DETEKSI GEN RESISTAN CHLORAMPHENICOL DAN ERYTHROMYCIN PADA PLASMID BAKTERI ASAM LAKTAT DARI PANGAN FERMENTASI TRADISIONAL INDONESIA SKRIPSI

UNIVERSITAS INDONESIA

DETEKSI GEN RESISTAN CHLORAMPHENICOL DAN ERYTHROMYCIN PADA PLASMID BAKTERI ASAM LAKTAT DARI PANGAN FERMENTASI TRADISIONAL INDONESIA

SKRIPSI

IKRIMAH MUZDALIFAH 0706263920

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM PROGRAM STUDI BIOLOGI DEPOK JANUARI 2012

Deteksi gen ..., Ikrimah Muzdalifah, FMIPA UI, 2012

UNIVERSITAS INDONESIA

DETEKSI GEN RESISTAN CHLORAMPHENICOL DAN ERYTHROMYCIN PADA PLASMID BAKTERI ASAM LAKTAT DARI PANGAN FERMENTASI TRADISIONAL INDONESIA

SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains

IKRIMAH MUZDALIFAH 0706263920

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM PROGRAM STUDI BIOLOGI DEPOK JANUARI 2012

ii Deteksi gen ..., Ikrimah Muzdalifah, FMIPA UI, 2012



KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur penulis panjatkan hanya kepada ALLOH subhanallohu wata’ala atas semua rahmat, karunia, dan petujuk sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi ini. Shalawat dan salam selalu tercurah kepada Rasululloh sholallohu ‘alaihi wasalam, sang rahmat bagi seluruh alam. Penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada: 1. Dr. Abinawanto selaku Pembimbing I dan A. Zaenal Mustopa, M.Si sebagai Pembimbing II atas semua bimbingan, ilmu, kesabaran, dukungan, doa, serta pengorbanan waktu dan pikiran selama penulis menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi. 2. Dr. Wibowo Mangunwardoyo dan Dra. Setiorini, M.Kes selaku Dosen Penguji dan Koordinator Seminar atas saran, masukan, kritik, dan bantuan yang diberikan selama penulisan skripsi. 3. Dr. Dra. Nisyawati, M.S selaku Penasihat Akademik atas kasih sayang, perhatian, nasehat, dan doa selama penulis menimba ilmu di Departemen Biologi FMIPA UI. 4. Dr.rer.nat. Mufti Petala Patria, M.Sc., selaku Ketua Departemen Biologi FMIPA UI, Dra. Nining Betawati Prihantini, M.Sc selaku Sekretaris Departemen, dan Dra. Titi Soedjiarti, S.U selaku Koordinator Pendidikan, beserta segenap staf pengajar atas semua ilmu pengetahuan yang diberikan selama perkuliahan. Tak lupa penulis ucapkan terima kasih untuk Mba Asri, Ibu Ida, Ibu Ros, dan seluruh karyawan Departemen Biologi UI atas segala bantuan yang diberikan kepada penulis. 5. Keluarga tercinta: Ibu (Jumiati) dan Ayah (Muhidi, S.T) yang senantiasa mencurahan cinta, kasih sayang, perhatian, pengertian, kesabaran, bimbingan, nasehat, dukungan, doa, dan segala hal terbaik yang diberikan demi keberhasilan penulis. Untuk adik tercinta, Muhammad Iqbal Shibghatallah dan seluruh keluarga besar penulis atas kasih sayang, keceriaan, dukungan, dan doa yang diberikan kepada penulis.

v Deteksi gen ..., Ikrimah Muzdalifah, FMIPA UI, 2012

6. Kepala Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI atas izin penelitian yang telah diberikan kepada penulis. Terima kasih pula penulis ucapkan untuk Mas Ridwan, Mbak Linda, Maya, Reni, Bowo, Patur, Bu Emi, Kak Bobby, Mas Ace, Mba Rere, Mas Kukun, dan Meita atas segala keceriaan, bantuan, motivasi, semangat, dan kebersamaan yang diberikan kepada penulis selama melakukan penelitian. 7. Maridha Normawati, Putsan, Gita, dan Tewe, Naya, Fika, Kymbod, Bayu, Karno, Tiwi, Kiki, Ade, Arty, Fahda, Iis, Teh Anggi ’06, CT HIMBIO ‘09 dan semua anggota keluarga besar BLOSSOM 07 atas segala dukungan, persahabatan, keceriaan, bantuan, dan semangat yang diberikan kepada penulis.

Akhir kata, penulis memohon maaf yang apabila terdapat hal yang kurang berkenan. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

Penulis

2011

vi Deteksi gen ..., Ikrimah Muzdalifah, FMIPA UI, 2012


ABSTRAK

Nama : Ikrimah Muzdalifah Program Studi : Biologi S1 Reguler Judul : Deteksi Gen Resistan Chloramphenicol dan Erythromycin pada Plasmid Bakteri Asam Laktat dari Pangan Fermentasi Tradisional Indonesia

Penelitian bertujuan untuk mendeteksi gen resistan chloramphenicol dan erythromycin pada plasmid bakteri asam laktat (BAL) yang diisolasi dari pangan fermentasi tradisional Indonesia. Sebanyak 120 isolat bakteri asam laktat diuji resistansinya terhadap chloramphenicol 2 μg/ml dan erythromycin 1 μg/ml. Hasil penapisan menunjukkan sebanyak 49 isolat resistan terhadap chloramphenicol dan 16 isolat resistan terhadap erythromycin. Isolasi plasmid dilakukan pada isolat yang resistan dan diketahui plasmid terdapat pada isolat D2, T8, dan S34. Plasmid tersebut selanjutnya dideteksi dengan menggunakan lima pasang primer, yaitu cat, catpIP501, ermB, ermC, dan Tn554. Hasil menunjukkan gen resistan chloramphenicol (cat) berhasil dideteksi pada plasmid BAL dari pangan fermentasi tradisional Indonesia, sedangkan gen resistan erythromycin (ermB) tidak berhasil dideteksi.

Kata kunci

: Bakteri asam laktat, Chloramphenicol, Erythromycin, Gen resistan, Plasmid.

xiii + 84 halaman; 20 gambar ; 13 lampiran; 8 tabel Daftar referensi : 81 (1973--2011)

viii

Universitas Indonesia


ABSTRACT

Name : Ikrimah Muzdalifah Study Program: Biology S1 Regular Title : Detection of Chloramphenicol and Erythromycin Resistance Genes on Plasmid of Lactic Acid Bacteria Isolated from Indonesian Traditional Fermented Foods

The research investigated to detect the chloramphenicol and erythromycin resistance genes on plasmid of lactic acid bacteria (LAB) isolated from Indonesian traditional fermented foods. A total 120 isolates were screened for resistance to 2 μg/ml chloramphenicol and 1 μg/ml erythromycin. The result showed that 49 isolates were resistance to chloramphenicol and 16 isolates were resistance to erythromycin. Plasmids from potential isolates then isolated and has been known there were in isolate D2, T8, and S34. Plasmids then has been detected with 5 pairs of specific primers: cat, catpIP501, ermB, ermC, and Tn554. The result showed that chloramphenicol resistance gene (cat) has successfully detected on plasmid of LAB from Indonesian traditional fermented foods, however the erythromycin resistance gene (ermB) has not detected. Keywords

: Chloramphenicol, Erythromycin, Lactic acid bacteria, Plasmid, Resistance gene.

13 appendices; xiii + 84 pages; 20 pictures; 8 tables Bibliography : 81 (1973--2011)

ix



DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ……………………………………………...……… HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ……………...…………. HALAMAN PENGESAHAN ……………………………………….…… KATA PENGANTAR …………………………………………………… HALAMAN PERNYATAAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ………………………………………….. ABSTRAK ……………………………………………………………….. ABSTRACT …………………………………………………………………….. DAFTAR ISI ……………………………………………………………... DAFTAR GAMBAR …………………………………………………….. DAFTAR TABEL ………………………………………………………... DAFTAR LAMPIRAN …………………………………………………...

vii viii ix x xii xiii xiii

1. PENDAHULUAN ……………………………………………………

1

2. TINJAUAN PUSTAKA …………………………………………….. 2.1 Bakteri asam laktat (BAL) ……………………………………... 2.1.1 Karakteristik BAL …………………..…………………… 2.1.2 Bakteri asam laktat pada produk pangan fermentasi …….. 2.2 Plasmid …………………………………………………………... 2.2.1 Plasmid BAL ………………..…………………………… 2.2.2 Plasmid sebagai vektor pengklonaan …….……………… 2.3 Gen resistan antibiotik ……………………………..…………….. 2.3.1 Gen resistan chloramphenicol ……………….…………... 2.3.2 Gen resistan erythromycin …………………….…………….. 2.4 Deteksi gen dengan teknik polymerase chain reaction (PCR) …... 2.4 Teknik biologi molekuler …….………………………………….. 2.4.1 Isolasi plasmid …………………………………………… 2.4.2 Elektroforesis gel agarosa ……..………………………… 2.4.3 Purifikasi produk PCR …….……………………………... 2.4.4 Sequencing DNA ………………………………………… 2.4.5 Analisis hasil sequencing …………….…………………..

4 4 4 5 6 6 9 9 9 11 12 14 15 16 17 18 19

3. METODE PENELITIAN……………………………………………. 3.1 Lokasi dan waktu penelitian .…………………………………….. 3.2 Bahan …………………………………………………………….. 3.2.1 Sampel …………………………………………………… 3.2.2 Primer ……………………………………………………. 3.2.3 Larutan dan dapar .……………………………………….. 3.2.4 Kit ………………………………………………………... 3.2.5 Medium ………………....……………………………….. 3.2.6 Bahan kimia …………………..………………………….. 3.3 Alat ………………………………………………………………. 3.4 Cara kerja …….…………………………………………………..

20 20 20 20 20 21 21 22 22 23 23

x

ii iii iv v



3.4.1 Pembuatan larutan, dapar, dan medium ………………..... 3.4.2 Penapisan BAL dengan chloramphenicol dan erythromycin ……………………………………………... 3.4.3 Isolasi plasmid ……………………………………………. 3.4.3.1 Metode alkaline lysis minipreparation ……..…… 3.4.3.2 Metode alkaline lysis midipreparation ………...… 3.4.3.3 Metode Qiagen Plasmid Midi Kit ……………….. 3.4.4 Elektroforesis gel agarosa ……………………………..… 3.4.5 Polymerase chain reaction (PCR) ……………………..… 3.4.6 Purifikasi produk PCR ……………………………….…... 3.4.7 Sequencing DNA ………………………………………… 3.4.8 Analisis sekuen nukleotida …………………………..…...

24 24 25 26 28 29 29 30 30

4. HASIL DAN PEMBAHASAN ……………………………………... 4.1 Penapisan BAL dengan chloramphenicol dan erythromycin ….… 4.2 Isolasi plasmid bakteri asam laktat (BAL) ..….….….…………… 4.2.1 Metode alkaline lysis minipreparation …………….……. 4.2.2 Metode alkaline lysis midipreparation ………..….….…….. 4.2.3 Metode Qiagen Plasmid Midi Kit ….…….…………….…. 4.3 Polymerase chain reaction (PCR) ….…………………….….………. 4.3.1 Hasil deteksi gen resistan chloramphenicol ….….….….... 4.3.2 Hasil deteksi gen resistan erythromycin ……….….….….. 4.4 Purifikasi produk PCR …………………………………………… 4.5 Sequencing dan analisis sekuen nukleotida …………..…….……. 4.5.1 Gen resistan chloramphenicol (cat) …………….….……. 4.5.2 Gen resistan erythromycin (ermB) …………….….……...

31 31 34 34 38 41 43 44 46 50 51 53 53

5. KESIMPULAN DAN SARAN ……………………………………… 5.1 Kesimpulan ………………………………………………………. 5.2 Saran ……………………………………………………………...

56 56 56

DAFTAR REFERENSI …………………………………………………

57

xi

23 23



DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1.1 Gambar 2.2.1 Gambar 2.3.1.(1) Gambar 2.3.1.(2) Gambar 2.3.2.(1) Gambar 2.3.2.(2) Gambar 2.4 Gambar 2.5.3 Gambar 4.1 Gambar 4.2.1.(1) Gambar 4.2.1.(2) Gambar 4.2.1.(3) Gambar 4.2.2 Gambar 4.2.3 Gambar 4.3.1 Gambar 4.3.2 Gambar 4.4.(1) Gambar 4.4.(2) Gambar 4.5.1 Gambar 4.5.2

Bentuk sel BAL ……………………………………. Peta plasmid pLFE1 ………………………………... Skema mekanisme aksi chloramphenicol ………….. Mekanisme inaktivasi chloramphenicol …………… Mekanisme aksi erythromycin ……………………... Mekanisme resistansi erythromycin ………………... Skema proses PCR …………………………………. Prinsip kerja purifikasi produk PCR ……………….. Perubahan warna media sebelum dan setelah inkubasi kultur BAL overnight……………………... Hasil visualisasi isolasi plasmid alkaline lysis minipreparation ……………………………………. Hasil visualisasi isolasi plasmid alkaline lysis minipreparation ……………………………………. Hasil visualisasi isolasi plasmid alkaline lysis minipreparation ……………………………………. Hasil visualisasi isolasi plasmid alkaline lysis midipreparation ……………………………………. Hasil visualisasi isolasi plasmid Qiagen Plasmid Midi Kit …………………………………………….. Hasil visualisasi produk PCR dengan primer cat …... Hasil visualisasi produk PCR dengan primer ermB .. Hasil visualisasi purifikasi produk PCR plasmid T8 dengan primer cat …………………………………... Hasil visualisasi purifikasi produk PCR plasmid T8 dengan primer ermB ……………………………….. Sekuen nukleotida gen cat pada plasmid T8 dengan primer cat …………………………………………... Sekuen nukleotida gen ermB pada plasmid T8 dengan primer ermB ………………………………..

xii

5 8 10 10 11 12 14 18 31 35 36 36 39 42 45 47 51 52 53 54



DAFTAR TABEL Tabel 3.2.2

Primer yang digunakan dalam penelitian .............................

21

Tabel 3.2.4

Kit yang digunakan dalam penelitian ……….......................

22

Tabel 3.4.5

Komposisi reaksi PCR ………………………………..........

27

Hasil penapisan BAL dengan chloramphenicol atau erythromycin…………………………………………………...... Tabel 4.1.(2) Hasil pengujian isolat BAL yang resistan terhadap kombinasi chloramphenicol dan erythromycin ………..……. Tabel 4.2.3 Hasil pengukuran kuantitas hasil isolasi plasmid BAL ……

32

33 43

Tabel 4.3.1

Hasil deteksi gen resistan chloramphenicol ..………….……

46

Tabel 4.3.2

Hasil deteksi gen resistan erythromycin …….………………..

48

Tabel 4.1.(1)

DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1 Lampiran 2 Lampiran 3 Lampiran 4 Lampiran 5 Lampiran 6 Lampiran 7 Lampiran 8 Lampiran 9 Lampiran 10 Lampiran 11 Lampiran 12 Lampiran 13

Skema alur penelitian …………………………………… Cara pembuatan larutan, dapar, dan medium yang digunakan dalam penelitian ……………………………….. Komposisi medium de Mann, Rogosa, Sharpe (MRS) .….. Elektroferogram hasil sequencing produk PCR plasmid T8 dengan primer cat ………………………………………….. Elektroferogram hasil sequencing produk PCR plasmid T8 dengan primer ermB ……………………...……………….. Hasil analisis sekuen nukleotida produk PCR plasmid T8 dengan primer cat …………………………………..……... Hasil analisis sekuen nukleotida produk PCR plasmid T8 dengan primer ermB ………………………………..……... Standard warna PANTONE ® color bridgeTM CMYK PC .. Perhitungan hasil isolasi DNA plasmid dengan metode Qiagen Plasmid Midi Kit dari hasil elektroforesis ……...…. Perhitungan ukuran produk PCR plasmid BAL dengan primer cat dari hasil elektroforesis ……………………….... Perhitungan ukuran produk PCR plasmid BAL dengan primer ermB dari hasil elektroforesis …..…….………….... Perhitungan ukuran purifikasi produk PCR plasmid BAL dengan primer ermB dari hasil elektroforesis ……...…….... Perhitungan ukuran purifikasi produk PCR plasmid BAL dengan primer ermB dari hasil elektroforesis ……..….…....

xiii

66 67 69 70 71 72 73 74 75 77 79 81 83



BAB 1 PENDAHULUAN

Bakteri asam laktat (BAL) sejak lama dimanfaatkan dalam pembuatan produk pangan fermentasi karena digolongkan sebagai mikroorganisme GRAS (Generally Recognized As Safe), yaitu mikroorganisme yang aman jika ditambahkan ke dalam bahan pangan dan bersifat non-toksik (Kusmiati & Malik 2002: 2). Bakteri asam laktat diketahui berperan dalam proses fermentasi produk pangan tradisional Indonesia, di antaranya tape ketan (Sujaya dkk. 2001: 355), tempoyak (Urnemi dkk. 2010: 672) , dadih (Pato dkk. 2005: 103), dan bekasam (Mustopa dkk. 2010: 680). Bakteri asam laktat juga dimanfaatkan dalam bidang kesehatan, yaitu sebagai bahan probiotik, vaksin oral, dan biopreservasi (Rixon & Warner 2003: 2; Kullen & Klaenhammer 2000: 4). Pemanfaatan potensi BAL pada saat ini masih dilakukan secara tradisional. Oleh karena itu, potensi BAL yang sangat luas pada bidang pangan dan kesehatan mendorong para peneliti untuk melakukan studi dan analisis molekuler BAL, salah satunya melalui teknologi rekayasa genetika. Teknologi rekayasa genetika BAL diharapkan dapat meningkatkan kualitas produk pangan dan farmasetik yang berpotensi untuk diaplikasikan pada level industri (Rixon & Warner 2003: 2). Teknologi rekayasa genetika BAL memerlukan beberapa komponen, salah satunya yaitu vektor pengklonaan berupa plasmid BAL yang berukuran kecil (2--5 kb) dan dapat disisipi gen asing. Plasmid BAL yang digunakan sebagai vektor pengklonaan harus memiliki kompatibilitas dengan sel inang dan memiliki gen penanda untuk membedakan sel inang yang berhasil tersisipi vektor rekombinan dengan sel inang yang tidak tersisipi (Schumann 2008: 4). Gen penanda tersebut umum dikenal sebagai penanda seleksi (selectable marker), salah satunya yaitu gen resistan terhadap antibiotik (Wright 1998: 16--17). Plasmid BAL telah diidentifikasi membawa satu atau lebih gen resistan antibiotik. Dua macam sifat resistan antibiotik yang umum digunakan sebagai penanda seleksi dalam manipulasi genetik BAL yaitu sifat resistan terhadap erythromycin dan chloramphenicol (Rixon & Warner 2003: 5). Wang dan Lee

1



2

(lihat Mathur & Singh 2005: 288) melaporkan bahwa terdapat sekitar 25 spesies BAL memiliki plasmid native yang mengandung gen resistan terhadap antibiotik. Plasmid BAL yang memiliki gen resistan terhadap erythromycin di antaranya plasmid pGT633 dari Lactobacillus reuteri (Tannock dkk. 1994: 60), plasmid BAL yang memiliki gen resistan terhadap chloramphenicol di antaranya pLFVM2 dari Lactobacillus fermentum (Alehsin dkk. 1999: 50), dan plasmid yang memiliki gen resistan chloramphenicol dan erythromycin di antaranya pLUL201 dari Lactobacillus reuteri (Ahrne dkk.1992, lihat Shareck dkk. 2004: 181). Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler, Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI saat ini berupaya mengembangkan pembuatan protein rekombinan plantaricin dari BAL sebagai anti-thyposa melalui teknologi rekayasa genetika. Protein rekombinan plantaricin yang terbentuk diharapkan dapat diaplikasikan pada produk pangan fermentasi. Penelitian besar tersebut terbagi menjadi beberapa tahapan, salah satunya yaitu pengkonstruksian vektor yang berasal dari mikroorganisme GRAS. Vektor yang digunakan berupa plasmid BAL yang diisolasi langsung dari pangan fermentasi tradisional Indonesia dan memiliki gen resistan antibiotik chloramphenicol dan erythromycin sebagai penanda seleksi. Vektor plasmid BAL diharapkan memiliki kompatibilitas dengan sel inang. Tahap awal untuk mengembangkan penelitan tersebut adalah dengan cara mendeteksi keberadaan gen resistan chloramphenicol dan erythromycin pada plasmid BAL yang akan digunakan sebagai vektor pengklonaan. Deteksi gen resistan chloramphenicol dan erythromycin penting dilakukan untuk mengetahui letak gen resistan tersebut, karena selain terletak pada plasmid, gen resistan antibiotik juga diketahui terletak pada kromosom (Teuber dkk. 2003: 317). Pendeteksian gen resistan chloramphenicol dan erythromycin pada plasmid BAL dapat dilakukan dengan teknik polymerase chain reaction (PCR) menggunakan primer spesifik (Suttcliffe dkk. 1996: 2562). Teknik PCR digunakan dalam proses pendeteksian karena metode tersebut relatif mudah dan terbukti dalam mendeteksi gen resistan chloramphenicol dan erythromycin pada plasmid BAL dari produk pangan fermentasi tradisional China (Lu Pan dkk. 2011: 1320).

Universistas Indonesia Deteksi gen ..., Ikrimah Muzdalifah, FMIPA UI, 2012

3

Penelitian bertujuan untuk mendeteksi gen resistan chloramphenicol dan erythromycin yang terdapat pada plasmid BAL dari pangan fermentasi tradisional Indonesia. Gen resistan chloramphenicol dan erythromycin yang diketahui terdapat pada plasmid BAL selanjutnya digunakan sebagai penanda seleksi pada tahap transformasi dalam usaha konstruksi vektor rekombinan pada BAL. Hipotesis penelitian yang diajukan yaitu gen resistan chloramphenicol dan erythromycin berhasil dideteksi terdapat pada plasmid BAL dari pangan fermentasi tradisional Indonesia.

Universistas Indonesia Deteksi gen ..., Ikrimah Muzdalifah, FMIPA UI, 2012

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2. 1 Bakteri asam laktat (BAL)

2.1.1 Karakteristik BAL

Bakteri asam laktat (BAL) merupakan kelompok bakteri yang memiliki kemampuan mengubah glukosa menjadi asam laktat sebagai metabolit utama melalui proses fermentasi (Axelsson 2004: 21). Bakteri asam laktat termasuk ke dalam kelompok bakteri Gram positif, non-motil, dan tidak membentuk spora (Pelczar & Chan 2008: 177). Bakteri asam laktat umumnya tumbuh pada pH 4-4,5 dan dapat hidup pada suhu antara 5--45 oC (Jay dkk. 2005: 153), namun suhu 37 oC diketahui sebagai suhu optimum untuk pertumbuhan BAL (Baati dkk. 2004: 137). Bakteri asam laktat dibedakan menjadi dua bentuk berdasarkan morfologi selnya, yaitu bulat (cocci) dan batang (bacilli) (Gambar 2.1.1). Bakteri asam laktat berdasarkan kondisi hidupnya termasuk kelompok bakteri anaerob fakultatif. Bakteri asam laktat mampu tumbuh pada kondisi anaerob, namun tetap dapat tumbuh dengan pada kondisi sedikit oksigen (Axelsson 2004: 22). Bakteri asam laktat terdiri atas sebelas genus, yaitu Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Oenococcus, Streptococcus, Vagococcus, Tetragenococcus, dan Weisella (Todar 2011: 1). Bakteri asam laktat juga dapat dibedakan menjadi dua kelompok berdasarkan produk akhir hasil metabolismenya, yaitu homofermentatif dan heterofermentatif. Kelompok homofermentatif hanya menghasilkan asam laktat selama fermentasi glukosa, sedangkan tipe heterofermentatif menghasilkan asam asetat, etanol, dan karbondioksida disamping asam laktat (Korhonen 2010: 21). Bakteri asam laktat secara alami dapat ditemukan pada susu dan produk olahannya, serealia, sayur-sayuran, serta buah-buahan segar maupun busuk. Bakteri asam laktat merupakan mikroflora normal yang umum ditemukan pada

4



5 rongga mulut, saluran pencernaan dan lapisan mukosa hewan dan manusia (Rixon & Warner 2003: 2; Todar 2011: 1).

(a)

(b)

Keterangan : a. Sel bentuk batang/bacilli (Lactobacillus acidophilus) b. Sel bentuk bulat/cocci (Lactococcus lactis) Gambar 2.1.1. Bentuk sel BAL [Sumber: Todar 2011: 1&5.] 2.1.2 Bakteri asam laktat pada produk pangan fermentasi

Beberapa genus BAL banyak digunakan dalam pembuatan produk pangan. Bakteri asam laktat umumnya digunakan sebagai kultur starter untuk fermentasi pada susu, daging dan sayuran. Proses pengasaman dan enzimatik yang terjadi selama pertumbuhan BAL berperan dalam perubahan tekstur, rasa, aroma, warna, dan kualitas nutrisi produk fermentasi (Kusmiati & Malik 2002: 2). Oleh karena itu, BAL digolongkan sebagai food grade microorganism atau lebih dikenal sebagai mikroorganisme Generally Recognized As Safe (GRAS), yaitu mikroorganisme yang aman ditambahkan dalam produk pangan karena bersifat non-toksik, bahkan beberapa jenis bakteri tersebut berpotensi sebagai bahan probiotik yang bermanfaat bagi kesehatan (Korhonen 2010: 25). Bakteri asam laktat telah banyak diisolasi dari berbagai macam pangan fermentasi tradisional Indonesia, di antaranya kecap ikan, asinan kubis, acar ketimun, bekasam, dadih, tempoyak, dan tape ketan (Kusumawati dkk. 2003: 39). Dadih merupakan produk fermentasi pada susu kerbau yang berasal dari daerah Sumatera Barat. Proses fermentasi dadih terjadi secara spontan tanpa Universitas Indonesia


6 penambahan starter. Beberapa spesies BAL yang berperan dalam proses fermentasi dadih di antaranya Leuconostoc mesenteroides, Streptococcus faecalis, Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Lactobacillus casei (Pato dkk. 2005: 103). Tempoyak merupakan produk fermentasi tradisional Indonesia yang terbuat dari daging buah durian. Bakteri asam laktat diketahui sebagai mikroorganisme yang mendominasi fermentasi tempoyak (Urnemi dkk. 2010: 672). Beberapa spesies BAL yang telah diisolasi dan diidentifikasi dari tempoyak di antaranya Lactobacillus fersantum, Lactobacillus casei, Leuconostoc fructosum, dan Leuconostoc durionis (Leisner dkk. 2005: 1267; Nur 2005: 16-17). Bekasam merupakan produk fermentasi pada daging yang berasal dari daerah Lampung. Hasil penelitian menunjukkan bahwa bekasam mengandung sejumlah BAL, diantaranya Lactobacillus plantarum (Mustopa dkk. 2010: 680). Tape ketan merupakan pangan fermentasi tradisional Indonesia yang berasal dari beras ketan. Beberapa genus bakteri asam laktat diketahui berperan dalam proses fermentasi tape ketan, di antaranya Pediococcus, Enterococcus, Lactobacillus, dan Weisella (Sujaya dkk. 2001: 355).

2.2 Plasmid

2.2.1 Plasmid BAL

Plasmid merupakan materi DNA ekstrakromosomal dan dapat bereplikasi secara terpisah dari sistem replikasi kromosom (Yuwono 2005: 77). Plasmid telah diidentifikasi terdapat pada beberapa genus BAL (Rixon & Warner 2003: 3). Plasmid BAL umumnya berbentuk sirkuler, namun pada Lactobacillus gasseri ditemukan plasmid yang berbentuk linear (Morelli dkk.2004: 255). Jumlah salinan (copy number) plasmid di dalam satu sel BAL bervariasi dari 1 salinan sampai beberapa ratus salinan per sel. Ukuran plasmid BAL juga bervariasi, yaitu antara 1,5 kilobasa (kb) sampai 600 kb (Shareck dkk. 2004: 157).



7 Plasmid BAL bereplikasi dengan cara semikonservatif yaitu satu untai molekul DNA dijadikan cetakan (template) untuk sintesis untai DNA komplementer dengan bantuan enzim DNA polimerase (Rixon & Warner 2003: 3). Mekanisme replikasi plasmid BAL berkaitan erat dengan stabilitas plasmid, jumlah salinan (copy number), serta kompatibilitas plasmid dengan sel inang (Morelli dkk. 2004: 255). Mekanisme replikasi plasmid BAL terbagi menjadi dua macam, yaitu replikasi lingkaran berputar (rolling circle replication/RCR) dan replikasi theta (Rixon & Warner 2003: 3--4). Plasmid BAL yang berukuran kecil umumnya bereplikasi dengan mekanisme replikasi lingkaran berputar, sedangkan plasmid BAL yang berukuran besar umumnya bereplikasi dengan mekanisme theta. Plasmid BAL yang bereplikasi dengan mekanisme lingkaran berputar di antaranya pLo13 dari Oenococcus oeni, pLEM dari Lactobacillus fermentum, dan pCI411 dari Lactococcus lactis (Morelli dkk. 2004: 256--257). Plasmid BAL yang bereplikasi dengan mekanisme theta di antaranya pFV1201, pJW565 dan pFW094 dari Lactococcus sp. (Rixon & Warner 2003: 3--4; Morelli dkk. 2004: 257). Plasmid BAL umumnya membawa gen-gen tertentu yang memberikan keuntungan tambahan bagi sel inang dalam keadaan tertentu, di antaranya gen resistan antibiotik, gen resistan logam berat, gen yang mengendalikan produksi bakteriosin, dan gen yang mengendalikan metabolisme gula dan karbohidrat (Rixon & Warner 2003: 3; Yuwono 2005: 77). Plasmid BAL telah diidentifikasi membawa satu atau lebih gen resistan terhadap antibiotik. Gen resistan erythromycin dan gen resistan chloramphenicol dilaporkan sebagai gen resistan antibiotik yang sering ditemukan pada plasmid BAL (Shareck dkk. 2004: 177183). Plasmid BAL yang memiliki gen resistan terhadap erythromycin di antaranya: plasmid pGT633 dari Lactobacillus reuteri (Tannock dkk. 1994: 60); pTE80 dari Lactobacillus reuteri L1, pTE15 dari Lactobacillus reuteri N16 (Lin & Chung 1999: 31) dan pLFE1 dari Lactobacillus plantarum M345 (Feld dkk. 2009: 62) (Gambar 2.2.1). Plasmid BAL yang memiliki gen resistan terhadap chloramphenicol di antaranya plasmid pLFVM2 dari Lactobacillus fermentum (Alehsin dkk. 1999: 50), pC1534 dari Lactococcus lactis (Lucey dkk. 1993, lihat Universitas Indonesia


8 Shareck dkk. 2004: 174) dan pSMQ172 dari Streptococcus thermophilus (Turgeon & Moineau 2001 lihat Shareck dkk. 2004: 174). Plasmid BAL yang memiliki lebih dari satu gen resistan lebih dari satu antibiotik di antaranya yaitu plasmid pLME300 dari Lactobacillus fermentum ROT1 yang memiliki gen resistan erythromycin dan dalfopristin (Gfeller dkk. 2003: 190) dan pLUL201 dari Lactobacillus reuteri yang memiliki gen resistan chloramphenicol dan erythromycin (Ahrne dkk.1992, lihat Shareck dkk. 2004: 181).

Gambar 2.2.1 Peta plasmid pLFE1 [Sumber: Feld dkk. 2009: 62.]

2.2.2 Plasmid sebagai vektor pengklonaan

Vektor merupakan suatu molekul DNA sirkular yang bertindak sebagai kendaraan untuk membawa DNA sisipan ke dalam suatu sel inang. Vektor berdasarkan fungsinya terbagi menjadi dua macam, yaitu vektor pengklonaan dan vektor ekspresi. Vektor pengklonaan berfungsi untuk memperbanyak suatu fragmen DNA, sedangkan vektor ekspresi digunakan untuk mengekspresikan gen yang diklona (Schumann 2008: 1). Universitas Indonesia


9 Plasmid umumnya digunakan sebagai vektor pengklonaan dan vektor ekspresi dalam rekayasa genetika. Ciri-ciri vektor pengklonaan antara lain: berukuran kecil biasanya sekitar 2--4 kilobasa (kb) sehingga mudah untuk diisolasi dan dimanipulasi; memiliki sekuen origin of replication (ori) sehingga plasmid dapat bereplikasi secara mandiri di dalam sel; mempunyai multiple cloning site (MCS), sebagai situs beberapa enzim restriksi yang digunakan sebagai tempat penyisipan gen asing; dan memiliki penanda seleksi (selectable marker) sehingga memudahkan seleksi terhadap sel inang yang mengandung plasmid (Brock dkk. 1994: 288--289; Dellis 2009a: 8).

2.3 Gen resistan antibiotik

Gen resistan antibiotik menyandi sifat resistan terhadap antibiotik. Resistansi terhadap antibiotik merupakan salah satu bentuk mekanisme adaptasi bakteri untuk dapat tetap bertahan hidup pada lingkungan yang terpapar antibiotik. Beberapa jenis antibiotik bekerja dengan cara berikatan dengan ribosom bakteri dan mengganggu sintesis protein. Ribosom menerjemahkan kode genetik melalui messenger RNA (mRNA) untuk merakit asam amino menjadi protein. Ribosom bakteri terdiri atas dua subunit, yaitu subunit kecil (30S) dan subunit besar (50S). Kedua subunit ribosomal tersebut akan membentuk kompleks 70S pada saat proses translasi (Egervarn 2009: 17).

2.3.1 Gen resistan chloramphenicol

Antibiotik chloramphenicol bekerja dengan cara mengikat daerah peptidyl transferase center (PTC). Daerah peptidyl transferase center (PTC) merupakan suatu sekuen nukleotida penyandi enzim peptidil transferase yang berada pada subunit ribosomal 50S. Ikatan yang terbentuk antara chloramphenicol dan daerah PTC menyebabkan terhambatnya kerja enzim peptidil transferase sehingga tidak dapat mengkatalis pembentukan ikatan peptida pada proses translasi (Gambar 2.3.1) (Sands & Shaw 1972: 299). Universitas Indonesia


10

chloramphenicol

Gambar 2.3.1.(1) Skema mekanisme aksi chloramphenicol [Sumber:Phoenix College ? : 1.]

Gen resistan chloramphenicol menyandi protein chloramphenicol acetyl transferase (cat). Chloramphenicol acetyl transferase merupakan enzim yang berperan dalam mengkatalisis pemindahan gugus asetil pada struktur chloramphenicol yang membuat chloramphenicol menjadi bentuk tidak aktif. Inaktivasi chloramphenicol mengakibatkan tidak terbentuknya ikatan antara chloramphenicol dan daerah PTC (Sands & Shaw 1972: 299).

Gambar 2.3.1.(2) Mekanisme inaktivasi chloramphenicol [Sumber Sands & Shaw 1973: 299 diterjemahkan sesuai aslinya.]



11 2.3.2 Gen resistan erythromycin

Erythromycin merupakan antibiotik yang dapat menghambat proses translasi dengan cara berikatan dengan sisi E pada subunit 50 S (Canu & Leclercq 2009: 211--212). Ikatan tersebut akan menghambat proses pemanjangan (elongasi) dengan cara menghalangi translokasi ribosom ke kodon berikutnya pada mRNA (Kaiser 2001:1). Mekanisme aksi erythromycin dalam menghambat sintesis protein bakteri dapat dilihat pada Gambar 2.3.2.

Gambar 2.3.2.(1) Mekanisme aksi erythromycin [Sumber:Phoenix College ? : 1.]

Gen resistan erythromycin (erythromycin ribosome methylase /erm) menyandi enzim metil transferase. Metil transferase merupakan enzim yang berperan dalam mengkatalisis pembentukan gugus metil dan pelekatan gugus metil tersebut pada sisi residu adenin spesifik di daerah 23S rRNA dalam subunit 50S ribosom. Metilasi tersebut menyebabkan erythromycin tidak dapat berikatan dengan ribosom sehngga translokasi ribosom ke kodon berikutnya pada mRNA dapat tetap berjalan (Guilfoile 2007: 75; Canu & Leclercq 2009: 211).



12 Erythromycin binding

Erythromycin

Gambar 2.3.2.(2) Mekanisme resistansi erythromycin [Sumber: Kaiser 2001: 1]

Gen erm umumnya terdapat pada plasmid dan transposon (Canu & Leclercq 2009: 213). Egervarn (2009: 21) mengemukakan bahwa saat ini terdapat 33 macam gen erm. Empat kelas gen erm yang umum ditemukan pada bakteri yaitu ermA, ermB, ermC, dan ermF. Gen ermB diketahui sebagai gen resistan erythromycin yang ditemukan pada bakteri anaerob, contohnya kelompok bakteri asam laktat (Canu & Leclercq 2009: 214). Gen ermB dilaporkan terdeteksi pada plasmid Lactobacillus plantarum SHC096, Lactobacillus plantarum SHC167, Lactobacillus brevis CC085, dan Enterococcus faecium yang diisolasi dari pangan fermentasi tradisional China (Lu Pan dkk. 2011: 1320). Gen ermB juga teridentifikasi terdapat pada plasmid pLFE1 Lactobacillus plantarum M345 yang diisolasi dari keju (Feld dkk. 2009: 62). 2. 4 Deteksi gen dengan teknik polymerase chain reaction (PCR)

Polymerase chain reaction (PCR) merupakan suatu reaksi in vitro untuk memperbanyak jumlah molekul DNA pada target tertentu. Perbanyakan jumlah molekul DNA dilakukan dengan cara menyintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target melalui bantuan enzim polimerase dan oligonukleotida primer dalam suatu alat yang disebut thermal cycler (Muladno 2010: 61). Teknik PCR dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan Universitas Indonesia


13 dan mutasi suatu gen, penyakit yang dapat menginfeksi dan mengetahui kekerabatan spesies (Wolfe 1993: 127). Proses PCR melibatkan tujuh macam komponen, yaitu DNA cetakan, oligonukleotida primer, dNTP (deoksiribonukleotida trifosfat), enzim DNA polimerase, dapar PCR, kation divalen, dan akuabides (Primrose dkk.2001: 19-21). Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisinya diapit oleh sepasang primer. Primer merupakan suatu oligonukleotida yang mengenali daerah target dan menginisiasi proses amplifikasi. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) yang terdiri atas dATP (deoksi adenin trifosfat), dTTP (deoksi timin trifosfat), dGTP (deoksi guanin trifosfat), dan dCTP (deoksi sitosin trifosfat) digunakan dalam teknik PCR sebagai sumber nukleotida untuk mencetak DNA baru. Enzim DNA polimerase berfungsi sebagai katalis pemanjangan untai molekul DNA baru. Enzim polimerase yang digunakan merupakan enzim yang tahan terhadap suhu tinggi, sehingga tidak terdenaturasi. Dapar PCR digunakan untuk menjaga kestabilan pH pada campuran reaksi (Muladno 2010: 61; Sambrook & Russell 2001: 8.5--8.6). Proses PCR umumnya berlangsung selama 25--35 siklus . Siklus PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu denaturasi, annealing (penempelan primer), dan ekstensi atau polimerisasi (pemanjangan rantai DNA baru). Tahap denaturasi dilakukan pada suhu tinggi, yaitu sekitar 92--95 oC. Suhu tinggi tersebut menghentikan semua reaksi enzimatik dan menyebabkan perubahan pada struktur DNA, yaitu dari untai ganda menjadi untai tunggal. Tahap annealing terjadi pada suhu yang berkisar antara 50 oC sampai 60 oC, tergantung pada nilai Tm oligonukleotida primer. Primer forward dan reverse yang urutan nukleotidanya berkomplemen dengan salah satu untai tunggal DNA akan menempel pada posisi komplemen masing-masing (Muladno 2010: 61). Tahap ekstensi terjadi pada suhu 72 oC, dimana pada suhu tersebut enzim DNA polimerase mulai mengkatalis sintesis molekul DNA baru yang dimulai dari ujung 5’ masing-masing primer. Tahap disebut merupakan tahap polimerisasi atau ekstensi (Muladno 2010: 61--62) Gambar 2.4 menunjukkan skema proses PCR. Hasil dari proses PCR yaitu fragmen DNA target dengan dengan panjang



14 tertentu dalam jumlah yang banyak. Hasil tersebut dapat diperiksa dengan menggunakan teknik elektroforesis gel agarosa (Lodge dkk. 2007: 71).

Gambar 2.4 Skema proses PCR [Sumber: Guilfoile 2007:52 diterjemahkan sesuai aslinya.]

2.5 Teknik biologi molekuler

2.5.1 Isolasi plasmid

Proses isolasi DNA plasmid terdiri atas tiga tahap utama, yaitu pelisisan dinding sel bakteri, denaturasi DNA kromosom, dan pemisahan DNA plasmid dari debris serta pengotor. Salah satu metode isolasi DNA plasmid yaitu metode alkaline lysis yang umum digunakan dalam teknologi rekayasa genetika. Prinsip isolasi DNA plasmid metode alkaline lysis berdasarkan pada perbedaan struktural



15 antara DNA plasmid yang berukuran lebih kecil dibandingkan dengan DNA kromosom (Sambrook & Russell 2001: 1.31). Isolasi plasmid metode alkaline lysis menggunakan beberapa larutan spesifik berupa alkaline lysis solution I, II, dan III. Alkaline lysis solution I digunakan sebagai larutan pelisis dinding sel. Komposisi larutan tersebut terdiri atas glukosa dan Tris-Cl yang berfungsi untuk menjaga tekanan osmotik pada pH 8.0, serta EDTA yang akan berikatan dengan kation divalen pada lipid bilayer sehingga dapat memecahkan dinding sel (Dellis 2009a: 2). Alkaline lysis solution II berfungsi sebagai larutan pendenaturasi karena komposisinya terdiri atas sodium dodesil sulfat (SDS) dan sodium hidroksida (NaOH). Sodium dodesil sulfat berfungsi untuk melarutkan lipid yang berasal dari membran sel dan protein seluler, sedangkan sodium hidroksida menyebabkan larutan bersifat basa sehingga dapat mendenaturasi DNA kromosom (Dellis 2009a: 2). Homogenisasi campuran setelah penambahan alkaline lysis solution II tidak dilakukan dengan cara vortex karena dapat mendenaturasi DNA plasmid (Sambrook & Russell 2001: 1.34). Alkaline lysis solution III merupakan larutan penetralisasi yang komposisinya terdiri atas asam asetat glasial dan potasium asetat. Asam asetat glasial berfungsi untuk menetralkan larutan kembali ke pH normalnya sehingga dapat merenaturasi rantai DNA plasmid. Potasium asetat yang digunakan berfungsi dalam mengendapkan SDS bersama dengan lipid dan protein (Dellis 2009a: 2). Larutan PCI yang terdiri atas fenol, kloroform, dan isoamylalkohol digunakan sebagai larutan yang berfungsi untuk memisahkan DNA plasmid dari pengotor-pengotor seperti protein. Fenol merupakan larutan organik yang dapat dapat melarutkan protein, sedangkan kloroform dapat memisahkan fenol dari fase aqueous sehingga menyebabkan campuran menjadi 2 lapisan, yaitu lapisan atas yang mengandung DNA plasmid, dan lapisan bawah yang mengandung protein pengotor (Sambrook & Russell 2001: 1.34). Isopropanol yang digunakan pada tahap isolasi plasmid bertujuan untuk presipitasi DNA (Ehrt & Schnappinger 2003: 75).



16 2.5.2 Elektroforesis gel agarosa

Elektroforesis merupakan suatu teknik pemisahan molekul bermuatan berdasarkan ukurannya dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium penyangga matriks stabil. Teknik tersebut digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik negatif yang ada pada DNA. Gugus fosfat menyusun DNA menyebabkan DNA bermuatan negatif (Dellis 2009b: 15). Molekul DNA ditempatkan dalam suatu medium kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya sehingga molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan migrasi DNA tergantung pada perbandingan muatan terhadap massanya, serta tergantung pula pada bentuk molekulnya (Sambrook & Russell 2001: 5.2). Laju migrasi DNA dalam medium yang dialiri medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Fragmen DNA yang yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibandingkan dengan fragmen DNA yang berukuran lebih besar, sehingga fragmen DNA dapat terpisah berdasarkan ukuran panjangnya (Yuwono 2005: 35). Medium yang umum digunakan dalam teknik elektroforesis yaitu gel agarosa. Gel agarosa merupakan suatu bahan semi padat berupa polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut. Gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berukuran 50--20.000 pasang basa (pb) dan prosesnya dijalankan secara horizontal (Sambrook & Russell 2001: 5.2). Gel agarosa dibuat dengan melarutkannya dalam suatu dapar. Dapar yang digunakan untuk melarutkan gel agarosa harus sama dengan dapar yang digunakan pada tanki aparatus elektroforesis. Dapar yang umum digunakan yaitu tris asetat-EDTA (TAE) atau tris-borat EDTA (TBE) (Yuwono 2005: 35). Fragmen DNA yang telah terpisah divisualisasi dengan penambahan agen interkalasi, yaitu etidium bromida (Etbr). Etidium bromida merupakan suatu senyawa yang dapat berikatan di antara ikatan basa nitrogen DNA dan dapat berpendar di bawah sinar UV (Boffey 1994: 43--44).



17 2.5.3 Purifikasi produk PCR Tahap purifikasi perlu dilakukan terhadap produk PCR untuk mendapatkan fragmen DNA yang murni. Produk PCR umumnya masih mengandung berbagai kontaminan di antaranya primer, dNTP, enzim polimerase, dan komponen dapar PCR. Hal tersebut dapat menganggu proses sequencing DNA. Purifikasi produk PCR dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai kit komersial, salah satunya Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System dari Promega. Tahapan kerja kit tersebut berdasarkan pada metode purifikasi asam nukleat oleh Boom dkk. (1990: 495) yaitu dengan memanfaatkan kemampuan DNA untuk berikatan dengan membran silika dalam campuran garam chaotropic. Fragmen DNA yang dipurifikasi dapat berupa potongan gen hasil visualisasi elektroforesis maupun produk langsung amplifikasi PCR. Fragmen DNA dilarutkan dalam garam chaotropic guanidin isotiosianat berupa larutan membrane binding solution dan diisolasi melalui teknik sentrifus untuk memaksa potongan gel terlarut maupun produk PCR dapat melewati membran silika serta secara bersamaan mengikat DNA pada permukaan membran silika. Fragmen DNA selanjutnya dielusi dengan menggunakan nuclease free water setelah dibersihkan dengan membrane wash solution yang mengandung garam konsentrasi tinggi (Promega 2010: 2--3).



18

Gambar 2.5.3 Prinsip kerja purifikasi [Sumber: Promega 2010: 8.]

2.5.4 Sequencing DNA

Sequencing DNA merupakan teknik penentuan urutan basa nukleotida yang menyusun suatu fragmen DNA. Sequencing DNA terdiri atas dua metode, yaitu metode Maxam-Gilbert dan metode Sanger (Primrose dkk. 2001: 120--121). Metode Sanger lebih sering digunakan karena lebih mudah, praktis, dan efisien dibandingkan metode Maxam-Gilbert (Muladno 2010: 70). Komponen kunci dalam reaksi sequencing adalah dideoksiribonukleotida trifosfat (ddNTP). Dideoksiribonukleotida trifosfat (ddNTP) tidak memiliki gugus hidroksil pada posisi 3’ deoksiribosa dan tidak dapat digabungkan dengan enzim polimerase pada untai DNA yang sedang disintesis melalui gugus trifosfat 5’. Gugus 3’-hidroksil yang tidak ada mencegah terbentuknya ikatan fosfodiester dengan dNTP berikutnya. Sintesis DNA tidak dapat dilanjutkan dan berhenti pada posisi ddNTP. Hasil akhir dari reaksi tersebut yaitu sejumlah potongan



19 DNA yang bervariasi dan basa terakhirnya tergantung pada ddNTP yang digunakan (Muladno 2010: 70).

2.5.5 Analisis hasil sequencing

Hasil sequencing DNA berupa urutan basa nukleotida dan direpresentasikan melalui suatu grafik elektroferogram. Hasil tersebut dapat dianalisis dengan beberapa perangkat lunak, di antaranya BioEdit, DNA Baser, dan Applied Biosystems Sequence Scanner. Urutan basa nukleotida hasil sequencing DNA selanjutnya dapat dianalisis dengan program perangkat lunak online yaiitu Basic local alignment search tool (BLAST) yang dapat diakses melalui website (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov./Blast.cgi). Program BLAST dapat menentukan similarity berbagai sekuen query dari seluruh basis data yang tersedia dengan cepat (Madden 2002: 16-1).



BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1 Lokasi dan waktu penelitian

Penelitan dilakukan di Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler, Pusat Penelitian Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Jalan Raya Bogor Km. 46 Cibinong, Bogor, 16911 selama tujuh bulan mulai dari bulan Mei sampai November 2011.

3.2 Bahan

3.2.1 Sampel

Sampel merupakan isolat BAL koleksi Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler, Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI. Sebanyak 120 isolat BAL yang ditumbuhkan dalam medium MRS diisolasi dari pangan fermentasi tradisional Indonesia (dadih, bekasam domba, bekasam sapi, tempoyak, dan tape ketan).

3.2.2 Primer

Primer yang digunakan untuk mendeteksi gen resistan chloramphenicol adalah primer cat dan catpIP501. Primer yang digunakan untuk mendeteksi gen resistan erythromycin adalah primer ermB, ermC, dan Tn554. Sekuen masingmasing primer dapat dilihat pada Tabel 3.2.2.

20



21 Tabel 3.2.2. Primer yang digunakan dalam penelitian Nama Primer

Sekuen Primer

Ukuran

ermB-F

5’-CATTTAACGACGAAACTGGC -3’

ermB-R

5’-GGAACATCTGTGGTATGGCG -3’

ermC-F

5’-ATCTTTGAAATCGGCTCAGG-3’

ermC-R

5’-CAAACCCGTATTCCACGATT-3’

Tn554-F

5’-AAGCGGTAAACCCCTCTGAG-3’

Tn554-R

5’-TCAAAGCCTGTCGGAATTGG-3’

catpIP501-F

5’-GGA TAT GAA ATT TAT CCC TC-3’

catpIP501-R

5’-CAA TCA TCT ACC CTA TGA AT-3’

cat-F cat-R

405 pb

294 pb

440 pb

5’- CCTGCCACTCATCGCAGT-3’

486 pb

623 pb

5’- CCACCGTTGATATATCCC -3’

[Sumber: Jensen 1998: 154; Guerra dkk.2001: 1307; Lu Pan dkk. 2011: 1317;.]

3.2.3 Larutan dan dapar

Larutan dan dapar yang digunakan dalam penelitian di antaranya alkaline lysis solution I; alkaline lysis solution II; alkaline lysis solution III; larutan PCI (Phenol Chloroform Isoamylalkohol); dapar MgCl2 10x [TaKaRa]; Tris borat EDTA (TBE); dan dapar STE (Sukrosa, Tris-Cl, EDTA).

3.2.4 Kit

Kit yang digunakan dalam penelitian adalah Qiagen Plasmid Midi Kit [Qiagen] untuk isolasi plasmd dan Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System [Promega] untuk purifikasi produk PCR. Komponen masing-masing kit dapat dilihat pada Tabel 3.2.4

Universitas Indonesia Deteksi gen ..., Ikrimah Muzdalifah, FMIPA UI, 2012

22 Tabel 3.2.4 Kit yang digunakan dalam penelitian Kit

Produsen

Plasmid Midi Kit

Qiagen

Wizard SV Gel and PCR

Promega

Clean-Up System

Komponen kit Dapar P1 Dapar P2 Dapar P3 Qiagen Tip Dapar QBT Dapar QC Dapar QF SV Minicolumn Tabung pengumpul Membrane Binding Solution Membrane Wash Solution

[Sumber: Qiagen 2005: 4; Promega 2010: 6.]

3.2.5 Medium

Medium yang digunakan dalam penelitian adalah de Mann, Rogosa, Sharpe (MRS) cair [Oxoid]. Komposisi medium MRS dapat dilihat pada Lampiran 3.

3.2.6 Bahan kimia

Bahan kimia yang digunakan adalah chloramphenicol [Gold Biocomm], erythromycin [Sigma], sodium azide [Merck], lisozim [Sigma], sukrosa [Merck], glukosa [Merck], tris base [Bioreagent], EDTA [Bio-Rad], sodium hidroksida [Merck], sodium dodesil sulfat [Qbiogene], potassium asetat [Junsei], asam asetat glasial [Merck], akuades, fenol [Sigma], kloroform [Merck], isoamilalkohol [Merck], isopropanol [Merck], etanol [Merck], bubuk agarosa [Invitrogen], etidium bromida (Etbr) 10 mg/ml [Plus One], loading dye [TaKaRa], 2.5 mM dNTP [TaKaRa], penanda DNA 1 kb [Bionexus], penanda DNA 1 kb [Promega], penanda DNA 100 bp [Invitrogen], Taq DNA polymerase [TaKaRa], RNase [Qiagen], dan nuclease free water [Promega].


23

3.3 Alat Alat yang digunakan dalam penelitian antara lain mikropipet berbagai ukuran (20µl, 200µl, dan 1000µl) [Gilson], tips mikropipet [Biologix], laminar air flow [Esco], sentrifus [Hermile], autoklaf [All American], perangkat elektroforesis [Advance Mupid ex-U], timbangan elektrik [Acis], penangas [Cimarec], lemari pendingin [GEA, Yupiter & Sharp], freezer suhu -20° C [Sansio], ice maker [Scotsman], cawan petri; tabung reaksi [Iwaki Pyrex], tabung Falcon ukuran 15ml & 50ml [Becton Dickinson & Corning], tabung mikrosentrifus [Axygen], labu Erlenmeyer [Iwaki Pyrex], botol bertutup [Schott Duran]; gelas ukur ukuran 10ml, 50ml, 100ml, dan 1000 ml [Iwaki Pyrex], komputer [Acer], printer [Canon], UV transilluminator [Scope], spektrofotometer [Genequant], sarung tangan [Sensi gloves], masker [Pro-mask], parafilm [Sigma], berbagai alat tulis, kamera digital [Canon], PCR thermal cycler [Applied Biosystem], dan inkubator [N-Biotek, Inc.].

3.4 Cara kerja

Skema alur kerja penelitian secara keseluruhan dapat dilihat pada Lampiran 1.

3.4.1 Pembuatan larutan, dapar, dan medium

Komposisi bahan kimia serta cara pembuatan larutan, dapar, dan medium yang digunakan dalam penelitian dapat dilihat pada Lampiran 2.

3.4.2 Penapisan BAL dengan chloramphenicol dan erythromycin

Penapisan BAL yang resistan terhadap chloramphenicol dilakukan dengan cara menginokulasikan isolat BAL ke dalam medium 3 ml MRS cair yang telah ditambahkan 3 μl chloramphenicol 2 mg/ml sehingga mencapai konsentrasi akhir Universitas Indonesia Deteksi gen ..., Ikrimah Muzdalifah, FMIPA UI, 2012

24 sebesar 2 μg/ml. Cara kerja yang sama dilakukan untuk penapisan BAL yang resistan terhadap erythromycin, yaitu dengan cara menginokulasikan isolat BAL ke dalam 3 ml MRS cair yang telah ditambahkan erythromycin 1 mg/ml sebanyak 3 μl hingga mencapai konsentrasi akhir sebesar 1 μg/ml. Kultur diinkubasi selama 16 jam (overnight) pada suhu 37 oC. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna pada medium menjadi lebih keruh. Tahap selanjutnya dilakukan pengujian ulang terhadap isolat BAL yang diketahui mampu tumbuh dalam medium dengan penambahan chloramphenicol dan erythromycin. Isolat BAL masing-masing diinokulasi ke dalam 3 ml medium MRS cair yang telah ditambahkan chloramphenicol (2 μg/ml) dan erythromycin (1 μg/ml). Kultur diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37 oC. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna pada medium menjadi lebih keruh.

3.4.3 Isolasi plasmid BAL

3.4.3.1 Metode alkaline lysis minipreparation

Isolasi plasmid dilakukan pada isolat BAL yang mampu tumbuh dalam medium dengan penambahan chloramphenicol atau erythromycin. Isolasi plasmid dilakukan berdasarkan Sambrook & Russell (2001: 1.32) dengan modifikasi penambahan lisozim. Isolat BAL sebanyak 3 μl diinokulasi ke dalam 3 ml medium MRS cair dan diinkubasi selama 16 jam (overnight) pada suhu 37 oC. Kultur tersebut dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifus sebanyak 1,5 ml. Sentrifus dilakukan pada kecepatan 6.000 rpm selama 6 menit untuk memanen sel-sel BAL (pengkoleksian pelet). Supernatan yang merupakan medium dibuang dan pelet yang terbentuk ditambahkan alkaline lysis solution I sebanyak 100 µl dan lisozim 10 mg/ml sebanyak 100 µl, kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama satu jam. Sebanyak 200 µl alkaline lysis solution II ditambahkan ke dalam campuran kemudian dihomogenkan dengan cara membolak-balikkan tabung. Sebanyak 150 µl alkaline lysis solution III ditambah ke dalam campuran, dan dihomogenkan dengan cara membolak-balikkan tabung selanjutnya diinkubasi dalam es selama 3 menit.


25 Campuran disentrifus pada kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang terbentuk dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifus baru, kemudian ditambah larutan PCI sebanyak satu volume supernatan atau ± 500 μl. Sentrifus selanjutnya dilakukan pada kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit sampai terbentuk dua lapisan, yaitu lapisan atas dan lapisan bawah. Lapisan atas dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifus baru, kemudian ditambah isopropanol dingin sebanyak 500 μl dan diinkubasi pada suhu ruang selama 3 menit. Campuran selanjtnya disentrifus pada kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit dan pelet yang terbentuk dicuci dengan etanol 70% sebanyak 1 ml kemudian disentrifus kembali pada kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit. Supernatan selanjutnya dibuang dan pelet DNA dikeringanginkan. Pelet DNA yang telah dikeringanginkan dilarutkan dengan 18 μl nuclease free water dan 2 μl RNase (10 mg/ml) kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit untuk optimalisasi kerja RNase. Hasil isolasi DNA plasmid diperiksa dengan teknik elektroforesis gel agarosa.

3.4.3.2 Metode alkaline lysis midipreparation

Isolasi plasmid metode alkaline lysis midipreparation dilakukan terhadap isolat BAL yang diketahui membawa plasmid berdasarkan hasil visualisasi isolasi plasmid minipreparation. Isolasi plasmid alkaline lysis midipreparation dilakukan berdasarkan protokol Sambrook & Russell (2001: 1.32) dengan modifikasi penambahan lisozim. Tahapan isolasi plasmid diawali dengan menginokulasi 100 μl isolat BAL ke dalam 100 ml medium MRS dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 16 jam (overnight). Kultur selanjutnya dipindahkan ke dalam tabung Falcon dan disentrifus pada kecepatan 6.000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang merupakan medium dibuang dan pelet yang terbentuk diresuspensi dengan dapar STE sebanyak 10 ml dan dihomogenkan dengan cara pipetting, kemudian disentrifus pada kecepatan 6.000 rpm selama 15 menit. Pelet yang terbentuk ditambahkan alkaline lysis solution I sebanyak 4 ml dan lisozim 10 mg/ml sebanyak 4 ml, lalu dihomogenkan dengan cara pipetting. Campuran kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama satu jam untuk optimalisasi kerja


26 lisozim. Sebanyak 8 ml alkaline lysis solution II ditambahkan ke dalam campuran, kemudian dihomogenkan dengan cara membolak-balikkan tabung. Sebanyak 6 ml alkaline lysis solution III ditambahkan ke dalam tabung, lalu campuran dihomogenkan dengan cara membolak-balikkan tabung dan diinkubasi dalam es selama 10 menit. Campuran disentrifus pada kecepatan 10.000 rpm selama 30 menit, kemudian supernatan yang terbentuk dipindahkan ke dalam tabung Falcon baru. Larutan PCI (Lampiran 1) sebanyak satu volume supernatan (± 22 ml) ditambahkan ke dalam tabung Falcon dan disentrifus pada kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit sampai terbentuk dua lapisan, yaitu lapisan atas dan lapisan bawah. Lapisan atas dipindahkan ke dalam tabung Falcon baru, kemudian ditambahkan isopropanol sebanyak 22 ml dan diinkubasi pada suhu -20 oC selama 2 jam untuk presipitasi DNA plasmid. Sentrifus selanjutnya dilakukan pada kecepatan 10.000 rpm selama 30 menit. Pelet yang terbentuk dicuci dengan etanol 70% sebanyak 1 ml dan disentrifus kembali pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Pelet dikeringanginkan dengan cara membalikkan posisi tabung dan dialasi dengan tisu. Proses pengeringanginan pelet dilakukan di dalam laminar air flow untuk mencegah terjadinya kontaminasi. Pelet yang telah kering dan bebas dari aroma etanol dilarutkan dengan 90 μl nuclease free water dan 10 μl RNase (10 mg/ml) kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit untuk optimalisasi kerja RNase. Hasil isolasi DNA plasmid diperiksa dengan teknik elektroforesis gel agarosa 1%.

3.4.3.3 Metode Qiagen plasmid midi kit

Isolasi plasmid BAL selanjutnya menggunakan kit komersial Qiagen Plasmid Midi Kit (Qiagen 2005: 19--23) untuk meminimalisasi kesalahankesalahan teknis yang terjadi pada metode isolasi plasmid manual. Tahapan kerja kit tersebut menggunakan prinsip metode alkaline lysis solution. Isolasi plasmid diawali dengan menginokulasi 100 μl isolat BAL ke dalam medium MRS cair 100 ml dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 16 jam (overnight). Kultur BAL


27 kemudian dipindahkan ke dalam tabung Falcon dan disentrifus pada kecepatan 4.000 rpm selama 15 menit. Pelet yang terbentuk dicuci dengan 20 ml dapar STE (Lampiran 1) dan disentrifus pada kecepatan 4.000 rpm selama 15 menit. Pelet yang terbentuk diresuspensi dengan 4 ml dapar P1 yang telah ditambahkan 10 mg/ml lisozim, kemudian dihomogenkan dengan cara pipetting. Campuran diinkubasi pada suhu 37 oC selama 1 jam. Sebanyak 4 ml dapar P2 ditambahkan ke dalam campuran dan dihomogenkan dengan cara membolakbalikkan tabung, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Sebanyak 4 ml dapar P3 ditambahkan ke dalam campuran dan dihomogenkan dengan cara membolak-balikkan tabung, kemudian diinkubasi dalam es selama 15 menit. Campuran tersebut disentrifus pada kecepatan 10.000 rpm selama 30 menit, kemudian supernatan yang terbentuk dipindahkan ke dalam tabung Falcon baru dan disentrifus kembali pada kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk dipindahkan ke dalam tabung Falcon baru melalui Qiagen tip yang sebelumnya telah dicuci dengan dapar QBT sebanyak 4 ml. Qiagen tip selanjutnya dicuci dengan 10 ml dapar QC sebanyak 2 kali. Qiagen tip dipindahkan ke tabung Falcon baru dan ditambahkan 5 ml dapar QF untuk mengelusi DNA plasmid. Qiagen tip selanjutnya dibuang, kemudian sebanyak 3,5 ml isopropanol ditambahkan ke dalam tabung Falcon untuk presipitasi DNA plasmid, dan disentrifus pada kecepatan 10.000 rpm selama 30 menit. Pelet yang terbentuk kemudian dicuci dengan 2 ml etanol 70 % dan disentrifus pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Pelet dikeringanginkan dengan cara membalikkan posisi tabung dan dialasi tisu kering. Proses pengeringan pelet dilakukan di dalam laminar air flow untuk mencegah masuknya kontaminan. Pelet yang telah kering dan bebas dari aroma etanol selanjutnya dilarutkan dengan menambahkan nuclease free water sebanyak 100 μl. Kualitas hasil isolasi DNA plasmid diukur kualitasnya dengan teknik elektroforesis gel agarosa, sedangkan kuantitas (kemurnian dan konsentrasi DNA) dilakukan dengan alat spektrofotometer. Hasil isolasi plasmid Qiagen Plasmid Midi Kit disimpan dalam freezer -20 oC sebelum digunakan sebagai cetakan dalam proses PCR.


28 3.4.4 Elektroforesis gel agarosa

Teknik elektroforesis gel agarosa dilakukan untuk memeriksa hasil isolasi plasmid dan hasil PCR. Hasil isolasi plasmid dielektroforesis menggunakan gel agarosa dengan konsentrasi 1%, sedangkan produk PCR dielektroforesis menggunakan gel agarosa dengan konsentrasi 2%. Gel agarosa 1% dibuat dengan mencampur 1 gram bubuk agarosa dengan 100 ml larutan TBE 1x (Lampiran 1), sedangkan gel agarosa 2% dibuat dengan mencampur 2 gram bubuk agarosa dengan 100 ml larutan TBE 1x. Campuran bubuk agarosa dan dapar TBE kemudian dihomogenkan dengan menggunakan magnetic stirrer dan dipanaskan di atas penangas sampai larutan gel berwarna bening. Larutan gel dituang ke dalam cetakan yang sudah disiapkan. Sisir (cetakan sumur) diangkat setelah gel mengeras, kemudian gel diletakkan di dalam aparatus elektroforesis dan direndam dengan larutan TBE 1x. Sampel hasil isolasi plasmid BAL sebanyak 20 µl dicampur dengan loading dye sebanyak 5 µl, sedangkan sampel hasil PCR sebanyak 5 µl dicampur dengan loading dye sebanyak 3 µl. Proses pencampuran dilakukan di atas parafilm dan dilakukan dengan cara pipetting. Campuran dimasukkan masing-masing ke dalam sumur pada gel. Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan tegangan listrik sebesar 100 volt selama ± 45 menit. Gel kemudian dinkubasi dalam dapar TBE 1x yang telah ditambahkan etidium bromida 10 mg/ml sebanyak 5 μl selama 30 menit. Pita DNA divisualisasi dengan UV transilluminator, kemudian hasil elektroforesis didokumentasikan menggunakan kamera digital.

3.4.5 Polymerase chain reaction (PCR)

Hasil isolasi plasmid Qiagen Plasmid Midi Kit digunakan sebagai DNA cetakan untuk mendeteksi gen resistan chloramphenicol dan erythromycin pada plasmid BAL menggunakan teknik PCR. Komposisi reaksi PCR dapat dilihat pada Tabel 3.4.5.


29 Tabel 3.4.5 Komposisi reaksi PCR Komposisi PCR ddH2O steril

Volume (μl) 35,5

10x dapar dengan MgCl2

5

dNTP mix

2

Primer F

2

Primer R

2

Cetakan DNA plasmid

3

Platinum Taq DNA Polimerase

0,5

Total

50

Campuran reaksi PCR dimasukkan ke dalam mesin thermal cycler. Kondisi reaksi PCR terdiri atas denaturasi awal (I) pada suhu 94 oC selama 5 menit, denaturasi (II) pada suhu 94 oC selama 30 detik, annealing (III) selama 1 menit pada suhu yang berbeda-beda untuk setiap pasang primer, polimerisasi (IV) pada suhu 72 oC selama 90 detik, dan polimerisasi akhir (V) pada suhu 72 oC selama 10 menit. Tahapan II sampai IV dilakukan sebanyak 35 siklus. Hasil PCR divisualisasi dengan teknik elektroforesis gel agarosa 2%. Hasil positif diperlihatkan dengan adanya pita tunggal pada ukuran yang telah diketahui berdasarkan literatur. Produk PCR yang diketahui positif resistan terhadap chloramphenicol maupun erythromycin selanjutnya dipurifikasi dan selanjutnya diverifikasi dengan teknik sequencing.

3.4.6 Purifikasi produk PCR

Purifikasi produk PCR dilakukan dengan menggunakan kit komersial Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega 2010: 6). Seluruh tahapan purifikasi dilakukan pada suhu ruang dan kondisi steril. Tabung pengumpul, minicolumn, dan tabung mikrosentrifus disiapkan pada rak tabung. Sebanyak 135 μl (3 kali volume sampel) membrane binding solution ditambahkan ke dalam sampel, yaitu seluruh produk PCR yang tersisa setelah tahapan elektroforesis.


30 Campuran dipindahkan ke dalam minicolumn yang telah dimasukkan ke dalam tabung pengumpul, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit. Tabung pengumpul beserta minicolumn disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit. Sebanyak 700 μl membrane wash solution ditambahkan ke dalam minicolumn dan disentrifus pada kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit. Sebanyak 500 μl membrane wash solution kembali ditambahkan ke dalam minicolumn dan disentrifus pada kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit. Minicolumn selanjutnya dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifus baru, kemudian sebanyak 50 μl nuclease-free water ditambahkan ke dalam minicolumn dan diinkubasi selama 1 menit. Tabung mikrosentrifus beserta minicolumn disentrifus pada kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit. Minicolumn kemudian dibuang, sedangkan hasil purifikasi pada tabung mikrosentrifus disimpan pada suhu 4 oC untuk selanjutnya dilakukan sequencing.

3.4.7 Sequencing DNA

Sequencing DNA dilakukan pada sampel produk PCR yang telah dipurifikasi. Proses sequencing dilakukan oleh teknisi dari perusahaan penyedia jasa sequencing 1st Base.

3.4.8 Analisis sekuen nukleotida

Hasil sequencing berupa elektroferogram dan data sekuen nukleotida. Grafik elektroferogram dianalisis dengan menggunakan perangkat lunak Applied Biosystems Sequence Scanner version 1.0, sedangkan data urutan nukleotida dianalisis dengan menggunakan perangkat lunak DNA Baser. Data sekuen nukleotida yang diperoleh selanjutnya diperiksa melalui pencarian homologi program perangkat lunak BLASTX pada situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST untuk memastikan apakah sekuen tersebut merupakan sekuen gen resistan chlorampehnicol atau erythromycin berdasarkan data yang terdapat pada GenBank.


BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Penapisan BAL dengan chloramphenicol dan erythromycin

Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI telah mengisolasi BAL dari empat jenis pangan fermentasi tradisional Indonesia, yaitu dadih, tape ketan, bekasam daging (sapi dan domba), dan tempoyak. Isolat BAL sebanyak 120 sampel ditapis dengan antibiotik chloramphenicol (2 μg/ml) dan erythromycin (1 μg/ml). Tahap penapisan dilakukan untuk menyeleksi isolat BAL mana saja yang potensial memiliki resistansi terhadap chloramphenicol atau erythromycin. Tahap penapisan BAL diawali dengan menginokulasikan masing-masing isolat BAL dalam medium MRS yang telah ditambahkan chloramphenicol dan medium MRS yang telah ditambahkan erythromycin. Parameter hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna pada medium MRS cair, yaitu dari warna kuning kecokelatan (No. 137) menjadi lebih keruh (No. 129) berdasarkan standard warna PANTONE ® color bridge CMYKTM PC (Lampiran 8) (Gambar 4.1). Oxoid (2010: 1) menyatakan indikator pertumbuhan BAL pada medium MRS cair dapat diamati secara visual melalui perubahan warna dan kekeruhan pada medium. Keterangan: 1. Kultur BAL dalam medium MRS cair dengan penambahan chloramphenicol sebelum inkubasi 37 ºC 2. Kultur BAL dalam medium MRS cair yang telah ditambahkan chloramphenicol setelah inkubasi overnight pada suhu 37 ºC.

Gambar 4.1 Perubahan warna medium sebelum dan setelah inkubasi kultur BAL overnight [Sumber: Dokumentasi Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler-Puslit Bioteknologi LIPI, 2011.]

31



32 Hasil penapisan BAL dengan chloramphenicol atau erythromycin (Tabel 4.1.(1)) menunjukkan dari total 120 isolat BAL terdapat 49 isolat (40,83 %) mampu tumbuh dalam medium dengan penambahan chloramphenicol dan 16 isolat (13,33%) mampu tumbuh dalam medium dengan penambahan erythromycin. Isolat BAL yang mampu tumbuh dalam medium penambahan chloramphenicol atau erythromycin diasumsikan sebagai isolat BAL yang potensial resistan terhadap chloramphenicol atau erythromycin (Lu Pan dkk. 2011: 1317). Sebanyak 4 isolat yang sama diketahui potensial resistan terhadap kedua antibiotik tersebut, yaitu isolat T3, T8, S23, dan D2. Isolat T3 dan T8 merupakan isolat BAL yang diisolasi dari tape ketan, sedangkan S23 dan D2 merupakan BAL yang diisolasi dari bekasam daging sapi dan domba.

Tabel 4.1.(1) Hasil penapisan BAL dengan chloramphenicol atau erythromycin Jumlah Isolat

Jumlah Isolat

Jenis Pangan

Kode

Jumlah

Resistan

Resistan

Fermentasi

Isolat

Isolat

Chloramphenicol

Erythromycin

(2 μg/ml)

(1 μg/mL)

Dadih

DH

65

30

4

T

10

4

8

Air Tape

AT

10

1

1

Bekasam

S, D

34

13

3

U

1

1

-

120

49 (40, 83%)

16 (13,33 %)

Tape Ketan

Tempoyak Total (Persentase)

Empat isolat BAL yang diketahui potensial resistan terhadap chloramphenicol dan erythromycin tersebut selanjutnya dilakukan pengujian ulang terhadap sifat resistansinya. Pengujian dilakukan dengan cara menumbuhkan isolat tersebut di dalam medium MRS cair yang telah ditambahkan kombinasi kedua antibiotik, yaitu chloramphenicol dan erythromycin. Hasil pengujian menunjukkan bahwa keempat isolat potensial tersebut mampu tumbuh dalam medium dengan penambahan dua jenis antibiotik tersebut, yaitu chloramphenicol 2 μg/ml dan erythromycin 1 μg/ml (Tabel 4.1.(2)). Universitas Indonesia


33

Tabel 4.1.(2) Hasil pengujian isolat BAL yang resistan terhadap kombinasi chloramphenicol dan erythromycin Chloramphenicol 2 μg/mL

Asal Isolat

Isolat

+ Erythromycin 1 μg/mL

D2

+

Bekasam daging domba

T3

+

Tape ketan

T8

+

Tape ketan

S23

+

Bekasam daging sapi

Sebanyak 49 isolat BAL potensial resistan chloramphenicol diasumsikan memiliki gen resistan chlorampehnicol, begitu pula 16 isolat BAL yang potensial resistan erythromycin diasumsikan memiliki gen resistan erythromycin. Sebanyak empat isolat BAL yang potensial resistan terhadap kedua jenis antibiotik tersebut menunjukkan bahwa isolat tersebut memiliki lebih dari satu gen resistan antibiotik, yaitu gen resistan chloramphenicol dan gen resistan erythromycin. Ahrne dkk. (1992) telah membuktikan bahwa pada Lactobacillus reuteri memiliki potensi sifat resistansi ganda terhadap chloramphenicol dan erythromycin (lihat Shareck dkk. 2004: 181). Penggunaan konsentrasi akhir chloramphenicol sebesar 2 μg/ml dan erythromycin sebesar 1 μg/ml yaitu berdasarkan hasil optimasi Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler, Puslit Bioteknologi LIPI untuk proses pengklonaan dengan menggunakan sel inang BAL (Data belum dipublikasi). Gen resistan antibiotik terletak pada plasmid maupun kromosom BAL, sehingga belum dapat diketahui apakah sifat resistansi antibiotik pada isolat BAL dari pangan fermentasi tradisional Indonesia tersenut disandi oleh gen resistan antibiotik yang terletak pada plasmid atau kromosom BAL (Teuber 2004: 317). Oleh karena itu, diperlukan tahap isolasi plasmid untuk mendeteksi keberadaan gen resistan antibiotik pada plasmid BAL. Gen resistan antibiotik yang terdapat pada plasmid BAL dapat digunakan sebagai penanda seleksi pada proses transformasi (Wright 1998: 16--17).



34 4.2 Isolasi plasmid bakteri asam aktat (BAL)

Isolasi plasmid bertujuan untuk mendapatkan DNA plasmid pada isolat BAL yang potensial resistan terhadap chloramphenicol dan erythromycin. Isolasi plasmid BAL dilakukan menggunakan tiga metode, yaitu alkaline lysis minipreparation (Sambrook & Russell 2001: 1.31 ), alkaline lysis midipreparation (Sambrook & Russell 2001: 1.35), dan Qiagen Plasmid Midi Kit (Qiagen 2001: 1--2). Isolasi plasmid metode alkaline lysis minipreparation bertujuan untuk mengetahui isolat BAL potensial mana saja yang memiliki plasmid, sedangkan isolasi plasmid alkaline lysis midipreparation dan Qiagen Plasmid Midi Kit dilakukan untuk mendapatkan DNA plasmid dengan konsentrasi yang lebih besar dan selanjutnya dapat digunakan sebagai DNA cetakan pada proses PCR.

4.2.1 Metode alkaline lysis minipreparation

Isolasi plasmid metode alkaline lysis minipreparation (Sambrook & Russell 2001: 1.31) dengan modifikasi penambahan lisozim 10 mg/ml dilakukan terhadap 49 isolat BAL resistan terhadap chloramphenicol dan 16 isolat resistan terhadap erythromycin. Metode alkaline lysis minipreparation merupakan metode isolasi plasmid skala kecil (small scale) yang memiliki keunggulan yaitu hanya menggunakan bahan-bahan dalam jumlah yang sedikit sehingga relatif lebih ekonomis saat dilakukan terhadap sampel yang berjumlah banyak (Sambrook & Russell 2001: 1.31). Visualisasi hasil isolasi plasmid BAL dilakukan dengan elektroforesis menggunakan agarosa 1% (100 volt, 45 menit).



35

a

4.000 pb

Agarosa 1%, 100v, 45 menit M

b

1

2

3 >10.000 pb

10.000 pb

4.000 pb

2.000 pb 1.000 pb

Keterangan: a. Hasil visualisasi elektroforesis b. Gambar skematis Lajur M: Penanda DNA 1 Kb Lajur 1: Isolat T1 Lajur 2: Isolat T2 Lajur 3 :Isolat D2

Gambar 4.2.1.(1) Hasil visualisasi elektroforesis isolasi plasmid alkaline lysis minipreparation Hasil isolasi plasmid yang divisualisasi dengan teknik elektroforesis gel agarosa 1% menunjukkan pola pita berbeda pada tiga isolat (Gambar 4.2.1 (1)). Pada Lajur 1 dan lajur 2 terlihat tidak adanya pita DNA plasmid yang terbentuk yaitu pada isolat T1 dan isolat T2, sedangkan pada lajur 3 yang merupakan isolat D2 menunjukkan adanya dua pita yang berada pada ukuran lebih dari 10.000 pb dan 4.000 pb dibandingkan dengan penanda DNA . Isolat T8 juga menunjukkan adanya pita DNA plasmid (Gambar 4.2.1.(2), Lajur 4) pada ukuran lebih dari 10.000 pb dan 3.000 pb dibandingkan dengan penanda DNA. Plasmid juga Universitas Indonesia


36 terlihat pada isolat S34 (Gambar 4.2.1.(3), Lajur 2) berupa pita tipis pada ukuran lebih dari 10.000 pb dan 4.000 pb. Hasil isolasi plasmid alkaline lysis minipreparation menunjukkan dari total 65 isolat BAL hanya menunjukkan 3 isolat BAL yang diketahui membawa plasmid, yaitu isolat D2, T8, dan S34. Dengan demikian, hanya tiga isolat tersebut yang digunakan dalam tahap selanjutnya, yaitu isolasi plasmid alkaline lysis midipreparation.

a

Agarosa 1%, 100V, 45 Menit b

1

2

3

4

5

M

>10.000 pb 4.000 pb

Keterangan: a. Hasil visualisasi elektroforesis b. Gambar skematis Lajur M: Penanda DNA 1 Kb Lajur 1: Isolat T5 Lajur 2: Isolat T6 Lajur 3 :Isolat T7 Lajur 4 : Isolat T8 Lajur 5: Isolat T10 Gambar 4.2.1.(2) Hasil visualisasi elektroforesis isolasi plasmid alkaline lysis minipreparation Universitas Indonesia


37

a

4.000 pb

Agarosa 1%, 100 Volt, 45 Menit

b

M

1

2 >10.000 pb 4.000 pb

Agarosa 1%, 100 Volt, 45 Menit Keterangan: a. Hasil visualisasi elektroforesis b. Gambar skematis Lajur M: Penanda DNA 1 Kb Lajur 1: Isolat S31 Lajur 2: Isolat S34 Gambar 4.2.1.(3) Hasil visualisasi elektroforesis isolasi plasmid alkaline lysis minipreparation Pita DNA plasmid BAL dengan intensitas rendah (terlihat sangat tipis) pada sampel isolat D2, T8, dan S34 menunjukkan konsentrasi DNA plasmid BAL yang rendah (O’Sullivan & Klaenhammer 1993: 2732). Akan tetapi, pengukuran konsentrasi dengan spektrofotometer tidak dilakukan pada hasil isolasi plasmid alkaline lysis minipreparation, karena seluruh volume sampel hasil isolasi digunakan pada tahap elektroforesis gel agarosa. Pita DNA plasmid BAL yang



38 terlihat sangat tipis juga diprediksi karena metode isolasi plasmid BAL yang dilakukan belum optimal (Cataloluk 2002: 127). Plasmid BAL yang diisolasi tergolong low copy number atau memiliki jumlah salinan rendah dalam satu sel sehingga menyebabkan pita yang terbentuk pada gel elektroforesis terlihat sangat tipis. Teknik isolasi plasmid BAL low copy number dapat dimodifikasi untuk mendapatkan pita DNA yang terlihat tebal pada visualisasi elektroforesis. Modifikasi berupa penambahan konsentrasi sel yang dapat dilakukan dengan cara menambah volume kultur pada saat pemanenan sel. Hal tersebut diharapkan dapat meningkatkan konsentrasi sel yang membawa plasmid low copy number. Metode isolasi plasmid alkaline lysis minipreparation merupakan metode yang umum digunakan untuk mengisolasi plasmid dari bakteri E. coli yang tergolong bakteri Gram negatif. Modifikasi penambahan lisozim yang dilakukan dalam penelitian bertujuan untuk membantu melisiskan dinding sel BALyang tergolong ke dalam bakteri Gram positif (O’Sullivan & Klaenhammer 1993: 2730). Bakteri Gram positif memiliki struktur dinding sel yang tebal akibat adanya jembatan peptidoglikan sebagai komponen utama dinding sel (Pelczar & Chan 2008: 117). Lisozim mampu menghidrolisis ikatan β-1,4 antara asam Nasetilmuramat dan N-asetilglukosamin yang merupakan polisakarida penyusun peptidoglikan pada dinding sel bakteri (Sambrook & Russell 2001: A4.51).

4.2.2 Metode alkaline lysis midipreparation

Tahap isolasi plasmid metode alkaline lysis midipreparation (Sambrook & Russel 2001: 1.31) dengan modifikasi penambahan lisozim dilakukan terhadap tiga sampel isolat BAL yang menunjukkan adanya pita DNA plasmid berdasarkan visualisasi hasil isolasi plasmid metode alkaline lysis minipreparation, yaitu isolat D2, T8, dan S34. Prosedur kerja isolasi plasmid alkaline lysis midipreparation secara keseluruhan hampir sama dengan tahapan isolasi alkaline lysis minipreparation, perbedaan hanya terletak pada volume kultur BAL yang digunakan dalam pengkoleksian pelet, volume larutan yang digunakan, waktu dan kecepatan sentrifus yang digunakan, serta penambahan dapar STE setelah koleksi Universitas Indonesia


39 pelet kultur overnight. Penambahan dapar STE bertujuan untuk menetralisir asam yang diproduksi oleh BAL selama pertumbuhannya. Kultur BAL overnight umumnya memiliki pH asam yaitu kurang dari 5 (Qiagen 2001: 1).

Agarosa 1%, 100v, 45 menit Keterangan: Lajur M: Penanda DNA 1 Kb Lajur 1 : Isolat D2 Lajur 2 : Isolat T8 Lajur 3 : Isolat S34 Gambar 4.2.2 Hasil visualisasi isolasi plasmid alkaline lysis midipreparation Hasil visualisasi elektroforesis gel agarosa 1 % menunjukkan tidak terlihatnya pita DNA pada isolat D2 (Gambar 4.2.2, Lajur 1) dan terdapatnya smear pada isolat T8 dan S34 (Gambar 4.2.2, Lajur 2 dan 3). Proses isolasi plasmid metode alkaline lysis midipreparation kembali diulang untuk mendapatkan plasmid BAL dalam jumlah konsentrasi yang lebih besar. Pengulangan telah dilakukan sebanyak 6 (enam) kali, namun hasil yang didapatkan dari pengulangan tersebut tetap sama bahkan pada beberapa kali pengulangan isolasi plasmid yang didapatkan adalah tidak terlihatnya pita DNA pada ketiga sampel isolat. Dengan demikian, isolasi plasmid BAL dengan metode alkaline lysis midipreparation belum berhasil dilakukan. Hasil smear yang terlihat pada sampel plasmid T8 dan S34 (Gambar 4.2.2, Lajur 2 dan 3) diasumsikan sebagai terdegradasinya DNA plasmid. Degradasi DNA plasmid dapat terjadi karena adanya aktivitas enzim DNase, dan perlakuan mekanis pada saat isolasi plasmid. Enzim DNAse merupakan enzim yang dapat Universitas Indonesia


40 mendigesti DNA pada bagian dalam sekuen DNA (Cataloluk 2002: 128). Teknik homogenisasi (pembolak-balikkan tabung) yang terlalu kasar pada saat penambahan alkaline lysis solution II juga dapat menyebabkan DNA plasmid ikut terdenaturasi (Dellis 2009a: 2). Hasil isolasi plasmid BAL yang belum berhasil tersebut disebabkan oleh beberapa faktor, di antaranya yaitu sulitnya teknik isolasi plasmid native BAL. Plasmid BAL yang diisolasi dalam penelitian merupakan plasmid native atau plasmid asli yang berasal dari isolat BAL asal pangan fermentasi tradisional Indonesia dan belum diketahui secara pasti ukuran dan fenotip yang dimiliki. Soomro & Masud (2007: 452) menyatakan bahwa teknik pengisolasian DNA plasmid BAL memiliki kendala di antaranya proses pelisisan dinding sel BAL yang sangat sulit, perbedaan asal isolat, dan rendahnya jumlah salinan plasmid (low copy number). Bakteri asam laktat tergolong bakteri Gram positif yang memiliki struktur dinding sel yang sangat tebal, sehingga diperlukan penambahan lisozim sebagai enzim yang mengkatalis pelisisan dinding sel. Namun waktu penginkubasian yang terlalu lama (lebih dari 30 menit) setelah penambahan lisozim dapat mengakibatkan aktifnya enzim DNAse yang memungkinkan hilangnya plasmid (plasmid loss) (Cataloluk 2003: 128). Metode isolasi plasmid yang belum optimal juga diprediksi sebagai penyebab belum berhasilnya isolasi plasmid alkaline lysis midipreparation. Pencarian alternatif metode isolasi plasmid BAL yang belum berhasil dilakukan dengan teknik manual menggunakan metode alkaline lysis minipreparation perlu dilakukan dalam penelitian. Penggunaan kit dalam tahap isolasi plasmid BAL dapat menjadi alternatif pilihan karena prosedur kerja isolasi plasmid telah terstandardisasi, sehingga dapat meminimalisasi kesalahan dalam teknik isolasi dan waktu yang dibutuhkan lebih sedikit. Larutan yang digunakan dalam kit juga sudah siap pakai sehingga dapat mengurangi kesalahan pada faktor kontaminasi dan kualitas bahan (Fibriana dkk. 2010: 13).



41 4.2.3 Metode Qiagen Plasmid Midi Kit

Isolasi plasmid metode Qiagen Plasmid Midi Kit dilakukan terhadap 3 sampel isolat BAL yaitu isolat D2, T8, dan S34. Tahap isolasi menggunakan kit komersial dilakukan sebagai alternatif, karena tahap isolasi plasmid alkaline lysis midipreparation belum berhasil dilakukan. Hasil isolasi plasmid BAL divisualisasi dengan teknik elektroforesis gel agarosa 1% (100 volt selama ±45 menit). Gel agarosa 1% digunakan untuk untuk memisahkan frgamen DNA dengan ukuran 500--10.000 pb (Ausubel dkk. 2002: 2--14). Hasil visualisasi elektroforesis gel agarosa 1 % menunjukkan pita DNA dengan ukuran dan intensitas yang berbeda pada setiap sampel (Gambar 4.2.3). Lajur 1 merupakan plasmid dari sampel isolat D2 yang menunjukkan adanya pita tunggal berukuran 12.000 pb. Lajur 2 merupakan hasil isolasi plasmid isolat T8 yang menunjukkan dua pita DNA plasmid pada ukuran 8.060 pb dan 3.840 pb. Lajur 3 menunjukkan pita DNA hasil isolasi plasmid pada isolat S34 yang terlihat smear. Dengan demikian, hanya plasmid isolat T8 yang berhasil diisolasi dengan menggunakan Qiagen Plasmid Midi Kit. Penentuan ukuran plasmid dilakukan dengan menggunakan persamaan garis linear dari kurva standard penanda DNA yang digunakan (Lampiran 9).



42

12.000 pb 8.060 pb 3.840 pb

Agarosa 1 %, 100 volt, 45 menit Keterangan: M : Marker DNA Ladder 1 Kb Lajur 1: D2 Lajur 2: T8 Lajur 3: S34 Gambar 4.2.3 Hasil visualisasi isolasi plasmid Qiagen Plasmid Midi Kit Penyebab terlihatnya smear pada hasil isolasi plasmid S34 diprediksi karena adanya degradasi DNA plasmid. Degradasi DNA plasmid dapat disebabkan karena adanya aktivitas DNase (Cataloluk 2002: 128). Qiagen (2005: 43) juga menyebutkan bahwa penyebab terjadinya degradasi DNA plasmid adalah teknik pembolak-balikan tabung yang terlalu cepat pada saat penambahan dapar P2 dan P3. Ketidakberhasilan tahap isolasi plasmid BAL menggunakan kit komersial pernah terjadi pada penelitian Ronka dkk. (lihat Soomro & Masud 2007: 452) yang mengisolasi plasmid BAL dengan menggunakan Qiagen Plasmid Protokol Kit, yaitu pita DNA plasmid BAL low copy number tidak dapat terlihat pada visualisasi gel agarosa.



43 Penggunaan kit komersial bertujuan untuk meminimalisasi kesalahan teknis pada proses isolasi plasmid, karena prosedur kerja isolasi plasmid pada kit komersial umumnya telah terstandardisasi. Kit tersebut tidak spesifik dirancang untuk plasmid native BAL yang tergolong bakteri Gram positif, tetapi untuk mengisolasi plasmid yang secara umum digunakan pada proses pengklonaan, misalnya plasmid seri pUC dan pGEM (Qiagen 2005: 12) sehingga diperlukan modifikasi penambahan dapar STE dan lisozim pada dapar P1 (Qiagen 2001: 1). Lisozim merupakan enzim yang dapat merusak ikatan β-1,4 antara asam Nasetilmuramat dan N-asetilglukosamin yang merupakan polisakarida penyusun peptidoglikan pada bakteri (Sambrook & Russell 2001: A4.51). Menurut O’Sullivan & Klaenhammer (1993: 2730), penambahan lisozim pada teknik isolasi plasmid BAL sangat efektif untuk membantu proses lisisnya dinding sel BAL yang tebal

Tabel 4.2.3 Hasil pengukuran kuantitas hasil isolasi plasmid BAL Isolat Plasmid BAL

Konsentrasi (ng/ml)

Kemurnian

D2

45

1,3

T8

92

1,7

S34

50,9

1,3

Hasil pengukuran konsentrasi DNA plasmid D2, T8, dan S34 menggunakan spektrofotometer menunjukkan hasil berbeda. Konsentrasi DNA plasmid berturut-turut sebesar 45 ng/μl, 92 ng/μl, dan 50,9 ng/μl untuk plasmid D2, T8, dan S34. Kemurnian DNA plasmid juga diukur dengan tingkat kemurnian masing-masing sebesar 1,3; 1,7; dan 1, 3 untuk plasmid D2, T8, dan S34. Menurut (Finn 2003: 1), kemurnian DNA dihitung melalui absorbansi larutan DNA pada panjang gelombang 260 dan 280 (A260/ A280). Nilai kemurnian DNA yang baik yaitu berkisar antara 1,8--2,0. Hal tersebut menunjukkan bahwa hasil isolasi plasmid masih memiliki nilai kemurnian yang rendah. Nilai kemurnian yang kurang dari 1,8 atau lebih dari 2 menunjukkan terdapatnya kontaminasi protein atau RNA (Brown 1991: 33).



44 Kemurnian DNA plasmid yang masih rendah disebabkan karena adanya kontaminan seperti protein, etanol, dan SDS yang terdapat pada hasil isolasi plasmid (Ausubel dkk. 2007: 3.17). Tahap pengeringanginan pelet hasil isolasi plasmid yang belum sempurna menyebabkan terjadinya kontaminasi oleh etanol yang menyebabkan rendahnya kemurnian DNA plasmid (Wegmuller & Schmid 2009: 1). Hasil isolasi plasmid BAL metode Qiagen Plasmid Midi Kit selanjutnya digunakan sebagai cetakan dalam proses PCR.

4.3 Polymerase chain reaction (PCR)

Teknik PCR dilakukan untuk mendeteksi gen resistan chloramphenicol dan erythromycin. Proses PCR dilakukan terhadap tiga sampel hasil isolasi plasmid Qiagen Plasmid Midi Kit. Plasmid D2, T8,dan S34 digunakan untuk mendeteksi gen resistan chloramphenicol, sedangkan plasmid isolat D2 dan T8 digunakan untuk mendeteksi gen resistan erythromycin. Sampel plasmid isolat S34 tidak digunakan sebagai cetakan untuk mendeteksi gen resistan erythromycin karena isolat tersebut tidak resistan terhadap erythromycin. Menurut Applied Biosystems (2011: 1), cetakan yang digunakan pada proses PCR dapat berupa DNA kromosomal dan plasmid. Produk PCR divisualisasikan pada gel agarosa 2% (100 Volt, 45 menit). Ausubel dkk. (2002: 2--14) menyatakan bahwa gel agarosa dengan konsentrasi sebesar 2% efektif untuk memisahkan fragmen DNA berukuran antara 200 dan 3000 pb.

4.3.1 Hasil deteksi gen resistan chloramphenicol

Keberadaan gen resistan choramphenicol pada plasmid dapat dideteksi dengan menggunakan primer spesifik. Pasangan primer cat-F, cat-R dan catpIP501F, catpIP501-R digunakan untuk mendeteksi gen cat. Urutan nukleotida primer diacu langsung dari hasil penelitian terdahulu, yaitu Guerra (2001: 1307) dan Lu Pan dkk. (2011: 1317) sehingga tahap desain primer tidak dilakukan dalam penelitian.



45 Hasil visualisasi elektroforesis produk PCR plasmid D2,T8, dan S34 yang dideteksi menggunakan primer cat-F dan cat-R menunjukkan hasil positif (Gambar 4.3.1, Lajur 1, 2, 3), yaitu ketiga sampel tersebut menghasilkan pita tunggal. Analisis perhitungan ukuran produk PCR plasmid BAL dengan primer cat dapat dilakukan dengan menggunakan persamaan garis linear yang dihasilkan dari kurva standard penanda DNA yang digunakan (Lampiran 10). Berdasarkan hasil perhitungan diketahui ukuran produk PCR plasmid BAL dengan primer cat yaitu sebesar 623 pb. Hal tersebut sesuai dengan Guerra dkk. (2001: 1307) yang menyatakan bahwa fragmen gen cat dilaporkan memiliki ukuran sebesar 623 pb. Dengan demikian ketiga sampel plasmid BAL berhasil terdeteksi mengandung gen cat.

M

1

2

3

2.072 pb 750 pb 500 pb

623 pb

Agarosa 2 %, 100 volt, 45 menit 100 pb

Keterangan: Lajur M : Penanda DNA 100 pb Lajur 1 : D2 Lajur 2 : T8 Lajur 3 : S34 Gambar 4.3.1 Hasil visualisasi produk PCR dengan primer cat Hasil visualisasi elektroforesis produk PCR plasmid D2, T8, dan S34 yang

dideteksi menggunakan pasangan primer catpIP501-F, catpIP501-R menunjukkan hasil negatif yaitu pita DNA tidak terdeteksi pada ketiga sampel (Data belum dipublikasi). Dengan demikian, gen resistan chloramphenicol pada plasmid BAL hanya berhasil dideteksi dengan menggunakan primer cat-F dan cat-R.



46 Tabel 4.3.1 Hasil deteksi gen resistan chloramphenicol Plasmid Primer

D2

T8

S34

cat

+

+

+

catpIP501

−

−

−

Keterangan: (+) = Sampel positif terdeteksi, yaitu menghasilkan pita tunggal pada ukuran tertentu. (-) = Sampel negatif terdeteksi, yaitu tidak terdapat pita

4.3.2 Hasil deteksi gen resistan erythromycin

Keberadaan gen resistan erythromycin pada plasmid BAL dapat dideteksi dengan menggunakan primer spesifik. Pasangan primer ermB-F, ermB-R; ermCF, ermC-R; dan Tn554-F, Tn554-R masing-masing digunakan untuk mendeteksi gen ermB, ermC, dan ermA. Sekuen nukleotida primer diacu langsung dari hasil penelitian terdahulu yaitu Jensen (1998: 154) dan Lu Pan dkk. (2011: 1317) sehingga tahap desain primer tidak dilakukan pada penelitian. Hasil visualisasi elektroforesis sampel plasmid isolat D2 dan T8 yang dideteksi menggunakan primer spesifik ermB menunjukkan hanya sampel plasmid isolat T8 yang menghasilkan satu pita tunggal (Gambar 4.3.2, Lajur 1). Analisis perhitungan ukuran produk PCR plasmid T8 dengan primer ermB dapat dilakukan dengan menggunakan persamaan garis linear yang dihasilkan dari kurva standard penanda DNA yang digunakan (Lampiran 11). Berdasarkan hasil perhitungan diketahui ukuran produk PCR plasmid BAL dengan primer ermB yaitu sebesar 531 pb. Hal tersebut tidak sesuai dengan Jensen dkk. (1998: 154) dan Lu Pan dkk. (2011: 1317), yang menyatakan bahwa fragmen gen ermB memiliki ukuran sebesar 405 pb.



47 Perbedaan ukuran gen ermB yang diperoleh dalam penelitian dengan dengan literatur menunjukkan bahwa gen ermB belum berhasil diamplifikasi secara spesifik sehingga terdapat beberapa basa yang ikut teramplifikasi. Oleh karena itu, perlu dilakukan verifikasi dengan menggunakan teknik sequencing untuk mengetahui sekuen nukleotida penyusun gen tersebut. Hasil negatif dapat terlihat pada produk PCR sampel plasmid D2 (Gambar 4.3.2, Lajur 2) yang tidak menunjukkan adanya pita DNA. Sifat resistan terhadap erythromycin yang dimiliki oleh isolat D2 kemungkinan diekspresikan oleh gen resistan erythromycin lain selain ermB.

M

1

2

2.072 pb

600 pb 500 pb 531 pb Agarosa 2 %, 100 volt, 45 menit Keterangan: Lajur M : Penanda DNA 100 pb Lajur 1 : T8 Lajur 2 : D2

Gambar 4.3.2 Hasil visualisasi produk PCR dengan primer ermB Hasil visualisasi elektroforesis produk PCR plasmid D2 dan T8 yang dideteksi menggunakan pasangan primer ermC-F, ermC-R; dan Tn554-F, Tn554R menunjukkan hasil negatif yaitu pita DNA tidak terdeteksi pada semua sampel (Data belum dipublikasi). Dengan demikian, gen resistan erythromycin pada plasmid BAL hanya berhasil dideteksi dengan menggunakan primer ermB-F dan ermB-R.



48 Tabel 4.3.2 Hasil deteksi gen resistan erythromycin Plasmid Primer

D2

T8

ermB

−

+

ermC

−

−

Tn554

−

−

Keterangan: (+) = Sampel positif terdeteksi, yaitu menghasilkan pita tunggal pada ukuran tertentu. (-) = Sampel negatif terdeteksi, yaitu tidak terdapat pita

Faktor keberhasilan PCR dipengaruhi oleh konsentrasi komponen dalam reaksi PCR, antara lain primer, DNA cetakan, enzim polimerase, dNTP, dapar MgCl, serta kondisi reaksi PCR (Sambrook & Russell 2001: 8.4--8.9). Primer ermB-F dan ermB-R masing-masing memiliki panjang 20 basa dengan kandungan basa GC sebesar 45--55%, sedangkan primer cat-F dan cat-R masing-masing memiliki panjang 18 basa dengan kandungan GC sebesar 50--61 %. Yuwono (2006: 18) menyatakan bahwa primer yang baik memiliki panjang 18--28 basa nukleotida dan memiliki kandungan GC sebesar 50--60%. Panjang nukleotida primer yang lebih pendek akan memicu terjadinya amplifikasi produk PCR nonspesifik (Sulistyaningsih 2007: 18). Konsentrasi primer juga merupakan faktor yang menentukan keberhasilan proses PCR. Konsentrasi primer yang digunakan dalam penelitian yaitu 0,5 µM. Konsentrasi primer yang optimal berkisar antara 0,1--0,5 µM (Qiagen 1997: 3), namun konsentrasi primer sampai 1 µM masih menghasilkan produk PCR yang spesifik. Konsentrasi primer yang lebih tinggi dari 1,0 µM dapat menyebabkan terjadinya mispirming (penempelan primer pada daerah non-spesifik) dan akumulasi produk non-spesifik (Yuwono 2006: 18), sedangkan konsentrasi primer yang terlalu rendah dapat menurunkan efisiensi proses PCR (Bustin 2000: 179).



49 Menurut Roche Applied Science (2005: 2), konsentrasi DNA cetakan yang berasal dari DNA plasmid berkisar antara 0,1 ng--15 ng. dengan kemurnian sebesar 1,3; 1,7; dan 1,3 masing-masing untuk DNA plasmid D2, T8, dan S34. Hal tersebut menunjukkan bahwa DNA cetakan memiliki kemurnian yang sangat rendah karena terdapatnya kontaminasi protein dan RNA. Kemurnian DNA dapat dihitung berdasarkan rasio sampel pada absorbansi 260 dan 280 (A260/ A280). Nilai rasio yang berada pada kisaran 1,8--2,0 menunjukkan DNA cetakan tersebut memiliki kemurnian yang baik (Finn 2003: 1). Tahapan PCR yang digunakan dalam penelitian diawali dengan tahap denaturasi awal pada suhu 94 oC selama 5 menit. Denaturasi awal dilakukan sebagai pemanasan untuk membantu DNA cetakan agar terdenaturasi dengan baik (Yuwono 2006: 27). Denaturasi awal dilanjutkan dengan tahap denaturasi pada suhu 94 oC selama 30 detik. Tahap denaturasi umumnya terjadi pada suhu 92-- 94 o

C selama 15 detik sampai 2 menit (Hajkova dkk. 2006: 559). Tahap selanjutnya yaitu penempelan primer (annealing) pada DNA

cetakan. Ahsen (2001: 1956) menyatakan bahwa suhu annealing sangat tergantung pada nilai Tm (melting temperature) pada primer yang digunakan. Penentuan suhu annealing umumnya menggunakan kalkulasi 5 oC lebih rendah dari nilai Tm primer. Primer cat memiliki nilai Tm sebesar 57--62 oC, sedangkan primer ermB memiliki nilai Tm sebesar 58--62 oC. Suhu annealing sebesar 52 oC merupakan suhu optimal reaksi amplifikasi gen cat dan ermB berdasarkan hasil optimasi yang dilakukan dalam penelitian. Suhu annealing yang terlalu rendah dapat menyebabkan primer berhibridisasi tidak spesifik pada sekuen target, sedangkan suhu annealing yang terlalu tinggi menyebabkan primer tidak dapat berhibridisasi (Palumbi dkk. 2002: 2),. Tahap terakhir yaitu polimerisasi pada suhu 72 oC selama 90 detik. Polimerisasi umumnya terjadi pada suhu 72 oC, karena suhu tersebut merupakan suhu optimal untuk enzim Taq DNA polimerase (Dellis 2009c: 9). Polimerisasi akhir dilakukan pada suhu 72 oC selama 10 menit. Polimerisasi akhir dilakukan untuk membantu mengakhiri pemanjangan produk PCR yang diinisiasi selama siklus terakhir (Applied Biosystems 2011: 5).



50 Seluruh tahapan PCR dalam penelitian berlangsung selama 35 siklus. Jumlah siklus yang digunakan dalam reaksi PCR sebaiknya berlangsung tidak lebih dari 35 siklus. Jumlah siklus yang berlangsung lebih dari 35 siklus dapat menurunkan laju eksponensial amplifikasi serta peningkatan peluang kesalahan pemasangan basa pada rantai DNA cetakan karena jumlah reagen PCR dan aktivitas DNA polimerase yang semakin berkurang. Jumlah siklus terlalu sedikit dapat mengurangi kualitas produk yang diharapkan (Yuwono 2006: 20).

4.4 Purifikasi produk PCR

Produk PCR yang diduga merupakan fragmen gen cat dan ermB dari sampel plasmid T8 selanjutnya dipurifikasi. Purifikasi bertujuan untuk memurnikan produk PCR dari pengotor berupa komponen PCR, protein, serta garam (Promega 2005: 1--2). Komponen PCR seperti primer, dNTPs, enzim polimerase, dan dapar yang masih terdapat pada produk PCR dapat menyebabkan masalah pada proses sequencing, oleh karena itu produk PCR sebaiknya dipurifikasi terlebih dahulu sebelum disequencing (Hooper 2002: 12). Purifikasi dalam penelitian menggunakan kit komersial Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System [Promega] yang dirancang untuk mengekstraksi dan mempurifikasi fragmen DNA berukuran 100 pb hingga 10.000 pb dari gel agarosa atau langsung dari produk PCR. Prinsip kerja kit tersebut didasarkan pada kemampuan DNA untuk berikatan dengan membran silika yang berada dalam campuran garam chaotropic (Promega 2005: 1). Visualisasi hasil purifikasi menunjukkan terdapatnya pita tunggal berukuran 623 pb (Gambar4.4.(1) Lajur 1) pada hasil purifikasi produk PCR plasmid isolat T8 dengan primer cat. Pita tunggal juga tampak pada Gambar 4.4.(2) (Lajur 1) yang berukuran 531 pb pada hasil purifikasi produk PCR plasmid isolat T8 dengan primer ermB. Penentuan ukuran fragmen hasil purifikasi dilakukan dengan menggunakan persamaan garis linear yang dihasilkan dari kurva standard penanda DNA yang digunakan (Lampiran 12 & Lampiran 13).



51 Pita DNA hasil purifikasi terlihat lebih tebal dan terang daripada pita DNA hasil PCR. Penampakan pita DNA yang relatif tebal dan terang menunjukan bahwa proses purifikasi berhasil memurnikan fragmen DNA gen cat dan ermB dari pengotor berupa komponen PCR, protein, dan garam. Dengan demikian, proses purifikasi berhasil dilakukan, karena gen cat dan ermB dari sampel isolat T8 hasil purifikasi tidak terdegradasi dan tidak mengalami perubahan ukuran sehingga hasilnya dapat digunakan dalam tahap sequencing.

M

1

750 pb 500 pb

623 pb Agarosa 2%, 100 volt, 45 menit Keterangan: Lajur M : Penanda DNA 100 pb Lajur 1 : Hasil purifikasi produk PCR plasmid T8 dengan primer cat

Gambar 4.4.(1) Hasil visualisasi purifikasi produk PCR plasmid T8 dengan primer cat [Sumber: Dokumentasi Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler-Puslit Bioteknologi LIPI, 2011.]



52

531 pb

Agarosa 1%, 100 Volt, 45 menit. Keterangan: Lajur M : Penanda DNA 100 pb Lajur 1 : Hasil purifikasi gen ermB pada plasmid T8

Gambar 4.4.(2)

Hasil visualisasi purifikasi produk PCR plasmid T8 dengan primer ermB

[Sumber: Dokumentasi Laboratorium Bakteriologi dan Virologi MolekulerPuslit Bioteknologi LIPI, 2011.]

4.5 Sequencing dan analisis sekuen nukleotida

Tahap kerja sequencing dilakukan untuk memverifikasi hasil positif pada tahap deteksi. Sequencing bertujuan untuk mengetahui urutan basa nukleotida gen cat dan ermB pada plasmid T8 serta dianalisis homologinya dengan data pada pangkalan data GenBank. Proses sequencing dilakukan oleh teknisi dari perusahaan penyedia jasa sequencing 1st Base. Hasil sequencing berupa data sekuen nukleotida dan direpresentasikan dengan grafik elektroferogram. Data sekuen nukleotida dianalisis melalui pencarian homologi program perangkat lunak BLASTX pada situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast. Program BLASTX akan mentranslasi sekuen nukleotida menjadi protein, kemudian membandingkannya dengan protein yang terdapat pada pangkalan data GenBank (Gaedeke 2011: 1— 3).



53 4.5.1 Gen resistan chloramphenicol (cat)

Proses sequencing menggunakan pasangan primer cat yang juga digunakan pada proses PCR. Hasil sequencing produk PCR plasmid T8 dengan primer cat yaitu berupa sekuen nukleotida (Gambar 4.5.1) dan direpresentasikan dengan elektroferogram (Lampiran 4). Urutan basa hasil sequencing selanjutnya dianalisis dengan program bioinformatika BLASTX. Hasil analisis BLASTX menunjukkan sekuen nukleotida gen cat pada plasmid T8 memiliki similarity 98% dengan fragmen gen chloramphenicol acetyl transferase (cat) pada plasmid pSG76-CS dan plasmid pKD3 dari E.coli (Lampiran 6). Hasil tersebut menunjukkan bahwa penelitian deteksi gen resistan chloramphenicol (cat) pada plasmid BAL dari pangan fermentasi tradisional Indonesia berhasil dilakukan.

Gambar 4.5.1 Sekuen nukleotida gen cat pada plasmid T8 dengan primer cat 4.5.2 Gen resistan erythromycin (ermB)

Proses sequencing menggunakan primer ermB yang juga digunakan pada tahap deteksi. Hasil sequencing gen ermB pada plasmid T8 berupa data sekuen nukleotida (Gambar 4.5.2) dan direpresentasikan dengan grafik elektroferogram (Lampiran 5). Hasil analisis BLASTX pada sekuen nukleotida gen ermB plasmid T8 menunjukkan similarity tertinggi sebesar 46% dengan protein regulator Universitas Indonesia


54 transkripsi gen NifA/NtrC pada Bacillus licheniformis (Lampiran 7). Walmsley dkk. (1994: 422) menyatakan bahwa gen NifA/NtrC merupakan gen yang yang menyandikan enzim nitrogenase fungsional yang berfungsi untuk fiksasi nitrogen. Ketidaksesuaian hasil yang didapat dengan gen ermB tersebut diprediksi karena adanya kontaminan yang ikut teramplifikasi pada proses PCR (Mifflin ?: 4).

Gambar 4.5.2 Sekuen nukleotida gen ermB pada plasmid T8 dengan primer ermB Proses sequencing diulang kembali untuk mendapatkan sekuen gen ermB yang memiliki nilai similarity dengan data yang ada pada GenBank. Proses preparasi PCR dilakukan dalam kondisi steril untuk meminimalisasi masuknya kontaminan ke dalam campuran reaksi. Kontaminasi dapat berasal dari bahan yang digunakan, seperti tip mikropipet dan tabung PCR dan dapat dihindari dengan cara terlebih dahulu mensterilisasi bahan-bahan tersebut dengan autoklaf sebelum digunakan pada proses PCR (Roche Applied Science 2008: 1). Analisis BLASTX sekuen nukleotida gen ermB yang didapatkan dari hasil pengulangan sequencing tetap menunjukkan hasil yang sama, yaitu nilai similarity tertinggi sebesar 46% dengan protein regulator transkripsi gen NifA/NtrC pada Bacillus licheniformis. Proses pengulangan sequencing yang belum berhasil tersebut dapat disebabkan beberapa faktor di antaranya kontaminan pada oligonukleotida primer ermB yang digunakan (Mifflin ?: 4). Faktor kontaminan pada cetakan DNA diabaikan pada penelitian ini, karena pada proses amplifikasi gen ermB menggunakan DNA cetakan yang sama dengan proses amplifikasi gen Universitas Indonesia


55 cat. Gen cat pada plasmid T8 menunjukkan similarity 98% dengan data yang ada pada GenBank. Proses sequencing kembali diulang dengan mengganti primer ermB yang digunakan. Primer ermB dengan sekuen yang sama sebelumnya dipesan pada perusahaan penyedia jasa pembuatan oligonukleotida primer, sehingga diharapkan kemungkinan adanya faktor kontaminasi pada primer dapat diatasi. Primer ermB baru segera di-aliquot dalam tabung mikrosentrifus steril untuk menghindari adanya kontaminasi primer pada saat penggunaan (Hale 2005: 1). Analisis BLASTX sekuen nukleotida gen ermB pada plasmid T8 yang didapatkan dari hasil pengulangan sequencing yang kedua tetap menunjukkan hasil yang sama, yaitu similarity tertinggi sebesar 46% dengan protein regulator transkripsi NifA/NtrC pada Bacillus licheniformis. Hasil tersebut menunjukkan bahwa gen ermB pada plasmid BAL tidak berhasil dideteksi. Perbedaan asal isolat menyebabkan adanya keunikan sekuen yang dimiliki oleh plasmid T8, sehingga analisis lebih lanjut untuk mengetahui sekuen nukleotida lengkap penyusun plasmid T8 perlu dilakukan.



BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Gen resistan chloramphenicol (cat) berhasil dideteksi pada plasmid BAL dari pangan fermentasi tradisonal Indonesia, sedangkan gen resistan erythromycin (ermB) tidak berhasil dideteksi.

5.2 Saran 1.

Perlu dilakukan sequencing plasmid BAL untuk mengetahui urutan lengkap basa nukleotida yang dimiliki plasmid tersebut sebelum digunakan sebagai vektor pengklonaan.

2. Perlu dilakukan perancangan primer untuk mendeteksi gen resistan erythromycin pada plasmid BAL.

56



DAFTAR REFERENSI

Ahsen, N. von, C.T. Wittwer & E. Scutz. 2001. Oligonucleotide melting temperatures under PCR conditions: Nearest-neighbor corrections for Mg2+, deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas. Clinical Chemistry 47(11): 1956--1961. Alehsin, V.V., E.V. Semenova, V.G Doroshenko, Y.V. Jomantas, B.V. Tarakanov & V.A. Livshits. 1999. The broad host range plasmid pLF1311 from Lactobacillus fermentum VKM1311. FEMS Microbiology Letter 178: 47-53. Applied Biosystems. 2011. PCR Amplification Kit. Applied Biosystems, California: 1-1—5-19 + A1—E6. Ausubel, F.M., R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith & K. Struhl. 2002. Short protocols in molecular biology. 5th ed. John Wiley & Sons, Inc., Canada: xxxviii + 12.10 + A1-29 + 17 hlm. Axelsson, L. 2004. Lactic acid bacteria: Classification and physiology. Dalam: Salminen, S., A.T. von Wright & Ouwehand, A. 2004. Lactic acid bacteria: Microbiological and functional aspects. 3rd ed. Marcell Dekker, Inc., NewYork: 629 hlm. Baati, L., G. Roux, B. Dahou & J.L Uribelarrea. 2004. Unstructured modeling growth of Lactobacillus acidophilus as a function of the temperature. Mathematics and Computers in Simulations 65: 137--145. Boffey, S.A. 1994. Agarose gel electrophoresis of DNA. Dalam: Walker, J.M. 1984. Methods in molecular biology. The Humana Press, Clifton: 43--50. Boom, R., C.J.A Sol, M.M.M. Sallimans, C.L. Jansen, P.M.E. Wertheim-vanillen & J. van der Noordaa. 1990. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of Clinical Microbiology 28: 495--503. Brock, T.D., M.T. Madigan, J. M. Martinko, & J. Parker. 1994. Biology of microorganisms. 7th ed. Prentice-Hall, Inc., New Jersey: xvii + 909 hlm.

57



58 Brown, T.A. 1991. Pengantar kloning gena. Yayasan Essentia Medica, Yogyakarta: 274 hlm. Bustin, S.A. 2000. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology 25 : 169--193. Canu, A. & R. Leclercq. 2009. Macrolides and lincosamide. Dalam: Mayers, D.L. 2009. Antimicrobial drug resistances. Volume 1. Humana Press, New York: xxvi + 671 hlm. Cataloluk, O. 2002. The development of a modified method for isolating plasmids from expopolysaccharide producing Lactobacillus species using conventional plasmid isolation methods. Turkey Journal of Bilogy 27: 125--129. Dellis. S. 2009a. Molecular lab experiment molecular biology. Minipreparation of plasmid DNA. (?): 8 hlm. http://dellis.people.cofc/virtuallabbook/LabReadings/Miniprep/MINIPREP ARATION.pdf, 7 Agustus 2011, pk. 19.05 WIB. Dellis. S. 2009b. Molecular lab experiment molecular biology. Restriction digest, gel electrophoresis, and DNA ligation. (?): 23 hlm. http://dellis.people.cofc.edu/virtuallabbook/LabReadings/RE_GelElectrop horesis.pdf, 7 Agustus 2011, pk. 18.55 WIB. Dellis, S. 2009c. PCR and thermalcycling. (?): 11 hlm. http://dellis.people.cofc/virtuallabbook/LabReadings/PCR_Thermalcyclin g.pdf, 7 Agustus 2011, pk. 19.05 WIB. Egervarn, M. 2009. Antibiotic resistance in Lactobacillus reuteri and Lactobacillus plantarum. Doctoral Thesis-Departement of Microbiology Faculty of Natural Resources and Agricultural Sciences Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala: 68 hlm. Ehrt, S. & D. Schnappinger. 2003. Isolation of plasmids from E. coli by alkaline lysis. Dalam: Casali, N. & A. Preston. 2003. E. coli plasmid vectors: Method and application. Humana Press, New Jersey: 305 hlm.



59 Feld, L., E. Bielak, K. Hammer & A. Wilks. 2009. Characterization of a small erythromycin resistance plasmid pLFE1 from food-isolate Lactobacillus plantarum M345. Plasmid 61 (3): 59--70. Fibriana, F., T. Widianti & A. Retnoningsih. 2010. Deteksi kandungan daging babi pada bakso yang dijajakan di pusat kota Salatiga menggunakan teknik polymerase chain reaction. Biosaintifika 2 (1): 10--17. Finn, K. 2003. Spectrophotometric determination of DNA or RNA concentration. Juni 2003: 1 hlm. http://www.nd.edu/~clarklab/protocols/molec.biol/DNA.UV.pdf, 21 Oktober 2011, pk. 15.15 WIB. Gaedeke, N. 2011. Nucleotide BLAST. Januari 2011: 6 hlm. http://biotools.info/links/B1bioinfo.pdf, 22 Oktober 2011, pk. 19.33 WIB. Gfeller, M.R., L. Meile & M. Teuber. 2003. Sequence and genetics organization of the 19,3-kb erythromycin and dalfospristin resistance plasmid pLME300 from Lactobacillus fermentum ROT1. Plasmid 50 190--201. Guerra, B., S. Soto, J. M. Arguelles & M.C. Mendoza. 2001. Multidrug resistance is mediated by large plasmids carrying a class 1 integron in the emergent Salmonella enteric serotype [4,5,12:i:2]. Antimicrobial Agents and Chemotheraphy 45 (4): 1305--1308. Guilfoile, P.G. 2007. Antibiotic resistance bacteria. Chelsea House Publishers, New York : 128 hlm. Hajkova, P., B. Zemanova, J. Bryja, B. Hajek, K. Roche, E. Tkadlec & J. Zima. 2006. Factors affecting success of PCR amplification of microsatelite loci from otter faeces. Molecular Ecology Notes 6 : 559--562. Hale, J. 2005. Notes for human TREC standard preparation. Oktober 2005: 4 hlm. http://humanvaccine.duke.edu/wysiwyg/downloads.pdf, 27 November 2011, pk 8.58 WIB Hooper, K. 2002. Promega’s SV membrane technology: The evolution of an indispensable laboratory tool. 2002: 4 hlm. http://www.promega.com/~/media/Files/Resources/Promega%20Notes/82/ Promega.pdf, 21 Oktober 2011, pk. 16.14 WIB.



60 Invitrogen. 2011. Platinum Taq DNA polymerase. 2011: 1 hlm. http://www.invitrogen.com, 27 November 2011, pk. 16.48 WIB Jay, J.M., M.J. Loessner & D.A. Golden. 2005. Modern food microbiology. 7th ed. Springer Science+Bussiness Medium, Inc., New York: xx + 790 hlm. Jensen, L.B., N. Frimodt-Moller & F.M. Aarestrup. 1998. Presence of erm gene classes in Gram-positive bacteria of animal and human origin in Denmark. FEMS Microbiology Letters 170: 151--158. Kaiser, G.E. 2001. Mode of action macrolides in blocking translation during bacterial protein synthesis. Maret 2001: 1 hlm. http://faculty.ccbcmd.edu/courses/bio141/genetics/protsyn/translation/mac resr.html, 25 November 2011, pk. 3.15 WIB. Korhonen, J. 2010. Antibiotic resistance of lactic acid bacteria. Dissertations in Forestry and Natural Sciences-Publications of the University of Eastern Finland : 71 hlm. Kullen, M.J. & T.R. Klaenhammer. 2000. Genetic modification of intestinal Lactobacilli and Bifidobacteria. Current Issue Molecular Biology 2: 1-29. Kusmiati & A. Malik. 2002. Aktivitas bakteriosin dari bakteri Leuconostoc mesenteroides Pbac1 pada berbagai media. Makara Kesehatan 6 (1): 1--7. Kusumawati, N., B.L. Jenie, S. Setyahadi & R.D.Hariyadi. 2003. Seleksi bakteri asam laktat indigenus sebagai galur probiotik dengan kemampuan menurunkan kolesterol. Jurnal Mikrobiologi Indonesia 8(2): 39--42. Lavanya, B., S. Sowrniya, S. Balaji & B. Muthuvelan. 2011. Plasmid profiling and curing of Lactobacillus strains isolated from fermented milk for probiotic application. Advance Journal of Food Science and Technology 3 (2): 95--101. Leisner, J.J., M. Vancanneyt, R. van der Meulen, K. Lefebvre, K. Engelbeen, B. Hoste, B. G. Laursen, L. Bay, G. Rusul, L. De Vuyst & J. Swings. 2005. Leuconostoc durionis sp. nov., a heterofermenter with no detectable gas production from glucose. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 55:1267--1270.



61 Lin, Chuen-Fu & Chung Tung-Ching. 1999. Cloning of erythromycin-resistance determinants and replication origins from indigenous plasmids of Lactobacillus reuteri for potential use in construction of cloning vectors. Plasmid 42: 31--41. Lodge, J., P. Lund & S. Minchin. 2007. Gene cloning. Taylor & Francis Group, Abingdon: iii + 462 hlm. Lu Pan, Xiaoqing Hu & Xiaoyuan Wang. 2011. Assesment of antibiotic resistance of lactic acid bacteria in Chinese fermented food. Food Control 22: 1316-1321. Madden, T. 2003. The BLAST sequence analysis tool. 13 Agustus 2003: 17 hlm. http://binf.gmu.edu/vaisman/binf630/madden_blast_ch16.pdf, 27 November 2011, pk. 7.15 WIB. Mathur, S. & R. Singh. 2005. Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria. International Journal of Food Microbiology 105: 281--295. Mifflin, T.E. ?. Setting up a PCR laboratory. ?: 14 hlm. http://biosupplynet.com/pdf/01_PCR_Primer_p.5_14.pdf, 27 November 2011, pk. 9.05 WIB. Morelli, L., F.K. Vogensen & A. von Wright. 2004. Genetics of lactic acid bacteria. Dalam: Salminen, S., A. von Wright, & A. Ouwehard. 2004. Lactic acid bacteria: Microbiological and functional aspects. 3rd ed Marcel Dekker, INC., New York: 629 hlm. Muladno. 2010. Teknologi rekayasa genetika. Edisi kedua. Penerbit IPB Press, Bogor: ix + 130 hlm. Mustopa, A.Z., R. Balia, W.S. Putranto, M. Ridwan & M. Solehudin. 2010. Penapisan bakteri asam laktat yang diisolasi dari bekasam daging sapi dalam menghasilkan bakteriosin untuk menghambat bakteri patogen. Prosiding Seminar Nasional Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran ke-2 : 679--685. Nur, H.S. 2005. Pembentukan asam organik oleh isolat bakteri asam laktat pada medium ekstrak daging buah durian (Durio zibethinus Murr.). Bioscientiae 2(1): 15--24.



62 O’Sullivan & T.R. Klaenhammer. 1993. Rapid mini-prep isolation of high quality plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp. Applied and Environmental Microbiology 59 (8): 2730--2733. Oxoid. 2010. MRS broth (de man, rogosa, sharpe). ?: 1 hlm. http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail.asp?pr=CM0359&org=133&c =UK&lang=EN, 5 Oktober 2011, pk. 21.32 WIB. Palumbi, S., A. Martin, S. Romano, W.O McMillan, L. Stice & G. Grabowski. 2002. The simple fool’s guide to PCR. Oktober 2002: 46 hlm. http://palumbi.stanford.edu/simplefoolsmaster.pdf, 22 Oktober 2011, pk. 18.30 WIB. PANTONE. 2011. Pantone color bridge CMYK PC. 2011: 14 hlm. http://barcodegallery.com/v/resources/PMS_Colors.pdf, 18 Desember 2011, pk. 18.15 WIB. Pato, U., M. Ali & A.K. Parlindungan. 2005. Taurocholate deconjugation and cholesterol binding by indigenous dadih lactic acid bacteria. Hayati 12(3): 103--107. Pelczar, M. J. & E. C. S. Chan. 2008. Dasar-dasar mikrobiologi 1. Terj. dari Elements of microbiology. Oleh R. S. Hadioetomo, T. Imas, S. S. Tjitrosomo. Dan S. L. Angka. UI-Press, Jakarta: viii + 443 hlm. Phoenix College. ?. Antibiotics that inhibit protein synthesis. ?: 2 hlm. http://pc.maricopa.edu/biology/rcotter/lessonbuilder.html, 25 November 2011, pk. 4.15 WIB. Primrose, S. B., R. M. Twyman & R. W. Old. 2001. Principles of gen manipulation. 7th ed. Blackwell Science, Ltd., Oxford: 323 hlm. Promega. 2010. Wizard SV gel and PCR clean-up system. Promega Corporation, Madison: 13 hlm. Qiagen. 1997. Biolistic transformation of plants. 1997: 6 hlm. http://qiagen.com/literature/qiagennews/0597/975pcro.pdf, 21 Oktober 2011, pk. 14.39 WIB. Qiagen 2001. Isolation of plasmid DNA from Lactobacillus spp. ?: 2 hlm. http://qiagen.com/literature/render/aspx.pdf, 20 Juli 2011, pk 20.10 WIB



63 Qiagen. 2005. Qiagen plasmid purification handbook. Qiagen, Singapore: 51 hlm. Rixon, J.E. & P.J. Warner. 2003. Introduction: Background, relevant genetic techniques, and terms. Dalam: Wood, B.J.B & P.J. Warner. 2003. Genetic of lactic acid bacteria. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York: xvii + 394 hlm. Roche Applied Science. 2005. Taq DNA polymerase. November 2005: 4 hlm. http://www.roche-applied-science.com/Taq-DNA-Polymerase.pdf, 22 Oktober 2011 , pk. 19.30 WIB. Roche Applied Science. 2008. Application hints and troubleshooting. 2008: 1 hlm. http://roche-applied-science.com/amplification/pcr.html, 27 November 2011, pk. 8.15 WIB. Sambrook, J. & D.W. Russell. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual. Vol 1. 3rd ed. Coldspring Harbor Laboratory Press, New York: xxvii + 1.1— 7.94 + I.1--I.44 hlm. Sands, L.C. & W.V. Shaw. 1973. Mechanism of chloramphenicol resistance in Staphylococci: Characterization and hybridization of variants of chloramphenicol acetyltransferase. Antimicrobial Agents and Chemotheraphy 3 (2): 299--305. Schumann, W. 2008. Escherichia coli cloning and expression vectors. Dalam: Lipps, G. 2008. Plasmids current research and future trends. Calister Academic Press, Norfolk: vi + 263 hlm. Shareck, J., Y. Choi, B. Lee & C.B. Miguez. 2004. Cloning vectors based on cryptic plasmids isolated from lactic acid bacteria: Their characteristics and potential applications in biotechnology. Critical Reviesw in Biotechnology 24 (4): 155--208. Soomro, A.H. & T. Masud. 2007. Protein pattern and plasmid profile of LAB. Food Tehnology amd Biotechnology 45 (4): 447--453. Sudhamani, M., E. Ismaiel, A. Geis, V. Batish & K.J. Heller. 2007. Characterisation of pSMA23, a 3.5 kbp plasmid of Lactobacillus casei, and application for heterologous expression in Lactobacillus. Plasmid 59 : 11--19 Universitas Indonesia


64 Sujaya, I.N., S. Amachi, A. Yokota, K. Asano & F. Tomita. 2001. Identification and characterization of lactic acid bacteria in ragi tape. World Journal of Microbiology and Biotechnology 17: 394--357. Sulistyaningsih, E. 2007. Polymerase chain reaction (PCR): Era baru diagnosis dan manajemen penyakit infeksi. Biomedis 1(1): 17--25. Sutcliffe, J., T. Grebe, A. Tait-Kamradt, & L. Wondrack. 1996. Detection of erythromycin resistance determinants by PCR. Antimicrobial Agents and Chemotheraphy 40 (11): 2562--2566. Tannock, G.W., J.B. Luchansky, L. Miller, H. Connell, S. Thode-Andersen, A.A. Mercer & T. R. Klaenhammer. 1994. Molecular characterization of a plasmid-borne (PGT633) erythromycin resistance determinant (ermGT) from Lactobacillus reuteri 100-63. Plasmid 31: 60--71. Teuber, M., F. Schwarz & L. Meile. 2003. Antibiotic resistance and transfer in lactic acid bacteria. Dalam: Wood, B.J.B & P.J. Warner. 2003. Genetic of lactic acid bacteria. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York: xvii + 394 hlm. Todar, K. 2011. Lactic acid bacteria. 2011: 5 hlm. http://textbookofbacteriology.net/lactics.html, 21 Oktober 2011, pk. 10.52 WIB. Urnemi, A.Z. Mustopa & M. Ridwan. 2010. Potensi bakteri asam laktat dari lempok durian dalam menghasilkan bakteriosin sebagai biopreservatif pangan. Prosiding Seminar Nasional Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran ke-2 : 672--678. Walmsley, J., A. Toukdarian & C. Kennedy. 1994. The role regulatory nifA, vnfA. AnfA, nfrX, ntrC, and rpoN in expression of genes encoding the three nitrogenases of Azotobacter vinelandii. Archea Microbiology 162 (6): 422--429. Wegmuller, S. & S. Scmidt. 2009. Plasmid isolation from the Gram-positive bacterium Pediococcus damnosus using a modified Pureyield™ Plasmid Midiprep System protocol. Juli 2009: 3 hlm. http://www.promega.com/resources/articles/pubhub/enotes/plasmid-dna-



65 isolation-from-the-gram-positive-bacterium-pediococcus-damnosus, 25 November 2011, pk. 19.53 WIB. Wolfe, S.L., 1993. Molecular and cellular biology. Wadsworth Publishing Company, Belmont: xviii + 1145 hlm. Wright, A.T. von. 1998. Genetic modification of lactic acid bacteria. Dalam: Salminen, S. & A.T. von Wright. 1998. Lactic acid bacteria: Microbiology and functional aspects. Marcel Dekker, Inc., New York: xi + 607 hlm. Yuwono, T. 2005. Biologi molekular. Penerbit Erlangga, Jakarta: xiii + 269 hlm. Yuwono, T. 2006. Teori dan aplikasi polymerase chain reaction. Penerbit ANDI, Yogyakarta: x + 246 hlm.



66 Lampiran 1 Skema alur penelitian

Penapisan BAL resistan terhadap chloramphenicol dan erythromycin

Alkaline Lysis Minipreparation Isolasi Plasmid BAL

Alkaline Lysis Midipreparation

Qiagen Plasmid Midi Kit

Deteksi gen resistan chloramphenicol dan erythromycin

Purifikasi produk PCR

Sequencing dan analisis hasil sequencing gen cat dan ermB



67 Lampiran 2 Cara pembuatan larutan, dapar, dan medium yang digunakan dalam penelitian

Larutan

Cara Pembuatan

Alkaline lysis solution I

Glukosa 50 mM, Tris-Cl 25 mM (pH 8,0), dan EDTA 10 mM (pH 8,0) dilarutkan dalam akuades sampai volume larutan mencapai 100 ml. Larutan disterilisasi menggunakan autoklaf suhu 121 oC dan disimpan dalam lemari pendingin suhu 4 oC.

Alkaline lysis solution II

Sebanyak 1 ml NaOH 0,2 N dan 1 ml sodium dodesil sulfat 1% dilarutkan dalam akuades steril sampai volume larutan mencapai 10 ml. Larutan dibuat segar dan digunakan dalam suhu ruang.

Alkaline lysis solution III

Sebanyak 60 ml potassium asetat 5 M, 11,5 ml asam asetat glasial, dan 28,5 ml akuades steril dicampurkan dan dihomogenisasi. Larutan disimpan dalam lemari pendingin suhu 4 oC.

Larutan PCI

Fenol, kloroform, dan isoamylalkohol dicampur ke dalam suatu tabung dengan perbandingan volume sebesar 25:24:1. Urutan bahan kimia yang dimasukkan dimulai dari bahan kimia dengan volume terendah. Pencampuran dilakukan di dalam ruang asam.

Dapar STE 100 ml

Sukrosa 6,7%, Tris HCl (pH 8), dan EDTA 1 mM dilarutkan dalam akuades sampai volume larutan mencapai 100 ml. Larutan disterilisasi menggunakan autoklaf suhu 121 o C dan disimpan dalam lemari pendingin suhu 4 oC.

Lisozim 10 mg/ml, 10 ml

Bubuk lisozim sebanyak 0,1 gram dilarutkan ke dalam 10 ml tris-HCl 50 mM pH.8,0 dan disimpan di dalam freezer -20 o C



68 Lanjutan

Dapar TBE 10 x

Sebanyak 108 gram Tris base, 55 gram asam borat, dan 40 ml EDTA 0,5 M (pH 8,0) dilarutkan dalam akuades hingga volume tepat 1.000 ml untuk menghasilkan larutan stock dapar TBE 10x.

Dapar TBE 1 x

Dapar TBE 1x dibuat dengan mencampurkan 100 ml TBE 10x dan akuades hingga volume tepat 1.000 ml.

Dapar TE

10 mM Tris-Cl dan 1 mM EDTA dilarutkan dalam 90 ml akuades dan pH larutan diatur sesuai kebutuhan.

de Mann, Rogosa, Sharpe (MRS) cair

Sebanyak 5,2 gram bubuk MRS dilarutkan ke dalam 100 ml akuades dan ditambahkan 100 μl sodium azide 20%. Selanjutnya medium dihomogenisasi dan disterilisasi dengan autoklaf suhu 121 oC selama 15 menit.

100 ml

[Sumber: Sambrook & Russell 2001: A1.7, A1.16--A1.17,& A1.22; Oxoid 2010: 1.]



69 Lampiran 3 Komposisi medium de Mann, Rogosa, Sharpe (MRS)

Medium de Mann, Rogosa, Sharpe (MRS) cair

Komposisi (per Liter) 10 gr Bacto peptone 4 gr Yeast extract 20 gr Glukosa 8 gr Lab lemco powder 1 ml Sorbitan mono-oleate 2,0 gr Dipotassium hidrogen fosfat 5,0 gr Sodium asetat 2,0 gr Triammonium sitrat 0,2 gr Magnesium sulfat 0,05 gr Mangan sulfat

[Sumber: Oxoid 2010: 1.]








75 Lampiran 9 Perhitungan ukuran hasil isolasi DNA plasmid dengan metode Qiagen plasmid midikit dari hasil elektroforesis

Ukuran DNA Jarak migrasi (pb) penanda (cm) 10000 2 8000 2.4 4000 2.8 3000 3.3 2000 4.3 1550 4.8 1400 5.1 1000 6 Jarak migrasi larutan = 9.6 cm

Log base 10 penanda DNA (y) 4 3.903 3.602 3.477 3.301 3.190 3.146 3

Rf (x) 0.208 0.250 0.292 0.344 0.448 0.500 0.531 0.625

Log base 10 penanda DNA

Grafik kurva standard ukuran penanda DNA 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0

y = -2.369x + 4.399 R² = 0.945

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

Rf penanda DNA

Kurva standar dari Rf (x) dan Log ukuran DNA (y) menghasilkan persamaan y = -2.369x+4.399  Plasmid isolat D2 Jarak migrasi sampel dari sumur = 1,3 cm Rf sampel (x)

= Jarak migrasi sampel dari sumur : jarak migrasi larutan = 1,3 cm ; 9,6 cm = 0,135 cm



76 Lanjutan

Maka ukuran DNA plasmid: Log ukuran DNA = -2.369 (0,135) +4.399 = 4.079 Ukuran DNA

= 12.000 pb

Kesimpulan : Plasmid isolat D2 memiliki ukuran sebesar 12.000 pb  Plasmid isolat T8 Jarak migrasi sampel dari sumur = 2 cm dan 3,3 cm Rf sampel(i) (x)

= Jarak migrasi sampel dari sumur : jarak migrasi larutan = 2 cm ; 9,6 cm = 0,208cm

Rf sampel(ii)(x)

= 3,3 cm ; 9,6 cm = 0,344 cm

Maka ukuran DNA plasmid T8: i.

Log ukuran DNA

= -2.369 (0,208) +4.399 = 3,906

Ukuran DNA ii. Log ukuran DNA

= 8060 pb = -2.369 (0,344) +4.399 = 3,584

Ukuran DNA

= 3.840 pb

Kesimpulan : Plasmid isolat T8 memiliki ukuran sebesar 8.060 pb dan 3.840 pb



77 Lampiran 10 Perhitungan ukuran produk PCR plasmid BAL dengan primer cat dari hasil elektroforesis

Ukuran nukleotida (pb)

Jarak migrasi penanda DNA dari sumur (cm)

Rf (x)

Log base10 ukuran DNA (y)

1000 750 500 400 300 100

1.3 1.7 2.3 2.7 3.2 4.8

0.181 0.236 0.319 0.375 0.444 0.667

3 2.88 2.70 2.60 2.48 2

Jarak migrasi larutan = 7,2 cm

Log base 10 ukuran DNA penanda

Grafik kurva standar ukuran DNA 4 3 3 2 2

y = -2.032x + 3.361 R² = 0.998

1 1 0 0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

Rf penanda DNA

Jarak migrasi sampel dari sumur = 2 cm Rf sampel (x) = Jarak migrasi sampel dari sumur : jarak migrasi larutan = 2 cm ; 7,2 cm = 0,279 cm Kurva standar dari Rf (x) dan Log ukuran DNA (y) menghasilkan persamaan y=-2,032 x + 3,361



78 Lanjutan

Berdasarkan fungsi tersebut, maka diperoleh:

log ukuran DNA

= -2,032 (0,279) + 3,361 = 2,794

Ukuran DNA

= 623 pb

Kesimpulan : Produk PCR plasmid BAL dengan primer cat memiliki ukuran sebesar 623 pb.



79 Lampiran 11 Perhitungan ukuran produk PCR plasmid BAL dengan primer ermB dari hasil elektroforesis

Ukuran nukleotida (pb)

Jarak migrasi penanda DNA dari sumur (cm)

Rf (x)

Log ukuran DNA (y)

2072 1500 600 500

1.1 1.6 3.5 3.8

0.153 0.222 0.486 0.528

3.316 3.176 2.778 2.699



Grafik kurva standar ukuran DNA 3.500 3.000 2.500

y = -1.601x + 3.548

2.000 1.500 1.000 0.500 0.000 0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

Rf penanda DNA

Jarak migrasi sampel dari sumur = 3,7 cm Rf sampel (x) = Jarak migrasi sampel dari sumur : jarak migrasi larutan = 3,7 cm ; 7,2 cm = 0,514 cm Kurva standar dari Rf (x) dan Log ukuran DNA (y) menghasilkan persamaan y = -1.601x + 3.548



80 Lanjutan

Berdasarkan fungsi tersebut, maka diperoleh:

log ukuran DNA

= -1.601 (0,514) + 3.548 = 2,725

Ukuran DNA

= 531 pb

Kesimpulan : Produk PCR plasmid BAL dengan primer ermB memiliki ukuran sebesar 531 pb.



81

Lampiran 12 Perhitungan ukuran purifikasi produk PCR plasmid BAL dengan primer cat dari hasil elektroforesis Ukuran penanda DNA (pb)

Jarak penanda dari sumur (cm)

Rf (x)

Log base 10 ukuran penanda DNA (y)

10000 8000 6000 5000 4000 3000 2500 2000 1500 1000 750 500 250

0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.5 1.7 2 2.4 3.1 3.5 4.2 5.1

0.068 0.102 0.136 0.169 0.203 0.254 0.288 0.339 0.407 0.525 0.593 0.712 0.864

4 3.903 3.778 3.699 3.602 3.477 3.398 3.301 3.176 3 2.875 2.699 2.398



Grafik kurva standard ukuran penanda DNA 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0.000

y = -1.936x + 4.025 R² = 0.986

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

Rf penanda DNA



82

Lanjutan

Jarak migrasi sampel dari sumur = 3.75 cm Rf sampel (x) = Jarak migrasi sampel dari sumur : jarak migrasi larutan = 3,75 cm ; 5,90 cm = 0,636 cm Kurva standar dari Rf (x) dan Log ukuran DNA (y) menghasilkan persamaan y = -1,936x + 4,025 Berdasarkan fungsi tersebut, maka diperoleh:

log ukuran DNA

= -1,936 (0,636) + 4,025 = 2,794

Ukuran DNA

= 623 pb

Kesimpulan : Purifikasi produk PCR plasmid BAL dengan primer ermB memiliki ukuran sebesar 623 pb.



83

Lampiran 13 Perhitungan ukuran purifikasi produk PCR plasmid BAL dengan primer ermB dari hasil elektroforesis Ukuran penanda DNA (pb) 10000 8000 6000 5000 4000 3000 2500 2000 1500 1000 750 500 250

Jarak migrasi penanda dari sumur (cm) 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.5 1.7 2 2.4 3.1 3.5 4.2 5.1

Log base 10 penanda DNA (y) 4 3.903 3.778 3.699 3.602 3.477 3.398 3.301 3.176 3 2.875 2.699 2.398

Rf (x) 0.068 0.102 0.136 0.169 0.203 0.254 0.288 0.339 0.407 0.525 0.593 0.712 0.864



Grafik kurva standar ukuran penanda DNA 5 4 3 2

y = -1.936x + 4.025 R² = 0.986

1 0 0.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

Rf penanda DNA



84

Lanjutan

Jarak migrasi sampel dari sumur = 3.96 cm Rf sampel (x) = Jarak migrasi sampel dari sumur : jarak migrasi larutan = 3,96 cm ; 5,90 cm = 0,671 cm Kurva standar dari Rf (x) dan Log ukuran DNA (y) menghasilkan persamaan y = -1,936x + 4,025 Berdasarkan fungsi tersebut, maka diperoleh:

Log ukuran DNA

= -1,936 (0,671) + 4,025 = 2,725

Ukuran DNA

= 531 pb

Kesimpulan : Purifikasi produk PCR plasmid BAL dengan primer ermB memiliki ukuran sebesar 531 pb.



DETEKSI GEN RESISTAN CHLORAMPHENICOL DAN ERYTHROMYCIN PADA PLASMID BAKTERI ASAM LAKTAT DARI PANGAN FERMENTASI TRADISIONAL INDONESIA SKRIPSI

Recommend Documents