makromolekulák biofizikája
DNS, RNS, Fehérjék
•Tér Méret, alak, lokális és globális szerkezet
•Idő Fluktuációk, szerkezetváltozások, gombolyodás
Kellermayer Miklós
•Kölcsönhatások Belső és külső kölcsöhatások, kötések, kötési energiák Mechanika, rugalmasság
Biológiai makromolekulák HATALMAS molekulák
A makromolekulák TÖMEG szerinti mennyisége a sejtben NAGY
ÉRDEKES molekulák Ionok, kismolekulák (4%)
30 % egyéb vegyületek
Foszfolipidek (2%) DNS (1%) RNS (6%)
Hemoglobin alegység (térszerkezeti modell) A fehérje hogyan veszi fel térszerkezetét?
Bakteriofágból kiszabaduló DNS fonal Mi határozza meg a DNS globális alakját és rugalmasságát?
Fehérjék 15%)
Baktériumsejt Újonnan termelődő fehérje (selyemfibroin)
Poliszacharidok (2%)
MAKROMOLEKULÁK
70 % Víz
A biológiai makromolekulák biopolimérek Polimérek: Építőkockákból, monomerekből felépülő láncok
A polimérek alakja a bolyongó mozgásra emlékeztet Bolyongó (Brown-féle) mozgás (“random walk”)
rN
Monomerek száma: N>>1; Típusosan, N~102-104, de DNS: N~109-1010
R
Entropikus* rugalmasság: Termikus gerjesztésre a polimerlánc random, ide-oda hajló fluktuációkat végez.
Biopolimer
Egység
Kötés
Fehérje
Aminosav
Kovalens (peptidkötés)
r1 “Négyzetgyök törvény”:
Nukleinsav (RNS, DNS)
Nukleotid (CTUGA)
Kovalens (foszfodiészter)
R = vég-vég távolság ri = elemi vektor
Poliszacharid (pl. glikogén)
Cukor (pl. glukóz)
Kovalens (pl. α-glikozid)
Nl = L = kontúrhossz
Fehérjepolimer (pl. mikrotubulus)
Fehérje (pl. tubulin)
Másodlagos
A globális alak és rugalmasság között összefüggés van l = perzisztencia hossz (hajlítómerevséget jellemzi) L = kontúrhossz
R = Nl = Ll 2
2
N = elemi vektorok száma l = ri = korrelációs hossz (“perzisztencia hossz”,
Nő a lánc konformációs entrópiája (elemi vektorok orientációs rendezetlensége).
Az entrópiamaximumra törekvés miatt a polimerlánc rövidül.
hajlítási merevséget jellemzi)
Bolyongó (diffúzióvezérelt) mozgás esetén R=elmozdulás, N= elemi lépések száma, L=teljes megtett út, és l=átlagos szabad úthossz.
*Entrópia: rendezetlenség
Entropikus rugalmasság vizualizálása Csomókötés egyetlen DNS láncra
Merev lánc l>>L
Mikrotubulus mikrogyöngy mozgatható lézercsipeszben Fáziskontraszt kép
Szemiflexibilis lánc l~L
Flexibilis lánc l<
Az elemi vektorok orientációs rendezetlenségre törekvése rugalmasságot eredményez
Fluoreszcencia kép
Aktin filamentum
DNS molekula
mikrogyöngy stacionárius lézercsipeszben Kinosita Group
1. DNS: dezoxiribonukleinsav
A DNS-molekula rugalmas!
Funkció: biológiai raktármemória molekulája Kémiai szerkezet
Térszerkezet: kettős hélix
Változatos DNS szerkezetek
A dsDNS rugalmas erőgörbéje
Rugalmasságmérés: lézercsipesszel 80
Lézer fókusz
Határtávolság: kontúrhossz 60
DNS túlnyúlás (B-S átmenet)
A-DNS
B-DNS
Z-DNS
Erő (pN)
dsDNS Latex gyöngy
40
20
Hidratáció, ionkörnyezet, kémiai módosítás (pl. metiláció), szuperhélix iránya függvényében
feszítés 0
interkaláció
visszaengedés 0
10
20
30
Megnyúlás (μm) “Watson-Crick” bázispárosodás: H-hidakkal Génszekvencia a molekuláris genetika centrális problémaköre
Mozgatható mikropipetta
Nagy árok
Kis árok
A dsDNS perzisztenciahossza ~50 nm Benne ~65 pN-nál túlnyúlási átmenet
dsDNS
DNS nanostrukturák Bázispárosodási rend és hierarchia függvényében
Mennyi DNS van a sejtben?
2. RNS: Ribonukleinsav Funkció: információátvitel (transzkripció), szerkezeti elem (pl. riboszóma), szabályozás (génexpresszió ki-, bekapcsolása)
Megoldás: a DNS-t csomagolni kell Kromoszóma kondenzáció Egyszerűsített sejtmodell: kocka Sejt: 20 μm oldalfalú kocka
Analógia Tanterem: 20 m oldalfalú kocka
DNS vastagsága
2 nm
2 mm
Humán DNS teljes hossza
~2 m
~2000 km (!!!)
dsDNS
~50 nm
~50 cm
dsDNS vég-vég távolsága (R)
~350 μm (!)
~350 m (!)
Teljesen kompakt DNS térfogata
~2 x 2 x 2 μm3
~2 x 2 x 2 m3 (= 8 m3)
perzisztenciahossza
Kémiai szerkezet hiszton fehérjekomplexből: nukleoszóma
Cukor: ribóz Bázisok: adenin uracil guanin citozin
Az RNS molekula (nem párban áll!)
Másodlagos és harmadlagos szerkezetek
RNS hajtű (hairpin)
Komplex szerkezet (ribozim)
“Watson-Crick” bázispárosodás
• Magas rendű DNS csomagolásban szerepet játszó fehérjék: kondenzinek
• DNS lánc: lineáris, bonyolult akadálypálya!
Az RNS szerkezet mechanikai erővel megbontható
3. Fehérjék: peptid kötéssel egybekapcsolt biopolimérek Funkció: az élet legfontosabb molekulái - rendkívül változatos funkciók szerkezet, kémiai katalízis, energiaátalakítás, motorikus feladatok, stb.
Kitekert frakció
Erő (pN)
Mechanikai feszítés lézercsipesszel
Megnyúlás (nm) Erő (pN)
A peptidkötés és kialakulása RNS hajtű mechanikai kitekerése: közel reverzibilis folyamat az RNS hajtű gyorsan visszarendeződik
Víz felszabadulással járó kondenzációs reakció Erő (pN)
Fehérjék szerkezete Elsődleges
Másodlagos
Harmadlagos
Aminosavsorrend
α-hélix β-lemez β-kanyar (hajtű)
Egyláncú fehérje teljes térszerkezete
Fehérjeszerkezet megjelenítése
drótváz
térkitöltő
Meghatározza a térszerkezetet is
gerincváz
α-hélix: • jobbmenetes • 3.4 aminosav/ emelkedés • H-hidak
β-lemez: • parallel v. antiparallel • H-hidak távoli aminosavak között
*Negyedleges szerkezet: önálló alegységek komplexbe kapcsolódása
szalag
Miozin S-1 (Miozin “subfragment-1”)
Fehérjeszerkezeti osztályok
Fehérjeszerkezetet összetartó kölcsönhatások
1. Tiszta alfa
Gyenge (másodlagos) kötések
1. Hidrogén híd: megosztott proton a protondonor oldalláncok között. 2. Elektrosztatikus kölcsönhatás (sókötés): ellentétesen töltött részek között.
2. Tiszta béta
3. van der Waals kötés: lezárt elektronhéjak közötti gyenge kölcsönhatás.
calmodulin
porin
(3. Alfa-béta)
Bár ahány fehérje, annyi egyedi szekvencia, a térszerkezet alapján a fehérjék néhány fő osztályba sorolhatók!
Kovalens kötés
4. Hidrofób-hidrofób kölcsönhatás: hidrofób molekularészek között (molekula belsejében).
4. Multidomén 5. Diszulfid híd: cisztein aminosavak között; egymástól távol levő láncokat kapcsol össze.
Hogyan alakul ki a fehérje térszerkezete?
A fehérjegombolyodást a konformációs tér alakja vezérli
Anfinsen: a fehérjék spontán gombolyodnak (az aminosav sorrend meghatározza a szerkezetet)
Konformációs tér: gombolyodási tölcsér (“folding funnel”)
rendellességek (“folding disease”) Kitekert állapot
Natív szerkezet (N) Legalacsonyabb energia
Levinthal-féle paradoxon (Cyrus Levinthal, 1969): Kipróbálja-e a fehérje az összes lehetséges konformációt?
Konformáció
• A fehérjék “lecsúsznak a tölcsér
in
i = az egyetlen φ vagy ψ szöghöz tartozó elméletileg lehetséges szögállások száma n = φ vagy ψ szögek összes száma Pl.: 100 aminosavból álló peptidben a φ vagy ψ szögállások lehetséges száma legyen 2. n=198m. Szabadsági fokok száma 2198(!!!)
oldalán
• A tölcsér alakja bonyolult lehet (az Energia
A lehetséges konformációk (szabadsági fokok) száma:
• Peptidkötés által meghatározott planáris peptidcsoport • Minden peptidkötéshez egy-egy φ és ψ szög
Pathológia • Fehérjegombolyodási • Alzheimer-kór • Parkinson-kór • II. típusú diabetes • Familialis amiloidotikus neuropátia
Energia
Christian Anfinsen (1916-1995)
miozin
Domén: fehérjegombolyodási “alegység”
alak teljes meghatározása nehézkes)
• A fehérje elakadhat köztes
Konformáció Mi a valószínűsége, hogy egy biliárdgolyó véletlenszerű mozgással beletalál a lyukba?
konformációs állapotokban (pathologia!) • Az élő sejt chaperon fehérjékkel segíti a gmbolyodást
500 nm
β-fibrillumok: oldhatatlan precipitátum kereszt-β szerkezet
Fehérjekitekerési módszerek • • •
Hő Kémiai ágens Mechanikai erő
Titin Ig domének mechanikailag stabilak
Felszakítják a másodlagos kémiai kötéseket Megbontják a másodlagos, harmadlagos szerkezetet
Egyetlen fehérjemolekula mechanikai kitekerése atomerőmikroszkóppal
Erő Erő Erő
Mechanikai stabtilitás alapja: H-hidak párhuzamos csatolása
H-hidak “zippzár”-szerű elrendezésben
Titin immunglobulin domének
Erő spektrum
Alacsony mechanikai stabilitás: H-hidak sorba kapcsoltan
doménszerkezetet összetartó H-hidak
C2A domén erőspektruma
Kitekeredéshez szükséges erő ~ 20 pN Kitekeredéshez szükséges erő > 200 pN
doménszerkezetet összetartó H-hidak
Mechanikai stabilitás logikája makroszkopikus rendszerben Kölcsönhatások párhuzamos csatolása
Alkalmazás:
Gecko talp tapadása: Párhuzamosan csatolt sertékkel
Mesterséges gecko talp
