DNS VIZSGÁLATOK AZ IGAZSÁGÜGYI ORVOSTANBAN

DNS VIZSGÁLATOK AZ IGAZSÁGÜGYI ORVOSTANBAN

DOKTORI ÉRTEKEZÉS

Dr. LÁSZIK ANDRÁS

Budapest 2001 TARTALOMJEGYZÉK

2

1.

BEVEZETÉS

8

2.

CÉLKITŰZÉS

9

3.

IRODALMI HÁTTÉR

10

3.1.

A DNS molekula szerkezete és felépítése, stabilitása

10

3.2.

A humán genom szerveződése, mutációk, polimorfizmusok

12

3.2.1.

Miniszatelliták

15

3.2.1.1.

Multi- és single lokusz szondák

16 3.2.1.2.

Amplifikálható hossz-polimorf lokuszok

17

3.2.2.

Mikroszatelliták

17

3.2.2.1.

Short tandem repeat lokuszok

18

3.2.2.1.1.

Autoszomális lokuszok

18

3.2.2.1.2.

Y kromoszómális lokuszok

20

3.2.3.

Szekvencia polimorfizmus

22

3.3.

A DNS molekula kinyerése, tisztítása

23

3.4

A DNS polimorfizmusok vizsgálatában alkalmazott módszerek

24

3.4.1.

Restrikciós fragmens hossz-polimorfizmus (RFLP)

24

3.4.2.

DNS polimeráz enzimmel végzett sokszorosítás (PCR)

25

3.5.

A vizsgálati eredmények detektálása

27

3.6.

Mutációk és polimorfizmusok

28

3.7.

Spermakimutatás – előtesztek

30

3.8.

A DNS vizsgálatok jelentősége az igazságügyi orvostanban

30

3.9

Statisztikai elemzések

32

4.

VIZSGÁLATI ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

35

4.1.

A DNS molekula stabilitásának vizsgálata

35

4.2.

Az YNZ24 és az ACTBP2 lokuszok populációgentikai vizsgálata 39

4.3.

A DYS 19, DYS 390 és a DYS 389 lokuszok mutáció analízise

43

5.

EREDMÉNYEK

48

6.

MEGBESZÉLÉS

56

7.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

59

8.

IRODALOMJEGYZÉK

60

3

9. 10.

AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁVAL KAPCSOLATOS SAJÁT KÖZLEMÉNYEK BIBLIOGRÁFIAI ADATAI

68

FÜGGELÉK

70

4

ÖSSZEFOGLALÁS DNS VIZSGÁLATOK AZ IGAZSÁGÜGYI ORVOSTANBAN Szerző: Dr. Lászik András Témavetető: Dr. Falus András egyetemi tanár Készítés helye: Budapest, Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Program: A humán molekuláris genetika és a géndiagnosztika alapjai Az elmúlt évtized eredményei, mint az emberi genetikai állomány teljes feltérképezésének elindítása, valamint az új molekuláris biológiai módszerek bevezetése lehetővé tették a molekuláris biológia alkalmazását az igazságügyi orvostani gyakorlatban is. A hagyományos szerológiai elemzés az egyedi jellegeket a fehérjék, míg a DNS analízis ezeket már közvetlenül az örökítő anyag szintjén vizsgálja. A DNS analízis alkalmazásának két fő területe az igazságügyi orvostanban a származás megállapítás és a bűnügyekben biztosított biológiai nyomok alapján végzett személyazonosítás. E dinamikusan fejlődő új, objektív vizsgáló módszerrel a személyazonosítással és származás megállapítással kapcsolatban olyan fontos kérdésekre kaphatunk választ, melyeket az eddig rendelkezésre álló vizsgálati eljárásokkal nem lehetett eredményesen megválaszolni. Vizsgálataink célja az volt, hogy adatokat nyerjünk a DNS molekula egy speciális külső környezeti hatásra bekövetkező változásairól és azok jellegéről, két polimorf

lokusz különböző

populációk közötti allélmegoszlásáról és három Y kromoszómális lokusz meiozis során bekövetkező mutációs gyakoriságáról. Eredményeink szerint a kémiai előkezelést nem igénylő elemanalizátorral összekapcsolt scanning elektronmikroszkópos vizsgálat során a spermiummintákba zárt DNS molekulák az elektronsugárzás behatási idejével arányos, kifejezett károsodást szenvedtek el. A napjainkban használt molekuláris biológiai módszerekkel azonban eredményesen amplifikálhatók és tipizálhatók maradtak, ill. nem eredményeztek téves tipizálást sem. További vizsgálataink során az irodalomban először végeztük el a jelenleg legpolimorfabb mikroszatellita lokusz populációgenetikai vizsgálatát négy kontinens nyolc népességénél. A nyert adatainkkal bizonyítottuk, hogy e lokusz magas polimorfizmusa miatt kiválóan alkalmazható az

5

igazságügyi hemogenetikai gyakorlatban, mind a származás-megállapítás, mind pedig a személyazonosítás területén egyaránt. Az Y kromoszóma három polimorf lokuszán elvégzett mutációanalízissel bizonyítottuk ezen régiók alkalmazhatóságát főként az ún. deficiens esetek vizsgálatánál.

6

SUMMARY DNA TECHNOLOGY AND ITS APPLICATION IN FORENSIC MEDICINE Author: András Lászik, M.D. Tutor: András Falus, Ph.D, D.Sc School of Ph.D Studies of Semmelweis University Scientific research of the last decade including the introduction of new molecular biological methods and mapping of the human genome allowed the development of a revolutionary new molecular biological approach in forensic medicine. The traditional serological methods study proteins, the new DNA analysis goes further down to studies DNA structures to analyze unique individual features. The two main areas of DNA application in forensic medicine are inheritance studies and identification in criminal cases using biological remnants. Using this new, reliable and reproducible DNA method we can answer questions they were almost impossible in the past. The goals of our studies were: to obtain data on changes of DNA molecule on a specific external environmental condition, on allele distribution of two polymorph loci in different populations and occurrence of mutation of three Y-chromosomal loci during meiosis. According to our results, during X-ray diffraction elemental analysis the DNA molecules of sperms, they suffer damage proportional to the time of irradiation. Using new molecular biological methods these damaged sperms can still be used for amplification and can be typed, no false typing has occurred. Our further studies, first time in the scientific literature we genetically examined the most polymorph locus population in 8 racial groups of 4 continents. The data obtained proved that this locus could be used in ancestry and identification cases due to its high polymorphism. Our mutation analysis on three different polymorph loci of Y chromosome showed excellent usefulness of these regions mainly in the so-called deficient cases.

7

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE AA

akrilamid

A.L.F.

Automata Lézer Fluorescens DNS szekvenáló

APS

ammónium peroxid szulfát

BIS

N,N-metilén biszakrilamid

BSA

bovin szérum albumin

Cy5

indodikarbocianin-5’- foszforamidit

dNTP

dezoxiribonukleozid-trifoszfát

DNS

dezoxiribonulkeinsav

DTT

dithiotreitol

DMSO

dimethyl-sulfoxid

EDTA

etiléndiamin-tatraacetát

Exp.

várható

FAM

fluorescens festék (kék)

GEDNAP

german DNA profiling

HEX

fluorescens festék (zöld)

JOE

fluorescens festék (zöld)

mtDNS

mitokondriális DNS

Obs.

megfigyelt

PAA

poli-akrylamid

PDA

piperazin diakrylamid

POP

performance optimised polymer

ROX

fluorescens festék (piros)

SDS

nátrium dodecil szulfát

STR

rövid ismétlődési egység (short tanden repeat)

TAMRA

fluorescens festék (sárga)

TEMED

N,N,N,N –tetrametilén-diamin

UP

ultra tiszta (ultra pure)

UV

ultraviola

8

1.

BEVEZETÉS

A polimorf markerek használata az igazságügyi kérdések megoldásában korántsem új keletű, azonban a használható markerrendszerek limitált elérhetősége jó ideig nem volt megoldott. A XIX. század elején egy francia kutató azt állította magáról, hogy képes pusztán a szaguk alapján megkülönböztetni állati és emberi vérnyomokat, sőt az utóbbiaknál a nemeket is el tudja különíteni (4). Századunk elején az igazán nagy áttörést a Landsteiner és Wiener által felfedezett, szabályszerűen öröklődő AB0 vércsoportok jelentették, melyet számos, közel hasonló, kevéssé polimorf rendszer felfedezése követett (33). Közülük néhány – azok környezeti hatásra bekövetkező változása miatt – téves következtetések levonásához is vezetett (54). További hátrányuk az volt, hogy nagy részük csupán a vérben volt megtalálható (3). Az elmúlt évtized eredményei, mint az emberi genetikai állomány teljes feltérképezésének elindítása, valamint az új molekuláris biológiai módszerek bevezetése lehetővé tették a molekuláris biológia alkalmazását az igazságügyi orvostani gyakorlatban is. A hagyományos szerológiai elemzés az egyedi jellegeket a fehérjék, míg a DNS analízis ezeket már közvetlenül az örökítõ anyag szintjén vizsgálja. A DNS analízis alkalmazásának két fő területe az igazságügyi orvostanban a származás megállapítás és a bűnügyekben biztosított biológiai nyomok alapján végzett személyazonosítás. Az igazságügyi orvostani esetek vizsgálatakor a DNS technika – a radiológiai, szövettani, toxikológiai vizsgálatok mellett – mára az egyik legfontosabb boncolást kiegészítő vizsgálat lett. E dinamikusan fejlődő új, objektív vizsgáló módszer által kínált lehetőségekkel a személyazonosítással és származás megállapítással kapcsolatban olyan fontos kérdésekre kaphatunk választ, melyeket az eddig rendelkezésre álló vizsgálati eljárásokkal nem lehetett eredményesen megválaszolni.

9

2. CÉLKITŰZÉS A vizsgálataink során célul tűztük ki annak vizsgálatát, hogy: 1./ az emberi szervezet különböző sejtjeiben fellelhető DNS molekulák kémiai szerkezetükből adódóan a rájuk ható – a kísérleteink során alkalmazott – szélsőséges környezeti hatásokat milyen módon viselik el. Integritásuk milyen mértékben változik meg

és

a

továbbra

is

pontosan

tipizálhatók

maradnak-e

az

igazságügyi

haemogenetikában napjainkban használatos molekuláris biológiai módszerekkel. 2./ az elektronmikroszkóppal vizsgált spermiumok DNS molekulái milyen fokú károsodást szenvednek a nagy energiával gyorsított elektronok becsapódása következtében és ez befolyásolja-e a kinyerhető DNS minőségét, mennyiségét, sokszorosíthatóságát (amplifikálhatóságát) ill. tipizálhatóságát. 3./ a D17S30 lokuszban és az ACTBP2 pszeudogénben foglalt sokszorosítható (amlifikálható) hosszpolimorfizmus, ill. mikroszatellita short tandem repeat (STR) polimorfizmusok alléljai milyen megoszlást mutatnak a magyarországi népességben és ezek a markerek alkalmasak-e személyazonosításra. Továbbá arra, hogy a talált jellegek mutatnak-e eltérést, ill. egyezést az eddig vizsgált populációkkal. 4./ a rendkívül polimorf ACTBP2 lokusz alléljai milyen módon oszlanak meg a vizsgált, egymástól földrajzilag távol álló populációkban, ill. szükség van-e ezen polimorf lokusz esetén a különböző népességek szerint történő adatbázisok létrehozására. 5./ az Y kromoszómán kapcsoltan öröklődő DYS 19, DYS 390 és a DYS 389-es lokuszok milyen mutációs rátával rendelkeznek és így alkalmasak-e származás megállapítási vizsgálatok végzésére, főként az un. deficiens esetek esetén.

10

3. IRODALMI HÁTTÉR 3.1. A DNS MOLEKULA SZERKEZETE, FELÉPÍTÉSE, STABILITÁSA

1944-ben Avery ismerte fel, hogy az örökítő anyag a DNS molekula. 1953-ban Watson és Crick röntgendiffrakciós eljárással fedezte fel a DNS kettős spirál szerkezetét. 1961ben Nierenberg és Mattei megfejtette a genetikai kódot. 1977-ben Sanger és munkacsoportjának új módszerével lehetővé vált a DNS molekula bázissorrendjének meghatározása, a szekvenálás. A DNS molekula a hozzá kapcsolódó hisztonokkal a kromoszómák egységeit, a nukleoszómákat alkotja. Az egymás mellett elhelyezkedő nukleoszómákat az un. spacer DNS szakaszok és a hozzájuk kapcsolódó H1-es hisztonok kötik össze. Az egymás mellett elhelyezkedő nukleoszómák alkotják a kromatinszálakat. A DNS elsődleges szerkezete egy hossztengelye körül megcsavart létrára emlékeztet. A létra szárait dezoxiribóz-foszforsavlánc, fokait pedig mindössze négy különböző és páronként egymáshoz kapcsolódó nitrogéntartalmú molekulák, az un. bázisok alkotják. Ezek az adenin, a guanin, a timin, és a citozin. Az első kettő az egy gyűrűs purin-, az utóbbiak pedig a két gyűrűs pirimidin bázisok. Az adenint és timint két, a guanint és a citozint három laza hidrogénhíd kötés, míg a cukormolekulát a foszforsav molekulával erős kovalens foszfodiészter kötések kapcsolják össze. A DNS molekula alapkövei a dezoxiribózból, foszforsavból és egy bázisból álló nukleotidok. A bázisok egymás utáni sorrendje határozza meg a genetikai kódot ( 1. ábra ).

11

1. ábra. A DNS molekula szerkezete A DNS molekula kémiai szerkezetének köszönhetően jelentős hőmérséklet, pH, só, szerves oldószer és más szélsőséges környezeti hatásnak is ellenáll, ellentétben a szerológiai

markerekkel.

Stabilitása

főként

a

környezet

hőmérsékletétől,

nedvességtartalmától és a mikroorganizmusok aktivitásától függ. Nedves, meleg környezetben a DNS molekula a bakteriális endonukleázok által gyorsan és szinte teljesen lebomlik, degradálódik, míg a szárazság kitűnően konzerválja. A fentiekből adódóan több ezer éves egyiptomi múmiából, gyantába zárt 30 millió éves rovarból és jégbefagyott ősállatokból is sikeresen lehetett használható DNS molekulákat izolálni. Száraz környezetben elfekvő csontokból, fogakból – főként mitokondriális DNS technikával – évtizedek, sőt évszázadokkal később is eredményes vizsgálat végezhető (45).

12

3.2. A HUMÁN GENOM SZERVEZŐDÉSE Egy felnőtt ember szervezete kb. 1014 sejtből áll (50). Az örökítő anyag a DNS molekula a sejtmagban (genomiális DNS) és a mitokondriumokban (mitokondriális DNS) helyezkedik el. A sejtmagban a fehérjékhez – hisztonokhoz – kötött DNS molekulák alkotják a kromoszómákat. A testi sejtek csaknem mind diploidok, így 22 pár anyai és apai testi kromoszómát (autoszomát) és egy pár ivari – a nemek meghatározásában szerepet játszó – kromoszómát (gonoszómát) tartalmaznak. Az ivari kromoszóma lehet X vagy Y. Egy női egyed 2x22 autoszómát és két X gonoszómát, míg egy férfi 2x22 autoszomát, egy X és egy Y gonoszómát hordoz. Kivételt jelentenek például a poliploid sejtek, így a tetraploid májsejtek (92 kromoszóma), a sokmagvú izomsejtek és a mag nélküli vörösvértestek. A szervezet ivarsejtjei haploidok, így 1x23 kromoszómát tartalmaznak. A testi kromoszómákat alkotó DNS láncok hossza 250 – 55 Mb között mozog, míg az X ivari kromoszómáé kb. 140, az Y kromoszómáé pedig 60 Mb. A sejtmag genetikai állománya kb. 50.000 – 100.000 gént tartalmaz. A gének a DNS molekulák meghatározott szakaszai, melyek fehérjéket vagy RNS molekulákat kódolnak, különböző kifejezésformái az allélok. Ha a genetikai állomány egy helyén a szülőktől származó allél / gén szerkezet megegyezik homozigóciáról, ha különbözik heterozigóciáról beszélünk (58). Egy diploid kromoszómaszerelvény mag DNS molekulája 2x3x109 bázispárból áll. A legnagyobb kromoszóma kiegyenesített kettősspirálja kb. 8,5 cm hosszú lenne. A DNS molekulába foglalt összes szekvencia információjával több százezer könyvlapot lehetne megtölteni. Ellentétben a sejtmag DNS molekulájával, a mitokondriális DNS nincs szerkezeti fehérjékhez kötve. A sejtben akár több ezer kópiában van jelen, gyűrű alakú, 16569 bázispár hosszú, anyai öröklődésű és bázissorrendje pontosan ismert (2). A mitokondriális DNS molekula 37 gént tartalmaz, melyek a különböző RNS típusok közel kétharmadát és az oxidatív foszforilációban résztvevő enzimek génjeinek közel egy harmadát kódolják (36, 58).

13

A sejtmag DNS szerkezete Az emberi genetikai állomány mindössze kb. 3 %-a kódolódik, azaz íródik át fehérje molekulákba. A nem kódoló DNS pszeudogénekből, intronokból, még nem pontosan definiált szekvenciákból és ismétlődő DNS szakaszokból tevődik össze. Az intronok a szomszédos

fehérjekódoló

gének

kifejeződésének

szabályozásában,

a

gének

átrendeződésében és újrakombinálódásában játszhatnak szerepet. A humán genom kb. 30%-ban tartalmaz ismétlődő, un. repetitív szekvenciákat is, melyek két nagy csoportra oszthatók. Az első csoport a szatellita DNS csoport, a másik pedig a szétszóródó repetitív DNS, amely elsősorban az ún. transzpozonokból származik. A szatellita DNS sajátos szekvenciájú, rövid DNS darabokból áll, amelyek akár több ezerszer is ismétlődhetnek. Emberben elsősorban a kromoszóma centromer régiója körüli területen helyezkednek el és az ún. konstitutív heterokromatin fő alkotói. A szatellita DNS nem egységes csoport. Létezik miniszatelllita és mikroszatellita DNS is. Ahogy a nevük mutatja ezekben az esetekben a repetitív szekvencia rövidebb, mint a szatellita DNS esetében. Az eloszlásuk is más, egyenletesebben oszlanak el a genomban. A szatellita DNS szekvenciák nem íródnak át és jellemző feladataikat sem sikerült eddig megtalálni (58, 64). A mitokondriális DNS szerkezete A magasabb rendű, soksejtű élőlényekben létezik DNS a sejtmagon, a kromoszómákon kívül is. A sejtlégzést és az energiatermelést végző sejtalkotók a mitokondriumok is tartalmaznak DNS-t. Ez a DNS is örökítő anyag, bár információtartalma a kromoszómális DNS-nek csak csekély töredéke. A humán mitokondriális DNS (mtDNS) körkörös, kétszálú, 16 569 bp hosszú, két riboszómális RNS-t, huszonkét transzfer RNS-t és az oxidatív foszforilációs rendszer 67 polipeptidjéből 13-at kódol. Az I komplex (NADH CoQ reduktáz) 7 alegységét, a III komplex (apocitokrom b), a IV. komplex (citokrom c oxidáz; COX) I., II. és III. alegységeit, valamint az V. komplex APT-áz 6. és 8. alegységeit (36). Erre a harminchét génre nem vonatkozik a genetika jól ismert, Mendel által megállapított törvényei. Elsősorban azért nem, mert a mtDNS sejtenként több ezer példányban található meg, sőt a petesejtben több százezer

14

példányban, a spermiumok fejében viszont gyakorlatilag egyáltalán nem. A megtermékenyítéskor az új egyed mtDNS-ét egyedül az anyától kapja, így az általa meghatározott tulajdonságok öröklése kizárólag anyai. A mtDNS változékonyabb is, mint a mag DNS, a mutációk gyakorisága itt körülbelül tízszer nagyobb, mint a sejtmagban. Eszerint két – egymással rokonságban nem álló – ember összesen 16 569 nukleotidpár hosszúságú mitokondriális DNS-e átlagosan kb. 70 pontban különbözik egymástól, de a különbség akár 500 nukleotid is lehet. Minél távolabb áll egymástól két ember származástanilag, annál nagyobb a különbség. És fordítva, ha két ember mtDNSe teljesen azonos, akkor biztos, hogy közöttük közvetlen anyai ágú – rokonság van. Cann, Stoneking és Wilson 147 a ma élő emberiség különböző rasszait (fajtáit) képviselő személy mtDNS-ét elemezték és hasonlították össze. Komputerprogramok segítségével ezek rokonsági foka megállapítható ill. valószínűsíthető volt, sőt meg tudtak állapítani egy feltételezett családfát, leszármazási sort is. Annak ismeretében, hogy milyen gyakorisággal történnek mutációk, ez a leszármazási sor, vagy családfa az idő dimenziójában is hitelesíthető, azaz megbecsülhető, hogy mikor eredtek az egyes leágazások ezen a törzsfán. Az elvégzett számítások alapján ez a törzsfa a vizsgált 147 különböző ember esetében egyetlen képzeletbeli pontból indult ki. Ennek a képzeletbeli szekvenciának az összehasonlítása a ma fellelhetőkkel egyértelműen azt igazolta, hogy a fa legelső elágazásai Afrikában történtek. Ezzel összhangban van az a tény is, hogy a ma élő afrikaiak mtDNS-e sokkal több eltérést mutat egymástól, mint bármely más embercsoport egyedei, ezzel is alátámasztva, hogy ők mentek keresztül a leghosszabb ideig tartó evolúción (60). Az mtDNA vizsgálatával már sejtmag nélküli biológiai anyagok ( pl. haj, szőr, csont ) felhasználásával is lehetőség nyílik anyai ágú rokonsági viszonyok tisztázására, rasszok és személyek azonosításra.

3.2.1. MINISZATELLITÁK

15

A miniszatelliták olyan hipervariábilis DNS-régiók, melyeket a human genomban elsõként Wyman és White talált meg véletlenül 1980-ban (64). Az igazságügyi orvostanban különösen nagy jelentõségük van. Nem kódolódnak, ezáltal az itt fellépett mutációk ez egyed életét nem befolyásolják hátrányosan, így generációkon keresztül igen nagy variábilitásra tettek szert. Egymás után összekapcsolt, azonos polaritású, magas guanin és citozin tartalmú, különbözõ számú DNS ismétlődési-egységekbõl (VNTR) állnak, melyek szekvenciája könnyen módosulhat. Ezek az ismétlõdések 20100 bázispár hosszúságúak és számuk akár 230-ig is emelkedhet. Így e magas polimorfizmusú VNTR-fragmensek hossza elérheti a 23 000 bázispárt is (25). Funkciójuk jelenleg nem ismeretes, egyesek ”parazita”, ” önzõ ”, mások másodlagos, jelentés nélküli evolúciós maradványoknak vélik õket (11). Az egyes lokuszok egyedre jellemzõ variabilitása az ismétlõdõ egységeik számbeli és szekvencia eltérése – polimorfizmusa – következtében jön létre (2. ábra). Jeffreys és Nakamura a mioglobin-, a zéta globin -, az inzulin gén és a hepatitisz B vírus X gén régiójának szekvenciájából olyan un. multi lokusz szondákat készítettek, melyekkel a humán genomban elszórtan elõforduló hipervariábilis VNTR lokuszallélok hossz-polimorfizmusának vizsgálatára nyílt lehetõség (25, 43). A laborok közötti információ csere szempontjából fontos lépés volt az un. single lokusz oligonukleotid szondák kifejlesztése, melyekkel egy adott lokusz két allélja – egy anyai és egy apai eredetû – lett azonosítható. Több lokusz vizsgálatával az egyedre jellemzõ genetikai profil – un. ”genetikai ujjlenyomat ” – nyerhetõ. Az allélok mendeli öröklõdést mutatnak, az utód egyiket az anyjától, másikat az apjától örökli (34, 38).

lokusz A allél 1

-↓------

------↓--------

16

allél 2

-↓------

------↓-------------------

lokusz B allél 1

--↓-----

allél 2

--↓-----

---------↓---------------↓-------------

2. ábra. A VNTR-polimorfizmus sematikus ábrázolása. A négyzetek és téglalapok a különbözõ szekvenciájú, ismétlõdõ egységeket szimbolizálják, melyeknek számbeli eltérése eredményezi az egyedre jellemzõ változatosságot. A nyilak a restrikciós endonukleáz felismerési helyeit jelölik. 3.2.1.1. MULTI- ÉS SINGLE LOKUSZ SZONDÁK A multi lokusz (MLS) génszondák minden olyan lokuszhoz hozzákapcsolódnak, ahol a szondáéval komplementer szekvencia megtalálható (26). Az így nyert profilt nevezzük „fingerprintnek” (25). Az igazságügyi hemogenetikai gyakorlatban – főként korábban – használt fontosabb ML szondákat az 1. táblázat foglalja össze. A szonda neve

Kromoszómális lokalizáció

Lokusz

Gyártó

MLS 33.15

7q31.1

D7S437

Cellmark

MLS 33.6

1 cen-q24

D1S111

Cellmark

(GTG)5

Több kromoszómán

Több lokuszon

Fresenius

1.táblázat. Az igazságügyi hemogenetikában használt multi lokusz szondák jellemzői.

3.2.1.2. AMPLIFIKÁLHATÓ HOSSZ-POLIMORF LOKUSZOK

17

Ezeknél a lokuszoknál (pl. MCT118/D1S80, YNZ22/D17S30 stb.) 15-70 bázispár az ismétlődő DNS szakaszok hossza és a leghosszabb allél 1010 bp hosszú. Megbízható tipizálásukhoz jó minőségű DNS minta és az STR lokuszokhoz hasonlóan szekvenálással hitelesített allélkoktélok szükségesek.

3.2.2. MIKROSZATELLITÁK A mikroszatelliták 2-10 bp ismétlődő egységeket tartalmazó nem kódoló szekvenciák (59). E short tandem repeat (STR) rendszereket a DNS tipizálásban és genetikai térképezésben először Edwards és munkatársai alkalmazták 1991-ben. A genomban igen nagy számban (105) fordulnak elő és az ismétlődő egységek száma akár száz is lehet lokuszonként. Az AmpFLP-rendszerekhez hasonlóan az amplifikálható VNTRpolimorfizmusokhoz tartoznak, azoktól az ismétlődő egységek lényegesen alacsonyabb számában és az amplifikált fragmentumok hosszúságában különböznek (< 400 bp) (12). A gyakorlatban a négy bázispáros ismétlődő egységeket tartalmazó tetramer STR lokuszok vizsgálata terjedt el a leginkább, mivel a DNS-polimeráz csúszásából eredő és a kiértékelést esetlegesen zavaró aspecifikus fragmentek keletkezése ezeknél figyelhető meg a legkisebb mértékben (63). A tandem ismétlődések e csoportja a miniszatellitákkal a VNTR polimorfizmusokhoz tartozik (59, 62). Az igazságügyi hemogenetikában alkalmazásukkal lehetőség nyílt rossz minőségű, un. degradált DNS minták vizsgálatára is. Az alábbiakban néhány fontosabb, az értekezésben is vizsgált STR rendszert és azok fontosabb tulajdonságait ismertetjük.

3.2.2.1.

RÖVID ISMÉTLŐDŐ EGYSÉGEKET TARTALMAZÓ ÚN.

SHORT TANDEM REPEAT (STR) MIKROSZATELLITA LOKUSZOK

18

3.2.2.1.1.

AUTOSZÓMÁLIS LOCUSOK

HumCD4: Fragmenshossz 100 bp, viszonylag alacsony polimorfizmus a kaukazoid populációban. Igen nagy érzékenység (<50 pg templát DNS). Éles sávok és ritka műtermékek. Nagy degradációs érzékenység idős biológiai anyagoknál (pl. csontok). Ismétlődő egység bázissorrendje: CTTTT. Kromoszómális lokalizáció: 12p (12). P1 :5’- TTG GAG TCG CAA GCT GAA CTA GC – 3’ P2: 5’- GCC TGA GTG ACA GAG TGA GAA CC –3’ HumF13B: Fragmenshossz 200 bp, viszonylag alacsony polimorfizmus a kaukazoid populációban. Igen nagy érzékenység (< 100 pg templát DNS). Éles sávok és ritka műtermékek (pl. árnyéksávok). Alacsony degradációs érzékenység idős biológiai anyagoknál. Ismétlődő egység bázissorrendje: TTTA. Kromoszómális lokalizáció: 1q31-q32 (43). P1 :5’- TGA GGT GGT GTA CTA CCA TA – 3’ P2: 5’- GAT CAT GCC ATT GCA CTC TA – 3’ HumFES/FPS (FES): Fragmenshossz 250 bp, viszonylag alacsony polimorfizmus a kaukazoid populációban. Nagy érzékenység. Éles sávok és ritka műtermékek (pl. árnyéksávok). Alacsony degradációs érzékenység idős biológiai anyagoknál. Ismétlődő egység bázissorrendje: ATTT. Kromoszómális lokalizáció: 15q25 (46). P1 :5’- GGG ATT TCC CTA TGG ATT GG- 3’ P2: 5’- GCG AAA GAA TGA GAC TAC AT – 3’ HumTPOX (HTPO): Fragmenshossz 250 bp, viszonylag alacsony polimorfizmus a kaukazoid populációban. Nagy érzékenység. Éles sávok és ritka műtermékek (pl. árnyéksávok). Alacsony

19

degradációs érzékenység idős biológiai anyagoknál. Ismétlődő egység bázissorrendje: AATG. Kromoszómális lokalizáció: 2p13 (43). P1 :5’- ACT GGC ACA GAA CAG GCA – 3’ P2: 5’- GGA GGA ACT GGG AAC CAC ACA GGT – 3’

HumTH01: Fragmenshossz 150 bp, közepesen nagy polimorfizmus a kaukazoid populációban. Nagy érzékenység. Éles sávok és ritka műtermékek (pl. árnyéksávok). Alacsony degradációs érzékenység idős biológiai anyagoknál. Ismétlődő egység bázissorrendje: AATG. Kromoszómális lokalizáció: 11p15-15.5 (12, 46). P1: 5’- GTG GGC TGA AAA GCT CCC GAT TAT- 3’ P2: 5’- GTG ATT CCC ATT GGC CTG TTC CTC - 3’

HumVWF31A (vWA): Fragmenshossz 150 bp, közepesen nagy polimorfizmus a kaukazoid populációban. Nagy érzékenység. Gyakori műtermékek (árnyéksávok). Alacsony degradációs érzékenység idős biológiai anyagoknál. Ismétlődő egység bázissorrendje: TCTA/TCTG. Kromoszómális lokalizáció: 12q12 (24). P1 :5’- CCC TAG TGG ATG ATA AGA ATA ATC- 3’ P2: 5’- GGA CAG ATG ATA AAT ACA TAG GAT GGA TGG – 3’

HumFIBRA (FGA): Fragmenshossz 200 bp, viszonylag magas polimorfizmus a kaukazoid populációban. Nagy érzékenység. Éles sávok és ritka műtermékek (pl. árnyéksávok). Alacsony

20

degradációs érzékenység idős biológiai anyagoknál. Ismétlődő egység bázissorrendje: TC/TCTT. Kromoszómális lokalizáció: 4q28 (13). P1 : 5’- GCC CCA TAG GTT TTG AAC TCA- 3’ P2: 5’- TGA TTT GTC TGT AAT TGC CAG C – 3’ HumACTBP2 (SE33): Ezt a rendkívül polimorf lokuszt dél-magyarországi populációban Csete és munkatársai natív gélen vizsgálták 1996-ban, azonban az ezzel a vizsgálati módszerrel nyert vizsgálati eredmények nem tekinthetők megfelelőnek a kellő felbontás hiánya miatt. A Genetikai disztanciák Cavalli Forza, populációk rokonsága, eredete. Adatbank egyik rendszere. A lokusz a 6. kromoszomán helyezkedik el (47). P1: 5’ – AAT CTG GGC GAC AAG AGT GA P2: 5’ – ACA TCT CCC CTA CCG CTA TA

3.2.2.1.2. Az

Y KROMOSZÓMÁLIS LOKUSZOK

igazságügyi

hemogenetikában

napjainkban

használt,

kapcsoltan

öröklődő

tetranukleotid mikroszatellita STR rendszerek az Y kromoszóma nem rekombinálódó részén helyezkednek el. Az utóbbi időben egyre nagyobb jelentőséget kapnak elsősorban az apai ágú öröklődés nyomon követése és szexuális bűncselekmények elkövetőinek azonosítása miatt. Füredi és munkatársai számos Y kromoszómális lokusz populációgenetikai adatait publikálták (18). Az irodalomban közölt nagyszámú Y kromoszómális lokuszok közül csak az általunk vizsgált DYS 19, DYS 390 és DYS 389 lokuszok kerülnek az alábbiakban részletes ismertetésre.

DYS 19 ( 27H39LR) lokusz:

21

Ennél az Y kromoszóma rövid karján található lokusznál a polimorfizmus a CTAT tetranukleotid egységek számbeli variációja eredményezi / (CTAT)n /. Az ismétlődő egységek száma 10-19. Az allélok mérete 174-210 bp. Eddig az irodalomban 10 kükönböző allélt került leírásra (48). P1: 5’- CTACTGAGTTTCTGTTATAGT- 3’ P2: 5’ – ATGGCATGTAGTGAGGACA – 3’

DYS 390 lokusz: Ennél az Y kromoszóma hosszú karján található lokusznál a polimorfizmus a CTGT tetranukleotid egységek számbeli variációja eredményezi / (CTGT)n /. Az ismétlődő egységek száma 18-27. Az allélok mérete 191-227 bp. Eddig az irodalomban 10 különböző allélt írtak le (49). P1: 5’ – TATATTTTACACATTTTTGGGCC – 3’ P2: 5’ – TGACAGAAAATGAACACATTGC – 3’

DYS389 lokusz: Ez a két részből álló lokusz az Y kromoszóma hosszú karján található. A polimorfizmust a CTGT / CTAT tetranukleotid egységek számbeli variációja eredményezi / (CTGT)n ill. (CTAT)n /. Az ismétlődő egységek száma 7-13 ill. 23-31. Az allélok mérete 239-263 ill. 353-385 bp. Eddig az irodalomban 7 ill. 9 különböző allélt észleltek (49). P1: 5’- TCATCTGTATTATCTATG-3’ P2: 5’- JOE – CCAACTCTCATCTGTAATTATCTAT-3’ P3: 5’- FAM – ATAAATAATATAAAATATAAATAAATAAATATAGATAGACAG

22

3.2.3. SZEKVENCIA POLIMORFIZMUS (OLIGOTYPING) A DNS szekvencia polimorfizmusok vizsgálata az igazságügyi PCR-tipizálások első fázisához tartoznak (22, 56). Ezt a tipizáló rendszert a Cetus molekuláris biológiai társaság humángenetikai részlege fejlesztette ki. Az igazságügyi DNS tipizálás céljából kiválasztott és legalaposabban vizsgált terület a HLA II osztályának D génrégiójában található HLA DQ A1-es lokusza, mely a 6. Kromoszómán helyezkedik el (5). Ez a génrégió öt egységre – DP, DN, DO, DQ, DR – tagozódik. Az itt elhelyezkedő exonok a- és b-glikopeptideket kódolnak, melyek variábilis régiói idegen antigének peptidfragmenseit képesek megkötni. E területnek megfelelően egy kb. 240 bp nagyságú fragmens amplifikálható, nyolc alléllal. Az allélok meghatározására szekvenciaspecifikus oligonukleotidokkal (SSO) történő hibridizálással nyílik lehetőség (14). A tipizálás az un. dot-blot technikával történik, melynél a szekvenciaspecifikus szonda egy poli-timin nyéllel nylonmembránhoz van gyárilag kötve, melyhez a biotinnal jelölt primert tartalmazó amplifikátumok kapcsolódnak. A kapcsolódást követő színreakció útján nyílik lehetőség a talált jellegek meghatározására.

3.3. A DNS MOLEKULA KINYERÉSE , TISZTÍTÁSA A DNS technika egyik legfontosabb lépése a vizsgálni kívánt DNS molekula kinyerése, lehetőleg úgy, hogy az extrahálás alkalmával minél kevésbé sérüljenek a molekulák. Az első ilyen módszert Sambrook és munkatársai fejlesztették ki, melynek során Proteináz K emésztést követően fenollal vonták ki a fehérjéket, majd etanollal csapták ki a már megtisztított DNS molekulákat (55). Jelentős lépés volt azoknak a környezet és kutatóbarát eljárásoknak a megjelenése, melyek a fenolt már nem használják (32, 61). Legújabban különböző kitek kerültek forgalomba, melyek összetételét azonban a gyártó

23

cégek nem adják meg. DNS vizsgálatra minden olyan biológiai anyag alkalmas – a mitokondriális DNS vizsgálaton kívül – melyben sejtmaggal rendelkező sejt található. A könny, izzadtság, szérum valamint sejtmag nélküli sejteket tartalmazó testnedvek standard DNS vizsgálatra nem alkalmasak. Az alábbi biológiai anyagokból izolálható és tipizálható eredményesen DNS a klasszikus módszerekkel: • vér és vérnyomok • sperma- és spermanyomok • szerv és szövet • csontok és fogak • hajhagymás hajszál • nyál, vizelet A DNS profil elkészítését számos faktor befolyásolhatja. Az első a rendelkezésre álló minta mennyisége. A második faktor a degradáció. Környezeti hatásra (pl. bakteriális kontamináció) a DNS – akár még viszonylag nagy mennyiségű biológiai anyagnál is – tönkremehet. A harmadik faktor a minta tisztasága. Különböző szennyeződések (pl. indigó) nagyfokban gátolhatják a tipizálást, különösen a PCR reakciót. Különböző biológiai anyagok átlagos DNS tartalmát a 2. táblázatban foglaltuk össze (37, 38).

A minta típusa Vér Vérnyom (1cm2) Sperma Postkoitalis hüvelykenet Haj (hagymával) -tépett -hullott Nyál Szájnyálkahártya kenet Vizelet Csont

DNS mennyiség 20.000-40.000 ng /µl 250-500 ng 150.000 – 300.000 ng /ml 10 – 3000 ng 1-750 ng / gyökét 1-12 ng / gyökér 1000 – 10.000 ng /ml 1000 – 1500 ng 1-20 ng / ml 3-10 ng / mg

24

2. táblázat. Különböző biológiai anyagok átlagos DNS tartalma. A legtöbb DNS-t a Quiagen cég QIAampTissue kittel tudtuk kinyerni, ezért ezt használtuk több esetben is, amikor a fenolos módszereket el kívántuk kerülni. Az általunk használt eljárások részletes leírása a függelékben található meg.

3.4. A DNS POLIMORFIZMUSOK VIZSGÁLATÁBAN ALKALMAZOTT MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI MÓDSZEREK 3.4.1. Restrikciós fragmens hossz-polimorfizmus (RFLP) A restrikciós fragmens hossz-polimorfizmus a genomi DNS baktériumokból nyert restrikciós endonukleáz enzimekkel történt hasítása után kapott DNS fragmentumok méretében megfigyelt változékonyság. Az RFLP vizsgálat során az egész genetikai állományt vizsgáljuk és a kérdéses régiókat un. több- vagy egy lokuszos szondákkal detektáljuk. A vizsgálat lépéseit a 3. ábra szemlélteti.

• • • • • • • •

DNS izolálás Fotometriás mennyiség meghatározás DNS emésztés restrikciós endonukleaz enzimmel (Hinf I, Hae III, stb.) Az emésztettség vizsgálata minigélben Az emésztett DNS szétválasztása gélelektroforézissel DNS átvitel nylon membránra (Southern blotting) DNS depurinálás DNS denaturálás A DNS hibridizációja multi- ill. single locus szondával prehibridizálás hibridizálás Chemiluminescens detekció (ECL) RTG filmmel

25

•

Értékelés

3. ábra. Az RFLP vizsgálat lépései. Az RFLP vizsgálat nagy előnye, hogy rendkívül polimorf. Hátránya, hogy eredményes elvégzéséhez viszonylag nagy mennyiségű (> 500ng), ép DNS molekula szükséges (24).

3.4.2. POLIMERÁZ EMZIMMEL VÉGZETT DNS SOKSZOROSÍTÁS (POLYMERASE CHAIN REACTION – PCR) A Nobel-díjjal jutalmazott eljárást 1986-ban K. Mullis és munkacsoportja fejlesztette ki. Ennek lényege, hogy akár rendkívül kis mennyiségű biológiai minták – kivételes esetben már akár néhány sejtnyi (0,000 000 000 01g !) DNS minta – vizsgálni kívánt polimorf szakaszát egy speciális, hő stabil enzim segítségével több milliószorosára lehet sokszorozni, ami ezt követően már molekuláris biológiai módszerekkel vizsgálhatóvá válik. A biológiai nyomokból (vér, ondó, nyál stb.) kinyert DNS molekulákat, a vizsgálni kívánt polimorf szakasz elejéhez kapcsolódó indító molekulákat (primerek), hő stabil polimeráz enzimet, ionokat és a DNS molekula építő köveit tartalmazó oldatban – a DNS szálak egymást kiegészítő tulajdonságát kihasználva – 25-40 cikluson át láncreakciószerűen felszaporítjuk (amplifikáció). Így a vizsgálni kívánt DNS szakaszok száma ciklusonként megduplázódik. Egy ciklus általában három lépésből áll. Az első lépésben a mintát 90-96 oC-ra felmelegítjük, ekkor a DNS molekulák szálai szétválnak (denaturáció). A második lépésben a reakcióelegyet 50-65oC közötti hőmérsékletre hűtjük, ahol az indító molekulák (primerek) mindkét DNS szál vizsgálandó szakaszainak elejéhez kapcsolódnak (annealing). Az utolsó lépésben az enzim egy magasabb hőmérsékleten (70-72 oC), az építőköveket (dNTP) felhasználva megszintetizálja a komplementer DNS szálakat (extension). Ezután a ciklus kezdődik előröl és ekkor már a vizsgálni kívánt ismétlődő egységeket tartalmazó új DNS szálak is mintaként szolgálnak az indító molekulák és az enzim számára. A felszaporított, az

26

egyedre jellemző ismétlődő egységeket tartalmazó DNS szakaszok ezt követően elektromos áram segítségével szétválaszthatók (elektroforézis) (42). 3.4.2.1. DNS polimerázok Ezek az enzimek a sejtben a kromoszóma replikációt és a DNS molekula helyreállítását végzik. Két szubsztrátjuk van. Az egyik a templát DNS-hez kapcsolódott, szabad 3’-OH csoportot

tartalmazó

egyszálú

oligonukleotid

primer

molekula,

a

másik

a

dezoxinukleotid 5’- trifoszfát (dNTP). A polimerizáció során a lánchosszabbodás 5’→3’ irányban történik. A polimeráz enzimek fontos tulajdonságai a percenkénti nukleotid beépítési sebesség ( turnover rate ) és az új lánc felépítési hűsége ( fidelity ). Néhány DNS polimeráznak a polimerizáción kívül más funkciója is lehet. Ilyen a 3’→5’ ill. 5’→3’ exonukleáz aktivitás, képesség RNS, mint szubsztrát elfogadására (reverz transzkripció) és templát nélküli nukleotid beépítésre. A 3’ –exonukleáz aktivitás lehetőséget teremt a helytelenül beépített bázisok eltávolítására és ez által a polimerizáció folytatására ( proofreading role). Taq DNS polimeráz A Taq DNS polimeráz (E.C. 2.7.7.7) enzim eredetileg hőforrásokban élő Thermus aquaticus moszatból izolált, hő stabil DNS polimeráz, mely magnézium ionok jelenlétében a duplex DNS láncba a nukleotidok primer dependens beépülését katalizálja 5’→3’ irányban. Az enzim működéséhez feltétlenül szükséges magnézium ionok stabilizálják a DNS kettős szálát, azonban magas (> 1,5 mM) koncentrációban a teljes denaturációt meggátolják, ezáltal a keletkezett amplifikárum mennyiségét és – hamis primer / templát kapcsolódáshoz vezetve – a reakció specificitását csökkentik (3. táblázat).

Molekulasúly

94 kDa

Fél élet idő 95 oC-on

40 perc

Extenziós sebsség 72oC-on ( nukl. / sec )

60-150

27

Reverz transzkriptáz aktivitás

minimális

PCR optimum :extenziós hőmérséklet

70-75 oC

Mg2+koncentráció

1-4 mM

pH

7-7.5

dNTP koncentráció

40-200 µM

Primer koncentráció

0.1-1 µM

5’→3’ exonukleáz aktivitás

van

3’→5’ exonukleáz aktivitás

nincs

3’ kapcsolás

van

Tárolás

-20 o C

Koncentráció

5 U/µl

3. táblázat. A Taq DNS polimeráz enzim tulajdonságai. 3.5.

A VIZSGÁLATI EREDMÉNYEK DETEKTÁLÁSA

Az igazságügyi DNS vizsgálatok során keletkezett fragmenseket legegyszerűbben az un. ezüst festési technikával jeleníthetjük meg (1). Az utóbbi években megnőtt az igény olyan technológiák iránt, amelyek sebesség és érzékenység területén jobbak, mint a korábban használt technikák és ezen túlmenően használatuk nem rejt veszélyeket magában. Ilyen a fluorescens technika. A fluorescencia jelensége egyszerű: bizonyos molekulák energiát elnyelve (lézer) gerjesztődnek (elektronjaik magasabb szintre lépnek), majd bizonyos idő elmúltával, alapállapotba visszatérve a leadott energiát fény formájában kibocsátják (emisszió). Az emittált fény általában nagyobb hullámhosszú, mint az elnyelt fény (Stokes-törvény). Az igazságügyi DNS technikában főként a következő fluorescens festékeket használjuk: Cy5, FAM, HEX, JOE, NED, ROX, TAMRA (35). 3.6.

MUTÁCIÓK ÉS POLIMORFIZMUSOK

28

Jelenlegi tudásunk szerint a miniszatellita szekvenciáknál az ivarsejtekkel átörökített mutációk

meiozis

során

kiegyensúlyozatlan

crossing

over,

míg

a

rövid

mikrosztellitáknál a DNS replikációja során az un. polimeráz csúszás (slippage) következtében jönnek létre (59). Az autoszómális mikroszatellita lokuszok mutációs gyakorisága az STR-ek szerkezetétől, hosszától függ (9, 29). A mutációk az igazságügyi hemogenetikában kiemelt jelentőséggel bírnak, mert téves kizárást eredményezhetnek. Szerencsére a többszörös mutációk csak irodalmi ritkaságként fordulnak elő (19). A DNS molekulában kódolt öröklött egyedi különbségek (polimorfizmusok) lehetnek hossz- és szekvencia alapúak. A genetikai állományban a gének között számtalan helyen dadogásszerűen ismétlődő DNS szakaszok találhatók, melyek szabályosan öröklődnek és számuk a vizsgált egyénre jellemző. Nem kódolódnak, ezáltal az itt fellépett mutációk ez egyed életét nem befolyásolták hátrányosan, így generációkon keresztül igen nagy variabilitásra tehettek szert. Ezek az ismétlődések 20-100 bázispár hosszúságúak és számuk akár 230-ig is emelkedhet (un. miniszatellita hipervariabilis régiók). A hosszpolimorf rendszerekhez tartoznak az un. short tandem repeat locusok (STR), ahol 2-10 bp hosszúságú szakaszok ismétlődnek 400 bp-nál nem hosszabb allélokat alkotva. Funkciójuk jelenleg nem ismert, egyesek ”parazita”, ”önző”, mások másodlagos, jelentés nélküli evolúciós maradványoknak vélik őket. Az egyes lokuszok egyedre jellemzõ variabilitása ezen ismétlõdõ egységeik számbeli és szekvencia eltérése – polimorfizmusa – következtében jön létre (2. ábra).

A DNS molekulában kódolt öröklött egyedi különbségek másik formája a szekvencia polimorfizmus, itt az allélok hossza azonos, azonban a DNS szekvenciájában van egy vagy több bázis eltérés. Ilyen polimorfizmus az igazságügyi hemogenetikában vizsgált néhány nukleáris DNS lokuszon és a mtDNS un. kontroll (D-hurok) régiójában van (8). Y kromoszómális polimorfizmusok Az Y kromoszóma a kb. 60 millió bázispárból áll és így a 21-es kromoszóma után az ember második legkisebb kromoszómája (40). Egy heterokromatikus és egy eukromatikus részből áll. A heterokromatikus régió a hosszú kar disztális részén

29

helyezkedik el, nagyszámú ismétlődő egységet tartalmaz és hossza jelentős mértékben változhat (8). Az Y kromoszóma eukromatikus régiójának kiterjedése ezzel szemben konstans. Ide tartozik a kromoszóma rövid karja (Yp), a centromer régió és a hosszú kar proximális része. Az eukromatikus régió négy szekvenciaosztályra tagolódik: az X kromoszóma

homológok, a centromer régió repetitív szekvenciái, az Y-specifikus

repetitív szekvenciák és Y-specifikus egyes szekvenciák. Az Y komoszóma mindkét karjának telomer részén az X kromoszómával rekombinálódó pszeudoautoszomális részeket tartalmaz. Ezek hossza a rövid karon (PAR1) 2,6 Mb, a hosszú karon (PAR2) pedig 0,5 Mb. A PAR1 és PAR2 régiókon kívül az Y kromoszóma nem rekombinálódik. Ritkán fellépő aberráns rekombináció esetén az Y kromoszómáról örökítő anyag kerülhet át az X kromoszómára. Ha ez magában foglalja a TDF/SRY (testis determining factor/ sex determinig region Y) gént, úgy steril, 46, XX kromoszómaszerelvényű férfi és 46, XY kromoszómaszerelvényű, SRY deléciós nő keletkezik (8).

3.7. SPERMAKIMUTATÁS – ELŐTESZTEK A mindennapi gyakorlatban használt un. előpróbák lehetővé teszik a vizsgálni kívánt biológiai nyomok azonosítását és ezáltal nagymértekben hozzájárulnak az eredményes DNS analízis elvégzéséhez. Számos kémiai anyag azonban csökkentheti a biológiai nyomokból kinyerhető DNS mennyiségét, sőt akár lehetetlenné is teheti annak analízisét. A mindennapi gyakorlatban elterjedt savi foszfatáz teszt mind fals negatív, mind pedig fals pozitív reakciót is eredményezhet (51). Elemanalizátorral felszerelt scanning elektron mikroszkóppal előzetes kémiai anyagokkal történt kezelés nélkül nyílik lehetőség különböző biológiai minta, így a spermanyomok azonosítására is, azok morfológiája és magas cink koncentrációjának meghatározása útján (57).

30

3.8.

A DNS VIZSGÁLATOK JELENTŐSÉGE AZ IGAZSÁGÜGYI

ORVOSTANBAN Az elmúlt évtized eredményei, mint az emberi genetikai állomány teljes feltérképezésének elindítása, az új molekuláris biológiai módszerek bevezetése lehetővé tették a DNS technika alkalmazását az igazságügyi orvostani gyakorlatban is. A hagyományos, a vér vizsgálatán alapuló szerológiai elemzés a egyedi jellegeket a fehérjék, míg a DNS analízis ezeket már közvetlenül az örökítő anyag szintjén vizsgálja. A PCR alapú DNS technikával a bűncselekmények helyszínén talált rendkívül kis mennyiségű (pl. köröm alatt talált hámsejtek, cigarettacsikk, egyetlen hajszál, felragasztott bélyeg stb.), akár már részben tönkrement DNS molekulákat tartalmazó biológiai mikronyomok is eredményesen azonosíthatók. A mitokondriális DNS technikával az anyai ágú rokonsági kapcsolatok több generációs feltárása, sejtmag nélküli biológiai anyagok – pl. hagyma nélküli hajszálak, magnélküli hámsejtek – hátrahagyóinak azonosítása is lehetővé vált. Ez a módszer idős csontok, elszenesedett holttestek vizsgálatánál is eredményesnek bizonyult, ahol a nukleáris DNS teljes degradálódása miatt az un. klasszikus DNS rendszerekkel eredmény már nem volt nyerhető. Az Y kromoszómális rendszerek szexuális bűncselekmények és deficiens esetek megoldásában adnak értékes információt. Míg a klasszikus szerológiai vizsgálatokkal a talált jellegek fenotípusát, addig a DNS technikával már a genotípusukat lehet megállapítani. A származás megállapítási perek nagy része a klasszikus szerológiai vizsgálati eljárásokkal eredményesen megoldható. A vizsgált esetek egy részében azonban az összes eddig ismert vércsoportrendszerrel – melyek száma időközben a HLA-rendszerrel együtt 40 fölé emelkedett – sem lehetséges

31

egyértelmű eredményt elérni (53). E vizsgálati eljárással ezek az esetek is megoldhatók. A fentieken kívül a DNS technika segítségével egyértelműen állás foglalható a származás kérdését illetően már a terhesség alatt (magzatvíz- vagy méhlepénybolyh sejtekből), szülés után, az anya ill. a vélelmezett apa halálakor (pl. rokonok vérmintáiból, archivált szövettani blokkokból, metszetekből ), családon belüli szexuális kapcsolatból (pl. após- meny, sógor – anya, stb.) született gyermek származásának tisztázására vonatkozóan, valamint holttestből származó szövet- és vérmintákból. Ez

az

új

vizsgálati

eljárás

forradalmasította

az

igazságügyi

orvostani

személyazonosítást, segítségével olyan kérdésekre kaphatunk választ, melyeket az eddig rendelkezésre álló vizsgálati módszerekkel nem volt lehetséges megoldani.

3.9.

STATISZTIKAI ELEMZÉSEK

A populációgenetikai- és mutációs vizsgálatok elemzéséhez az alábbi biometriai egyenleteket használtuk (8). Diszkriminációs index Y kromoszómális lokuszok számára:

n DI(Y) = 1 -

Σ i=1

fij 2

32

DI = diszkriminációs index

fij = i allél fekvenciája a./ A heterozigótasági ráta meghatározása (observed heterozygosity):

Phet =

Chet

=

N - C ho

N

Chet = Σ

N

= 1-

C ho N

= 1- Pho

Σ Cij

i j>i

Phet

= heterozigóta ráta

Pho

= homozigóta ráta

Cho

= a homozigóta egyedek száma

Chet

= a heterozigóta egyedek száma

Cj

= AiAj fenotípussal rendelkező egyedek száma

N

= a nem rokon egyedek száma

b./ Megegyezési valószínűség (matching probability or probability of match – pM ): n

n

33

pM =

ΣΣ p

2 ij

i=1 j ≥ i

pM = megegyezési valószínűség pj

= az AiAj fenotípussal (genotípussal ) rendelkező egyedek gyakorisága

n = a különböző allélok száma c. / Általános apasági kizárási esély (mean exclusion cance - MEC):

MEC =

Σpi3(1-pi)2 +Σpi(1-pi)3+Σpipj(pi+pj)(1-pi-pj)2 I

i< j

i

MEC = általános apasági kizárási esély

pi,pj = az Ai ill. az Aj allélok gyakoriságai d. / A polimorfizmus információtartalmának meghatározása (polymorphism information content - PIC):

n

n

i=1

i=1

n

PIC = 1-Σpi2 – (Σpi2)2+Σpi4 i=1

PIC = a polimorfizmus információtartalma

pi = az Ai allél gyakorisága n = az egymástól különböző allélok száma

34

e / A mutációs ráta kiszámítása:

µ

X = M

X = a mutációk száma M = a független meiózisok száma Alkalmazot számítógépes programok: 1. DNA view ( Charles Brenner, USA ) 2. RxC -1.3 verzió ( M. Miller, USA ) 3. Hardy-Weinberg-Analysis- 3.2 verzió ( C.Puers, Németország )

4. VIZSGÁLATI ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. A DNS MOLEKULA STABILITÁSÁNAK VIZSGÁLATA A két véletlenszerűen kiválasztott személy friss, ép, átlagos mennyiségű spermiumokat tartalmazó spermájából 7-7 cseppet ( kb.100µl-t ) steril, fehér vászonra cseppentettünk, majd szobahőmérsékleten megszárítottuk. Mindegyik minta közepéből 1x1cm nagyságú darabot vágtunk ki, majd 6-6 darabot szénszalaggal a SEM tárgytartójára rögzítettünk. Egy-egy mintát kontrollként félretettünk. A mintákat JEOL JEE 4B vákuum gőzölőben 6x10-4-Hgmm-es vákuumban ≅50 Å vastag szénréteggel - 10 cm távolságból 30 másodpercen át 45 amperrel és 220 V-al izzított 5mm átmérőjű spektrál grafit katóddal fedtük. Ezt követően mindkét személy egy-egy mintáját EDAX detektorral felszerelt DSM OPTON 940 digitális szkenning elektronmikroszkóp vákuum terébe helyeztük és

35

1, 5, 10, 15, 20 és 25 percig 20.000 Volttal gyorsított elektronsugárral bombáztuk 10-5 Hgmm vákuumban, 64 µA áramerősség mellett (4. ábra).

4. ábra. Spermium minta EDAX spektruma, 20 keV gyorsító feszültség mellett, a spermára jellemző cinkkel (nyíl). A mintákat külön-külön Eppendorf csövekbe helyeztük és 500µl extrakciós pufferben (0.01M Tris-HCl, 0.01M EDTA, 0.1 M NaCl, 0.039 M DTT, 2% SDS pH 8.0) 12 µl (20mg/ml) Proteináz K-val 56 oC-on egy éjjelen át emésztettük. Másnap a mintákhoz még 5-5µl Proteináz K-t adtunk és 3 órán át 56 oC-on tovább emésztettük, majd a DNSt standard fenol/kloroform módszerrel extraháltuk (lásd a függelékben). A kinyert DNS mennyiségét és minőségét 0.8 %-os ethidium bromidot tartalmazó agaróz gélben UV fénnyel kontrolláltuk és ismert mennyiségű DNS-t tartalmazó standardok mellett DNS koncentrációjukat szemikvantitatív úton meghatároztuk. Ezt követően egy AmpFLP (D1S80 - Perkin Elmer, USA), 4 STR (CD4, TH01, VWA, F13B - SERAC, Németország ) és egy szekvencia polimorf rendszerben (HLA DQA1 - Perkin Elmer) vizsgáltuk polimeráz láncreakció (PCR) segítségével, PTC 200 (U.S.A.) DNS sokszorozóval. Az alkalmazott rendszerek amplifikációs paramétereit a 4. sz

36

táblázatban foglaltuk össze. Az amplifikációhoz szükséges összetevők és azok mennyisége az alábbiak voltak: - PCR végtérfogat:

25 µl

- Genomi DNS:

1-5 ng

- PCR puffer:

Perkin Elmer - 10x PCR Puffer II (MgCl2 nélkül) (100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl)

- Nukleotidok:

2 µl (SERAC)

- MgCl2:

1,5 µl 25mM (Perkin Elmer)

- Primer mix :

0,5 µl (SERAC)

- Taq-polymeráz:

1 U (Perkin Elmer 5 U/µl)

- UP H2O:

ad 25 µl

D1S80 és a HLA DQA1 rendszereknél a Perkin Elmer gyártó cég utasításai szerint játunk el.

PCR rendszerek CD4

F13B

TH01

VWA

D1S80

HLADQA1

Denaturáció 94oC 60 s 96oC

30 s 90oC

30 s 94oC

60 s 95oC

60 s 94 oC 60 s

Annealing

63oC 60 s 59oC

30 s 64oC

30 s 50oC

30 s 66oC

60 s 60oC

60 s

Extension

72oC 90 s 72oC

60 s 72oC

60 s 72oC

30 s 72oC

90 s 72oC

90 s

Végtérfogat

25µl

25µl

25µl

25µl

50 µl

50µl

Ciklusszám

30

30

30

30

30

32

Hot start

+

+

+

+

-

-

4. táblázat. A vizsgált lokuszok amplifikációs paraméterei.

37

Az amplifikációkat követően a DNS hozamokat 2 %-os agarózgélben ellenőriztük és azok mennyiségét szemikvantitatív úton megállapítottuk és lefényképeztük . A különböző nagyságú PCR termékek méret szerinti elválasztására poliakrilamid gélelektroforézist (hd-PAGE), majd a fragmentumok ezt követő detektálására ezüstfestést

alkalmaztunk.

A

kérdéses

fragmentumok

nemzetközileg

egységesített

nevezéktan szerinti tipizálása minden egyes rendszer esetében hitelesített allél-koktél egyidejű alkalmazásával történt. A HLADQA1 szekvencia polimorf rendszer detektálása enzimatikus úton történt a Perkin Elmer gyártó cég utasításának megfelelően. Horizontális natív discontinous elektroforézis Pharmacia Multiphor rendszerrel: A minták GEL-FIX (Serva) fóliára öntött natív, PAA/ PDA gélen kerültek futtatásra 1000 V, 40 mA, 10 W-on. A gélt hűtő termosztátot 15 oC-ra állítottuk be. Az egyes rendszerek esetében alkalmazott natív gélek összetételét az 5. táblázatban foglaltuk össze.

PCR lokusz CD4

UP H2O 13.5 ml

Trishangyasav Puffer 5 ml

F13B

13.0 ml

4 ml

vWA

12.2 ml

TH01 D1S80

CHES

AA/PDA (29.1: 0.9) 8.5 ml

APS (10%) 300µl

TEMED

2.5 ml

5.5 ml

300µl

10µl

4 ml

2.5 ml

6.3 ml

300µl

10µl

12.7 ml

4 ml

2.5 ml

5.8 ml

300µl

10µl

15.0 ml

3 ml

-

7.0 ml∗

300µl

10µl

3 ml

15µl

5. táblázat. A CD4, F13B, vVA, TH01 és a D1S80 lokuszok vizsgálatához szükséges natív gélek összetételének adatai ( ∗ AA/BIS (29.1: 0.9)).

38

PAA gélek ezüstfestése: - Fixálás 1 %-os salétromsavval

5 perc

- Mosás UP H2O-el

1 perc

- Festés 0.2 %-os ezüst nitrát oldattal

10 perc

- Mosás 2x UP H2O -val a fólia alatt is - Elõhívás 0.28M nátriumkarbonát / 0,037 %-os formaldehid oldattal. - Leállítás 10 %-os ecetsavval

3 perc

- Mosás UP H2O-el

2 perc

- Impregnálás 7 %-os glicerin oldatban

5 perc

- A géleket száradás után jelöljük (dátum és rendszer), nylon fóliába csomagoljuk és archiváljuk.

4.2. Az D17S5 (YNZ22) ÉS AZ ACTBP2 LOKUSZOK POPULÁCIÓGENETIKAI VIZSGÁLATA 4.2.1. A D17S5 ( YNZ22 ) lokusz populációgenetikai vizsgálata 209 nem rokon magyar nemzetiségű személy lenvásznon beszárított vérmintájából 5x5 mm nagyságú darabokat külön-külön Eppendorf csövekbe helyeztünk és 500µl extrakciós pufferben (0.01M Tris-HCl, 0.01M EDTA, 0.1 M NaCl, 2% SDS pH 8.0) 12 µl (20mg/ml) Proteináz K-val 56 oC-on egy éjjelen át emésztettünk. Másnap a mintákhoz még 5-5µl Proteináz K-t adtunk és 3 órán át 56 oC-on tovább emésztettük, majd a DNS-t standard fenol/kloroform módszerrel extraháltuk (lásd a függelékben). A kinyert DNS mennyiségét és minőségét 0.8 %-os ethidium bromidot tartalmazó agaróz

39

gélben UV fény alatt kontrolláltuk és ismert mennyiségű DNS-t tartalmazó standardok mellett DNS koncentrációjukat szemikvantitatív úton meghatároztuk, majd vizsgáltuk polimeráz láncreakció (PCR) segítségével, PTC 200 (U.S.A.) DNS sokszorozóval. Az alkalmazott amplifikációs paramétereket a 6. számú táblázat tartalmazza. Az amplifikációhoz szükséges komponensek és azok mennyiségei az alábbiak voltak: - PCR végtérfogat:

50 µl

- Genomi DNS:

10-50 ng !

- PCR puffer:

10 µl 5xPCR Puffer (SERAC)

- Nukleotidok:

2 µl (SERAC)

- DMSO (100%)

2.5 µl ( Merck )

- Primer mix :

0,5 µl (SERAC)

- Taq-polymeráz:

2 U (SERAC 5 U/µl)

- UP H2O:

ad 50 µl

Denaturáció 94 Co

5 min

Denaturáció 94Co 60 s

YNZ22 (D17S30) Annealing Extension 63Co 30 s 30 ciklus

72Co 60s

Final extension 72Co

600s

6. táblázat. Az YNZ22 rendszer amplifikációs paraméterei. Az amplifikációkat követően a DNS hozamokat 2 %-os agarózgélben ellenőriztük, azok mennyiségét megbecsültük és lefényképeztük. A PCR termékek méret szerinti elválasztására horizontális natív poliakrilamid gélelektroforézist (hd-PAGE), majd a fragmentumok ezt követő detektálására ezüstfestést alkalmaztunk (lásd fent). A kérdéses fragmentumok nemzetközileg egységesített nevezéktan szerinti tipizálása minden egyes rendszer esetében hitelesített allél-koktél egyidejű alkalmazásával történt. A minták GEL-FIX (Serva) fóliára öntött natív, 10 %os PAA/ PDA gélen kerültek futtatásra 1000 V, 40 mA, 10 W-on Pharmacia Multiphor

40

II elektroforézis rendszerrel. A gélhűtő termosztátot 15

o

C-ra állítottuk be. Az

alkalmazott gél összetételt a 7. táblázatban foglaltuk össze. A biostatisztikai számításokat számítógéppel - e célra írt DNA-view biostatisztikai elemzõ programmal (Charles Brenner, USA) - végeztük Buscemi, Fisher, Guo és Thompson valamint Nei ajánlásának megfelelően (7, 20, 44).

UP H2O

Tris-hangyasav Puffer

AA / PDA (29.1: 0.9)

APS (10%)

TEMED

15 ml

5 ml

10 ml

300µl

15µl

7. táblázat. Az YNZ22 lokusz vizsgálatához használt gél összetétele.

4.2.2. Az ACTBP2 (SE33) lokusz populációgenetikai vizsgálata nyolc népességben 1183 nem rokon személy véréből Chelex módszerrel DNS-t izoláltunk Walsh és munkatársai által kifejlesztett módszer segítségével (61). A vizsgált személyek között 240 magyar, 141 Brüsszelben élő marokkói, 198 Adona régióból származó török, 136 Shiga régióból származó japán, 95 Shen Yang tartományból származó kínai, 187 délnyugat bantu csoportból származó ovambó néger volt. Az új guineai és ausztál népességet 107 pápua és 79 aborigin személy képviselte. Az így nyert mintákat polimeráz láncreakció (PCR) segítségével vizsgáltuk, Cy5 fluorescens festékkel jelölt reverz primerrel, Biometra-trioblock (Németország) DNS sokszorozóval. Az alkalmazott amplifikációs paramétereket a 8. számú táblázat tartalmazza. Az amplifikációhoz szükséges komponensek és azok mennyisége az alábbiak voltak: - PCR végtérfogat:

25 µl

41

- Genomi DNS:

1-.5 ng

- PCR puffer:

Eurogentech - 10x PCR Puffer II ( MgCl2 nélkü l ) ( 100mM Tris-HCl pH 8,3, 500mM KCl )

- Nukleotidok:

2 µl (Pharmacia)

- MgCl2:

1,5 µl 25mM ( Eurogentech )

- Primer 1 :

0,3 µM ( Gibco )

- Primer 2 :

0,3 µM ( Gibco ) – 5’- Cy5 jelölt

- BSA(10 mg/ml)

2 µl ( Sigma )

- Taq-polymeráz:

1 U ( Eurogentech 5 U/µl )

- UP H2O:

ad 25 µl

Denaturáció 94 Co

10 min

ACTBP2 (SE33) 30 ciklus Denaturáció Annealing Extension 93Co 30 s

61Co 30 s 30 ciklus

72Co 30s

Final extension 72Co

30min

8. táblázat. Az ACTBP2 (SE33) lokusz amplifikációs paramétei. Az amplifikációt követően a DNS hozamot 8 %-os akrilamid gélben ellenőriztük, azok mennyiségét megbecsültük, a géleket archiváltuk. A tipizáláshoz 0.5-3 µl amplifikátumot, 10-10 fmol 114 bp és 402 pb hosszú Cy5-el jelölt belső standardot és 3 µl loading puffert használtunk. A mintákat 3 percig 93 Co-on denaturáltuk, majd 0.5 mm vastag 0.6 x TBE-t és 7 M ureát tartalmazó 6 %-os akrilamid gélben ALFexpress DNA szekvenátorral ( Amersham Pharmacia Biotech ) vizsgáltuk az alábbi paraméterekkel: 700 V, 20 W, 38 mA, 50Co, 500 perc. Külső standardként 26 szekvenált allélt tartalmazó alléllétrát használtunk (40). A talált fragmensek azonosítása Allele Links 1.0 (Amersham, Pharmacia Biotech) program

42

segítségével történt a szekvenált allélokat tartalmazó alléllétrával történt összehasonlítás útján. Az eredmények statisztikai kiértékelését, így a populációk közötti összehasonlító tesztet a RxC (M. Miller ) és HWE ( C. Puers ) programokkal végeztük. Az allélok elnevezése a GEDNAP ajánlásainak megfelelően történt (52). Eredményeinket a korábban publikált adatokkal is összevetettük (39).

43

4.4. A DYS 19, DYS 390 és a DYS 389 LOKUSZOK MUTÁCIÓ ANALÍZISE

457 - korábban szerológiai ill. DNS vizsgálattal igazolt - származás-megállapítási ügy fiúgyermek-apa páros Y kromoszómán elhelyezkedő három polimorf lokuszát vizsgáltuk. A beszárított vérmintákból Chelex módszerrel DNS-t izoláltunk ( lásd fent ). Az így nyert mintákat polimeráz láncreakció (PCR) segítségével vizsgáltuk, FAM és JOE fluorescens festékkel jelölt reverz primerekkel, Biometra-trioblock (Németország) DNS sokszorozó segítségével. Az alkalmazott amplifikációs paramétereket a 9. számú táblázat tartalmazza.

Y kromoszómális rendszerek DYS 19

DYS 390

Denaturáció

94oC

90 s

Annealing

55oC

30 s

Extension

72oC

60 s

Végtérfogat

25µl

Ciklusszám

30

DYS389 I.+II.

9. táblázat. A DYS 19, DYS 390 és a DYS 389 lokuszok amplifikációs paraméterei. Az amplifikációkat követően a DNS hozamokat 8 %-os akrilamid gélben ellenőriztük, azok mennyiségét megbecsültük, a géleket archiváltuk. Az amplifikációhoz szükséges komponensek és azok mennyisége az alábbiak voltak:

44

DYS 19: - PCR végtérfogat: 25 µl - Genomi DNS:

1-.5 ng

- PCR puffer:

2 µ Eurogentech - 10x PCR Puffer II ( MgCl2 nélkül ) ( 100mM Tris-HCl pH 8,3, 500mM KCl )

- Nukleotidok:

2 µl (Pharmacia)

- MgCl2:

1,5 µl 25mM ( Eurogentech )

- Primer 1 :

0,2 µM ( Gibco )

- Primer 2 :

0,2 µM ( Gibco ) – FAM jelölt

- BSA(10 mg/ml)

0,5 µl ( Sigma )

- Taq-polymeráz:

1 U ( Eurogentech 5 U/µl )

- UP H2O:

ad 25 µl

DYS 390: - PCR végtérfogat: 25 µl - Genomi DNS:

1-.5 ng

- PCR puffer:

2 µ Eurogentech - 10x PCR Puffer II ( MgCl2 nélkül ) ( 100mM Tris-HCl pH 8,3, 500mM KCl )

- Nukleotidok:

2 µl (Pharmacia)

- MgCl2:

1,5 µl 25mM ( Eurogentech )

- Primer 1 :

0,3 µM ( Gibco )

- Primer 2 :

0,3 µM ( Gibco ) – HEX 5’-jelölt

- BSA(10 mg/ml)

0,5 µl ( Sigma )

- Taq-polymeráz:

1 U ( Eurogentech 5 U/µl )

- UP H2O:

ad 25 µl

DYS389 (nested PCR):

45

- PCR végtérfogat: 25 µl - Genomi DNS:

1-.5 ng

- PCR puffer:

2 µ Eurogentech - 10x PCR Puffer II ( MgCl2 nélkü l ) ( 100mM Tris-HCl pH 8,3, 500mM KCl )

- Nukleotidok:

2 µl (Pharmacia)

- MgCl2:

1,5 µl 25mM ( Eurogentech )

- Primer 1 :

0,3 µM ( Gibco )

- Primer 2 :

0,3 µM ( Gibco ) – JOE 5’ - jelölt

- Primer 3 :

0,2 µM ( Gibco ) - FAM 5’- jelölt

- BSA(10 mg/ml)

0,5 µl ( Sigma )

- Taq-polymeráz:

1 U ( Eurogentech 5 U/µl )

- UP H2O:

ad 25 µl

A tipizáláshoz 0.5-3 µl amplifikátumot ill. 1 µl hitelesített allélétrát, 0.5 µl GeneScan 500 (ROX) belső standardot valamint 12 µl ionmentes formamidot (Sigma) mértünk össze. A mintákat 94 oC denaturáltuk 3 percig, majd ABI PRISM 310 (Applied Biosistems - Perkin Elmer) lézer fluorescens elven működő automata analizátorral vizsgáltuk az alábbi paraméterekkel: 47cm / 50µm kapilláris, POP4 polimer oldat, futási idő 24 perc, 60oC, az injektálás ideje 5 másodperc, a feszültség 15 kV, a lézer sugár teljesítménye 9.9 mW volt. A kiértékelést GeneScan 2.1 szoftverrel végeztük. A I. és II. allélokat un. nested PCR segítségével határoztuk meg, így elkerülhető volt a jóval fáradságosabb szekvenálás elvégzése.

A DYS 389 lokusz I. és II. alléljainak vizsgálata un. nested PCR technikával:

46

1. PCR reakció ( „zöld színű” fragmensek ):

(CTGT)n

(CTAT)m

48 bp

(CTGT) 3

(CTAT) q

(CTGT) n

(CTAT) m

48 bp

(CTGT) 3

(CTAT) q ⇐ P2∗

P1⇒

(CTGT) 3

(CTAT) q

P1 ⇒

⇐ P2∗

A nyert „ zöld színű „ fragmesnek információtartalma: 1.

n+m+3+q

2.

3+q

2. PCR reakció ( un. nested PCR – „ kék színű fragmensek „) :

(CTGT) n

(CTAT) m

(CTGT) 3 ⇐ P3∗

P1⇒

(CTGT) n P1⇒

48 bp

⇐ P3∗

47

A nyert „kék színű „ fragmesnek információtartalma:

I.

allél : 3 + q

II.

allél : n +m +3 +q

3.

n+m+3

4.

n

Az egyes fragmesnsek hossztartományai: Hosszú zöld fragmens ( n+m+3+q ):

361 - 381 bp.

Rövid zöld fragmens ( 3+q ):

243 - 259 bp.

Hosszú kék fragmens ( n+m+3 ):

176 - 208 bp.

Rövid kék fragmens

( n ):

60 - 92 bp.

Például: Rövid kék fragmens (n):

76 bp = 5 repeat

Hosszú kék fragmens (n+m+3):

184 bp = 19 repeat

Rövid zöld fragmens ( 3+q ):

252 bp = 13 repeat

Hosszú zöld fragmens( n+m+3+q ):

370 bp = 29 repeat

n

m

3

q

5

19 – (5+3) = 11

konstans

13 - 3 = 10

I. allél : 3 + q = 3 + 10 = 13 5. EREDMÉNYEK

II. allél: n+m+q +3 = 5+ 11 + 10+ 3 = 29

48

5.1. A DNS molekulák stabilitásának vizsgálata A különböző időtartamú elektronsugárrral besugárzott DNS molekulák agaróz gélben történt quantitatív és qualitatív vizsgálatakor jól látható volt a bekövetkezett degradáció, mely a 15, 20 és 25 percig kezelt minták esetében különösen szembetűnő volt ( 5. ábra).

5. ábra. Két személy etidium bromiddal festett sperma DNS mintáinak mennyiségi és minőségi vizsgálata 0.8 %-os agaróz tesztgélben UV fény alatt, egy ( 8 és 15 ), öt ( 9 és 16), tíz (10 és 17 ), tizenöt ( 11 és 18), húsz ( 12 és 19 ) valamint huszonöt perces ( 13 és 20 ) elektronbesugárzást követően, besugárzásnak ki nem tett kontroll mintákkal ( 7 és 14). 1-5: nagy molekulasúlyú bovin DNS marker ( 200, 100, 50, 25, 12.5 ng). A hatos mező üres. A jelentős fokú károsodások ellenére minden minta eredményesen amplifikálható és tipizálható maradt, ill. nem következett be téves tipizálás a napjainkban használt különböző - AmpFLP, STR és szekvencia-polimorf – rendszerekben (6., 7., 8. ábrák ). A vizsgált személyek és a belső labor kontroll genotípusai a 9. táblátatban kerültek összefoglalásra

49

6. ábra. Két személy sperma mintájának tipizálása az MCT118 ( D1S80) amlifikálható hossz polimorf lokusznak megfelelően. Egy ( 1 és 8 ), öt ( 2 és 9), tíz ( 3 és 10 ), tizenöt ( 4 és 11), húsz ( 5 és 12 ) valamint huszonöt perces ( 6 és 13 ) elektronbesugárzást követően. Az 7 és 14 szám alatti minták a sugárral nem kezelt kontrollok. C: A belső laborkontroll, A: allélkoktél. Az első személy genotípusa: 24/31, a másodiké: 23m/24, a kontrollé: 22/24.

7. ábra. Két személy sperma mintájának tipizálása a HLADQA szekvencia-polimorf lokusznak megfelelően. Az 1. és 3. minta 25-25 perces elektron besugárzást követően. A 2. és 4. minták a besugárzás nélküli kontrollok. Az első személy genotípusa: 1/4, a másodiké 1.1/1.1.

50

8. ábra. Két személy sperma mintájának tipizálása az F13B mikroszatellita STR lokusznak egfelelően. Egy ( 1 és 8 ), öt ( 2 és 9), tíz ( 3 és 10 ), tizenöt ( 4 és 11), húsz ( 5 és 12 ) valamint huszonöt perces ( 6 és 13 ) elektronbesugárzást követően. Az 7 és 14 szám alatti minták a sugárral nem kezelt kontrollok. C: A belső laborkontroll, A: allélkoktél. Mindkét személy genotípusa: 9/10, a kontrollé: 8/10.

CD4

F13B

TH01

VWA

D1S80

HLADQA1

1. személy

5/6

9 / 10

6 / 9.3

15 / 16

24 / 31

1/4

2. személy

5/6

9 / 10

6 / 9.3

16 / 17

23m / 24

1.1 / 1.1

10 / 12

8 / 10

9 / 9.3

14 / 17

22 / 24

1.1 / 3

Kontroll

9. táblázat. A vizsgált személyek és a belső laborkontroll genotípusai a vizsgált lokuszoknak megfelelően.

5. 2. Az YNZ22 ( D17S5) és az ACTBP2 lokuszok populációgenetikai vizsálata Az YNZ22 (D17S5) lokuszon 13 különböző allélt és 51 genotípust találtunk a 209 vizsgált személynél. A leggyakoribb allél a 4-es ( f = 0.251 ), a 2-es ( f = 0.227 ) és a 3-as ( f = 0.129 ) volt ( 10. és 11. táblázat).

51

allél 1 2 3 4 5 6 7

frekvencia

allél

0,093 0,227 0,129 0,251 0,053 0,029 0,017

frekvencia

8 9 10 11 12 13

0,043 0,050 0,079 0,014 0,007 0,007

10. táblázat. A 209 nem rokon magyar kaukázusi személy D17S5(YNZ22) lokuszon talált alléljai és azok frekvenciája.

genotípus

szám ( db )

1 -1 2 -1 2 -2 3 -1 3 -2 3 -3 4 -1 4 -2 4 -3 4 -4 5 -1 5 -2 5 -3 5 -4 5 -5 6 -2 6 -4 6 -5 7 -2 7 -4 7 -7 8 -1 8 -2 8 -3 8 -4

4 8 15 8 12 4 6 20 17 13 2 5 3 8 1 4 3 1 2 2 1 1 4 1 3

Homozygosity obs.( n = 41) Homozygosity exp. Heterozygosity obs. (n = 168 )

genotípus 8- 6 8- 8 9- 1 9- 2 9- 3 9- 4 9- 5 9- 8 9- 9 10 - 1 10 - 2 10 - 3 10 - 4 10 - 6 10 - 7 10 - 8 10 - 9 10 -10 11 - 2 11 - 4 11 -10 12 - 2 12 - 4 13 - 2 13 -10 13 -11 = 0.196 = 0.154 = 0.803

szám ( db ) 3 1 3 2 2 6 1 1 1 3 3 3 11 1 1 3 4 1 3 1 1 1 2 1 1 1

52

Heterosygosity exp. Power of discrimination Power of exclusion obs. Power of exclusion exp. Exact test, P-value

= = = = =

0.845 0.958 0.606 0.685 0.294

11. tablázat. A 209 nem rokon magyar kaukázusi személy YNZ22 (D17S5) lokuszon talált genotípusainak megoszlása és a számított statisztikai paraméterek.

Az ACTBP2 lokuszon négy kontinens nyolc populációjában 58 különböző allélt találtunk az 1183 vizsgált nem rokon személynél. Ezek közül egyik sem volt 18 %-nál gyakoribb. A leggyakoribb két allél volt, a 18-as és a 27.2 -es a pápuák kivételével minden populációban. Ez utóbbi népességben a 26.2 és a 28.2 allélok fordultak elő a leggyakrabban (12. táblázat ).

Allel

magyarok n = 240

marokkóiak n = 141

törökök n = 198

7

0.0025

8.1

0.0051

japánok n = 136

han ovambók aboriginok kínaiak n = 187 n = 79 n = 95

0.0071

10 11

0.0021

11.2

0.0021

12

0.0021

0.0035

0.0025

0.0063 0.0053

0.0025

0.0027 0.0063

0.0319

0.0152 0.0080

13.2

14.2

0.0253

0.0027

12.2

14

n = 107

0.0047

9.2

13

pápuák

0.0250

0.0390

0.0278

0.0035

0.0025

0.0053

0.0127

0.0214 0.0134

0.0443

0.0093

53

15

0.0208

15.2

0.0042

16

0.0438

16.2

0.0021

17

0.0604

17.2

0.0021

0.0780

0.0253

0.0147

0.0158

0.0107 0.0027

0.0603

0.0328

0.0294

0.0211

0.0603

0.0808

0.1016

0.0404

0.0421

0.0829

0.0047

0.0127

0.0047

0.0025 0.0667

18.2

0.0021

19

0.0771

0.0887

0.1206

0.096

0.0846

0.0076

0.0074

0.0833

0.0809

19.2

0.0146

0.0035

20

0.0667

0.0390

0.0657

20.2

0.0042

0.0035

21

0.0188

0.0426

21.2

0.0526

0.0963 0.0080

0.0632

0.1096

0.0053

0.0027

0.0515

0.0842

0.1257

0.0051

0.0074

0.0053

0.0303

0.0588

0.0474

0.0561

0.0167

0.0076

0.0110

0.0158

0.0027

22

0.0063

0.0126

0.0184

0.0105

0.0187

22.2

0.0250

0.0126

0.0257

0.0263

0.0027

23

0.0021

0.0076

0.0110

0.0053

0.0080

23.2

0.0500

0.0390

0.0328

0.0441

0.0526

24

0.0021

24.2

0.0354

0.0709

0.0379

0.0441

0.0632

25

0.0021

25.2

0.0438

26

0.0021

26.2

0.0313

0.0355

0.0248

0.0253

0.0551

0.1158

0.0037 0.0390

0.0213

0.0063

0.0063

0.0234

0.0053

0.0570

0.0327

0.0134

0.0443

0.0280

0.0401

0.0696

0.1495

0.0379

0.0919

0.0421

0.0696

0.1729

0.0505

0.1066

0.0615 0.0080

0.1211

0.1123

0.0025

28 0.0646

0.0063

0.0027

0.0037 0.1000

0.0127

0.0053

27

29

0.0316

0.0053

18

28.2

0.0047

0.0127

17.3

27.2

0.0063

0.0496

0.0808

0.0047 0.1013

0.1028

0.0063 0.0809

0.0421

0.0374

0.1772

0.1402 0.0047

54

29.2

0.0563

0.053 0.0461

29.3 30

0.0021

30.2

0.0500

31

0.0021

31.2

0.0375

32

0.0021

32.2

0.0188

33

0.0063

33.2

0.0167

0.0248

0.0579

0.0134

0.0823

0.0027

0.0127

0.0107

0.1013

0.0248

0.1308

0.0037

0.0657

0.0294

0.0632

0.0025 0.0354

0.1121

0.0063 0.0037

0.0211

0.0147

0.0053

0.0380

0.0421

0.0105

0.0253

0.0280

0.0053

0.0063

0.0025 0.0142

0.0202

0.0142 0.0051

34 34.2

0.0735

0.0063

0.0035

0.0051

35

0.0126

36

0.0025

0.0063

0.0127

36.2 0.0037

39.2 H

0.9458

0.8652

0.8535

0.9265

0.9263

0.9198

0.8608

0.8785

D

0.9876

0.9851

0.9773

0.9867

0.9822

0.9830

0.9771

0.9659

MEC

0.8892

0.8832

0.7991

0.8708

0.8667

0.8409

0.8395

0.7633

Pvalue

0.0640

0.0520

0.058

0.129

0.737

0.517

0.119

0.175

12. táblázat. Négy kontinens nyolc populációjának ACTBP2 lokuszon talált alléljai, megoszlásuk és statisztikai paramétereik. H = megfigyelt heterozigótaság, D = diszkiminációs valószínűség, MEC = általános apasági kizárási esély, P-value = HardyWeinberg-egzakt teszt valószínűségi érték.

5.3. A DYS19, DYS 390 ÉS A DYS 389 LOKUSZOK MUTÁCIÓ ANALÍZISE A részletes vizsgálati adatokat a 13. számú táblázat tartalmazza, mely a függelékben található.

55

A DYS 19 lokuszon 438 meiózist vizsgáltunk meg. Két mutációt találtunk, mely µ = 0,00456-es mutációs rátát jelent. Egy ismétlődő egységgel hosszabb és eggyel rövidebb új allélt figyeltünk meg az utódban ( 15 → 16 ill. 18→ 17). A DYS 390 lokuszon 435 meiózist vizsgáltunk meg, melynek során mindössze egy mutációt találtunk, ez 0,00229-es mutációs rátának felel meg. Egy ismétlődő egységgel hosszabb új allélt figyeltünk meg az utódban ( 24 → 25 ). DYS 389 lokusz I. és II. részén 343 meiózist vizsgáltunk meg, mindkét részben mindössze egy-egy mutációt találtunk, ez µ = 0,00291 mutációs rátának felel meg. Mindkét mutációnál egy-egy tetranukleotid egységgel hosszabb allél fordult elő ( I: 13 → 14 ill. II.: 29→30). Kayser és munkatársai az elmúlt évben publikált multicentrikus vizsgálatban 4999 meiózist vizsgáltak 15 különböző Y kromoszómális mikroszatellita lokuszon és összesen 14 mutációt észleltek. Az átlagos mutációs ráta ennek megfelelően 0,0028 volt. Tíz esetben az allélok hosszának növekedését, négy esetben azok csökkenését észlelték (30). Tizenhárom esetben egy, egy esetben pedig két ismétlődő egységnyi változást figyeltek meg. Az általunk talált öt mutációnál kizárólag egy ismétlődő egységnyi változást találtunk. A talált mutációkat direkt szekvenálással bizonyítottuk.

6. MEGBESZÉLÉS A mindennapi gyakorlatban használt un. előpróbák lehetővé teszik a vizsgálni kívánt biológiai nyomok azonosítását és ezáltal nagymértekben hozzájárulnak az eredményes DNS analízis elvégzéséhez. Számos kémiai anyag azonban csökkentheti a biológiai nyomokból kinyerhető DNS mennyiségét, sőt akár lehetetlenné is teheti annak analízisét. Elemanalizátorral felszerelt scanning elektron mikroszkóppal előzetes kémiai

56

anyagokkal történt kezelés nélkül nyílik lehetőség különböző biológiai minta, így a spermanyomok azonosítására is, azok morfológiája és magas cink koncentrációjának meghatározása útján (4. ábra). A nagyfeszültséggel gyorsított elektronok vizsgálati mintába való becsapódásakor a felszabaduló hőenergia útján a DNS molekula denaturációja mellett annak egy vagy mindkét szálán töréseket (un. single and doublestrand breaks), a bázisok és a cukormolekulák sérülését, thymidin-thymidin, ill. cytosincytosin dimerek kialakulását képesek előidézni és ezáltal annak tipizálását lehetetlenné tehetik (16, 23). Jeffreys megállapítása szerint az igazságügyi orvostanban használt repetitív DNS szekvenciákban nagyon könnyen lép fel mutáció ionizáló sugárzás hatására is (27). Ezt támasztja alá Fuciarelli elektron migrációs elmélete is (17). Az elvégzett vizsgálataink szerint az elektronsugár a spermiumok speciális fehérje burokba zárt DNS molekuláit a behatási idővel arányosan károsította, azonban azok molekuláris biológiai módszerekkel, a mindennapi haemogenetikában használt különböző lokuszokon eredményesen amplifikálhatók és tipizálhatók maradtak, ill. nem vezettek téves tipizáláshoz. Az elvégzett vizsgálatok alapján megállapítható, hogy a scanning elektronmikroszkóppal vizsgált, ill. elemanalizáláson átesett spermiumminták további DNS vizsgálatra is alkalmasak. Az igazságügyi hemogenetikai gyakorlatba bevezetendő PCR alapú DNS rendszernek számos feltételnek kell megfelelnie. Egyrészt a molekuláris genetikai vizsgálatoknak (szekvenciaanalízis, mutációsvizsgálatok, populációgenetikai vizsgálatok), a technikai validálásnak (primer tervezés, PCR-optimalizálás, multiplex analízis) valamint a standardizált alkalmazásnak (allél nomenklatúra, alléllétra). A D17S5 (YNZ22) és az ACTBP2 (SE33) lokuszok populációgenetikai vizsgálata során, főként az ACTBP2 (SE33) pszeudogén esetében a miniszatellita rendszerekre jellemző extrém fokú polimorfizmust észleltünk a vizsgált populációk esetében, így a magyar népességben is. M. Miller RxC népességek között végezhető Fischer egzakt tesztjén alapuló összehasonlító-elemző programjával az ACTBP2 rendszert illetően a kínai és japán népesség között szoros rokonság volt megfigyelhető (p = 0.2). A többi populációnál azonban

lényegesen

egyértelműen

mutatja

távolabbi az

rokonság

ACTBP2

mutatkozott

adatbázisok

(p<0.05),

populációk

mely

ezáltal

szerint

történő

létrehozásának szükségességét. Eredményeinket a korábban publikált adatokkal is

57

összevetettük (39). A japán ill. a kínai populációkban nem találtunk szignifikáns eltérést az általunk megfigyelt eredményektől (p = 0.47 ill. p = 0.28). A statisztikai eredmények alapján megállapítható, hogy ezek a lokuszok magas polimorfizmusuk miatt kiválóan alkalmazhatók az igazságügyi hemogenetikai gyakorlatban, mind a származásmegállapítás, mind pedig a személyazonosítás területén is. Az Y kromoszómális DNS analízis igazságügyi orvostani jelentőségét az adja, hogy az erőszakos és szexuális bűncselekmények döntő többségét férfiak követik el és a vitás apasági esetek közel felében hímnemű utódról van szó. Emellett bizonyos esetek nem, vagy nem kellőképpen voltak tisztázhatók autoszómális DNS analízissel. Ezek a polimorfizmusok új, eddig ki nem használt lehetőségeket kínálnak, főként hímnemű utódok

származás megállapítási vizsgálatainál un. deficiens esetekben ill. olyan

kriminalisztikai esetekben ahol kevert nyomok vannak és azokban több férfi DNS tulajdonsága is fellelhető. Egy további előny az Y kromoszómális mikroszatellita lokuszoknál, hogy a DNS tulajdonságokat csak az apa, míg az autoszómális lokuszoknál mindkét szülő örökíti, mely alapján az apasági és kriminalisztikai esetek tisztázása könnyebb. Az apai ágú öröklődés hátránya mind az apasági vizsgálatoknál, mind pedig a kriminalisztikai esetekben, hogy a vizsgált személy minden hímnemű rokona ugyan azzal a Y kromoszómális DNS profillal (haplotípussal) rendelkezik. A gyakorlatban azonban csak azok a lokuszok használhatók, melyek kellően polimorfak és mutációs rátájuk alacsony. Az Y kromoszómán vizsgált három kapcsoltan öröklődő lokuszon talált alacsony mutációs gyakoriságok más szerzők időközben publikált eredményeivel jó korrelációt mutattak és nem találtunk eltérést azok jellegét illetően sem (21, 29, 30). A nyert adatok alapján megállapítható, hogy e lokuszok alacsony mutációs rátájuk miatt jól alkalmazhatók az igazságügyi hemogenetikai gyakorlatban, hímnemű utód(ok) származás-megállapításának céljából. A humán Y kromoszómális mikroszatelliták mutációs

rátája

és

a

mutációjuk

jellege

megegyezik

az

autoszómális

mikroszatellitáékkal, mely alapján megállapítható, hogy mutációs mechanizmusuk a rekombinációtól független.

58

7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Munkámat a Semmeleweis Egyetem, a Freiburgi Albert-Ludwig Egyetem, a Berlini Freie Egyetem valamint a Münsteri Egyetem Igazságügyi Orvostani Intézeteinek DNS laboratóriumaiban végezetem 1994 és 2000 között. Őszinte hálával és köszönettel tartozom tanítómestereimnek Dr. Falus András és Dr. Sótonyi Péter egyetemi tanároknak, akik program, ill. alprogram vezetőként lehetővé tették számomra tudományos kutatásaim elindítását és elvégzését, inspiráló szakmai tanácsaikkal és bátorításukkal hozzájárultak munkám sikeréhez.

59

Ezúton köszönöm Stefan Pollak, Volkmar Scheider, Hubert Pöche és Brinkmann professzor Urak támogatását, akik németországi tartózkodásom alatt támogattak tanácsaikkal tudományos munkám során. Köszönöm továbbá Hans Joachim Weisser, Sabine Lutz, Frank Heidorn, Steve Rand, Burkhardt Rolf, Carsten Hohoff, Peter Forster tudományos munkámhoz adott segítségét és hasznos tanácsait. Köszönet illeti Hannelore Seidelt, Manfred Thomast és Bognár Gyulát a fényképfelvételek elkészítéséért. Köszönöm

feleségem

megértő

türelmét

és

támogatását,

amellyel

mindig

kiegyensúlyozott, békés hátteret biztosított - nagyrészt külföldön végzett - kutatásaim elvégzéséhez. Végül, de nem utolsó sorban köszönöm az OTKA-nak, a Magyar Állami Eötvös Ösztöndíj Bizottságnak, a Freiburgi Egyetemnek és a Humboldt Alapítványnak, hogy ösztöndíjaik odaítélésével tudományos munkám elvégzését támogatták.

8. IRODALOMJEGYZÉK

1.

Allen RC, Graves G, Budowle B: Polymerase chain reaction amplification products separated on rehydrateble polyacrylamide gels and stained with silver. BioTechniques 7: 736-744 (1989)

2.

Anderson S, Bankier AT, Barrell GB: Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature 290: 457- 465 (1981)

60

3.

Bär W: Past, Present and Future Trends in Forensic DNA Technologies in Europe. Acta Med Leg 20-25 (1994)

4.

Barruel JP: Mémoire sur l´existence d´un principe propre á caractériser le sang de l´omme et celui des diverses espéces d´animaux. Ann Hyg Publique Med Leg 1: 267-277 (1929)

5.

Bertrams J: Das HLA-System: Eine aktuelle Übersicht. DG Klinische Mitteilungen 22:107-115 (1991)

6.

Bodstein D, White RL, Skolnick M, Davis RW: Construction of a genetic linkage map in man usig restriction fragment length polymorphysms. Am I Hum Genet 32:182-190 (1980)

7.

Buscemi L, Cucurachi N, Mencarelli R, Sisti B, Tagliabracci A, Ferrara SD: PCR typing of the locus D17S30 (YNZ22 VNTR) in an Italian population sample. Int J Legal Med 106:200-204 (1994)

8.

Brinkmann B, Wiegand P: DNA-Technologie in der Medizinischen Kriminalistik. Schmidt-Römhild Verlag, Lübeck (1997)

9.

Brinkmann B, Klintschar M, Neuhuber F, Hühne J, Rolf B: Mutation rate in human microsatellites: influance of the structure and length of the tandem repeat. Am J Hum Genet 62:1408-1415 (1998)

10.

Csete K, Schürenkamp M, Varga T: The STR systems HumVWA and HumACTBP2 in a Hungarian population. Int J Leg Med 108(6): 316-317 (1996)

11.

Epplen JT: Darstellung der genetischen Individualität mittels OligonucleotidFingerprinting in DNA-Technologie in der Rechtsmedizin, (Hrg. V. Schneider und H.Pöche ) Vorträge anläßlich eines Kolloquiums am 17. November 1989.

61

12.

Edwards A, Civitello A, Hammond HA, Caskey CT: DNA typing and Genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats. Am J Hum Genet 49: 746756 (1991)

13.

Edwards A, Hammond HA, Lin J, Caskey C T, Chakraborty R: Genetic variation at five trimeric and tetrameric tandem repeat loci in four human population groups. Genomics 12: 241- 253 (1992)

14.

Erlich HA, Bugawan TL: HLA class II gene polymorphism: DNA typing, evolution relationship to disease susceptibility. In: Erlich HA (ed.): PCR Technology: principles and applications for DNA amplification. Stockton Press, New York p. 193-208 (1989)

15.

Fisher RA: Standard calculation for evaluating a blood group system. Heredity 5: 95-102 (1951)

16.

Fritz-Niggli H: Strahlengefährdung-Strahlenschutz, Hans Huber Verlag, Bern, Stuttgart, Toronto (1988)

17.

Fuciarelli AF, Sisk EC, Miller JH, Zimbrick JD: Radiation-induced electron migration in nucleic acids. Int J Radiat Biol 66 (5): 505-509 (1994)

18.

Füredi S, Woller J, Pádár Z, Angyal M: Y-STR haplotyping in two Hungarian populations. Int J Legal Med 113: 38-42 (1999)

19.

Gunn PR, Trueman K, Stapleton P, Klarkowski DB: DNA analysis in disputed parentage: the occurence of two apparently false exclusion of paternity, both at short tandem repear (STR) loci, in one child. Electrophoresis 18: 1650-1652

62

20.

Guo SW, Thompson EA: Performing the exact test of Hardy-Weinberg proportion for multiple alleles. Biometrics 48: 361-372 (1992)

21.

Heyer E, Puymirat J, Dieltjes P, Bakker E, de Knijff P: Estimating Y chromosome specific microsatellite mutation frequencies using deep rooting pedigres. Human Molecular Genetics 6:799-803 (1997)

22.

Higuchi R, von Beroldingen CH, Sensabaugh GF, Erlich HA: DNA-Typing from single hairs. Nature 332, p 543-546 (1988)

23.

Hüttermann J, Köhnlein W, Téoule R: Effects of Ionizing Radiation on DNA, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York (1978)

24.

Inman K, Rudin N: An Introduction to Forensic DNA Analysis, CRC Press Inc, Boca Raton, New York (1997)

25.

Jeffreys AJ, WilsonV, Thein SL: Hypervariable „minisatellite„ regions in human DNA. Nature 314, p 67-73 (1985)

26.

Jeffreys AJ: „Major minisatellitae loci” detectedby minisatellie clones 33.6 and 33.15 correspond to the cognate loci D1S111 and D7S437. Genomics 7 (3): 449452 (1990)

27.

Jeffreys AJ: Spontaneous and induced minisatellite instability in human genome. Clin Sci (Colch) 93 (5):383-90 ( 1997)

28.

Jones DA: Blood samples: Probability of discrimination. Forensic Sci Soc 12:355359 (1972)

29.

Kayser M, Cagliá A, Corach D, Fretwell N, Gehring C, Graziosi G, Heidorn F, Herrmann S, Herzog B, Hidding M, Honda K, Jobling M, Krawczak M, Leim K,

63

Meuser S, Meyer E, Oesterrich W, Pandya A, Parson W, Penacino G, Perez – Lezaun A, Piccinini A, Prinz M, Schmitt C, Schneider PM, Szibor R, TeifelGreding J, Weichold G, de Knijff P, Roewer L: Evaluation of Y-chromosomal STRs: a multicenter study. Int J Legal Med 110:125-133 (1997) 30.

Kayser M, Roewer L, Hedman M, Henke L, Henke J, Brauer S, Krüger C, Krawczak M, Nagy M, Dobosz T, Szibor R, de Knijff P, Stoneking M, Sajantila A: Characteristics and Frequency of germline mutations at microsatellite loci from the human Y chromosome, as revealed by direct observation in father/son pairs. Am J Hum Genet 66:000-000 (2000)

31.

Krüger J, Fuhrmann W, Lichte KH, Steffens C: Zur Vervendung des Polymorphismus der sauren Erythrocytenphosphatsae bei der Vaterschaftsbegutachtung. Dtsch Z Gerichtl Med 64:127-146 (1968)

32.

Lahiri K, Nurnberger JI: A rapid non-enzymatic method for the preparation of HMW DNA from blood for RFLP studies. Nucl. Acids Res 19, 5444.- 7 (1991)

33.

Landsteiner K: Über Agglutinationserscheinungen normalen menschlichen Blutes. Wiener Klin Wschr 14: 1132-1134 (1901)

34.

Lászik A, Pöche H, Mauer V, Schneider V: Apaság megállapítás a DNS technológia (RFLP) alkalmazásának segítségével. Orvosi Hetilap 136 (39) 21172119 (1995)

35.

Lászik A, Brinkmann B, Sótonyi P, Falus A: Automated fluorescent detection of a 10 loci multiplex for paternity testing. Acta Biol Hung 51 (1) 99-105 (2000)

36.

László A.: Mitokondriális betegségek. In: Kopper L, Marcsek Z, Kovalszky I: Molekuláris medicina. Medicina Könyvkiadó, Budapest, p. 248-253. (1997)

64

37.

Lee HC, Ladd C, Scherczinger AC, Bourke MT: Forensic application of DNA typing. Part 2: Collection and preservation of DNA evidence. Am Journal of Forensic Med and Pathology 19 (1): 10-18 (1998)

38.

Lee HC, Ladd C, Bourke MT, Pagliaro E: DNA Typing in Forensic Science. Am J of Forensic Med and Path 15 (4): 269-282 (1994)

39.

Liu C, Harashima N, Katsuyama Y, Ota M, Arakura A, Fukushima H: ACTBP2 gene frequency distribution and sequencing of the allelic ladder and variants in the Japanese and Chinese populations. Int J Legal Med 110:208-212 (1997)

40.

Morton NE: Parameters of the human genome. Proceedings of the National Academy of Scinece of the U.S.A. 88: 7474-7476 (1991)

41.

Möller A, Schürenkamp M, Brinkmann B: Evaluation of an ACTBP2 ladder composed of 26 sequenced alleles. Int J Legal Med 108:75-78 (1995)

42.

Mullis KB, Faloona F, Scharf S, Saiki RK, Horn GT, Erlich HA: Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 51, 263-273 (1986)

43.

Nakamura Y., Leppert M, O´Conell P: Variable number of tandem repeat (VNTR) Markers of human gene mapping. Science 235: 1616-1622 (1987)

44.

Nei M, Roychoudhury AK: Sampling variances on heterozygosity and genetic distance. Genetics 76: 379-390 (1974)

45.

Pääbo S, Higushi RG, Wilson AC: Ancient DNA and the polymerase chain reaction. J Biol Chem 264: 9709-9712 (1998)

65

46.

Polymeropoulos MH, Hiao H, Rath DS, Merril CR: Tetranucleotide repeat polymorphism at the human thyrosine hydrolase gene (TH). Nucleic Acids Res 19: 3753 (1991)

47.

Polymeropoulos MH, Rath DS, Xiao H, Merril CR: Tetranucleotid repeat polymorphism at the human beta-actin related pseudogene H-beta AC-psi-2 (ACTBP2). Nucleic Acids Res 20:1432 (1992)

48.

Roewer L, Arnemann J, Spurr NK, Grzeschik K-H, Epplen JT: Simple repeat sequences on the human Y chromosome are equally polymorphic as their autosomal counterparts. Hum Genetics 89:389-394 (1992)

49.

Roewer L, Kayser M, Dieltjes P, Nagy M, Bakker E, Krawczak M, de Knijff P: Analysis of molecular variance (AMOVA) of Y-chromosome specific microsatellites in two closely related human populations. Human molecular Genetics 5: 1029-1033 (1996)

50.

Robertson J, Ross AM, Burgoyne LA: DNA in forensic science: theorie, techniques and applications. Ellis Horwood Limited, England (1990).

51.

Scheithauer R, Luta C: Vergleichende Untersuchungen zur praktischen Anwendbarkeit verschiedener Spermavorproben. Arch Kriminol 181: 41-49 (1988)

52.

Schneider

HR,

Rand

S,

Schmitter,

Weichgold

ACTBP2-nomenclature

recommendation of GEDNAP Int J Legal Med 11: 97-100 (1998) 53.

Schneider PM: Zum Stellenwert des Genetischen Fingerprinting in der Vaterschaftsbegutachtung in DNA-Technologie in der Rechtsmedizin, ( Hrg. V. Schneider und H. Pöche ) Vorträge anläßlich eines Kolloquiums am 17. November 1989.

66

54.

Sensabaugh GF, Blake ET, and Northey DH: Genetic markers in semen III: alteration of phosphoglucomutase isoenzyme patterns in semen contaminated with saliva. J Forens Sci Soc 25: 470-478 (1980)

55.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)

56.

Saiki RK, Walsh PS, Levenson CH, Erlich HA: Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci USA, 86:6230-6234 (1989)

57.

Sótonyi P, Darok M: Die rasterelektronenmikroskoposche Elementanalyse in der Rechtsmedizin. Rechtsmedizin 5:37-44 (1995)

58.

Strachan T: Das menschliche Genom. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg Berlin Oxford (1994)

59.

Tautz D, Schlotterer C: Simple sequences. Curr Opin Genet Dev 4: 832-837 (1994)

60.

Venetianer P: A DNS szép új világa. Kulturtrade Kiadó, Budapest (1998)

61.

Walsh PS, Metzger DA, Higuchi R: Chelex 100 as a Medium for Simple Extraction of DNA for PCR-Based Typing from Forensic Material BioTechniques (10) 4: 506-513 (1991)

62.

Weber JL, May PE: Aboundant class of human DNA polymorphysms which can be typed using the polymerase chain reaction. Am J Hum Genet 44: 388-396 (1989)

63.

Woller J, Füredi S, Pádár Z: Polimeráz láncreakción alapuló DNS-vizsgálatok a magyar igazságügyi gyakorlatban. Orvosi Hetilap 138(51):3223-3228

67

64.

Wyman AR, White R: Highly polymorphic locus in human DNA. Proc Natl. Acad Sci U.S.A 83:5165-5169 (1980)

9. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁVAL KAPCSOLATOS SAJÁT KÖZLEMÉNYEK BIBLIOGRÁFIAI ADATAI I. Lászik A, Pöche H, Mauer V, Schneider V: Apaság megállapítás a DNS technológia (RFLP) alkalmazásának segítségével. Orvosi Hetilap, 13 (39) 2117-2119 (1995) II. Lászik A, Falus A, Keresztury L: DNA technology and its application in forensic medicine. Acta Biologica Hungarica 49 (1) 89-95 (1998) III. Keresztury L, Lászik A, Pénzes M, Hegyesi H, Falus A: Application of a chemiluminescent labelled single locus probe in the detection of repetitive nucleotide sequences on the 6-th chromosome. Med Sci Monit 4 (4) 583-586 (1998)

68

IV. Lászik A, Weisser H-J, Keresztury L, Pollak S: Allele frequencies for VNTR locus D17S5 (YNZ 22) in Hungary. International Journal of Legal Medicine 112 (5) 336 (1999) V. Lászik A, Weisser H-J, Keresztury L, Pollak S, Papp G, Pozsgai I: PCR typing of human semen stain after SEM-EDX examination. International Journal of Legal Medicine 112 (5) 376-379 (1999) VI. Lászik A, Brinkmann B, Sótonyi P, Falus A: Automated fluorescent detection of a 10 loci multiplex for paternity testing. Acta Biologica Hungarica 51 (1) 97-103 (2000) VII. Sótonyi P, Lászik A, Rand S, Hohoff C: Frequency data for the STR locus HumACTBP2 (SE33) in eight populations. International Journal of Legal Medicine in press Könyvrészlet VIII. Lászik A, Sótonyi P: DNS-vizsgálatok az igazságügyi orvostanban. in Molekuláris medicina Ed.: Kopper L., Marcsek Z., Kovalszky I, Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest, 1997. Előadások Lászik A: A DNS technika jelentősége az igazságügyi orvosszakértői gyakorlatban Fiatal Igazságügyi Orvosok III. Fóruma, Miskolc 1996. június 28-29. Lászik A, Weisser H-J, Keresztury L, Pollak S, Papp Gy: Stabilität der human Spermium DNA nach Elektronenstrahl-Bestrahlung Partnerschaftstreffen der Universitäten (Feiburg-Heidelberg-Budapest) V. Symposium Budapest, 1997. május 26-27.

69

Lászik A, Sótonyi P: Genetical approach in forensic medicine Semmelweis Symposium, Molecular genetics and gene diagnostics in medicine. Budapest, 1997. november 6-7. Lászik A: Apaság megállapítás több évvel a halál után „A DNS vizsgálatok jelentősége a kriminalisztikában témakörben” címmel megrendezésre került tudományos ülés. Budapest, 2000.június 6.

10. FÜGGELÉK DNS IZOLÁLÁS TELJES VÉRBŐL KISÓZÁSSAL (Lahir és Nurnberger szerint friss vérmintákból) •

Megszámozott 10 ml-es, zárható műanyag csövekbe 200µl 0,5 M Na4-EDTA-t mérünk, majd mindegyikbe 5-10 ml teljes vért engedünk.

•

Azonos mennyiségben 10 ml-es üvegpipettával (5ml) 1xSSC pH 7.0 Puffert és levágott végű pipettával kb. 125µl, mézszerű Nonidet P40-et adunk hozzá, mely a vvt-ket hemolizálja.

•

Azonnali vortexelés következik. Az oldatot - ha kell - 10 percre rázógépre helyezzük, majd centrifugáljuk 2800-as fordulaton, 10 percig, szobahőmérsékleten.

•

A felülúszót egy új 10 ml-es csőbe óvatosan átöntjük és a preparálás végéig megőrízzük.- a DNS a cső alján van! (A csöveket megjelölni!)

•

A 2.-5- fázist Nonindet nélkül ismételjük meg, amíg az üledék enyhén opálos nem lesz!

•

A felülúszót óvatosan leöntjük.

70

•

Az üledéket 800µl 1xSSC pufferben reszuszpendáljuk, majd 2 ml-es, előre megjelölt Eppendorf-csövekbe rakjuk át, melyeket celluxszal körberagasztottunk.

•

50- 50µl 10 %-os SDS-t adunk hozzájuk, mely a DNS-t tartalmazó fehérvérsejtek membránjait eltávolítja. Az elegyet vortexeljük, majd 20 percre 55Co fokos hőlégtermosztátba helyezzük.

•

300- 300µl, 6 Mólos telített NaCl-ot mérünk hozzájuk, majd vortexelünk (a látható részecskék fehérjék, a DNS molekulák láthatatlanul az oldatban vannak).

•

12000-es fordulaton 10 percig centrifugálunk szobahőmérsékleten, majd a DNS-t tartalmazó felülúszót lepipettázzuk, majd feliratozott 2 ml-es csövekben legalább azonos térfogatú, 100 %-os, szobahőmérsékletű isopropanolt adunk hozzájuk. A csövek óvatos döntögetésekor a DNS kicsapódik és általában látható lesz!

•

12000 fordulaton 10 percig centrifugálunk 4 Co-on, a felülúszót kidobjuk, majd 1 ml -20 fokos 70 %-os ethanolt mérünk hozzájuk a megmaradt só eltávolítása miatt, és vortexelünk.

•

Centrifugálás 12000-es fordulaton, 10 percig, 4 Co-on. A csövek helyzete fontos!

•

A csövek alján lévő DNS-ről az etanolt óvatosan eltávolítjuk. Az üledéket előmelegített exszikkátorban, nyitott fedél mellett (5-10 percig vagy egy éjjen át hőlégben 37Co-on kilyukasztott parafilmmel letakarva) szárítjuk (ha nagyon kiszárítjuk nehéz feloldani), majd a DNS mennyiségétől függően 50-100µl pH 8-as TE pufferben, 25 percig 65 Co-os hőlégben, vagy 37 Co-on - zárt csövekben - egy éjjen át reszuszpendáljuk.

EDTA-S TELJES VÉR PREPARÁLÁSA FENOL-KLOROFORM MÓDSZERREL (Freiburgi methodika) •

Kesztyűt veszünk fel. Maximum 5 napig 4 Co -on tartott EDTA-s vérből 500 µl-t mérünk ki 2,5 ml-es Eppendorf csőbe és 30 '-re -20 Co -ra helyezzük (hemolízis).

•

500 µl 1x SSC puffert mérünk be és vortexeljük, centrifugálás 8000/5' szobahőn.

•

A felülúszót öntsük le és ezt a lépést 3x ismételjük ( mosás ).

71

•

Leszívjuk az 1x SSC nagy részét, az így maradt üledékhez 700µl UP H2 0-t , 15 20µl Prot K-t (20 mg / ml), 50µ 10 %-os SDS-t, 50µl 3 M Na acetátot ( pH. 7.0 !) tartalmazó emésztő puffert adunk, vortexeljük és az oldatot rázás alatt egy éjjelre 56Co- os termosztátba helyezzük.

•

Másnap reggel, ha még emésztetlen üledéket látunk, további 10-20µl Prot. K enzimet adunk az oldatokhoz, és 1-2 órán át 56 Co -on tovább emésztünk.

•

A fenti oldathoz 500µl fenol-kloroform-izoamilalkohol 25: 24: 1 arányú elegyét mérjünk és az oldatot tejfehérre vortexeljük.

•

Az oldatot 15 ' ig szobahőn 10 000/ perc centrifugáljuk, majd a DNS -t tartalmazó felső fázist óvatosan lepipettázzuk. Ne érintsük a denaturálódott interfázist!

•

A 3. és 4. lépést 1 x megismételjük.

•

A felülúszót új 2,5 ml -es Eppendorf csőbe mérjük és 500µl 4 Co -os 24:l arányú kloroform-izoamil alkoholos oldatot mérünk hozzá, erősen vortexeljük! Ezután l0000 / 5'-ig szobahőn centrifugáljuk.

•

A DNS-t tartalmazó felülúszót új, feliratozott l,5 ml-es Eppendorf csőbe óvatosan lepipettázzuk úgy, hogy az intefázist illetve a kloroformos oldatot ne érintsük. Az oldathoz annyi etanolt adunk (l00%, 4 Co-os), hogy a cső tele legyen. Ezt követően az Eppendorf csövet többször óvatosan döntögetjük, hogy a DNS molekulák kicsapódjanak.

•

A kicsapódó DNS mennyiségét -20Co-ra helyezéssel akár egy éjjelen át is fokozhatjuk.

•

Centrifugálás teljes sebességen 30'-ig 4 Co -on. (A csövek állására figyelni!)

•

Az alkoholt leöntjük, majd l ml 80%-os szobahőmérsékletű etanolt mérünk és vortexeljük.

•

Centrifugáljuk l5 '-ig 4 Co-on teljes sebességgel.

•

Alkoholt óvatosan leszívjuk (a pelletre figyelve) és a csöveket nyitott fedéllel kb. l0 '-re exszikkátorba helyezzük. (Az exszikkátort lassan nyitjuk ki !)

•

A száraz DNS-t 200µl UP H2O -ban, vagy TE pufferben oldjuk 56Co-on egy éjjelen át, majd reggel vortexeljük. Az oldat kész 0,8 %-os agaróz gélben történő koncentráció meghatározásra.

72

DNS izolálás CHELEX módszerrel (Walsh és mts 1991) •

3µl teljes, előzőleg felkevert vért steril, lehetőleg csavaros tetejű Eppendorf csőbe helyezünk, 1ml steril UP bidest vizet hozzámérünk és vortexeljük.

•

15-30 percig - régi beszárított véreknél tovább - szobahőmérsékleten inkubáljuk, időnként votexeljük vagy orbitális rázó szekrénybe helyezzük.

•

A mintát 5 percig nagy fordulaton (kb. 13000 g) lecentrifugáljuk.

•

A felülúszót óvatosan lepipettázzuk úgy, hogy az oldatból kb. 30-50 µl maradjon csak vissza a cső alján. A nyomhordozót is a csőben hagyjuk.

•

+ 150µl 5%-os Chelex oldatot és

•

+ 50µl Proteináz K oldatot (2 mg/ml) mérünk hozzá. Vortexeljük!

•

30 percig 56 Co-on folyamatos rázás alatt inkubálunk.

•

5-10 másodpercig erősen vortexelünk.

•

Főzés 100 Co -os vízfürdőben, rázás nélkül 8 percig.

•

5-10 másodpercig erősen vortexelünk.

•

5 percig nagy fordulaton (kb. 13000 g ) centrifugálunk.

•

Kb. 2-5µl oldat amplifikáláshoz használható.

13. táblázat. 457 - szerológiai ill. DNS vizsgálattal igazolt - származás-megállapítási ügy fiúgyermek-apa párok meiózisainak DYS 19, DYS 390 és a DYS 389 polimorf Y kromoszómális lokuszokon megfigyelt részletes vizsgálati eredményei (németországi populáció). A ∗ -gal jelölt minták esetében vizsgálati eredményt nem nyertünk.

Sorszám

Személy

Labor kód

DYS 19

DYS 390

Talált mutációk

DYS 389

I. allél

II. allél

1.

Gyermek

0.1

14

23

12

28

2.

APA

0.2

14

23

12

28

3.

Gyermek

0.5

14

23

12

28

4.

APA

0.6

14

23

12

28

5.

Gyermek

0.7

14

24

13

29

73

6.

APA

0.8

14

24

13

29

7.

Gyermek

0.9

14

25

14

31

8.

APA

0.10

14

25

14

31

9.

Gyermek

0.13

14

23

13

29

10.

APA

0.14

14

23

13

29

11.

Gyermek

0.15

16

24

13

31

12.

APA

0.16

16

24

13

31

13.

Gyermek

0.17

17

25

13

30

14.

APA

0.18

17

25

13

30

15.

Gyermek

0.19

14

23

13

29

16.

APA

0.20

14

23

13

29

17.

Gyermek

0.21

14

24

13

29

18.

APA

0.22

14

24

13

29

19.

Gyermek

0.23

14

24

12

28

20.

APA

0.24

14

24

12

28

21.

Gyermek

0.28

14

24

13

30

22.

APA

0.29

14

24

13

30

23.

Gyermek

0.30

14

25

14

31

24.

APA

0.31

14

25

14

31

25.

Gyermek

0.32

16

25

∗

∗

26.

APA

0.33

16

25

∗

∗

27.

Gyermek

0.34

14

22

12

28

28.

APA

0.35

14

22

12

28

29.

Gyermek

0.36

14

24

13

29

30.

APA

0.37

14

24

13

29

31.

Gyermek

0.38

17

25

12

29

32.

APA

0.39

17

25

12

29

33.

Gyermek

0.40

14

22

12

28

34.

APA

0.41

14

22

12

28

35.

Gyermek

0.42

15

24

13

30

36.

APA

0.43

15

24

13

30

37.

Gyermek

0.44

14

23

13

30

38.

APA

0.45

14

23

13

30

39.

Gyermek

0.46

13

23

13

31

40.

APA

0.47

13

23

13

31

41.

Gyermek

0.48

16

25

13

29

42.

APA

0.49

16

25

13

29

43.

Gyermek

0.50

15

23

14

30

44.

APA

0.51

15

23

13

29

45.

Gyermek

0.52

13

25

13

31

46.

APA

0.53

13

25

13

31

47.

Gyermek

0.54

14

24

13

30

48.

APA

0.55

14

24

13

30

49.

Gyermek

0.56

14

24

14

30

50.

APA

0.57

14

24

14

30

Mut. DYS389

74

51.

Gyermek

0.58

14

23

12

28

52.

APA

0.59

14

23

12

28

53.

Gyermek

0.60

13

23

13

30

54.

APA

0.61

13

23

13

30

55.

Gyermek

0.62

16

24

13

30

56.

APA

0.63

16

24

13

30

57.

Gyermek

0.64

14

24

13

29

58.

APA

0.65

14

24

13

29

59.

Gyermek

0.66

14

22

12

28

60.

APA

0.67

14

22

12

28

61.

Gyermek

0.68

14

24

13

30

62.

APA

0.69

14

24

13

30

63.

Gyermek

0.70

15

26

13

29

64.

APA

0.71

15

26

13

29

65.

Gyermek

0.72

14

23

14

32

66.

APA

0.73

14

23

14

32

67.

Gyermek

0.74

14

23

13

29

68.

APA

0.75

14

23

13

29

69.

Gyermek

0.76

14

24

13

28

70.

APA

0.77

14

24

13

28

71.

Gyermek

0.78

14

24

14

31

72.

APA

0.79

14

24

14

31

73.

Gyermek

0.80

14

23

12

29

74.

APA

0.81

14

23

12

29

75.

Gyermek

-1.1

14

24

13

29

76.

APA

-1.2

14

24

13

29

77.

Gyermek

-1.3

14

21

13

29

78.

APA

-1.4

14

21

13

29

79.

Gyermek

-1.5

14

21

13

31

80.

APA

-1.6

14

21

13

31

81.

Gyermek

-1.7

14

21

12

28

82.

APA

-1.8

14

21

12

28

83.

Gyermek

-1.9

14

∗

13

29

84.

APA

-1.10

14

∗

13

29

85.

Gyermek

-1.11

14

∗

13

29

86.

APA

-1.12

14

∗

13

29

87.

Gyermek

-1.13

16

∗

∗

∗

88.

APA

-1.14

16

∗

∗

∗

89.

Gyermek

-1.15

14

24

∗

∗

90.

APA

-1.16

14

24

∗

∗

91.

Gyermek

-1.17

14

23

∗

∗

92.

APA

-1.18

14

23

∗

∗

93.

Gyermek

-1.19

15

24

14

31

94.

APA

-1.20

15

24

14

31

95.

Gyermek

-1.21

14

23

13

29

75

96.

APA

-1.22

14

23

13

29

97.

Gyermek

-1.23

14

24

13

29

98.

APA

-1.24

14

24

13

29

99.

Gyermek

-1.25

14

23

13

29

100.

APA

-1.26

14

23

13

29

101.

Gyermek

-1.27

15

24

13

29

102.

APA

-1.28

15

24

13

29

103.

Gyermek

-1.29

14

24

13

29

104.

APA

-1.30

14

24

13

29

105.

Gyermek

-1.31

14

24

13

29

106.

APA

-1.32

14

24

13

29

107.

Gyermek

-1.33

16

23

13

30

108.

APA

-1.34

16

23

13

30

109.

Gyermek

-1.35

14

24

13

31

110.

APA

-1.36

14

24

13

31

111.

Gyermek

-1.37

14

23

13

29

112.

APA

-1.38

14

23

13

29

113.

Gyermek

-1.39

14

24

12

28

114.

APA

-1.40

14

24

12

28

115.

Gyermek

-1.43

14

24

13

29

116.

APA

-1.44

14

24

13

29

117.

Gyermek

-1.47

15

21

∗

∗

118.

APA

-1.48

15

21

∗

∗

119.

Gyermek

-1.49

15

24

14

31

120.

APA

-1.50

15

24

14

31

121.

Gyermek

-1.51

14

25

13

29

122.

APA

-1.52

14

25

13

29

123.

Gyermek

-1.53

14

22

12

29

124.

APA

-1.54

14

22

12

29

125.

Gyermek

-1.55

13

23

14

30

126.

APA

-1.56

13

23

14

30

127.

Gyermek

-1.57

15

23

12

28

128.

APA

-1.58

15

23

12

28

129.

Gyermek

-1.61

14

22

12

28

130.

APA

-1.62

14

22

12

28

131.

Gyermek

-2.10

17

25

13

28

132.

APA

-2.11

17

25

13

28

133.

Gyermek

-2.30

15

23

13

28

134.

APA

-2.31

16

23

13

28

135.

Gyermek

-2.34

13

25

∗

∗

136.

APA

-2.35

13

25

∗

∗

137.

Gyermek

1.4

16

12

∗

∗

138.

APA

1.6

16

12

∗

∗

139.

Gyermek

1.10

14

11

∗

∗

140.

APA

1.12

14

11

∗

∗

76

141.

Gyermek

1.16

15

10

13

29

142.

APA

1.18

15

10

13

29

143.

Gyermek

1.22

14

12

13

29

144.

APA

1.24

14

12

13

29

145.

Gyermek

1.25

14

11

∗

∗

146.

APA

1.27

14

11

∗

∗

147.

Gyermek

1.28

14

10

13

30

148.

APA

1.30

14

10

13

30

149.

Gyermek

1.34

14

11

13

29

150.

APA

1.36

14

11

13

29

151.

Gyermek

1.43

15

11

14

31

152.

APA

1.45

15

11

14

31

153.

Gyermek

1.46

14

11

13

30

154.

APA

1.48

14

11

13

30

155.

Gyermek

1.49

14

10

13

29

156.

APA

1.51

14

10

13

29

157.

Gyermek

1.52

14

10

13

29

158.

APA

1.54

14

10

13

29

159.

Gyermek

1.58

14

9

12

28

160.

APA

1.60

14

9

12

28

161.

Gyermek

1.70

17

12

13

30

162.

APA

1.72

17

12

13

30

163.

Gyermek

1.76

14

11

13

31

164.

APA

1.78

14

11

13

31

165.

Gyermek

2.4

14

11

13

29

166.

APA

2.6

14

11

13

29

167.

Gyermek

2.16

14

10

13

29

168.

APA

2.18

14

10

13

29

169.

Gyermek

2.31

15

10

14

32

170.

APA

2.33

15

10

14

32

171.

Gyermek

2.37

14

12

13

29

172.

APA

2.39

14

12

13

29

173.

Gyermek

2.46

14

11

13

29

174.

APA

2.48

14

11

13

29

175.

Gyermek

2.52

13

11

13

30

176.

APA

2.54

13

11

13

30

177.

Gyermek

2.58

16

12

13

30

178.

APA

2.60

16

12

13

30

179.

Gyermek

2.73

15

10

12

28

180.

APA

2.75

15

10

12

28

181.

Gyermek

2.76

14

10

∗

∗

182.

APA

2.78

14

10

∗

∗

183.

Gyermek

2.79

15

10

13

30

184.

APA

2.81

15

10

13

30

185.

Gyermek

3.1

16

8

12

28

77

186.

APA

3.3

16

8

12

28

187.

Gyermek

3.4

15

12

13

29

188.

APA

3.6

15

12

13

29

189.

Gyermek

3.16

14

11

14

30

190.

APA

3.18

14

11

14

30

191.

Gyermek

3.28

15

11

13

31

192.

APA

3.30

15

11

13

31

193.

Gyermek

3.31

17

12

13

29

194.

APA

3.33

17

12

13

29

195.

Gyermek

3.34

14

11

13

29

196.

APA

3.36

14

11

13

29

197.

Gyermek

3.37

15

12

13

31

198.

APA

3.39

15

12

13

31

199.

Gyermek

3.43

14

10

12

28

200.

APA

3.45

14

10

12

28

201.

Gyermek

3.46

14

10

12

28

202.

APA

3.48

14

10

12

28

203.

Gyermek

3.52

14

11

13

29

204.

APA

3.54

14

11

13

29

205.

Gyermek

3.58

15

12

13

29

206.

APA

3.60

15

12

13

30

207.

Gyermek

4.4

15

12

13

31

208.

APA

4.6

15

12

13

31

209.

Gyermek

4.7

16

12

13

30

210.

APA

4.9

16

12

13

30

211.

Gyermek

4.13

15

12

13

30

212.

APA

4.15

15

12

13

30

213.

Gyermek

4.16

14

10

13

29

214.

APA

4.18

14

10

13

29

215.

Gyermek

4.25

14

11

13

29

216.

APA

4.27

14

11

13

29

217.

Gyermek

4.31

15

11

12

28

218.

APA

4.33

15

11

12

28

219.

Gyermek

4.34

14

9

∗

∗

220.

APA

4.36

14

9

∗

∗

221.

Gyermek

4.46

14

11

13

29

222.

APA

4.48

14

11

13

29

223.

Gyermek

4.52

14

10

13

29

224.

APA

4.54

14

10

13

29

225.

Gyermek

4.55

16

10

13

31

226.

APA

4.57

16

10

13

31

227.

Gyermek

4.58

15

8

∗

∗

228.

APA

4.60

15

8

∗

∗

229.

Gyermek

4.70

14

11

∗

∗

230.

APA

4.72

14

11

∗

∗

78

231.

Gyermek

4.79

14

11

∗

∗

232.

APA

4.81

14

11

∗

∗

233.

Gyermek

5.13

14

9

∗

∗

234.

APA

5.15

14

9

∗

∗

235.

Gyermek

5.16

15

10

∗

∗

236.

APA

5.18

15

10

∗

∗

237.

Gyermek

5.19

14

10

∗

∗

238.

APA

5.21

14

10

∗

∗

239.

Gyermek

5.22

14

11

∗

∗

240.

APA

5.24

14

11

∗

∗

241.

Gyermek

5.34

14

11

13

29

242.

APA

5.36

14

11

13

29

243.

Gyermek

5.46

14

10

∗

∗

244.

APA

5.48

14

10

∗

∗

245.

Gyermek

5.49

14

10

∗

∗

246.

APA

5.51

14

10

∗

∗

247.

Gyermek

5.52

16

9

∗

∗

248.

APA

5.54

16

9

∗

∗

249.

Gyermek

5.58

14

10

∗

∗

250.

APA

5.60

14

10

∗

∗

251.

Gyermek

5.67

14

10

∗

∗

252.

APA

5.69

14

10

∗

∗

253.

Gyermek

5.70

17

12

∗

∗

254.

APA

5.72

17

12

∗

∗

255.

Gyermek

5.73

14

11

∗

∗

256.

APA

5.75

14

11

∗

∗

257.

Gyermek

5.76

14

10

∗

∗

258.

APA

5.78

14

10

∗

∗

259.

Gyermek

6.10

14

11

∗

∗

260.

APA

6.12

14

11

∗

∗

261.

Gyermek

6.34

14

10

∗

∗

262.

APA

6.36

14

10

∗

∗

263.

Gyermek

6.37

17

9

∗

∗

264.

APA

6.39

17

9

∗

∗

265.

Gyermek

6.52

14

11

13

29

266.

APA

6.54

14

11

13

29

267.

Gyermek

6.55

14

9

∗

∗

268.

APA

6.57

14

9

∗

∗

269.

Gyermek

6.58

14

10

∗

∗

270.

APA

6.60

14

10

∗

∗

271.

Gyermek

6.67

14

11

13

29

272.

APA

6.69

14

11

13

29

273.

Gyermek

6.73

15

8

12

29

79

274.

APA

6.75

15

8

12

29

275.

Gyermek

7.1

14

10

∗

∗

276.

APA

7.3

14

10

∗

∗

277.

Gyermek

7.7

14

11

13

29

278.

APA

7.9

14

11

13

29

279.

Gyermek

7.19

17

12

13

30

280.

APA

7.21

17

12

13

30

281.

Gyermek

7.22

14

10

14

30

282.

APA

7.24

14

10

14

30

283.

Gyermek

7.28

14

12

13

29

284.

APA

7.30

14

12

13

29

285.

Gyermek

7.40

14

9

12

28

286.

APA

7.42

14

9

12

28

287.

Gyermek

7.46

17

12

13

30

288.

APA

7.48

17

12

13

30

289.

Gyermek

7.55

14

9

12

29

290.

APA

7.57

14

9

12

29

291.

Gyermek

7.58

14

11

∗

∗

292.

APA

7.60

14

11

∗

∗

293.

Gyermek

7.64

14

12

13

30

294.

APA

7.66

14

12

13

30

295.

Gyermek

7.67

15

12

∗

∗

296.

APA

7.69

15

12

∗

∗

297.

Gyermek

7.73

13

11

∗

∗

298.

APA

7.75

13

11

∗

∗

299.

Gyermek

8.4

14

11

14

31

300.

APA

8.6

14

11

14

31

301.

Gyermek

8.7

15

12

13

30

302.

APA

8.9

15

12

13

30

303.

Gyermek

8.19

13

11

∗

∗

304.

APA

8.21

13

11

∗

∗

305.

Gyermek

8.22

15

11

13

29

306.

APA

8.24

15

11

13

29

307.

Gyermek

8.25

14

11

∗

∗

308.

APA

8.27

14

11

∗

∗

309.

Gyermek

8.28

16

11

∗

∗

310.

APA

8.30

16

11

∗

∗

311.

Gyermek

8.34

15

11

12

28

312.

APA

8.36

15

11

12

28

313.

Gyermek

8.37

17

11

13

32

314.

APA

8.39

17

11

13

32

315.

Gyermek

8.40

14

11

13

30

316.

APA

8.42

14

11

13

30

317.

Gyermek

8.43

14

11

13

29

318.

APA

8.45

14

11

13

29

80

319.

Gyermek

8.46

15

10

14

31

320.

APA

8.48

15

10

14

31

321.

Gyermek

8.49

15

9

∗

∗

322.

APA

8.51

15

9

∗

∗

323.

Gyermek

8.55

14

11

∗

∗

324.

APA

8.57

14

11

∗

∗

325.

Gyermek

8.64

13

11

∗

∗

326.

APA

8.66

13

11

∗

∗

327.

Gyermek

8.73

16

12

∗

∗

328.

APA

8.75

16

12

∗

∗

329.

Gyermek

8.76

14

12

∗

∗

330.

APA

8.78

14

12

∗

∗

331.

Gyermek

8.79

14

11

∗

∗

332.

APA

8.81

14

11

∗

∗

333.

Gyermek

9.7

14

11

∗

∗

334.

APA

9.9

14

11

∗

∗

335.

Gyermek

9.10

16

12

∗

∗

336.

APA

9.12

16

12

∗

∗

337.

Gyermek

9.34

14

11

∗

∗

338.

APA

9.36

14

11

∗

∗

339.

Gyermek

9.55

14

12

13

30

340.

APA

9.57

14

12

13

30

341.

Gyermek

9.70

14

10

∗

∗

342.

APA

9.72

14

10

∗

∗

343.

Gyermek

9.76

17

11

13

30

344.

APA

9.78

17

11

13

30

345.

Gyermek

9.79

14

11

∗

∗

346.

APA

9.81

14

11

∗

∗

347.

Gyermek

10.1

14

10

13

30

348.

APA

10.3

14

10

13

30

349.

Gyermek

10.4

16

11

∗

∗

350.

APA

10.6

16

11

∗

∗

351.

Gyermek

10.7

14

12

∗

∗

352.

APA

10.9

14

12

∗

∗

353.

Gyermek

10.16

16

12

∗

∗

354.

APA

10.18

16

12

∗

∗

355.

Gyermek

10.25

16

12

13

30

356.

APA

10.27

16

12

13

30

357.

Gyermek

10.31

16

10

∗

∗

358.

APA

10.33

15

10

∗

∗

359.

Gyermek

10.34

14

9

13

28

360.

APA

10.36

14

9

13

28

361.

Gyermek

10.37

14

9

∗

∗

362.

APA

10.39

14

9

∗

∗

Mut. DYS19

81

363.

Gyermek

10.40

14

11

13

30

364.

APA

10.42

14

11

13

30

365.

Gyermek

10.49

13

11

14

31

366.

APA

10.51

13

11

14

31

367.

Gyermek

10.52

15

12

12

29

368.

APA

10.54

15

12

12

29

369.

Gyermek

10.58

14

11

13

29

370.

APA

10.60

14

11

13

29

371.

Gyermek

10.61

14

12

14

31

372.

APA

10.63

14

12

14

31

373.

Gyermek

11.1

15

10

13

29

374.

APA

11.3

15

10

13

29

375.

Gyermek

11.7

14

8

∗

∗

376.

APA

11.9

14

8

∗

∗

377.

Gyermek

11.16

14

10

12

28

378.

APA

11.18

14

10

12

28

379.

Gyermek

11.19

14

11

14

31

380.

APA

11.21

14

11

14

31

381.

Gyermek

11.22

14

10

12

28

382.

APA

11.24

14

10

12

28

383.

Gyermek

11.25

15

10

14

31

384.

APA

11.27

15

10

14

31

385.

Gyermek

11.31

14

9

12

28

386.

APA

11.33

14

9

12

28

387.

Gyermek

11.43

14

11

13

29

388.

APA

11.45

14

11

13

29

389.

Gyermek

11.61

17

9

14

32

390.

APA

11.63

17

9

14

32

391.

Gyermek

11.64

14

11

12

28

392.

APA

11.66

14

11

12

28

393.

Gyermek

11.67

15

9

∗

∗

394.

APA

11.69

15

9

∗

∗

395.

Gyermek

11.70

14

9

12

28

396.

APA

11.72

14

9

12

28

397.

Gyermek

11.76

16

9

∗

∗

398.

APA

11.78

16

9

∗

∗

399.

Gyermek

12.1

14

11

14

29

400.

APA

12.3

14

11

14

29

401.

Gyermek

12.7

14

11

13

29

402.

APA

12.9

14

11

13

29

403.

Gyermek

12.10

14

11

13

29

404.

APA

12.13

14

11

13

29

405.

Gyermek

12.26

14

11

13

29

406.

APA

12.28

14

11

13

29

407.

Gyermek

12.29

14

11

13

29

82

408.

APA

12.31

14

11

13

29

409.

Gyermek

12.38

13

11

∗

∗

410.

APA

12.40

13

11

∗

∗

411.

Gyermek

12.41

15

12

13

31

412.

APA

12.43

15

12

13

31

413.

Gyermek

12.44

14

11

13

29

414.

APA

12.46

14

11

13

29

415.

Gyermek

12.62

16

12

13

30

416.

APA

12.64

16

12

13

30

417.

Gyermek

12.65

13

11

14

31

418.

APA

12.67

13

11

14

31

419.

Gyermek

12.74

14

10

∗

∗

420.

APA

12.76

14

10

∗

∗

421.

Gyermek

12.77

14

10

12

28

422.

APA

12.79

14

10

12

28

423.

Gyermek

13.71

16

10

13

29

424.

APA

13.73

16

10

13

29

425.

Gyermek

14.35

14

11

13

30

426.

APA

14.37

14

11

13

30

427.

Gyermek

14.74

14

10

13

29

428.

APA

14.76

14

10

13

29

429.

Gyermek

15.2

14

11

14

30

430.

APA

15.4

14

11

14

30

431.

Gyermek

15.20

14

9

12

28

432.

APA

15.22

14

9

12

28

433.

Gyermek

15.23

14

11

11

27

434.

APA

15.25

14

11

11

27

435.

Gyermek

15.26

15

10

14

31

436.

APA

15.28

15

10

14

31

437.

Gyermek

15.29

15

9

12

28

438.

APA

15.31

15

9

12

28

439.

Gyermek

15.32

17

12

12

28

440.

APA

15.34

17

12

12

28

441.

Gyermek

15.77

16

15

12

28

442.

APA

15.79

16

15

12

28

443.

Gyermek

16.35

16

25

∗

∗

444.

APA

16.37

16

25

∗

∗

445.

Gyermek

16.41

14

23

∗

∗

446.

APA

16.43

14

23

∗

∗

447.

Gyermek

16.44

15

22

∗

∗

448.

APA

16.46

15

22

∗

∗

449.

Gyermek

16.47

16

25

∗

∗

450.

APA

16.49

16

25

∗

∗

451.

Gyermek

16.56

13

25

∗

∗

452.

APA

16.58

13

24

∗

∗

Mut. DYS390

83

453.

Gyermek

16.62

14

25

∗

∗

454.

APA

16.64

14

25

∗

∗

455.

Gyermek

16.65

16

26

∗

∗

456.

APA

16.67

16

26

∗

∗

457.

Gyermek

16.71

14

24

∗

∗

458.

APA

16.73

14

24

∗

∗

459.

Gyermek

17.2

14

24

∗

∗

460.

APA

17.4

14

24

∗

∗

461.

Gyermek

17.5

15

23

∗

∗

462.

APA

17.7

15

23

∗

∗

463.

Gyermek

17.8

14

25

13

31

464.

APA

17.10

14

25

13

31

465.

Gyermek

17.17

14

23

13

29

466.

APA

17.19

14

23

13

29

467.

Gyermek

17.23

14

23

14

30

468.

APA

17.25

14

23

14

30

469.

Gyermek

17.26

16

25

13

30

470.

APA

17.28

16

25

13

30

471.

Gyermek

17.29

15

22

13

30

472.

APA

17.31

15

22

13

30

473.

Gyermek

17.32

14

24

13

29

474.

APA

17.34

14

24

13

29

475.

Gyermek

17.50

14

24

13

29

476.

APA

17.52

14

24

13

29

477.

Gyermek

17.62

14

22

12

28

478.

APA

17.64

14

22

12

28

479.

Gyermek

17.65

14

24

12

28

480.

APA

17.67

14

24

12

28

481.

Gyermek

17.74

14

24

13

29

482.

APA

17.76

14

24

13

29

483.

Gyermek

17.80

14

22

13

29

484.

APA

18.1

14

22

13

29

485.

Gyermek

18.2

15

24

14

31

486.

APA

18.4

15

24

14

31

487.

Gyermek

18.5

15

25

14

31

488.

APA

18.7

15

25

14

31

489.

Gyermek

18.32

14

24

13

30

490.

APA

18.34

14

24

13

30

491.

Gyermek

18.35

14

23

13

29

492.

APA

18.37

14

23

13

29

493.

Gyermek

18.41

16

25

13

30

494.

APA

18.43

16

25

13

30

495.

Gyermek

18.68

14

24

13

29

496.

APA

18.70

14

24

13

29

497.

Gyermek

18.74

14

24

12

28

84

498.

APA

18.76

14

24

12

28

499.

Gyermek

18.77

16

24

13

30

500.

APA

18.79

16

24

13

30

501.

Gyermek

18.80

16

25

13

29

502.

APA

19.1

16

25

13

29

503.

Gyermek

19.2

15

22

12

28

504.

APA

19.4

15

22

12

28

505.

Gyermek

19.11

16

25

13

31

506.

APA

19.13

16

25

13

31

507.

Gyermek

19.14

14

25

14

31

508.

APA

19.16

14

25

14

31

509.

Gyermek

19.23

14

22

12

29

510.

APA

19.25

14

22

12

29

511.

Gyermek

19.26

14

22

13

29

512.

APA

19.28

14

22

13

29

513.

Gyermek

19.29

13

∗

13

29

514.

APA

19.31

13

∗

13

29

515.

Gyermek

19.38

14

24

∗

∗

516.

APA

19.40

14

24

∗

∗

517.

Gyermek

19.44

15

24

13

29

518.

APA

19.46

15

24

13

29

519.

Gyermek

19.47

∗

∗

13

30

520.

APA

19.49

∗

∗

13

30

521.

Gyermek

19.50

14

23

12

28

522.

APA

19.52

14

23

12

28

523.

Gyermek

19.53

15

22

12

28

524.

APA

19.55

15

22

12

28

525.

Gyermek

19.56

15

22

14

31

526.

APA

19.58

15

22

14

31

527.

Gyermek

19.62

14

23

13

28

528.

APA

19.64

14

23

13

28

529.

Gyermek

19.74

17

24

13

31

530.

APA

19.76

17

24

13

31

531.

Gyermek

20.5

14

24

13

28

532.

APA

20.7

14

24

13

28

533.

Gyermek

20.8

14

24

13

30

534.

APA

20.10

14

24

13

30

535.

Gyermek

20.11

14

24

12

28

536.

APA

20.13

14

24

12

28

537.

Gyermek

20.23

15

24

13

29

538.

APA

20.25

15

24

13

29

539.

Gyermek

20.32

14

23

13

29

540.

APA

20.34

14

23

13

29

541.

Gyermek

20.47

16

25

12

28

542.

APA

20.49

16

25

12

28

85

543.

Gyermek

20.50

14

25

15

32

544.

APA

20.52

14

25

15

32

545.

Gyermek

20.53

14

24

13

29

546.

APA

20.55

14

24

13

29

547.

Gyermek

20.59

15

24

13

29

548.

APA

20.61

15

24

13

29

549.

Gyermek

20.62

14

24

13

29

550.

APA

20.64

14

24

13

29

551.

Gyermek

20.65

13

22

13

29

552.

APA

20.67

13

22

13

29

553.

Gyermek

20.68

15

25

13

30

554.

APA

20.70

15

25

13

30

555.

Gyermek

20.74

14

24

13

28

556.

APA

20.76

14

24

13

28

557.

Gyermek

20.80

14

25

13

29

558.

APA

21.1

14

25

13

29

559.

Gyermek

21.14

16

25

13

30

560.

APA

21.16

16

25

13

30

561.

Gyermek

21.17

13

22

12

28

562.

APA

21.19

13

22

12

28

563.

Gyermek

21.20

14

23

∗

∗

564.

APA

21.22

14

23

∗

∗

565.

Gyermek

21.26

14

23

14

30

566.

APA

21.28

14

23

14

30

567.

Gyermek

21.38

14

23

12

27

568.

APA

21.40

14

23

12

27

569.

Gyermek

21.41

16

24

13

32

570.

APA

21.43

16

24

13

32

571.

Gyermek

21.47

16

25

13

30

572.

APA

21.49

16

25

13

30

573.

Gyermek

21.50

14

22

12

28

574.

APA

21.52

14

22

12

28

575.

Gyermek

21.53

14

22

13

29

576.

APA

21.55

14

22

13

29

577.

Gyermek

21.56

15

∗

12

29

578.

APA

21.58

15

∗

12

29

579.

Gyermek

21.62

14

23

12

28

580.

APA

21.64

14

23

12

28

581.

Gyermek

21.74

16

23

12

29

582.

APA

21.76

16

23

12

29

583.

Gyermek

21.77

15

23

∗

∗

584.

APA

21.79

15

23

∗

∗

585.

Gyermek

21.80

15

23

∗

∗

586.

APA

22.1

15

23

∗

∗

587.

Gyermek

22.2

14

23

∗

∗

86

22.4

14

23

∗

∗

588.

APA

589.

Gyermek

22.5

14

24

13

31

590.

APA

22.7

14

24

13

31

591.

Gyermek

22.8

14

23

12

30

592.

APA

22.10

14

23

12

30

593.

Gyermek

22.11

13

25

∗

∗

594.

APA

22.13

13

25

∗

∗

595.

Gyermek

22.17

14

23

∗

∗

596.

APA

22.19

14

23

∗

∗

597.

Gyermek

22.44

14

11

∗

∗

598.

APA

22.46

14

11

∗

∗

599.

Gyermek

22.53

14

12

13

29

600.

APA

22.55

14

12

13

29

601.

Gyermek

22.59

14

11

13

29

602.

APA

22.61

14

11

13

29

603.

Gyermek

22.65

14

12

13

29

604.

APA

22.67

14

12

13

29

605.

Gyermek

22.68

14

11

∗

∗

606.

APA

22.70

14

11

∗

∗

607.

Gyermek

22.71

15

12

∗

∗

608.

APA

22.73

15

12

∗

∗

609.

Gyermek

22.74

16

12

13

31

610.

APA

22.76

16

12

13

31

611.

Gyermek

22.77

14

11

∗

∗

612.

APA

22.79

14

11

∗

∗

613.

Gyermek

23.11

14

9

∗

∗

614.

APA

23.13

14

9

∗

∗

615.

Gyermek

23.17

15

11

13

29

616.

APA

23.19

15

11

13

29

617.

Gyermek

23.20

14

11

13

30

618.

APA

23.22

14

11

13

30

619.

Gyermek

23.26

13

11

∗

∗

620.

APA

23.28

13

11

∗

∗

621.

Gyermek

23.29

16

12

13

29

622.

APA

23.31

16

12

13

29

623.

Gyermek

23.35

14

9

∗

∗

624.

APA

23.37

14

9

∗

∗

625.

Gyermek

23.38

15

10

13

29

626.

APA

23.40

15

10

13

29

627.

Gyermek

23.47

17

12

∗

∗

628.

APA

23.49

17

12

∗

∗

629.

Gyermek

23.56

14

9

∗

∗

630.

APA

23.58

14

9

∗

∗

631.

Gyermek

23.59

16

11

13

31

87

632.

APA

23.61

16

11

13

31

633.

Gyermek

23.65

16

13

14

30

634.

APA

23.67

16

13

14

30

635.

Gyermek

23.77

14

10

13

29

636.

APA

23.79

14

10

13

29

637.

Gyermek

24.5

15

12

13

31

638.

APA

24.7

15

12

13

31

639.

Gyermek

24.8

14

9

12

28

640.

APA

24.10

14

9

12

28

641.

Gyermek

24.11

14

11

13

29

642.

APA

24.13

14

11

13

29

643.

Gyermek

24.14

14

9

12

28

644.

APA

24.16

14

9

12

28

645.

Gyermek

24.32

16

12

13

30

646.

APA

24.34

16

12

13

30

647.

Gyermek

24.35

15

10

13

29

648.

APA

24.37

15

10

13

29

649.

Gyermek

24.38

14

10

13

29

650.

APA

24.40

14

10

13

29

651.

Gyermek

24.47

16

12

∗

∗

652.

APA

24.49

16

12

∗

∗

653.

Gyermek

24.53

14

11

∗

∗

654.

APA

24.55

14

11

∗

∗

655.

Gyermek

24.62

16

10

∗

∗

656.

APA

24.64

16

10

∗

∗

657.

Gyermek

24.68

15

12

∗

∗

658.

APA

24.70

15

12

∗

∗

659.

Gyermek

24.71

13

11

∗

∗

660.

APA

24.73

13

11

∗

∗

661.

Gyermek

24.77

14

11

∗

∗

662.

APA

24.79

14

11

∗

∗

663.

Gyermek

24.80

15

9

12

28

664.

APA

25.1

15

9

12

28

665.

Gyermek

25.2

14

10

13

29

666.

APA

25.4

14

10

13

29

667.

Gyermek

25.8

13

10

13

29

668.

APA

25.10

13

10

13

29

669.

Gyermek

25.11

14

10

13

29

670.

APA

25.13

14

10

13

29

671.

Gyermek

25.14

13

12

14

32

672.

APA

25.16

13

12

14

32

673.

Gyermek

25.17

16

12

∗

∗

674.

APA

25.19

16

12

∗

∗

675.

Gyermek

25.23

13

11

∗

∗

676.

APA

25.25

13

11

∗

∗

88

677.

Gyermek

25.26

14

9

12

28

678.

APA

25.28

14

9

12

28

679.

Gyermek

25.32

14

11

13

29

680.

APA

25.34

14

11

13

29

681.

Gyermek

25.35

14

11

13

30

682.

APA

25.37

14

11

13

30

683.

Gyermek

25.41

14

11

13

29

684.

APA

25.43

14

11

13

29

685.

Gyermek

25.44

16

12

13

30

686.

APA

25.46

16

12

13

30

687.

Gyermek

25.53

16

12

13

30

688.

APA

25.55

16

12

13

30

689.

Gyermek

25.56

15

12

∗

∗

690.

APA

25.58

15

12

∗

∗

691.

Gyermek

25.77

15

11

13

30

692.

APA

25.79

15

11

13

30

693.

Gyermek

26.2

15

11

∗

∗

694.

APA

26.4

15

11

∗

∗

695.

Gyermek

26.5

15

11

13

28

696.

APA

26.7

15

11

13

28

697.

Gyermek

26.14

15

10

14

30

698.

APA

26.16

15

10

14

30

699.

Gyermek

26.20

14

9

12

29

700.

APA

26.22

14

9

12

29

701.

Gyermek

26.23

16

11

13

31

702.

APA

26.25

16

11

13

31

703.

Gyermek

26.26

14

10

12

28

704.

APA

26.28

14

10

12

28

705.

Gyermek

26.29

14

10

13

29

706.

APA

26.31

14

10

13

29

707.

Gyermek

26.41

17

12

14

31

708.

APA

26.43

18

12

14

31

709.

Gyermek

26.47

16

12

13

29

710.

APA

26.49

16

12

13

29

711.

Gyermek

26.50

16

12

13

29

712.

APA

26.52

16

12

13

29

713.

Gyermek

26.53

14

11

12

29

714.

APA

26.55

14

11

12

29

715.

Gyermek

26.56

14

11

14

30

716.

APA

26.58

14

11

14

30

717.

Gyermek

26.62

14

9

11

27

718.

APA

26.64

14

9

11

27

719.

Gyermek

26.71

15

9

13

29

720.

APA

26.73

15

9

13

29

721.

Gyermek

26.74

17

11

13

31

Mut. DYS19

89

722.

APA

26.76

17

11

13

31

723.

Gyermek

26.77

14

11

13

29

724.

APA

26.79

14

11

13

29

725.

Gyermek

27.17

14

10

13

30

726.

APA

27.19

14

10

13

30

727.

Gyermek

27.20

14

9

12

29

728.

APA

27.22

14

9

12

29

729.

Gyermek

27.23

16

9

13

29

730.

APA

27.25

16

9

13

29

731.

Gyermek

27.26

14

9

12

28

732.

APA

27.28

14

9

12

28

733.

Gyermek

27.29

15

10

14

30

734.

APA

27.31

15

10

14

30

735.

Gyermek

27.32

14

11

14

29

736.

APA

27.34

14

11

14

29

737.

Gyermek

27.35

14

11

13

29

738.

APA

27.37

14

11

13

29

739.

Gyermek

27.41

15

12

13

31

740.

APA

27.43

15

12

13

31

741.

Gyermek

27.47

14

10

14

30

742.

APA

27.49

14

10

14

30

743.

Gyermek

27.50

14

11

13

29

744.

APA

27.52

14

11

13

29

745.

Gyermek

27.59

14

9

12

28

746.

APA

27.61

14

9

12

28

747.

Gyermek

27.68

14

9

12

28

748.

APA

27.70

14

9

12

28

749.

Gyermek

27.71

15

9

12

29

750.

APA

27.73

15

9

12

29

751.

Gyermek

28.2

13

12

13

30

752.

APA

28.4

13

12

13

30

753.

Gyermek

28.17

14

23

∗

∗

754.

APA

28.19

14

23

∗

∗

755.

Gyermek

28.20

16

25

∗

∗

756.

APA

28.22

16

25

∗

∗

757.

Gyermek

28.29

15

∗

∗

∗

758.

APA

28.31

15

∗

∗

∗

759.

Gyermek

28.32

15

22

∗

∗

760.

APA

28.34

15

22

∗

∗

761.

Gyermek

28.44

14

22

13

29

762.

APA

28.46

14

22

13

29

763.

Gyermek

28.47

14

22

∗

∗

764.

APA

28.49

14

22

∗

∗

765.

Gyermek

28.50

17

25

∗

∗

766.

APA

28.52

17

25

∗

∗

90

767.

Gyermek

28.53

14

23

∗

∗

768.

APA

28.55

14

23

∗

∗

769.

Gyermek

28.59

13

22

13

29

770.

APA

28.61

13

22

13

29

771.

Gyermek

28.62

14

23

13

29

772.

APA

28.64

14

23

13

29

773.

Gyermek

28.65

14

24

13

29

774.

APA

28.67

14

24

13

29

775.

Gyermek

28.74

14

23

13

29

776.

APA

28.76

14

23

13

29

777.

Gyermek

28.80

14

24

13

29

778.

APA

29.1

14

24

13

29

779.

Gyermek

29.8

14

23

12

28

780.

APA

29.10

14

23

12

28

781.

Gyermek

29.11

15

27

12

28

782.

APA

29.13

15

27

12

28

783.

Gyermek

29.14

15

25

14

31

784.

APA

29.16

15

25

14

31

785.

Gyermek

29.20

∗

24

∗

∗

786.

APA

29.22

∗

24

∗

∗

787.

Gyermek

29.23

14

24

13

29

788.

APA

29.25

14

24

13

29

789.

Gyermek

29.41

15

23

13

30

790.

APA

29.43

15

23

13

30

791.

Gyermek

29.44

14

24

13

29

792.

APA

29.46

14

24

13

29

793.

Gyermek

29.47

14

24

13

30

794.

APA

29.49

14

24

13

30

795.

Gyermek

29.53

15

22

12

28

796.

APA

29.55

15

22

12

28

797.

Gyermek

29.62

14

23

13

30

798.

APA

29.64

14

23

13

30

799.

Gyermek

29.68

15

24

13

31

800.

APA

29.70

15

24

13

31

801.

Gyermek

29.74

∗

22

12

29

802.

APA

29.76

∗

22

12

29

803.

Gyermek

29.77

15

25

13

30

804.

APA

29.79

15

25

13

30

805.

Gyermek

30.2

∗

∗

13

29

806.

APA

30.4

∗

∗

13

29

807.

Gyermek

30.5

∗

∗

12

28

808.

APA

30.7

∗

∗

12

28

809.

Gyermek

30.20

∗

∗

13

30

810.

APA

30.22

∗

∗

13

30

811.

Gyermek

30.23

14

23

12

28

91

812.

APA

30.25

14

23

12

28

813.

Gyermek

30.29

14

23

13

29

814.

APA

30.31

14

23

13

29

815.

Gyermek

30.50

16

21

14

31

816.

APA

30.52

16

21

14

31

817.

Gyermek

30.68

15

24

12

28

818.

APA

30.70

15

24

12

28

819.

Gyermek

30.71

14

22

∗

∗

820.

APA

30.73

14

22

∗

∗

821.

Gyermek

30.74

15

24

12

29

822.

APA

30.76

15

24

12

29

823.

Gyermek

30.77

∗

∗

13

29

824.

APA

30.79

∗

∗

13

29

825.

Gyermek

31.2

15

23

14

31

826.

APA

31.4

15

23

14

31

827.

Gyermek

31.14

16

23

13

32

828.

APA

31.16

16

23

13

32

829.

Gyermek

31.26

15

23

13

29

830.

APA

31.28

15

23

13

29

831.

Gyermek

31.32

14

22

12

28

832.

APA

31.34

14

22

12

28

833.

Gyermek

31.35

14

23

13

29

834.

APA

31.37

14

23

13

29

835.

Gyermek

31.38

14

24

13

29

836.

APA

31.40

14

24

13

29

837.

Gyermek

31.41

14

23

12

28

838.

APA

31.43

14

23

12

28

839.

Gyermek

31.44

15

23

∗

∗

840.

APA

31.46

15

23

∗

∗

841.

Gyermek

31.50

∗

∗

12

28

842.

APA

31.52

∗

∗

12

28

843.

Gyermek

31.56

∗

∗

12

30

844.

APA

31.58

∗

∗

12

30

845.

Gyermek

31.62

15

∗

14

30

846.

APA

31.64

15

∗

14

30

847.

Gyermek

31.74

14

24

13

29

848.

APA

31.76

14

24

13

29

849.

Gyermek

31.77

∗

∗

14

30

850.

APA

31.79

∗

∗

14

30

851.

Gyermek

32.2

14

22

12

28

852.

APA

32.4

14

22

12

28

853.

Gyermek

32.14

13

24

∗

∗

854.

APA

32.16

13

24

∗

∗

855.

Gyermek

32.17

13

24

14

31

856.

APA

32.19

13

24

14

31

92

857.

Gyermek

32.20

14

23

13

30

858.

APA

32.22

14

23

13

30

859.

Gyermek

32.26

15

23

13

30

860.

APA

32.28

15

23

13

30

861.

Gyermek

32.29

14

23

14

30

862.

APA

32.31

14

23

14

30

863.

Gyermek

32.32

15

24

13

32

864.

APA

32.34

15

24

13

32

865.

Gyermek

32.47

14

24

13

29

866.

APA

32.49

14

24

13

29

867.

Gyermek

32.50

14

24

13

28

868.

APA

32.52

14

24

13

28

869.

Gyermek

32.56

14

22

13

30

870.

APA

32.58

14

22

13

30

871.

Gyermek

32.62

15

24

12

29

872.

APA

32.64

15

24

12

29

873.

Gyermek

32.71

14

23

12

28

874.

APA

32.73

14

23

12

28

875.

Gyermek

32.74

15

24

13

30

876.

APA

32.76

15

24

13

30

877.

Gyermek

32.80

14

23

14

30

878.

APA

33.1

14

23

14

30

879.

Gyermek

33.8

16

25

∗

∗

880.

APA

33.10

16

25

∗

∗

881.

Gyermek

33.11

15

25

13

29

882.

APA

33.13

15

25

13

29

883.

Gyermek

33.14

17

24

∗

∗

884.

APA

33.16

17

24

∗

∗

885.

Gyermek

33.20

14

24

∗

∗

886.

APA

33.22

14

24

∗

∗

887.

Gyermek

33.23

15

23

14

32

888.

APA

33.25

15

23

14

32

889.

Gyermek

33.26

∗

∗

13

29

890.

APA

33.28

∗

∗

13

29

891.

Gyermek

33.32

∗

∗

13

29

892.

APA

33.34

∗

∗

13

29

893.

Gyermek

33.38

∗

∗

13

29

894.

APA

33.40

∗

∗

13

29

895.

Gyermek

33.41

∗

∗

13

30

896.

APA

33.43

∗

∗

13

30

897.

Gyermek

33.44

∗

∗

13

30

898.

APA

33.46

∗

∗

13

29

899.

Gyermek

33.68

∗

∗

14

32

900.

APA

33.70

∗

∗

14

32

Mut. DYS389

93

901.

Gyermek

33.74

15

23

13

31

902.

APA

33.76

15

23

13

31

903.

Gyermek

33.80

∗

24

14

31

904.

APA

34.1

∗

24

14

31

905.

Gyermek

34.2

14

22

12

29

906.

APA

34.4

14

22

12

29

907.

Gyermek

34.14

∗

∗

12

28

908.

APA

34.16

∗

∗

12

28

909.

Gyermek

34.23

14

23

13

29

910.

APA

34.25

14

23

13

29

911.

Gyermek

34.26

∗

22

12

28

912.

APA

34.28

∗

22

12

28

913.

Gyermek

34.29

14

24

13

30

914.

APA

34.31

14

24

13

30