Disková difuzní metoda EUCAST pro vyšetřování citlivosti k antibiotikům. Verze 3.0 Duben 2013

Disková difuzní metoda EUCAST pro vyšetřování citlivosti k antibiotikům Verze 3.0 Duben 2013

Obsah • • • • • • • • •

Půdy Příprava inokula Očkování ploten Disky Inkubace Odečítání zón Interpretace Kontrola kvality Analýza chyb

EUCAST 2013 Verze 3.0

2

EUCAST - disková difuzní metoda modifikace prezentace Verze

Modifikace

Verze 3.0 Duben 2013

• • • • •

Vysvětlení ohledně defibrinované koňské krve v půdě MH-F, str. 5 a 6. Pasteurella multocida, Campylobacter jejuni a C. coli přidány na str. 6 a 19. Vysvětlení ohledně výběru kolonií pro diskovou difuzi, str. 11 a 12. Přidán Campylobacter jejuni ATCC 33560, str. 30. Přidána čísla sbírek DSM and CCUG pro E. faecalis ATCC 51922, str. 31.

Verze 2.1 Únor 2012

•

Vysvětlení ohledně odečítání zón na str. 23 a 25.

Verze 2.0 Leden 2012

• • • •

Nová terminologie (Viridující streptokoky) a přidání Listeria monocytogenes na str. 6 a 19. Vysvětlení ohledně odečítání zón na str. 24. Další výjimky u odečítání zón na str. 27. K. pneumoniae ATCC 700603 a E. faecalis ATCC 51299 přidány na str. 31.

Verze 1.1 Červen 2010

• •

Vysvětlení ohledně výšky agaru na str. 7. Čísla španělské sbírky kultur přidána na str. 30 a 31.

Verze 1.0 Prosinec 2009

•

EUCAST poprvé zveřejňuje na webových stránkách obrázkovou prezentaci diskové difuzní metody EUCAST.


3

Půdy pro vyšetření citlivosti


4

Půdy pro vyšetření citlivosti • Používá se Mueller-Hinton agar (MH).

• Půda pro náročné bakterie (MH-F, Mueller-Hinton Fastidious) je MH obohacený 5% mechanicky defibrinované koňské krve a 20 mg/l β-NAD (nikotinamid adenin dinukleotid).


5

Půdy pro různé bakterie Bakterie Enterobacteriaceae Pseudomonas spp. Stenotrophomonas maltophilia Acinetobacter spp. Staphylococcus spp. Enterococcus spp.

Půda

Mueller-Hinton agar

Streptococcus pneumoniae Streptokoky sk. A, B, C a G Viridující streptokoky Haemophilus spp. Moraxella catarrhalis Listeria monocytogenes Pasteurella multocida Campylobacter jejuni a coli Ostatní náročné bakterie

Mueller-Hinton (MH) agar + 5 % mechanicky defibrinované koňské krve + 20 mg/l β-NAD (MH-F)

V přípravě EUCAST 2013 Verze 3.0

6

Vlastní příprava půd • Při přípravě se postupuje podle pokynů výrobce. • Krev nebo β-NAD lze přidat, pouze je-li půda ochlazena na 42-45°C (je třeba zajistit příslušné nastavení teploty), poté se půda pečlivě promíchá a vylije na plotny. • Půda se do ploten vylévá na rovném povrchu do jednotné výšky 4.0 +/- 0.5 mm. Pokud opakované měření prokáže výšku agaru pod nebo nad 4 mm, vylévaný objem se upraví, i když je výška agaru na plotně v rozmezí 3.5 - 4.5 mm. Obvykle se používají kulaté plotny o průměru 90 mm (~25 ml), 100 mm (~31 ml), 150 mm (~71 ml), nebo čtvercové plotny o straně 100 mm (~40 ml). EUCAST 2013 Verze 3.0

7

Kontrola kvality Mueller-Hinton agaru Je třeba ověřit, zda všechny používané šarže MuellerHinton agaru jsou v přípustném rozmezí inhibičních zón pro všechna vyšetřovaná antibiotika a bakterie. Zvláštní problémy: – Inhibiční zóny aminoglykosidů u P. aeruginosa ATCC 27853 o menším/větším průměru než je dolní/horní limit ukazují na vysokou/nízkou koncentraci dvojmocných kationtů v půdě. – Inhibiční zóny trimethoprim-sulfamethoxazolu u E. faecalis ATCC 29212 o menším průměru než je dolní limit ukazují na vysoký obsah thyminu a thymidinu v půdě. 8


Sušení a skladování agarových ploten • Na povrchu ploten před vyšetřením citlivosti nesmí být žádné viditelné kapky vody. • Plotny nesmí být přesušené. • Při vlastní přípravě ploten závisí podmínky pro sušení a skladování na dostupném vybavení a měly by být určeny na místě. • Při skladování komerčně připravovaných půd je zapotřebí postupovat podle pokynů výrobce. EUCAST 2013 Verze 3.0

9

Inokulum • Metoda vyžaduje zákal inokula odpovídající 0,5 McFarlandova standardu*.

* Odpovídá přibližně 1-2 x108 CFU/ml u E. coli.


10

Výběr izolovaných kolonií vyrostlých přes noc na neselektivní půdě


11

Příprava inokula • Sterilní kličkou nebo bavlněným tamponem se k vyloučení atypických variant odebere několik (pokud možno) morfologicky podobných kolonií, které se rozetřou ve fyziologickém roztoku tak, aby homogenní, viditelný zákal odpovídal McFarlandovu standardu 0,5. – Výjimka: Streptococcus pneumoniae z krevního agaru se připraví podle zákalového stupně 0,5 McFarlanda, z čokoládového agaru podle zákalového stupně 1,0 McFarlanda.

• Hustotu suspenze lze upravit přidáním bakterií nebo fyziologického roztoku tak, aby odpovídala McFarlandovu zákalu 0,5. Zákal se změří nejlépe na fotometru. EUCAST 2013 Verze 3.0

12

Inokulace ploten • Suspenze inokula se očkuje na plotny, nejlépe do 15 minut od přípravy, a nejpozději do 60 minut. • Bavlněný tampon se ponoří do suspenze a přebytečná tekutina se odstraní jeho rotací po vnitřní stěně zkumavky. • Inokulum se roztírá tamponem ve třech směrech nebo rotátorem tak, aby byl naočkován celý povrch plotny.


13

Husté inokulaci ploten je třeba řeba se vyhnout • Je důležité, ležité, aby inokulum na plotn plotně nebylo husté. • Ověří se, zda průměry ů ěry zón kontrolních kmen kmenů ů jsou v přípustném ípustném rozmezí. Husté inokulum vytvá vytváří zóny inhibice o menším průmě průměru. • Přebytek ebytek inokula na tamponu se p před inokulací odstraní jemnou rotací po vnit vnitřní stěně zkumavky (u u grampozitivních bakterií se však nesmí tampon p příliš říliš vysušit). EUC UCAST 2013 Verze 3.0

14

Skladování disků s antibiotiky • Disky se skladují podle podmínek daných výrobcem. • Běžně používané disky se uchovávají v temnu při 4-8°C v uzavřených kontejnerech s indikátorem vlhkosti. • Před otevřením je nutno kontejner s disky umístit do pokojové teploty, aby nedocházelo ke kondenzaci vody. Lépe je ponechat disky během pracovního dne při pokojové teplotě než je opakovaně ukládat do ledničky. • Disky nelze používat po datu expirace uvedeném na obalu. EUCAST 2013 Verze 3.0

15

Aplikace disků s antibiotiky • Disky se aplikují do 15 minut od inokulace ploten. • Disky musí být pevně a celou plochou přitištěny k povrchu půdy. • Počet disků na plotně je nutno omezit, aby se předešlo překrývání inhibičních zón a interferenci mezi antibiotiky. Tím lze dosáhnout spolehlivé měření průměrů zón. EUCAST 2013 Verze 3.0

16

Souhrn postupu při inokulaci • Suspenze inokula se vytvoří z izolovaných kolonií vyrostlých přes noc na neselektivní půdě. • Hustota inokula se upraví podle zákalu McFarlandova standardu. Inokulum se v optimálním případě naočkuje na plotny do 15 minut od vytvoření suspenze. • Sterilní tampon se ponoří do inokula a přebytek tekutiny se odstraní rotací tamponu po vnitřní stěně zkumavky. • Inokulum se rovnoměrně naočkuje po celém povrchu agaru. • Disky se aplikují do 15 minut po inokulaci ploten a inkubace se zahájí do následujících 15 minut. EUCAST 2013 Verze 3.0

17

Inkubace ploten • Do 15 min od aplikace disků se plotny obrátí víčkem dolů a dají se inkubovat. Toto omezení času predifuze předchází tvorbě zón o nežádoucím větším průměru. • Počet ploten ve sloupci by měl být co nejnižší k potlačení rozdílné teploty uvnitř sloupce, která ovlivňuje průměry zón (podle možností inkubátoru). •

MH se inkubuje na vzduchu, MH-F na vzduchu s 4-6% CO2. EUCAST 2013 Verze 3.0

18

Inkubace ploten Bakterie

Podmínky inkubace

Enterobacteriaceae

35+/-1 ºC na vzduchu po 16-20h

Pseudomonas spp.


Stenotrophomonas maltophilia


Acinetobacter spp.


Staphylococcus spp.


Enterococcus spp.


Streptococcus sk. A, B, C a G

35+/-1 ºC na vzduchu s 4-6% CO2 po 16-20h

Viridující streptokoky


Streptococcus pneumoniae


Haemophilus spp.


Moraxella catarrhalis


Listeria monocytogenes


Pasteurella multocida


Campylobacter jejuni a C. coli

41+/-1 ºC v mikroaerobním prostředí po 24h

Další náročné bakterie

V přípravě 19 EUCAST 2013 Verze 3.0

Pravidlo 15 -15 -15 minut Plotny je třeba připravit tak, že: • inokulum se očkuje do 15 minut od přípravy, nejpozději však do 60 minut, • disky se kladou do 15 minut po inokulaci ploten, • do 15 minut po aplikaci disků je třeba plotny začít inkubovat.


20

Prohlížení ploten po inkubaci • Správné inokulum, dobře rozetřené na plotny, poskytuje splývavý nárůst. • Rovnoměrný nárůst kolonií umožňuje vytvoření kruhových zón inhibice s ostrými (nevykousanými) okraji. (viz následující obrázek). • Málo koncentrované inokulum vytváří izolované kolonie a vyšetření je nutno opakovat


21

Růst by měl být splývavý a rovnoměrný

Plotny by měly vypadat takto...

…a NIKOLI takto!


22

Odečítání zón • Okraje zón se odečítají ve vzdálenosti 30 cm od oka, od bodu úplné inhibice viditelné pouhým okem. Příklady:

E. coli Ciprofloxacin

S. aureus Erythromycin

KNS Trimethoprim


S. pneumoniae Rifampicin

23

Odečítání zón • MH plotny se odečítají ze spodní strany proti tmavému pozadí v odraženém světle.

• MH-F plotny se odečítají po odstranění víčka z horní strany v odraženém světle.


24

Odečítání zón • Plotny nelze odečítat v procházejícím světle (kdy je plotna umístěna proti zdroji světla) nebo pomocí lupy, pokud není stanoveno jinak (viz dále).

• Průměry zón lze měřit pravítkem, posuvným měřítkem nebo automatickým odečítáním zón. • Zřetelné kolonie, které se vyskytnou uvnitř zóny, je třeba vyočkovat, ověřit jejich čistotu a pokud je nutno, opakovat vyšetření. EUCAST 2013 Verze 3.0

25

Odečítání zón – výjimky (1) Bakterie

Antibiotikum

Odečítání inhibičních zón

Proteus spp.

Kterékoli

Plazivý růst se přehlíží.

Streptococcus spp.

Kterékoli

Odečítá se zóna inhibice růstu, nikoli hemolýzy.

Kterákoli

Trimethoprim Trimethoprim-sulfamethoxazol

Jemný, zastřený růst v inhibiční zóně se zřetelnými okraji se ignoruje.

Staphylococcus spp.

Linezolid

Zóna se prohlíží v procházejícím světle (proti zdroji světla).

Enterococcus spp.

Vankomycin

Zóna se prohlíží v procházejícím světle (proti zdroji světla).

Enterobacteriaceae

Ampicilin

Jemný růst uvnitř zóny, který se může vyskytnout u některých šarží MH agaru, se přehlíží.


26

Odečítání zón – výjimky (2) Bakterie

Antibiotikum

Odečítání inhibičních zón

E. coli

Mecilinam

Izolované kolonie uvnitř inhibiční zóny se přehlížejí.

Stafylokoky

Benzylpenicilin

Zóna se prohlíží v blízkosti procházejícího světla (proti zdroji světla).

Stafylokoky

Cefoxitin

Inhibiční zóna se pečlivě prohlíží a pátrá se po koloniích uvnitř zóny.


27

Interpretace zón • Před interpretací výsledků se ověří, zda průměry inhibičních zón vytvořené kontrolními kmeny jsou v přípustném rozmezí. • Naměřené průměry inhibičních zón (na nejbližší milimetr) se interpretují v kategoriích citlivosti (C, I a R) podle tabulek breakpointů EUCAST (EUCAST Breakpoint Tables (www.eucast.org), česky Tabulky breakpointů EUCAST (www.szu.cz/eucast-dokumenty).


28

Kontrola vyšetření citlivosti •

Ke kontrole správnosti provedení je zapotřebí používat doporučené kmeny pro kontrolu kvality (viz EUCAST Quality Control Tables, česky EUCAST Tabulky pro kontrolu kvality).

• Kontrolní kmeny s definovanou rezistencí lze použít ke kontrole schopnosti detekovat rezistenci. • Kontrolní kmeny lze koupit ze sbírek kultur nebo z komerčních zdrojů.


29

EUCAST - kmeny pro rutinní kontrolu kvality Druh E. coli

Číslo sbírky kultur ATCC 25922; NCTC 12241; CIP 7624 DSM 1103; CCUG 17620; CECT 434; CNCTC 5276

Vlastnosti Citlivý, divoký typ

P. aeruginosa

ATCC 27853; NCTC 12903; CIP 76110 DSM 1117; CCUG 17619; CECT 108; CNCTC 5482

Citlivý, divoký typ

S. aureus


Slabý producent β-laktamázy

E. faecalis



S. pneumoniae

H. influenzae

Campylobacter jejuni

ATCC 49619; NCTC 12977; CIP 104340 DSM 11967; CCUG 33638; CNCTC 5043 NCTC 8468; CIP5494; CCUG 23946; CNCTC 7425 ATCC 33560; NCTC 11351; CIP 702 DSM 4688; CCUG 11284; CNCTC 7365


Intermediární k penicilinu



30

EUCAST - kmeny pro detekci specifických mechanizmů rezistence (ve vývoji) Druh

E. coli

K. pneumoniae

S. aureus

Číslo sbírky kultur ATCC 35218; NCTC 11954; CIP 102181; DSM 5564; CCUG 30600; CECT 943; CNCTC 5321 ATCC 700603; NCTC 13368; CCUG 45421; CECT 7787 NCTC 12493

Vlastnosti

Producent TEM-1 β-laktamázy

Producent ESBL (SHV-18) Heterorezistentní k oxacilinu, mecA pozitivní

E. faecalis

ATCC 51299; NCTC 13379; CIP 104676; DSM 12956; CCUG 34289; CNCTC 5530

Rezistentní k vysoké koncentraci aminoglykosidů (HLAR) a k vankomycinu (vanB pozitivní)

H. influenzae

ATCC 49247; NCTC 12699; CIP 104604; DSM 9999; CCUG 26214; CNCTC 5063

β-laktamáza negativní, ampicilin- rezistentní (BLNAR)


31

Sbírky kultur ATCC, American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA. NCTC, National Collection of Type Cultures, Health Protection Agency Centre for Infections, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT, UK. CIP, Collection de Institut Pasteur, 25–28 Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 France. DSMZ, Deutsche Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 16, D-38124 Braunschweig, Germany. CCUG, The Culture Collection University of Gothenburg. http://www.ccug.se/ CECT, Colección Española de Cultivos Tipo. Universidad de Valencia. 46100. Burjassot. Valencia. Spain. http://www.cect.org CNCTC, Česká sbírka typových kultur, Státní zdravotní ústav, Šrobarova 48, 100 42, Praha, Česká republika. http://apps.szu.cz/cnctc/ EUCAST 2013 Verze 3.0

32

Denní provádění kontroly kvality pro posouzení celkového provozu • Kontrolní testy by měly být prováděny a vyhodnocovány denně, zejména s antibiotiky, která jsou v rutinní sestavě. • Každý den, kdy se vyšetření provede, se prohlédnou výsledky posledních 20 konsekutivních testů. • Prozkoumají se výsledky trendů a zón, které opakovaně spadají nad nebo pod přípustné rozmezí. • Pokud dva nebo více z 20 testů jsou mimo přípustné rozmezí, je zapotřebí vyšetřit příčinu.


33

Monitoring provádění testů Jednotlivé výsledky mimo kontrolní limity

25 Průměr zóny (mm)

Horní limit rozmezí

20

Cíl Dolní limit rozmezí

15 Všechny výsledky

10

na jedné straně limitu

5

Konsekutivní výsledky mimo limity na stejné straně

0 0

5

10

15

20

25

30

35

40

Den


34

Postup při výsledcích kontrolních kmenů mimo limit • Pokud jsou hodnoty dvou nekonsekutivních průměrů inhibičních zón kontrolních kmenů z 20 testů mimo přípustné rozmezí, lze sice výsledky vyšetření citlivosti hlásit, je však třeba vyšetřit příčinu. •

Pokud jsou hodnoty dvou konsekutivních průměrů inhibičních zón kontrolních kmenů z 20 testů mimo přípustné rozmezí, je zapotřebí vyšetřit příčinu před hlášením výsledků vyšetření citlivosti. Vyšetření citlivosti je zapotřebí opakovat.

•

Pokud je ve stejném dni více disků (>2) mimo rozmezí, je zapotřebí vyšetřit příčinu před hlášením výsledků vyšetření citlivosti. Vyšetření citlivosti je zapotřebí opakovat.

•

Pokud není prokázána rezistence u kontrolního kmene pro rezistenci, pozastaví se hlášení výsledků, vyšetří se příčina a vyšetření se opakuje. EUCAST 2013 Verze 3.0

35

Uchování a subkultivace kontrolních kmenů • Kmeny se uchovávají při -70 °C v glycerolovém bujónu nebo na korálcích: jedna lahvička “pro použití”, jedna “pro archiv”. Alternativně lze použít lyofilizáty nebo komerční zdroje kmenů. • Z lahvičky "pro použití" lze týdně kmeny vyočkovat na neselektivní půdy a kontrolovat čistotu kolonií. • Čistou kulturu lze vyočkovávat a používat denně do 7 dnů. • Náročné bakterie lze postupně vyočkovávat pouze po 6 dnů. • Po spotřebování lahvičky “pro použití” se subkultivuje lahvička "pro archiv" a připraví se další lahvička “pro použití”. EUCAST 2013 Verze 3.0

36

Možné příčiny chyb (1) Uchovávání ploten Nedodržení postupu při přípravě Variabilita šarží nebo změna dodavatele

Půda

Suplementy (variabilita šarží, chybná navážka, prošlá expirace) pH Výška agaru/objem agaru Datum expirace Nedodržení pravidla “15-15-15” (suspenze naočkována do 15 min, disky kladeny do 15 min, inkubace do 15 min)

Podmínky vyšetření

Inkubace (teplota, prostředí a čas) Inokulum (málo/hodně koncentrované, nebo nehomogenní) Způsob odečítání Odečítání okraje zón EUCAST 2013 Verze 3.0

37

Možné příčiny chyb (2) Nesprávný disk (chybný druh nebo obsah disku)

Disky

Síla disku (nesprávné uchování, labilita, datum expirace) Nevyrovnání na pokojovou teplotu po otevření zásobníku disků Mnoho disků na plotně (interference mezi látkami)

Kontr olní kmeny

Nesprávný kontrolní kmen Mutace Kontaminace Stáří kultury


38

webová stránka EUCAST ST • Webová stránka EUCAST uvádí pravidelné aktualizace metody vyšet vyšetření, rozmezí kontrolních kmenů ů a breakpoint breakpointů.

www.eucast.org • Jakékoli komentáře ře e a návrhy lze posílat na adresu [email protected] nebo na sekretariát EUC CAST (viz webová ová stránka). stránka

EUC UCAST 2013 Verze 3.0

39

X EUCAST

EUROPEAN COMMITTEE ON ANTIMICROBIAL SUSCEPTIBIILITY TESTING

European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases

EUCAST český překlad na stránkách SZÚ http://www.szu.cz/eucast-dokumenty

Disková difuzní metoda EUCAST pro vyšetřování citlivosti k antibiotikům. Verze 3.0 Duben 2013

Recommend Documents