LAPORAN AKHIR PENELITIAN RISBIN PIPTEKDOK 2011
Deteksi Mutasi Nucleophosmin (NPMJ) dan Hubungannya dengan lmmunophenotyping dan Sitogenetik pada Pasien Leukemia Mieloblastik Akut (LMA)
Nama Penyusun Laporan : DELTA FERMIKURI AKBAR
Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia Jl. Salemba Raya No.6, Jakarta Pusat
2012
--
� ===
:r.
-
'="='=--
KEMENTERIAN KESEHATAN
BAD;\N PF.NELITli\1'\ DAN PF.NCiFI'viAAN GAN KESEHATAN Ja1an 1\·n·. t�. tak.:m '.:�,:!!:lr:l Nt' 29 l . �1karla lOShO Knlal.. Po� 1 �2(, J"d,•p,>n: (().�I) .J!I.j Ol'K l':!kSIUHk: (II:!\ ) C.J.l<J.\.1 F·mad. .��:-.han
l\l�PUTLI:-)1\N J<�:I'ALr\ HI\Di\N PI�NEUTLi\N D.l\f\ l'I•:Nt�EM!3l\N{1i\N hi·:St:IIATi\N NOMOI�· l ll\
tl:\li.J " / I i 39?/.!011
PI::N ETAI'i\N TIM I'I·;Ltd--:SAN.i\
l�l�ET I'I':M IIINI\AN II.MU I'�:N(>I·:.Ti\llllt\N IJ/\N Tt:I\NULU
Mt..·ttinl\lctitg
a. l>ah\'<1 llt l \ uL llli'JHngk:tlk.m k;t pasi tus pcn<"lit tnn d:1n
pcn�.!;<"llih�Ing_�tn d1 hldang k<.·st·�EHl�H1 pct�Ju dilal,u kHn
P•'mtntt;\,ll\ k<"p
l>nhw;t pt•lt'llsi
dala111
l't'Jili>tll
pem bm aan
nH1gka JHttd.l
p('ndit1
p<"·rlu
1\·ng<'l<>hLWI\
illlltl
tll<'lll!,gHll
cLnt
Riset
dibkulwn d
Tcknologi
l\1·dok Lt'r; 111.
e.
hnh\\'tt
hvrd�tsurk(.ttl
dnn; 1ksud
p i!d"
hunt!
pt:rtitnbang;ln cbn
a
lJ
Badan
st'1Jtlgairnnn.._,
di t ct;qJI
(Wrlu
l'nwlttian
d
PPtlg�·nlb''''g.tn h,l'St'hal�.�n �·· tt \ :l tlg Pt•tntk·ntukr1n TtJIJ f'd
<111;1
1-/tsc·t l'l'mbin<�
T•·!"H>logJ 1\cdol,t era 11 1\1 hun 201 I . M�,."'l!��ill���'l
\.
l'nd,,"g llnda!t;>. �isll'l\1
l'l'tltT< 1 p
I.Lnnb;n·wl Nt>nlllt'
N<>m(lr
N<�sion<>l
X·L
llmu
Rcpul.>lih.
'1\lmb:rhdll
l\•·sdtai
"icHJH!I
(i,•·nd);tLIIJ
1l'ntang
l't·ng<'I'Jlh
:1h
N q�at·n
Ncgnra
l ah tlll
'1\thun
..!Otl'l
.J00'2
Rt'JHtb!ik
lOOlJ
1-1-1. 'l'alllbah:�11 Lnnl>:1mn Nq�:�t·a Nmn or
chin
Tckt10logi
thn1
Indonesia tahun
l.•·mb;lt-mt
i!ldtJtl•·si;• t\iot!!O!' L'IU)·.
.WOJ
t;llnlll
t>c·ng,.:tn huu 11
Nq•.aril
.!. llnd" ll;.( Und.n1g
IX
f'c·nt·litwn.
tcnt:llli!, Notnor
SOld);
:3. l'tT1 ,\1·l T
!�cvubilk
'l':m;buh:lll
lndo11l'si:'
L<'tllh:•r•"'
Nonu;J ,hl(lq}:
t->hun
Nq�an•
IL)q;,
!{<'j)Lil>lik
Nomor t>7. lndmwsia
KEMENTERIA� KESEHATAN
BAOAN PENELITIAN DAN f>EN<JEMB/\NCiAN KESEH.ATAN Ja{an l)'l�rc�l�Jl...an N4..·g�1ra ,r, �q Jalarra I O:'i60 Kt..l(:lk Po� t�26 _ Tdepon. 11121) �.:hi OX� Lok,Hnik II(' I) -���.\9.\.1 F·tlltli/: ><:�lxm(ulitt>ang.
Pen\ e!cng_l!_nn ..hHl
lL't1l,.1ng f'L'ndit mn
1\otlrditwsi f'{'ngcmbnngan
dan
Ko·sehnL\11. :>.
Pcratttr "''
fVlo·ntcn
1\t·s.-lwtan
I ':)7:'>i Metok c './ l't't I XI! lOU:>
Nomm·
I' '
t:nrg�:!l
Nop<'t n lw r·
2Ulk> ILill:mg CJn.>_
1�1
PL-ruttormo
diubah
Lelah
�t'l>agaim
k c ng
Nomor
1\eso·hal;tn
M<'tti<Ti
I i·I"'/Mt·rlkt'"/l'n/\'111/2010 lt'tl l;t n g Oq.;<·JJtis:Jsi dart
Tnta 1\tT )'I [,<·r1tt'tll<'n,lf1 l\('s.-lwt:Jt1 1�1;
Metwtapkan hl·S:llll
1'1·:1\ET.'\I'i\N Tll\-1 I'I�L/\I,SJ\Ni\ I(ISC:T Pl�MBIN/\1\N ILMU
I'ENW·:Tr\ I l l I i\ :'!
Ill\ N
Ti\lll'N )()I i;
KEIH li\TrSRi\ N
Tl·:l\NOLOC I
Ri :-w t l'•·mlJtn:wn lltnu l'<"ngcr:dllW!l dan
Tim Pdnks:111<1
T<'krllllo�:r l"·doktn:tll Tnhtm .W J I lsdai!Jlllll� :t
fpt(·J,d�)h.
_l() i l) st·bdg:Hn):n1;t IPrcctnl urn d:ll:-nn
Lunpn-dn kl·purusc\1! Hit LllTitlg:is;
l. Ml'l.1ks:m:oknn jWIH:ltlHm s<'Sll:li luoi(bh ilmi:d1 rl:tll l'tika dl'ng;Hl wnktu vang tc•!ah
2. l\t'fernpl'r-t�lngt�un�i(I\cl11kall
pt·n.t;,t;unann
S\'suai fJ
ung�drcll1
3. M,·mblr;tt tbtr nu'll)'-11Hp:tik:tn l�tpora 1 1 kc·tnajU
4. Mo·mln 1< ol
ringk<1s;n!
pt·rwl!t.i
:-wl>:•g
di.SL'ktttif bahan
bl-rdasarkan
m:lslll·wn
basil
k<·pa , la
pl·nguml,ol:ttl kc·pulu�
lLTkiHI dcng:111 hasif jW\Wli 11<111: l\l'1ign
Tim
Pl'laksana
d imak suci
f�Jsbn;
lpit'kcluk
.!0 I I
pad,t dwtum k•·du:t diht-riknn
S<'iJ: l��; litl!Hll:l fitHHH- SC�U�1i
•
1)11lnlll mt'iilk!'
J>cln ksa na
!�rshin
lp�t·ktlok '.Zll 11 lwrpt·doman pnd:l pt·mttJr:tn p\'nllldfmg
�tnddn�:tn , :111.� bvrlclku; _
KEMli:NTERIAN KESEHATAN 13ADr'\N PFNELIT!/\N Di\N f'I:NGHv1UANGAN KESEHATI\N Jabn 1\.�n..-�lakan !'.t.�g;�n.' N'-) 2l) Jakarta I O�bfl Kntal� Po� f'2�6 Tdcpon: (0� I> -I�C>IO�l' I "k""llk. (Oc l)-12-l.\9.1_1 F-muil. .s�c.;han1.0 lith:mg depkL's.p.o.id, H(·h•:it,·· lutr:r·\\ \\w.!ithang.dcpi,L':-...go.id
Palam nwL-d S < ilttal-"11\ 1\lt�
f><-rkonsultn,;i dan
tlnp:ll
bnkoonlin;�si
ckngan Tim !\mel l'ak ilr dan Tim Pengl'lnlu .1\drninistr;�si 1-1tsbm lptd<.dnk:
f��
l pt l' kt ! ok
2U I I dib<'i>
DIPA Sckr.'IH!"i;tl 11ad:m Lilh<�ngkcs Nomor
!lbSJ/024
l)t'Tigttn
h.t'p�llllS
1 1 . 1 . 0 I ! 00/ JO I I :
h�TLrkUtl�d
l\t._'plttliS'-Itl
llti, tllak:l
1-\ep:tla 13
l'innl
tcn!;ll1!-:. l'ctH'I:lfXIll Tim l'd
da11
Tcknolo.o.;i
1-\edokt<-r"n
Tahun
}(lHJ
dim<>t<�k:m tub!; hnlai-;ul:tt�i: f..:q>ltll!S:!tl lks<·mbt.T
lfll
i>n!:lklt
Sl'_jak
ditl'L!pbt!l
S
Jj
.>() ll. dcngan k.-tcntuan ap:1bib dikl·rnudiw1
__
h:1ri !enl\.tt:l tcrd:1p:>t
kcb·lint;ul dalam k epul u s n n ini
d,qml diLt k uk
di .J .,knrt;�
l'dd;t latl!!,g:d
I 9 . Januan J.O I
\ld·�l'l\U\
B/\tlf\N l'EN!•;LJTlAI\: Dt\N
··j l'I•:N<;EMI1ANU\N \.!o,SEI-!AIAN.
i
1)1
d1
/
/
.y;lll"ll".
MSc
t\11'. 1'):1 �\).JI··� I()X0111001
T,·mbusnn:
I. Mc·ntt:n Kcsdmwn !�cpu bilk It ltf.,tWSt:!,
1. !-kkrl"l aris .lendna! l.;c•mt·ntt-rintl l"·s•·hiliilll:
3. lnspd
·I. h:cpala Eunlor l>l'laynnun Pcrb....·nci<Jhnraun Nq:�<�r:t . Ia k:n·1 <-1 V:
:'i. PcjabaL Pcmbw1t 1\omitmcn Risbtn lptt·kduk;
''· lknduhara f>t·ngdmJr<•n l3
rp
LAMPlRAN KEPUTUSAN KEPALA SADAN LITSANG KESEHATAN
NOMOR : HK.03.06/11 �93 12011 TANGGAL: 19 JANUARI 2011
NO
PEII/ELITI1
INSTANSI
PENELITI2
FK UNIVERSITAS ANOALAS, PADANG
PENELITJ 3
STAF ADMINISTRASI
ANGGARAN
JUOUL RISET
(Rp.)
i<
�!orwig car An! as • G�n !'·ty L.iS!er c; A� -::an- ;:::ka P:,;'-z; -:i' f·IISc
Lr"';:tSft� dr
Sya��,z:;.
P. SSos ·-/:M
'T'• ':l'"':IC:,O�o�e-::;ot. i'e..:.•;J"C ' P::;.;e.,, --S<..=:trclis!n •LLO· -,e-b aga Modei Te;J)e.l B o:o\j. :.;·"!adsf; .:nfei-:s•
.d.-1 a�·, :J·:Jc
,·�1 fl...-bf'CJI���!ii
U; ;:J;:!j.:t•'lt9;S
To::friz� fJ'
r.H·o-r��a�id6 � K�1e!rijaf G�f.S�
Benr;g Kars·:"!·�·-.;: t.l;M·.., a:e -Jer-g�"' t.:�t:;:(i!
Ms:.•narc· Afi·r r..1s- M�:; So:.>.A
ot·.·�r�� T.. $1&"�'1:;:tasePC� \lbrrmac·oO!r �a'l
!15.: •74 c:c-
�1�:�C!S 'I'''L.JfC'l sr�.'· ''· 1 0 AE j;J o�d!: �O'lr.
�:�/���� .? �; ,:�:��:� � ��C�I��� ���;;: ;:� ;R r:s;u�
Yt:fl;��· r��--J•.;1:cr
:v
.;:-.�P
ErJr5on d· r-!.Ph'
S;·�'r .:<1-
f..
'33�s <'�1'yl
H•-Cr.;"'O::.(!"
;.J¢l:J P<Jr·;'-':;;i:�C:" �-!:5 S��"!S •jar I(_ 1'·".;,
�� ·
l ' :) � t; ·
.
: �,, 9-"'':'!.C,00
�
FK UNIVERSITAS INDONESIA, .JAKARTA
De ta
F;:r·n ...i.:r: J..,;t_.a� SSr
�t w� a:1
'-!.l"�2 S r c ·
o• S;e:Pr(
lr.ca',··��a� O·a
D��..:�:.: f·,\:ta:>: N-ec•eQor·o;s..... . r. .t�•;.l/'1 :;::;-;·1 !�.J:::..... ·'l(
:Jo 2;�.o: ·:
�e"'gf; l"''"•t:ar95T S·s:e:·� ;:.e ..cate�o:� !-,'.-;Vl:(ls s�
E"
Rtl Wer·r:i·k�-!Jnr P'.rtr SS�b
.:.:.•c;a Mil�sida SS
S•�Ctoloo::,;i;.; COB t:C!': HeN(;r. Co:;: .1 ::.a5:a lmt..�r•: !;i�S
0::€-�g.w He·�.ag!Jt:.·�::-, �HA1 V•r·JS 1r.' L,J;nz(l r-i!!N 1 d
·
it-.3 :...:} ·:;i)G
rl\Nl 20�r;
6
N'"''"t D';�l"' ltlt;·;,sa· d'
��P<
Pel·rar� Drr'il;a.>te:rt. d·
P aa
Fi:KI(;' yar1g 8er;::t-rsn da;ar·, Pen3.Jt=Jran -t-tep�·IJ � .,Or:-nr;or e'l t ,l r 6eSI !:·t1�J� tr�:; 0�·�1�80 P.c-r;:;r GO� 15 dar !•)fe;,�, HE!r.:;H;U:!. C
S'.rc:elo.tr
128 t.-� ; OC:'J
.
Trara A--:r.,cr�r.� dr 5pS
t\.:r l:e Morgyai' :""�qs
!��nlic;'l Syam�urr.3wc!- d· PhD
� .u.��:J�:
li ;;;:r"'.Oatiin Hecar!l"! 1ert'aCc:.c l r5S.J� Fac.:�r tl8t1
Fecto"
P;>,R>:> 1017
Fa
Vi:i'SCU·C' EPCo!rP.f·�· GrC".r·i� fc:cto· met.aliJ TssJe tn •..,ay lr.� cn�r d
..;�ru�gi!r Men.ng10T'a
l-:)1.4.�5.UDCI
KATAPENGANTAR
Puji riset
dan
syukur ke hadirat
Deteksi
Mutasi
Allah
Subhana wa Ta'ala atas berkat dan rahmat Nya,
Nuc/eophosmin
(NPMJ)
dan
Hubungannya
dengan
Immunophenotyping dan Sitogenetik pada Pasien Leukemia Mieloblastik Akut (LMA) telah dapat dilaksanakan dengan dukungan dari dana RISBIN IPT'EKDOK 2011. Kami berterima kasih kepada seluruh pihak. yang telah memberikan bantuan moril dan materiil agar terlaksananya riset ini, seluruh panel pak.ar panel
HI
atas segala masukan
dan bimbingannya, Badan Litbangkes, Poliklinik Hematologi Onkologi Medik RSCM serta Timja Hematologi Onkologi RS Kanker Dharmais yang sangat membantu dalam penyediaan sampel,
dan
rekan-rekan sejawat di laboratoriwn Biologi Molekuler Divisi
Hematologi Onkologi Medik llmu Penyakit Dalam FKUI/RSCM, Departemen Patologi Klinik RS Kanker Dharmais serta Laboratorium sitogenetik Divisi Hematologi Onkologi Medik Ilmu Penyakit Dalam FKUIIRSCM yang sangat membantu dalam pengerjaan sampel dalam penelitian ini. Kiranya basil riset ini dapat memberikan data mengenai frekuensi teijadinya mutasi gen NPMI pada pasien LMA di Rumah Sakit Cipto Mangunkusumo dan Rumah Sakit Kanker Dharmais. Penelitian lini masih akan dilanjutkan sampai jtunlah sampel tercapai dan
kami berharap hasil yang diperoleh dapat digunak.an sebagai data epidemiologi mutasi
NPMJ pada pasien LMA. Akhir kata, kami mohon maaf atas segala keterbatasan yang terdapat dalam laporan mt.
Segala kritik dan saran untuk pengembangan dan penyempurnaan riset ini sangat
diharapkan.
Jakarta, 13 Februari 2012
Tim Riset
RINGKASAN EKSEKUTIF
Deteksi Mutasi
Nucleophosmin (NP Ml) dan Hu bungannya dengan lmmunophenotyping
dan Sitogenetik pada Pasien Leukemia Mieloblastik Akut (LMA)
Delta Fem1ikuri Akbar
Leukemia Mieloblastik A.kut (LMA) adalah suatu penyakit yang ditandai dengan
transformasi neoplastik dan gangguan sel-sel progenitor dari seri mieloblastik. Di negara maju seperti Amerika Serikat, LMA merupakan 32% dari seluruh kasus leukemia. Penyakit ini lebih sering ditemukan pada dewasa (85%) daripada anak-anak (15%). Di Indonesia belum ada data LMA
secara nasional, namun berdasarkan hasil kunjungan pasien kanker
ke Rumah Sakit Kanker Dharmais pada tahun 2007, leukemia menempati
urutan ke - 8 dari
semua jenis kank.er, dengan kasus LMA sebanyak 32% dari 62 kasus leukemia. Sedangkan di RSCM, jumlah pasien LMA yang berkunjung ke poliklinik hematologi-onkologi medik Departemen Ilmu Penyakit Dalam, berkisar 18 pasienltahun (data poliklinik tahun 20062008).
Leukemia Mieloblastik Akut (LMA) merupakan penyakit keganasan darah yang sangat heterogen berdasar karakteristik biologis dan klinisnya. Umumnya LMA mengenai sumsum tulang namun pada beberapa kasus dapat mengenai organ lain seperti hati dan
limpa. Oleh karena itu penanganan pasien LMA bergantung pada informasi lain seperti subtipe LMA, usia pasien dan hasil laboratorium lainnya. klasifikasi subtipe LMA yaitu klasifikasi terbaru
Saat ini dikenal dua sistem
French-American-British (F AB)
World Health Organization (WHO).
dan klasiflkasi
Selain itu gejala klinis yang bervariasi
berhubungan dengan abnormalitas genetik yang secara spesifik teridentifikasi dalam LMA
nampaknya berhubungan dengan prognosis yang spesifik.
Berdasar hasil sitogenetik ,
kelompok prognostik dibagi m enjadi tiga kelompok risiko: baik, menengah, dan buruk. Prognosis yang baik ditandai dengan adanya t(8;21), t(15;17), inv(16) atau t(l6;16), dan kelompok prognosis buruk ditandai dengan adanya kariotipe yang kompleks, -5/del(Sq),
-7. Kelompok pr og no si s menengah tidak memiliki kelainan kariotipe spesifik dan sekitar 50% biasanya menunjukkan kariotipe yang normal. Penemuan
sebelumnya
molekuler baru (seperti
pada
penelitian
FLT3, NPMI, CEBPA)
LMA menunjukkan adanya
penanda
ditemukan pada kelompok prognosis
menengah dengan kariotipe normal.
.ak an
merup
Mutasi gen
nucleophosmin (NPMI)
ekson
12
perubahan genetik yang paling sering diketahui pada pasien LMA dengan
kariotipe normal. Insidensi mutasi
NPMl
meningkat berdasarkan usia, 2.1%-6.5% pada
LMA anak-anak dan 25%-35% pada LMA dewasa.
Hal tersebut menunjukkan bahwa
insidensi LMA lebih tinggi pada dewasa dari pada anak-anak. Mutasi tipe A muncul sebagai
mutasi
yang
paling
umum
.
pada
LMA
dewasa
dengan
kariotipe
normal,
mengandung duplikasi tetranukleotida TCTG pada posisi 956 sampai 959 dari sekuen referensi (GenBank accession number NM_002520). Kerusakan NPMl , baik oleh translokasi kromosom maupun mutasi, menghasilkan dislokasi sitoplasmik dari NPMI. Frekuensi yang tinggi dari mutasi
NPMJ
denga.n
kariotipe normal dan observasi bahwa NPMl sitoplasmik tidak dapat berfungsi secara normal sebagai mutasi
NPMI
binding partner
dan protein transporter mengarah pada hipotesis bahwa
mungkin menjadi kejadian awal dalam leukemogenesis.
menunjukkan bahwa pasien dengan mutasi dengan kesintasan yang tinggi.
Adanya mutasi
respons yang baik terhadap terapi. Mutasi mendeteksi
NPMl
minimal residual disease
(MRD).
memiliki prognosis yang lebih baik
NPMJ
ini juga
Sejumlah studi
pada LMA berhubungan dengan
dapat digunakan sebagai penanda untuk
Oleh karena itu, analisis mutasi
NPMJ
muncul sebagai langkah baru dalam diagnostik/prognostik pasien LMA dengan kariotipe normal. Insidensi mutasi
NPMI
bervariasi di setiap negara.
secara
keseluruhan dan
NPMI
tipe A pada pasien LMA
Banyak data dari negara barat dan negara maju asia seperti
Jepang dan Thailand sebagai pionir ctalam melaporkan insictensi mutasi
NPMJ
pacta
populasi etnis mereka. Saat ini belwn ada penelitian tentang mutasi
NPMI
pada populasi
Indonesia, sehingga belum ada data dan laporan mengenai mutasi
NPMI
pada populasi
orang Indonesia. Di samping itu, data mengenai gambaran jenis leukemia berdasarkan •
klasifikasi MIC-M sesuai klasifikasi WHO pacta populasi Indonesia juga belurn pemah dilaporkan. Mengingat lndonesia merupakan negara multi-etnik, maka perbedaan etnis di Indonesia dengan negara Asia lainnya seperti Jepang dan Thailand memungkinkan adanya variasi tipe mutasi baru dari NPMJ. Berdasarkan penelitian oleh Falini et al. (2006) tentang mutasi
NPMJ
menunjukkan
bahwa tipe A hadir dengan frekuensi paling besar yaitu 80.5%, tipe B 7.5%, tipe C < 1%, dan tipe D 5.5%. Oleh karena itu, untuk skreening awal kami mendeteksi mutasi NPMl tipe A menggunakan teknik
an Allele-Spesific Oligonucleotide
Ul
(ASO)-RT-PCR. Karena
mutasi
NPMJ merupakan heterozygous mutation, maka hasil ASO-RT-PCR positif, tetapi
dengan pita yang tipis, akan dilakukan semi-nested ASO-PCR untuk mernastikan tidak adanya
positif palsu
pada
hasil RT-PCR. Sedangkan
hasil
ASO-RT-PCR negatif
selanjutnya disequencing untuk: mengetahui tipe mutasi lainnya. Tujuan secara umum dari penelitian mutasi
ini adalah untuk mengetahui karakteristik
nucleophosmin (NPMJ) pada pasien LMA dewasa di fndonesia. Secara khusus
tujuan penelitian adalah: 1.
Untuk: mengetahui frek:uensi kejadian mutasi
NPMJ tipe A dan tipe lainnya pada
pasien LMA dewasa di Indonesia. 2.
Untuk mengetahui hubungan mutasi
NPMJ dengan gambaran immunophenotyping
pada pasien LMA dewasa di Indonesia. 3.
Untuk mengetahui hubungan mutasi
NPMJ dengan gambaran sitogenetik pada pasien
LMA dewasa di Indonesia. Pada penelitian
NPMJ tipe A sebanyak mengalami mutasi.
ini karni mendapatkan 34 subjek pasien 8 subje� mutasi
LMA. Dengan mutasi
NPMJ tipe lainnya tidak ada, dan 26 subjek tidak
Berdasarkan dari basil tersebut, didapatkan frekuensi mutasi
NPMJ
tipe A sebesar 23,53%. Terdapat hubungan yang bermakna antara NPMJ dengan berbagai variabel yaitu CD13, CD?, CD34, CD33, HLA DR, CD14, CD117, dan kariotipe. Terdapat 6 sampel dengan mutasi hanya 1 sampel dengan mutasi
NPMI yang mengekspresikan CD34 dam HLA-DR dan
NPMI yang memiliki kariotipe normal serta tidak terdapat
metafase pada 12 sampel. Masih banyak kekurangan dalam penelitian ini, maka diperlukan pengumpulan sampel yang lebih banyak lagi agar data yang diperoleh benar-benar dapat dipecaya. Selain itu, perlu pengulangan pembuatan kariotipe pada 12 sarnpel yang tidak memiliki metafase agar hasil sitogenetiknya relevan dan dapat dipertanggungjawabkan.
IV
ABSTRAK
Mutasi gen nucleophosmin (NPMJ) ekson 12 merupakan perubahan genetik yang Insidensi mutasi
paling sering diketahui pada pasien LMA dengan kariotipe normal.
NPMJ pada LMA dewasa sekitar 25%-35%. Mutasi tipe A, yaitu duplikasi tetranukleotida TCTG
pada posisi 956-959, merupakan mutasi yang paling uinum pada LMA dewasa
dengan kariotipe normaL Adanya mutasi NPMI pada LMA berhubungan dengan respon yang baik terhadap Mutasi ini juga dapat digunakan sebagai penanda untuk mendeteksi minimal
terapi.
residual disease (MRD). Oleh karena itu, anal isis mutasi NPMl muucul sebagai langkah baru dalarn diagnostik/prognostik pasien LMA dengan kariotipe normal. Hingga saat
ini
belum ada penelitian mengenai mutasi NPMJ pada populasi
Indonesia, sehingga belum ada data dan laporan mengenai mutasi NPMI pada populasi orang
Mengingat
Indonesia.
Indonesia
merupakan
negara
multi-etnik,
maka
memungkink.an pula keberadaan variasi tipe mutasi baru dari NPMl. Pasien dicurigai LMA mengisi informed consent dan selanjutnya diarnbil sampel sumsum
tulang
dan
darah
tepi.
Sampel
kemudian
dipreservasi,
dilakukan
immunophenotyping, sitomorfologi, dan sitogenetik. Sampel diperiksa mutasi NPMJ tipe A dengan menggunakan teknik
ASO-RT-PCR, basil negatif dilanjutk:an dengan
seminested-ASO-RT-PCR. Untuk mengetahui mutasi NPMJ tipe lainnya dilak:ukan PCR ekson 12 dan selanjutnya direct sequencing. Dari 34 sampel, didapatkan mutasi tipe A sebanyak 8 sampel, dan normal sebanyak 26 sarnpel. Terdapat hubungan yang bermakna antara NPMJ dengan berbagai variable yaitu CD13, CD7, CD34, CD33, HLA-DR, CD14, CD117, dan kariotipe. Terdapat 12 sampel yang tidak memiliki hasil sitogenetik karena tidak terdapat metafase. ,.
Kata kunci:
Nucleophosmin, NPMl, ASO-RT-PCR
v
DAFTARANGGOTA TIM PENELITI
I. Peneliti Utama
:
Delta Fermikuri Akbar, S,Si.
2. Peneliti Anggota
:
dr. Lyana Setiawan, SpPK.
VI
DAFTARISI
Halaman KATA PENGANTAR 11
RINGKASAN EKSEKUTIF
v
ABSTRAK
VI
DAFTARANGGOTA PENELITI
vii
DAFTARISI
lX
DAFTAR TABEL DAFTARGAMBAR
X
DAFTARLAMPIRAN
Xl
I.
PENDAHULUAN
II.
TIN.JAUAN PUSTAKA
III.
I
11.1.
LEUKEMIA MIELOBLASTIK AKUT (LMA)
11.2.
NUCLEOPHOSMIN (NPMl)
3
11.2.1. Struktur NPMl
4
11.2.2. Kelainan Gen NPMI
6
11.2.3. Mutasi Gen NPMJ Pada LMA
7
TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN 111.1.
111.2.
TUJUAN 111.1.1. Tujuan Umum
9
ill.1.2. Tujuan Khusus
9
MANFAAT
9
IV.
METODE PENELITIAN
IV.l.
DESAIN PENELITIAN DAN POPULASI PENELITIAN IV.2.
TEMPAT PENELITIAN
10 10
Vll
IV.3.
KRITERIA INKLUSI DAN EKSKLUSI IV.3.1. Kriteria Inklusi
10
IV.3.2. Kriteria Eksklusi
10
IV.4.
JUMLAH SAMPEL
10
IV.5.
TEKNIK PENGUMPULAN DATA
11
IV.6.
PROSEDUR PEMERIKSAAN IV.6.1. Persiapan Sampel IV.6.2. Pemeriksaan
v.
VI.
11
lmmunophenotyping
11
IV.6.3. Pemeriksaan Sitogenetik
12
IV.6.4. Pemeriksaan Mutasi Gen NPMJ
13
IV.6.5. Analisis Data
14
HASIL DAN PEMBAHASAN V.l.
HASIL
15
V.2.
PEMBAHASAN
26
KESIMPULAN DAN SARAN VI.l. KESIMPULAN
30
Vl.2·. SARAN
30
UCAPAN TERIMA KASIH
31
DAFTAR PUSTAKA
32
LEMBAR PENGESAHAN
•
Vlll
DAFTAR TABEL
Hala man Tabel l . Klasii f kasi LMA berdas arkan FAB
3
Tabel2. Kelainan NPMJ pada kan ker manusia
6
Tabel 3. Frek:u ensi mutasi NPMJ
21
Tabel4. Basilimmunophenotyping, sitogenetik, dan mutasi NPMJ
22
Tabel5. Hubungan beberapa variabel dengan NPMJ
26
IX
DAFTARGAMBAR
Hal a m a n G a mbar 1. Struk.tur NPMI dan domain fungsionalnya
5
Gamba r2. Me kanisme perpindahan NPMI wild-type (NPM1 wt) dari sitoplasma ke n u kleolus
6
Gambar3. Bagaimana kelainan gen NPMJ berkontribusi terhadap tumorigenesis
7
Gambar4. Visualisasi NPMJ tipe A hasil amplitikasi ASO-RT-PCR
15
Gambar 5. H a sil ele ktroferogram sampel de ngan mutasi NPMJ tipe A
16
Gambar6. Hasil analisis BLAST sampel dengan mutasi NPMJ tipe A
17
Gambar 7. Visualisasi NPMJ tipe A hasil amplifikasi semineste d-ASO-RT-PCR
18
Gambar 8. Visu alisasi NPMJ ekson 12 hasil an1plifikasi RT-PCR
19
Gambar9. Visualisasi gel polia kril amid NPMJ ekson 12 h a sil arnplifikasi RT-PCR
20
Gambar 10. Kariotipe abnormal dari subjek dengan mutasi NPMJ tipe A (44,XX,-1 , -17)
21
"
X
DAFTAR LAMPIRAN
Halarnan Lampiran 1 . Personalia Penelitian
35
Lampiran 2.
36
Posisi Primer untuk ASO-RT-PCR NPMI tipe A
Lampiran3. Posisi Primer untukSeminested-ASO-RT-PCR NPMJ tipe A
37
Lampiran 4. Posisi Primer untuk RT-PCR NPMJ ekson 12
38
xi
--
iifiiTic.!:.:I:"Jiiili ii!i!li&'l:i!i31iUii�- ---·
---- - - ----- -
- -
--..:....!! � --
-
-
BAB I PENDAHULUAN
Leukemia Mieloblastik Akut (LMA) adalah suatu penyakit yang ditandai dengan transformasi neoplastik dan gangguan sel-sel progenitor dari seri mieloblastik.1 Di negara maju seperti Amerika Serikat, LMA merupakan 32% dari seluruh.kasus leukemia. Penyakit
2
ini lebih sering ditemukan pada dewasa (85%) daripada anak-anak ( 15%)_ Di Indonesia belum ada data LMA secara nasional, namun berdasarkan hasil kunjungan pasien kanker ke Rumah Sakit Kanker Dharmais pada tahun 2007, leukemia menempati urutan ke-8 dari semua jenis kanker, dengan kasus LMA sebanyak 32% dari 62 kasus leukemia. Sedangkan di RSCM, jumlah pasien LMA yang berkunjung ke poliklinik hematologi-onkologi medik Departemen Ilmu Penyakit Dalam, berkisar 18 pasien/tahun (data poliklinik tahun 2006-
2008). 3 Leukemia Mieloblastik Akut (LMA) merupakan penyakit keganasan darah yang sang at heterogen berdasar karakteristik biologis dan klinisnya. 2 Umumnya LMA mengenai sumsum tulang namun pada beberapa kasus dapat mengenai organ lain seperti hati dan limpa. Oleh karena itu penanganan pasien LMA bergantung pada informasi lain seperti subtipe LMA, usia pasien dan hasil laboratorium lainnya.4 Saat ini dikenal dua sistem ·.
klasifikasi subtipe LMA yaitu klasifikasi French-American-British (FAB) dan klasifikasi terbaru World Health Organization (WH0).1•4 Selain
itu
gejala klinis yang bervariasi
berhubungan dengan abnormalitas genetik yang secara spesifik teridentifikasi dalam LMA
nampaknya berhubungan den gan prognosis yang spesifik.
Berdasar hasil sitogenetik,
kelompok prognostik dibagi menjadi tiga kelompok risiko: baik, menengah, dan buruk. Prognosis yang baik ditandai dengan adanya t(8;21), t ( 15;17), inv(16) atau t(l6;16), dan kelompok prognosis buruk ditandai dengan adanya kariotipe yang kompleks, -5/del(Sq), -7. Kelompok prognosis menengah tidak memiliki kelainan kariotipe spesifik dan sekitar
50% biasanya menunjukkan kariotipe yang normal. 5 Penemuan sebelumnya molekuler bam (seperti
pada
penelitian LMA menunjukkan adanya
penanda
FLTJ, NPMI, CEBPA) ditemukan pada kelompok prognosis
menengah dengan kariotipe normal.6'7 Mutasi gen nucleophosmin (NPMJ) ekson 12 merupakan perubahan genetik yang paling sering diketahu.i pada pasien LMA dengan kariotipe normal. Insidensi mutasi NPMl meningkat berdasarkan usia, 2.1%-6.5% pada LMA anak-anak dan 25% 3 - 5% pada LMA dewasa.
1
Hal tersebut menunjukkan bahwa
insidensi LMA lebih tinggi pada dewasa dari pada anak-anak. sebagai
mutasi
yang
paling
umum pada
8
Mutasi tipe A muncul
LMA dewasa dengan kariotipe nom1al,
mengandung duplikasi tetranukleotida TCTG pada posisi 956 sampai 959 dari sekuen
9 10
referensi (GenBank accession number NM_002520). •
Kerusakan NPMl, baik oleh translokasi kromosom maupun mutasi, menghasilkan
dislokasi sitoplasmik dari NPM 1. Frekuensi yang tinggi dari mutasi NPM1 dengan kariotipe normal dan observasi bahwa NPMl sitoplasmik tidak dapat berfungsi secara normal sebagai
binding partner
dan protein transporter mengarah pada hipotesis bahwa
11 mutasi NPMJ rnungkin rnenjadi kejadian awal dalam leukemogenesis.
Sejurnlah studi
menunjukkan bahwa pasien dengan mutasi NPM! memiliki prognosis yang lebih baik dengan kesintasan yang tinggi.
12
Adanya mutasi NPMI pada LMA berhubungan dengan
respons yang baik terhadap terapi. Mutasi ini juga dapat digunakan sebagai penanda untuk mendeteksi
minimal residual disease
(MRD).
Oleh karena itu, analisis mutasi NPMJ
rnuncul sebagai langkah baru dalam diagnostik/prognostik pasien LMA dengan kariotipe 13 normal. Insidensi mutasi NPMl secara keseluruhan dan NPMl tipe A pada pasien LMA bervariasi di setiap negara.
Banyak data dari negara barat dan negara maju asia seperti
Jepang dan· Thailand sebagai pionir dalam melaporkan insidensi mutasi NPMJ pada populasi etnis mereka. Saat ini belum ada penelitian tentang mutasi NPMJ pada populasi Indonesia, sehingga belum ada data dan laporan mengenai mutasi NPMI pada populasi Di samping itu, data mengenai gambaran jenis leukemia berdasarkan
orang Indonesia.
klasifikasi MIC-M sesuai klasifikasi WHO pada populasi Indonesia juga belum pemah dilaporkan. Mengingat Indonesia merupakan negara multi-etnik, maka perbedaan etnis di Indonesia dengan negara Asia lainnya seperti Jepang dan Thailand memungkinkan adanya variasi tipe mutasi baru dari NPMJ. Berdasarkan penelitian oleh Falini et al. (2006) tentang mutasi NPMl menunjukkan bahwa tipe A hadir dengan frekuensi paling besar yaitu 80.5%, tipe 8 7.5%, tipe C dan tipe D 5.5%.
13
< 1%,
Oleh karena itu, untuk skreening awal kami mendeteksi mutasi NPMJ
tipe A menggunakan teknik mutasi NPMJ merupakan
an Allele-Spesific Oligonucleotide
heterozygous mutation,
(ASO)-RT -PCR.
Karena
maka hasil ASO-RT-PCR positif, tetapi
dengan pita yang tipis, akan dilakukan semi-nested ASO-PCR untuk memastikan tidak adanya positif
palsu pada hasil RT-PCR.
Sedangkan hasil ASO-RT-PCR
selanjutnya di.�equencing untuk mengetahui tipe mutasi laitmya.
2
9
negatif
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
II.l. LEUKEMIA MIELOBLASTIK AKUT (LMA)
Leukemia Mieloblastik Aleut (LMA) adalah suatu penyakit yang ditandai dengan transformasi neoplastik dan gangguan sel�sel progenitor dan seri mieloid.1 Puncak terjadinya LMA adalah pada saat awal anak-anak dan dewasa tua. Insiden LMA di negara Barat adalah sekitar 3.7 per 100.000 orang dan angka kematian adalah 2.7 sampai 18 per 100.000
orang. 14
Pada sebagian besar kasus, etiologi LMA tidak diketahui. Beberapa faktor yang dapat menyebabkan atau menjadi predisposisi tetjadinya LMA adalah riwayat terpapar senyawa kimia Benzene, radiasi ionik� trisomi kromosm 2 1 (sindrom down)� mendapat kemoterapi sitotoksis dari golongan alkylating dan topoisomerase
II
inhibitor. 1•15 Faktor
faktor tersebut dapat menyebabkan tetjadinya perubahan gen (mutasi). Penemuan sebelumnya pada penelitian LMA menunjukkan adanya penanda molekuler baru (seperti FLT3, NPMJ, CEBPA) ditemukan pada kelompok prognosis menengah dengan kariotipe normaL5•6 Patogenesis utarna LMA adalah blokade maturitas yang menyebabkan proses diferensiasi sel-sel seri mieloid terhenti pada sel�sel muda (blast) dengan akibat akumulasi blast di sumsum tulang. Akumulasi blast di surnsum tulang akan rnenyebabkan gangguan hernatopoesis normal dan pada gilirannya akan rnengakibatkan sindrom kegagalan sumsurn tulang yang ditandai dengan sitopenia. Selain itu sel�sel blast yang terbentuk juga mempunyai kemarnpuan untuk migrasi keluar sumsum tulang dan berinfiltrasi ke organ organ lain seperti kulit, tulang, jaringan lunak dan sistem saraf pusat. 1 Saat ini dikenal dua sistern klasiftkasi subtipe LMA yaitu klasiftkasi French American-British (FAB) dan klasiftkasi terbaru World Health Organization (WH0).1•4 Pasien LMA diklasifikasikan berdasarkan morfologi dan blast leukernik sesuai dengan ). French-American-British (FAB) (Tabel 1 1 6 Tabel 1 . Klasifikasi LMA berdasarkan FAB.4 Subtipe FAD
Nama
MO
LMA undiferensiasi
Ml
LMA dengan maturasi minimal
3
Presentase AML
Prognosis
5%
Buruk
15%
Sedang
M2
LMA dengan maturasi
25%
Baik
M3
Leukemia promieloblastik akut
10%
Paling baik
M4
Leukemia mielomonositik akut
20%
Sedang
M4 eos
Leukemia mielomonositik akut dengan eosinofolia
5%
Baik
M5
Leukemia monositik akut
10%
Sedang
M6
Leukemia eritroid akut
5%
Bumk
M7
Leukemia megakarioblastik akut
5%
Bumk
Gejala klinis yang bervariasi berhubungan dengan abnormalitas genetik yang secara spesifik teridentifikasi dalam LMA nampaknya berhubungan dengan prognosis yang spesiftk. Berdasarkan hasil sitogenetik, kelompok prognostik dibagi menjadi tiga kelompok risiko: baik, menengah, dan buruk. Prognosis yang baik ditandai dengan adanya t(8;21 ), t(l �;l7), inv(16) atau t(l6;16), dan kelompok prognosis buruk ditandai dengan adanya kariotipe yang kompleks, -5/del(Sq), -7. Kelompok prognosis menengah tidak memiliki kelainan kariotipe spesifik dan sekitar 50% biasanya menunjukkan kariotipe yang normal.5 II.2.
NUCLEOPHOSMIN (NPMl)
l l .2.1. Strqktur NPMl
Nucleophosmin (NPMI ), juga dikenal sebagai nucleophosmin, N038, numatrin atau B23, merupakan anggota dari keluarga NPM yang secara langsung berkaitan dengan perkembangan kanker pada manusia. Nucleophosminl sangat lestari
(conserved) pada
manusia, rodensia, ayam, dan ikan. Nucleophosminl dikode oleh gen NPMJ yang terletak pada kromosom nomor 5 lengan panjang (q) lokus 23 (5q23) dan terdiri atas 12 ekson. 17 Nucleophosmin adalah protein dengan berat molekul 37 kD yang terdiri atas 294 asam amino dan memi liki rantai polipeptida NPMI yang memiliki struktur modular, mengandung
motif-motif sekuen
yang
berbeda.
Berbagai
domain
fungsional telah
diidentifikasi di dalam protein yang terletak di dalam segmen-segmen yang secara
umurn
berdiri sendiri, tetapi saling melengkapi .18 Nucleophosmin mengandung satu segmen hidrofobik pada N-tenninus yang terlibat dalam oligomerisasi dan aktivitas
chaperone, diikuti oleh dua bagian asam yang penting
untuk berikatan dengan histon. Daerah sentral di antara dua domain asam dibutuhkan untuk aktivitas ribonuk.lease, bersama dengan domain C-terminal, mengandung daerah utama yang terlibat dalam pengikatan asam nukleat. Bagian aromatik, mengandung dua residu
4
triptophan
(288
dan
29 0)
yang
Nucleophosmin juga mengandung 8 signal (NES) (Gambar 1 ).1
N[S
Nr•,,
(' '
(fi13.1)
dibutuhkan
untuk
lokalisasi
nukleolar
nuclear-localization signal (NLS) dan nuclear-export
"J. "
l\ll5
�utS
II r J11�: 1 II [Lf=rD
I '
Oligo'11eriz.at ion Molecular chaperone
protein.
2g4 3a
DNJ\/RNI\ bindi11g
Histone bindby
R ibonuc!casc a<: livt1y
0 1\fcxfcratcly ba'>ic region 0 �on ;:�o!ar N terminal domain 0 \uclear port si9nal (N[S: 94- lOt) D Ba">ic ustcr 0 1\cidic ctom.ains (120-- 13/; l@ l8S) 0 .'\r<>m,1tJc region (uniq:Je to BH isoform H D Cemrdl region 0 N.Jdc-olar loca.·lation signa. (:>.uLS: 188-190} 0 lliparti:c nuclear localiza�ion signal C)(
c
:N�.-5: 1 !:.1- 157: 190-- tt;/)
Gambar 1. Struktur NPM1 dan domain fungsionalnya. Nucleophosmin
termasuk
ke
dalam
anggota
nucleophosmin/nucleoplasmin, yang merupakan protein
18
dari
keluarga
protein
chaperone nuklear yang berfungsi
sebagai penyusunan histon dan faktor kondensasi kromatin. Pacta N-terminus, memiliki homologi 50% dengan protein nucleoplasmin dari
Xenopus laevis. Fungsi utama NPMl
adalah untuk berikatan dengan bagian tengah histon dan mentransfer DNA ke bagian tersebut dalam reaksi yang membutuhkan ATP. Nucleophosmin memiliki fungsi dan domain tambahan, seperti aktivitas enzimatik ribonuklease dan domain yang berikatan 18 dengan asam nukleat pada bagian C-tenninal. Nucleophosmin
merupakan phospoprotein nuklear yang
terdapat melimpah,
berfungsi sebagai chaperone molekuler dan berpindah antara nukleus dan sitoplasma 2 (Gambar 2). 3 Kotak hij au menunjukkan protein NPMI wt dan lingkaran merah adalah residu triptophan, motif NES menunjukkan motif sinyal ekspor nuklear, sedangkan NLS sinyal lokalisasi nuklear. Impor nuklear dari NPMl (tanda panah) sangat mendominasi dari pada ekspor nuklear (panah putus-putus). Oleh karena itu, NPMl utamanya terdapat di 20 nukleolus.
NUCLEUS
I �
/
/
a t... zt,f, .,
.
NPI>1V'It
CYTOPLASM
Gambar 2. Mek.anisme perpindahan NPMl nukleolus.2°
wild-type (NPMl wt) dari sitoplasma ke
11.2.2. Kelainan Gen NPMJ
Nucleophosmin telah diketahui berperan dalam tumorigenesis manusia (Tabel 2). Tetjadi ekspresi berlebihan protein NPMl pada berbagai tumor, dan telah dlgunakan sebagai penanda (marker) untuk kanker lambung, usus, ovarium, dan prostat.18 Tabel 2. Kelainan NPMl pada kanker manusia.
18
Kelainan
Produk termutasi
Keganasan
Over-ekspresi
Peningkatan ekspresi
Tumor dari berbagai asal yang berbeda
NPMl -RARa
Acute promyelocytic leukemia (APL)
Translokasi
t(5:1 7(q35:ql2)
protein
t(2:5)(p23:q35)
NPMl -ALK
t(3:5)(q25 :q3 5)
NPM-MLF l
Mutasi (ekson 12)
NPMl c+mutan
(lambung, usus, ovarium dan prostat)
Anaplastoc large cell lymphoma (ALCL)
Myelodysplastic syndrome (MDS) dan
Acute myeloid leukemia
AML dengan kariotipe normal
sitoplasmik
MDS (de novo), AML, dan tumor non
Delesi (-5q35,-5)
Gen
(AML)
small-cell-lung
NPMl merupakan target kelainan genetik yang paling sering pada tumor
hematopoetik. Dua kelainan genetik pada gen
NPMl yang terkarakterisasi secara baik
yaitu translokasi kromosom pada kelainan myeloid dan lymphoid, dan mutasi pada LMA. Lebih lanjut lagi, daerah pada kromosom no 5 di mana NPMI dipetakan, yaitu lokus 5q35,
6
terkadang terdelesi pada pasien dengan myelodysplastic syndrome (MDS) 5q35 ini juga diketahui tetjadi pada solid tumor. Kelainan gen
de
Delesi
NPMJ menyebabkan pembentukan protein fusi onkogenik atau
produk NPMl mutan,
dan sering juga hilangnya salah
tersebut. Peran bagian NPMl pada berbagai produk
satu alel fungsional pada gen
chimeric masih belum dikarakterisasi
secara penuh. Akan tetapi, protein fusi akan menggangu transkripsi, diferensiasi,
novo.
18
menghambat
dan juga meningkatkan proliferasi. Produk NPMl mutan (NPM l c+)
menyebabkan NPMl akan terlokalisasi ke sitoplasma dan fungsi onkogenik dari produk ini masih dalam proses penelitian. Akan tetapi, NPMl mutan akan mempengaruhi Arf, baik delokalisasi maupun kestabilannya. Sedangkan hilangnya salah satu alel fungsional pada gen
NPMJ merupakan ciri
NPMJ. Kelainan ini akan 18 menyebabkan amplifikasi kromosom, aneuploidi, dan juga stabilitas Arf (Gambar 3). umum
::::==::::;::: ::: =::::
1 1r---, =----,
wlld-type NPMl
d
Genetic
C
\
•,••••••••• .___ I _.__
;
a
N
dari semua kelainan pada
alterations
�--=...=-'' -
----• '--
----,..-.._____..__ 1<:.
_, .
_
Fusion producu
•i -<
• lnterferencewith [ranscript ion • Inhibition ofdifferentiation • lncn�ased proliferation
IOncogenesisI
. '< _ c • ARF d�locahtutiOn . . . NPM 1 ann•• ... 1 ----.. • lneffoc1em ARF stab1l 1 zanon h�t�roz r"g051· n 'J, NPMc- mutant>
gen/:
l
1 ..
l
_j? .
• C11-ntroSome amplification • Anc;uploidy • lnefficientARF stabilization?
Gambar 3. Bagaimana kelainan gen
NPMJ berkontribusi terhadap tumorigenesis.
11.2.3. Mutasi Gen NPMJ Pada LMA
Mutasi gen
NPMJ pada ekson 12 telah diidentifikasi sebagai lesi genetik dari
subkelompok LMA dewasa yang ditandai dengan kariotipe normal, ekspresi sitoplasmik yang menyimpang dari protein NPMl (NPMc), spektrum morfologi yang luas, keterlibatan multilineage, peningkatan frekuensi muatasi FLT3, LMA
secara
dan CD34 negatif.2 1 Selain itu, NPMc
klinis berhubungan dengan respon yang lebih baik terhadap induksi
kemoterapi, walaupun implikasi prognostik untuk hasil jangka panjang masih belurn jelas?2 Mutasi NPMl
dan mutasi gen lainnya berkerja sama dalam leukemogenesis. Sekitar
40% dari pasien dengan mutasi
(FLT3-ITD),
NPMJ juga membawa FLTJ duplikasi tandem internal
dan beberapa studi menunjuk.kan bahwa mutasi
mewakili suatu prognostik marker yang menguntungkan.23
7
NPMJ tanpa FLT3-ITD
Penelitian mutasi NPMJ pada pasien LMA oleh Verhaak et al. (2005) menunjukkan bahwa mutasi NPMJ tipe A merupakan mutasi yang muncul dengan frekuensi paling besar, yaitu 26%, diikuti oleh mutasi tipe lainnya yaitu B, D, It, Jt, Kt dengan frekuensi masing masing 4%, 1%, <1 %, <1 %, <1 %.
11
Begitu pun halnya penelitian yang dilakukan oleh
Falini et al. (2005) mengenai mutasi NPj\11 . Tipe A merupakan mutasi yang paling sering
ditemukan dengan :frekuensi sebesar 70%, sedangkan tipe B, C, dan D masing-masing memiliki frekuensi sebesar 13%, 2%, dan 2%.
24
Penelitian tentang mutasi
NPMJ pada
pasien LMA di Asia Tenggara juga dilakukan oleh Boonthimat (2008) dari Thailand. Hasil penelitian Boonthimat menunjukkan berbagai tipe mutasi NPMJ dengan frekuensi paling besar adalah tipe A, yaitu 20.3%, diikuti oleh tipe B, D, dan J masing-masing 1.3%, 1 .8%, dan 0.5%. Selain itu, Boonthimat juga menemukan adanya tipe baru yaitu THl, TH2, TH3,
TH4, THS, TH6, TH7, dan TH8.8 Falini et al. (2005) telah menunjukkan bahwa terdapat korelasi negatif antara keberadaan mutasi NPMJ dengan tingkat ekspresi CD34. Pada percobaannya menunjukkan hasil bahwa ekspresi m.RNA CD34 rendah pada pasien LMA dengan mutasi NPM1.24 Penelitian oleh Syampurnawati et al. (2008), menunjukkan bahwa pasien LMA dengan mutasi NPMJ memiliki HLA-DR negatif.
7
•
8
BAB III TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN
111.1.
TUJUAN
Ill.l.l. Tujuan Umum
Untuk tnengetahui karakteristik mutasi nucleophosmin (NPMJ) pada pas1en Leukemia Mieloblastik Akut (LMA) dewasa di Indonesia. 111.1.2. Tujuan Kbusus
1 . Untuk mengetahui frek:uensi kejadian mutasi NPMl tipe A dan tipe lainnya pada pasien LMA dewasa di Indonesia.
2. Untuk mengetahui hubungan mutasi NPMl dengan gambaran immunophenotyping pada pasien LMA dewasa di Indonesia.
3 . Untuk mengetahui hubungan mutasi NPMl dengan gambaran sitogenetik pada pasien LMA dewasa di Indonesia. 111.2.
MANFAAT
Hasil dari penelitian ini akan memberikan data epidemiologi penanda molekuler baru khususnya NPMl pada LMA dewasa di Indonesia.
9
-- - --
-· --� -
-
· -
BAB IV METODE PENELITIAN
IV.l.
DESAIN PENELITIAN DAN POPULASI PENELITIAN
Desain penelitian adalah potong lintang
(cross sectional). Populasi target adalah
· sernua penderita LMA di RSCM dan RSKD pada tahun 20 1 1 yang memenuhi kriteria penelitian. IV.2.
TEMPAT PENELITIAN
Penelitian Onkologi
Medik,
sitogenetik Divisi
dilakukan
di
Departernen
laboratorium Ilmu
biologi
Penyakit
molekuler Divisi
Dalam
FKUI/RSCM,
Hernatologi Onkologi Medik, Departemen
Hematologi laboratoriurn
Ilrnu Penyakit Dalarn
FKUIIRSCM, laboratorium Patologi Klinik RSKD, dan laboratorium biologi Departernen Biologi Kedokteran FKUL
IV.3.
KRITERIA INKLUSI DAN EKSKLUSI
IV.3.1. Kriteria Inklusi
1.
Pasien yang baru didiagnosis Leukemia Mieloblastik Akut (LMA) berdasarkan hasil pemeriksaan sitomorfologi dari sumsum tulang rnenunjukkan adanya sel-sel muda > 20% dengan type rnielositik.
2.
Pasien LMA berusia diatas 1 8 tahun.
IV.3.2. Kriteria Eksklusi
1.
Pasien menolak mengikuti penelitian.
IV.4.
JUMLAH SAMPEL
Jumlah sampel adalah seluruh pasien LMA yang memenuhi kriteria penelitian yang •
datang ke RSCM dan RSKD pada periode Januari 201 1 - Januari 2012 . 2 n = Zs PQ
d2 2 = 1,96 x 0,23 x 0,77 2 0'13
= 40,25 = 40 Keterangan: Za
=
P
= frekuensi mutasi NPMl (kepustakaan)
1,96
10
Q
=
1-P
d
=
IV.S.
TEKNIK PENGUMPULAN DATA
Presisi 0,13
D a ta penelitian berupa s ampel y a itu as pir asi s ums u m tulang s eb a nyak 5cc dan d a rah tepis ebanyak 1 Occ. IV.6.
PROSEDUR PEMERIKSAAN
IV.6.1. Persiapan Sampel
Sampel berupa aspirasi s ums um tulang dan darah tepi dari pas ien LMA y a ng didapatkan
dari pas ien
yang s ec a r a
klinis
dic urigai LMA.
Unt uk pemeriks a an
s itomorfologi, immunophenotyping, dan mutas i gen NPMI sarnpel ber upa darah tepi dan/ata u
as pirat s ums um
tul ang dengan ant ikoagulan
EDTA, s edangk: an unt uk
pemeriks a a n s itogenetik a s a mpel berupa darah tepi dan aspirat s ums um tulang dengan antikoagula n heparin . Kemudian dila kukan pemeriks a an untuk menegakkan diagnos is LMA s ec a r a morfologi , SBB , s itogenetik dan
immunophenotyping. Sa mpel dari pas ien
yang telah tegak diagnos is s ebagai LMA akan dipres erv asi d a l a m bentuk pellet dan akan dis impan dalam s uh u -80° C s ampa i terk umpul untuk: kemudian dilakukan pemeriks a an mutasi NPM1. IV.6.2. Pemeriksaan
/mmunophenotyping
1.
Ambil darah ( BMP) 200 f..ll + 200 fll PBS � vortex
2.
Siapkan 4 tabung beri label , m asukkan ke tabung 1 ,2,3 , dan 4 s ebanyak 1 0 f.il CD45 per CD
3.
K emudi a n pada tabung1 sarnpai ke 4, m a sukkan1 0 fllmas ing-m as ing:
a.
CD 7 FITC/ CD33 PE
b.
HLADR FITC/ CD13PE
c.
CD14 FITC/ CD34PE
d.
CD 1 1 7 PE
4.
Mas ukk an ke mas ing-mas ing tabung d a r a h y ang s udah dicarnpur dengan PBS 50 f..ll kemudian vortex
5.
Inkubas i 15 menit pada s u hu ruang dalam kamar gel ap
6.
Tambahkail. 1 ml lysing solution, vortex s ec ar a perlahan-lahan.
7.
Inkubas i 5 -10 menit pada s uh u ruang dan d a l a m kamar gelap.
8.
Sentrifus 5 menit 1200 rpm, buangs upem a tann y a .
11
9.
Tambahkan lml FACSflow, sentrifus kembali selama 5 menit, huang supematannya.
10. Mix masing-masing tabung dan tambahkan 500 Jll formaldehyd dan mix kembali. 1 1. Inkubasi 30 menit pada suhu 4°C 12. Baca dengan alat FACS Calibur dengan program CellQuest Pro IV.6.3. Pemeriksaan Sitogenetik
1.
Masukkan 200 ul sampel ke dalam tabung yang berisi 1 0 ml medium lengkap (RPMI 1640, FBS, Penstrep dan L-glutamin).
2.
Masukkan ke dalam inkubator C02 yang bersuhu 37°C, overnight.
3.
Setelah 24 jam pengeraman, lakukan blocking dengan 0,1 ml FdU dan 0,1 ml Uridin setiap tabung. Masukkan kembali ke dalam inkubator.
4.
Setelah 15-1 7 jam proses blocking tambahkan 0, 1 ml BrdU dan bungkus dengan menggunakan alumunium foil dan eramkan kembali.
5.
Tambahkan Colcemid (1 0 J.!g/ml) setelah 5 8 - jam kemudian. Kembalikan ke inkubator.
6.
Lakukan pemutaran sampel pada 1300 rpm selama 10 menit.
7.
Buang supernatan.
8.
Resuspen pelet dalam 10 ml KCL (0.075 M), biarkan dalam suhu 37° C selama 20 men it.
9.
Lakukan pemutaran sampel pada 1300 rpm selama 10 menit
10. Buang supernatan 1 1 . Resuspen pelet dalam 5 m[ Carnoy (3: 1 =methanol:Asam asetat glasial). Pipet sambil
vortex dengan kuat dan hati-hati untu.k menghindari penggumpalan. 12. Simpan pelet dalam suhu 4°C (ovenight), atau 13. Pelet diputar selama 5 menit dalam 1300 rpm. Lakukan pemutaran sampai pelet berwarna putih seperti salju. 14. Dropping sampel ke atas slide. 1 5 . Biarkan dalam inkubator (Aging) 60°C overnight. 16. Keringkan dalam derikator sebelum dilakukan banding dengan metode G-banding. 17. G-banding: Lakukan tripsinisasi kemudian warnai slide dengan larutan Giemsa selama 10 menit. 18. Keringkan dan baca dibawah milcroskop untuk mencari metafase. Jumlah metafase minimal yang dinilai 20 sel. 19. Analisa basil.
12
· -
-
-
-
-
IV.6.4. Pemeriksaan Mutasi Gen NPMl 1.
Separasi sel mononuklear dengan gradien sentrifugasi menggunakan ficoll paque.
2.
Preservasi sampel dalam pelet dan disimpan dalam -80°C.
3.
Sampel dilakukan ekstraksi RNA dengan menggunakan reagen trizol.
4.
Dibuat eDNA dengan cara reverse transcript menggunakan primer random hexamer.
5.
Dilakukan RT-PCR untuk mutasi Nucleophosmin 1 (NPMl ) tipe A menggunakan teknik Allele Specific Oligonucleotide (ASO)-RT-PCR dengan
primer NPM-A (5'
dan
CCAAGAGGCTATfCAAGATCTCTCTC-3 ')
NPM-REV-6
(5 'ACCATITCCATGTCTGAGCACC-3 ') 6.
Kemudian dilakukan elektroforesis dengan menggunakan 2% gel agarose yang ditambahkan Ethidium bromide menggunakan marker DNA 1 OObp. Kemudian dilihat dengan UV transilluminasi dan di dokumentasi. Sampel dengan mutasi NPM 1 tipe A
akan memberikan pita dengan posisi berada pada fragmen 320bp, sedangkan sampel yang negatif tidak akan menghasilkan pita PCR. 7.
Sampel yang menunjukkan pita tipis dilakukan semi-nested ASO-PCR dengan primer berikut: NPM-AN (5'-CAAGAGGCTATTCAAGATCTCTGTCTG-3') dan NPM REV-6 (5'ACCATTTCCATGTCTGAGCACC-3'), menggunakan template 0,5ul dari produk ASO-RT-PCR.
8.
Kemudian dilakukan elektroforesis dengan menggunakan 2% gel agarose yang ditambahk:an Ethidium bromide menggunakan marker DNA 1 OObp. Kemudian dilihat dengan UV transilluminasi dan di dokumentasi. Sampel dengan mutasi NPMJ tipe A akan memberi.kan pita dengan
posisi berada pada fragmen 319b p, sedangkan sampel
yang negatif tidak akan menghasilk:an pita PCR. 9.
Sampel yang negatif dengan teknik ASO-RT-PCR selanjutnya diJakukan RT-PCR kembali dengan primer berikut: NPM-F (5'- CTTCCGGATGACTGACCAAGAG 3'), NPM-R (5'-CCTGGACAACATTTATCAAACACG -3') .
10. Kemudian dilakukan elektroforesis dengan 12% gel polyacrylamide dan di staining dengan ethidium bromide. Sampel yang mempunyai mutasi NPMI akan menunjukkan dua pita, sedangkan sampel yang tidak mempunyai mutasi hanya akan memberikan satu pita. 1 1 . Selanjutnya dilakukan direct sequencing untuk sampel yang mempunyai dua pita (mutasi).
13
..,._
-- -
-
-
-=--
-
-
- -
IV 6 5 Analisis Data .
.
.
Data hasil
immunophenotyping, sitogenetik, dan mutasi gen NPMl dianalisis
dengan uj i statistik Fisher exact untuk melihat hubungannya.
14
....,
--
-
--
-
-
-
-
-
BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN
V.l.
BASIL
I.OOObp 500 bp 300bp 100 bp
Agarosa 2%: 100 V: EtBr 0,5 ug/ml Keterangan : Lajur M = DNA Ladder 100 bp Lajur 1 = ID-01 0 Lajur 2 = Kontrol tnternal ID-0 1 0 Lajur 3 ID-009 Kontrol Internal ID-009 Lajur 4 Lajur 5 = ID-007 Lajur 6 = Kontrol Internal lD-007 ID-0 19 Lajur 7 Lajur 8 = Kontrol Internal ID-01 9 Lajur 9 = Kontrol Negatif Sampel =
=
=
Lajur 10
=
Kontrol Negatiflntemal
Gambar 4. Visualisasi NPMJ tipe A basil amplifikasi ASO-RT-PCR
15
,.. _
� -
-
-
-
-
Keterangan: Daer� yang mengalami mutast
D
Gambar 5. Hasil elektroferogram sampel dengan mutas1
NPMJ t1pe A.
16
.., _ -
�
-
-
--
--
-c ·
-
-·
ID-010 Homo sapiens nucleophosmin (NPM1 ) ,
transcript variant
(nucleolar phosphoprotein B2 3 , 2,
numat rin)
mRNA
Length=l362 GENE
ID:
4 8 6 9 NPMl
I nucleophosmin
(nucleolar phosphoprotein B2 3 ,
numatrin) [Homo sapiens]
Score =
( Over 100 PubMed links)
4 7 7 bits
(258 ) , Expect ( 98 % ) , Gaps
Identities = 2 7 3 / 2 7 9
6e-134 6/279
(2%)
Strand=Plus/Plus 2
CAAGAGGCTATTCAAGATCTCTGTCTGGCAGTGGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAGTTT
999
CAAGAGGCTATTCAAGATC----TCTGGCAGTGGAGGAAGTCTCT TTAAGAAAATAGTTT
62
AAACAATTTGTTAAAAT AA TTTCCGTCTTATTTCATTTCTGTAACAGTTGATATCTGGCT
1055
AAACAATTTGTTAAAATTTTCCGTCTTATTTCATTTCTGTAACAGTTGATATCTGGCT AA
122
GTCCTTT TTATAATGCAGAGTGAGAACTTTCCCTACCGTGTTTGATAAATGTTGTCCAGG
1115
GTCCTTTTTATAATGCAGAGTGAGAACTTTCCCTACCGTGTTTGATAAATGTTGTCCAGG
182
TTCTATT GCCAAGAATGTGTTGTCCAAAATGCCTGTTTAGTT TTTAAAGATGGAACTCCA
1175
TTCTATTGCCAAGAATGTGTTGTCCAAAATGCCTGTTTAGTTTTTAAAGATGGAACTCCA
Query
242
CCCTTTGCTTGGTT TTAAGTATGTATG-AATGTTA-GAT
278
Sbjct
1235
CCCTTTGCTTGGTT TTAAGTATGTATGGAATGTTATGAT
1273
Query 61 Sbjct
I I I I I I I I I I I I I 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1054 Query 121 Sbjct
I I 1 1 1 1 1 1 I I I I I 1 1 1 1 1 1 I I I I I I I I I I I 1 1 1 1 1 1 I I I I I I l l I l l I I I l l I I I I I I l l
1114 Query 181 Sbjct
I I 1 1 1 1 1 1 I I I I I 1 1 1 1 1 1 I I 1 1 1 1 1 1 I l l 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 I I I I I I I I
1174 Query 241 Sbjct
I I I I I l l I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I l l I I 1 1 1 1 1 1 I l l I l l I l l I I I I I I I I I I I I I I
1234
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1
I l l
Keterangan: TCTG Insersi empat basa
Gambar 6. Hasil analisis BLAST sampel dengan mutasi NPMJ tipe A
17
......
-
-
-
-----
-
-
1 .000 bp
3 1 9 bp
Agarosa 2%; 100 V; EtBr 0,5 J.lg/ml Keterangan: Lajur M DNA Ladder 100 bp Lajur 1 ID-039 Lajur 2 ID-040 Laj ur 3 ID-041 Lajur 4 ID-034 Lajur 5 = Kontrol (+) Lajur 6 ID-038 Lajur 7 ID-037 Lajur 8 ID-035 Lajur 9 = ID-016 Lajur 10 ID-033 Lajur 1 1 Kontrol (-) =
=
=
=
=
=
=
=
=
=
Gambar 7. Visualisasi NPMJ tipe A hasil amplifikasi seminested-ASO-RT-PCR
18
....
· -
-
.. -=-.. -
-- -
-
- -
-
· -
500
208 pb
Agarosa 2%; 100 V; EtBr 0,5 Jlg/ml Keterangan : Lajur M Lajur 1 Lajur 2 = Lajur 3 Lajur 4 Lajur 5 = Lajur 6 Lajur 7 =
=
=
=
=
=
DNA Ladder l OObp ID-039 ID-040 ID-041 ID-030 ID-038 ID-035 Kontrol negatif
Gambar 8. Visualisasi NPMJ ekson 12 basil amplifikasi RT-PCR
19
..... . ....;; � --·
-
-----
� -= ===� === -====
-
� !! !
-
-
� � �
--
-
· -
1.000 pb 500pb
200pb Aiel nonnal
100 pb
Poliakrilamid 1 2%; 1 00 V; EtBr 0,5 Keterangan: Lajur M DNA ladder 100 bp Lajur 1 ID-003 Lajur 2 ID-024 ID-0 1 8 Lajur 3 Lajur 4 ID-025 Lajur 5 = ID-039 Lajur 6 ID-040 Lajur 7 ID-041 Lajur 8 = ID-030 Lajur 9 Kontrol (+) =
=
=
=
=
=
=
=
Gambar 9. Visualisasi gel poliakrilamid NPMJ ekson 12 hasil amplifikasi RT-PCR
•
20
......
-
-
-
-
�
Gambar I 0. Kariotipe abnormal dari su�jek dengan mutasi NPMJ tipe A (44,XX,- l,-17)
Tabel 3. Frekuensi mutasi NPMl N 26 8 0 34
NPMJ Normal Tipe A Tipe lainnya
•
Jumlah
% 76,47 23,53 0 100
21
c:&l.
-�
-
-
-
- -
-
Tabel 4. Hasil immunophenotyping, sitogenetik, dan mutasi NPMJ No.
10-001
ID-002
Mutasi NPMJ
Normal
Normal
ID-003
Normal
ID-004
Normal
ID-005
Normal
Immunopltettotypittg
Sitogenetik
43,)0(,-7,- 1 0,20[2/20)/43,XX,-3,·1 1 ,18[1120]/45,XX,5[1/20]/45,XX,16[1120)/46,XX[1 5/20]
a. CD7 FITC/CD33PE (-)/(+) b. HLADR FITC/CD13PE (+)/(+) c. CD14 FITC/CD34PE (-)/(-) d. CD 1 1 7 PE (+) a. CD7 FfTC/CD33PE (+)/(-) b. HLADR FITC/CD13PE (-)/(+) c. CD14 FITC/CD34PE (-)/(+) d. CD 1 1 7 PE (+)
Tidak ditemukan metafase
a. CD7 FITC/CD33PE (-)/(+) b. HLADR FITC/CD13PE (+)/(+) c. CD14 FITC/CD34PE (-)/(+) d. CD 1 1 7 PE (+) a. CD7 FITC/CD33PE (-)/(+) b. HLADR FITC/CD13PE (-)/(-) c. CDI4 FITC/CD34PE (-)/(-) d. CD I I 7 PE (+)
Tidak ditemukan metafase
Tidak ditemukan metafase
a. CD7 FITC/CD33PE (-)/(+) b. HLADR FlTC/CDIJPE (-)/(+) c. CDI4 FITC/CD34PE ( )/(+) d. CD I I 7 PE (+)
46,XX
a. CD7 FITC/CD33PE (-)/(+) b. HLADR FlTC/CD l JPE (+)/(+) c. CD14 FITC/CD34PE (+)/(+) d. CD 1 1 7 PE (+)
Tidak ditemukan metafase
Normal
a. CD7 FITC/CD33PE (-)/(+) b. HLADR FJTC/CDI3PE (+)/(+) c. CD14 FITC/CD34PE (-)/(+) d. CD 1 1 7 PE (+)
46,XX
A
a. CD7 FITC/C033PE (-)/(+) b. HLADR FITC/CD13PE (-)/(+) c. CDI4 FITC/CD34PE (-)/(-) d. CD 1 1 7 PE (+)
44,XY,-I 0 20[2/20]/45,XY,3[1/20]/45,XY,1 1 [ l/20]/45,XY,19[ l/20]/46,XY[ 15/20]
A
a. CD7 FITC/CD33PE (-)/(+) b. HLADR FITC/CD13PE (+)/(-) c. CD14 FITC/CD34PE HI(+) d. CD 1 1 7 PE (-)
Tidak ditemukan metafase
-
ID-007
ID-008
ID-010
ID-012
Normal
,
22
.....
--
-
-
-
-
-
- --
Tabel 4. lanjutan No.
ID-0 13
Immunophenotyping
Mutasi NPMl
A
a. CD7 FITC/CD33PE (-)/(+) HLADR FITC/CD13PE (+)/(+) c. CD14 FITC/CD34PE (+) d CD 1 1 7 PE (+)
41 ,XX,-5,-7,-9,-10,17(2/20]/44,xx.,-7,1 3 [2/20]/45,xx[ l/20]/46,xx[l 5/20]
a. CD7 FJTC/CD33PE (-)/(+) b. HLADR FITC/CD 13PE (+)/(+) c. CD14 FITC/CD34PE (-)/(+) d.CD 1 1 7 PE (+)
Tidak ditemukan metafase
b.
.
lD-016
ID-0 18
lD-019
ID-020
fD-021
ID-022
ID-023
A
Normal
Sitogenetik
a. CD? FITC/CD33PE (-)/(+) b. HLADR F[TC/CD13PE (-)/(-) c. CD14 FfTC/CD34PE (-)/(+) d. CD 1 1 7 PE (+)
46,XY
Nonnal
a. CD7 FITC/CD33PE (-)/(-) b. HLADR FITC/CD13PE (+)/(+) c. CD14 FITC/CD34PE (-)/(+) d. CD 1 l 7 PE (+)
Tidak ditemukan metafase
Normal
a. CD7 FITC/CD33PE (-)/(+) b. HLADR FITC/CDI3PE (+)/(+) c. CD J 4 FITC/CD34PE (-)/(+) d. CD 1 1 7 PE (+)
46,XY
Normal
a. CD? FITC/CD33PE (-)/(+) HLADR FITC/CD13PE (+)/(+) c. CD 14 FITC/CD34PE (-)/(+) d. CD 1 1 7 PE (+)
46,XY
Normal
a. CD7 FITC/CD33PE (-)/(+) b. HLADR FlTC/CD13PE (+)/(+) c. CD14 FrTC/CD34PE (-)/(+) d. CD 1 1 7 PE (+)
46,XX
Normal
a. CD7 FITC/CD33PE (-)/(+) b. HLADR FITC/CD13PE (+)/(+) c. CD14 FITC/CD34PE (-)/(+) d. CD I 1 7 PE (+)
46,XX
b.
a. CD7 FITC/CD33PE (-)/(+)
ID-024
lD-025
Normal
Normal
b. ID.-ADR FrTC/CD13PE (+)/(+)
c. CD14 FITC/CD34PE (-)/(+) d. CD 1 1 7 PE (+)
a. CD7 FITC/CD33PE (+)/(+) b. HLADR FlTC/CD13PE (+)/(+) c. CD14 FJTC/CD34PE (-)/(+) d. CD 1 1 7 PE (+)
23
Tidak ditemukan metafase
45,x.x,- 1 9[2/20]/45,xx,5[1/20]/45,xx,17[1/20]/46,xx[16/20]
Tabel 4. lanjutan No.
ID-027
ID-029
ID-030
ID-031
ID-032
ID-034
ID-035
ID-037
Mutasi NPMl
ID-039
Sitogeoetik
A
a. CD7 FITC/CD33PE (-)/(+) b. HLADR FITC/CD 13PE (+)/(+) c. CD14 FITC/CD34PE (-)/(+) d. CD 1 1 7 PE (+)
46,xx,del(5q)(4/26]/46,xx[22/26]
Normal
a. CD7 FITC/C033PE (-)/(-) b. HLADR FITC/CDl3PE (+)/(+) c. CD 14 FITC/CD34PE (-)/(+) d. CD 1 1 7 PE (+)
Tidak ditemukan metafase
Normal
a. CD7 FITC/CD33PE (-)/(+) b. HLADR FITC/CD13PE (+)/(+) c. CD14 FITC/CD34PE (-)/(+) d. CD 1 17 PE (+)
46,XY
A
a. CD7 FITC/CD33PE (-)/(+) b. HLADR FITC/CD13PE (+)/(+) c. CD14 FITC/CD34PE (-)/(+) d. CD 1 17 PE (+)
46,XY
Normal
a. CD7 FITC/CD33PE HI(+) b. HLADR FITC/CDl3PE (+)/(+) c. CD 14 FITC/CD34PE (-)/(+) d. CD 1 1 7 PE (+)
44,XY,-17,-2 1 [l/20]/44,XY,-18,21 (2/20]/46,XY[ 17/20]
Normal
a. CD7 FITC/CD33PE (-)/(+) b. HLADR HTC/CD13PE (+)/(+) c. CD14 FITC/CD34PE (-)/(+) d. CD 1 1 7 PE (+)
45,XY ,-21 [5/20]/46,XY(l 5/20]
Normal
a. CD7 FITC/CD33PE (+)/(+) b. HLADR FITC/CD13PE (+)/(+) c. CD 14 FITC/CD34PE (-)/(+) d. CD 1 17 PE (+)
46,XX
A
a. CD7 FITC/CD33PE (-)/(+) b. HLADR FITC/CD13PE (+)/(+) c. CD14 FITC/CD34PE (-)/(+) d. CD 1 1 7 PE (-)
44,XX,-1,-17[4/20]/46,XX(l 6/20]
Normal
a. CD7 FITC/CD33PE (+)/(+) b. HLADR FITC/CD 13PE (+)/(+) c. CD14 FITC/CD34PE (-)/(+) d. CD 1 1 7 PE (+)
Tidak ditemukan metafase
Normal
a. CD7 FITC/CD33PE (-)/(+) b. HLADR FITC/CD 13PE (+)/(+) c. CD14 FITC/CD34PE (-)/(+) d. CD 1 17 PE (+)
43,Y,-X,-1 0,-2 1 [2/20]/43,X-Y,-19,20[2/20]/44,XY ,t(J: 19),-5,-9,12,+14,2 l ,+marl[7/20]/45,XY,del(l9),t(3: 19 )'-5' -7' 1 7,+mar1 ,+mar2[2/20]/46,XY[7/20]
•
ID-038
Immunophenotyping
24
Ql.
-
- .
··--- - --
-
--- - � --= =--=-===-'='--=-=-..,.. - -
---
-
-- __ ::. --
--
Tabel 4. lanjutan No.
Immunophenotyping
Mutasi NPMl
Sitogenetik
a. CD7 FITC/CD33PE
ID-040
Normal
(-)/(+) b. HLADR FITC/CDl 3PE (+)/(+) c. CD14 FITC/CD34PE (-)/(+) d. CD 1 17 PE (+) a.
ID-041
ID-042
Normal
Nanna!
Tidak ditemukan metafase
CD7 FITC/CD33PE (-)/(+)
b. HLADR FITC/CDl3PE (+)/(+)
Tidak ada sampel untuk sitogenetik
CD 14 FITC/CD34PE (-)/(+) d. CD 1 1 7 PE (+) c.
a. CD7 FITC/CD33PE (-)/(+) b. HLADR F1TC/CD13PE (-)/(+) c. CD14 FITC/CD34PE (-)/(-) d. CD 1 17 PE (-)
46,XY
a.
rD-043
Normal
CD7 FITC/CD33PE (-)/(+) b. HLADR FITC/CDlJPE (+)/(+) c. CD 14 FITC/CD34PE (-)/(+) d. CD 1 1 7 PE (+)
46,XY
a.
10-044
A
CD7 FITC/CD33PE (-)/(+) b. HLADR FITC/CDt3PE (-)/(+) c. CD14 FITC/CD34PE (-)/(-) d. CD 1 1 7 PE (+)
45,XY,-1 1 [2/20]/45,XY,19[2/20]/46,)(Y[ 16/20]
25
.....
--
-
---
-------
- --
Tabel 5. Hubungan beberapa variabel dengan NPMJ
NPMJ
Mutasi Positif
CDJ3 CD7 CD34 CD33 HLADR CD14 CDI I 7
i
Kariot pe
*
V.2.
Negatif Positif Negati f Positif Negatif Positif Negatif Positif Negatif Positif Negatif Positif Negatif Normal Abnormal
N
%
7 I 0 8 6 2 8 0 6 2 1 7 6 2 1 5
20,59 2,94 0 23,53 17,65 5,88 23,53 0 1 7,65 5,88 2,94 20,59 17,65 5,88 4,55 22,73
n
%
24 2 4 22 23 3 5 21 21 5
70,59 5,88 1 1,76 64,71 67,65 8,82 14,71 61,76 6 1,76 14,71 2,94 73,53 73,53 2,94 50,00 22,73
25 25 1 11 5
0,00002 < 0,00001
<
0,00001
< 0,00001
<
0,0000 1 0,0008
0,00002 <
0,0000 1
Uji Fisher Exact
PEMBAHASAN Pada penelitian ini kami mendapatkan 34
NPMJ
p*
Tidak mutasi
subjek pasien LMA. Pemeriksaan mutasi
diawali dengan mendeteksi tipe A menggunakan teknik ASO-RT-PCR. Teknik
allele-specific oligonucleotides (ASOs) merupakan metode alternatif untuk mendeteksi mutasi di mana hanya oligonukleotida yang cocok yang dapat berperan sebagai primer untuk amplifikasi daerah target. Primer oligonukleotida yang digunakan didesain agar dapat menempel hanya pada sekuen normal atau mutan, di mana keduanya digunakan •
berpasangan dengan primer biasa. 25 Pada penelitian ini, primer
forward hanya akan
menempel pada sekuen yang mengalami mutasi sehingga jika tidak ada mutasi, fragmen tidak. akan
terarnplifikasi.
Dengan menggunakan teknik ini, fragmen yang diharapkan
muncul, yaitu 320 bp, tidak ada yang teramplifikasi pada semua sampel. Akan tetapi, fragmen ABL sebesar 258 bp digtmakan sebagai internal kontrol berhasil diamplifikasi pada semua sampel (Gambar 4). Hasil ampliftkasi dengan teknik ASO-RT-PCR yang kami lakukan berbeda dengan hasil yang dipero leh oleh Ottone et al. (2008).10 Pada penelitiannya, Ottone et a!. juga
26
menggl.Ulakan teknik ASO-RT-PCR untuk mendeteksi mutasi NPMJ tipe A dan hasilnya ada fragmen sebesar 320 pb muncul pada saat amplifikasi. Hal ini menunjukkan bahwa teknik ASO-RT-PCR yang kami gunakan tidak dapat mendeteksi mutasi NPMJ tipe A. Karena semua sampel menunjukkan hasil negatif dengan teknik ASO-RT-PCR untuk mutasi NPMJ tipe A, selanjutnya dilakukanlah seminested-ASO-RT-PCR pada beberapa
sampel.
Teknik
seminested-ASO-RT-PCR dilakuk�n untuk meningkatkan
sensitivitas dari uji.9 Panjang fragmen yang diharapkan dengan teknik ini adalah 3 1 9 bp. Berdasarkan basil seminested-ASO-RT-PCR, terdapat dua sampel yang teramplifikasi dengan panjang 3 1 9 bp. Untuk mengkonfirmasi kebenaran mutasi NPMJ tipe A, pada kedua sampel tersebut dilakukan menggunakan primer
direct sequencing. Direct sequencing dilakukan dengan
reverse NPM-REV-6 sehingga pada elektroferogram tidak langsung
terlihat insersi empat basa TCTG. Lokasi terjadinya insersi pada elektroferograrn adalah basa ke 264-271 (Gambar 5). Hasil
direct sequencing kemudian diedit dengan BioEdit dan
dianalisis melalui BLAST. Berdasarkan analisis BLAST, terlihat jelas bahwa ada insersi empat basa TCTG pada sekuen (Gambar
6). Menurut Falini et al. (2005)24, mutasi NPMJ
tipe A mengandung insersi tetranukleotida TCTG, sehingga dapat disimpulkan bahwa hasil
direct sequencing kedua sampel tersebut merupakan mutasi NPMl tipe A. Kedua sampel yang telah dikonfirmasi sebagai mutasi NP}vfl tipe A, selanjutnya digunakan sebagai kontrol positif pada seminested-ASO-RT-PCR selanjutnya. Dari 34 sampel, terdapat
8 sampel yang teramplifikasi pada serninested-ASO-RT-PCR dengan
ukuran fragmen 3 1 9 bp (Gambar 7). Untuk mengetahui tipe mutasi NPMJ yang lain, dilakukanlah amplifikasi NPN!l ekson 12 dengan RT-PCR. Hasil amplifikasi dengan RT PCR adalah fragrnen dengan panjang
208 bp (Gambar 8). Dari 26 sampel, semua
terarnplifikasi dengan panjang fragmen tersebut. Hal tersebut menunjukkan bahwa fragmen NPMJ ekson 12 berhasil diamplifikasi.
Selanjutnya, untuk melihat ada atau tidaknya mutasi NP Ml tipe lain, di lakukanlah
•
visualisasi pada gel poliakrilamid 12% (Garnbar 9). Hasil elektroforesis gel poliakrilamid menunjukkan dua pola pita yang berbeda. Pada lajur 9, terdapat dua pita yang terpisah dan itu menunjukkan bahwa terdapat dua aiel yang berbeda yaitu alel normal pada pita yang lebih rendah dan aiel mutan pada pita yang lebih tinggi. Perbedaan kedua alel tersebut dikarenakan mutasi pada NPMJ merupakan mutasi heterozigot. Sedangkan pada lajur 2-7 hanya terdapat satu pita dengan ukuran yang sama dengan alel normal pada lajur 9. Hal tersebut menunjukkan bahwa kedelapan sampel tersebut memiliki aiel normal sehingga
27
..q
-
-
-�-
-
- -- -
-- --
dapat dikatakan bahwa tidak ada mutasi
NPMJ tipe
lain.
Dari dua puluh empat sampel
yang divisualisasikan dengan gel p�liakrilamid 12%, semua menunjukkan satu pita yang sej�jar dengan pita aiel normal pada kontrol positif. Berdasarkan basil analisis mutasi tersebut, maim didapatkan frekuensi mutasi
NPMJ tipe A yaitu 23,53% dan tidak ada mutasi NPMJ tipe lainnya (Tabel 3). Frekuensi mutasi
.
NPMJ tipe A hampir sama dengan hasil penelitian Boonthimat (2008)8. Pada
penelitiannya, Boonthimat mendapatkan frekuensi mutasi Akan tetapi, pada penelitian ini tidak ada mutasi penelitian sebelurnnya tentang mutasi
NPMJ tipe A sebesar 20,3%.
NPMJ tipe lainnya, sedangkan penelitian
NPMl ditemukan adanya tipe lain. Hal ini dapat
disebabkan karena jumlah sampel yang terlalu sedikit pada penelitian ini sehingga mutasi tipe lainnya yang memang memiliki frekuensi kecil tidak muncul. Selain
data
mutasi
NPlvfl, pada penelitian
immunophenotyping dan sitogenetik
dari subjek (Tabel
ini
juga
dikumpulkan
data
4). Semua subjek memiliki data
immunophenotyping. Akan tetapi, hanya 22 subjek yang memiliki data sitogenetik karena sebanyak 1 2 sampel tidak ditemukan metafase saat pembuatan kariotipe. Pada pembuatan kariotipe, metafase sering kali tidak ditemukan. Hal tersebut dapat terjadi karena waktu penghentian siklus sel di dalam kultur tidak tepat sehingga bukan saat metafase siklus tersebut terhenti. Kariotipe abnormal dari subjek yang merniliki mutasi
NPMl tipe A dapat
bermacam-macam. Salah satu kariotipe abnormal dari subjek dengan mutasi
NPMJ tipe A
dapat dilihat pada Garnbar I 0. Selanjutnya, dilakukan analisis hubungan lain ,
NPMI dengan berbagai variabel, antara
CD7, CD34, CD33, HLA-DR, CD14� CD 1 1 7, dan kariotipe (Tabel 5). Berdasarkan
Tabel 5, diketahui bahwa terdapat hubungan yang bermakna antara NPMI dengan berbagai variabel tersebut.
Dari 8 sampel yang mengalami mutasi NPMJ tipe A, terdapat 6 sampel
yang mengekspresikan
CD34 positif. Sedangkan menurut Falini et
al. (2005), mutasi
NPMJ akan mengekspresikan CD34 negatif?4 Hasil yang kami peroleh berbeda dengan •
hasil penelitian yang dilakukan oleh Falini et al. tersebut. Hal ini dapat disebabkan jumlah sampel yang terlalu sedikit dan hanya mutasi tipe A yang kami dapatkan. Sedangkan pada penelitian Falini et al. tersebut,
mutasi
merupakan keseluruhan mutasi, yaitu tipe
NPMl yang rnengekspresikan CD34 negatif
A dan tipe lainnya.
Begitu pun halnya dengan HAL-DR, pada penelitian ini dari 8 sampel dengan mutasi
NPMI tipe A, terdapat
6
sampel yang mengekspresikan
HLA-DR positif
Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Syampurnawati et al. (2008), pasien LMA
dengan mutasi
NPMJ memiliki
HLA-DR negatif.7 Hal tersebut berbeda dengan hasil
penelitian kami. Perbedaan tersebut dapat terjadi karena sedikitnya jumlah sampel yang kami kumpulkan dan hanya mutasi tipe A yang terdeteksi. Sedangkan pada penelitian Syampurnawati et
al.
tersebut, mutasi NPMJ yang mengekspresikan CD34 negatif
merupakan keseluruhan mutasi, yaitu tipe A dan tipe lainnya. Mutasi NPMJ kebanyakan
ditemukan pada subjek dengan kariotipe normal. Hal ini
berbeda dengan hasil yang karni dapatkan. Dari 8 subjek dengan mutasi yang dapat diketahui kariotipenya dan dari
6
NPMJ,
hanya
6
subjek tersebut hanya 1 yang memiliki
kariotipe normal. Perbedaan ini dapat disebabkan
karena jumlah sampel yang sedikit dan
tidak diketahu i kariotipe dari 2 subjek yang lain.
29
....
--
--
-
--
--
-
-
BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN
VI.l. KESIMPULAN 1 . Tipe mutasi NPMJ yang berhasil dideteksi adalah tipe A .
2. Frekuensi kejadian mutasi NPMJ tipe A yaitu 23,53%.
3. Mutasi NPMJ mengekspresikan CD34 dan HLA-DR. 4. Mutasi NPMI memiliiki gambaran sitogenetik abnormal. VI.2. SARAN
Perlu pengtm1pulan sampel yang lebih banyak lagi agar data yang diperoleh benar
1.
benar dapat dipecaya.
2.
Perlu dilakukan pengulangan pembuatan kariotipe pada
12 sampel yang tidak
memiliki metafase agar hasil sitogenetiknya relevan dan dapat dipertanggungjawabkan
•
30
...._,
- -- -
-
-
-
-
-
-
- --"""" . • "" .
UCAPAN TERIMA KASIH
1.
Badan Litbangkes Kementrian Kesehatan Republik Indonesia.
2.
Seluruh panitia RISBIN IPTEKDOK 201 1 .
3.
Seluruh Panel Pakar paneli III (penyakit tidak menular) RISBIN IPTEKDOK 201 1 .
4.
Divisi Hematologi Onkologi Medik (HOM) Departemen Ilm� Penyakit Dalarn, Rumah Sakit Cipto Mangunkusumo, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
5.
Laboratorium Patologi Klinik Rurnah Sakit Kanker Dhannais.
6.
Poliklinik Hematologi Ilmu Penyakit Dalam Rumah Sakit Cipto Mangunkusumo.
7.
Laboratorium Sitogenetik Divisi Hematologi Onkologi Medik (HOM) RSCM/FKUI.
8.
Laboratorium Biologi Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
9.
Lembaga Biologi Molekuler Eijkman.
10.
Laboratorium Patologi Molekuler Departemen Patologi Anatomi RSCM/FKUI.
11.
Timja Hematologi Onkologi Medik RS.Kanker Dharmais: dr. Nugroho Prayogo, SpPD-KHOM, dr. Ronald Hukom, SpPD-KHOM, Dr.dr. Abidin Widjanarko, SpPD KHOM, dr. Syafrizal Syafei, SpPD-KHOM .
•
31
DAFTAR PUSTAKA
1.
Kurnianda J. Leukemia mieloblastik akut. Dal.am: Sudoyo AW, Setiyohadi B, Alwi I, Kolopaking MS, Setiati S, editor. Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam. Jakarta: Pusat
2.
Penerbitan Departemen Ilmu Penyakit Dalam FKUI. h. 7 1 6-22. · National Comprehensive Cancer Network (NCCN). Practice Guidelines in Acute Myeloblastic Leukemia [serial online] 2008 [cited 2010 May 1 0). Available from: URL: http://www.nccn.org/professionals/physician gls!f guidelines.asp
3.
Data Rekam Medis Rumah Sakit Kanker Dharmais. Jakarta, Indonesia. 2008. Data tidak dipublikasikan.
4.
American Cancer Society (ACS). Detailed Guide: Leukemia - Acute Myeloid (AML). How Is Acute Myeloid Leukemia (AML) Classified? (serial online] 2009 (cited 2010
10].
May
from:
Available
URL:
4 3x how is acute myeloid leuke
http://www.cancer. org/docroot/cri/content/cri 2 mia aml classified.asp 5.
Grimwade D, et al. The Importance of Diagnostic Cytogenetics on Outcome in AML: Analysis
of
1,612
Patients
Entered
Into
the
MRC
AML
10 Trial. Blood
1 99 8;92(7) :2322-33. 6.
Syampurnawati M, et al. HLA-DR-negative AML (Ml and M2): FLT3 mutations
(liD and D835) and cell-surface antigen expression. Leuk Res 2006;3 1 (7):92 1 -9. 7.
Syampurnawati M, et al. DR negativity is a distinctive feature of M1/M2 AML cases with NPMl mutation. Leuk Res
8.
2008;32 : 1 141-3.
Boonthimat C. 2008. Identification of NPMJ mutaion and its prognostic impact in Thai adult acute myeloid leukemia. Thesis for Master Science. Mahidol University
133 hlm. 9.
•
Calvo KL, et al. Detection of the nucleophosmin gene mutations in acute myelogenous leukemia through RT-PCR and polyacrylamide gel electrophoresis. Eur J Haematol. 2009 Jan;82( 1 ):69-72.
10. Ottone T, et al.
An allele-specific RT-PCR assay to detect type A mutation of the
Nucleophosmin- 1 gene in acute myeloid leukemia. Journal of Molecular Diagnostics 2008 ; 1 0(3):212-16. 1 1 . Verhaak RG, et al. Mutations in nucleophosmin (NPM l ) in acute myeloid leukemia (AML): association with other gene abnormalities and previously established gene
32
...., ,
-
�
-
-
---
-
--
- ---
and
signatures
expression
their
prognostic
favorable
significance.
Blood
2005;1 06:3747-54. 12. Tan AYC, et al. Detection of NPMI exon 12 mutations and FLT3-intemal tandem duplications by high resolution melting analysis in normal karyotype acute myeloid leukemia. Journal of Hematology & Oncology 2008;! : 1 0.
..
13. Falini B, et al. Immunohistochemistry predicts nucleophosmin (NPM) mutations in acute myeloid leukemia. Blood. 2006 Sep 1 5 ; 1 08(6):1 999-2005. 14. Deschler B, Ltibbert M. Acute myeloid leukemia: epidemiology and etiology. Cancer 2006 ; 1 07(9):2099- 1 07. 15. American Cancer Society (ACS). Detailed Guide: Leukemia - Acute Myeloid (AML) What Are the Risk Factors for Acute Myeloid Leukemia (AML)? (serial online] 2009 June
2010
[cited
06
May
Available
10].
from:
URL:
http://wwvv .cancer.org/docroot!CRI/content!CRI 2 4 2x What Are the Risk Factor s for Acute Myeloid Leukemia AML.asp?mav=cri 16. Parcells BW, et al. FMS-Iike tyrosine kinase 3 in normal hematopoeisis and acute myeloid leukemia. Stem Cells 2006;24: 1 1 74-84. 17. Lindstrom MS. NPM1/B23: A multifunctional chaperone in ribosome biogenesis and chromatin remodelling. Biochemistry Research International. 201 0;20 1 1 ; 1-16. 18. Grisendi S, et al. Nucleophosmin and cancer. Nature Reviews. 2006;6;493-505. 19. Colombo E, et al. Delocalization and destabilization of the Arf tumor suppressor by the leukemia-associated NPM mutant. Cancer Research. 2006;66(6);3044-50. 20. Falini B, et al. Acute myeloid leukemia carrying cytoplasmic/mutated nucleophosmin (NPMc+ AML): biological and clinical features. Blood. 2006;1 -49. 2 1 . Schnittger S, et al. Nucleophosmin gene mutations are predictors of favorable prognosis
m
acute
myelogenous
leukemia
with
a
normal
karyotipe.
Blood
2005; 1 06:373-9 . •
22. Suzuki T, et al. Clinical characteristics and prognostic implications ofNPMI mutations in acute myeloid leukemia. Blood 2005;106:2854-6 1 . 23. Dohner K,
Dohner H.
Molecular characterization of acute myeloid leukemia.
Haematologica 2008;93(7);976-82 24. Falini B, et al. Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a normal karyotipe. N Eng J Med 2005;352:254-66.
33
...j
-
--
-
-
-
�
--
.
-� - �
25. Green EK. Allele Specific Oligonucleotide PCR. In: Theophilus BDM, Rapley R, editors. PCR Mutation Detection Protocols. New Jersey: Humana Press Inc., 2002; p.47-50.
•
34
ql
-�-- ---
-
-
---�
--
-- ------- --
Lampiran 1 Personalia Penelitian
1.
2.
3.
Ketua Peneliti a.
Nama Lengkap
: Delta Fermikuri Akbar, S.Si.
b.
Jenis Kelamin
: liP
c.
NIP
d.
Disiplin ilmu
e.
Pangkat/Golongan
f.
Jabatan fungsionallstruktural: -
g.
Fakultas/Jurusan
: Kedokteran Universitas Indonesia/Ilmu Biomedik
h.
Waktu penelitian
: 16 jam/minggu
Anggota Peneliti a.
Nama Lengkap
: dr. Lyana Setiawan, SpPK.
b.
Jenis Kelamin
: b/P
c.
NIP
: 19750823 200801 2 0 1 3
d.
Disiplin ilmu
: Kedokteran
e.
Pangkat/Golongan
: Penata muda Tk.IIIIIB
f.
Jabatan fungsionallstruktural: Dokter pertama
g.
Fakultas/1urusan
: Kedokteran Universitas Indonesia!Kedokteran
h.
Waktu penelitian
: 16 jam/minggu
Tenaga Laboran/Teknisi 1.
2. •
4.
: Biologi Molekuler
Nama
Dra. lndahwati
Keahlian
Sitogenetik
Nama
Dra. Indarini
Keahlian
lmmunophenotyping
Tenaga Administrasi Drs. Purwanto
35
m
-- -
-·
-:
��-=-
- --
� -
-
--
.
-
-
- ---
Lampiran 2 Posisi Primer untuk ASO-RT-PCR NPMJ tipe A
1 agaaaggagt ggggttgaaa agcgcttgcg caggacggct acggtacggg ggtgggaggg 6 1 cttcggagca cgcgcgcgga ggcgggactt gggaagcgct cgcgagatct tcagggtcta 1 2 1 tatataagcg cggggagcct gcgtcctttc cctggtgtga ttccgtcctg cgcggttgtt 181
ctctggagca gcgttctttt atctccgtcc gccttctctc cta
2 4 1 acccgatgga agattcgatg gacatggaca tgagccccct gaggccccag aactatcttt 3 0 1 tcggttgtga actaaaggcc gacaaagatt
atcactttaa ggtggataat gatgaaaatg
3 6 1 agcaccagtt atctttaaga acggtcagtt taggggctgg tgcaaaggat gagttgcaca 4 2 1 ttgttgaagc agaggcaatg aattacgaag gcagtccaat taaagtaaca ctggcaactt 4 8 1 tgaaaatgtc tgtacagcca acggtttccc ttgggggctt tgaaataaca ccaccagtgg 5 4 1 tcttaaggtt gaagtgtggt tcagggccag tgcatattag tggacagcac ttagtagctg 6 0 1 tggaggaaga tgcagagtca gaagatgaag aggaggagga tgtgaaactc ttaagtatat 6 6 1 ctggaaagcg gtctgcccct ggaggtggta gcaaggttcc acagaaaaaa gtaaaacttg 7 2 1 ctgctgatga agatgatgac gatgatgatg aagaggatga tgatgaagat gatgatgatg 7 8 1 atgattttga tgatgaggaa gctgaagaaa aagcgccagt gaagaaatct atacgagata 8 4 1 ctccagccaa aaatgcacaa aagtcaaatc agaatggaaa agactcaaaa ccatcatcaa 901 caccaagatc aaaaggacaa gaat ccttca agaaacagga aaaaactcct aaaacaccaa 9 6 1 aaggacctag ttctgtagaa gacattaaag caaaaatgca agcaagtata gaaaaaggtg 1 0 2 1 gttctcttcc caaagtggaa gccaaattca tcaattatgt
b
J
gaagaattgc ttccggatga
1 0 8 1 ctgaccaaga ggctattcaa gatctctggc agtggaggaa gtctctttaa gaaaatagtt 5 ' - caaga ggctattcaa gatctctJct - 3 '
posisi dan sek:uen primer NPM-A
1 1 4 1 taaacaattt gttaaaaaat tttccgtctt atttcatttc tgtaacagtt gatatctggc 1 2 0 1 tgtccttttt ataatgcaga gtgagaactt tccctaccgt gtttgataaa tgttgtccag 1 2 6 1 gttctattgc caagaatgtg ttgtccaaaa tgcctgttta gtttttaaag atggaactcc 1 3 2 1 accctttgct tggttttaag tatgtatgga atgttatgat aggacatagt agtagcgg tg
posisi primer NPM-REV-6 sekuen primer NPM-REV-6
1 3 8 1 gtcagacatg gaaat ggt gg ggagacaaaa atatacatgt ct ca acats saaa tqg_ gagtctgtac ctttacca-5' 1 4 4 1 aataaagta
36
gg
�
3 ' ccac
gaaataaaac tcagtatttt
Lampiran 3 Posisi Primer untuk Seminested-ASO-RT-PCR NPMI tipe A
1 agaaaggagt ggggttgaaa agcgcttgcg caggacggct acggtacggg ggtgggaggg
6 1 cttcggagca cgcgcgcgga ggcgggactt gggaagcgct cgcgagatct tcagggtcta 1 2 1 tatataagcg cggggagcct gcgtcctttc cctggtgtga ttccgtcctg cgcggttgtt
1 8 1 ctctggagca gcgttctttt a t ctccgtcc gccttctctc ct�cctaagt gcgtgccgcc 2 4 1 acccgatgga agattcgatg gacatggaca tgagccccct gaggccccag aactatcttt 3 0 1 tcggttgtga actaaaggcc gacaaagatt atcactttaa ggtggataat gatgaaaatg 3 6 1 agcaccaqr:t atctttaaga acggtcagtt taggggctgg tgcaaaggat gagttgcaca 4 2 1 ttgttgaagc agaggcaatg aattacgaag gcagtccaat taaagtaaca ctggcaactt 4 8 1 tgaaaatgtc tgtacagcca acggtttccc ttgggggctt tgaaataaca ccaccagtgg 5 4 1 tcttaaggtt gaagtgtggt tcagggccag tgcatattag tggacagcac ttagtagctg 6 0 1 tggaggaaga tgcagagtca gaagatgaag aggaggagga tgtgaaactc ttaagtatat 6 6 1 ctggaaagcg gtctgcccct ggaggtggta gcaaggttcc acagaaaaaa gtaaaacttg 7 2 1 ctgctgatga agatgatgac gatgatgatg aagaggatga tgatgaagat 7 8 1 atgattttga tgatgaggaa gctgaagaaa aagcgccagt gaagaaatct
8 4 1 ctccagccaa aaatgcacaa aagtcaaatc agaatggaaa agactcaaaa 9 0 1 caccaagatc aaaaggacaa gaatccttca agaaacagga aaaaactcct 9 6 1 aaggacctag ttctgtagaa gacattaaag caaaaatgca agcaagtata
1 0 2 1 gttctcttcc caaagtggaa gccaaattca tcaattatgt gaagaattgc 1 0 8 1 ctgaccaaga ggctattcaa ga-cct:ctggc agtggaggaa gtctctttaa
5 ' -caa a taaacaattt 1 2 0 1 tgtccttttt 1 2 6 1 gttctattgc 1 3 2 1 accctttgct 1141
atctctgtc tttccgtctt gtgagaactt ttgtccaaaa tatgtatgga
tg-3'
gatgatgatg atacgagata ccatcatcaa aaaacaccaa gaaaaaggtg ttccggatga gaaaatagtt
posisi dan sekuen primer NPM-AN
atttcatttc tgtaacagtt gatatctggc tccctaccgt gtttgataaa tgttgtccag tgcctgttta gtttttaaag atggaactcc atgttatgat aggacatagt ag tagcggtg
posisi primer NPM-REV-6 sekuen primer NPM-REV-6
1381
1441
99t
3' -ccac gt cagaca tg gaaatggtgg ggagacaaaa atatacatgt gaaataaaac tcagtatttt ctca ac� gagtctgtac aataaagta
37
�d
�-� -
-
-
--- -
-
-
�
-
-
-
�
-
Lampiran 4 Posisi Primer untuk RT-PCR NPMJ ekson 12 1 agaaaggagt ggggttgaaa agcgcttgcg caggacggct acggtacggg ggtgggaggg 61 cttcggagca cgcgcgcgga ggcgggactt gggaagcgct cgcgagatct tcagggtcta 121 tatataagcg cggggagcct gcgtcctttc cctggtgtga ttccgtcctg cgcggttgtt 'l- Q l. 10 i::. 10-e'3'3Q.'90CL '3"''9ttotttt c:>totoogtoo goottotctc ctaectaagt gcgtgccgcc 2 4 1 acccgatgga agattcgatg gacatggaca tgagccccct gaggccccag aactatcttt 301 tcggttgtga actaaaggcc gacaaagatt atcactttaa ggtggataat gatgaaaatg 3 6 1 agcaccagtt atctttaaga acggtcagtt taggggctgg tgcaaaggat gagttgcaca 4 2 1 ttgttgaagc agaggcaatg aattacgaag gcagtccaat taaagtaaca ctggcaactt 4 8 1 tgaaaatgtc tgtacagcca acggtttccc ttgggggctt tgaaataaca ccaccagtgg 5 4 1 tcttaaggtt gaagtgtggt tcagggccag tgcatattag tggacagcac ttagtagctg 601 tggaggaaga tgcagagtca gaagatgaag aggaggagga tgtgaaactc ttaagtatat 661 ctggaaagcg gtctgcccct ggaggtggta gcaaggttcc acagaaaaaa gtaaaacttg 7 2 1 ctgctgatga agatgatgac gatgatgatg aagaggatga tgatgaagat gatgatgatg 7 8 1 atgattttga tgatgaggaa gctgaagaaa aagcgccagt gaagaaatct atacgagata 8 4 1 ctccagccaa aaatgcacaa aagtcaaatc agaatggaaa agactcaaaa ccatcatcaa 901 caccaagatc aaaaggacaa gaatccttca agaaacagga aaaaactcct aaaacaccaa 961 aaggacctag ttctgtagaa gacattaaag caaaaatgca agcaagtata gaaaaaggtg 1 0 2 1 gttctcttcc caaagtggaa gccaaattca tcaattatgt gaagaattgc ttccggatga 5 ' -h..,t tc cg_9at � 1081 ggctattcaa gatctctggc agtggaggaa gtctctttaa gaaaatagtt ,g-3 ' posisi dan sekuen primer NPM-F gttaaaaaat tttccgtctt atttcatttc tgtaacagtt gatatct_ggc ataatgcaga gtgagaactt tccctaccgt gtttgataaa tgtt gtccag
1141 1201
posisi primer NPM-R
kgt gtttgataaa tgt tgtcc
ad
sekuen primer NPM-R 3' -gca caaactattt acaacaggtc
1 2 6 1 gttct attgc caagaatgtg ttgtccaaaa tgcctgttta gtttttaaag atggaactcc
(g
c- 5 '
1 3 2 1 accctttgct tggttttaag tatgtatgga atgttatgat aggacatagt agtagcggtg 1 3 8 1 gtcagacatg gaaatggtgg ggagacaaaa atatacatgt gaaataaaac tcagtatttt 1 4 4 1 aataaagta
38
-
�
-
-
-
.
----
-
--
- - -- ---
LEMBAR P�GESAHAN RISBIN IPTEKDOK 2011
: Deteksi Mutasi .\'ucleophosmin (NPM 1 ) dan
l . Judul riset
Hubungannya dengan Imm unophenotyping dan Sitogenetik Pada Pasien Lewkemia M i e l o b lastik Akut
2.
3.
Periset utama a.
Nama lengkap dan gelar akademik
: Delta Fermikuri Akbar, S.Si.
b.
Jenis kelamin
: Perempuan
c. d.
Pangkat/Golongan/NIP Fakultas!Departemen
: Kedokteran/IImu Penyak:it Dalam, Divisi Hematologi Onkologi Medik
Periset utama No 1
4.
(LMA)
Nama Periset
Wak.-tu Riset
(jam/pekan)
Pendidikan terakhir
NIPIN UP
16
Sl
-
Delta Fermikuri Akbar
Periset anggota
No 1
'Nama Periset
Wak.-tu Riset
Pendidikan tera.kbir
Qam/pekan)
Lyana Setiawan
NIP/NUP
Dokter Spesialis
16
19750823 200801 2 013
2
5.
Surat Keputusan Kepala Badan Litbang Kesehatan a. Nomor : HK.03.05/l/393/20 1 1 b.
: 1 9 Januari 2011
6.
Tanggal Lama riset
7.
Tahun pendanaan
: 201 1
8.
Total biaya riset
: Rp.
: 6 bulan 130.298.000,00
Jakarta, 27 Desember 201 1
� �,pie�a� F
Periset Utama
Delta Fermikuri Akbar, S.Si.
ultas/Ketua Program Pascasatjana UII 0 Kepala Pusat Riset $ \ .,
; wu·'� �li/2())/J'YYA //
��� �[f),� �� ? , ·
z
Mengetahui,
.
¥ c ..:.� ... �/'�t . R.Dr. � A·- AJatna Sitompul, ,,/ / vSp.M(K) -r � ;,f j; �it-.JP .� I
'=' � *,..... �
.
tlt1 4s no -..;:;;::
.
/N
1961 0206 198703 2 005
'
.fl
--
-
-
-
--
-
-
- -
---
