Detekce minimální reziduální choroby u pacientek s časnými stádii karcinomu prsu (dizertační práce)
MUDr. Filip Janků Školitel: Doc. MUDr. Bohuslav Matouš, CSc. Ústav biochemie a experimentální onkologie 1. LF UK v Praze 2007
Obsah Seznam použitých zkratek………………………….………………….5 1. Úvod do problematiky časného karcinomu prsu……………….7 1.1. Rizikové faktory pro vznik karcinomu prsu……………………9 1.2. Prognostické faktory…………………………………………………10 2. Minimální reziduální choroba – teoretická část……………….12 2.1. Úvod……………………………………………………………………….12 2.2. Možné způsoby stanovení minimální reziduální choroby…………………………………….14 2.2.1. Detekce chromozomálních mutací, aberací a epigenetických změn……………………………………………….14 2.2.2. Detekce tkáňově specifických markerů……………………………………15 2.2.3. Detekce pomocí imunocytochemických metod……………………….15 2.2.3.1. Detekce a prognostický význam minimální reziduální choroby v kostní dřeni………………………..15 2.2.3.2. Detekce a prognostický význam minimální reziduální choroby v periferní krvi……………………….20 2.2.3.3. Detekce a prognostický význam minimální reziduální choroby v lymfatických uzlinách…………..21 2.2.4. Detekce pomocí průtokové cytometrie…………………………………….23 2.2.5. Detekce pomocí molekulárně biologických metod…………………..24 2.2.5.1. Detekce a prognostický význam minimální reziduální choroby v kostní dřeni……………………………27 2.2.5.2. Detekce a prognostický význam minimální reziduální choroby v periferní krvi…………………………..29 2.2.5.3. Detekce a prognostický význam minimální reziduální choroby v lymfatických uzlinách…………….31 2.3. Obecné problémy markerů minimální reziduální choroby u karcinomu prsu…………….32 2.4. Minimální reziduální choroba jako marker pro volbu adjuvantní léčby a měření její terapeutické účinnosti……………………………………………..…34
2
3. Minimální reziduální choroba – experimentální část………..36 3.1. Cíle práce ……………………………………………………………….36 3.2. Metodika…………………………………………………………………37 3.2.1. Cílová populace pacientek……………………………………………………….37 3.2.2. Odběr vzorků lymfatických uzlin……………………………………………..37 3.2.3. Odběr aspirátu kostní dřeně…………………………………………………….37 3.2.4. Metoda gradientové centrifugace…………………………………………….38 3.2.5. Metodika kultivace nádorových buněk…………………………………….38 3.2.6. Izolace mRNA……………………………………………………………………………38 3.2.7. Příprava cDNA pro nested RT-PCR: reverzní transkripce (RT)…………………………………………………………39 3.2.8. Nested RT-PCR pro detekci mammaglobinu A, mammaglobinu B a CK 19……………………………………………………….39 3.2.9. Příprava cDNA kvantitativní RT-PCR: reverzní transkripce (RT)…………………………………………………………41 3.2.10. Kvantitativní RT-PCR pro detekci CEA…………………………………..41 3.2.11. Imunocytochemie a imunohistochemie…………………………………42 3.2.12. Statistická analýza………………………………………………………………….43 3.3. Výsledky………………………………………………………………….43 3.3.1. Soubor pacientek………………………………………………………………………43 3.3.2. Výsledky stanovení minimální reziduální choroby v kostní dřeni pomocí nested RT PCR pro CK19, mammaglobin A a mammaglobin B……………………….44 3.3.2.1. Soubor pacientek v podskupině…….………………………………………44 3.3.2.2. Stanovení mammaglobinu A v kostní dřeni pomocí nested RT PCR…………………….……………………………………..46 3.3.2.3. RT PCR stanovení mammaglobinu B v kostní dřeni……..………47 3.3.2.4. RT PCR stanovení cytokeratinu 19 v kostní dřeni………….…….48 3.3.2.5. Vliv exprese mammaglobinu A a B v kostní dřeni na dobu do recidivy……………………………………………………………..49. 3.3.2.5.1. Před chemoterapií……………………………………………………………..49 3.3.2.5.2. Po chemoterapii………………………………………………………………..51
3
. 3.3.3. Minimální reziduální choroba detekovaná pomocí kvantitativní RT PCR pro CEA v kostní dřeni………………………52 3.3.3.1. Soubor pacientek v podskupině………………………………………….52 3.3.3.2. Kvantitativní RT PCR pro stanovení CEA v kostní dřeni…….54 3.3.4. Minimální reziduální choroba detekovaná imunocytochemicky v kostní dřeni………………………………………..60 3.3.5. Imunohistochemické stanovení cytokeratinu v spádových lymfatických uzlinách…………………………………………62 4. Diskuse……………………………………………………………………..63 5. Závěr………………………………………………………………………..68 6. Literatura………………………………………………………………….70 7. Poděkování………………………………………………………………..94
4
Seznam použitých zkratek ASCO
American Society of Clinical Oncology
CAM
adhezívní molekuly
cDNA
komplementární DNA
CEA
karcinoembryonální antigen
CK
cytokeratin
c-Met
onkogen receptor
CTC
cirkulující nádorové buňky
ČOS
Česká onkologická společnost
DCIS
Duktální karcinom in situ
DFS
disease free survival – doba do recidivy, nenádorového úmrtí, kontralaterálního nebo sekundárního nádoru
DMFS
distant metastasis free survival- doba do vzniku vzdálených metastáz
DNA
deoxyribonukleová kyselina
EDTA
kyselina etylendiamintetraoctová
EGFR
receptor pro epiteliální růstový faktor
EMA
epiteliální membránový antigen
EpCAM
adhezívní molekula epiteliálních buněk
FISH
fluorescenční hybridizace in-situ
Ga1NAc-T ß 1 4-N-acetylgalaktosaminyl-transferáza HCG
lidský choriový gonadotropin
HER-2/neu receptor pro lidský epidermální růstový faktor 2 HER-3
receptor pro lidský epidermální růstový faktor 3
HER-4
receptor pro lidský epidermální růstový faktor 4
hMAM
mammaglobin
hMLH1
tzv. mismatch repair gen
ki-67
protein ki-67
k-RAS
onkogen Kirsten rat sarcoma
MAGE
nádorový antigen
MIH
substance inhibující vývoj Millerových vývodů
5
mRNA
messengerová RNA
mTOR
savčí cíl Rapamycinu
MUC-1
mucin 1
NASBA
amplifikace založená na sekvenci nukleových kyselin
OS
overall survival – celkové přežití
p16
tumor supresorový protein 16
p53
tumor supresorový protein 53
PAI-1
inhibitor urokinázového aktivátoru plazminogenu
PCR
polymerázová řetězová reakce
PIP
protein indukovaný prolaktinem
RASO
roční analytické studie v onkologii
RNA
ribonukleová kyselina
RR
relativní riziko
RFS
relapse free survival – doba do lokální nebo vzdálené recidivy nebo karcinomu in situ
RT-PCR
zpětná polymerázová řetězová reakce
SMS
serial multi-sectioning – několikanásobné prokrájení
sn
sentinelová uzlina
VEGF
vaskulární endoteliální růstový faktor
UICC
International Union Against Cancer
uPA
urokinázový aktivátor plazminogenu
TAG-12
mucinový glykoprotein TAG-12
TGFbeta
transformující růstový faktor beta
6
1. Úvod do problematiky časného karcinomu prsu Pomineme-li nádory kůže, je karcinom prsu v České republice nejčastějším maligním onemocněním dospělých žen (v roce 2003 bylo diagnostikováno 5784 nových případů) (1). V období mezi lety
1970 -
2003 stoupla jeho incidence téměř trojnásobně ze 42/100 000 žen na současných 110,5/100 000 žen (obrázek 1). Ve srovnání s ostatními rozvinutými státy je u nás incidence tohoto onemocnění o něco málo nižší (obrázek 2). Za příznivé trendy je nutné považovat zvyšující se podíl pacientek prvního a druhého klinického stádia (obrázek 3) a snížení mortality za stejné časové období o 26% (z 63% na 37%) (obrázek 1) (1). Vysoký celospolečenský význam této nemoci je dán nejen její vysokou incidencí, ale také dalšími faktory - značnou finanční náročností prováděné
léčby
a
nezanedbatelnou
dlouhodobou
morbiditou
žen
v produktivním věku.
7
Obrázek 1: Incidence a mortalita u karcinomu prsu v České republice Graf zobrazuje časový vývoj hrubé incidence (počet nových případů na 100000 osob) a hrubé mortality (počet úmrtí na diagnózu na 100000 osob) pro zvolenou diagnózu v celé populaci.
Obrázek 2: Srovnání incidence karcinomu prsu v České republice se zahraničím
8
Obrázek 3: Podíl jednotlivých klinických stádií
1.1. Rizikové faktory pro vznik karcinomu prsu Identifikaci rizikových faktorů vzniku karcinomu prsu je věnována mezi odbornou veřejností velká pozornost. V národní studii provedené ve Spojených státech amerických v 90. letech, které se účastnilo více než 25 000 žen, byly v multivariační analýze nalezeny jako statisticky významné následující rizikové faktory (2):
-
počet příbuzných prvního řádu s karcinomem prsu
-
počet příbuzných prvního a druhého řádu s jakoukoliv malignitou
-
věk v době menarche
-
věk v době prvního porodu
-
počet
biopsií
prsu
a
přítomnost
atypické
duktální
hyperplázie
v bioptickém vzorku -
body mass index
9
Na základě této studie
byl vytvořen matematický model pro
výpočet rizika vzniku karcinomu prsu. Jelikož validita modelu nebyla nikdy potvrzena mimo území Spojených států, provedla podobnou studii skupina autorů z České republiky (3). Celkem bylo zařazeno 4598 pacientek a zdravých žen, které sloužily jako kontrolní skupina. Na rozdíl od Gailova modelu nebyl v jeho české podobě identifikován jako významný rizikový faktor věk v době menarche. Překvapivě v české populaci bylo nejnižší riziko karcinomu prsu u žen, které prvně rodily mezi 25-29 rokem nebo u bezdětných. V českém modelu je problematické hodnotit výskyt atypické duktální
hyperplázie,
protože
tato
jednotka
je
českými
patology
nedostatečně hlášena. Ostatní nálezy se od původního Gailova modelu podstatně nelišily.
1.2. Prognostické faktory Současné
znalosti
biologického
chování
nádorových
buněk
karcinomu prsu neumožňují v dostatečné míře předpovídat budoucí klinický
vývoj
onemocnění
ani
léčebné
účinky
různých
modalit
protinádorové léčby u jednotlivých pacientek. Léčba je indikována na základě výsledků randomizovaných studií se stratifikací do několika málo prognosticko-terapeutických podskupin. Řadě pacientek je tak podávána léčba ze zdravotnického hlediska zbytečná a z ekonomického neefektivní. Pouze kontinuální úsilí zaměřené na identifikaci prognostických a prediktivních faktorů může vést k žádoucí individualizaci léčby, od níž si lze slibovat zvýšení účinnosti při současném snížení nákladů na její provádění. V klinické
praxi
jsou
pro
terapii
karcinomu
prsu konsensuálním
panelem odborníků (St. Gallen konsensus, 2005) zohledněny následující prognostické faktory (4):
-
věk
10
-
klinické stádium
-
postižení axilárních uzlin
-
velikost primárního nádoru
-
histopatologický grading nádoru
-
peritumorální vaskulární invaze
-
přítomnost jaderných hormonálních receptorů v nádorových buňkách
-
exprese onkogenu HER-2/neu Detekce minimální reziduální choroby (nebo izolovaných okultních
nádorových buněk) patří spolu se stanovením nádorových koncentrací urokinázového typu aktivátoru plazminogenu (uPA) a jeho inhibitoru (PAI1) a mezi perspektivní prognostické faktory, jejichž zkoušky právě probíhají (5-7). Tak, jak pronikají molekulárně biologické metody do klinické praxe, objevují se snahy prosadit vyšetření okultních nádorových buněk do klinické praxe. Před několika lety byl skupinou, která se podílí na vývoji stagingové
klasifikace
UICC,
vyvinut
fakultativní
systém
klasifikace
spádových lymfatických uzlin (8) (viz. tabulka 1). Tabulka 1: Navržená klasifikace zohledňující přítomnost izolovaných nádorových buněk v sentinelové lymfatické uzlině podle UICC Histopatologie
Imunohistologie
pN0 (i –)
Negativní
pN0 (i +)
Pozitivní
PCR
pN0 (mol –)
Negativní
pN0 (mol +)
Pozitivní
sn, předpona pro sentinelovou uzlinu.
11
2. Minimální reziduální choroba – teoretická část 2.1. Úvod Asi u poloviny diagnostikovaných primárně operabilních případů karcinomu prsu se do 5 let objeví vzdálené metastázy (9). U pacientek bez postižení axilárních lymfatických uzlin se recidiva objeví pouze ve čtvrtině případů (10). V obou skupinách a především u pacientek relativně nízkého
rizika
diseminace
je
zcela
nezbytné
identifikovat
nové
prognostické markery s cílem odlišit na jedné straně pacientky vyléčené již
chirurgickým
metastatického
zákrokem
potenciálu,
od
nemocných
které
jsou
s nádorem
kandidátkami
vyššího
intenzivnější
pooperační léčby. Hematogenní
diseminace
(obrázek
4)
nádorových
s následným vznikem klinicky patrných vzdálených metastáz
buněk je hlavní
příčinou recidiv a kratšího přežití (11). V době diagnózy a primární operace
není
tato
diseminace
patrná
ani
klinicky
ani
rutinním
histopatologickým vyšetřením nebo zobrazovacími metodami (12). Rozsev izolovaných okultních nádorových buněk se nazývá minimální reziduální choroba. Jak již bylo zmíněno, právě vhodně zvolenou pooperační léčbou by mělo dojít k eliminaci okultních nádorových buněk, a tím ke snížení rizika recidivy a vzdálených metastáz s prodloužením celkového přežití (13-16). Adjuvantní terapie, která se sebou často nese řadu nežádoucích účinků,
je
nyní
podávána
na
základě
publikovaných
výsledků
randomizovaných klinických studií bez možnosti ověření nutnosti a účinnosti jejího podání u jednotlivých pacientek (13). Sice byly vyvinuty matematické modely k odhadu redukce rizika zvolenou léčbou, nicméně ty opět pracují pouze s daty z randomizovaných studií (17). Vyšetření minimální reziduální choroby by bylo možné využít pro přesnější indikaci pooperační systémové léčby a monitoraci léčebné odpovědi na podanou adjuvantní terapii. To dosud není možné žádnou vyšetřovací metodou.
12
Minimální reziduální chorobu lze v klinické praxi detekovat v kostní dřeni, periferní krvi a spádových lymfatických uzlinách. V poslední době je věnována značná pozornost vyšetření sentinelové axilární lymfatické uzliny. Jako nejspolehlivější se z hlediska prognostického významu pro vznik vzdálených metastáz jeví vyšetření kostní dřeně (18). K detekci minimální reziduální choroby solidních nádorů se používají metody imunohisto(cyto)chemické nebo molekulárně biologické. Pomocí imunocytochemických metod je možné zjistit nádorovou buňku mezi 104
-
105 elementů kostní dřeně (19,20). Při použití polymerázové řetězové reakce (PCR) senzitivita stoupá v optimálním případě až na 1:106-7 (21). Obrázek 4: Hematogenní rozsev nádorových buněk
CAM, adhezívní molekuly; CTC, cirkulující nádorové buňky
13
2.2. Možné způsoby stanovení minimální reziduální choroby K detekci minimální reziduální choroby byla vyzkoušena celá řada markerů a postupů, kterým je věnován následující oddíl. 2.2.1. Detekce chromozomálních mutací, aberací a epigenetických změn Na rozdíl od hematologických malignit nebyly u většiny solidních nádorů
identifikovány
aberace,
což
lze
žádné
vysvětlit
dostatečně
specifické
na
straně
jedné
chromozomální
difúzní
povahou
hematologických malignit a naopak vysokou heterogenitou solidních nádorů. Pravděpodobně nejčastěji mutovaným genem u solidních nádorů je p53, který má významnou roli v procesu reparace a apoptózy (22). Ačkoliv stanovení mutací p53 se jeví jako perspektivní vyšetření pro určení prognózy, limitací pro vyšetření minimální reziduální choroby je fakt, že se vyskytují jen u necelé poloviny všech nádorů (23). Navíc mutací existuje celá řada, což brání vytvoření univerzálních sad na jejich detekci (22). Podobně problematické je stanovení jiných mutací jako k-RAS apod. (24). Výhodou těchto metodik je, že k vyšetření je potřeba DNA, která je ve srovnání s RNA nebo proteiny relativně stabilní. Chromozomální změny, podobně jako u leukémií, by bylo možné detekovat pomocí fluorescenční hybridizace in situ (FISH). Nevýhodou je detekční limit, který se u solidních nádorů pohybuje okolo 1:103 (25). V nádorových buňkách se také často objevují epigenetické alterace genomické DNA. Hypermetylace v oblastech bohatých na dinukleotidy CG (ostrůvky CpG) v oblasti promotoru může indukovat funkční inaktivaci tumor supresorových genů. Hypermetylace promotoru p16 je běžná u karcinomu plic, hepatocelulárního karcinomu a karcinomu pankreatu. Hypermetylace promotoru hMLH1 je často přítomna u kolorektálního karcinomu (26). U karcinomu prsu zatím neexistují data o využití
14
diagnostiky na úrovni mismatch repair genů pro diagnózu reziduální choroby. 2.2.2. Detekce tkáňově specifických markerů Tkáňově specifický marker musí splňovat několik následujících kritérií. Musí být exprimován nádorem samotným a na druhou stranu se nesmí vyskytovat v tkáních, kde minimální reziduální chorobu testujeme. Taková
kritéria
splňují
různé
epiteliální
markery
jako
epiteliální
cytokeratiny (CK), muciny a některé antigeny jako je např. EpCAM (27). Jelikož se jedná o obecně epiteliální markery, je jejich nevýhodou nízká specificita v daném případě pro tkáň karcinomu prsu (28-30). Markerem, který tímto nedostatkem netrpí, je mammaglobin, který je specifický pro tkáň prsu (31,32). Jeho relativní nevýhodou je poněkud nižší senzitivita ve srovnání
s cytokeratiny
(32).
Dalším
studovaným
markerem
je
karcinoembryonální antigen (CEA). Za normálních okolností se CEA u člověka
vůbec
nevyskytuje
a
jeho
exprese
stoupá
se
stupněm
dediferenciace (33). Obdobně byly zkoušeny u karcinomu prsu i jiné markery jako maspin a EGFR (34,35).
2.2.3. Detekce pomocí imunocytochemických metod 2.2.3.1. Detekce a prognostický význam minimální reziduální choroby v kostní dřeni Nejčastěji se pro stanovení minimální reziduální nemoci využívá monoklonálních protilátek proti epitopům cytokeratinů a epiteliálních mucinů (36-40). Doposud bylo v mezinárodních odborných časopisech nebo na odborných konferencích publikováno téměř 27 studií s 6228 pacientkami vyšetřenými na přítomnost minimální reziduální choroby v kostní dřeni (19,27,36-41,44-50,52-64). Přehled jednotlivých prací je
15
přehledně
znázorněn v tabulce 2. Výsledky jsou navzájem obtížně
srovnatelné
vzhledem
k variabilitě
použitých
protilátek,
metodik
zpracování vzorku apod.. Proto ani nepřekvapuje, že v první publikované metaanalýze (51), kde bylo hodnoceno 2494 pacientek z celkem 20 klinických studií, nebyl prognostický význam minimální reziduální choroby jako
nezávislého
v znázorněném
prognostického
aktuálním
faktoru
přehledu 27
prokázán.
Nicméně
studií (6228 pacientek)
byl
prognostický význam reziduální choroby ve smyslu kratší doby do události (DFS; disease free survival – doba do recidivy, nenádorového úmrtí, kontralaterálního
nebo
sekundárního
nádoru)
nebo
kratšího
přežití
potvrzen v 16 studiích (4632 pacientek). Navíc v 11 (3772 pacientek) publikacích byly tyto výsledky podpořeny multivariační analýzou. Tyto studie patřily velikostí souboru a metodikou mezi nejlépe provedené (18). Počtem zařazených pacientek největší studie se 727 pacientkami ukázala,
že
nález
TAG-12
(mucin)
v
kostní
dřeni
je
nezávislým
prognostickým faktorem pro kratší dobu do události (DFS) i kratší celkové přežití, a to dokonce s větší významností než imunocytochemický průkaz TAG-12 v axilárních lymfatických uzlinách.
Byla prokázána
statisticky
významná korelace mezi průkazem epiteliálního antigenu v kostní dřeni a velikostí tumoru (p<0,001), postižením axilárních lymfatických uzlin (p= 0,001) a histopatologickým gradingem (p = 0,002) (39). Jiná
pracovní
skupina
(36)
prokázala
korelaci
mezi
nálezem
cytokeratinů v kostní dřeni a diagnózou inflamatorního karcinomu, větší velikostí primárního nádoru, masivním postižením axilárních uzlin (více než 10) a vyšším histopatologickým gradingem. V souboru bylo vyšetřeno celkem 552 žen s karcinomem prsu klinického stádia I – III. Cytokeratin byl imunocytochemicky zjištěn u 199 (36%) pacientek. V kontrolní skupině bylo vyšetřeno 191 pacientů bez nádorového onemocnění a pouze u
2 (1%) vzorků byla imunocytochemicky prokázána přítomnost
cytokeratinu. Výskyt cytokeratin pozitivních buněk byl spojen s více jak čtyřnásobným rizikem nádorového úmrtí oproti skupině bez postižení kostní dřeně (p<0,001). Podle výskytu nádorových buněk (rutinním
16
histopatologickým vyšetřením) v axilárních lymfatických uzlinách byli nemocní rozděleni na další 4 skupiny. Nejdelší přežití bylo pozorováno ve skupině pacientek bez postižení uzlin i kostní dřeně. Naopak nejkratší přežití bylo zjištěno ve skupině pacientek s postižením dřeně i uzlin. Mezi skupinou s nádorovou infiltrací uzlin a s imunocytochemicky negativní dření a skupinou bez infiltrace uzlin a imunocytochemicky pozitivní dření na cytokeratin nebyl signifikantní rozdíl v celkovém přežití. Následnou multivariační regresní analýzou bylo postižení kostní dřeně na základě imunocytochemického průkazu potvrzeno jako nepříznivý
prognostický
faktor nezávislý na postižení lymfatických uzlin. V této práci bylo použito širokospektré anticytokeratinové monoklonální protilátky A45-B/B3, která se stala pro vyšetření reziduální choroby pomocí imunocytochemie jistým „zlatým standardem“. V práci zveřejněné ve formě abstraktu v roce 1998 Solomayerem (41) byly nádorové buňky v kostní dřeni prokazovány u pacientek s karcinomem prsu, které byly indikovány k neoadjuvantní chemoterapii. U
140
pacientek
po
4
cyklech
kombinované
chemoterapie
epirubicin/cyklofosfamid byla při následné operaci odebrána kostní dřeň. Nádorové buňky v kostní dřeni prokazované pomocí TAG-12 (mucin) se ukázaly být nepříznivým prognostickým faktorem pro DFS vyjádřeno relativním rizikem 2,92. Jako silnější nepříznivý prognostický faktor byl potvrzen
pouze
histologický
průkaz
nádorové
infiltrace
axilárních
lymfatických uzlin s relativním rizikem (RR) 3,92. Ve studii publikované Gebauerem (40) bylo vyšetřeno 393 pacientek s časnými stádii karcinomu prsu. Medián doby sledování byl 78 měsíců. Nádorové buňky byly imunocytochemicky (mucin- EMA, CK) zjištěny u 166 žen.
Vzdálené
metastázy
se
během
sledování
objevily
u
35%
s imunocytochemicky prokázaným postižením kostní dřeně a pouze u 20% pacientek
bez
tohoto
postižení.
Co
bylo
zajímavé,
u
pacientek
s histologicky negativními axilárními lymfatickými uzlinami nebyl rozdíl v počtu událostí hodnocených pro DFS v obou skupinách a procento výskytu vzdálených metastáz činilo 16%.
Vyjádřeno relativním rizikem
17
byla
nejvýznamnějším nepříznivým prognostickým faktorem velikost
tumoru nad 2cm (relativní riziko 2,45; p<0,0001), dále postižení axilárních lymfatických uzlin (relativní riziko 2,036; p=0,0018). Přítomnost nádorových buněk v kostní dřeni byla sdružena s relativním rizikem 1,758 (p = 0,0058). Nejčerstvější publikovanou prací na tomto poli je metaanalýza publikována na konferenci ASCO 2005 a následně v New England Journal of Medicine Braunem et al. (42,43). V této práci se autoři snažili vyvarovat nedostatků vytýkaných předchozí metaanalýze (51), a proto vybírali studie s dobře definovanou metodikou, které byly navzájem srovnatelné. Celkem bylo hodnoceno 9 velkých studií s celkem 4703 pacientkami. Prevalence minimální reziduální choroby v této populaci byla těsně nad hranicí 30%. Reziduální choroba korelovala s ostatními prognostickými faktory jako je velikost nádoru, nádorový grading, infiltrace spádových lymfatických
uzlin
a
negativita
hormonálních
receptorů.
Reziduální
choroba znamenala horší 10-leté přežití vyjádřené relativním rizikem 2,26. Výsledky byly statisticky významné (p=0, 007).
18
Tabulka 2: Přehled studií s imunocytochemickou detekcí nádorových buněk v kostní dřeni Autor
Počet pacientek
Technika
Marker
Detekce v %
Ellis (19)
25
aspirát
CK
17
Mathieu (27)
93
biopsie
mucin/CK
1
Braun (36)
552
cytospin
CK
36
Cote (37)
49
aspirát
mucin/CK
37
Harbeck (38) Diel (39) Gebauer (40)
100 727 393
aspirát aspirát aspirát
mucin/CK mucin mucin/CK
38 43 42
Prognostický význam nepotvrzen nepotvrzen *
DFS (DMFS), OS DFS, OS
*
DFS, OS
*
DFS, OS
*
DFS
*
Solomayer (41)
140
aspirát
mucin
53
Mansi (44)
350
aspirát
mucin
25
DFS, OS
Untch (46)
581
cytospin
CK
28
nepotvrzen
Porro (47)
159
biopsie
mucin
16
nepotvrzen
Singletary (48)
71
aspirát
mucin/CK
38
nepotvrzen
Salvadori (49)
121
biopsie
mucin
17
nepotvrzen
Kirk (50)
25
aspirát
mucin
48
nepotvrzen
Coombes (52)
269
aspirát
E29
23
DFS
Schlimok (53)
155
aspirát
CK18
18
DFS (DMFS)
Dearnaley (54)
37
aspirát
mucin
33
DFS, OS
Molino (55)
109
aspirát
mucin/CK
38
Landys (56)
128
biopsie
CK
19
Wiedswang (57)
817
aspirát
CK
13
Courtemanche (58)
50
biopsie
mucin
8
Funke (59)
234
cytospin
CK
38
Gerber (60) Janni
(61)
Pierga (62)
484 228 114
cytospin cytospin cytospin
CK CK CK
31 16
DFS
nepotvrzen *
DFS, OS
*
DFS (DMFS), OS nepotvrzen nepotvrzen
*
DFS, OS
*
DFS, OS
59
*
DFS, OS
Janni (63)
89
cytospin
CK
28
*
Kasimir-Bauer S (64)
128
cytospin
CK
34
nepotvrzen
DFS, OS
DFS; disease free survival- doba bez události (recidiva, kontralaterální nádor, úmrtí bez nádoru, sekundární nádor) DMFS; distant metastasis free survival- doba do vzniku vzdálených metastáz OS; overall survival- celkové přežití * výsledky potvrzeny multivariační analýzou
19
2.2.3.2. Detekce a prognostický význam minimální reziduální choroby v periferní krvi Pro minimální reziduální chorobu v periferní krvi se někdy užívá termín cirkulující nádorové buňky. Cirkulující nádorové buňky byly poprvé v odborné
literatuře
popsány
v roce
1869
Ashworthem,
který
je
identifikoval v krvi zemřelých (65). Engel (66) publikoval v roce 1955 systematickou práci dokladující přítomnost cirkulujících nádorových buněk u pacientů s pokročilými nádory. V následující dekádě se této problematice věnovala celá řada vědeckých týmů (67). Jelikož v 60. letech se k detekci cirkulujících nádorových buněk používal pouze světelný mikroskop, tak detekce nepřesahovala 1% (67). Zájem o problematiku opět vzbudila až možnost využití imunocytochemických metod. U karcinomu prsu Redding (68) v roce 1983 publikoval výrazně vyšší záchyt cirkulujících nádorových buněk ve srovnání s konvenční technikou. Pečlivou rešerší dostupné odborné literatury je možné identifikovat asi 8 publikovaných prací systematicky se zabývající touto problematikou. Podstatná část z nich jsou pouze malé soubory, které se nezabývají prognostickým významem. Přehled studií je v tabulce 3.
20
Tabulka 3: Přehled studií s imunocytochemickou detekcí nádorových buněk v periferní krvi Autor
Počet pacientek
Technika
Marker
Detekce v %
Prognostický význam
Slade (30)
23
cytospin
CK
43
nepotvrzen
Pierga (62)
114
cytospin
CK
24,5
OS
Redding (68)
110
cytospin
CK
28
nehodnocen
Gaforio
92
cytospin
CK
62
OS
CK
10
*DFS
95
nehodnocen
CK
5
nehodnocen
CK
17
(69)
Wiedswang G (70)
341
imunomagnetická separace
Beitsch (71)
23
cytospin
Schoenfeld A (72)
78
cytospin
Lopez-Guerrero (73) 33
CK/MUC1
leukaferéza
nehodnocen
DFS; disease free survival - doba bez události (recidiva, kontralaterální nádor, úmrtí bez nádoru, sekundární nádor) OS; overall survival, celkové přežití * výsledky potvrzeny multivariační analýzou 2.2.3.3. Detekce a prognostický význam minimální reziduální choroby v lymfatických uzlinách Infiltrace
axilárních
lymfatických
uzlin
je
nejdůležitějším
prognostickým faktorem u časného karcinomu prsu (4). Je zřejmé, že v případě velmi malé subklinické infiltrace může být nádor v axilárních uzlinách snadno přehlédnut. Již méně je jasné, zda tyto okultní metastázy mají nějaký prognostický význam. První studie zabývající se touto problematikou spočívaly v prostém druhém čtení původních histologií v běžném barvení (74). Překlasifikováno bylo od 7 do 33% původně negativních vzorků. Průměrně bylo překlasifikováno 13% preparátů (75). Následoval
výzkum
pomocí
imunohistochemické
detekce
s využitím
monoklonálních protilátek. Ve většině studií se jednalo o specifické protilátky
proti
cytokeratinům,
jejichž
pomocí
lze
odlišit
epitelové
elementy od normální lymfatické tkáně uzliny. Někdy bylo použito protilátek proti mucinům (76). Na rozdíl od rutinního histopatologického 21
vyšetření se při detekci okultních nádorových buněk většinou vyšetřuje jeden řez. Použitím takových technik jsou nádorové buňky nalezeny u 14 až 30% původně negativních pacientek. Průměrně se jedná o 16% (77, 78). Ačkoliv se ukázalo, že imunohistochemie je senzitivnější v detekci metastáz ve spádových uzlinách, překvapivě prognostický význam těchto okultních nádorových ložisek zůstává nejasný. Jak ve studiích s druhým čtením ve standardním barvení hematoxylin v publikacích
s imunohistochemickým
eosinem (79-81), tak
barvením
nebyl
prognostický
význam potvrzen (82-84). V těchto studiích bylo zařazeno obvykle méně než 100 a často dokonce méně než 50 pacientek. Je otázkou, zda takové studie vůbec měly sílu prokázat statisticky významný rozdíl v době do recidivy nebo dokonce celkovém přežití. Na to, abychom prokázali 10% rozdíl v přežití mezi 2 skupinami, bychom potřebovali zhruba 1400 případů (79). Podobnými nedostatky netrpěla studie provedená v Ludwigově institutu v Mnichově (85). Celkem bylo zařazeno 921 pacientek bez postižení axilárních lymfatických uzlin při rutinním vyšetření. U každé z nich bylo provedeno 2. čtení série řezů rutinní histologickou technikou. Metastázy byly zjištěny u 9% pacientek, které měly výrazně horší prognózu co se týče recidivy (p=0,003) a přežití (p=0,002). Podobně dopadla další studie s mediánem sledování 6 let publikována Nevillem (75). Mascarel
a spol. (86) provedl velkou
studii
s celkem 1121
zařazenými pacientkami. Metastázy v lymfatických uzlinách byly zjištěny u 120 z nich. Tyto pacientky měly významně kratší dobu do recidivy (p=0,005) i celkové přežití (p=0,04). Nicméně detekce přítomnost okultních nádorových buněk nebyla v následné multivariační analýze potvrzena jako nezávislý prognostický faktor. Prognostický význam byl prokázán i v některých studiích s imunohistochemií (76,87,88). Cote (89) detekoval nádorové buňky pomocí imunohistochemie u 148 (20%) ze 736 zařazených pacientek. Nález těchto buněk znamenal signifikantně kratší dobu do recidivy i přežití, což bylo potvrzeno i multivariační analýzou. Souhrn publikovaných studií je v tabulce 4. Zájem o imunohistochemickou detekci
nádorových
buněk
v lymfatických
uzlinách
se
zintenzívnil
22
v posledních
letech
s rozšířením
sentinelové
biopsie.
Vzhledem
ke
konfliktním datům zatím nález nádorových buněk v sentinelové uzlině neznamená překlasifikování pacientky do kategorie N1 a z klinického hlediska by její léčba měla probíhat obdobně jako u N0 pacientek (4).
Tabulka 4: Přehled studií s imunohistochemickou detekcí nádorových buněk v lymfatických uzlinách Autor
Počet pacientek
Bussolati (84)
50
De Mascarel (86) Cote
129
(89)
Technika SMS
Marker CK/Mucin
SMS
Detekce v %
Prognostický význam
23
DFS
CK
10
DFS
736
SMS
CK
20
nepotvrzen
Dowlatshahi (90)
200
SMS
CK
43
nehodnocen
Nasser (91)
159
SMS
CK
31
nepotvrzen
McGuckin (92)
208
SMS
25
*DFS
Gerber (93)
484
SMS
CK
11
*DFS
Braun
150
SMS
CK
9
nepotvrzen
(94)
CK/ Mucin
SMS; serial multi-sectioning – několikanásobné prokrájení DFS; disease free survival, doba bez události (recidiva, kontralaterální nádor, úmrtí bez nádoru, sekundární nádor) OS; overall survival, celkové přežití * výsledky potvrzeny multivariační analýzou
2.2.4. Detekce pomocí průtokové cytometrie Technika
průtokové
cytometrie
spočívá
v laminárním
proudění
buněčné suspenze v izotonickém roztoku. V průtokové komoře jsou buňky ozařovány
monochromatickým
světlem,
většinou
laserem.
Světlo
vyzařované buňkami je následně převedeno přes sérii filtrů a dichroických zrcadel, která izoluji jednotlivá spektra. Fotony jednotlivých vlnových délek jsou potom detekovány fotonásobiči a naměřené hodnoty jsou
23
počítačově zpracovány (95). Průtoková cytometrie byla vyvinuta k detekci ojedinělých nádorových buněk v kostní dřeni nebo krvi (96). Jedná se o velmi senzitivní metodu schopnou detekovat 1 pozitivní buňku mezi 10 miliony
krevních
morfologické
buněk
(97).
charakteristiky
Hlavní
zachycených
nevýhodou buněk.
je
V rámci
nemožnost stanovení
minimální reziduální choroby ať už v krvi nebo kostní dřeni jsou zatím výsledky
s průtokovou
cytometrií
rozporuplné
(55,98-100).
Ačkoliv
deklarovaná senzitivita se pohybuje někde okolo 1:107 dostupná data tomu příliš neodpovídají (101). V odborné literatuře byly publikovány práce
prokazující
přínos
průtokové
cytometrie
v detekci
okultních
nádorových buněk. Bohužel počet negativních studií je zhruba obdobný (102-107). Konzistentních a reprodukovatelných dat je tak málo, že nemá smysl zpracovávat přehlednou tabulku. Nejkonzistentnější práci publikoval Leers et al (108). Celkem bylo zařazeno 98 pacientek s karcinomem prsu, u kterých byla kromě standardního vyšetření provedena multiparametrická průtoková cytometrie materiálu ze sentinelové uzliny. Okultní nádorové buňky byly touto technikou zjištěny v 38% případů. Vliv na prognózu nebyl potvrzen. Práce Vredenburgha et al. (98) a Wingrena et al. (99) se více méně omezily na konstatování, že pomocí průtokové cytometrie je detekce okultních nádorových buněk možná.
2.2.5. Detekce pomocí molekulárně biologických metod Mezi molekulárně biologické metody patří především techniky založené na průkazu RNA v aspirátu kostní dřeně nebo periferní krvi. Jedná se především o zpětnou polymerázovou řetězovou reakci (RT-PCR) a amplifikaci založené na sekvenci nukleových kyselin (NASBA). Metodika RT-PCR je často zpochybňována z hlediska specificity, která závisí na počtu amplifikačních cyklů a designu primerů. Navíc nejčastěji používané
24
cytokeratiny
jsou
obecnými
epiteliálními
markery
a
ne
nádorově
specifickými markery karcinomu prsu. PCR byla popsána v roce 1985 (109). Na rozdíl od cytochemie, kde je u standardizovaných metodik deklarovaná senzitivita od 1:105 do 1:2x106 (20), u PCR se senzitivita pohybuje od 1: 106 do 1: 108. (110). Senzitivitu imunocytochemie lze sice zvýšit až na 1:5x107pomocí metod buněčné separace (111-113), ale tato technika zatím nebyla pro klinické použití spolehlivě ověřena. Výhodou PCR oproti imunocytochemii je, že hodnocení je významně méně zatíženo subjektivním hodnocením jednotlivých výzkumných pracovníků. Na druhou stranu má PCR několik nedostatků. Pokud je pro PCR detekci použit obecně epiteliální marker, může možná kontaminace epiteliálními buňkami při odběru způsobit u takto citlivé metodiky falešně pozitivní výsledky. Tyto případy byly potvrzeny u zdravých dobrovolníků (114). Řada výzkumných týmů se snaží toto riziko minimalizovat drobnou kožní incizí před odběrem kostní dřeně. V případě vyšetření periferní krve není většinou analyzován první vzorek. Výsledek RT-PCR může být také do značné míry ovlivněn ve smyslu falešné
pozitivity
kontaminací
genomovou
DNA.
Bohužel
izolovat
absolutně čistou mRNA téměř není možné. Nicméně možností, jak minimalizovat kontaminaci DNA, je použití enzymu DNázy I, který nespecificky štěpí DNA. Dále je možné využít faktu, že každý gen je složen z intronů a exonů a navrhnout primery, které se nacházejí na různých exonech. Amplikony získané PCR z cDNA jsou v důsledku nepřítomnosti intronů v mRNA elektroforeticky rozlišitelné na základě velikosti od amplikonů obdržených z genomové DNA. Lze také navrhnout primery skládající se ze dvou sousedních exonů. PCR potom proběhne pouze v případě vystřihnutí intronu a navázaní obou sousedních exonů, což ale bohužel nefunguje u alternativního sestřihu. Zavádějícím faktorem může být kontaminace reakce PCR produktem z předchozích reakcí prováděných ve stejné laboratoři. Tomu lze zamezit pokud je s PCR produkty pracováno pouze v oddělené místnosti. Ne vždy je to ale technicky možné.
25
Dalším problémem je krátký poločas mRNA. Obecně je nutné zahájit izolaci mRNA ihned po odběru vzorku. Jedině tak je minimalizována aktivita RNáz. Nedávno byly vyvinuty nové reagencie pro stabilizaci RNA, které jsou nyní komerčně dostupné (RNAlater ®, Ambion Inc., Austin, TX, USA). Potom je možné vzorek skladovat při pokojové teplotě až 48 hodin nebo několik dní v lednici (do 4
o
C). Takto skladované vzorky se od
čerstvých morfologicky neliší a umožňují izolaci vysoce kvalitní RNA (115). Nicméně minimální reziduální choroba při použití těchto technik nebyla systematicky studována. Pokud se ale potvrdí přínos metodik umožňující delší skladování, bude znamenat značné usnadnění klinického využití metodik založených na průkazu mRNA. Studie s RT-PCR jsou často kritizovány kvůli možné nelegitimní transkripci genů vyskytujících v jakékoliv buňce nebo tkáni, což je součástí komplexních regulačních mechanismů buňky (116). Tento jev byl popsán u některých tkáňově specifických genů jako např. genu pro MIH (kódující substanci potlačující vývoj Mullerových vývodů), který byl nalezen i v tkáních, pro které není jeho exprese specifická (117). Navíc exprese určité cílové mRNA může být in-vivo ovlivněna působením cytokinů a růstových faktorů (118). U některých transkriptů je zmiňován problém tzv. pseudogenů. Např. v případě CK 18 a CK 19 existuje v genomické DNA sekvence, které se od nich liší jen v několika sekvencích (119). Výsledek RT PCR může být ovlivněn původem vzorku jako takového. V případě minimální reziduální choroby se jedná o vzorky kostní dřeně, periferní krve a lymfatických uzlin. Například heparin často používaný jako antikoagulans inhibuje DNA polymerázu (120). Tento problém odpadá při využití EDTA nebo citrátu (121). Jiné inhibitory mohou být obsaženy přímo ve vzorku jako je např. hemová složka hemoglobinu (Qiamp RNA blood mini kit brochure, Qiagen). Poslední nevýhodou, která vychází ze samé podstaty vyšetření, je nemožnost provádění retrospektivních studií.
26
Stejně
jako
v případě
imunocyto(histo)chemie
je
minimální
reziduální choroba převážně zkoumána v kostní dřeni, periferní krvi a spádových lymfatických uzlinách. V případě reziduální choroby v kostní dřeni není výzkum zdaleka v takové fázi jako u imunocytochemie. Doposud nebyla prezentována žádná metaanalýza, proto je nutné se zorientovat v jednotlivých studiích. 2.2.5.1. Detekce a prognostický význam minimální reziduální choroby v kostní dřeni Mezi
prvními
publikoval
svoje
zkušenosti
s RT-PCR
v detekci
minimální reziduální choroby u karcinomu prsu Datta a spol. (122). V malém souboru 34 pacientek zjistil transkripty pro CK 19 u 26% z nich. Přítomnost minimální reziduální choroby byla sdružená s kratší dobou do události (recidivy, nového nádoru nebo úmrtí; DFS). Výsledky dosahovali hladiny statistické signifikance v univariační analýze. Ikeda a spol. (123) provedli studii metodicky velmi podobnou s využitím stejného markeru. V souboru 117 pacientek byla reziduální choroba zjištěna u 34%. Opět to znamenalo horší prognózu ve smyslu DFS. Podobné výsledky byly publikovány v práci Fieldse (124), Vanucchiho (125), Junga (126) a Ooky (127). V ostatních studiích nebyl prognostický význam buď potvrzen nebo nebyl
reportován
(30,72,122-127,133-141).
Situace
je
navíc
komplikována zpochybňováním samotného markeru jako vhodného cíle pro detekci z důvodu častého výskytu pseudogenů (128). Obecně všem cytokeratinům je vyčítána nespecificita pro prsní tkáň. V některých pracích (129-131) byl potvrzen výskyt CK19 ve vzorcích zdravých dobrovolníků, což někteří vysvětlují kontaminací vzorku při odběru (132). Přehled identifikovaných prací v tabulce 5. Souhrnně lze konstatovat, že celkem bylo identifikováno 18 studií publikovaných v odborných časopisech nebo na mezinárodních konferencích. Celkem v nich bylo zařazeno 1193 pacientek. Transkripty svědčící pro přítomnost nádorových buněk byly identifikovány v kostní dřeni 9-81% pacientek. V 6 z nich byl potvrzen
27
prognostický význam znamenající kratší dobu do recidivy v univariační analýze a ve 2 v multivariační analýze. V 8 prognostický význam potvrzen nebyl a 5 prací se touto problematikou nezabývalo.
Tabulka 5: Přehled studií s RT-PCR detekcí nádorových buněk v kostní dřeně
Autor
Počet pacientek
Marker
Detekce v %
Prognostický význam
Slade (30)
23
CK 19
61
nepotvrzen
Schoenfeld (72)
78
CK
35
nehodnocen
Datta (122)
34
CK19
26
DFS
Ikeda
117
CK 19
34
*DFS
Fields (124)
83
CK19
71
DFS
Vannucchi (125)
33
CK 19
48
DFS
Jung (126)
59
CK19
47
DFS
Ooka (127)
111
hMAM
29,7
*DFS
Gerhard (133)
6
CEA
67
nehodnocen
Zhong
181
CEA
28
nepotvrzen
Berois (135)
46
CEA
17
nehodnocen
Janku
(136)
70
CEA
41
nepotvrzen
Janku
(137)
34
hMAM
12
nepotvrzen
Mapara (138)
21
CK19
81
nepotvrzen
Statohopoulou (139)
27
CK19
63
nehodnocen
Masuda (140)
206
CK7
48
nepotvrzen
Berois (141)
42
CK19
48
nepotvrzen
CEA
29
nepotvrzen
hMAM
9
nehodnocen
(123)
(134)
Bossolasco (142)
22
DFS; disease free survival, doba bez události (recidiva, kontralaterální nádor, úmrtí bez nádoru, sekundární nádor) OS; overall survival, celkové přežití * výsledky potvrzeny multivariační analýzou
28
2.2.5.2. Detekce a prognostický význam minimální reziduální choroby v periferní krvi Molekulárně biologické metody obecně považujeme za senzitivnější než metody imunohisto(cyto)chemické. Ve dvou studiích byla prokázána desetkrát vyšší senzitivita RT-PCR ve srovnání s imunocytochemií při detekci reziduálních buněk pomocí markeru CK19 (72, 73). Senzitivitu podobně jako v případě imunocytochemie lze dále zvýšit (až desetkrát) pokud vlastní PCR předchází imunomagnetická separace. Jako markery opět slouží nejčastěji cytokeratiny. V literatuře lze identifikovat nejvíce studií s cytokeratinem 19, který byl v některých studiích specifický (72,122,143) a v některých naopak nikoliv (144,145). V jednotlivých
studiích
bylo
zařazeno
od
23
do
206
pacientů
(30,72,73,139,140,141,145-155). Cirkulující nádorové buňky byly zjištěny u 3-60% zařazených. Prognostický význam většinou nebyl studován (72,73,145, 149-154). Přítomnost cirkulujících nádorových buněk se u 3 studií pojila s kratším DFS a v 1 z nich i s kratším přežitím (139,140,146). Ve dvou z nich byla přítomnost cirkulujících nádorových buněk v periferní krvi potvrzena jako nezávislý prognostický faktor multivariační analýzou (139,146). Ale vzhledem k nehomogenitě dat a konfliktním výsledkům je zatím u těchto metodik do rutinní klinické praxe velmi daleko. Zatím ještě není definován jednoznačně, který marker nebo skupina markerů by měl být použit. Přehled identifikovaných prací je v tabulce 6.
29
Tabulka 6: Přehled studií s RT-PCR detekcí nádorových buněk v periferní krvi Autor
Počet pacientek
Slade (30)
23
Schoenfeld A (72) Lopez-Guerrero (73)
33
Marker
Detekce v %
Prognostický význam
CK19
13
nepotvrzen
CK19
25
nehodnocen
CK19
70
nehodnocen
CEA
63
nehodnocen
Maspin
22
nehodnocen
Statohopoulou (139)
148
CK19
29,7
*DFS, OS
Masuda (140)
206
CK7
18
DFS
Berois(141)
37
CK19
35
nepotvrzen
CEA
3
nepotvrzen
CK 20
23,3
nehodnocen
CK 19
100
nehodnocen
Bae (145)
30
Jotsuka (146)
100
CEA
14 (30 předop.)
*DFS
Zach
114
hMAM
25
nepotvrzen
Silva (148)
65
hMAM
22
nepotvrzen
Silva
45
CK19,
60
nehodnocen
hMAM
49
nehodnocen
Multimarker
31
nehodnocen
(147)
(149)
Taback (150)
65
HCG, c-MET,
nehodnocen
GalNAc-T, MAGE
nehodnocen
Stathopoulou (151)
77
CK19
31
nehodnocen
Lin Yung-Chang (152)
79
hMAM
29
nehodnocen
Lin Yung-Chang (153)
33
hMAM
54
nehodnocen
Grunwald
133
hMAM
8
nehodnocen
CK19
48
nehodnocen
EGFR
10
nehodnocen
CK19
33
nepotvrzen
Schroder (155)
(154)
149
DFS; disease free survival, doba bez události (recidiva, kontralaterální nádor, úmrtí bez nádoru, sekundární nádor) OS; overall survival, celkové přežití * výsledky potvrzeny multivariační analýzou
30
2.2.5.3. Detekce a prognostický význam minimální reziduální choroby v lymfatických uzlinách Podobně biologických
metod
metastatického specifické
jako
v předchozích
umožnil
postižení
mRNA
výzkum
pomocí
(156,157).
statích
rozvoj
molekulárně
citlivých
technik
na
testování
Ideální
marker
amplifikace by
měl
detekci
pro být
nádor výrazně
exprimován v infiltrované uzlině a vůbec ne v uzlině normální. Bohužel většina markerů používaná k detekci okultního nádorového postižení jako CK 19 (158), mucin-1 (156) maspin (159), vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF) a transformující růstový faktor beta (TGFbeta) (160) jsou také exprimovány do určité míry v normálních uzlinách (161). Specifický pro
karcinom
prsu
je
mammaglobin
a
CEA
(162).
V žádné
z identifikovaných studií nebyl potvrzen prognostický význam průkazu specifických
transkriptů
podotknout,
že
to
v lymfatických
většinou
nebylo
uzlinách. jejich
Nicméně
cílem.
je
nutné
V největší
studii
publikované Marchettim (163) bylo zařazeno 248 pacientek s i bez infiltrovaných uzlin. Jako markery vzhledem k vysoké specificitě byly zvoleny CEA a mammaglobin. CEA byl prokázán u 79% infiltrovaných a u 20% histologicky negativních axilárních uzlin. Mammaglobin byl prokázán u 97% infiltrovaných a u 29% histologicky negativních axilárních uzlin. Schroder (164) zjistila pomocí RT-PCR detekce pro CK19 infiltraci axilárních uzlin u 16 ze 44 pacientek. Čtrnáct mělo potvrzeno infiltraci i rutinním histopatologickým vyšetřením. Mitas (165) s použitím panelu markerů zjistil infiltraci u 38% pacientek. Výsledky jsou však limitovány velmi malým souborem čítajícím 21 zařazených pacientek bez prokázané infiltrace axilárních uzlin. Přehled studií je v tabulce 7. Přestože s rozšířením techniky sentinelové biopsie je využití zmiňovaných technik lákavé, není v současné době dostatek dat, který by nás k tomu ospravedlňoval.
Zatím je
volitelně možné používat
výše zmíněnou
31
klasifikaci UICC, kde pacientky s průkazem příslušných specifických transkriptů lze označovat jako N0 (mol+) bez dopadu na klinický rozhodovací proces (8).
Tabulka 7: Přehled studií s RT-PCR detekcí nádorových buněk v lymfatických uzlinách Autor
Počet pacientek
Marker
Schroder (155)
44
CK19
36
nepotvrzen
Noguchi (156)
15
MUC1
30
nepotvrzen
Schoenfeld (158)
75
CK19
31
nepotvrzen
Marchetti (162)
248
CEA
20 (79%
hMAM
29 (97% u N+)
nehodnocen
CEA, PIP,
38
nepotvrzen
Mitas
(163)
21
Detekce v %
Prognostický význam
u N+) nehodnocen
CK19, MUC1, hMAM A, hMAM B
2.3. Obecné problémy markerů minimální reziduální choroby u karcinomu prsu Jak již bylo zmíněno, imunocytochemické metody jsou založeny na schopnosti monoklonálních a/nebo polyklonálních protilátek rozlišit buňky rozdílné
histogeneze
(např.
epiteliální
nádorové
buňky
od
hematopoetických nebo stromálních buněk kostní dřeně a lymfatických uzlin). Většina protilátek je cílena proti antigenům specifických pro epitel. Žádná z těchto protilátek není specifická pro nádor, což znamená, že může reagovat jak s normální epiteliální buňkou, tak buňkou nádorovou. Výsledek pak může být ovlivněn kontaminací při odběru vzorku (164). Výsledky
imunocytochemického
vyšetření
velmi
závisí
na
správné
metodice. Dalším klíčovým problémem je specificita použitých protilátek. Některé epiteliální muciny a jiné membránové antigeny mohou být exprimovány na hematopoetických prekurzorových buňkách jakou jsou
32
např. erytroblasty (164-166). Naopak ilegitimní transkripce mRNA pro cytokeratin v hematopoetických buňkách by u imunocytochemie neměla být problém. Nedostatkem PCR reakce je její extrémní senzitivita, která může vést k falešně pozitivním výsledkům. Jsou doklady o variabilitě výsledků mezi jednotlivými laboratořemi, které zkoušely stejný vzorek (167). Falešně pozitivní výsledky mohou být způsobeny ilegitimní transkripcí, což je transkripce jakéhokoliv genu v jakékoliv buňce. Na druhou stranu množství takových transkriptů je velmi nízké (168), ale při zmiňované vysoké senzitivitě RT-PCR by to mohlo být příčinou falešně pozitivních výsledků. Například marker specifický pro neurony protein PGP 9,5 byl zastižen v omezeném množství v buňkách kostní dřeně a lymfatických uzlin (169). Stejně jako u imunocytochemie může dojít ke kontaminaci vzorku (170). Dalším limitujícím faktorem PCR je krátký poločas mRNA. Za účelem eliminace RNAzové aktivity je nutné ihned vzorek zpracovat. V poslední době jsou komerčně dostupné zkumavky obsahující RNA later (PAXgene, Qiagen, USA), které je možné skladovat po dobu přibližně 48 hodin při pokojové teplotě a několik dní v lednici (171). Jako
marker
reziduální
choroby
jsou
nejčastěji
testovány
cytokeratiny (především Cytokeratin 19 a 20). Jak již bylo zmíněno, cytokeratiny jsou obecné epitelové markery nespecifické pro epiteliální buňky prsní žlázy (18, 172). Tento fakt je příčinou nižší specificity citlivých molekulárně genetických metod. V těchto souvislostech je tedy nutné definovat nové markery, pokud možno specifické pro nádory prsu. Jedním z takových markerů je mammaglobin (31). Gen pro mammaglobin patří do skupiny uteroglobinových genů a jeho funkce v lidském organismu je nejasná. Nicméně jeho zvýšená exprese je specifická pro prsní tkáň, obzvláště
nádorově
mammaglobin
A.
změněnou
Naopak
(32).
homologní
Takové
vlastnosti
mammaglobin
B
má
tzv.
podle
není
dostupných informací specifický pro tkáň prsu (173, 174). Ve vzorcích primárních nádorů je exprese mammaglobinů prokazatelná v 80%-90% případů s výhodou téměř 100% specificity (175). Mammaglobin byl
33
zkoumán
především
v rámci
RT-PCR
detekce
minimální
reziduální
choroby. S imunocytochemickou detekcí jsou zde jen omezené zkušenosti (175). Z ostatních markerů CEA je sice specifické pro nádorovou tkáň, ale nemusí se nutně jednat o karcinom prsu. CEA exprese je přítomna u většiny kolorektálních karcinomů (176). Dalšími studovanými markery je mucin (MUC-1), což je epiteliální glykoprotein exprimovaný buňkami prsního epitelu (177) a nebo maspin (34). Bohužel i v případě těchto markerů byly pozorovány falešně pozitivní výsledky (73,129,178-182). 2.4.
Minimální
reziduální
choroba
jako
marker
pro
volbu
adjuvantní léčby a měření její terapeutické účinnosti Adjuvantní terapie je v současnosti podávána na základě výsledků klinických randomizovaných studií aniž by bylo možné ověřit její účinnost u konkrétního pacienta. Jelikož k vyhodnocení randomizované studie je obvykle zapotřebí alespoň 5 let sledování, je pokrok v této oblasti poměrně
pomalý
a
je
problematické
přizpůsobit
léčbu
potřebám
konkrétního jednotlivce. Otázkou zůstává, zda okultní nádorové buňky jsou opravdovou známkou hematogenní diseminace nebo zda se spíše jedná o buňky s nízkou proliferační aktivitou bez schopnosti dalšího dělení a šíření.
Dle některých autorů tyto buňky jen zřídka proliferují v době
primární diagnózy, což potvrzuje nedávno publikovaná studie prokazující nízkou aktivitu proliferačního markeru Ki-67 v nádorových buňkách (183). To
může
vysvětlovat,
proč
v současnosti
používané
cytostatické
adjuvantní režimy jsou často neúčinné v eliminaci okultních nádorových buněk.
Braunova skupina (184)
s karcinomem
prsu
vysokého
provedla
rizika,
kde
studii s 59 pacientkami byla
imunocytochemicky
vyšetřována kostní dřeň před a po ukončení chemoterapie (antracyklinové nebo taxanové režimy). Prevalence postižení kostní dřeně před a po chemoterapii byla zhruba stejná, i když u některých pacientek s iniciálně pozitivním imunocytochemickým nálezem došlo k eliminaci nádorových buněk z kostní dřeně a naopak. Každopádně průkaz cytokeratinu v kostní
34
dřeni po ukončení adjuvantní chemoterapie byl prognosticky velmi nepříznivým faktorem. Efekt vysokodávkované chemoterapie na eradikaci nádorových buněk z kostní dřeně byl zkoumán ve dvou pilotních studiích. V souboru 18
pacientek
byl
použit
režim
ifosfamid-epirubicin-karboplatina.
ukončení léčby byl prokázán cytokeratin
Po
v kostní dřeni u 15 pacientek
(83%) (185). V jiném souboru 10 pacientek léčených režimem vinblastinifosfamid-karboplatina byla reziduální choroba v kostní dřeni prokázána u 3 pacientek (33%) po ukončení léčby (186). Přítomnost okultních nádorových buněk v kostní dřeni může sloužit jako vysvětlení příčiny selhání vysokodávkované chemoterapie. Za
účelem
eradikace
jednotlivých
nádorových
buněk
byly
vyzkoušeny i novější postupy včetně využití monoklonálních protilátek. Deseti pacientkám s pokročilým karcinomem prsu byla podána 1 dávka edrecolomabu, což je monoklonální protilátka proti epitelové adhezívní molekule EpCAM exprimované na buňkách prsního karcinomu (187). U všech pacientek bylo pozorováno výrazné zlepšení nálezu v kostní dřeni 5 - 7 dní po aplikaci. U 4 pacientek nebyly nádorové buňky v kostní dřeni prokázány. Je však nutné tento postup zhodnotit ve větších prospektivních klinických studiích.
35
3. Minimální reziduální choroba – experimentální část 3.1. Cíle práce 1. Zavedení metodiky stanovení minimální reziduální choroby. a. Stanovení
exprese
cytokeratinu
19
(CK19)
imuno(cyto)histochemicky v tkáni spádových lymfatických uzlin a kostní dřeni. b. Stanovení exprese mammaglobinu A, B a CK19 pomocí RTPCR v kostní dřeni. c. Stanovení exprese CEA pomocí kvantitativní RT-PCR v kostní dřeni. 2. Posouzení
výskytu
minimální
reziduální
choroby
s použitím
jednotlivých markerů a technik. 3. Posouzení prognostického významu nálezu minimální reziduální choroby. 4. Korelace minimální reziduální choroby s ostatními klinickými a histopatologickými prognostickými faktory.
Význam projektu spočívá v tom, že: -
napomáhá
určení
nových
markerů
minimální
reziduální
choroby
senzitivnější technikou než bylo doposud u solidních nádorů běžné -
pomáhá identifikovat nemocné s vysokým rizikem časné diseminace nádorových buněk, a tím vyšším rizikem recidivy a úmrtí na nádor
-
metoda by mohla sloužit k hodnocení účinnosti adjuvantní léčby.
36
3.2. Metodika 3.2.1. Cílová populace pacientek Ke vstupu do projektu byly vybrány pacientky s časnými nebo lokálně pokročilými stádii karcinomu prsu (klinické stádium I, II a III) (188) po radikálním chirurgickém výkonu před zahájením adjuvantní léčby nebo před zahájením neoadjuvantní terapie s kurativním záměrem. Výběr pacientek
probíhal
v letech
2001
až
2005
na
Onkologické
klinice
1. lékařské fakulty Univerzity Karlovy a Všeobecné fakultní nemocnice v Praze a v roce 2003 také na Ústavu radiační onkologie Fakultní nemocnice Bulovka. Všechny pacientky byly léčeny ve shodě s konsensem ze St. Gallen (189,190). Studie probíhala ve shodě s Helsinskou deklarací a byla schválena Etickou komisí Všeobecné fakultní nemocnice a 1. LF UK. Všechny pacientky podepsaly informovaný souhlas. Celkem bylo zařazeno 91 pacientek.
3.2.2. Odběr vzorků lymfatických uzlin Vzhledem k nezbytné přednosti konvenční diagnostiky pro rutinní klinickou praxi byl reprezentativní vzorek nativní tkáně lymfatických uzlin použit
nikoliv
pro
vyšetření
RT
PCR,
ale
pouze
pro
následnou
imunohistochemickou analýzu.
3.2.3. Odběr aspirátu kostní dřeně Odběr vzorku kostní dřeně byl prováděn jednorázovou punkční jehlou 15-gauge (1.8 mm) (Allegiance Healthcare Corporation, McGaw Park, IL, USA) z hrudní kosti nebo lopaty kosti kyčelní do zkumavek obsahujících EDTA.
Pro zamezení kontaminace vzorku epitelovými
37
buňkami byla před vlastním odběrem provedena skalpelem drobná kožní incize v místě vpichu. Vzorky byly ihned po odběru zpracovány za účelem co největšího výtěžku mRNA. 3.2.4. Metoda gradientové centrifugace Před
vlastním
imunocytochemickým
vyšetřením
bylo
potřeba
nejdříve aspirát kostní dřeně zpracovat metodou gradientové centrifugace. Kostní
dřeň
nebo
periferní
krev
byla
nejprve
resuspendována
s kultivačním médiem RPMI 1640 a následně navrstvena na roztok Percollu o hustotě 1,05 g/ml. Takto připravené vzorky byly centrifugovány 30 minut při 900 G. Bílý prstenec buněk na přechodu Percoll – médium byl odsát a resuspendován s médiem H-MEMd. S cílem odstranit zbytky Percollu byl vzorek centrifugován při 400 G. Po odsátí supernatantu byl vzorek dále analyzován (viz. imunocytochemie a imunohistochemie). 3.2.5. Metodika kultivace nádorových buněk Vzorek
získaný
aspirací
kostní
dřeně
byl
resuspendován
v kultivačním mediu EMA na Petriho misce, následně 48 hodin inkubován v termostatu při 37% a sycení CO2 na 3,5%. Následně bylo provedeno imunocytochemické
vyšetření
(viz.
imunocytochemie
a
imunohistochemie). 3.2.6. Izolace mRNA Pro potřeby PCR bylo nutné nejprve vyizolovat RNA. Celková RNA byla extrahována z aspirátů kostní dřeně a vzorků periferní krve využitím kitu (QIAamp RNA
Blood Kit, Qiagen, Valencia, USA) podle instrukcí
výrobce v návodu. Kvantita a čistota získané RNA byla zhodnocena spektrofotometricky a analýzou na agarózovém gelu.
38
3.2.7. Příprava cDNA pro nested RT-PCR: reverzní transkripce (RT) Komplementární
DNA
(cDNA)
byla připravena
pomocí
MMuLV
Expand Reverse Transcriptase (Roche) a náhodných hexanukleotidů (Roche) podle pokynů výrobce. Ve stručnosti, 2 μg
RNA s 20 pmol
hexanukleotidů jsme inkubovali 10 minut při 65°C. Reakce RT byla provedena přidáním 4 μl RT pufru (Roche), 2 μl 100 mM DTT, 50U MMuLV Expand Reverse Transcriptase a 2 μl 10 mM dNTPs. Reakční směs byla inkubována 45 minut při 42°C a přenesena na led.
3.2.8.
Nested
RT-PCR
pro
detekci
mammaglobinu
A,
mammaglobinu B a CK 19 Detekce dvoustupňové
specifického amplifikace
produktu
pomocí
PCR
byla (obrázek
provedena 5).
pomocí
Jednostupňová
amplifikace transkriptu pro β-globin sloužila jako ukazatel integrity cDNA resp. izolované celkové RNA. Vlastní PCR cykly probíhaly za podmínek optimalizovaných pro anelační teplotu, počet cyklů, množství templátu, koncentraci MgCl2 a primerů. Specifita PCR produktů byla verifikována sekvenováním (BigDye 3.1., ABI 310). PCR reakce byla provedena s použitím
přístroje
PTC200
Dyad
PCR
machine
(MJR)
podle
optimalizovaných podmínek shrnutých v tabulce 8. Pro provedení PCR detekce pro mammaglobiny a cytokeratin jsme připravili sady specifických primerů (syntéza Generi-Biotech, tabulka 8).
39
Obrázek 5: Schéma nested PCR pro mammaglobin A (mRNA 504 bp) a B (mRNA 517 bp)
Tabulka 8: Primery použité pro detekci mammaglobinu A, mammaglobinu B a cytokeratinu CK 19. Pro sestavení primeru byly použity sekvence z databáze NCBI (accession number) mammaglobin A (NM_002411), mammaglobin B (NM_002407) a cytokeratin 19 (NM_002276) Primer MA01f MA02r MA03f MA04r MB01f MB02r MB03f MB04r CK19/01f CK19/02r CK19/03f CK19/04r
Sekvence (5’->3’) CTT ATT GGA GAA TGT TTC TCA CCA TAC CCT CCA AGA CAA TCA ATC TGT GAG CCA AAG GTC AAC TCC TGG AGG ACA TGG CCA TAG TCT GTA ACT CCT GGA GGA CAT TCT GAG CCA AAC GCC AAG CTA ACC ATG CAG GGC TCT TCT CCT GAC TCC CGC GAC TAC AGC GTA CCA GCG GCT CAT
GAT GCA CAC TTG TGG GCC GGT TTG AAC CTG CAC GGA
TTC GTT AAG CAG TTG CTC TGA GGT CTC CCA TAC CAT
C C
Ta1 (°C)
Ta2 (°C)
53
-
-
61
53 AAC ATA TAC CAA
GAC CGC A ACG ACC GTC GCG
58
53 -
61
První stupeň PCR byl proveden v objemu 10μl obsahující 2 μl cDNA, 0,4 U LA Taq polymerázy (TaKaRa), 1 μl 10x PCR bufferu, 1 μl 25 mM MgCl2, 7,5 pmol každého z priméru a 1.6μl 2.5 mM dNTPs. První PCR byla prováděna ve 30 cyklech: 1 min/ 94°C, 1 min/Ta1, 1 min /72°C,
40
následovaných
terminální
inkubací
10
min/72°C.
Druhá
PCR
byla
prováděna v 15 l reakční směsi (analogického složení 1°PCR s výjimkou primerů a templátu) ve 30 cyklech: 1 min/ 94°C, 1 min/Ta2, 1 min /72°C následně 10 minut při 72°C. Detekce produktu (6 l PCR) probíhala vyhodnocením elektroforézy na 2% agarozovém gelu v 1x TAE. (BioRad): Po proběhnutí elektroforézy byly vzorky
obarvené
ethidiumbromidem
(Sigma)
vizualizovány
na
transluminátoru. Reakce byla dokumentována fotograficky. 3.2.9.
Příprava
cDNA
pro
kvantitativní
RT-PCR:
reverzní
transkripce (RT) Komplementární DNA (cDNA) byla připravena pomocí kitu RevertAid (Fermentas, Burlington, Kanada) na gradientovém cykléru Thermal Cycler PTC 200 (MJ Research, Waltham, MA) s použitím následujícího schématu: V prvním kroku byla směs 3μg celkové RNA s 0,3 μg náhodných hexamerů Random primers (Promega, Madison, WI, USA) inkubována 5minut při 700C, poté rychle zchlazena na ledu. V následujícím kroku bylo ke směsi přidáno 6µl 5x RT pufru (Fermentas), 3µl 10mM dNTP a 0,75 µl inhibitoru ribonukleáz RNAsin (40U/µl) (Promega, Madison, WI, USA). Směs byla ponechána 5 minut při pokojové teplotě, a na závěr bylo přidáno 150 U reverzní transkriptázy M-MuLV RevertAid (Fermentas, Burlington, Kanada) a inkubováno 60 minut při 420C. Posledním krokem byla tepelná inaktivace reverzní transkriptázy 5 minut při 95 οC. 3.2.10. Kvantitativní RT-PCR pro detekci CEA
Priméry byly vybrány pomocí software PrimerPremier3 a NCBI (National
Center
for
Biotechnology
Information)
databáze
(číslo
NM_004363, NM_002354 a NM_002046) (191) b: CEA3 (5' - TAA GTG TTG ACC ACA GCG ACC C - 3'), CEA4 (5' - GTT CCC ATC AAT CAG CCA
41
AGA A – 3') a TaqMan próba CEA-P (5' - ATG TCC TCT ATG GCC CAG ACG ACC C - 3' BHQ1 – HEX). Celková délka amplikonu byla 167 bp. Real-time RT-PCR bylo provedeno na real-time cykléru Rotor-Gene 3000 (Corbett-Research, Sydney, Austrálie). PCR reakce byla zahájena 15-ti minutovou inkubací při teplotě 96°C, kdy došlo k aktivaci HotStart Taq polymerázy (AB Gene, Epsom, Velká Británie). Poté následovalo samotné cyklování 15s/95°C – l5s/65°C. Reakční směs o celkovém objemu 25µl pro detekci CEA obsahovala primery o koncentraci CEA3 300nM, CEA4 600nM, specifickou TaqMan sondu CEAP o koncentraci 200nM (vše Generi-Biotech, Hradec Králové, Česká republika), MgCl2 3mM, 10x PCR buffer, 1U HotStart Taq polymerázy (vše AB Gene, Epsom, Velká Británie), dNTP 200uM (Promega, Madison, WI, USA) a 100ng cDNA. Amplifikovaná DNA byla klonovaná pomocí Topo TA Cloning kitu v PCR 2.1-Topo plasmidu (Invitrogen, Carlsbad, California). Koncenrrace a čistota izolované plazmidové DNA byla hodnocena UV absorbanční metodou. Kalkulace aboslutního počtu kopií CEA v plazmidu DNA byla založena na známé molekulární hmotnosti plazmidu a Avogadrově čísle (6,023 x 1023). Exprese genu byla stanovena na základě kalibračních křivek využívajících příslušně naředěné klonované geny od 102 do 109 kopií
na
reakci. Každý
vzorek
byl analyzován ve dubletu. Každý
experiment zahrnoval pozitivní a negativní kontrolu. Konečné výsldky byly prezentovány v absolutním počtu kopií CEA mRNA na 1ug celkové RNA. K prevenci kontaminace během zpracování vzorků bylo také používáno špiček s filtry a oddělených pracovních ploch. 3.2.11. Imunocytochemie a imunohistochemie Imunocytochemická analýza nativních buněk kostní dřeně a periferní krve byla provedena s využitím sedimentační komůrky. Buňky pozitivně se barvící
při
cytokeratinu
použití 19
myší
monoklonální
(Immunotech
®)
byly
protilátky
A53-B/A2
považovány
za
proti
suspektně
nádorové. Při imunohistochemické analýze byly pětimikrometrové řezy 42
(fixované ve formolu a uskladněné v parafinu) položeny na poly-L-lysinem potažená podložní sklíčka (Sigma). Následovala standardní dvoustupňová reakce
s využitím
myší
protilidské
monoklonální
protilátky
proti
cytokeratinu 19 s vizualizací klasickou peroxidázovou-antiperoxidázovou technikou. 3.2.12. Statistická analýza Ke statistické analýze bylo použito softwaru Statistica version 6 (StatSoft
© 2003). Hodnocena byla korelace mezi výskytem minimální
reziduální choroby a dalšími prognostickými faktory a zpracována byla univariační analýza vlivu minimální reziduální choroby na dobu do recidivy.
3.3. Výsledky 3.3.1. Soubor pacientek Na
základě
zmíněných
vstupních
kritérií
bylo
po
podepsání
písemného informovaného souhlasu prospektivně vyšetřeno celkem 91 pacientek před zahájením adjuvantní nebo neoadjuvantní léčby. Z nich 48 se podrobilo kontrolnímu odběru aspirátu kostní dřeně po ukončení adjuvance nebo v případě hormonoterapie po minimálně 6 měsících léčby. Zbylých 43 nemocných se nepodařilo kontaktovat nebo kontrolní odběr odmítly. Dále je nutné již hodnotit výsledky s jednotlivými markery nebo skupinami markerů odděleně.
43
3.3.2. Výsledky stanovení minimální reziduální choroby v kostní dřeni pomocí nested RT PCR pro CK19, mammaglobin A a mammaglobin B
3.3.2.1. Soubor pacientek v podskupině V této podskupině bylo prospektivně vyšetřeno celkem 70 pacientek před zahájením adjuvantní nebo neoadjuvantní léčby. Z nich 26 se podrobilo
kontrolnímu
odběru
aspirátu
kostní
dřeně
po
ukončení
adjuvance nebo v případě hormonoterapie po minimálně 6 měsících léčby. U 19 pacientek byl v době analýzy odběr po ukončení léčby ještě plánován a 25 nemocných kontrolní odběr odmítlo. U 2 pacientek byla zjištěna recidiva karcinomu prsu. Bohužel obě odběr kostní dřeně odmítly. Odběrem kostní dřeně ze sterna nebo lopaty kosti kyčelní po provedení kožní incize bylo získáno 0,5 až 5,5 mL (medián: 1ml) aspirátu. Reprezentativní vzorky RNA se podařilo izolovat v 51 případech ze 70 vzorků odebraných před léčbou a ve 24 případech z 26 vzorků odebraných po léčbě. Při prezentaci výsledků se budeme zabývat pouze těmito reprezentativními vzorky. Celkem se jedná o 56 pacientek z nichž u 32 byl dostupný reprezentativní vzorek RNA jen z období před léčbou, u 5 pouze po léčbě a u 19 před i po léčbě. Úplná charakteristika souboru pacientek je v tabulce 9.
44
Tabulka 9: Soubor pacientek s reprezentativními vzorky RNA z kostní dřeně pro RT-PCR (N=56)
Proměnná
.
Pacientky
.
No.
%
Reprezentativní RNA pouze ze vzorku před léčbou
32
57
Reprezentativní RNA pouze ze vzorku po léčbě
5
9
Reprezentativní RNA z obou odběrů
19
34
I
20
36
IIA
13
23
IIB
21
37
IIIB
1
2
Neurčeno
1
2
N+
27
53
HR +
47
84
HER2/neu +
22
40
Invazivní duktální karcinom
49
88
Invazivní lobulární karcinom
6
10
Neurčeno
1
2
4
7
28
50
CMF
4
7
antracyklíny-taxany
8
14
47
84
Věk Medián
53
Rozmezí
28-76
Klinické stádium
Histologie
Chemoterapie Neoadjuvantní (F)AC* nebo ET** Adjuvantní (F)AC* ***
Tamoxifen nebo jiná hormonální léčba (IA) *
(F)AC: (fluorouracil), doxorubicin, cyklofosfamid
**
ET:
epirubicin, docetaxel
***
CMF: cyklofosfamid, metotrexat, fluorouracil
45
3.3.2.2. Stanovení mammaglobinu A v kostní dřeni pomocí nested RT PCR Před zahájením adjuvantní/neoadjuvantní terapie bylo odebráno 70 pacientek. Exprese mammaglobinu A v kostní dřeni byla vyšetřena v 51 vzorcích s dostatečně kvalitní RNA. Mammaglobin A byl identifikován u 6 (12%) z 51 pacientek. Exprese mammaglobinu A pozitivně korelovala s počtem postižených spádových lymfatických uzlin (r=0,29; p=0,045) a histopatologickým gradingem (r=0,32; p=0,024). Ostatní korelace byly statisticky nevýznamné (klinické stádium, infiltrace axilárních lymfatických uzlin, histologický typ, exprese hormonálních receptorů a HER2/neu). V kontrolních odběrech po léčbě jsme identifikovali mammaglobin A ve 2 (8%) z 24 reprezentativních vzorků. Ani v jednom případě se nejednalo o vzorek, ve kterém byl mammaglobin A prokázán již před zahájením
terapie.
Exprese
mammaglobinu
A
negativně
korelovala
(r= -0,46; p=0,03) s expresí hormonálních receptorů. Ostatní korelace byly statisticky nevýznamné. Výsledky PCR jsou znázorněny na obrázku 6.
46
Obrázek 6: Výsledky RT-PCR amplifikace mammaglobinu A a B v kostní dřeni. Výsledky elektroforézy na agarózovém gelu po druhém PCR. Transkripty mammaglobinu A jsou přítomné ve vzorku 2 a 5. M
–
DNA
mark
(čísla
udávají
bp),
A
–
nested
PCR
pro
mammaglobin A (219 bp), B – nested PCR pro mammaglobin B (245 bp), neg.C. – negativní kontrola (bez cDNA), pos.C – pozitivní kontrola (cDNA získána z RNA ze vzorku karcinomu prsu)
3.3.2.3. RT PCR stanovení mammaglobinu B v kostní dřeni Podobně jako v případě mammaglobinu A byla stanovena exprese mammaglobinu B.
Specifická mRNA byla identifikována u 2 (4%) z 51
pacientek s reprezentativním vzorkem RNA. V jednom případě se jednalo o pacientku, u které byl zároveň prokázaný transkript mammaglobinu A. Exprese mammaglobinu B negativně korelovala (r=-0,38; p = 0,007) s expresí hormonálních receptorů. Jiné korelace nebyly zjištěny (např. s klinickým stádiem, infiltrací axilárních lymfatických uzlin a jejich počtem, histologickým typem, histopatologickým gradingem a expresí HER2/neu). V kontrolních odběrech jsme identifikovali mammaglobin B ve 2 (8%) z 24 reprezentativních vzorků. U jedné pacientky se jednalo o přetrvávající expresi po terapii. Navíc právě u této pacientky se nově objevil transkript mammaglobinu A v kontrolním vzorku. Při srovnání s dalšími prognostickými faktory byla i tentokrát pozorována negativní
47
korelace s expresí hormonálních receptorů (r= - 0,67; p = 0,0006). Ostatní korelace byly nevýznamné (klinické stádium, infiltrace axilárních lymfatických uzlin a jejich počet, histologický typ, histopatologický grading a exprese HER2/neu). 3.3.2.4. RT PCR stanovení cytokeratinu 19 v kostní dřeni Transkripty cytokeratinu 19 byly zjištěny ve všech 51 vyšetřovaných vzorcích od pacientek před adjuvantní/neoadjuvantní léčbou (viz. obrázek 7), a proto nebylo dále účelné ve vyšetření pokračovat (viz. diskuse).
Obrázek 7:
RT-PCR exprese cytokeratinu 19 v kostní dřeni
pacientek s karcinomem prsu. Výsledky elektroforézy na agarózovém gelu po druhém PCR. Transkripty cytokeratinu 19 jsou přítomné ve všech vzorcích. M – DNA mark, 1-20 čísla vzorků, NC. – negativní kontrola (bez cDNA), PC – pozitivní kontrola (cDNA získána z RNA ze vzorku karcinomu prsu)
M 1
3
5
7
9 10 12 14 16 18 20PCNC
48
3.3.2.5. Vliv exprese mammaglobinu A a B v kostní dřeni na dobu do recidivy 3.3.2.5.1. Před chemoterapií V souboru
51
adjuvantní/neoadjuvantní
pacientek léčby
odebraných
s reprezentativními
před vzorky
zahájením RNA
byl
hodnocen vliv přítomnosti transkriptů mammaglobinu A a B v kostní dřeni na výskyt recidivy onemocnění. Předem je nutné předeslat, že v celém souboru se v době analýzy objevily pouze 2 recidivy, což je nejmenší možný počet pro statistickou analýzu. Ve sledované populaci byly zaznamenány 2 úmrtí, ale ani jedno nemělo vztah k nádorovému onemocnění (plicní embolie, autonehoda). Vyhodnocení možného vlivu minimální reziduální choroby na celkové přežití tedy postrádá smysl. Obě recidivy byly pozorovány u pacientek bez exprese mammaglobinu A nebo B v kostní dřeni. Křivky kumulativního přežití ve smyslu doby do recidivy pro mammaglobin A a B jsou znázorněny v grafech 1A a 1B. Nicméně rozdíly při univariační analýze nebyly statisticky signifikantní ani u mammaglobinu A (p=0,95) ani u mammaglobinu B (p=0,79).
49
Graf 1: Kumulativní křivky doby do recidivy v závislosti na expresi mammaglobinu A Kumulativní podíl přeživajících (Kaplan-Meier) Ukončené Cenzorované 1,05 1,04 1,03
Kumulat. podíl přežívajících
1,02 1,01 1,00 0,99 0,98 0,97 0,96 0,95 0,94 0,93 0,92
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Skup. 0, Skup. 1,
Čas
p = 0,95 skupina 0: mammaglobin A skupina 1: mammaglobin A +
50
Graf 2: Kumulativní křivky doby do recidivy v závislosti na expresi mammaglobinu B Kumulativní podíl přeživajících (Kaplan-Meier) Ukončené Cenzorované 1,05 1,04 1,03 1,02 1,01 1,00 0,99 0,98 0,97 Kumulat. podíl přežívajících
0,96 0,95 0,94 0,93
0
5
10
15
20
25
30
35
Skup. 0, Skup. 1,
40
Čas
p = 0,79
skupina 0: mammaglobin B skupina 1: mammaglobin B +
3.3.2.5.2. Po chemoterapii V souboru
24
pacientek
s reprezentativními
vzorky
RNA
vyšetřených po ukončení adjuvantní terapie nebo více jak 6 měsících od zahájení
hormonoterapie se objevila pouze 1 recidiva, a to u pacientky
s transkriptem
mammaglobinu
A
v kostní
dřeni.
Před
zahájením
onkologické léčby byl vzorek pacientky negativní jak na přítomnost mammaglobinu A, tak B. Vzhledem k jediné recidivě v této podskupině 51
nemáme
pro
statistické
vyhodnocení
dostatek
necenzorovaných
proměnných, tudíž není možné provést univariační analýzu prognostického vlivu mammaglobinu A a B v kostní dřeni.
3.3.3. Minimální reziduální choroba detekovaná pomocí kvantitativní RT PCR pro CEA v kostní dřeni
3.3.3.1. Soubor pacientek Vyšetření na expresi CEA bylo provedeno později než předchozí analýza. Tehdy byla k dispozici mRNA od 70 pacientek. Vyšetřeny byly pouze vzorky odebrané před zahájením adjuvantní nebo neoadjuvantní léčby. Všechny pacientky byly buď po radikálním chirurgickém výkonu bez známek
onemocnění
nebo
před
zahájením
neoadjuvantní
léčby
s
kurativním záměrem. Nábor probíhal od března 2001 do června 2004. Vstupní kritéria zahrnovala: primární karcinom prsu stádia I, II, a nebo III podle UICC (188), adekvátní radikální chirurgický výkon, nebo plánovaná neoadjuvantní léčba s kurativním záměrem. Celkem bylo na základě zmíněných kritérií zařazeno 70 pacientek: 26(37 %) stádia I, 19 (27 %) stádia IIA, 23 (33 %) stádia IIB a 2 (3 %) stádia IIIB. Podrobná charakteristika souboru je popsána v tabulce 10. Adjuvantní léčba byla indikována na základě platného konsensu ze St. Gallen buď z roku 2001 (189) nebo z roku 2003 (190). Adjuvantní chemoterapie zahrnovala antracyklínové režimy nebo režimy s antracyklíny a taxány nebo režimy bez antracyklínů. Celkem byla podána 51 (73 %) pacientkám. Z 62 (89 %) pacientek s expresí hormonálních receptorů byla 54 (77%) podána příslušná adjuvantní hormonální léčba tamoxifenem nebo anastrozolem. Osm pacientek s expresí hormonálních receptorů nebylo zatím léčeno adjuvantní
hormonální
léčbou,
protože
v
době
analýzy
neukončily
adjuvantní chemoterapii nebo radioterapii. Devět premenopauzálních pacientek podstoupilo chirurgickou nebo farmakologickou ovariální ablaci.
52
V případě prs zachovávajícího chirurgického výkonu následovala vždy radioterapie. Pacientky s více než 3 postiženými axilárními lymfatickými uzlinami nádorem podstoupily ozařování axily. Všechny zařazené subjekty byly sledovány stran recidivy a případného úmrtí.
53
Tabulka 10: Soubor pacientek (N=70) Pacientky
.
No.
%
Premenopauzální
27
39
Postmenopauzální
43
61
I
26
37
IIA
19
27
IIB
23
33
IIIB
2
3
N+ (postižení spádových axilárních uzlin)
35
50
HR + (hormonální receptory)
62
89
Invazivni duktální karcinom
53
76
Invazivní lobulární karcinom
14
20
Smíšený duktální/lobulární karcinom
3
4
4
6
antracyklin-taxán
3
4
letrozol
1
1
37
53
CMF
5
7
antracylin-taxán
9
13
Tamoxifen
52
74
Anastrozol
2
3
Věk Medián 52 Rozmezí
28-76
Stádium
Histologie
Chemoterapie Neoadjuvantní (F)AC*
Adjuvantní (F)AC/(F)EC * **
*
(F)AC/(F)EC: (fluorouracil), doxorubicin, cyklofosfamid/(fluorouracil), epirubicin, cyklofosfamid
**
CMF: cyklofosfamid, metotrexát, fluorouracil
3.3.3.2. Kvantitativní RT PCR pro stanovení CEA v kostní dřeni
Transkripty CEA mRNA byly zjištěny v kostní dřeni u 29 (41%) pacientek. Většina pacientek byla stádia II: 9 stádium IIA, 9 stádium IIB.
54
Deset pacientek mělo klinické stádium I a pouze 1 stádium IIIB. Více jak polovina
z nich
(15/52%)
měla
prokázané
postižení
axilárních
lymfatických uzlin. Ve srovnání s ostatními prognostickými faktory nebyla prokázána korelace
s nádorovým gradingem (r
= -0,22), expresí
hormonálních receptorů (r = 0) a histologickým typem (r = 0,06). Medián doby sledování činil v době analýzy 22 měsíců (rozmezí: 2 až 45 měsíců). U 8 pacientek (9%) byla zaznamenána událost hodnocena v rámci DFS (disease free survival – doba do recidivy, nenádorového úmrtí, kontralaterálního nebo sekundárního nádoru). Z nich se jednalo u 4 pacientek o vznik vzdálených metastáz, 1 lokoregionální recidivu, 1 DCIS a 2 úmrtí bez nádoru (plicní embolie, autonehoda). U pacientek s transkripty CEA v kostní dřeni byly zaznamenány 2 systémové recidivy a 2 úmrtí bez nádoru. U pacientek bez CEA v kostní dřeni byly zjištěny 2 systémové recidivy, 1 DCIS a 1 lokoregionální recidiva. Byl zjištěn trend ke kratšímu DFS ve skupině s CEA v kostní dřeni. Nicméně statisticky se pohyboval těsně nad hranicí statistické významnosti (p=0,05548, GehanWilcoxon). Křivka pro DFS je znázorněna na grafu 3. Nebyl pozorován statisticky významný rozdíl mezi jednotlivými skupinami ve smyslu DMFS (distant metastasis free survival- doba do vzniku vzdálených metastáz) (p=0.271) (křivka je na grafu 4) a RFS (relapse free survival- doba do vzniku
lokální
nebo
vzdálené
recidivy
nebo
karcinomu
in-situ)
(p=0.37231) (křivka je na grafu 5). Celkové přežití nebylo hodnoceno, jelikož se v souboru objevily pouze 2 úmrtí (obě nenádorové). Data týkající se DFS by měla být interpretována s velkou opatrností, protože mohou být při daném počtu pacientek a událostí ovlivněna 2 nenádorovými úmrtími ve skupině pacientek s CEA expresí v kostní
dřeni.
Nebyla
potvrzena
korelace
s
ostatními
klinickými
a
laboratorními prognostickými faktory. Studie prokázala, že technika kvantitativní RT-PCR pro CEA může být využita pro detekci minimální reziduální choroby v kostní dřeni pacientek s časnými stádii karcinomu prsu. Nicméně specificita techniky by měla být ověřena na vzorcích kostní
55
dřeně
zdravých
dobrovolníků,
aby
byla
stanovena
míra
ilegitimní
transkripce CEA v normální kostní dřeni. Prognostická hodnota CEA v kostní dřeni pacientek s karcinomem prsu zůstává nejasná. Příklady záznamu real-time RT-PCR jsou na obrázku 8.
Graf 3: DFS v závislosti na expresi CEA (Kaplan Maier) Kumulativní podíl přeživajících (Kaplan-Meier) Ukončené
Cenzorované
Kumulat. podíl přežívajících
1,0
0,9
0,8
0,7
P = 0.05548 Gehan-Wilcoxon
0,6
0,5 0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Skup. CEA – 0, Skup. CEA + 1,
Čas
Čas v měsících
56
Graf 4: DMFS v závislosti na expresi CEA (Kaplan-Meier)
Kumulativní podíl přeživajících (Kaplan-Meier) Ukončené
Cenzorované
Kumulat. podíl přežívajících
1,0
0,9
0,8
0,7
P = 0,271 Gehanův Wilcoxonův test
0,6
0,5 0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Čas v Čas měsících
57
CEA – 0, Skup. CEA + Skup. 1,
Graf 5: RFS v závislosti na expresi CEA (Kaplan-Meier) Kumulativní podíl přeživajících (Kaplan-Meier) Ukončené
Cenzorované
15
25
Kumulat. podíl přežívajících
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5 0
5
10
20
30
Čas Čas v měsících
35
40
45
50
CEA Skup.–0, CEA Skup.+1,
58
Obrázek 8: Příklad záznamu real-time RT-PCR analýzy. Analýza se skládá ze tří navzájem provázaných dílů. Barevné křivky představují nárůst fluorescence v závislosti na počtech amplifikačních cyklů. Čím více bylo ve vzorku hledané mRNA, tím dříve došlo k nárůstu fluorescence. Do analýzy jsou také přidány vzorky o známé koncentraci – standardy, které jsou naředěny v desetinásobném ředění. Z výsledků amplifikace standardů je poté sestrojena standardizační křivka, na jejímž základě je vypočteno množství (počet kopií) hledaného markeru (CEA) u neznámých vzorků. Výsledky jsou potom přehledně vyneseny do tabulky dat.
59
3.3.4.
Minimální
reziduální
choroba
detekovaná
imunocytochemicky v kostní dřeni Celkem bylo vyšetřeno 43 pacientek před zahájením terapie. Poté co nebyla detekována ani jedna okultní nádorová buňka ve vzorcích prvních 28 pacientek zpracovaných technikou gradientové centrifugace, rozšířili jsme
metodiku
imunocytochemickým
o
kultivaci
vyšetřením.
buněk Takto
bylo
in-vitro vyšetřeno
s následným dalších
15
pacientek, z nichž u 2 jsme imunocytochemicky zachytili suspektní okultní nádorové buňky (viz obrázek 9). Oba odběry byly provedeny před zahájením onkologické léčby. V jednom případě nemáme pro srovnání dostupnou
reprezentativní
RNA.
V druhém
nebyla
přítomnost
mammaglobinu A ani B prokázána. Cytokeratin 19 samozřejmě přítomen byl, stejně jako ve všech ostatních testovaných vzorcích. Proto tato korelace nemá výpovědní hodnotu. Pro pochyby o spolehlivosti metodiky při pasážování nádorových buněk jsme tuto techniku opustili (viz. diskuse).
60
Obrázek 9: Vzorek 1: A/ Okultní nádorová buňka detekovaná imunocytochemicky
B/ Negativní kontrola
61
Vzorek 2: A/ Okultní nádorová buňka detekovaná imunocytochemicky
B/ Negativní kontrola
3.3.5. Imunohistochemické stanovení cytokeratinu v spádových lymfatických uzlinách Vyšetřeno bylo celkem 11 pacientek. Ze 70 zařazených pacientek v době analýzy bylo vyřazeno 34, které měly infiltrované axilární uzliny již na
základě
rutinního
histopatologického
vyšetření.
pacientek se u 25 nepodařilo zajistit parafinové
Ze
zbylých
36
bločky s vhodným
62
materiálem. Imunohistochemické vyšetření bylo provedeno pomocí myší protilidské
monoklonální
protilátky
A53-B/A2
proti
cytokeratinu
19
(Immunotech ®). Z 11 vyšetřených pacientek byla minimální reziduální choroba imunohistochemicky zjištěna u jedné pacientky (9%) v 1 spádové uzlině z 9 vyšetřených. Jednalo se o pacientku II. klinického stádia, u které
nebyla
zjištěna
minimální
reziduální
choroba
v kostní
dřeni
vyjádřenou expresí mammaglobinu A nebo B. Ve vyšetřované skupině nebyla zachycena ani jedna recidiva. 4. Diskuse Přítomnost okultních nádorových buněk v kostní dřeni pacientek s časnými stádii karcinomu prsu koreluje s kratší dobou do recidivy a horším
přežitím
(36-41,44,52-54,56,57,60-63,122-127).
V případě
přítomnosti okultních nádorových buněk ve vzorcích periferní krve nebo spádových lymfatických uzlin již to není tak jednoznačné (30,62,6873,84,86,89-94,139,140,141,145,156,158,162,163,199).
Nedostatek
nádorově specifických markerů vedl k výzkumu cytokeratinů, jejichž význam byl podrobně u karcinomu prsu studován. Limitem stanovení exprese cytokeratinů je relativně nízká specificita (145,192), která může být
způsobena
např.
přítomností
ilegitimních
transkriptů
RNA
(129,158,193). U karcinomu prsu se nejčastěji zkouší cytokeratin 19. Několik výzkumných týmů testovalo i cytokeratin 20, ale jeho nevýhodou je, že nemusí být exprimován u všech buněk karcinomu prsu (192). Z ostatních markerů CEA je specifický pro nádorovou tkáň, ale u karcinomu
prsu se
na
rozdíl
od kolorektálního karcinomu nemusí
vyskytovat u všech případů (130). Naopak mammaglobin A je jako marker jak senzitivní, tak specifický. Již méně specifický je mammaglobin B, který kromě prsní tkáně lze nalézt v slinných žlázách a děloze (174). Cílem výzkumu bylo detekovat minimální reziduální chorobu ve vzorcích spádových lymfatických uzlin odebraných při primární operaci a ve vzorcích kostní dřeně odebraných před adjuvantní/neoadjuvantní 63
léčbou a po léčbě za účelem posouzení vhodnosti metodik, studovaných markerů,
vyhodnocení
s ostatními
možného
prognostického
významu,
korelací
prognostickými faktory a posoudit případný vliv léčby na
minimální reziduální chorobu. Při vyšetření vzorků kostní dřeně pomocí metodiky nested RT-PCR byla minimální reziduální choroba pomocí průkazu mammaglobinu A zjištěna u 12% (6 z 51) pacientek před léčbou a u 8% (2 z 24) pacientek po léčbě. Polovina pacientek (celkem 3) s nálezem mRNA mammaglobinu A v kostní dřeni před terapií se nedostavila ke kontrolnímu odběru, v ostatních případech došlo po léčbě k vymizení mammaglobinu A z kostní dřeně. Naopak při kontrolních odběrech byl mammaglobin A zjištěn ve vzorcích, kde před léčbou detekován nebyl. Mammaglobin B byl ve vzorcích odebraných před léčbou zjištěn ve 4% (2 z 51) a v 8% (2 z 24) po léčbě. Jedna pacientka s pozitivním nálezem se ke kontrolnímu odběru nedostavila, u druhé přetrvával nález mammaglobinu B i ve vzorku odebraném po léčbě a u jedné pacientky byl mammaglobin B prokázán nově až v kontrolním vzorku. Výskyt mammaglobinu A i B byl společně prokázán pouze u jedné pacientky odebrané před léčbou (kontrolní odběr nepodstoupila) a u jedné pacientky po léčbě (tam se jednalo o nový záchyt mammaglobinu A a přetrvávající přítomnost mammaglobinu B). V odborné literatuře byly publikovány 2 podobné studie zkoumající expresi mammaglobinu A. Mammaglobin B na souboru pacientek testován nebyl. Ooka et al. (127) v souboru 111 pacientek s karcinomem prsu klinického stádia I-III detekoval transkripty mammaglobinu A v kostní dřeni 33 (29,7%) pacientek. Při mediánu sledování 21 měsíců byl prokázán signifikantně kratší DFS (DMFS) u pacientek s postižením kostní dřeně. Tento fakt byl podpořen i multivariační analýzou. Bossolasco et al (142) v souboru 22 pacientek zachytila mammaglobin A u 9%, což je číslo podobné jako v našem souboru. Prognostický význam v této studii nebyl publikován.
64
Překvapivý byl průkaz cytokeratinu 19 ve všech testovaných vzorcích odebraných před léčbou. V literatuře byly objeveny práce, kde některá
zahraniční
pracoviště
popisují
podobné
zkušenosti
(129,130,145,194). Vzhledem ke konfliktním datům v literatuře a naším vlastním výsledkům jsme RT PCR průkaz cytokeratinu 19 vyhodnotili jako nespolehlivý. V
souboru hodnoceném na přítomnost mammaglobinu A, B a
cytokeratinu 19 se vyskytly pouze 2 recidivy. Jinými slovy, v době analýzy přežívalo 97% pacientek bez známek recidivy. Za těchto okolností je na hodnocení prognostického významu minimální reziduální choroby příliš brzy.
Proto
není
překvapivé,
že
zatím
nebyl
prokázán
statisticky
signifikantní vliv na četnost a dobu do recidivy onemocnění. Z hlediska metodiky se mammaglobin A a s menší mírou jistoty mammaglobin B jeví jako užitečné markery pro výzkum minimální reziduální choroby. Při vyhodnocení korelací s ostatními prognostickými faktory byla zjištěna pozitivní
korelace
mezi
výskytem
mammaglobinu
A,
vyšším
histopatologickým gradingem a vyšším počtem postižených axilárních uzlin ve skupině pacientek odebraných před léčbou. V podskupině vzorků získaných po léčbě byla prokázána negativní korelace mezí výskytem mammaglobinu A a expresí hormonálních receptorů. Tento nález byl konzistentní s prokázanou negativní korelací přítomnosti mammaglobinu B a negativní expresí hormonálních receptorů v obou podskupinách. Relativně nižší celkové procento pozitivních nálezů minimální reziduální choroby v námi studované populaci ve srovnání s ostatními publikovanými studiemi
(127,142,195)
lze
přičítat
nízkému
počtu
recidiv
v době
hodnocení souboru. Exprese CEA jako markeru nádorových buněk byla zkoumána v lymfatických uzlinách, periferní krvi a kostní dřeni. Min a spol. (161) publikovali dobré výsledky s CEA RT-PCR detekcí nádorových buněk v sentinelové uzlině. Mitas a spol. (163) dosáhl podobných výsledků při použití kvantitativní RT-PCR. Naopak někteří autoři shledali detekci CEA
65
exprese ve stejných indikacích jako málo přínosnou (196). Bohužel všechny zveřejněné studie trpěly malým počtem zařazených pacientek (od 17 do 22), a tak je obtížné na základě dostupných dat vyvodit konečné závěry. Podobně nekonzistentní výsledky byly publikovány o detekci CEA v periferní krvi (34). Na základě přehledu literatury byly transkripty CEA mRNA v kostní dřeni zjištěny u 17,4% až 67 % pacientů. Gerhard a spol. (133) zjistil CEA pomocí RT-PCR u 4 z 6 pacientek s karcinomem prsu. Zhong a spol. (134) detekoval CEA podobnou technikou u 27,8% pacientek v doposud největším publikovaném souboru (181 pacientek s karcinomem prsu po radikálním výkonu pro karcinom prsu). Berois a spol. (135) ve své práci publikoval proporcionálně nejmenší záchyt CEA ve vzorcích kostní dřeně (17,4%; 8 z 46 pacientek). V naší práci jsme pomocí metody kvantitativního RT-PCR pro detekci CEA prokázali minimální reziduální chorobu u 41% (29 ze 70) pacientek s časným karcinomem. V
dříve
publikovaných
studiích
byla
minimální
reziduální
choroba
detekovaná pomocí imunocytochemie potvrzena jako nezávislý negativní prognostický faktor pro kratší dobu do recidivy a celkové přežití pacientek s
časným
karcinomem
metaanalýza
tyto
prsu
závěry
(172).
potvrdila
Navíc
(42,43).
nedávno U
CEA
publikovaná
jako
markeru
nádorových buněk v periferní krvi byla prokázána negativní prognostická hodnota u pacientů s kolorektálním karcinomem a nemalobuněčným karcinomem plic (197, 198). U karcinomu prsu Jotsuka a spol. (146) publikoval výsledky studie ze 101 pacientkami z časným karcinomem prsu. Průkaz transkriptů mRNA pro CEA v periferní krvi byl prognosticky nepříznivým faktorem. Stathopoulou a spol. (35) zkoumali expresi CEA v periferní
krvi
pacientů
s
karcinomem
prsu,
tlustého
střeva
a
hematologických malignit. Bohužel zveřejněné výsledky neobsahují data ohledně přežití. Doposud nebyla publikovaná větší studie zabývající se prognostickou hodnotou CEA v kostní dřeni. V naší studii při mediánu sledování 22 měsíců jsme pozorovali 8 událostí hodnocených v rámci DFS. Čtyři z nich byly popsány u pacientek s CEA transkripty v kostní dřeni. Nicméně 2 události ve skupině s CEA expresí neměly přímý vztah k 66
nádoru. Ve skupině s CEA v kostní dřeni byl pozorován trend ke kratšímu DFS, který byl těsně nad hranicí statistické významnosti (p=0.05548). Nicméně tento trend nebyl potvrzen obdobnými nálezy u DMFS a RFS. Data týkající se DFS by měla být interpretována s velkou opatrností, protože mohou být při daném počtu pacientek a událostí ovlivněna 2 nenádorovými úmrtími ve skupině pacientek s CEA expresí v kostní dřeni. Nebyla
potvrzena
korelace
s
ostatními
klinickými
a
laboratorními
prognostickými faktory. Studie prokázala, že technika kvantitativní RT PCR pro CEA může být využita pro detekci minimální reziduální choroby v kostní dřeni pacientek s časnými stádii karcinomu prsu. Nicméně specificita techniky by měla být ověřena na vzorcích kostní dřeně zdravých dobrovolníků, aby byla stanovena míra ilegitimní
transkripce CEA v
normální kostní dřeni. Prognostická hodnota CEA v kostní dřeni pacientek s karcinomem prsu zůstává nejasná. Při vyšetření kostní dřeně pomocí imunocytochemie jsme po neuspokojivých výsledcích při použití publikovaných postupů (164) rozšířili vyšetření o kultivaci buněk kostní dřeně in vitro (viz oddíl metodika). Takovým postupem jsme sice zjistili přítomnost suspektních okultních nádorových buněk u 2 pacientek z 15 (13%) ve vzorcích odebraných před léčbou. Nicméně vzorky byly poměrně dlouho vystaveny podmínkám in vitro, které samozřejmě mohly průběh reakcí ovlivnit. Proto výsledky získané touto metodikou nepovažujeme za spolehlivé. Perspektivně z hlediska klinického využití je důležité definovat úlohu reziduální choroby ve spádových lymfatických uzlinách. V současnosti, kdy dochází k rozvoji vyšetření tzv. sentinelové uzliny na úkor klasické disekce axilárních lymfatických uzlin, se soustřeďuje pozornost na to, zda by stanovení reziduální choroby nezpřesnilo diagnózu ve srovnání s klasickým histopatologickým vyšetřením. V současnosti zatím imunohistochemický průkaz minimální reziduální choroby v sentinelové uzlině nás neopravňuje k překlasifikování
klinického
stádia
pacientky
na
N+(4),
protože
prognostický význam takového nálezu není prokázán. Z vyšetřované
67
skupiny jsme vyloučili pacientky s prokázanými uzlinovými metastázami při
rutinním
histopatologickém
vyšetření.
V našem
souboru
byla
imunohistochemicky minimální reziduální choroba zjištěna u 1 z 11 doposud
vyšetřených
pacientek
(9%).
Ve
vyšetřované
skupině
se
neobjevila žádná recidiva, proto není možné zatím jakkoliv posoudit prognostický význam. Výsledky naší práce by mohly přispět k ověření nových markerů mammaglobinu A, B a CEA pro diagnostiku minimální reziduální chorobu u karcinomu prsu. Naopak v případě cytokeratinu 19 jsme podpořili již dříve vyslovené pochyby o jeho diagnostickém významu (129,130,145,194).
5. Závěr Karcinom prsu patří mezi závažné celospolečenské problémy. Jedná se o onemocnění, kterým v naší republice ročně onemocní téměř 6000 žen.
I
přes
narůstající
incidenci
nedochází
k nárůstu
mortality.
V některých zemích je dokonce pozorován pokles počtu úmrtí (200,201). Na tomto příznivém vývoji má svůj podíl nejen zavedení screeningové mamografie v rozvinutých evropských státech (202), ale i nové poznatky v oblasti molekulární biologie nádorů, které by mohly umožnit aplikaci těchto metod přímo do praxe. Molekulárně biologické markery jsou v klinické
praxi
používány jako prognostické
faktory
(estrogenní
a
progesteronové receptory, HER-2/neu, p53, Ki-67, vaskulární epiteliální růstový
faktor),
receptory,
prediktivní
HER-2/neu)
nebo
faktory
(estrogenní
terapeutické
cíle
a
progesteronové
protinádorové
léčby
(estrogenní a progesteronové receptory, EGFR, HER-2/neu, HER3, HER4, VEGF, mTOR) v různých stádiích klinického uplatnění (4,15,203,204,205) Využití detekce výskytu minimální reziduální choroby u časného karcinomu prsu je dalším pokusem implementovat moderní diagnostické technologie se snahou ovlivnit úmrtnost na nádory.
68
Cílem této práce bylo studovat možnosti diagnostiky a prognostický význam výskytu minimální reziduální choroby v spádových lymfatických uzlinách a kostní dřeni u nemocných s časným karcinomem prsu. Nejperspektivnějším materiálem pro vyšetření minimální reziduální choroby se zdá být kostní dřeň. Z klinického hlediska je důležité ověřit význam imunohistochemického nebo molekulárně genetického vyšetření spádových lymfatických uzlin
za účelem zpřesnění výsledků sentinelové
lymfadenektomie, která se postupně stává standardní metodou. Vzhledem k horší dostupnosti čerstvého materiálu bude zde i nadále pravděpodobně v popředí
imunohistochemie.
Naopak
u
vyšetření
kostní
dřeně
lze
s výhodou využít vyšší citlivosti metodiky RT PCR. Minimální
reziduální
choroba
v kostní
dřeni
byla
detekována
v závislosti na použitém markeru (mammaglobin A, mammaglobin B, CEA) a souboru pacientek u 4-41% nemocných před zahájením neoadjuvantní nebo adjuvantní terapie. Po 6 a více měsících od zahájení terapie byla minimální reziduální choroba (pomocí mammaglobin A, mammaglobin B) zjištěna
u
8%
pacientek.
Prognostický
význam
detekce
minimální
reziduální choroby pomocí RT PCR zůstává nejasný. Minimální reziduální choroba v lymfatických uzlinách byla potvrzena pomocí imunohistochemického vyšetření protilátkou proti cytokeratinu 19 u
9% pacientek. Bližší interpretaci tohoto výsledku brání malý počet
zařazených nemocných v této větvi. Závěrem lze konstatovat, že možnosti zlepšení léčebných výsledků pomocí klasické systémové cytostatické léčby jsou zřejmě již značně omezeny. Proto je naprosto nezbytné pochopení klíčových molekulárních mechanismů vedoucích ke vzniku maligních onemocnění, které může přinést další průlom v léčbě všech nádorů včetně karcinomu prsu. V současnosti dochází k překotnému vývoji nových diagnostických testů i nových léčiv, která se výrazně odlišují od konvenčních cytostatik. Jsou cíleně navržená proti přesně definovaným buněčným cílům, které se účastní procesu proliferace, reparace poškození DNA nebo apoptózy. Některé z těchto léků již postoupily z fáze klinického zkoušení a jsou
69
běžně dostupné pro rutinní klinickou praxi. Věřím, že i díky tomuto projektu se experimentální postupy opět o trochu přiblížily klinické praxi, což by v budoucnu mělo vést k racionalizaci a individualizaci léčby za účelem lepších výsledků.
6. Literatura: 1. Anonymus. Novotvary 2003 ČR. Praha, UZIS CR, NOR CR: 2006. 2. Gail MH, Costantino JP. Validating and improving models for projecting the absolute risk of breast cancer. J Natl Cancer Inst 2001; 93: 334-5. 3. Novotny J, Pecen L, Petruzelka L, Svobodnik A, Dusek L, Danes J, et al. Breast cancer risk assessment in the Czech female population an adjustment of the original Gail model. Breast Cancer Res Treat 2005; Dec 1:1-7 [Roub Ahead of Print]. 4. Goldhirsch A, Glick JH, Gelber RD, Coates AS, Thurlimann B, Senn HJ. Meeting highlights: International expert consensus on the primary therapy of early breast cancer 2005. Ann Oncol 2005; 16: 1569-83. 5. Meijer-van Gelder ME, Look MP, Peters HA, Schmitt M, Brunner N, Harbeck N, et al. Urokinase-type plasminogen activator system in breast cancer: association with tamoxifen therapy in recurrent disease. Cancer Res 2004; 64:4563-8. 6. Harbeck N, Kates RE, Look MP, Meijer-Van Gelder ME, Klijn JG, Kruger A, et al. Enhanced benefit from adjuvant chemotherapy in breast cancer patients classified high-risk according to urokinasetype
plasminogen
activator
(uPA)
and
plasminogen
activator
inhibitor type 1 (n = 3424). Cancer Res 2002;62:4617-22. 7. Harbeck N, Kates RE, Schmitt M. Clinical relevance of invasion factors urokinase-type plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor type 1 for individualized therapy decisions in
70
primary breast cancer is greatest when used in combination. J Clin Oncol 2002;20:1000-7. 8. Hermanek P, Hutter P, Sobin LH, Wittekind C: Classification of isolated tumor cells and micrometastasis. Cancer 1999;86:2668– 2673. 9. DeVita VT Jr. Breast cancer therapy: excercising all our options. N Engl J Med 320: 527-529, 1989. 10. Rosner D, Lane WW. Predicting recurrence in axillary-node negative breast cancer patients. Breast Cancer Res Treat 1993;25:127–139. 11. Konopásek B, Petruželka L.In: Karcinom prsu. Galén, Praha 1997: pp 38-42. 12. Coombes RC, Powles TJ: Tests for distant metastases in patients with breast cancer. J R Soc Med 1980; 73:617-623. 13. Early Breast Cancer Trialists` Collaborative Group. Favourable and unfavourable effects on long-term survival of radiotherapy for early breast cancer: an overview of the randomised trials. The Lancet 2000; 355: 1757-70. 14. Petruželka L. Karcinom prsu. Postgraduální medicína 1999; 1: 4149. 15. Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group (EBCTCG). Effects of chemotherapy and hormonal therapy for early breast cancer on recurrence and 15-year survival: an overview of the randomised trials. Lancet 2005;365:1687-717. 16. Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group (EBCTCG). Effects of radiotherapy and of differences in the extent of surgery for early breast cancor on local recurrence and 15-year survival: an overview of the randomised trials. Lancet 2005;366:2087-2107. 17. http://www.adjuvantonline.com/ 18. Janků F, Novotný J, Vedralova J, Kleibl Z, Matouš B, Petruželka L.. Minimální reziduální choroba u karcinomu prsu. Čas Lék čes 2002;141: 546-550.
71
19. Ellis G, Ferguson M, Yamanaka E, Livingston RB, Gown AM. Monoclonal antibodies for detection of occult carcinoma cells in bone marrow of breast cancer patients. Cancer 1989; 63:2509-2514. 20. Osborne MP, Wong GY, Asina S, Old LJ, Cote RJ, Rosen PP. Sensitivity of immunocytochemical detection of breast cancer cells in human bone marrow. Cancer Res 1991;51:2706-9. 21. Schoenfeld A, Luqmani Y, Sinnett HD, Shousha S, Coombes RC. Keratin 19 mRNA measurement to detect micrometastases in lymph nodes in Brest cancer patients. Br J Cancer 1996;74:1639-42. 22. Harris CC. Structure and function of the p53 tumor supressor gene: clues for rational cancer therapeutic strategies. J Natl Cancer Inst 1996;88:1442-55. 23. Offner S, Schmaus W, Witter K, Baretton GB, Schlimok G, Paslick B, et al. P53 gene mutations are not required for early dissemination of cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 6942-6. 24. van Houten VM, Tabor MP, van den Brekel MW, Denkers F, Wishaupt RG, Kummer JA, at al. Molecular assays for the diagnosis of minimal residual disease in head and neck cancer: methods, reliability, pitfalls, and solutions. Clin Cancer Res 2000; 6: 3803-16. 25. Gozzetti A, Le Beau MM: Fluorescence in situ hybridization: uses and limitations. Semin Hematol 2000;37:320–333. 26. Herman JG, Umar A, Polyak K, Graff JR, Ahuja N, Issa JP, et al. Incidence
and
functional
consequences
of
hMLH1
promoter
hypermethylation in colorectal carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A 1998;95:6870-5. 27. Mathieu MC, Friedman S, Bosq J, Caillou B, Spielmann M, Travagli JP, et al. Immunohistochemical staining of bone marrow biopsies for detection of occult metastasis in breast cancer. Breast Cancer Res Treat 1990;15:21–26. 28. Osta WA, Chen Y, Mikhitarian K, Mitas M, Salem M, Hannun YA, et al. EpCAM is overexpressed in breast cancer and is a potential target for Breast cancer gene therapy. Cancer Res 2004;64:5818-24.
72
29. Kasimir-Bauer S, Otterbach F, Oberhoff C, Schmid KW, Kimmig R, Seeber S. Rare expression of target antigens for immunotherapy on disseminated tumor cells in breast cancer patients without overt metastases. Int J Mol Med. 2003;12:969-75. 30. Slade
MJ, Smith
Quantitative
BM, Sinnett
polymerase
chain
HD, Cross reaction
NC, Coombes
for
the
detection
RC. of
micrometastases in patients with breast cancer J Clin Oncol 1999;17:870-879. 31. Watson MA, Darrow C, Zimonjic DB, Popescu NC, Fleming TP. Structure and transcriptional regulation of the human mammaglobin gene, a breast associated member of the uteroglobin gene family localized to Chromosome 11q13. Oncogene 1998;16:817-824. 32. Watson
MA,
Fleming
TP.
Mammaglobin,
a
mammary-specific
member of the uteroglobin gene family, is overexpressed in human breast cancer. Cancer Res 1996;56, 860-865. 33. De Potter CR, Beghin C, Praet MM, Pauwels CF, Roels HJ. CEA and HMFG in hyperplastic and malignant lesions of the breast. Pathol Res Pract 1988;183:271-6. 34. Corradini P, Voena C, Astolfi M, Delloro S, Pilotti S, Arrigoni G, et. al. Maspin and mammaglobin genes are specific markers for RT-PCR detection of minimal residual disease in patients with breast cancer. Ann Oncol 2001;12:1693-8. 35. Stathopoulou A, Mavroudis D, Perraki M, Apostolaki S, Vlachonikolis I,Lianidou E, et al. Molecular detection of cancer cells in the peripheral blood of patients with breast cancer: comparison of CK19,
CEA
and
maspin
as
detection
markers.
Anticancer
Res
2003;23:1883-90. 36. Braun S, Pantel K, Muller P, Janni W, Hepp F, Kentenich CR, et al. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and the survival of patients with stage I, II or III breast cancer. N Engl J Med 2000;342:525-533.
73
37. Cote RJ, Rosen PP, Lesser ML, Old LJ, Osborne MP. Prediction of early relapse in patients with operable breast cancer by detection of occult bone marrow micrometastases. J Clin Oncol 1991;9:17491756. 38. Harbeck N, Untch M, Pache L, Eiermann W. Tumor cell detection in the bone marrow of breast cancer patients at primary therapy: results of a 3-year median follow-up. Br J Cancer 1994;69:566-571. 39. Diel IJ, Kaufmann M, Costa SD, Holle R, von Minckwitz G, Solomayer EF, et al. Micrometastatic breast cancer cells in bone marrow at primary surgery: prognostic value in comparison with nodal status. J Natl Cancer Inst 1996;88:1652 – 1664. 40. Gebauer G, Fehm T, Merkle E, Beck EP, Lang N, Jager W. Epithelial cells in bone marrow of breast cancer patients at the time of primary surgery: Clinical outcome during long-term follow-up. J Clin Oncol 2001;19: 3669-3674. 41. Solomayer EF, Diel IJ, Gollan Ch, Wallwiener D, Bastert G. Prognostic impact of minimal residual disease and established prognostic factors in breast cancer patients with neoadjuvant chemotherapy. Proc Am Soc Clin Oncol 1998; 17:# 411. 42. Braun S, Vogl F, Pantel K. Disseminated tumor cells (DTC) in bone marrow (BM) and clinical outcome: Final results of pooled analysis on 10-year survival of 4,703 breast cancer patients. J Clin Oncol 2005;23:# 502 (post meeting edition). 43. Braun S, Vogl FD, Naume B, Janni W, Osborne MP, Coombes RC, et al. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N Engl J Med 2005; 353:793-802. 44. Mansi JL, Easton D, Berger U, Gazet JC, Ford HT, Dearnaley D, et al. Bone marrow micrometastases in primary breast cancer: Prognostic significance after 6 years' follow-up. Eur J Cancer 1991;27:15521555.
74
45. Mansi JL, Gogas H, Bliss JM, Gazet JC, Berger U, Coombes RC. Outcome of primary-breast-cancer patients with micrometastases: a long-term follow-up. Lancet 1999;354:197-202. 46. Untch M, Kahlert S, Funke I, Boettcher B, Konecny G, NestleKraemling G, et al. Detection of cytokeratin (CK) 18 positive cells in the bone marrow (BM) of breast cancer patients—no prediction of bad outcome. Proc Am Soc Clin Oncol 1999;18: #693a. 47. Porro G, Menard S, Tagliabne E, Orefice S, Salvadori B, Squicciarini P, et al. Monoclonal antibody detection of carcinoma cells in bone marrow biopsy specimens from breast cancer patients. Cancer 1988;61:2407-2411. 48. Singletary SE, Larry L, Tucker SL, Spitzer G.
Detection of
micrometastatic tumor cells in bone marrow of breast carcinoma patients.J Surg Oncol 1991;47:32-6. 49. Salvadori B, Squicciarini P, Rovini D, Orefice S, Andreola S, Rilke F, et al. Use of monoclonal antibody MBr1 to detect micrometastases in bone marrow specimens of breast cancer patients. Eur J Cancer 1990;26:865-867. 50. Kirk SJ, Cooper GG, Hoper M, Watt PC, Roy AD, Odling-Smee W. The prognostic significance of marrow micrometastases in women with early breast cancer. Eur J Cancer 1990;16:481-485. 51. Funke I, Schraut W. Meta-analysis of studies on bone marrow micrometastases: an independent prognostic impact remains to be substantiated. J Clin Oncol 1998;16:557-566. 52. Coombes RC, Berger U, Mansi J, Redding H, Powles TJ, Neville AM, et al. Prognostic significance of micrometastases in bone marrow in patients with primary breast cancer. NCI Monogr 1986; 1: 51-53. 53. Schlimok G, Funke I, Holzmann B, Gottlinger G, Schmidt G, Hauser H, et al. Micrometastatic cancer cells in bone marrow: in-vitro detection with anti-cytokertatin and in vivo labeling with anti-17-1A monoclonal antibodies. Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84: 86728676.
75
54. Dearnaley DP, Ormerod MG, Sloane JP. Micrometastases in breast cancer: long-term follow-up of the first patient cohort. Eur J Cancer 1991; 27: 236-239. 55. Molino A, Pelosi G,Turazza M, Sperotto L, Bonetti A, Nortilli R, et al. Bone marrow micrometastases in 109 breast cancer patients: correlations with clinical and pathological features and prognosis. Breast Cancer Res Treat 1997; 42: 23-30. 56. Landys K, Person S, Kovarik J, Hultborn R, Holmberg E. Prognostic value of bone marrow biopsy in operable breast cancer patients at the time of initial diagnosis: results of a 20-year median follow-up. Breast Cancer Res Treat 1998;49:27-33. 57. Wiedswang G, Borgen E, Karesen R, Kvalheim G, Nesland JM, Qvist H, et al. Detection of isolated tumor cells in bone marrow is an independent prognostic factor in breast cancer. J Clin Oncol 2003;21:3469–3478. 58. Courtemanche DJ, Worth AJ, Coupland RW, Rowell JL, MacFarlane JK. Monoclonal antibody LICR-LON-M8 does not predict the outcome of operable breast cancer. Can J Surg 1991;34:21–26. 59. Funke I, Fries S, Rolle M, Heiss MM, Untch M, Bohmert H, et al. Comparative analyses of bone marrow micrometastases in breast and gastric cancer. Int J Cancer 1996;65:755–761. 60. Gerber B, Krause A, Muller H, Richter D, Reimer T, Makovitzky J, et al. Simultaneous immunohistochemical detection of tumor cells in lymph nodes and bone marrow aspirates in breast cancer and its correlation with other prognostic factors. J Clin Oncol 2001;19:960– 971. 61. Janni W, Rack B, Schindelbeck C, Strobl B, Rjosk D, Braun S, et al. The persistence of isolated tumor cells in bone marrow from patients with breast carcinoma predicts an increased risk for recurrence. Cancer 2005; 103: 884-91. 62. Pierga JY, Bonneton C, Vincent-Salomon A, de Cremoux P, Nos C, Blin N, et al. Clinical significance of immunocytochemical detection
76
of tumor cells usány digital microscopy in peripheral blood and bone marrow of breast cancor patients. Clin Cancer Res 2004;10:1392400. 63. Janni W, Hepp F, Rjosk D, Kentenich C, Strobl B, Schindlbeck C, et al. The fate and prognostic value of occult metastatic cells in the bone marrow of patients with breast carcinoma between primary treatment and recurrence. Cancer 2001;92:46-53. 64. Kasimir-Bauer S, Oberhoff C, Sliwinska K, Neumann R, Schindler AE, Seeber S. Evaluation of different methods for the detection of minimal residual disease in blood and bone marrow of patients with primary breast cancer: importance for clinical use? Breast Cancer Res Treat. 2001;69:123-32. 65. Ashworth TR. A case of cancer in which cells similar to those in the tumours were seen in the blood after death. Australian Med J 1869; 14: 146. 66. Engel HC. Cancer Cells in the circulating blood. Acta Chir Scand 1955; Suppl 201:1-70. 67. Christopherson W. Cancer cells in the peripheral blood: a second look. Acta Cytol 1965, 9:169-74. 68. Redding
WH,
Coombes
RC,
Monaghan
P.
Detection
of
micrometastases in patients with primary breast cancer. Lancet 1983;2:1271-73. 69. Gaforio JJ, Serrano MJ, Sanchez-Rovira P, Sirvent A, DelgadoRodriguez M, Campos M, et al. Detection of breast cancer cells in the peripheral blood is positively correlated with estrogen-receptor status and predicts for poor prognosis. Int J Cancer. 2003;107:98490. 70. Wiedswang G, Borgen E, Schirmer C, Karesen R, Kvalheim G, Nesland JM, et al. Comparison of the clinical significance of occult tumor cells in blood and bone marrow in breast cancer. Int J Cancer 2005 Nov 14; [Epub ahead of print].
77
71. Beitsch PD, Clifford E. Detection of Carcinoma Cell in the blood of breast cancer patients. Am J Surg 2000, 180: 446-9. 72. Schoenfeld A, Kruger KH, Gomm J, Sinnett HD, Gazet JC, Sacks N, et al. The detection of micrometastases in the peripheral blood and bone
marrow
of
patients
with
breast
cancer
using
immunohistochemistry and reverse transcriptase polymerase chain reaction for keratin 19. Eur J Cancer 1997;33:854-61. 73. Lopez-Guerrero JA, Gilabert PB, Gonzalez EB, Sanz Alonso MA, Perez JP, Talens AS, et al. Use of reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) for carcinoembryonic antigen, cytokeratin 19, and maspin in the detection of tumor cells in leukapheresis products from
patients
with
breast
cancer:
comparison
with
immunocytochemistry. J Hematother 1999;8:53-61. 74. Apostolikas N, Petraki C, Agnantis NJ. The reliability of histologically negative axillary lymph nodes in breast cancer. Preliminary report. Pathol Res Pract 1988;184:35-8. 75. Neville AM, Price KN, Gelber RD, Goldhirsch A.
Axillary node
micrometastases and breast cancer. Lancet 1991;337:1110. 76. Hainsworth PJ, Tjandra JJ, Stillwell RG, Machet D, Henderson MA, Rennie GC, et al. Detection and significance of occult metastases in node-negative breast cancer. Br J Surg 1993;80:459-63. 77. Neville AM. Breast cancer micrometastases in lymph nodes and bone marrow are prognostically important. Ann Oncol 1991;2:13-4. 78. Neville AM. Prognostic factors Diagn Oncol 1991;1:55-57. 79. Fisher ER, Swamidoss S, Lee CH, Rockette H, Redmond C, Fisher B. Detection and significance of occult axillary node metastases in patients with invasive breast cancer. Cancer 1978;42:2025-31. 80. Pickern JW. Significance of occult metastases. A study of breast cancer. Cancer 1961;14:1266-71. 81. Wilkinson EJ, Hause LL, Hoffman RG, Kuzma JF, Rothwell DJ, Donegan WL, et al. Occult axillary lymph node metastases in
78
invasive breast carcinoma: characteristics of the primary tumor and significance of the metastases. Pathol Ann 1982;17:67-91. 82. Elson CE, Kufe D, Johnston WW. Immunohistochemical detection and significance of axillary lymph node micrometastases in breast carcinoma.
A
study
of
97
cases.
Anal
Quant
Cytol
Histol
1993;15:171-8. 83. Byrne J, Waldron R, McAvinchey D, Dervan P. The use of monoclonal antibodies for the histopathological detection of mammary axillary micrometastases. Eur J Surg Oncol 1987;13:409-11. 84. Bussolati G, Gugliotta P, Morra I, Pietribiasi F, Berardengo E. The immunohistochemical detection of lymph node metastases from infiltrating lobular carcinoma of the breast.Br J Cancer 1986;54:6316. 85. Ludwig
Institute,
International
Breast
Cancer
Study
Group:
Prognostic importance of occult lymph node micrometastases from breast cancers. Lancet 1990;335:1565–1568. 86. de Mascarel I, Bonichon F, Coindre JM, Trojani M. Prognostic significance of breast cancer axillary lymph node micrometastases assessed by two special techniques: reevaluation with longer followup. Br J Cancer 1992;66:523-7. 87. Cote RJ, Chaiwun B, Qu J. Prognostic importance of occult lymph node metastases in patients with breast cancer. Proc Am Assoc Cancer Res 1992;33:202. 88. Trojani M, de Mascarel I, Bonichon F, Coindre JM, Delsol G. Micrometastases to axillary lymph nodes from carcinoma of breast: detection by immunohistochemistry and prognostic significance. Br J Cancer 1987;55:303-6. 89. Cote RJ, Peterson HF, Chaiwun B, Gelber RD, Goldhirsch A, Castiglione-Gertsch M, et al. Role of immunohistochemical detection of lymph-node metastases in management of breast cancer. Lancet 1999;354:896–900.
79
90. Dowlatshahi K, Fan M, Anderson JM, Bloom KJ. Occult metastases in sentinel nodes of 200 patients with operable breast cancer. Ann Surg Oncol 2001;8:675-682. 91. Nasser IA, Lee AKC, Bosari S, Saganich R, Heatley G, Silverman ML. Occult axillary lymph node metastases in “node-negative” breast carcinoma. Hum Pathol 1993;24:950–957. 92. McGuckin MA, Cummings MC, Walsh MD, Walsh MD, Hohn BG, Bennett IC, et al. Occult axillary node metastases in breast cancer: their detection and prognostic significance. Br J Cancer 1996;73:88– 95. 93. Gerber B, Krause A, Muller H, Richter D, Reimer T, Makovitzky J, et al. Simultaneous immunohistochemical detection of tumor cells in lymph nodes and bone marrow aspirates in breast cancer and its correlation with other prognostic factors. J Clin Oncol 2001;19:960– 971. 94. Braun S, Cevatli BS, Assemi C, Janni W, Kentenich CR, Schindlbeck C, et al. Comparative analysis of micrometastasis to the bone marrow and lymph nodes of nodenegative breast cancer patients receiving no adjuvant therapy. J Clin Oncol 2001;19:1468–1475 95. Brown M, Wittwer C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem 2000; 46: 1221-1229. 96. Gross HJ, Verwer B, Houck D, Hoffman RA, Recktenwald D, et al. Model study detecting breast cancer cells in peripheral blood mononuclear cells at frequencies as low as 10-7. Proc Natl Acad Sci U S A 1995;92:537–541. 97. Leslie DS, Johnston WW, Daly L, Ring DB, Shpall EJ, Peters WP, et al: Detection of breast carcinoma cells in human bone marrow using fluorescent-activated cell sorting and conventional cytology. Am J Clin Pathol 1990;94:8–13. 98. Vredenburgh JJ, Silva O, Tyer C, DeSombre K, Abou-Ghalia A, Cook M,
et
al.
A
comparison
of
immunohistochemistry,
two-color
immunofluorescence, and flow cytometry with cell sorting for the
80
detection of micrometastatic breast cancer in the bone marrow. J Hematother 1996;5:57–62. 99. Wingren S, Guerrieri C, Franlund B, Stal O. Loss of cytokeratins in breast cancer cells using multiparameter DNA flow cytometry is related to both cellular factors and preparation procedure. Anal Cell Pathol 1995;9:229–233. 100.
Reed DN, Johnson J, Richard P, McCormick S, Shannon N,
Mikhail RA, et al. DNA flow cytometry does not predict 5- or 10-year recurrence rates for T1-2 node –negative breast cancer. Arch Surg 2000; 132: 1422-6. 101.
Leslie DS, Johnston WW, Daly L, Ring DB, Shpall EJ. Detection
of breast carcinoma cells in human bone marrow using fluoroscentactivated cell sorting and conventional cytology. Am J Clin Pathol 1990; 94: 8-13. 102.
Martinez-Arribas F, Nunez MJ, Piqueras V, Lucas AR, Sanchez
J, Tejerina A, et al. Flow cytometry vs. Ki67 labelling index in breast cancer: a prospective evaluation of 181 cases. Anticancer Res 2002;22:295-8. 103.
Baeten CI, Wagstaff J, Verhoeven IC, Hillen HF, Griffioen AW.
Flow cytometric quantification of tumour endothelial cells; an objective alternative for microvessel density assessment. Br J Cancer 2002;87:344-7. 104.
Rupa JD, de Bruine AP, Gerbers AJ, Leers MP, Nap M, Kessels
AG, et al. Simultaneous detection of apoptosis and proliferation in colorectal carcinoma by multiparameter flow cytometry allows separation of high and low-turnover tumors with distinct clinical outcome. Cancer 2003;97:2404-11. 105.
Tsavellas G, Huang A, McCullough T, Patel H, Araia R, Allen-
Mersh TG. Flow cytometry correlates with RT-PCR for detection of spiked but not circulating colorectal cancer cells. Clin Exp Metastasis 2002;19:495-502.
81
106.
Post C, Christensen IJ, Flyger H, Christiansen J, Larsen JK.
Flow cytometric bivariate analysis of DNA and cytokeratin in colorectal cancer. Anal Cell Pathol 2002;24:113-24. 107.
Wimberger P, Hillemanns P, Kapsner T, Hepp H, Kimmig R.
Evaluation of prognostic factors following flow-cytometric DNA analysis after cytokeratin labelling: I. Breast cancer. Anal Cell Pathol 2002;24:135-45. 108.
Leers MP, Schoffelen RH, Hoop JG, Theunissen PH, Oosterhuis
JW, vd Bijl H, et al. Multiparameter flow cytometry as a tool for the detection of micrometastatic tumour cells in the sentinel lymph node procedure of patients with Brest cancer. J Clin Pathol 2002;55:35966. 109.
Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mulis KB, Horn GT, Erlich HA, et
al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic seqeunces and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 1985; 230: 1350-4. 110.
Lacroix J, Doeberitz MK. Technical aspects of minimal residual
disease
detection
in
carcinoma
patients.Semin
Surg
Oncol.
2001;20:252-64. 111. R.
Zigeuner RE, Riesenberg R, Pohla H, Hofstetter A, Oberneder Immunomagnetic cell enrichment detects more disseminated
cancer
cells
than
immunocytochemistry
in
vitro.
J
Urol
2000;164:1834-7. 112.
Martin VM, Siewert C, Scharl A, Harms T, Heinze R, Ohl S, et
al. Immunomagnetic enrichment of disseminated epithelial tumor cells from peripheral blood by MACS. Exp Hematol 1998;26:252-64. 113.
Siewert C, Herber M, Hunzelmann N, Fodstad O, Miltenyi S,
Assenmacher M, et al. Rapid enrichment and detection of melanoma cells from peripheral blood mononuclear cells by a new assay combining immunomagnetic cell sorting and immunocytochemical staining. Recent Results Cancer Res. 2001;158:51-60.
82
114.
Peck K, Sher YP, Shih JY, Roffler SR, Wu CW, Yang PC.
Detection
and quantitation of circulating cancer cells in
the
peripheral blood of lung cancer patients. Cancer Res 1998;58:27615. 115.
Florell SR, Coffin CM, Holden JA, Zimmermann JW, Gerwels
JW, Summers BK, et al. Preservation of RNA for functional genomic studies: a multidisciplinary tumor bank protocol. Mod Pathol 2001;14:116-28. 116.
Cooper DN, Berg LP, Kakkar VV, Reiss J. Ectopic (illegitimate)
transcription: new possibilities for the analysis and diagnosis of human genetic disease. Ann Med 1994;26:9–14. 117.
Chelly J, Concordet JP, Kaplan JC, Kahn A. Illegitimate
transcription: transcription of any gene in any cell type. Proc Natl Acad Sci U S A 1989; 86: 2617-21. 118.
Jung R, Kruger W, Hosch S, Holweg M, Kroger N, Gutensohn
K, et al. Specificity of reverse transcriptase polymerase chain reaction assays designed for the detection of circulating cancer cells is influenced by cytokines in vivo and in vitro.Br J Cancer. 1998;78:1194-8.. 119.
Mighell AJ, Smith NR, Robinson PA, Markham AF. Vertebrate
pseudogenes. FEBS Lett 2000; 468: 109-114 120.
Beutler E, Gelbart T, Kuhl W. Interface of heparin with the
polymerase chain reaction. Biotechniques 1990; 9: 166 121.
Holodniy M, Kim S, Katzenstein D, Konrad M, Groves E,
Merigan TC. Inhibition of human immunodeficiency virus gene amplification by heparin. J Clin Microbiol 1991; 29: 676-9 122.
Datta YH, Adams PT, Drobyski WR, Ethier SP, Terry VH, Roth
MS. Sensitive detection of occult breast cancer by the reversetranscriptase polymerase chain reaction. J Clin Oncol 1994;12:475– 482. 123.
Ikeda N, Miyoshi Y, Motomura K, Inaji H, Koyama H, Noguchi
S. Prognostic significance of occult bone marrow micrometastases of
83
breast cancer detected by quantitative polymerase chain reaction for cytokeratin 19 mRNA. Jpn J Cancer Res 2000; 91: 918-24. 124.
Fields KK, Elfenbein GJ, Trudeau WL, Perkins JB, Janssen WE,
Moscinski LC et al. Clinical significance of bone marrow metastases as detected using the polymerase chain reaction in patients with breast cancer undergoing high-dose chemotherapy and autologous bone marrow transplantation. J Clin Oncol 1996;14:1868–76. 125.
Vannucchi AM, Bosi A, Glinz S, Pacini P, Linari S, Saccardi R, et
al. Evaluation of breast tumour cell contamination in the bone marrow and leukapheresis collections by RTPCR for cytokeratin-19 mRNA. Br J Haematol 1998;103:610–617. 126.
Jung YS, Lee KJ, Kim HJ, Yim HE, Park JS, Soh EY, et al..
Clinical significance of bone marrow micrometastasis detected by nested RT-PCR for keratin-19 in breast cancer patients. Jpn J Clin Oncol; 33: 167-72, 2003. 127.
Ooka M, Tamaki Y, Sakita I, Fujiwara Y, Yamamoto H, Miyake
Y, et al. Bone marrow micrometastases detected by RT-PCR for mammaglobin can be an alternative prognostic factor of breast cancer. Breast Cancer Res and Treat 2001; 67: 169-175. 128.
Mighell AJ, Smith NR, Robinson PA, Markham AF. Vertebrate
pseudogenes. FEBS Lett 2000; 468: 109-114 129.
Krismann M, Todt B, Schroder J, Gareis D, Muller KM, Seeber
S, etv al. Low specificity of cytokeratin 19 reverse transcriptase polymerase chain reaction analysis for detection of hematogenous lung cancer dissemination. J Clin Oncol 1995; 13: 2769-2775. 130.
Burchill SA, Bradbury MF, Pittman K, Southgate J, Smith B,
Selby P. Detection of epithelial cancer cells in peripheral blood by reverse
transcriptase-polymerase
chain
reaction.
Br
J
Cancer
1995;71:278-81. 131.
Ruud P, Fodstad O, Hovig E. Identification of a novel
cytokeratin-19
pseudogene
that
may
interfere
with
reverse
84
transcriptase-polymerase chain reaction assays used to detect micrometastatic tumor cells. Int J Cancer 1999;80:119–25 132.
Aihara T, Noguchi S, Ishikawa O, Furukawa H, Hiratsuka M,
Ohigashi H, et al. Detection of pancreatic and gastric cancer cells in peripheral and portal blood by amplification of keratin 19 mRNA with reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Int J Cancer. 1997;72:408-11. 133.
Gerhard M, Juhl H, Kalthoff H, Schreiber HW, Wagener C,
Neumaier
M.
Specific
detection
of
carcinoembryonic
antigen-
expressing tumour cells in bone marrow aspirates by polymerase chain reaction. J Clin Oncol 1994; 12:725-29. 134.
Zhong XY, Kaul S, Thompson J, Eichler A, Bastert G.
Evaluation of the reverse transcriptase/polymerase chain reaction for carcinoembryonic antigen for the detection of breast cancer dissemination in bone marrow and peripheral blood. J Cancer Res Clin Oncol 1999;125:669-74. 135.
Berois N, Varangot M, Sonora C, Zarantonelli L, Pressa C,
Lavina R, et al. Detection of bone marrow-disseminated breast cancer cells using an RT-PCR assay of MUC5B mRNA. Int J Cancer 2003;103:550-5. 136.
Janku F, Korinkova G, Srovnal J, Kleibl Z, Novotny J,
Petruzelka L, et al. Detection of Brest cancer cells in the bone marrow of early breast cancer patients using a quantitative RT PCR for CEA. J Clin Oncol 2005 ;23, No 16S (June 1 Supplement): 9638 (abstract). 137.
Janku F, Kleibl Z, Novotny J, Tesarova P, Petruzelka L, Matous
B. Mammaglobin A, a novel marker of minimal residual disease in early stages breast cancer. Neoplasma. 2004; 51:204-8. 138.
Mapara MY, Körner IJ, Hildebrandt M, Bargou R, Krahl D,
Reichardt P, et al. Monitoring of tumor cell purging after highly efficient immunomagnetic selection of CD34 cells from leukapheresis products
in
breast
cancer
patients:
comparison
of
85
immunocytochemical tumor cell staining and reverse transcriptasepolymerase chain reaction. Blood 1997;89:337–344. 139.
Stathopoulou A, Vlachonikolis I, Mavroudis D, Perraki M,
Kouroussis
Ch,
Apostolaki
S,
et
al.
Molecular
detection
of
cytokeratin-19-positive cells in the peripheral blood of patients with operable breast cancer: evaluation of their prognostic significance. J Clin Oncol 2002;20:3404-12. 140.
Masuda TA, Kataoka A, Ohno S, Murakami S, Mimori K,
Utsunomiya T, et al. Detection of occult cancer cells in peripheral blood
and
bone
marrow
by
quantitative
RT-PCR
assay
for
cytokeratin-7 in breast cancer patients. Int J Oncol. 2005;26:72130. 141.
Berois N, Varangot M, Aizen B, Estrugo R, Zarantonelli L,
Fernandez P, et al. Molecular detection of cancer cells in bone marrow and peripheral blood of patients with operable breast cancer. Comparison of CK19, MUC1 and CEA usány RT-PCR. Eur J Cancer 2000;36:717-23. 142.
Bossolasco P, Ricci C, Farina G, Soligo D, Pedretti D, Scanni A,
et al. Detection of micrometastatic cells in breast cancer by RT-pCR for the mammaglobin gene. Cancer Detect Prev. 2002;26:60-3. 143.
Kahn HJ, Yang LY, Blondal J, Lickley L, Holloway C, Hanna W,
et al. RT-PCR amplification of CK19 mRNA in the blood of breast cancer
patients:
correlation
with
established
prognostic
parameters.Breast Cancer Res Treat 2000;60:143-51. 144.
Lopez-Guerrero
JA,
Bolufer-Gilabert
P,
Sanz-Alonso
M,
Barragan-Gonzalez E, Palau-Perez J, De la Rubia-Comos J, et al. Minimal
illegitimate
levels
of
cytokeratin
K19
expression
in
mononucleated blood cells detected by a reverse transcription PCR method (RT-PCR). Clin Chim Acta. 1997;263:105-16. 145.
Bae JW, Choi KH, Kim HG, Park SH. The detection of
circulating breast cancer cells in peripheral blood by reverse
86
transcriptase-polymerase
chain
reaction.
J
Korean
Med
Sci
2000;15:194-198. 146.
Jotsuka T, Okumura Y, Nakano S, Nitta H, Sato T, Miyachi M,
et al. Persistent evidence of circulating tumour cells detected by means
of
prospective
RT-PCR study
for
CEA
mRNA
predicts
in
node-negative
brest
early
relapse:
cancer.
a
Surgery
2004;135:419-26. 147.
Zach O, Kasparu H, Krieger O, Hehenwarter W, Girschikofsky
M, Lutz D. Detection of circulating mammary carcinoma cells in the peripheral blood of breast cancer patients via a nested reverse transcriptase polymerase chain reaction assay for mammaglobin mRNA. J Clin Oncol 1999;17:2015–2019 148.
Silva AL, Tome MJ, Correia AE, Passos-Coelho JL. Human
mammaglobin RT-PCR assay for detection of occult breast cancer cells in hematopoietic products. Ann Oncol 2002;13:422-429. 149.
Silva JM, Dominguez G, Silva J, Garcia JM, Sanchez A,
Rodriguez O, et al. Detection of epithelial messenger RNA in the plasma of breast cancer patiens is associated with poor prognosis tumor characteristics. Clin Cancer Res 2001;7:2821-5. 150.
Taback B, Chan AD, Kuo CT, Bostick PJ, Wang HJ, Giuliano AE,
et al. Deetection of occult metastatic breast cancer in blood by multimolecular marker assay: correůation with clinical stage of disease. Cancer Res 2001; 61: 8845-50. 151.
Stathopoulou A, Gizi A, Perraki M, Apostolaki S, Malamos N,
Mavroudis D, et al. Real-time quantification of CK-19 mRNA-positive cells in peripheral blood of breast cancer patients using the lightcycler system. Clin Cancer Res. 2003; 9:5145-51. 152.
Lin YC, Chen SC, Hsueh S, Lo YF, Chow-Wu YH, Liaw IC, et al.
Lack of correlation between expression of human mammaglobin mRNA in peripheral blood and known prognostic factors for breast cancer patients. Cancer Sci 2003;94:99-102.
87
153.
Lin YC, Wu Chou YH, Liao IC, Cheng AJ. The expression of
mammaglobin mRNA in peripheral blood of metastatic Brest cancer patients as an adjunct to serum tumor markers. Cancer Lett 2003;191:93-9. 154.
Grunewald K, Haun M, Urbanek M, Fiegl M, Muller-Holzner E,
Gunsilius E, et al. Mammaglobin gene expression: a superior marker of breast cancer cells in peripheral blood in comparison to epidermal-growth-factor receptor and cytokeratin-19. Lab Invest 2000;80:1071-7. 155.
Schroder CP, Ruiters MH, de Jong S, Tiebosch AT, Wesseling J,
Veenstra R, et al. Detection of micrometastatic breast cancer by means of real time quantitative RT-PCR and immunostaining in perioperative blood samples and sentinel nodes.
Int J Cancer
2003;106:611-8. 156.
Noguchi S, Aihara T, Nakamori S, Motomura K, Inaji H,
Imaoka S, et al. The detection of breast carcinoma micrometastases in
axillary lymph nodes by means of reverse transcriptase-
polymerase chain reaction. Cancer 1994;74:1595-600. 157.
Mori M, Mimori K, Inoue H, Barnard GF, Tsuji K, Nanbara S, et
al. Detection of cancer micrometastases in lymph nodes by reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Cancer Res 1995;55:341720. 158.
Schoenfeld A, Luqmani Y, Smith D, O'Reilly S, Shousha S,
Sinnett HD, et al. Detection of breast cancer micrometastases in axillary lymph nodes by usány polymerase chain reaction.Cancer Res. 1994 Jun 1;54(11):2986-90. 159.
Luppi M, Morselli M, Bandieri E, Federico M, Marasca R, Barozzi
P, et al. Sensitive detection of circulating breast cancer cells by reverse-transcriptase polymerase chain reaction of maspin gene. Ann Oncol 1996;7:619-24. 160.
Amoils KD, Seymour L, Bezwoda WR. Comparison between
immunocytochemical and polymerase chain reaction techniques for
88
detection of oestrogen receptor and transforming growth factor beta in breast cancer.Br J Cancer 1996;73:1255-9. 161.
Min CJ, Tafra L, Verbanac KM. Identification of superior
markers for polymerase chain reaction detection of breast cancer metastases in sentinel lymph nodes. Cancer Res 1998;58:4581-4. 162.
Marchetti A, Buttitta F, Bertacca G, Zavaglia K, Bevilacqua G,
Angelucci
D,
metastases:
et
al.
mRNA
comparison
markers
of
between
breast
cancer
mammaglobin
nodal and
carcinoembryonic antigen in 248 patients. J Pathol 2001;195:18690. 163.
Mitas M, Mikhitarian K, Walters C, Baron PL, Elliott BM,
Brothers TE, et al. Quantitative real-time RT-PCR detection of breast cancer micrometastasis using a multigene marker panel. Int J Cancer 2001;93:162-71. 164.
Pantel K, Schlimok G, Angstwurm M, Weckermann D, Schmaus
W, Gath H, et al. Methodological analysis of immunocytochemical screening for disseminated epithelial tumor cells in bone marrow. J Hematother 1994;3:165-73. 165.
Braun S, Muller M, Hepp F, Schlimok G, Riethmuller G, Pantel
K, et al. Re: Micrometastatic breast cancer cells in bone marrow at primary surgery: prognostic value in comparison with nodal status. J Natl Cancer Inst 1998;90:1099-101. 166.
Brugger W, Buhring HJ, Grunebach F, Vogel W, Kaul S, Muller
R, et al. Expression of MUC-1 epitopes on normal bone marrow: implications for the detection of micrometastatic tumor cells. J Clin Oncol 1999;17:1535-44. 167.
Hughes T, Janssen JW, Morgan G, Martiat P, Saglio G, Pignon
JM, et al. False-positive results with PCR to detect leukaemiaspecific transcript. Lancet 1990;335:1037-8. 168.
Kaplan JC, Kahn A, Chelly J. Illegitimate transcription: its use
in the study of inherited disease. Hum Mutat 1992;1:357-60.
89
169.
Sklar J, Costa JC. Principles of cancer management: molecular
pathology. In De Vita V, Hellman S, Rosemberg SA, eds. Cancer Principles and Practice of Oncology. 5th edn. Philadelphia, LippincotRaven, 1997, 259-284. 170.
Olsson CA, de Vries GM, Buttyan R, Katz AE. Reverse
transcriptase-polymerase chain reaction assays for prostate cancer. Urol Clin North Am 1997;24:367-78. 171.
Florell SR, Coffin CM, Holden JA, Zimmermann JW, Gerwels
JW, Summers BK, et al. Preservation of RNA for functional genomic studies: a multidisciplinary tumor bank protocol. Mod Pathol 2001;14:116-28. 172.
Braun S, Pantel K. Clinical significance of occult metastatic
cells in bone marrow of breast cancer patients. Oncologist 2001; 6:125-32. 173.
Aihara T, Fujiwara Y, Ooka M, Sakita I, Tamaki Y, Monden M.
Mammaglobin B as a novel marker for detection of breast cancer micrometastases in axillary lymph nodes by reverse transcriptionpolymerase chain reaction. Breast Cancer Res Treat 1999;58:13740. 174.
Becker RM, Darrow C, Zimonjic DB, Popescu NC, Watson MA,
Fleming TP.
Identification of mammaglobin B, a novel member of
the uteroglobin gene family. Genomics 1998;54:70-8. 175.
Watson MA, Dintzis S, Darrow CM, Voss LE, DiPersio J, Jensen
R, et al. Mammaglobin expression in primary, metastatic, and occult breast cancer. Cancer Res 1999;59:3028-31. 176.
Shively JE, Beatty JD.
biology
and
clinical
CEA-related antigens: molecular
significance.
Crit
Rev
Oncol
Hematol
1985;2:355-99. 177.
Raynor M, Stephenson SA, Walsh DC, Pittman KB, Dobrovic A.
Optimisation
of
the
RT-PCR
detection of
immunomagnetically
enriched carcinoma cells. BMC Cancer 2002;2:14.
90
178.
Merrie AE, Yun K, Gunn J, Phillips LV, McCall JL. Analysis of
potential markers for detection of submicroscopic lymph node metastases in breast cancer. Br J Cancer 1999;80:2019-24. 179.
Bostick PJ, Huynh KT, Sarantou T, Turner RR, Qi K, Giuliano
AE, et al. Detection of metastases in sentinel lymph nodes of breast cancer
patients
by
multiple-marker
RT-PCR.
Int
J
Cancer
1998;79:645-51. 180.
Eltahir EM, Mallinson DS, Birnie GD, Hagan C, George WD,
Purushotham AD. Putative markers for the detection of breast carcinoma cells in blood. Br J Cancer 1998;77:1203-7 181.
Ko Y, Klinz M, Totzke G, Gouni-Berthold I, Sachinidis A, Vetter
H. Limitations of the reverse transcription-polymerase chain reaction method for the detection of carcinoembryonic antigen-positive tumor cells in peripheral blood. Clin Cancer Res 1998;4:2141-6. 182.
de Graaf H, Maelandsmo GM, Ruud P, Forus A, Oyjord T,
Fodstad O, et al. Ectopic expression of target genes may represent an inherent limitation of RT-PCR assays used for micrometastasis detection: studies on the epithelial glycoprotein gene EGP-2. Int J Cancer 1997;72:191-6. 183.
Pantel K, Schlimok G, Braun S, Kutter D, Lindemann F,
Schaller G, et al. Differential expression of proliferation-associated molecules in individua micrometastatic carcinoma cells. J Natl Cancer Inst 1993;85:1419-24 184.
Braun S, Kentenich C, Janni W, Hepp F, de Waal J, Willgeroth
F, et al. Lack of effect of adjuvant chemotherapy on the elimination of single dormant tumor cells in bone marrow of high-risk breast cancer patients. J Clin Oncol 2000;18:80-6. 185.
Hempel D, Muller P, Oruzio D. Adoptive immunotherapy with
monoclonal antibody 17-1A to reduce minimal residual disease in breast
cancer
patients
after
high-dose
chemotherapy.
Blood
1997;90(supppl 1):4454a.
91
186.
Hohaus S, Funk L, Brehm M. Persistence of isolated tumor
cells in patients with breast cancer after sequential high-dose therapy with peripheral blood stem cell transplantation. Blood 1996;88(supppl 10):501a. 187.
Braun S, Hepp F, Kentenich CR, Janni W, Pantel K, Riethmuller
G, et al. Monoclonal antibody therapy with edrecolomab in breast cancer
patients:
monitoring
of
elimination
of
disseminated
cytokeratin-positive tumor cells in bone marrow. Clin Cancer Res 1999;5:3999-4004. 188.
Sobin LH, Wittekind Ch. Nádory prsu. In: UICC - International
Union Against Cancer TNM klasifikace zhoubných nádorů, 6. vydání 2002,
česká
verze
2004.
John
Willey
&
Sons,
Inc.;
Ústav
zdravotnických informací a statistiky České republiky, Praha, 2004: pp 111-19. 189.
Goldhirsch A, Glick JH, Gelber RD, Coates AS, Senn HJ.
Meeting highlights: International Consensus Panel on the Treatment of Primary Breast Cancer. Seventh International Conference on Adjuvant
Therapy
of
Primary
Breast
Cancer.
J
Clin
Oncol.
2001;19:3817-27. 190. Senn
Goldhirsch A, Wood WC, Gelber RD, Coates AS, Thurlimann B, HJ.
Meeting
highlights:
updated
international
expert
consensus on the primary therapy of early breast cancer. J Clin Oncol. 2003;21:3357-65 191.
Silva JM, Rodriguez R, Garcia JM, Munoz C, Silva J, Dominguez
G, et al. Detection of epithelial tumour RNA in the plasma of colon cancer patients is associated with advanced stages and circulating tumour cells. Gut. 2002;50:530-4. 192.
Silva AL, Diamond J, Silva MR, Passos-Coelho JL, et al.
Cytokeratin 20 is not a reliable molecular marker for occult breast cancer cell detection in hematological tissues. Breast Cancer Res Treat. 66:59-66, 2001.
92
193.
Bader BL, Jahn L, Franke WW. Low level expression of
cytokeratins 8, 18 and 19 in vascular smooth muscle cells of human umbilical cord and in cultured cells derived therefrom, with an analysis of the chromosomal locus containing the cytokeratin 19 gene. Eur J Cell Biol 47:300-319, 1988. 194.
Lyda MH, Tetef M, Carter NH, Ikle D, Weiss LM, Arber DA.
Keratin
immunohistochemistry
detects
clinically
significant
metastases in bone marrow biopsy specimens in women with lobular breast carcinoma. Am J Surg Pathol 2000;24:1593-9. 195.
Benoy IH, Elst H, Van der Auwera I, Van Laere S, van Dam P,
Van
Marck
E,
et
al.
Real-time
RT-PCR
correlates
with
immunocytochemistry for the detection of disseminated epithelial cells in bone marrow aspirates of patients with Brest cancer. Br J Cancer 2004;91:1813-20. 196.
Bostick PJ, Chatterjee S, Chi DD, Huynh KT, Giuliano AE, Cote
R, et al. Limitations of specific reverse-transcriptase polymerase chain reaction markers in the detection of metastases in the lymph nodes
and
blood
of
breast
cancor
patients.
J
Clin
Oncol
1998;16:2632-40. 197.
Guadagni
F,
Kantor
J,
Aloe
S,
Carone
MD,
Spila
A,
D'Alessandro R, et al. Detection of blood-borne cells in colorectal cancer patients by nested reverse transcription-polymerase chain reaction for carcinoembryonic antigen messenger RNA: longitudinal analyses and demonstration of its potential importance as an djunct to multiple serum markers. Cancer Res 2001;61:2523-32. 198.
Castaldo
Marchetiello
I,
G,
Tomaiuolo
Salvatore
F.
R,
Sanduzzi
A,
Carcinoembryonic
Ponticiello antigen
A,
mRNA
analysis detects micrometastatic cells in blood from lung cancer patients. Eur Respir J 2003;22:418-21. 199.
Ghossein RA, Bhattacharya S, Rosai J. Molecular detection of
micrometastases and circulating tumor cells in solid tumors. Clin Cancer Res 1999;5:1950-60.
93
200.
Boyle P, d’Onofrio A, Maisonneuve P et al. Measuring progress
against cancer in Europe: has the 15% decline targeted for 2000 come about? Ann Oncol 2003; 14: 1312–1325. 201.
Boyle P, Ferlay J. Cancer incidence and mortality in Europe,
2004. Ann Oncol 2005;16:481-8. 202.
Gabe
R,
Duffy
SW.
Evaluation
of
service
screening
mammography in practice: the impact on Brest cancer mortality. Ann Oncol 2005;16 Suppl 2:ii153-62. 203.
Romond EH, Perez EA, Bryant J, Suman VJ, Geyer CE Jr,
Davidson NE, et al. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive Brest cancer. N Engl J Med 2005;353:167384. 204.
Piccart-Gebhart MJ, Procter M, Leyland-Jones B, Goldhirsch A,
Untch M, Smith I, et al. Trastuzumab after adjuvant chemotherapy in HER2-positive breast cancer. N Engl J Med 2005;353:1659-72. 205.
Wedam SB, Low JA, Yang SX, Chow CK, Choyke P, Danforth D,
et al. Antiangiogenic and antitumor effects of bevacizumab in patients with inflammatory and locally advanced breast cancer. J Clin Oncol. 2006;24:769-77.
7. Poděkování Na závěr této práce bych rád vyjádřil poděkování svému školiteli, Doc. MUDr. Bohuslavu Matoušovi, CSc., za neocenitelné odborné i metodické rady, které mi umožnily zrealizovat tuto výzkumnou práci v uvedeném rozsahu. Rád bych vyjádřil poděkování Doc. MUDr. Luboši Petruželkovi, CSc., že pro mne vytvořil na Onkologické klinice VFN a 1. LF UK takové podmínky, které mi umožnily věnovat se výzkumné práci.
94
Dík
patří
také
MUDr.
Zdeňkovi
Kleiblovi,
PhD
z Ústavu
experimentální onkologie a biochemie 1.LF UK, který mi naprosto zásadním pomohl při vývoji metodiky stanovení mammaglobinu A, B a cytokeratinu 19. Doktor Kleibl mi byl zcela nezištným průvodcem a rádcem po dobu mé práce v laboratoři. Považuji za nutné vyzdvihnout pomoc MUDr. Mariána Hajdúcha, PhD a celého kolektivu Laboratoře experimentální medicíny LF UP v Olomouci za jejich významný přínos pro metodiku stanovení CEA. Zcela nezištně se na výzkumu podílela paní RNDr. Eva Matoušková, CSc. z Ústavu molekulární biologie ČAV, která nám pomohla s výzkumem možnosti využití
kultivace nádorových buněk. Současně bych rád paní
doktorce poděkoval za zapůjčení fotografií okultních nádorových buněk. Obdobnou měrou se na práci podílela prim. MUDr. Jana Vedralová, která provedla imunohistochemické vyšetření reziduální choroby ve pádových uzlinách. Z pohledu organizace klinického části výzkumu patří dík všem spolupracujícím kolegům z Onkologické kliniky VFN a 1. LF UK. Za nutné považuji jmenovitě ocenit pomoc pana MUDr. Jana Novotného, PhD, který zajistil většinu náboru pacientek. V neposlední řadě je nutné poděkovat sestrám kliniky paní Soně Mandlové a paní Daně Duškové za technickou logistickou podporu. Práce byla vytvořena s podporou grantů IGA MZ ČR „Význam
detekce
mammaglobinu
a
cytokeratinu
19
NC/6672-3
v lymfatických
uzlinách, kostní dřeni a vzorcích periferní krve při stanovení minimální reziduální choroby u pacientek s karcinomem prsu“, výzkumného záměru MŠMT MSM 11110004 „Modelové tumory dospělého věku, vznik a rozvoj molekulárně biologické, genetické a epigenetické aspekty, epidemiologie, časná
diagnostika,
léčba,
lymfoproliferativní
a
myeloidní
nádorová
onemocnění, karcinom prsu, nádory trávicího ústrojí.“, Ligy proti rakovině Praha a RASO ČOS.
95
