerülő szolubilizálódott IC-eket, az üledékbe kerültek a nagyobb aggregátumok. A felülúszót eltávolítva mértük annak és az üledéknek a radioaktivitását. A szolubilizációs képességet a teljes aktivitás százalékában adtuk meg aszerint, hogy a felülúszóban milyen hányada jelent meg a teljes aktivitásnak. szolubilizációs kapacitás 90 - 100 % + kevert egészségesektől származó szérum

IC

+ vizsgált szérum

?%

IC IC

+ negatív kontroll [ hőinaktivált savó ]

< 10 % IC

inkubáció majd centrifugálás után: CMSC % =

IC

felülúszó aktivitás felülúszó + precipitatum aktivitás

x 100

4. ábra: Komplement mediált immunkomplex szolubilizáció (CMSC) mérésének elve IC: Izotóppal jelzett BSA + anti-BSA komplex 29

3.2.3. A komplement mediálta immunprecipitációgátló kapacitás (IPIC) A módszert Schifferli és munkatársai által leírt metodika alapján dolgoztuk ki (14). J125 izotóppal jelzett BSA oldathoz mértük a vizsgálandó friss, vagy –70oC-on tárolt szérummintát, majd 37 oC-on inkubálva a keveréket, hozzá adtuk az anti-BSA ellenanyag equivalens dózisát. A friss szérum jelenlétében az antigén-ellenanyag komplexek kisebb, oldott állapotban lévő formája képződött, míg hőinaktivált szérumban hozva létre a reakciót, a képződő komplexek kicsapódtak. A reakció leállítása után centrifugálva, a mintákban külön választottuk a felülúszót és az üledéket, külön mértük azok radioaktivitását. A precipitáció gátlás mértékét a teljes elegy radioaktivitásának százalékában adtuk meg, aszerint hogy annak milyen hányada került a felülúszó folyadékba.

precipitáció gátló kapacitás 90 - 100 %

BSA IC BSA + kevert egészséges szérum

?% BSA

+ Anti-BSA IC IC

BSA + vizsgált szérum < 20 % IC

BSA BSA + hőinaktivált szérum / negatív kontroll

IC

inkubáció majd centrifugálás után: felülúszó aktivitás IPIC % = x 100 a negatív kontroll teljes aktivitása

5. ábra: A komplement mediált immunprecipitáció gátló kapacitás (IPIC) mérésének elve BSA: J125-tel jelzett bovin szérum albumin IC: Izotóppal jelzett BSA + anti-BSA komplex

30

3.2.4. A klasszikus reakcióút összaktivitása – CH50 mérése A CH5o érték meghatározása a komplement haemolyticus aktivitása alapján Mayer módszerével történt (6). 3.2.5. C3 és C4 komplement faktorok meghatározása A meghatározás radiális immundiffúzió módszerével történt (6). 3.2.6. A keringő immunkomplex szérumszint meghatározása A meghatározás két módszer alapján történt. A DOTE laboratóriumában végzett meghatározások során a polietilén glikollal (PEG) történő precipitáció képezte a mérés alapját, amely Digeon által leírt módszer szerint történt (55). Az OHII laboratóriumában történt mérések során az un. komplement felhasználási (konzumpciós) tesztet alkalmaztuk (56). A két módszer eltérő tulajdonságaikon keresztűl méri a szérum keringő IC tartalmát, az első a preparátum turbiditásának változását, míg a másik az ICek komplementaktiváló képességét használja fel. A módszerek korrelálnak, de a korreláció nem szoros (69).

31

4. Eredmények A dolgozat anyagát képező közleményekben és könyvfejezetben leírt eredményeket, a dolgozat gondolatmenetének megfelelően és a saját közlemények sorrendjében foglaltam össze. 4.1. Az ELISA elvén működő mikro-módszert adaptálva SLE-ben szenvedő betegek szérummintáinak szimplaszálú DNS elleni antitestjeinek szérumszintjét mértük. Az antitest mennyiségének mérése céljából IgG standard görbét készítettünk. Az oldat hígítási során egyidejűleg elvégeztük a mérést a módszerrel. A standard görbe segítségével, µg/ml értékben adtuk meg a szérumminták anti-ssDNS tartalmát. Az eredményeket radioimmunassay kit eredményével összevetve, a korrelációs koefficiens 0.99 volt (I). 4.2. A mikro-ELISA technika felhasználásával a dsDNS elleni antitestek mérésére fejlesztettünk ki módszert. A natív (ds)DNS polisztirol felszínen történő megkötéséhez metilált BSA bevonatot alkalmaztunk. Igazoltuk, hogy ezzel az eljárással elegendő mennyiségben tudtunk antigént biztosítani a méréshez. Az anti-dsDNS szérumszintjét mértük mindhárom fő immunglobulin osztályban és standard görbék segítségével a mennyiségeket is pontosan meg tudtuk adni. SLE-s betegek (60 beteg) és egészséges kontrollok (20 személy) szérummintáit mérve azt találtuk, hogy az SLE-s betegek szérummintáiban szignifikánsan magasabb anti-dsDNS IgG és IgM volt, mint a kontroll savókban. A betegség aktivitása idején az IgG típusú ellenanyag szérumszintje haladta meg szignifikánsan az inaktív stádiumban lévők értékeit (II). 4.3. A mikro-ELISA eljárás elvének felhasználásával kidolgozott módszer alkalmasnak bizonyult a keringésből szeparálható IC-ek minőségi és mennyiségi összetételének vizsgálatára.

SLE-s

készítettünk

IC-ekben

betegek dúsított

szérummintáiból preparátumot,

polietilén-glikol ezzel

inkubáltuk

precipitációval a

polisztirol

reakciólemezeket. Előkísérletekben határoztuk meg a készítmények megfelelő higításait. A kitapadt komplexek immunglobulin és C3 komplement komponens tartalmát enzimmel jelzett konjugátumok és standard görbék használatával mértük. Vizsgáltuk a dsDNS tartalmú immunkomplexek összetételét is, olymódon, hogy azokat dsDNS komponensükön keresztül, metilált BSA-val bevont reakciólemezek felszínén 32

kötöttük meg. A nem kötődött komplexek eltávolítása után mértük az immunglobulin és C3 fragmentum tartalmat. A méréseket 68 SLE-s beteg szérummintáiban végeztük el, a betegség aktivitása és veseérintettség fennállása szerinti csoportosításban. Az új módszerrel kapott eredmények összehasonlíthatónak bizonyultak az irodalomban közölt, a komplexek megbontása útján mért értékekkel. Elsőként vizsgáltuk és mértük a megbontatlan IC-ek C3 komplementből származó összetevőit. Szignifikánsan alacsonyabb volt az IC preparátumban mérhető C3 tartalom a betegség aktivitása idején és a veseérintettséget mutató betegek csoportjában, az inaktív és a nem nephropathiás betegekével összehasonlítva (p<0,05; ill.:p<0,01). A dsDNS tartalmú komplexek vizsgálata során a betegség aktív stádiumában az IgM tartalom volt szignifikánsan magasabb.

Az

aktív

stádiumban

lévő

SLE-s

betegek

széruma

fokozottan

hipokomplementémiás környezetet teremtett az IC képződéshez. A megfigyelés megerősíti, hogy ilyen körülmények között inkomplett módon szolubilizált IC-ek jelennek meg a keringésben, melyek további komplementaktivációt képesek előidézni (III). 4.4. SLE-s betegek szérumának komplement mediált immunkomplex szolubilizáló képességét vizsgáltuk mesterségesen előállított és izotóppal jelzett BSA-anti-BSA komplexeken. 65 SLE-s beteg és 25 egészséges kontroll szérummintáit vizsgáltuk. A betegeket a betegség aktivitása és a veseérintettség szempontjából csoportosítottuk. A minták szolubilizáló képességét összehasonlítottuk az ugyanazon mintában mért keringő IC szinttel és az immunkomplex összetételének eredményeivel. A betegek savójának IC szolubilizáló kapacitása szignifikánsan alacsonyabb volt, mint az egészségeseké (p<0,001). Az aktív stádiumban vett, és a nephropathiát mutató esetekben is szignifikánsan alacsonyabb volt a mért érték a tünetmentes betegekéhez viszonyítva (p<0,001). A szolubilizáló képesség értékét összehasonlítva a mért egyéb paraméterekkel, korrelációt a magasabb szérum IC szinttel és a szérum alacsonyabb C3 szintjével találtunk (IV). 4.5

Feldolgoztam

az

immunkomplex

képződés,

feldolgozás

és

elimináció

mechanizmusában összegyűlt megfigyeléseket, a komplementrendszer szerepét az immunkomplexek képződés fiziológiás és patológiás történéseiben. Az IC-ek hatására visszavezethető gyulladások klinikai jelentőségét tárgyalva nemcsak az autoimmun 33

betegségekkel való összefüggéseket, de más immunkomplex patomechanizmusú tünetcsoport klinikumát is érintve, a malignus lymphomák kórlefolyásában is rámutattam az immunkomplexek szerepére (V). 4.6 Non-Hodgkin lymphomában szenvedő betegek komplement paramétereit és komplement funkcióit, köztük a komplement mediált immunkomplex szolubilizáló képességet és az immunprecipitáció gátlás képességét mértük. A betegcsoportok kialakítása a Kiel-i nomenklatura szerint történt. 14 kifejezett malignitású, 14 mérsékelt malignitású non-Hodgkin lymphomában szenvedő beteg vizsgálata történt a betegség parciális vagy teljes remissziójában, és 14 B-CLL-ben szenvedő beteget is értékeltünk a betegség nem kezelt, tünetmentes stádiumában. A szolubilizáló képesség és az immunprecipitációt gátló képesség a kifejezett malignitású - és a mérsékelt malignitású lymphomában szenvedők csoportjában egyaránt szignifikánsan alacsonyabb volt, mint az egészséges kontrollok értékei (p<0,001 , ill. p<0,05). A precipitáció gátló képesség és a szolubilizáló kapacitás csökkenése a magasabb keringő immunkomplex szinttel mutatott kapcsolatot, míg a precipitáció gátlás képessége alacsony CH50 és C3 szérum szint esetén volt alacsonyabb (VI). 4.7. B-sejtes chronicus lymphocytás leukaemiában (B-CLL) szenvedő betegek követéses vizsgálatáról számoltunk be a kollaborációs közleményben. 46 beteg szérummintáiban történt a komplement paraméterek vizsgálata. A minták részben az Országos Haematológiai Intézetben, részben a DOTE III Belklinikáján gondozott betegektől származtak. Az első komplement vizsgálat a diagnózis felállítása körüli hónapokat jelentette. Nyolc évvel később ismét összegyűjtöttük a betegek klinikai adatait és két csoport kialakítására nyílt lehetőségünk. Az egyik a rövid túléléssel jellemezhető csoport, amelyik kevesebb, mint 4 évvel az első komplement vizsgálatot követően meghalt és a másik, a hosszabban túlélők csoportja. A kiindulási komplement paraméterek közül, a klasszikus út komponenseinek deficienciáját jelző CH50 érték a röviden túlélők között szignifikánsan alacsonyabb volt (p<0,002), kisebb mértékben, de szignifikánsan alacsonyabb C3 szérumszint mellett. Az eredmények a komplement paraméterek prognosztikai értékére utalnak B-CLL-ben (VII). 4.8. Malignus lymphomában szenvedő, betegségük első vagy második teljes remissziójában lévő betegek autológ haemopoeticus őssejtátültetésének eseményeivel 34

párhuzamosan vizsgáltuk a CH50, C3, C4 értékeket és a keringő immunkomplex szinteket. Követéses vizsgálatokat 17 betegben végeztünk. A transzplantáció szövődménymentesen zajlott 14 betegben, 3 betegnél léptek fel szövődmények. A 14 betegben, a kondicionáló kezelés hatására, szignifikánsan csökkent a CH50, C3, C4 érték, majd az őssejt visszaadást (autológ transzplantáció, 0. nap) követő +7. naptól visszatért a kiindulási szintre. Ezzel ellentétben, a keringő immunkomplex szint a transzplantációt követő 7-14 nap között emelkedett szignifikánsan. A változások ellenére, az értékek a széles normál tartományon belül maradtak. Két betegnél szeptikus shock lépett fel a +8 illetve a +11 napon, mely a betegek halálához vezetett. Esetükben a +7 napon mért értékek szignifikáns emelkedést mutattak a kiindulási értékekhez képest. Egy esetben korai relapszust jelzett a +21 napon csökkenő, a +35 napon már egyértelműen alacsony komplement paraméterek értéke és az emelkedő immunkomplex szint, néhány héttel megelőzve a klinikai tüneteket. Az autológ traszplantáció folyamata során meghatározva a komplement változások mintázatát, az attól eltérően viselkedő paraméterek a szövődmények előjelzőjeként szerepelhetnek (VIII). 4.9. A könyvfejezet az angioimmunoblastos lymphadenopathiáról és ennek talaján kialakuló malignus lymphomákról készült irodalmi összefoglaló. A betegség kezdetben súlyos,

életveszélyes

immunszerológiai

heveny

paraméterek

infekciónak alapján

a

klinikai

tüneteit

immunpatomechanizmusú

mutatja.

Az

gyulladásos

betegségképet észlelünk, amit sajátos lymphadenopathia kísér. A betegek egy része meggyógyul immunszupresszív kezelésre, más részükben rossz prognózisú kifejezett malignitású lymphoma alakul ki. A kórkép patomechanizmusával kapcsolatos ismereteket elemezve, az autoimmun betegségekben zajló változásokban és a kezdődő lymphomás proliferációban egyaránt az immunreguláció defektusai tükröződnek (IX).

35

5. Megbeszélés A komplementrendszer komponenseinek és funkcióinak vizsgálata ma már a klinikai diagnosztika része, mely elsősorban az autoimmun betegségek diagnózisát és a betegség aktivitásának a megítélését segíti. Kivételt a hazánkban külön centrumban gyűjtött és vizsgált veleszületett vagy szerzett angioneurotikus oedemák gyanúja esetén végzett komplement vizsgálatok jelentenek (57). A hagyományosan vizsgált paraméterek a CH50 meghatározás, a C3, C4 szérumszint és a keringő immunkomplex szint mérése, melyek elsősorban a klasszikus komplement aktivációs út jellemzésére alkalmasak. Az ezekben a paraméterekben talált eltérések jól jelzik, hogy a komplementrendszer működésében zavar észlelhető, de nem tárják fel az eltérés okát, pl., hogy az alacsony C3 vagy C4 szintet a csökkent termelődés vagy a faktorok felhasználódása okozza-e. Olyan új módszereket kerestünk, amelyek jobban megvilágítják a kapott komplement eltérések hátterében zajló folyamatokat, és közelebb visznek a komplementrendszer közreműködésével zajló betegségek patomechanizmusának jobb megértéséhez. Az alkalmazott módszerek helytállósága, továbbfejlesztése Munkáinkban az ELISA mikrotechnika adaptálásával találtuk meg azt a módszert, amely a kísérleti mérésekhez rendkívül alkalmasnak bizonyult. Az orvosbiológiai mérések hibalehetőségeinek kiküszöbölése után, hazánkban elsőként közöltünk ssDNS elleni ellenanyagszinteket SLE-s betegek szérumában. A módszer elvét használva meg kellett oldani a mért értékek interpretálásának módját, amit az immunglobulin standard görbe alkalmazása biztosított. A mérések eredményeit, a mért ellenanyag szérumkoncentrációját µg/ml-ben fejeztük ki. Az ELISA elvét használva, továbbfejlesztettük a módszert és metilált-BSA–val bevont polisztirol felszínt alakítottunk ki. Ezzel lehetővé vált olyan antigén megkötése a mérés céljaira, amely spontán nem adszorbeálható ebben a rendszerben. Ezzel a megoldással először mértünk duplaszálú DNS elleni antitestet, és tudtuk megadni azok szérumkoncentrációját az immunglobulin standard görbék segítségével. Az ELISA módszer ma általánosan használt eljárás az anti-dsDNS szint mérésére, más munkacsoportok inkább a protamin szulfát bevonatot használják a dsDNS megkötésére (58). 36

Az ELISA módszer elvét használtuk fel az immunkomplexek összetételének vizsgálatára és mérésére is. A mérések technikai nehézségét az jelentette, hogy a vizsgált szérumminták keringő immunkomplex tartalma nagymértékben eltérő volt, és meg kellett határozni azt a hígítási szintet, ahol a legszélesebb tartományban tudtuk mérni az összetevőket. Időnként két hígítási koncentrációban mértük egy-egy minta összetételét. A mért értékeket a komplexekben megkötött C3 fragmentumok mérése esetében is µg/ml-ben adtuk meg a standard görbék segítségével. Az ELISA elv jól használható új kísérleti mérések összeállítására és a napi diagnosztikában egyaránt. A kereskedelemben egyre specifikusabb konjugátumok kaphatók, és nagyszámú gyors mérést tesznek lehetővé az automata leolvasó készülékek. A komplement mediálta immunkomplex szolubilizációs kapacitásának (CMSC) és a szérum immunprecipitáció gátló képességének (IPIC) mérésére vonatkozó módszereket alkalmazva, a komplementrendszer és az immunkomplex képződés mechanizmusának jobb megismerése vált lehetővé. Az így szerzett ismeretek nagy lendületet adtak az immunkomplex kutatásnak. A módszerek által modellezett jelenségek, ma már beépültek a komplementrendszer és az immunkomplex feldolgozás fiziológiájának ill. az immunkomplex patomechanizmusú betegségek értelmezésének elméleteibe (5, 21). A gyakorlatban, mint a klasszikus és az alternatív komplement utak funkciójának mérésére alkalmas diagnosztikus módszerek bírnak jelentőséggel. Széles körben való alkalmazásukat a méréshez használt izotóp technika akadályozta a legutóbbi időkig. 1999-ben Aranson és munkatársai kidolgozták a módszer izotópjelzést feleslegessé tévő változatát (17). A korábbi kutatásokban, és az általunk használt mesterséges immunkomplexben is, az antigén komponens a J125 izotóppal jelzett bovin szérumalbumin volt, amihez a nyulakban termelt anti-BSA molekula kapcsolódott. Az antigén izotóppal való összekapcsolását gyakran ismételtük, mivel a készítmény nem volt hosszú ideig tárolható, emellett izotóp-laboratóriumi hátteret igényelt. Aranson és munkatársai a mesterséges immunkomplexet alkalikus foszfatázból és az enzimmel szemben termelt antitestből állították össze. Az enzim szubsztrátjának bomlását kolorimetriával mérték, és mindkét reakció lezajlása után, ELISA módszerrel határozták meg a felülúszóban lévő enzimtartalmat. A módszer technikai kidolgozása után megjelentették az SLE-s szérumokban végzett méréseikről szóló első összefoglalót. 37

Eredményeikben korrelációt találtak a klasszikus és az alternatív aktivációs út működésével,

de

nagy

betegcsoportot

vizsgálva

megállapították,

hogy

az

immunprecipitáció inhibiciós kapacitás korai stádiumban és tünetmentes SLE betegek esetén is alacsony értéket mutat, megelőzve a más komplement paraméterekkel kimutatható komplement funkciós defektusokat (18). Az SLE-s betegek vizsgálata során kapott eredmények értékelése Az SLE-s betegek vizsgálata során az ELISA technika elvén kifejlesztett mérési módszerrel először az anti-DNS antitestek pontos mérése valósulhatott meg. Az alkalmazott módszer ma is korszerű, eredményeink az anti-dsDNS szint mérésében helytállóak. Az SLE diagnózisának felállításában használt korábbi ARA, ma ARC kritériumok része a “dupla szálú DNS elleni antitest kimutathatóság” (59). Napjainkban több módszer használatos az anti-dsDNS szint mérésére, és más antinukleáris antitest meghatározásokra, de egyelőre ennek a kritériumnak az elhagyását nem javasolják, és a vizsgálati módszerek közül elfogadhatónak ma is az ELISA teszttel végzett meghatározást tartják (60). Az anti-dsDNS szintek és a betegség aktivitásának változása vonatkozásában az antiDNS IgG szint emelkedését találtuk meghatározónak, melyet más szerzők is megerősítettek, szemben az anti-dsDNS IgM változásaival (58). A keringő immunkomplexek összetételének megismerhetősége izgalmas klinikai kutatási

területnek

ígérkezett.

Az

IC-összetétel

vizsgálatát

SLE-s

betegek

szérummintáiban, az ELISA elven működő mérési módszerekben megszerzett nagyobb gyakorlatunk, a módszerben rejlő nagy variálhatóság tette lehetővé. A keringő immunkomplexek összetételére vonatkozó kevés adat elsősorban a komplexek megbontásával, majd radiális immundiffúzióval történt vizsgálatokból származott (61). Vizsgálatainkban, a komplexek megbontása nélkül, mérhetővé vált a preparátum immunglobulin

összetevőinek

mennyisége.

Eredményeink

szerint

az

SLE-s

immunkomplexben döntően IgG van jelen, kb. az IgG mennyiség l/3-ának megfelelő IgM, valamit kb. 10% mennyiségének megfelelő IgA. A mért mennyiségek vonatkoztatása nehéz, hiszen egészségesek széruma csak minimális mennyiségben tartalmaz IC-eket. Ezért az aktív és inaktív stádiumban lemért SLE-s mintákat 38

hasonlítottuk össze, miután a keringő IC-szint alapján korrigáltuk a mért mennyiségeket. Az arányok és az immunglobulin mennyiségek vonatkozásában nem volt kimutatható szignifikáns különbség. A kapott értékeket ezen kívül össze tudtuk hasonlítani más, emelkedett keringő IC szintet mutató kórképben talált eredményekkel is. Azonos módon megmértük 18 angioimmunoblastos lymphadenopátiában (AIBL) szenvedő beteg immunkomplexeinek immunglobulin tartalmát, ahol a mért értékek arányaikban is eltérőek voltak (IgG: SLE-ben, átlag: 108,6 µg/ml; AIBL-ban, átlag: 77,6 µg/ml; IgA: SLE-ben, átlag: 18,16 µg/ml; AIBL-ban, átlag: 52 µg/ml; IgM: SLEben átlag: 33,2 µg/ml; AIBL-ban, átlag: 47 µg/ml) (62). A dsDNS-hez kötődött immunglobulin tartalom mérése során az anti-dsDNS IgM mennyiségét találtam szignifikánsan magasabbnak az aktív tüneteket mutató betegekben (p<0,01). Ennek lehetséges magyarázataként az aktív stádiumban megjelenő anti-IgG reuma-faktor kapcsolódása feltételezhető. Az immunkomplex összetétel vizsgálata során a C3 fragmentumok mennyiségét is mértük és ebben szignifikáns eltérést találtunk. Mind az aktivitást, mind a veseérintettséget

mutatók

csoportjában

az

érték

alacsonyabb

volt,

mint

az

összehasonlításként szolgáló inaktív és nem vesebeteg SLE-sek csoportjaiban. A megfigyelést a hipokomplementémiás környezetben képződött és inkomplett módon szolubilizálódott komplexek jelenlétével lehetett magyarázni (22, 23). Ez a magyarázat ma is helytálló, miután a komplexek in vivo keletkezésében a komplementrendszer szerepe részleteiben is tisztázódott (19, 20, 22). Az SLE-ben mért C3 fragmentum értékeket összehasonlítottam az AIBL-ban szenvedő betegek immunkomplexeiben mért C3 fragment összetétellel, itt is alacsonyabb értéket kaptam, mint a tünetmentes SLE-s betegek csoportjában (SLE-ben, átlag:1,51 µg/ml; AIBL-ban, átlag:0,57µg/ml). Az AIBL-ban észlelhető hipokomplementémia, magasabb IC-szint és a klinikai tünetek között gyakori immunkomplex patomechanizmusú gyulladások alapján a mért adat magyarázható (62, 63). Nagy betegcsoporton követve a komplement

paraméterek

változásait,

japán

szerzők

a

hipokomplementémia

megjelenését a betegség-aktivitás legfontosabb laboratóriumi tünetének tartják (32). Nagyszámú SLE-s beteg vizsgálata során igazoltuk a komplement mediált immunkomplex szolubilizáció (CMSC) csökkenését a hazánkban elsőként adaptált 39

módszerrel. A szolubilizáló képesség csökkenése az alternatív komplement út deficienciáját igazolja a betegségben. In vivo, szerepe az immunkomplexek képződésében és feldolgozásában kisegítő jellegű a klasszikus út immunprecipitációt gátló képessége mellett. A SLE-s betegek savómintáinak alacsonyabb kapacitása a mesterséges komplexek feloldására, az alternatív út faktorainak konzumpciójával függhet össze, mivel ez a mechanizmus végzi az inkomplett módon szolubilizálódott és a keringésből kiszűrődött komplexek “feldarabolását”, jelentős helyi gyulladást okozva (15, 21). Később a CMSC mellett a betegek immunprecipitációs képességét (IPIC) is mértük, a CMSC és a CH50, AP50, C3 szérumszint és keringő IC szint függvényében. A CMSC az AP50 szinttel és a keringő IC szinttel mutatott szorosabb korrelációt, míg az immunprecipitáció gátló kapacitás inkább a CH50 értékkel mutatott összefüggést (64). Malignus lymphomában szenvedők vizsgálatai során kapott eredmények értékelése A malignus lymphomában szenvedő betegek kórlefolyása során gyakran tapasztalt infekcióhajlam,

a

betegség

progressziója

idején

gyakran

megfigyelhető

immunpatomechanizmusú paraneopláziás tünetek, a betegekben mért magas keringő immunkomplex szint, és az angioimmunoblastos lymphadenopáthiák kórlefolyása során tapasztalt kettőség - súlyos immunpatomechanizmusú gyulladás és malignus lymphomába történő transzformáció - indítottak arra, hogy a komplementrendszer funkcióit vizsgáljam ezekben a kórképekben. A komplement funkciókat 42 NHL-s betegben is megvizsgáltuk, a betegeket 3 csoportra osztva. A csoportosításban a Kiel-i nomenklatúra ajánlását alkalmaztuk és harmadikként külön értékeltük a CLL-s betegeket (64, 65). Klinikailag a három csoport különböző tulajdonságokkal rendelkezik. A kifejezett malignitású lymphomák jellemzője a gyors progresszióra való hajlam, a súlyos általános tünetek és a kezelésekre adott jó válaszkészség, miáltal teljes remisszió érhető el. Az alacsony malignitású lymphomák csoportjára a lassú tumornövekedés, az enyhe tünetek, hosszabb túlélés jellemző, és az, hogy a kezelésekkel teljes remisszió csak nehezen érhető el és rövid ideig tart. Bár a modern klasszifikációk az egyes entitások egyedi vonásait helyezik előtérbe, a klinikai gyakorlatban ma is hasznosítható a Kiel-i munkacsoport ajánlása, és a fenti két klinikai 40

csoport megkülönböztetése. A harmadik csoportot alkotó a B-CLL osztályozás szerint a mérsékelt malignitású lymphomák között

szerepel,

azonban

sajátos

klinikai

tulajdonságokkal és gyakori autoantitest képződéssel járó lymphoma entitást képvisel. A kifejezett malignitású lymphomában szenvedők csoportjában szignifikánsan gyakoribbak voltak a komplement deficienciák. A betegek felében, több paraméterben is eltérést igazoltunk, mellyel megegyező arányban volt kimutatható a szolubilizáló és immunprecipitációt gátló képesség csökkenése is. A mérsékelt malignitású lymphomák valamelyikében szenvedő betegek között is igen gyakran, kb. minden negyedik betegben lehetett hasonló eltérést kimutatni. A talált eltérések a komplementrendszer szerzett defektusának gyakoriságát igazolják NHL-ben. A hipokomplementémia, és az immunkomplex feldolgozásban kialakuló deficiencia pontos oka ma még nem ismert. Valószínű, hogy több okra vezethető vissza a defektus. Feltételezhető a komplement faktorok folyamatos felhasználódása (konzumpció) a folyamatos komplement aktiváció következtében, vagy a hosszan tartó citosztatikus kezelések máj-károsító hatása, mely csökkent faktortermelődést eredményezhet. Feltételezhetőek a háttérben olyan, a termelődés szupresszióját okozó, ma még ismeretlen tényezők is, melyek a lymphoma előrehaladása, progressziója során jelenhetnek meg. A B-CLL-ben szenvedő betegek kiválasztásakor nem került a vizsgálatba komplement defektust mutató beteg. Más kutatók, így elsősorban Füst és munkatársai munkáiból, illetve saját klinikai tapasztalatokra alapozva is feltételezhető volt, hogy CLL-ben is megjelenhetnek komplement eltérések (30, 65). A budapesti és debreceni nagyszámú betegcsoport közös feldolgozása lehetővé tette, hogy több információt szerezzünk ebben a kérdésben. A közös munkacsoport igazolta, hogy a B-CLL-ben szenvedők között a klasszikus komplement út deficienciája kimutatható, és az immunprecipitáció képessége is csökken (66). Közös betegeink követéses vizsgálata alapján az érintett CLL-es betegek prognózisa eltért azokétól, akik komplement paraméterei a normális tartományban voltak. Kedvezőtlen kórlefolyás és a rövidebb túlélés jellemezte a hipokomplementémiás betegcsoportot. A kedvezőtlen kimenetel és a komplement defektus között közvetett kapcsolat lehetséges. Jelenleg is 8 (5,7%) következetesen hipokomplementémiát mutató beteget találtunk a gondozott 46 B-CLL-es betegünk között. Jellemzőnek találtuk, hogy betegségük nem jár magas fehérvérsejt számmal, 41

kóros nyirokcsomótömegük nem nagy, de 4 esetben immunhaemolyticus anaemia, 6 betegben alacsony thrombocyta szám, 3 esetben gyógyszer-túlérzékenység és urtikária hajlam, l esetben súlyos bullosus paraneopláziás dermatitis, 2 esetben thrombosisok és gyakorlatilag mindegyikőjükben idült felsőlégúti infekciók mutathatók ki. Két betegben a betegség kezdetén még normális CH50, C3, C4 érték később folyamatosan csökkent, míg a 6 másik esetben már a diagnózis időpontjában sem voltak normális tartományban a komplement paraméterek. Ennek a különleges betegcsoportnak a további vizsgálatait Füst professzor munkacsoportjával tervezzük végezni. Az autológ haemopoeticus őssejtátültetés hatását a komplement funkciókra és a komplement komponensekre azért terveztük, mert nem találtunk erre vonatkozó adatot a nemzetközi irodalomban, pedig a súlyos komplement aktivációt jelző szeptiko-toxikus shock szindróma tünetei ebben a beavatkozásban is előfordulnak, bár az allogén transzplantációkhoz viszonyítva, sokkal ritkábban. Komplementrendszer vizsgálatát allogén transzplantációkban is ritkán végezték. Hazai eredmények elsősorban az akut és krónikus graft-versus-host betegség (GVDH) vonatkozásában tártak fel összefüggéseket a GVHD és a komplement funkciók csökkenése között (67). A CH50, C3, C4 szint és a keringő IC szint mérések eredményeit 17 autológ transzplantációban, annak jellegzetes időpontjaiban összegeztük. Közülük a 14 eseménytelenül zajló transzplantáció értékei jelentették a viszonyítási alapot. “0” pontnak az őssejt-visszaadás (transzplantáció) napját tekintve, a -7. napon a transzplantáció előtti értékként a remisszióban lévő betegek adatait kaptuk. A -2 nap a nagydózisú kemoterápia (kondicionáló kezelés) utolsó napja, a közvetlen toxikus hatás lemérésére alkalmas időpont. A +7. nap a csontvelői aplázia időszaka, amikor leggyakoribb a szeptiko-toxikus shock kialakulása. A +21 nap a vérképzés visszatérését (regeneráció), a +35 nap a vérképzés és az általános állapot stabilizálódásának időszakát jelentette. A paraméterek változása alapján összeállítható volt az ebben az időszakban jellegzetes komplement változások mintázata, amelytől eltérő értékek esetleg kapcsolatba hozhatók a transzplantáció szövődményeivel. Az átlagos transzplantáció lefolyást jellemző mintázat ismeretében értékelni tudtuk a komplement funkciók változását azokban a betegekben, akikben súlyos, halálos végű, szeptiko-toxikus shock szindróma alakult ki. A transzplantációt megelőző, kondicionáló kezelés célja, hogy a 42

reziduális lymphoma sejteket elpusztítsa. Hatása nem szelektív, így nagymérvű sejt és szövetpusztulást okoz a szervezet egészében, ennek része a csontvelői aplázia kialakulása. A sejtszétesés nagymértékű citokin felszabadulást és komplement aktivációt is előidézhet. Károsodhatnak az erek endotél sejtjei, a kapillárisok áteresztőképessége fokozódhat és a koagulációs rendszer faktoraiban is felléphet aktiváció, majd konzumpció. Ezt a tünetegyüttest az általános gyulladás akut, súlyos jelei kísérik, kialakulhat a SIRS néven összefoglalt tünetcsoport (systemic inflammatory respons syndrome) is (68). Létrejötte a szövetkárosodás mértékétől, és a beteg szervezetének válaszkészségétől is függ. Ha ebben az időszakban egyúttal bakteriális és/vagy vírusfertőzés is fellép, úgy nagyobb a valószínűsége, hogy súlyos lefolyású lesz az általános gyulladásos reakció. Különösen veszélyeztetettek a súlyosan előkezelt, számtalan infekció során károsodott szervezetű betegek. A tünetcsoport kialakulása során a C3a és a C5a szérum szint jelentős megemelkedése észlelhető, mely nagymértékű komplement aktivációra és felhasználódásra utal. A két súlyos állapotú transzplantált betegnél a CH50, C3 és C4 szint csökkenését vártuk, de mindkét esetben emelkedtek az értékek. Ennek magyarázata, hogy infekció is szerepet játszott a súlyos tünetcsoport kialakulásában és ennek hatására stimulálható volt a komplement szintézis, mely ellensúlyozta, sőt túltermelődéssel biztosította az aktivációhoz szükséges komplement faktor mennyiséget. A SIRS reakciót vizsgálva leírták, hogy a C3a szint emelkedése diagnosztikus velejárója a tünetcsoportnak, de nem vizsgálták közben a komplement szérumszintek alakulását (66). Úgy vélhető, hogy a transzplantációnak ebben a peridusában, a +2 és a +20 napok között, a gyorsan, olcsón elvégezhető komplement mérések hasznosak lehetnek. A szokásostól eltérő, ebben az esetben emelkedő értékek felhívhatják a figyelmet a súlyos szeptiko-toxikus szövődmény kialakulására, és időt biztosíthatnak a megelőzésre. A harmadik – később szövődményt mutató - transzplantált betegben a vérkép rendeződése és az általános állapot stabilizálódása után a komplement paraméterek és a CH50 szint csökkenését észleltük a panaszmentes állapot ellenére. Ismertük a beteg kórtörténetéből, hogy a lymphoma aktivitása idején hipokomplementémiás paraméterei voltak, amelyek remisszióban rendeződtek. A komplement szintek további csökkenése mellett kb. 3 hét elteltével jelentkeztek a korai relapszus klinikai tünetei is. A betegség 43

lefolyása során megjelenő hipokomplementémia jellegzetes tulajdonságnak tartható, mely a remisszió és a relapszus jelzésére alkalmas lehet. Az angioimmunoblastos lymphadenopathia és az esetek harmadában kialakuló malignus lymphoma, bár sok tulajdonságában hasonlít az autoimmun gyulladásokra és a malignus lymphomákra is, önálló, sajátos entitás. Etiológiájának kutatása fontos ismeretek forrása lehet a lymphomák keletkezése vonatkozásában. Sajátos tulajdonsága, hogy a lymphadenopathia talaján mind T- mind B-sejtes lymphomák kialakulhatnak, ami az immunreguláció bonyolult felépítésére és a daganathoz vezető hiba eredetében többféle külső hatás szerepére utalhat. A komplementrendszer funkcióinak változása jellemző lehet, de nem segít a betegség lefolyásának előrejelzésében. A kezdeti heveny, súlyos tünetek esetén éppúgy kimutatható a komplementrendszer defektusa, mint a kialakuló lymphomákban. Talán a komplement funkciók és faktorok szérumszintjének normalizálódását lehetne kedvező prognosztikus jelnek tekinteni.

44

6. Következtetések 6.1. Az irodalomban megjelenő új, és perspektíváját is figyelembe véve hosszú távon használható technikák elvét adaptáltam kísérleti munkáimban, és azokat tovább fejlesztve új, ma is alkalmazható módszereket dolgoztam ki a komplementrendszer és az autoimmun kórképek, valamint a malignus lymphomák vizsgálatára. Ezek: az ELISA elven

működő

módszerek,

valamint

a

komplement

mediált

immunkomplex

szolubilizáció és immunprecipitációt gátló képesség vizsgálata. Az ELISA elvének felhasználásával módszert dolgoztam ki a mért szérumparaméterek mennyiségi jellemzésére az immunglobulin- és a C3- kalibrációs görbe alkalmazásával. Ez tette lehetővé a módszer alkalmazását az IC-k vizsgálatára. A keringő immunkomplexek összetételét vizsgálva, összefüggés igazolódott a komplexek C3 fragmentum tartalma és az SLE aktivitása és a veseérintettség kimutathatósága között. Egyben a mért értékek megerősítik a más módszerek alkalmazásával valószínűsített feltételezést, hogy az SLE-s betegek szérumában inkomplett módon szolubilizálódott, azaz további komplement aktivációt kiváltani képes immunkomplexek vannak jelen. A komplement mediálta immunkomplex szolubilizáló képesség (CMSC) és az immunprecipitációt gátló képesség (IPIC) csökkent az SLE-s betegek szérumában. A csökkenés mértéke összefügg a betegség aktivitásával és a veseérintettség meglétével. A paraméterek értéke a betegség kórlefolyása során az aktivitás függvényében változik. CMSC esetén korreláció igazolható az alternatív út aktiválódásával és IPIC esetén a klasszikus aktivációs út aktivitásával, de a korreláció nem szoros. Mindkét paraméter korrelál a szérum magas immunkomplex szintjével. 6.2. Malignus lymphomákban szenvedő betegek komplement paramétereit vizsgálva, eltérés igazolódott a komplement funkciók: CH50, CMSC, IPIC és C3, C4, valamint a keringő immunkomplexek szérumkoncentrációjának értékében, ezek az eltérések összefüggést mutattak a betegségben észlelt változásokkal és kezelés hatásaival. NHL-ben a hagyományos komplement paramétereket és a CMSC és IPIC értékeket összevetve a betegség szövettani jellemzőivel, kifejezett malignitású lymphomákban jelentősen, míg a mérsékelt malignitású lymphomákban kisebb mértékben csökkentnek 45

találtuk. Kimutatható volt a komplementrendszer deficienciája, és ezzel párhuzamosan a magasabb keringő immunkomplex szérumszint. Jellemző volt a szolubilizáló képesség és az immunprecipitációt gátló képesség csökkenése. A komplement működés deficienciája a B-CLL-ben szenvedő betegekben korrelációt mutat a rosszabb prognózissal és a rövidebb túléléssel. A kifejezett malignitású lymphomákban a komplementrendszer deficienciája a betegség aktivitása esetén kifejezett, remisszióban normalizálódhat. 6.3. Az autológ perifériás haemopoeticus őssejtátültetés folyamatát a komplement funkciók és a komplement paraméterek szérumszintjének vizsgálatával követtük lymphomás betegekben. Szövődménymentesen zajló transzplantációkban, a klinikai történések szempontjából meghatározónak tartott időpontokban (-7, -2, +7, +21, +35 napokon) történt a CH50, C3, C4 és keringő IC szintek vizsgálata. Az átlagértékek jellegzetes időbeli alakulását alapul véve, lehetővé vált a változások alapmintázatának megállapítása. A súlyos infekciós-toxikus szövődmények esetén a mért komplement funkciók és paraméterek, a zajló akut komplement aktiváció ellenére emelkednek, valószínűleg az egyidejű fertőzés okozta komplement faktor termelődés fokozódás ellensúlyozó hatása miatt. Korai relapszus esetén a komplement funkciók és faktorok csökkenése a relapszus előjele lehet. A komplement paraméterek követéses vizsgálata lehetőséget nyújthat infekciós szövődmények vagy az alapbetegség visszatérésének előrejelzésére, lehetőséget adva a prevenció megkezdésére.

46

7. Új eredmények 7.1. Az ELISA technikán alapuló mikro-módszer kidolgozása lehetővé tette a szimplaszálú és duplaszálú DNS elleni antitestek mérését. Az immunglobulin és C3 komplement kalibrációs görbék segítségével, elsőként valósítottam meg az eredmények pontos mennyiségi kifejezésének lehetőségét. 7.2. Módszert

dolgoztam

ki

SLE-s

betegek

szérum

mintáiból

származó

immunkomplexek összetételének vizsgálatára. Kimutattam, hogy a betegség aktív és nephropathiával járó formáiban az immunkomplexek C3 fragmentum tartalma alacsonyabb, mint inaktív betegségben. Az eredmény arra utalt, hogy a vizsgált immunkomplexek inkomplett módon szolubilizálódtak és további komplement aktiválásra képesek. 7.3. Malignus lymphomás betegekben a szérum komplement funkcióinak csökkenését igazoltuk. Kifejezett malignitású lymphomákban gyakoribb és súlyosabb eltérést észleltünk, de mérsékelt malignitású lymphomákban is kimutatható változást találtunk. 7.4. Kimutattam, hogy a malignus lymphomában szenvedő betegek savójának komplement

mediált

immunkomplex

szolubilizáló

képessége

és

immunprecipitációt gátló képessége csökkent. 7.5. A nemzetközi és a hazai irodalomban is elsőként alkalmaztam a komplement funkciók

és

faktorok

értékeinek

meghatározását

az

autológ

perifériás

haemopoeticus őssejtátültetés történéseinek követésére. Megállapítottam a transzplantáció

alapvető

klinikai

eseményeit

jellemző

komplement

és

immunkomplex változásokat. Az ettől eltérő eredmények a komplement funkciókban, komponensekben és az immunkomplex értékekben kiegészítő prognosztikai jelentőséggel rendelkezhetnek a transzplantáció szövődményeinek előrejelzésében.

47

8. Az új eredmények klinikai hasznosíthatósága A laboratóriumi gyakorlatban végzett legegyszerűbb komplement mérések, a CH50, C3, C4 szint és a keringő immunkomplex koncentráció meghatározásai gyors, nem költséges módszert jelentenek a fennálló deficiencia jelzésére. Rendellenesség esetén érdemes mind az immunológiai betegségekben, mind a malignus lymphomákban és transzplantációkban is további vizsgálatokkal feltárni az eltérés okát. A malignus lymphomákban, különösen a hipokomplementémiával járó csoportban, a komplement értékek a remisszióval és relapszussal együtt változhatnak. Lehetséges, hogy a komplement defektussal járó CLL esetek, ahol folyamatosan alacsony értékek mérhetők, is sajátos klinikai csoportot képeznek, melyek kezelési stratégiája a jövőben eltérő lehet. A komplementrendszer funkcióinak, beleértve a komplement receptorok működését is, igen lényeges szerepe van mind a szövet-, mind a szervátültetésekben. Autológ őssejt transzplantáció során a komplement változások észlelése a nagydózisú terápia toxikus hatásainak, illetve a transzplantáció infekciós, vagy az alapbetegség visszaesésével járó szövődményeinek figyelmeztető jele lehet. Allogén csontvelő-(őssejt)-átültetésekben, az akut GVHD súlyosságát módosíthatja a komplement funkciók alakulása. Allogén szervtranszplantációkban, a hiperakut kilökődési reakcióban van kiemelkedően fontos szerepe a kóros komplementaktivációnak, amelynek legsúlyosabb formája a xenograftok ellen kialakuló szövetkárosító reakció. A szabályozó fehérjék befolyásolása – egyéb tényezők mellett – hozzájárulhat a xenotranszplantáció alkalmazásának elterjedéséhez. Hosszú kutatási periódus után, az utóbbi években került bevezetésre a specifikus monoklonális

ellenanyag

terápia

malignus

lymphomákban

és

autoimmun

betegségekben. A transzplantációs gyakorlatban már korábban is alkalmazásra kerültek – elsősorban T-sejt elleni – antitestek. A monoklonális ellenanyagok a sejtpusztító hatás kifejeződéséhez

komplementet

igényelnek.

Fontosnak

látszik

ezért

a

komplementrendszer vizsgálata a kezelés elkezdése előtt, mert bármely súlyos deficiencia a kezelés hatástalanságát eredményezheti.

48

9. Összefoglalás A komplementrendszer az immunrendszer működése során alapvetően fontos effektor funkciókat lát el. Aktivációját a mikroorganizmusok felszíni molekulái és az antigénantitest komplexek idézik elő. Fontos szerepet tölt be az immunkomplexek (IC) képződésében is, szerkezetük, méretük kialakításában, szállításukban, eliminációjukban valamint az általuk kiváltott gyulladások patomechanizmusában. Az SLE-ben, az immunkomplex betegség és a komplement defektusok kapcsolata már sok részletében feltárt folyamat. A malignus lymphomák és a komplementrendszer kapcsolatáról kevés rendszerezett ismeret áll rendelkezésre, bár a betegek fokozott infekcióhajlamát és az IC patomechanizmusú paraneopláziás tünetek előfordulását gyakran megfigyelték. Célul tűztük ki új módszerek kidolgozását az SLE-s betegek komplement funkcióinak és keringő IC szintjének, összetételének jellemzésére, összefüggést keresve az aktivitás és a paraméterek változása között. Az SLE-s betegek vizsgálata során szerzett tapasztalatokat felhasználva, malignus lymphomában is, összefüggést kerestünk a betegségben zajló folyamatok és a komplement szérumszintek és funkciók, változása között. Az ELISA mikrotechnika elvének felhasználásával az IC-ek összetételének vizsgálatára alkalmas módszert dolgoztunk ki, és az immunglobulin és C3 kalibrációs görbék segítségével az eredmények mennyiségi kifejezését is megoldottuk. Az SLE aktív és nephropathiával járó formáiban igazoltuk az IC-ek alacsonyabb C3 tartalmát, ami inkomplett módon szolubilizált, további komplementaktivációt és gyulladást kiváltani képes komplexek képződésére utalt. Malignus lymphomában szenvedő betegek szérumában a komplement funkciók és szérumszintek csökkenését igazoltuk. Kifejezett malignitású lymphomákban gyakoribb és súlyosabb eltérést észleltünk, de mérsékelt malignitású lymphomákban is találtunk hipokomplementémiát. Igazoltuk, hogy a lymphomában szenvedő betegek savójának komplement mediált IC szolubilizáló képessége és immunprecipitációt gátló hatása csökkent. A nemzetközi és hazai irodalomban először alkalmaztam a komplement funkciók és faktorok értékeinek meghatározását az autológ őssejttranszplantációk történéseinek követésére. A transzplantáció alapvető klinikai eseményeit jellemző komplement és IC változások megállapítása mellett elsőként hívtuk fel a

figyelmet

az

eltérő

eredmények

prognosztikus

szövődményekkel való kapcsolatára.

49

jelentőségére

és

a

klinikai

10. Summary Study of complement functions in patients with malignant lymphomas based on experiences from SLE The complement system has essentially important effector function in the immune defense mechanism. Complement can be activated by surface molecules of microorganisms and antigen-antibody complexes. Complement system has also an important role in formation of immune complexes (IC) via determination of their structure, size, transport, elimination as well as role in pathomechanism of IC provoked inflammations. Connection between IC disease, defective complement functions and SLE has been explored extensively. However, few data are known about connection between complement system and malignant lymphomas despite clinical observations including high susceptibility to infections and paraneoplastic syndromes with IC pathomechanism. The aim of our work was to develop methods for characterization of function and components of complement system and circulating IC in SLE in order to study connections between activity of disease and changes of parameters. Using experiences and adopting the methods obtained in SLE connection between clinical course and complement alterations was studied in malignant lymphomas, too. On the basis of ELISA microtechnique new modified method was developed for study of IC composition in SLE. Quantification of results was determined by using calibration curves for immunoglobulins and C3. Decreased C3 content of IC was observed in active stage of SLE and in cases with renal involvement suggesting incomplete IC solubilization resulting in further complement activation and inflammation. In malignant lymphomas defective complement functions and decreased levels of complement components were observed. Complement abnormalities were more frequent in high-grade malignancies. However, hypocomplementemia was observed in low-grade cases, too. Decrease of complement mediated immune complex solubilization and immune precipitation inhibition was also determined. Study and follow-up of complement functions, serum levels of complement components C3, C4, and circulating IC during autologous blood stem cell transplantation in malignant lymphoma patients were published by our group as novel findings. Results of complications-free cases were regarded as standard and alterations from these values were suggested as signs of different complications.

50

11. Köszönetnyilvánítás Nagyon köszönöm Pálóczi Katalin egyetemi tanárnak, hogy munkámat irányította, segítette, témavezetőmként lehetővé tette a dolgozat megszületését. Köszönettel tartozom Szegedi Gyula professzornak, aki pályám kezdetétől lehetővé tette, hogy orvosi hivatásom mellett a tudományos kutatómunkát is megismerhessem és az részévé váljon a munkámnak. Mindezekhez a feltételeket biztosította, segítségére mindig számíthattam. Külön köszönöm Kávai Mária tudományos főmunkatársnak, aki közvetlen mentorom volt a laboratóriumi munka elsajátításában, hogy hosszú éveken át segítette tudományos munkámat, és hogy azóta is számíthatok tanácsaira és barátságára. Szeretettel köszönöm a Debreceni Egyetem III. Belgyógyászati Klinikáján és Immunológiai Laboratóriumában dolgozó volt kollegáimnak: Sipka Sándornak, Tamási Lászlónak, Illés Árpádnak, Bodolay Editnek, Dankó Katalinnak, Kiss Emesének, Gergely Lajosnak, Vadász Györgyinek, Csípő Istvánnak, hogy segítették a munkámat. Hálával emlékezem meg azokról a kollegáimról, akik segítségét már közvetlenül megköszönni nem tudom, akik már nincsenek köztük: Berényi Ernőnek, Sonkoly Ildikónak, Zsindely Attilának és Szabó Gábornak. Köszönettel tartozom Petrányi Győző professzornak, aki jelenlegi munkahelyemen lehetővé tette, hogy folytathassam az elkezdett munkámat. Az Országos Haematológiai Intézet korábbi, Füst György professzor által vezetett munkacsoportjának, akikkel munkakapcsolatunk már a debreceni években kialakult, itt folytatódhatott, külön köszönöm Varga Lilian segítségét és barátságát. Köszönöm munkahelyem jelenlegi vezetőjének, Vályi-Nagy Istvánnak, hogy lehetővé tette a dolgozat megírását, Hálásan köszönöm közvetlen munkatárasaim segítségét, ők: Barta Anikó, Kilián Katalin, Gopcsa László és Sandil Anita, valamint Kertészné Orbán Ildikó.

51

12. Irodalom 1. Bordet J, Gengou O.: Sur l’existence de substances sensibilisatrices dans la plupart des serum antimikrobiens Ann.Inst. Pasteur, 15: 289-302, (1901). 2. Erdei

A.:

A

komplementrendszer

szerepe

az

elsődleges

felismerési

mechanizmusokban és az immunválasz szabályozásában. Magy. Immunol., 2(4): 33-38, (2003). 3. Fearon DT, Carter RH.: The CD19/CR2/TAPA-1 complex of B lymphocytes: linking natural to acquired immunity. Annu.Rev. Immunol., 13: 127-149, (1995). 4. Nauta AJ, Trouw LA, Daha MR, Tijsma O, Nieuwland R, Schwaeble WJ, Gingras AR, Mantovani A, Hack EC, Roos A.: Direct binding of C1q to apoptotic cells and cells bleds induces complement activation. Eur. J. Immunol., 32: 1726-1736, (2002). 5. Carroll MC.: The complement system in regulation of adaptive immunity. Nat. Immunol., 5: 981-986, (2004). 6. Füst Gy.: A komplementrendszer és vizsgálata az orvosi gyakorlatban. Medicina, Budapest, (1987). 7. Erdei A,: A komplementrendszer. In: Gergely J, Erdei A. (szerk). Immunbiológia (2. kiadás). Medicina, Budapest, pp. 249-270, (2000). 8. Falus

A:

Az

immunológia

élettani

és

molekuláris

alapjai.

Semmelweis Kiadó, Budapest (1998). 9. Fujita T: Evolution of the lectin-complement pathway and its role in innate immunity. Nat. Reviews, 2: 346-353, (2002). 10. Prechl J.: A Toll-szerű receptorok szerepe a természetes immunitás kezdeti lépéseiben. (Jelátviteli mechanizmusok, sejt- és szervezet szintű válaszreakciók) Magy. Immunol., 2 (4): 20-24, (2003). 11. Ahmed AEE, Peter JB.: Clinical utility of complement assessment–minireview. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2(5): 509-517, (1995). 12. Kemper C, Chan AC, Green JM, Brett KA, Murphy KM, Atkinson JP.: Activation of human CD4+ cells with CD3 and DC46 induces regulatory cell 1 phenotype. Nature, 421: 388-392, (2003). 52

13. Ravetch JV.: A full complement of receptors in immune complex diseases. J. Clin. Invest.,110: 1759-1761, (2002). 14. Schifferli JA, Bartolotti SR, Peters DK.: Inhibition of immune precipitation by complement. Clin. Exp. Immunol., 42: 387-394, (1980). 15. Schifferli JA, Morris SM, Dash A, Peters DK: Complement mediated solubilization in patients wit systemic lupus erythematosus, nephritis or vasculitis. Clin.Exp. Immunol., 46: 564-577, (1981). 16. Miller GW, Nussenzweig V.: A new complement function: solubilization of antigen–antibody aggregates. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 72: 418-422,(1975). 17. Aranson GJ, D’Ambrogo MS, Vikingodottir T, Sigfusion A, Valdimarson H.: Enzime immunoassay for measuring complement dependent prevention of immune precipitation (PIP) and solubilization preformed antigen antibody complex (SOL). Immunol. Methods, 223: 37-46, (1999). 18. Aranson GJ, Steinsson K, Kolka R, Vikingdottir T, D’Ambrogio SM, Valdimarsson H.: Patients with systemic lupus erythematosus are deficient in complement dependent prevention of immune precipitation. Rheumatology (Oxford) 43 (6): 783-789, (2004). 19. Lachman PJ, Alport MK.: Deficiency of the effector mechanisms of immune response and autoimmunity. In: Whelan,J.: Autoimmunity and autoimmun disease. Ciba Fundation Symposion, Chichester, England, Whiley Ltd, pp149171, (1987). 20. Moller NP, Steengard J.: Fc mediated immune precipitation I. A new role of the Fc portion of IgG. Immunology, 38: 631-640, (1983). 21. Schifferli JA, Steiger G, Paccaud JP.: Complement mediated inhibition of immune precipitation and solubilisation generate different concentrations of complement anaphylatoxins (C4a, C3a, C5a). Clin. Exp. Immunol., 64: 407-414, (1986). 22. Schifferli JA.: Complement and immune complexes. Res. Immunol.,147(2): 108-110, (1996).

53

23. Schifferli JA, Steiger G, Hauptmann G, Spaeth PJ, Sjörkholm AG.: Formation of soluble immune compexes by complement in sera of patients with various hypocomplementemic states. J. Clin. Invest., 76: 2127-2133, (1985). 24. Beynon HLC, Devis KA, Haskard DO, Walport MJ.: Erythrocyte complement receptor type 1 and interactions between immune complexes, neutrophils and endothelium. J.Immunol., 153: 3160-3167, (1994). 25. Craig ML, Bankovich AJ, McElhenny JL, Taylor RP.: Clearance of doublestranded DNA antibodies.(The natural immune complex clerance mechanism). Athritis and Rheumatism, 43 (10): 2265-2275, (2000). 26. Kávai

M,

Szegedi,Gy.:

Immunkomlex

clearance

szisztémás

lupus

erythematosusban. Magy. Immunol.,2(2): 24-32, (2003). 27. Davies KA.: Immune complexes and autoimmunity. In: Lahita,R.G.: Autoimmune diseases. Lippincott Wliliams and Wilkins, Philadephia, USA, pp 37-152, (2000). 28. Arthus M.: Injections repetees de serum de cheval cuez le lapin. Seances et Memoire de la Societe de Biologie, 55: 817-825, (1903). 29. Wisnieski JJ, Jones SM: Comparison of autoantibodies to the collagen-like region of C1q in hypocomplementemic urticarial vasculitis syndrome and systemic lupus erythematosus. J. Immunol., 148: 1396-1403, (1992). 30. Varga L, Liszkai Zs, Czink E, Paloczi K, Szegedi Gy, Fust G, Hollan SR.: Study of the immune complex precipitation - inhibition of sera of patients with chronic lymphocytic leukaemia. Diagn. Clin. Immunol., 5: 129-134, (1987). 31. Szegedi Gy, Pálóczi K.: Autoimmun betegségek talaján kialakult malignus lymphomák. In: Pálóczi K, Kelényi G.: Non Hodgkin lymphomák. Springer Hungarica Kiadó, Budapest, pp. 172-185, (1998). 32. Higuchi T, Mori H, Niikura H, Omine M.: Hypocomplementaemia and haematological

abnormalities

in

immunoblastic

lympadenopathy

and

immunoblastic lymphadenopathy–like T cell lymphoma. Acta Haematol., 96(2): 68-72, (1996).

54

33. Barta A, Denes R, Stelich G, Lengyel L, Illes P, Paloczi K.: Chronic graft versus host disease, as systemic “autoimmune disease” following allogenic bone marrow trasplantation. Periodicum Biologorum, 98:459-462, (1996). 34. Varga L, Poros A, Puskas E, Panya A, Kramer J, Gyodi E, Fust G.: Clinical significance of longitudinal complement measurements in recipients of bone marrow transplant. Bone Marow Transplant., 15:509-514, (1995). 35. Szegedi Gy.: Az autoimmun betegségek sajátosságai. LAM, 14(11): 739-746, (2004). 36. Bowness P, Davis KA, Norsworthy PJ.: Hereditary C1q deficiency and systemic lupus erythematosus. Q. J. Med., 87: 455-464, (1994). 37. Vyse TJ, Spath PJ, Davies KA, Horley BJ, Philippe P, Athanassion P.: Hereditary complement factor I deficiency. Q. J. Med., 87: 385-401, (1994). 38. Ruddy S.: Complement deficiencies 3.: The second component. Prog. Allergy, 39: 250-267,(1986). 39. Botto M, Walport MJ.: Hereditary deficiency of C3 in animal and humans. Int. Rev. Immunol.,10: 37-50, (1993). 40. Hartung K, Baur MP, Coldewey R, Fricke M, Kalden JR, Lakomech HJ.: Major histocompatibility complex haplotypes and complement 4 alleles in systemic lupus erythematosus: results of a multicenter study. J. Clin. Invest., 90: 13461351, (1992). 41. Yang Y, Chung EK, Zhon B, Lhotta K, Herbert LA, Birmingham DJ, Ovin BH, Yu CY.: The intricate role of complement component C4 in human systemic lupus erythematosus. Curr. Dir. Autoimmun., 7: 98-132, (2004). 42. Horvath L, Czirjak L, Fekete B, Jakab L, Pozsonyi T, Kalabay L.: High levels of antibodies against C1q are associated with disease activity and nephritis but not with other manifestation in SLE patients. Clin. Exp. Rheumatol., 19: 667-672, (2001). 43. Boakle SA, Holers VM.: Role of complement in the development of autoimmunity. Curr. Dir. Autoimmun., 6:154-68, (2003). 44. Botto M.: Links between complement deficiency and apoptosis. Arthritis Res., 3:207-210, (2001). 55

45. Pálóczi K.: A non-Hodgkin lymphomák sejtes eredete és az immunológiai klasszifikáció alapjai. In: Pálóczi K, Kelényi G.: Non-Hodgkin lymphoma. Springer Hungarica Kiadó, Budapest, pp. 83-98, (1998). 46. Harris NL, Jaffe ES, Diebold J, Flandrin G, Muller-Hermelink HK, Vardiman J, Lister TA, Bloomfield CD.: The World Health Organization classification of neoplastic disases of haemopoetic and lymphoid tissues: report of the Clinical Advisory Committee, 1977. Histopathology, 36:69-87, (2000). 47. Matolcsi A, Fekete S.: Molekuláris genetikai vizsgálatok a non-Hodgkin lymphomák diagnosztikájában és osztályozásában. In: Pálóczi K, Kelényi G.: Non-Hodgkin lymphoma. Springer Hungarica Kiadó, Budapest, pp. 134-148, (1998). 48. Pálóczi K.: A non-Hodkin lymphomák patogenezisében szerepet játszó környezeti tényezők. In: Pálóczi K, Kelényi G.: Non-Hodgkin lymphoma. Springer Hungarica Kiadó, Budapest, pp. 121-131, (1998). 49. Szegedi Gy, Pálóczi K: Autoimmun betegségek talaján kialakuló malignus lymphomák. In: Pálóczi K, Kelényi G.: Non-Hodgkin lymphoma Springer Hungarica Kiadó, Budapest, pp. 172-183, (1998). 50. Berényi E, Kávai M, Pálkövi E, Szegedi Gy.: Keringő immuncomplexek Hodgkin kóros betegek szérumában. Orv. Hetil. 120: 79-82, (1979). 51. Kennedy AD, Beum PV, Solga MD, DuLillo DJ, Lindorfer MA, Hess CE, Densmore JJ, Taylor RP.: Rituximab infusion promotes rapid complement depletion and acute CD20 loss in chronic lymphocytic leukaemia. J. Immunol., 172(5): 3280-3288, (2004). 52. Takatsuka H, Takemoto Y, Yamada S, Wada H, Tamura S, Fujimori Y, Okamoto T, Suehiro A, Kanamaru A, Kakishita E.: Complications after bone marrow transplantation are manifestations of systemic inflammatory response syndrome. Bone Marrow Transpl., 26: 419-426, (2000). 53. Pesce AJ, Mendosa N, Boreisha M, Gaizutis MA, Pollak VE.: Use of enzimelinked antibodies to measure serum anti-DNA antibody in systemic lupus erythematosus. Clin-Chem.,20: 357-359, (1974).

56

54. Engwall E., Pelmann P: Enzime linked immunosorbent assay, ELISA. 3.: Quantitation of specific antibodies by enzime labelled anti-immunglobulin in antigen coated tubes. J. Immunol., 109(1):129-135. (1972) 55. Digeon M, Laver M, Riza J, Bach JF.: Detection of circulating immune complexes in human sera by simplified assay with polyethylene glycol. J. Immunol. Methods, 16:165-169, (1977). 56. Johnson AJ, Mowbray JF, Porter KA.: Detection of circulating immune complexes in pathological human sera. Lancet, I: 762-765, (1975). 57. Farkas H, Harmat G, Füst G, Varga L, Visy B.: Clinical management of hereditary angio-oedema in children. Pediatr. Allergy Immunol., 13: 153-161, (2002). 58. Bootsma H, Spronk PE, Ter Borg EJ, Hummel EJ, deBoer G, Limburg PC, Kallenberg CGM.: The predictive value of fluctuations in IgM and IgG class anti-dsDNA antibodies for relapse in systemic lupus erythematosus. A prospectiv long term observation. Ann. Rheum.Dis., 56:661-666, (1997). 59. Tan EM, Cohen AS, Fries JF, Masi AT, McShane DJ, Rothfield NF, Schaller JG, Talal N, Winchester RJ.: The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthitis Rheum., 25: 1271-1277, (1982). 60. Isenberg D.: Anti-dsDNS antibodies: still a useful criterion for patients with systemic lupus erythematosus? Lupus, 13(11): 881-885, (2004). 61. Roberts JL, Robinson MF, Lewis E.J.: Low molecular weight plazma cyoprecipitable

anti-nativ

DNA:

polynucleotide

complexes

in

lupus

glomerulonephritis. Clin. Immunol. Immunpathol., 19(1): 75-90, (1981). 62. Pálóczi K.: Az angioimmunoblasztos lymphadenopátia klinikai és immunológiai jellemzői, kapcsolata az autoimmun és liphoproliferatív betegségekkel. Kandidátusi értekezés, Debrecen, pp.85-87, 1985. 63. Banyai A, Danko K, Paloczi K, Szegedi Gy.: Early clinical symptoms of malignant

transformation

in

our

patients

with

angioimmunoblastic

lymphadenopathy. Ann. Hematol.,65(Suppl.): A23 (1992). 64. Banyai A, Csipo I, Csongor J, Sonkoly I, Szegedi Gy.: Complement mediated solubilization and precipitation. Inhibition of preformed immune complexes in 57

sera of SLE patients and in sera of patients with other autoimmune diseases. Complement, 3(4):211, (1986). 65. Lennert K, Mohri N, Stein H, Kaiserling E.: The histopathology of malignant lymphomas. Brit. J. Haematol. 31:193-203, (1975). 66. Füst G, Miszlay Zs, Czink E, Varga L, Pálóczi K, Szegedi Gy, Hollán SR.: C1 and C4 abnormalities in chronic lymphocytic leukaemia and their significance. Immunol. Letters, 14: 255-259, (1987). 67. Varga L, Poros A, Panya A, Kramer J, Gyodi E, Fust G.: Clinical significance of longitudinal complement measurements in bone marrow transplant recipients. Bone Marrow Transplant.,15: 509-514, (1994). 68. Takatsuka H, Takemoto Y, Yamada S, Wada H, Tamura S, Fujumori Y, Okamoto T, Suehiro A, Kanamaru A, Kakishita E.: Complication after bone marrow transplantation are manifestations of systemic inflammatory response syndrome. Bone Marrow Transplant., 26: 419-426, (2000). 69. Fust G, Kavai M, Szegedi Gy, Meretey K, Falus A, Lenkey A, Misz M.: Elavuation of different methods for detecting circulating immunne complexes. An inter-laboratory study. J. Immunol. Methods, 38: 281-289, (1980).

58

13. A dolgozat alapját képező saját közlemények jegyzéke I.

Bányai A, Kávai M, Zsindely A, Papp S, Szegedi G.: Enzimmel jelzett immunosorbens (ELISA) eljárás anti-DNS szint mérésére SLE-os betegek szérumában. Orv Hetil. 1980 Jun. (23):1371-1374.

II.

Kavai M, Banyai A, Zsindely A, Sonkoly I, Szegedi G.: Enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies to native DNA in sera of patients with SLE. J lmmuno1 Methods. 1982;48(2):169-175. – IF:2,742

III.

Bányai A., Kávai M., Sonkoly I., Szegedi Gy.: Keringő immunkomplexek összetételének

vizsgálata

szisztémás

lupus

erythematosusban.

Magyar Reumatológia. 1985;26:11-18. IV.

Banyai A, Szabo G, Csongor J, Sonkoly I, Szegedi G.: The effect of sera of patients with systemic lupus erythematosus on artificial immune complexes. Acta Med Hung. 1985;121,42(1-2):51-57. – IF:0,094

V.

Bányai A, Pá1óczi K.: Az immunkomplexek: új eredmények és klinikai jelentőségük. Orvosképzés. 2003; 2:51-59.

VI.

Banyai A, Paloczi K, Csipo I, Csongor J, Szegedi G.: Complement-mediated immune complex solubilization and precipitation inhibition in sera of patients with non-Hodgkin's lymphoma. Haematologia (Budap). 1990;23(2):87-95. – IF:0,268

VII. Varga L, Czink E, Miszlai Z, Paloczi K, Banyai A, Szegedi G, Fust G.: Low activity of the classical complement pathway predicts short survival of patients with chronic lymphocytic leukaemia. Clin Exp Immunol. 1995 Jan;99(1):112-116. – IF:2,680 VIII. Banyai A, Varga L, Barta A, Gopcsa L, Paloczi K.: Monitoring the level of complement components during autologous blood stem cell transplantation in patients with malignant lymphomas. Cancer Immunol Immunother. 2004 53: 835-839. – IF:2,759 IX.

Bányai A.: Angioimmunoblastos lymphadenopathia talaján kialakult lymphoma. In: Pá1óczi K, Kelényi G (szerk). Non-Hodgkin Lymphoma. Springer Hungarica Kiadó Kft, Budapest, 1998; 11: 235-243. 59

14. A dolgozat témájához nem közvetlenül kapcsolódó saját közlemények jegyzéke 1.

Bányai A., Kávai M., Zsindely A., Sonkoly I., Szegedi Gy.: Anti-nativ DNS szint mérése enzimmel jelzett immunoszorbens mikromeghatározás segítségével SLE-os betegek szérumában. Magyar Reumatológia, 1981, XXII: 23-29.

2.

Kávai M., Zsindely A., Bányai A., Major M., Krisztián J., Szegedi Gy.: SLE-os betegek

keringő

immunkomplexeinek

hatása

egészségesek

monocytáira.

Magyar Reumatológia, 1981, XXII: 135-140. 3.

Banyai A., Nagy E., Szegedi G., Meszaros C.: Double-stranded DNA antibodies in discoid lupus erythematosus. Z. Hautkr., 1982, 57(21): 1583-1586 (német)

4.

Kávai M., Zsindely A., Sonkoly I., Banyai A., Szegedi G.: Monocyte activation by immune complexes of patients with SLE. Adv.Exp. Med. Biol., 1982, 141: 575-582. – IF:0,511

5.

Lukács K., Kavai M., Banyai A., Sonkoly I., Vegh E., Szabó G., Szegedi G.: Effects of immune complexes from SLE patients on human monocyte locomotion and Fc receptor function. Ann.Rheum Dis, 1984, 43(5):729-733. – IF:1,750

6.

Bodolay E, Diószeghy P, Demeter J, Bányai A, Csipő I, Szegedi G.: Meningoencephalitissel

szövődött

kevert

kötőszöveti

betegség.

Orv Hetil. 1985 Dec 8;126(49):3035-3038. 7.

Bedő Z, Sonkoly I, Bányai A, Csipő I, Szegedi Gy.: Systemás lupus erythematosusos betegek plasmaferesis kezelése. Magyar Belorv Arch. 1986;39:169-177.

8.

Sonkoly I, Kávai M, Bányai A, Seres T, Stenszky V, Szegedi Gy.: Különböző antiDNS

titerü

szisztémás

lupus

erythematosusos

betegek

kór1efolyásának

tanulmányozása. Magyar Reumatológia. 1988;29:9-18. 9.

Illés A, Bányai A, Szegedi G.: Előrehaladott stádiumú Hodgkin-kóros betegek kezelése

CCNU,

etoposide

és

prednimustine

OrvHetil. 1994 Máj.29;135(22):1187-1190. Review. 60

(CEP)

terápiával.

10. Illes A, Banyai A, Vadasz G, Szegedi G. Relapse of Hodgkin's disease after ten years. Oncology. 1995 Jul-Aug;52(4):284-286. – IF:1,857 11. Illes A, Banyai A, Jenei K, Bacsko G, Kovacs J, Szakall S, Szegedi G. Bilateral primary

malignant

lymphoma

of

the

breast

during

pregnancy.

Haematologia (Budap). 1996;27(2):99-105. – IF:0,143 12. Illés Á, Bányai A, Jenei K, Bacskó Gy, Kovács J, Szakáll Sz, Szegedi G. Terhesség során felismert kétoldali, pimer emlőlymphoma. Orv Hetil. 1996 Jun 16;137(24):1315-1317. Review. 13. Bányai A, Illés Á, Nemes Z, Vadász Gy, Dévényi K, Szegedi Gy: A gastrointestinalis tractus másodlagos lymphomatosus polyposisa nyirokcsomó lymphomában szenvedő betegekben Orv. Hetil 1996 Jul. 21 137(29):1591-1595. 14. Illes A, Vadasz G, Banyai A, Szegedi G.: Infradiaphragmatic Hodgkin's disease. Haematologia (Budap). 1997;28(3):117-122. – IF:0,098 15. Kilian K, Banyai A, Karadi A, Miklos K, Petranyi Gy, Paloczi K.: FK-506 (tacrolimus)

therapy

for

an

unusual

SLE-like

disease.

Transplant Proc. 1998 Dec;30(8):4130-4131. – IF:0,740 16. Kiss E, Gal I, Simkovics E, Kiss A, Banyai A, Szakall S, Szegedi G.: Myelofibrosis in systemic lupus erythematosus. Leuk Lymphoma. 2000 Nov;39(5-6):661-665. – IF:1,252 17. Gopcsa L, Barta A, Banyai A, Foldi J, Kalasz L, Pajor L, Gidali J, Regeczy N, Paloczi K.: Autologous hematopoietic stem cell transplantation in chronic myeloid leukemia with different clinical stages. Acta Haematol. 2001;106(3):100-105. – IF:0,796 18. Gopcsa L, Barta A, Banyai A, Földi J, Kalász L, Pajor L, Gidáli J, Palóczi K.: Auto1óg hematopoetikus őssejt-transzp1antáció eredményei chronicus myeloid leukaemiában. Magy Onkol. 2001;45(1):9-13.

61

19. Kaliszky P, Bányai A, Forgács A, Gyurkovics E.: Mezenteriális B sejtes immunoblastoma

hosszú

ideig

követett

és

sikerrel

kezelt

esete.

Magy Seb. 2001 Okt;54(5):331-333. 20. Gopcsa L, Banyai A, Tamaska J, Karadi A, Matolcsy A, Paloczi K.: Hepatosplenic gamma delta T-cell lymphoma with leukemic phase successfully treated with 2chlorodeoxyadenosine. Haematologia (Budap). 2002;32(4):519-527. – IF:0,293 21. Gopcsa L, Barta A, Banyai A, Konya M, Pajor L, Foldi J, Paloczi K.: Acute myeloid leukaemia of donor cell origin developing 5 years after allogeneic bone marrow

transplantation

for

chronic

myeloid

leukaemia.

Bone Marrow Transplant. 2002 Mar;29(5):449-452. – IF:2,378 22. Horvath L, Csaszar A, Falus A, Dieplinger H, Horvath A, Puskas E, Halm G, Banyai A, Paloczi K, Laszlo E, Kalabay L, Romics L, Fust G.: IL-6 and lipoprotein(a) [LP(a)] concentrations are related only in patients with high APO(a) isoforms in monoclonal gammopathy. Cytokine. 2002 Jun 21;18(6):340-343. – IF:2,374 23. Regeczy N, Kormos L, Szigetvari CM, Torbagyi E, Hajdu M, Gopcsa L, Banyai A, Paloczi K.: Reactivity of new adhesion molecules on lymphocytes from patients with chronic graft versus host disease. Acta Microbiol Immunol Hung. 2003;50(1):55-65. 24. Gopcsa L, Barta A, Banyai A, Dolgos J, Halm G, Paloczi K.: Salvage chemotherapy with donor lymphocyte infusion and STI 571 in a patient relapsing with B-lymphoblastic phase chronic myeloid leukemia after allogeneic bone marrow transplantation. Pathol Oncol Res. 2003;9(2):131-133. 25. Bodolay E, Dioszeghy P, Demeter J, Banyai A, Csipo I, Szegedi G, Szekanecz Z. Meningitis in mixed connective tissue disease complicated by herpes virus infection: case report. Rheumatol Int. 2004;24(6):359-361. – IF:1,000 Összesített impakt faktor: 21,735 A dolgozat alapját képező közlemények impakt faktora: 8,543 62