1. Bahan dan Alat
1.1. Bahan tanaman.
Biji Solanum Wurrianwn Clarke diperdeh dari
kebun percobaan Balai Penelitian m a m a n Rempah dan Obat di Manoko-Lembang. Biji krsebut masing-masing berasal dari tiga fenotipe tanaman yaitu fenotipe berduri banyak-bengkok, fenotipe berduri banyaklurus dan fenotipe berduri jarang-lurus.
Dalam penelitian ini hanya
bunga dari fenotipe berduri jarang yang dipakai sedangkan dari fenotipe lainnya hanya &dar
untuk pembanding.
Biji disemaikan dalam baki plastik atau dalam kantumg -kantung plastik kecil yang berisi campuran tanah dan pupuk kandang dengan perbandingan 2:l. Setelah berumur dua bulan semai dipilih dan dipindahkan Ire dalam kantung plastik hitam berukuran 40 x 60 cm yang diisi campuran tanah dan pupuk kandang seperti medium untuk penyemaian biji. Ke dalam campuran tanah tersebut juga ditambahkan pupuk TSP dan KC1 masing-masing sebanyak 100 g serta urea sebanyak 150 g per kantung tanaman. Pupuk TSP dan KC1 diberikan pada waktu pemindahan semai, sedangkan urea diberikan dua kali yaitu pada waktu pemindahan semai sebanyak setengahnya dan sisanya diberikan sebulan kemudim. Tanaman ditempatkan di tempat terbuka atau pun dibawah naungan atap plastik. Daerah penanaman dipilih di kompleks IPB Baranangsiang dan di kompleks perumahan L. I. P.I. Baranangsiang.
1.2. ,&than kimia Bahan-bahan kimia penyusun medium kultur terdiri dari bahan-bahan himia dengan mutu analitik, demikian pula zat pengatur tumbuh yang dlgunalcan. Sukrosa yang digunakan berupa s u h s a mutu teknis yang berwarna putih bersih.
Medium padat dibuat dengan
menambahkan 0.6 persen Difco Bacto Agar. Pada kebanyakan permbaan ini medium dasar yang digunakan dibuat dalam sediaan pekat yang
d i b e k u b . Penambahan zat pengatur tumbuh, bahan otganik lain, gula, agar dan pengukuran keasaman medium dilakukan pada saat medium akan disterilkan.
Alkohol telatis 70 p e r m digunakan untuk mengelap tangan, rnernbersihkan kotak kultur ("laminar flow cabinet") dan menyemprot semua alat yang akan dimasukkan ke dalam kotak kultur. Untuk mensucihamakan bahan tanaman digunakan sodium hypochloride dengan merek dagang Clorox atau Bayclean y,ang mengandung bahan aktif sodium hypochloride (NaCtO) sebesat 5.25 persen.
1.3. Alat-alat. Wmgai wadah kultur digunakan tabung kultur berukur-
an 10 x 160 mm, 20 x 200 mm, 250 x 200 mm, tabung Ehrlenmeyer atau botol bundar berbagai ukuran bahkan juga botol selai, tergantung pada keperluannya. Alat-alat lainnya yang digunakan dalam pengerjaan kultur aniara lain pinset ukuran 10 cm baik berujung lengkung maupun berujung lurus, pinset ukuran 30 cm, jarum Ose, kaca pembesar dan cawan petri.
1.4. Sterilisasi bahan dan alat.
Bunga yang akan digunakan sebagai
sumber bahan kultur (eksplan) baik dengan atau tanpa praperlakuan
dingin dicuci bersih d q a n air ledeng yang diberi beberapa tetes sabun cair seperti tween atau teepol. Setelah dibilas bersih dengan air jedeng dan akuades bunga krsebut disterilkan dalam larutan clorox 25 persen selama 20 sampai 30 menit.
Selanjutnya lamtan clorox dibuang dan
bunga dibilas beberapa kali &ngan akuades yang telah disttrilkan. Kecuali pekerjaan pencucian bunga dengan air ledeng, semua peketjaan sterilisasi bunga sampai pembuatan kultur anter dilakukan dalam kondisi suci hama di dalam kotak steril ("laminar flow cabinet"). Medium kultur disterilkan &ngan jalan dipanaskan di dalam autoclav pada suhu sekitar 121°c dengan tekanan uap 15-16 psi (sekitar 1.5 kg/cm2) selama 30 menit. Demikian juga alat-alat yang digunakan dalam
pengejaan kultur disberilkan dengan jalan pemanasan di dalam autoclav atau dibakar dulu sampai pijar di atas nyala api lampu spiritus. Alat-alatlainnya yang tidak tahan panas ,api dan tidak berhubungan langsung &%an medium atau bahan tanaman disterilkan dengan cara dibilas dengan alkohol70 persen.
Metoda Penelitian
2.1. Temoat. P d i h a r a a n tanaman sebagai sumber eksplan dilakukan di lingkungan Jurusan Agronomi-Fakultas Pertanian-Institut Pertanian Bogor dan di limgkungan Puslitbang Biologi di Bogor.
Kegiatan
pembuatan kultur anter dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan Jurusan Budidaya Pertanian-Fakultas Pertanian-Institut Pertanian Bogor, Laboratorium Anggrek Kebun Raya Bogor dan Laboratorium TreubBalitbang Botani-Witbang Biologi-LIPI.
2.2. e
n
.
Penentuan stadium polen dilakukan dengan cara
pewarnaan umtuk melihat inti polen.
Untuk maksud tersebut contoh
bunga diukur dulu panjangnya sebelum anternya dikeluarkan untuk dipedwi stadium polennya. Panjang bunga diukur dari ujung bunga sampai ke batas pertemuan antara pangkal dasar bunga yang menggembung dengan gagang bunga yang mulai mengecil. Pewarna aceto-carmin, acetwrcein atau campuran fastgreen dengan giemsa digunakan untuk mewamai inti polen.
Berdasarkan hasil pemeriksaan stadium
polen maka dicari hubungan antara panjang bunga dengan stadium polen. Anter yang berasal dari berbagai ukuran panjang bunga (berbagai stadium polen), yaitu ukuran 2 mm sampai 9 atau 10 mm (bunga mekar), dikulturkan secara in-vitro untuk melihat kemungkinan pertumbuhannya dan perkembangannya.
Sebagai medium kultur digunakan
medium MS dengan konsentrasi NAA sebanyak 0.5 mgll, kinetin 1 mg/l, sukrosa 20 gll dan agar 6 gll. Pemilihan medium MS sebagai medium kultur didasarkan pada kenyataan bahwa medium tersebut paling umum digunakan untuk mengkulturkan eksplan dari berbagai jenis tanaman termasuk dari suku terung-terungan (Dunwell dan Sunderland, 1973; Sunderland dan Roberts, 1977; Reynolds, 1986). Kowalczyk, Mackenzie dan Cocking (1983) telah berhasil meregenerasikan tunas dari daun , batang bahkan akar dari Solanwn khasianwn Clarke dalam medium Murashige & Skoog.
Percwn 1. Pengaruh Komposisi Dasar dan Bentuk Fisik Medium Kultur terhadap Pertumbuhan dan Perkernbangan Anter dalam Kultur. Dalam percabaan penjajagan tehukti bahwa anter mampu membentuk kalus ddam medium Murashlge & Skoog (MS). Berda-
sarkan hasil penjajagan dan studi pustaka maka dicobakan untuk magkulturkan anter dalam beberapa medium kultur yang sudah baku. Susunan peroobaan adalah dua faktorial dengan rancangan percobaan ;beak
Iengkap (RAL).
Faktor pertama berupa empat macam komposisi
dasar medium kultur yaitu medium Murashige & Skoog (MS), medium MS
dengan
konsentrasi
ham
makro
setengahnya
(MS1/2), medium Nitsch dan Nitsch (N) yang dimodifikasi dan medium Gresshoff & Doy (GD). Komposisi medium dapat dilihat dalam Ethel Lampiran 1.
Faktor kedua adalah bentuk fisik medium kultur yaitu
bentuk padat {dengan penambahan agar) dan bentuk cair (tanpa agar tetapi diberi kertas penyangga).
Ke daiam medium ditambahltan sukrosa (mutu teknis) sebanyak 30 g/l, NAA sebanyak 0.01 mg/l dan kinetin sebanyak 0.1 mgll medium. Medium padat dibuat *an
menambahkan agar Difco Bacto sebanyak 6
gll medium sedangkan pada medium cair dipasang penyangga terbuat dari kertas saring.
Keasaman medium kultur ditentukan sekitar 5.8
sebelum disterilkan dalam autoclave pada tekanan 15 psi selama 25 menit. Sebagai wadah digunakan tabung kultur (test tube) ukuran 1 x 16 cm yang diisi 6 ml medium kultur dan ditutup dengan kertas aluminum
("aluminum foil").
Bunga yang bemkuran antara 4.5
-
5.0 mm setelah disimpan
selama 48 jam pada suhu sekitar 1 0' C disterilkan dalam larutan clorox 25 persen selama 25 menit.
Anter dikulturkan dalam tabung kultur.
Tiap tabuing berisi satu anter.
Tiap perlakuan terdiri atas sepuluh
duplilcat dan masing-masing perlakuan diulang tiga kali. Kultur diletakkan pada rak dengan penyinaran 16jam t e m g dan 8 jam gelap. Sumber cahaya berasal dari dua buah lampu tabung 40 watt yang terletak 50 cm di atas dasar rak. Suhu mangan berkisar sekitar 31' C pada s i q hari dan 26' C pada malam hari. Pengamatan dilakukan selama tiga bulan.
Unsur-unsur yang
diamati meliputi perubahan warna dari anter, jumlah anter yang berhasil tumbuhlberkembang, bentuk pertumbuhanlperkembangan dari ankr dan morfolcgi bentuk pertumbuhanlperkemb~ananter. Analisis data kuantitatif disesuaikan dengan rancangan percobaan dan keadaan data.
Percobaan 2, Pengaruh Konsentrasi NAA dan Kinetin terhadap Pertumbuhan dan Perkembangan Anter dalam Medium Kultur MS.
Dari hasil Peroobaan 1 didapatkan bahwa pembentukan kalus terbanyak didapatkan dalam medium MS dan GDl dalam bentuk padat. Waupun demikian tidak satu pun dari kalus yang terbentuk menghasil-
kan bentuk pertumbuhan lain selain dari kalus. Atas dasar ini dicoba penggunaan auksin dan sitokinin dalam usaha memanipulasi kondisi untuk merangsang regenerasi tanaman dari kalus.
Susunan percobaan adalah dua faktorial dengan rancangan acak lengkap (RAL). Sebagai medium kultur dipilih medium MS
.
Faktor
pertama adalah lima taraf konsentrasi NAA, yaitu 0, 0.05, 0.10, 0.25 dan 050 mgll medium hltur. Faktor kedua adalah empat taraf konsen-
trasi kinetin, yaitu 0, 0.10, 0.50 dan 1.00 mg/l medium kultur.
Ke
dalam medium ditambahkan sukrosa sebanyak 30 g/l d m agar sebanyak
6 d l . Keasaman medium ditentukan sekitar 5.8. Sebagai wadah digunakan botol bulat volume 50 ml yang masing-masing diisi 8 ml medium hlturdan ditutupdengan kertas aluminum. Medium disterilkandalamautoclave pada tekanan 15 psi selama 25 menit. Bunga yang berubran 4.5
- 5 mm setelah disimpan pada suhu 10'
C selama 48 jam disterilkan dalam larutan clorox 25 persen selama 25
menit.
Anter dikeluarkan dari bunga dan dikulturkan dalam botol
kultur yang berisi 8 ml medium kultur.
Tiap perlakuan terdiri atas
sepuluh duplikat dan masing-masing perlakuan diulang dua Mi. Kultur diletakkan pada ralc yang mendapat penyinaran 16 jam terang dan 8 jam gelap dari dua buah lampu tabung 40 watt yang terietak 50 cm diatas dasar rak. Suhu ruangan berkisar anma 26°C - 3@ C. Pengamatan dilakukan selama tiga bulan.
Unsur unsur yang
diamati meliputi perubahan warna dari anter, jumlah anter yang berhasil tumbuh /betkernbang, bentuk pertumbuhan /perkembangan dari an ter dan morfologi bentuk pertumbuhan/perkembangan anter. Analisis data kuantitatif disesuaikan dengan rancangan percobaan dan keadaan data.
Percobaan 3. Pengaruh Konsentrasi NAA dan Kinetin terhadap Pertumbuhan dan Perkembangan Anter dalam Medium Kultur MS112.
Dari Percobaan 2 diketahui bahwa anter hanya membentuk kalus apabila dalam medium terdapat auksin (NAA), tetapi sejauh yang diarnati tidak ada tanda bahwa kalus bisa meregenerasikan tanaman. Atas dasar ini maka dicoba peningkatan konsentrasi NAA dan kinetin sedangkan sebagai medium Icultur digunakan medium MS1/2 dengan harapan penurunan hara makro bisa mengubah pola perkembangan kalus. Konsemntrasi NAA yang dicoba adalah 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 dan 2.00 mg/l yang dikombinasikan dengan kinetin pada konsentfasi 0.10, 0.50, 1.00 dan 2.00 mgll. Ke dalam medium ditambahkan sukrosa sebanyak
30 g/l dan agar sebanyak 6 g/l. Keasaman medium ditentukan sekitar 5.8 sebelum disterilkan. Sebagai wadah kultur digunakan botol bundar ukuran 50 ml yang diisi dengan 8 ml medium dan ditutup dengan kertas aluminum. Medium disterilkan pada tekanan 15 psi selama 25 menit. Bunga yang berukuran 4.5 - 5 mm setelah disimpan pada suhu 10'
C selama 48 jam disterilkan dalam larutan clorox 25 persen selama 25 menit.
Anter dikduarkan dari bunga dan dikulturkan dalam botol
kultur yang berisi 8 ml medium kultur.
Tiap perlakuan terdiri atas
sepuluh duplikat dan masing-masing perlakuan diulang dua kali. Kultur diletakkan pada rak yang mendapat penyinaran 16 jam terang dan 8 jam gelap dari dua buah lampu tabung 40 watt yang terletak 50 cm diatas dasar rak. Suhu ruangan berkisar antara 26°C - 30' C
Pengamatan diiakukan selama tiga bulan.
Unsur unsur yang
diamati meliputi perubahan warna dari anter, jumlah anter yang bcrhasil tumbuh herkernbang, bentuk pertumbuhan /perkembangan dari an-
dan
morfologi bentuk pertumbuhanlperkembangan anter. Analisis data kuantitatif disesuaikan dengan mcangan pembaan dan keadaan data.
Percobaan 4, Pengaruh Masa Praperlakuan Pendinginan Bunga W a d a p Pertumbuhan dan Perkembangan Anter dalam Kultur.
Praperlairuan suhu krhadap bunga, baik pada suhu Mih rendah maupun pada suhu lebih tinggi dari pada kondisi suhu inkubasi kultur, dimaksudican untuk mempengaruhi pola pertumbuhan dan perkembangan
dari polen yang dihuapkan dapat meregenerasikan tanaman androgen. Efektivitas praperlakuan suhu bagi bunga tentunya ditentukan deh tingkat suhu dm masa atau lamanya pemberian perlakuan. Karena keterba-
tasan fasilitas m& hanya bisa dicoba prapedakuan pada satu tingkat suhu rendah dengan masa praperlakuan yang berbeda. Anter diberi praperlakuan dingin pada suhu 10% selama 2, 3, 5,
7 , 15 dan 19 hari. Sebagai medium kultur dipilih medium MS dengan kombinasi 0. 5 mg/l NAA dm 0.5 mgll kinetin sesuai dengan hasil dari Peroobaan 2 dan Percobaan 3. Ke dalam medium ditambahkan sukrosa
sebanyak 30 gll, agar 6 gll dm keasaman medium ditentukan sekitar 5.8 sebelum disterilkan. Sebagai wadah digunakan botol bulat volume 50 ml yang diisi 8 ml medium kultur dan ditutup dengan kertas aluminum.
Medium disterilkan dalam autoclave pada tekanan sekitar 15 psi selama 25 menit.
Bunga yang berukuran panjang 4.5 -5.0 mm setelah diberi praperlakuan dingin diskxitiran dalam larutan clorox 25 perm sdama 25 menit.
Tiap botol diisi satu anter dan tiap perlakuan btrdiri dari 20
duplikat yang diulang dua sampai empat kali. Kultur diGetairkan pada rak yang mendapat penyinaran 16 jam terang dan 8 jam gelap. Sumber sinar adalah dua buah lanrpu tabu% berkekuatan 40 watt yang d
i
e 50 cm di atas dasar rak. Suhu ru-
angan sekitar 300 pada siang hari dan 260 pada malam hari. Pengamatan d i i k a n selama tiga bulan.
Unsur- unsur yang
diamati meliputi pmbahan warna dari anter, jumlah anter yang berhasil tumbuhlberkembeng, bentuk pertumbuhanlperkembangan dari anter dan morfologi bentuk pertumbuhanlperkembangananter.
Percobaan 5, Pengaruh Konsentrasi Sukrosa terhadap M u m buhan dan Perkernbangan Anter dalam Kultur. n r a f k o n d sukrosa dalam medium kultur diketahui dapat menghasilkan pengaruh yang selektif terhadap pertumbuhan dan perkembangan sel somatik dan sel generatif (Keller et al, 1975). Dalam perahan ini ke dalam medium kultur MS ditambahkan tiga taraf konsentrasi sukrosa masing-masing sebanyak 30, 60 dan 100 gll. Ke dalam mediu juga ditambahkan NAA sebanyak 0.1 mgfl, 2-iP sebanyak 0.01 mgh , BA sebanyak 2.0 mgll dan agar sebanyak 6 gll. Keasaman medium kultur ditentukan sekitar 5.8 sebelum disterilkan. Sebagai wadah kultur digunakan botol bulat ukuran 50 ml yang diisi
dengan 8 ml medium kultur dan ditutup dengan kertas aluminum. Medium
dislerilkan pada tekanan &tar Bunga yang berukuran 5
15 psi selarna 25 menit.
- 6 mm setelah disimpan &ma
48 jam
pada suhu l m distetilkan daiam larutan clomx 25 persen. W l a h dibilas @an
akuades steril anter dilepas clan dikulturkan dalam botol
kultur. Tiap botol kultur berisi satu anter. Tiap perlakuan diulang tiga kali dengan waktu pembuatan kultur yang berbeda. Pada tiap ulangan terdapat 20 atau 25 duplikat untuk setiap perlakuan. Kuttur ditunpatkan dalam ruangan dengan kisaran suhu 26 - 30°C yang mtmhpat penyinaran 16 jam sehari dari dua buah lampu tabung 40 watt pada jar& 50 cm di atas dasar rak. Kalus yang tabentuk dipindahkan pada umur 2 - 4 hari ke dalam medium MS ckngan konsentlasi sukrosa 30 g/l, NAA sebanyalc 0.1 mg/l,
BA sebanyak 2.5 mg/l dan agar sebanyak 6 g/l. Pengamatan dilakukan selama tiga bulan.
Unsur- unsur yang
diamati meliputi perubahan warna dari anter, jumlah anter yang berhasil tumbuhfberkembang, bentuk pertumbuhaniperkembangan dari anter dan rnorfologi bentuk pertumbuhan/perkembangan anter.
Analisis data hintitatif disesuaikan dengan imcangan pemobaan
dan W m data.
?ercobaart 6, Pengaruh Konsentrasi S u h s a dan Glutamin terhadap Pertumbuhan dan Perkembangan Anter dalam Kultur.
Selain sukrosi dikethui pula bahwa penambahan glutamin ke dalam medium kultur dapat merangsang pembentukan planlet (NItsch dan Nitsch, 1969; Kelkr et al, 1975). Ddam percobaan ini dicoba perlakuan
kombinasi sukrosa dengan glutamin. Susunan percobaan adalah 4' faktorial dengan rancangan acak lengkap (RAL).
Faktor pwtama berupa
empat taraf konsentrasi sukrosa, yaitu 30, 60, 75 dm 90 g/l medium. Faktor kedua berupa empat taraf konsentrasi glutamin yang ditambahkan kc Warn medium kultur, yaitu 0, 200, 400 dan 600 mgl 1 medium kul-
tur. Di samping itu dicobakan juga pemberian glutamin pada konsentra-
-
si 0.5 5.0 mg/l dengan konsentrasi sukrosa 60 g/l medium hltur. Sebagai medium kultur dipilih medium MS. Ke dalam medium ditambahkan NAA sebanyak 0.1 mg/ 1, BA sebanyak 2 mg/l dan agar sebanyak 6 g/l.
Keasaman medium sekitar 5.8 sebelum disterilkan.
Manyak 6 ml medium kultur dituangkan ke dalam tabung kultur berukuran 1 x 16cm dan ditutup dengan kertas aluminum. Medium disterilkan dalam autoclave pada tekanan sekitar 15 psi selama 25 menit. Bunga yang berukuran panjang 4.5
-
5.0 mm setelah disimpan
selama 48 jam pada suhu 10% disterilkan dalam larutan clotox 25 persen selama 25 menit.
Anter dikeluarkan dari bunga dan dimasukkan ke
dalam &bung hltur. %bung kultur d i t e m p a h pada rak yang mendapat penyinaran 16 jam terang dan 8 jam gelap dari dua buah lampu tabung 40 watt dengan jarak v d ) ; a l 50 cm dari dasar rak. Tiap perlakuan terdiri dari 5 tabung dan diulang empat Mi. Suhu ruangan berkisar antara 3 1 OC pada siang hari dan 26'~ pada malam hari. Pengamatan dilakukan selama tiga bulan. Unsur unsur yang diamati meliputi perubahan wama dari anter, jumlah anter yang berhasil tumbuhlberkembang, bentuk pertumbuhanlperkembangan dari anter dan morfologi bentuk pertumbuhanlperkembangan anter.
Analisis data bantitatif disesuaikan dengan rancangan percobaan
dan keadaan data.
&aan
7, Pengaruh Masa Prakondisi Kultur terhadap Pertumbuhan dan Perkembangan Anter dalam Kultur.
Suhu dan siniu mempunyai pengaruh terhadap inisiasi pertumbuhan dan perkembangan kultur (Sunderland dan Roberts, 1977; Rush, 1981; Huang, 1987). Dalam percobaan ini akan dilihat pengaruh masa prakondisi Crhadap pertumbuhan dan perkembangan anter dalam kultur. Anter yang baru dihlturkan disimpan pada suhu prakondisi kultur 15"
C selama satu , dua, tiga dan empat minggu. Selama masa prakondisi kultur berada dalam keadaan tanpa sinar. Sebagai medium kultur dipilih medium MS dengan konsentrasi gula sebanyak 60 g/I, agar sebanyak 6 g/1, NAA sebanyak 0.1 mgll dan
BA sebanyak 1 mg/I. Keasaman medium ditentukan seicitar 5.8 sebelum distetilkan. Sebagai wadah medium digunakan botol bulat volume 50 ml yang diisi 8 ml medium dan ditutup dengan kertas aluminum. Medium disteriikan dalam autoclave pada telcanan 15 psi selama 25 menit. Bunga yang berubran panjang 4.5
- 5.5 mm diberi praperlakuan
dingin 100 C selama 48 jam. Setelah disteriikan dalam larutan clorox 25 persen selama 25 menit bunga dibilas dengan akuades steril dan anternya dikeluarkan. Tiap b o l kultur berisi satu anter. Tiap perlakuan terdiri dari 20 botol kultur dan diulang dua kali.
Setelah mengalami perlakuan prakondisi kultur dipindahkan ke atas rak yang mendapat penyinaran selama 16 jam sehari.
Sumber sinar
berasal dari dua buah lampu tabung 40 watt pada jarak SO cm dari dasar rak. Suhu ruangan kultur berkisar antara 26 - 300 C. Pengamatan d i l a k u h selama tiga bulan.
Unsur- unsur yang
diamati meliputi perubahan warna dari anter, jumlah anter yang berhasil tumbuhfberkembang, bentuk pertumbuhanlperkembangan dui an& dan morfdogi bat& pertumbuhanlperkembangan anter.
& w b a a n 8,
Pengaruh Umur Kalus dan Komposisi Medium Kultur terhadap Pertumbuhan dan Perkembangan Kalus.
Efektivitas pengaruh lingkungan terhadap pertumbuhan dan perkembarrgan sel hanya m u w n dapat dilihat pada sel-sel yang masih muda dan aktif tumbuh.
Dalam pe&aan
ini dilakukan pemindahan
kalus dari berbagai umur ke dalam medium pindahan. Ke dalam medium pindahan ditambaMPn berbagai bahan anorganik atau organik tang dilumpkin mampu nrengubah pola pertumbuhan dan perkembangan kalus
Ice arah ~
e
g t;anaman. d
Katus berasal dari anter yang ditumbuhkan dalam medium MS h g a n konsenltasi sukrosa 60 gll, agar 6 gll, NAA 0.1 mgll dan BA 1 mg/l.
Kalus dipindahkan dalam keadaan utuh ke dalam medium MS
dengan 0.1 mg/l NAA, 2.5 mgll BA dan 30 gll sukrosa dan ditumbuhkan dalam kondisi penyinaran 16 jam sehari. Dicoba juga pemindahan kalus
ke dalam medium MS dengan berbagai bahan tarnbahan. Sumber cahaya
berasztl dari dua buah lampu tabung 40 watt yang terletak 50 cm di atas
dasar rak tempat payimpanan kultur. Suhu ruangan sekitar 30% pada siang hari dan sekitar 26% pada malam hari.
Faktor yang diamati
adalah laju pertumbuhan dan perkembangan kalus.
3. R e g d , AMimatisasi dan Evaluasi 'haman Hasil Kultur. Bnas ganda yang terbentuk dari anter dipindahkan kc dalam medium MS dengan tambahan auksin NAA dan atau sitokinin @A,2iP)
pada berbagai konsetrasi. Planlet yang telah berakar dipindahkan ke dalam medium pasir dan ditempatkan dalam ruangan. Setelah dua minggu tanaman dipindah ke medium campuran tanah dan kompos dalam kantung plastik dan secara berangsur-angsur diaklimatisasikan ke tempat yang terkena sinar matahari. Setelah cukup besar tanaman dipindah ke dalam medium campuran tanah dm kompos dalam ember plastik dan
ditempatkan di rumah kaca. Pemeriksaan hdungan solasodin buah dilakukan dengan menggunakan alat HPLC. Fertilitas polen ditentukan dengan metoda pewarnaan
memahi pewarna tetriwlium atau acetocarmine. Perkecambahan polen dilakukan dalam larutan sukrosa 30 persen yang ditambah asam borat. Pemeriksaan sitologi dari kalus dm polen dilakukan dengan metoda squash memakai pewarna acetoorcein atau acetocarmine. Metoda irisan
digunakan untuk memeriksa anatomi kalus.
