DE ROL VAN APOLIPOPROTEINE AI (APO AI) EN DE ATP BINDENDE CASSETTE TRANSPORTER A1 (ABCA1) BIJ HET CHOLESTEROL METABOLISME

Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen Vakgroep Biochemie Labo Lipoproteïne Chemie

DE ROL VAN APOLIPOPROTEINE AI (APO AI) EN DE ATP BINDENDE CASSETTE TRANSPORTER A1 (ABCA1) BIJ HET CHOLESTEROL METABOLISME.

Stein Roosbeek

Promotor : Prof. Dr. J. Vandekerckhove Co-Promotor : Prof. Dr. M. Rosseneu

Proefschrift voorgelegd tot het verkrijgen van de graad van doctor in de wetenschappen-biotechnologie

I. Inleiding. ...................................................................................................................6 II. De lipoproteïnen. ....................................................................................................8 1. Algemeen. .............................................................................................................8 2. Indeling van de lipoproteïnen................................................................................9 3. De apolipoproteïnen. ...........................................................................................11 3.1. De apolipoproteïnen B. ................................................................................11 3.1.1. Apolipoproteïne B-100..........................................................................11 3.2. De uitwisselbare apolipoproteïnen. .............................................................13 III. Apolipoproteïne B bevattende lipoproteïnen en het voorwaarts cholesterol transport......................................................................................................................16 1. Transport van exogeen cholesterol door de chylomicronen................................16 2. Transport van endogeen cholesterol door VLDL, IDL en LDL. ........................16 3. Het atherogeen effect van de apo B bevattende lipoproteïnen............................17 IV. HDL en het omgekeerd cholesteroltransport...................................................18 1. 2. 3. 4.

Efflux van cholesterol uit de cel..........................................................................19 Hermodellering van HDL....................................................................................21 Transport van HDL cholesterolesters naar de lever. ...........................................23 De beschermende rol van HDL...........................................................................23

V. Apolipoproteïne AI...............................................................................................24 1. 2. 3. 4.

Algemeen. ...........................................................................................................24 De strucuur van humaan apo AI..........................................................................24 Conformatie van apo AI in HDL partikels..........................................................29 Eigenschappen van het apo AI. ...........................................................................30 4.1. Lipide binding. .............................................................................................31 4.2. Activatie van LCAT. .....................................................................................31 4.3. Apo AI als ligand voor de ATP binding cassette A1 (ABCA1) transporter. 33 5. Natuurlijke mutanten van humaan apo AI. .........................................................33 VI. Het lecithine : cholesterol acyltransferase (LCAT). ........................................36 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Algemeen. ...........................................................................................................36 De enzymatische werking van het LCAT enzym................................................36 Het katalytisch mechanisme van LCAT..............................................................38 Structuur van het LCAT enzym. .........................................................................40 Substraten van LCAT..........................................................................................40 Natuurlijke mutanten van LCAT.........................................................................41

VII. De ATP-bindende cassette A1 (ABCA1) transporter. ...................................46 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

ABC transporters : algemeen. .............................................................................46 De structuur van een ABC transporter. ...............................................................47 Interactie tussen verschillende domeinen tijdens transport van het substraat.....50 Evolutie van de ABC transporters.......................................................................51 De rol van humane ABC transporters bij het lipide metabolisme.......................54 De ABCA subfamilie. .........................................................................................54 De ABCA1 transporter........................................................................................56 7.1. Algemeen. .....................................................................................................56

1

7.2. Functies van de ABCA1 transporter. ...........................................................57 7.2.1. De rol van ABCA1 bij het cholesterol transport. ...................................57 7.2.1.1. De ziekte van Tangier. ...................................................................57 7.2.1.2. Lokalisatie van de ABCA1 transporter in de cel............................59 7.2.1.3. Het mechanisme van de lipide-efflux door ABCA1. .....................60 a) De “interactie” van ABCA1 met apo AI.............................................60 b) Fosfolipiden en cholesterol. ................................................................61 7.2.1.4. Regulatie van de ABCA1 transporter.............................................62 7.2.2. ABCAI flippase activiteit, fosfolipiden en apoptose. ..........................67 VIII. Doelstelling ........................................................................................................70 IX. Drie arginine residu’s in apolipoproteïne A-I zijn belangrijk voor de activatie van lecithine:cholesterol acyltransferase. .................................................73 X. Expressie en activiteit van de Nucleotide Bindende Domeinen van de humane ABC-A1 transporter. .................................................................................................78 XI. Karakterisering van de ABCA transporter subfamilie: identificatie van prokaryote en eukaryote leden en topologie. ...........................................................82 XII. Fosforylatie door proteïne kinase CK2 moduleert de activiteit van de ATPbindende cassette A1 (ABCA1) transporter. ...........................................................86 XIII. Samenvatting en besluiten. .............................................................................91 XIV. English summary. ............................................................................................95 XV. Referentielijst.....................................................................................................99

2

Gebruikte afkortingen.

ABC ACAT ALDR Apo ATP CAMP CE CETP CFTR CK2 CM DAG DMPC DNA DPPC FED FHD FL FLD GFP HBP HDL HisP HL HTGL IDL IFN-γ LCAT LDL LPL LRP LXR MDR mRNA MSD NBD NMR PA PAF PC PE PEST PI PIP PIP2

ATP-bindende cassette acyl : coenzymeA acyltransferase adrenoleukodystrophy-related gene apolipoproteïne adenosine trifosfaat cyclisch adenosine monofosfaat cholesterolester cholesterolester transfer proteïne cystic fibrosis transmembrane regulator caseine kinase 2 chylomicronen diacylglycerol dimyristoyl fosfatidylcholine desoxyribonucleïnezuur dipalmitoyl fosfatidylcholine Fish Eye Disease Familiale HDL Deficiëntie fosfolipide Familiale LCAT Deficiëntie green fluorescent protein HDL bindend proteïne hoge densiteits lipoproteïnen histidine permease hepatisch lipase hepatisch triglyceride lipase intermediaire densiteits lipoproteïnen interferon-gamma lecithine cholesterol acyltransferase lage densiteits lipoproteïnen lipoproteïne lipase LDL receptor related proteïne lever X receptor multidrug resistentie messenger ribonucleïnezuur membraan overspannend domein nucleotide bindend domein nucleaire magnetische resonantie fosfatidylzuur platelet activating factor fosfatidylcholine fosfatidylethanolamine peptide sequentie zeer rijk aan proline (P), glutaminezuur (E), serine (S) en threonine (T) residu’s fosfatidylinositol fosfatidylinositol 4-fosfaat fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat

3

PKA PKC PLTP POPC PS R-domein RHDL RXR SCD SDS-PAGE SM SR-BI TG VC VLDL WT

proteïne kinase A proteïne kinase C fosfolipide transfer proteïne palmitoyloleoyl fosfatidylcholine fosfatidylserine regulerend domein gereconstrueerde HDL partikels retinoid X receptor stearyol CoA desaturase natrium dodecyl sulfaat polyacrylamide gelelektroforese sfingomyeline scavenger receptor BI triglyceride vrij cholesterol zeer lage densiteits lipoproteïnen wild type

4

Inleiding

5

I. Inleiding. Cardiovasculaire aandoeningen als gevolg van atherosclerose zijn nog steeds de belangrijkste doodsoorzaak in de geïndustrialiseerde landen. Een teveel aan plasma cholesterol zorgt voor de accumulatie van cholesterol aan de binnenwand

van

de

bloedvaten

hetgeen

resulteert

in

de

vorming

van

atherosclerotische letsels die voornamelijk bestaan uit cholesterol, cholesterol esters, macrofagen en later collageen.

De belangrijkste risicofactoren voor de ontwikkeling van atherosclerose zijn een verhoogd

cholesterolgehalte

in

de

lage

densiteits

lipoproteïnen

(LDL),

hyperlipidemie, roken en overgewicht. Het cholesterolgehalte in de hoge densiteits lipoproteïnen (HDL) vertoont echter een inverse correlatie met het risico op hartziekten. Dit kan toegeschreven worden aan de beschermende rol van de HDL in het ‘omgekeerd cholesterol transport’ waarbij een teveel aan cholesterol in de perifere weefsels voor afbraak naar de lever getransporteerd wordt (Gordon et al., 1977; Miller, 1980).

Efflux van cholesterol uit de perifere cellen is de eerste stap in het ‘omgekeerd cholesterol transport’. Deze cellulaire efflux kan enerzijds gebeuren door een niet selectieve diffusie van membraancholesterol gevolgd door incorporatie in HDL partikels (Phillips et al., 1987; Johnson et al., 1991).

Anderzijds kan de efflux

gebeuren door actief transport van intracellulair cholesterol op een selectieve apolipoproteïne-gemedieerde manier. Fosfolipiden en cholesterol worden door de ATP-bindende

cassette

A1

(ABCA1)

transporter

naar

het

celoppervlak

getransporteerd en door apolipoproteïne AI (apo AI) gebonden. Dit resulteert in de vorming van nieuwe HDL precursoren (Hara et al., 1991; Hara et al., 1992).

In deze HDL precursoren wordt vervolgens vrij cholesterol veresterd door het plasma enzyme lecithine cholesterol acyltransferase (LCAT) waardoor matuur HDL gevormd wordt. LCAT speelt dus, samen met zijn belangrijkste activator, het apo AI (Fielding et al., 1972), een belangrijke rol in het metabolisme van de HDL en in het ‘omgekeerd cholesterol transport’.

6

In dit werk hebben wij de gecombineerde rol van apo AI als cholesterol acceptor en LCAT activator, samen met de rol van de ABCA1 transporter bestudeerd, in het bijzonder in het kader van het ‘omgekeerd cholesterol transport’ en van de beschermende rol van HDL bij atherosclerose.

7

II. De lipoproteïnen. 1. Algemeen.

Lipiden spelen een belangrijke rol in het lichaam. Fosfolipiden en cholesterol zijn essentiële bouwstenen van de celmembraan. Cholesterol is eveneens een precursor voor steroïdhormonen, galzouten en vitamine D. Triglyceriden zijn noodzakelijk als bron van energie. In het plasma worden deze hydrofobe lipiden getransporteerd door wateroplosbare lipoproteïnen.

Lipoproteïnen zijn sferische partikels opgebouwd uit lipiden en

apolipoproteïnen.

De buitenste laag van deze complexen bestaat uit amfifiele

fosfolipiden, vrij cholesterol en apolipoproteïnen, en omringt een hydrofobe kern bestaande uit neutrale lipiden (cholesterolesters en triglyceriden). De hydrofobe zijde van de amfifiele componenten is gericht naar de hydrofobe kern van het partikel, terwijl de hydrofiele zijde naar de waterige fase gericht is (Figuur 1). Onder invloed van lipolytische enzymen en lipide transporteiwitten treedt een continue uitwisseling van de lipide- en eiwitcomponenten op tussen de verschillende lipoproteïne-klassen.

Figuur 1 : Schematische voorstelling van een lipoproteïne partikel.

8

2. Indeling van de lipoproteïnen.

Lipoproteïnen worden meestal ingedeeld op basis van hun densiteitsverschillen, waarop hun scheiding via ultracentrifugatie gebaseerd is (Havel et al., 1955) . De densiteit wordt bepaald door de lipide/proteïne verhouding en varieert tussen <0.95 en 1.21 g/ml. In Tabel 1 worden de fysicochemische eigenschappen, de samenstelling en de functie van de verschillende lipoproteïnen samengevat.

Chylomicronen worden gesynthetiseerd in de darm en transporteren de exogene lipiden naar de lever en de perifere weefsels. Ze bestaan uit meer dan 95% lipiden (vnl. triglyceriden) en worden zeer snel gekataboliseerd.

VLDL (zeer lage densiteits lipoproteïnen) worden gevormd in de lever en bestaan voor 90% uit lipiden (vnl. triglyceriden). Ze zorgen voor het transport van endogene triglyceriden vanuit de lever naar de perifere weefsels.

IDL (intermediaire densiteits lipoproteïnen) worden gevormd uit de VLDL door hydrolyse van hun triglyceriden door het lipoproteïne lipase (LPL) en het hepatisch lipase (HL).

LDL (lage densiteits lipoproteïnen) worden door verdere hydrolyse gevormd uit IDL en bestaan voor 75% uit lipiden (vnl. cholesterolesters).

HDL (hoge densiteits lipoproteïnen) zijn de kleinste lipoproteïne-partikels en bevatten 50% lipiden en 50% proteïnen. Ze transporteren lipiden (vnl. cholesterol) vanuit de perifere weefsels naar de lever. HDL zijn een heterogene verzameling van lipoproteïne partikels waarbij nascente HDL schijfvormig zijn, terwijl mature HDL sferische partikels zijn.

Lipoproteïnen kunnen eveneens ingedeeld worden op basis van hun electroforetische mobiliteit (α, β, pre-β of γ) of op basis van hun apolipoproteïne samenstelling.

9

Densiteit (g/ml) Elektroforetische mobiliteit Molecuulmassa (Da) Diameter (nm) % Lipide 0.4-30 x 109 75-1200 98-99

< 0.95 -

50-65 4-8 12-22 12-18 5-10

10-80 x 106 30-80 90-95

0.95-1.006 pre-β

VLDL

29 6-8 23-32 20-30 18-20

5-10 x 106 25-35 82

1.006-1.019 tussen β en pre-β

IDL

4-9 5-10 35-50 18-25 25

2.3-4 x 106 18-25 75

1.019-1.063 β

LDL

4-7 4-6 18-20 26-30 50

0.36 x 105 9-12 50

1.063-1.125 α

HDL2

2-5 2-4 14-16 20-28 55-61

0.18 x 105 5-9 45

1.125-1.21 α

HDL3

opname van cellulair cholesterol en transport naar de lever

opname door de lever

75 65 15 25 spoor 6-11 3-7 0.5-2 spoor in de darm en lever

86-92 0.5-3 1-4 3-8 1-2

40-80 10-20 10-15 uit VLDL

precursor van LDL

tot LDL

95-98 0-2 1-3 uit IDL lysosomale hydrolyse van de componenten transport van cholesterol in bloed

triglyceriden vrij cholesterol cholesterolesters fosfolipiden % Apolipoproteïnen apo AI apo AII apo B apo C apo E Synthese Afbraak

Functie

2-10 spoor 1-10 spoor 2-20 30-40 56-75 40-55 5-15 5-13 in de darm in de lever lipolyse van de in plasma, o.i.v. triglyceriden lipoproteïne lipase tot IDL transport van exogene transport van vnl. triglyceriden endogene triglyceriden

Tabel 1 : Algemene eigenschappen van de verschillende soorten lipoproteïnen.

10

3. De apolipoproteïnen.

Apolipoproteïnen zijn eiwitten die in het plasma met lipiden kunnen associëren tot een lipoproteïne partikel. Naast hun functie als structureel element spelen ze een belangrijke rol bij het transport en de herverdeling van de lipiden. Ze worden door cellulaire receptoren herkend en kunnen ook activatoren of inhibitoren zijn van enzymen en van lipide-transferproteïnen.

De eigenschappen en functies van de

verschillende apolipoproteïnen zijn samengevat in Tabel 2. Apolipoproteïnen worden onderverdeeld in twee grote groepen. De apolipoproteïnen AI, AII, AIV, CI, CII, CIII en E zijn wateroplosbare eiwitten die kunnen uitwisselen tussen de verschillende lipoproteïne partikels. De apolipoproteïnen van de apo B familie daarentegen zijn niet wateroplosbaar en blijven in plasma steeds geassocieerd met hetzelfde lipoproteïne partikel.

3.1. De apolipoproteïnen B. Apo B komt voor in twee vormen; apo B-100 en apo B-48.

Het is het meest

hydrofobe apolipoproteïne en bestaat uit twee types repetitieve segmenten : de amfipatische helicoidale segmenten zoals deze in de uitwisselbare apolipoproteïnen enerzijds en proline-rijke domeinen anderzijds (De Loof et al., 1987). Deze prolinerijke domeinen zijn specifiek voor apo B en kunnen bijdragen tot de lipide bindende eigenschappen van het proteïne.

3.1.1. Apolipoproteïne B-100. Apo B-100 wordt gesynthetiseerd in de lever en is opgebouwd uit 4536 aminozuren en heeft een moleculair gewicht van 549 kDa (Chen et al., 1986). Het is de enige proteïnecomponent van LDL en komt ook voor in VLDL en IDL. Apo B-100 bezit, net zoals apo E, heparine-bindende domeinen die instaan voor de binding van triglyceriderijke lipoproteïnen op de endotheelcellen, waar hydrolyse van de triglyceriden plaatsvindt.

11

CII

CI

B100

B48

AIV

AII

AI

8.7

8.9

6.6

549

263

46

17

28

0.03-0.05

0.09-0.13

0.03-0.045

0.04-0.06

0.7-1

variabel

0.13-0.16

0.3-0.4

1-1.4

CM,VLDL,IDL, HDL

CM,VLDL,HDL

CM,VLDL,HDL

CM,VLDL,HDL

VLDL,IDL,LDL

CM

HDL

HDL

CM,HDL

Lipoproteïnedistributie

lever, hersenen, macrofagen

lever

lever,darm

lever

lever

dunne darm

dunne darm,lever

lever

lever

Syntheseplaats

ligand voor apo B/E receptor, LRP-receptor en VLDL-receptor

inhibeert LPL en HTGL

belangrijkste LPL activator

activeert LCAT, LPL inhibitor

biosynthese en secretie van VLDL, structurele rol in LDL en VLDL, ligand apo B/E receptor

biosynthese, secretie en structurele integriteit van chylomicronen

structurele rol in HDL, cholesterol efflux, activeert LCAT

structurele rol in HDL, moduleert HTGL

structurele rol in HDL, cholesterol efflux, activeert LCAT, is ligand voor de ABCA1 transporter

Functie

Moleculair Concentratie gewicht (kDa) in plasma (g/l)

CIII 34

Apo

E

Tabel 2 : Eigenschappen en functies van de belangrijkste apolipoproteïnen

12

3.2. De uitwisselbare apolipoproteïnen. De wateroplosbare apolipoproteïnen behoren tot dezelfde multigenfamilie (Li et al., 1988). Evolutionair gezien zijn de uitwisselbare apolipoproteïnen allen afkomstig van het apo CI. Duplicaties van 11 codons en van volledige genen leidde tot het ontstaan van de andere wateroplosbare apolipoproteïnen. Een schematisch overzicht van de evolutie van deze apolipoproteïne genen wordt weergegeven in Figuur 2 (Luo et al., 1986).

Figuur 2: schematische voorstelling van de evolutie van de genen van wateroplosbare apolipoproteïnen. □: gen duplicatie; ▲: duplicatie van 11 of 22 codons; x: deletie van 11 codons.

Het gen dat codeert voor apo AII bevindt zich op chromosoom 1, de apo AI, CIII en AIV genen zijn gelocaliseerd op chromosoom 11, terwijl de apo E, CI en CII genen een cluster vormen op chromosoom 19 (Li et al., 1988). De genstructuur van deze genen bestaat uit vier exons, met uitzondering van het apo AIV gen dat slechts drie exons bevat. Het eerste intron bevindt zich steeds in het 5’ deel van het gen, het deel dat niet voor proteïne codeert. Het tweede intron is

13

gesitueerd bij de signaal-peptide splitsingsplaats, en het zijn exon 3 en 4 die coderen voor het matuur apolipoproteïne (Figuur 3) (Li et al., 1988). Het laatste exon is voornamelijk opgebouwd uit repetitieve segmenten van 33 baseparen die coderen voor 11 aminozuren lange repeats. Twee dergelijke repeats vormen een basissegment dat instaat voor de vorming van amfipatische helices opgebouwd uit 22 residu’s (Li et al., 1988).

Figuur 3: Overzicht van de gen structuur van de uitwisselbare apolipoproteïnen. De zwarte balken stellen de exons voor met vermelding van het aantal nucleotiden waaruit ze zijn opgebouwd.

Amfipatische alfa helices of amfipatische beta vouwbladen (enkel in apo B) vormen het lipide-bindend motief van de apolipoproteïnen (Figuur 4) (Segrest et al., 1974). Hierbij bindt de hydrofobe zijde van deze structuurelementen aan de lipiden, terwijl de hydrofiele zijde naar de waterige fase gericht is.

14

Figuur 4 : Voorbeeld van een amfipatische helix in apolipoproteïne AI (residu 146-162). A: de helix is loodrecht geprojecteerd ten opzichte van de lengteas; zwart : hydrofobe residu’s , groen : neutraal hydrofiel, blauw : positief geladen hydrofiel, rood : negatief geladen hydrofiel.

In sferische HDL partikels bevinden deze amfipatische helices zich tussen de polaire hoofdgroepen van de fosfolipiden. Hierbij is de hydrofobe zijde van de helix naar de hydrofobe kern van het partikel gericht (Atkinson et al., 1974). In schijfvormige HDL vormen de helices een ring rond de dubbellaag van fosfolipiden en cholesterol (Wlodawer et al., 1979). Er werden twee modellen voorgesteld voor de conformatie van het apolipoproteïne AI in de schijfvormige HDL partikels : het “picket-fence” model en het “riem” model (zie Hoofdstuk V.: Apolipoproteïne AI).

15

III. Apolipoproteïne B bevattende lipoproteïnen en het voorwaarts cholesterol transport. 1. Transport van exogeen cholesterol door de chylomicronen.

Tijdens

de

spijsvertering

worden

de

exogene

lipiden

gehydrolyseerd

tot

monoacylglycerolen, lysofosfolipiden, cholesterol en vetzuren. Na absorptie in de darm worden deze componenten gebruikt voor de synthese van triglyceriden, cholesterolesters en fosfolipiden die samen met het apo B-48 en met apo AI, AII en AIV de chylomicronen vormen. Deze triglyceriderijke chylomicronen worden door de lymfevaten van de darm gesecreteerd en komen vervolgens in de bloedstroom terecht. In het bloed wisselen ze dan hun apo A apolipoproteïnen uit met apo E en apo C afkomstig van HDL partikels (Green en Glickman, 1981; Eisenberg, 1990). Ter hoogte van de spieren en vetweefsel worden de triglyceriden snel gehydrolyseerd door het lipoproteïne lipase (LPL). Hierdoor ontstaat er aan het oppervlak van de chylomicronen een overschot aan fosfolipiden en apo C, die getransfereerd worden naar HDL partikels. De met apo E en cholesterolesters aangerijkte chylomicron restpartikels worden vervolgens in de lever opgenomen door het LDL receptor related proteïne (LRP) en door de LDL receptor (Beisiegel et al., 1989).

2. Transport van endogeen cholesterol door VLDL, IDL en LDL.

Endogene triglyceriden en cholesterol worden door de lever gesynthetiseerd en in het plasma gesecreteerd als VLDL partikels. Door hydrolyse van de triglyceriden door het lipoproteïne lipase worden apo C en fosfolipiden getransfereerd naar HDL en worden de VLDL omgezet in kleinere VLDL remnants en IDL partikels, die door de apo B/E en LRP receptoren van de lever worden heropgenomen (Dolphin, 1992). 10 tot 20% van de IDL worden echter door inwerking van het hepatisch triglyceride lipase verder omgezet in kleinere LDL partikels (Havel, 1984). Door inwerking van het cholesterolester transfer proteïne (CETP) wisselen de VLDL en LDL partikels hun triglyceriden uit met cholesterolesters in de HDL partikels. De cholesterolester-rijke LDL partikels worden uiteindelijk in de lever en in de perifere cellen opgenomen door de apo B/E receptoren (Figuur 5).

16

Figuur 5: Het metabolisme van de VLDL partikels. LPL: lipoproteïne lipase ; HTGL: hepatisch triglyceride lipase ; CETP: cholesterolester transfer proteïne ; CE: cholesterolester ; VZ: vetzuur ; TG: triglyceride ; PL: fosfolipide.

3. Het atherogeen effect van de apo B bevattende lipoproteïnen.

Een verhoogde LDL concentratie in het plasma leidt tot een accumulatie van LDL partikels in de subendotheliale intima van de arteriën en tot de ontwikkeling van initiële atherosclerotische letsels. Onder invloed van vrije radicalen worden vetzuurketens in LDL omgezet in lipide hydroperoxiden, die verder omgezet worden tot aldehyden. Deze aldehyden kunnen de lysine residu’s op apo B modificeren. Deze geoxideerde LDL partikels worden via scavenger receptoren en via ox-LDL receptoren opgenomen door monocyten. In tegenstelling tot opname via de apo B/E receptor vertoont deze opname van geoxideerd LDL geen down-regulatie. Dit leidt tot een accumulatie van cholesterol en cholesterolesters in de cel, waardoor de macrofagen omgevormd worden tot

17

schuimcellen (Brown en Goldstein, 1983).

Schuimcellen en endotheelcellen

secreteren chemotactische elementen en groeifactoren waardoor gladde spiercellen uit de media in de intima migreren, waarna ze prolifereren. Door de accumulatie van lipiden en de vorming van bindweefsel vormen de initiële letsels zich dan om tot atherosclerotische letsels (Stary et al., 1995). IV. HDL en het omgekeerd cholesteroltransport. Cholesterol is een essentiële bouwsteen van cellulaire membranen en is een belangrijke precursor voor galzouten en voor steroid hormonen. Alle lichaamscellen kunnen dan ook cholesterol zelf aanmaken, en deze biosynthese is de belangrijkste bron voor cholesterol in het menselijk lichaam (Dietschy et al., 1993). Enkel de levercellen en de steroid hormoon producerende cellen in de gonaden en de bijnier zijn echter in staat om cholesterol af te breken.

Om cholesterolaccumulatie in

extrahepatische cellen tegen te gaan wordt het cholesterol opgenomen door de hoge densiteits lipoproteïnen (HDL) en getransporteerd naar de lever. In de lever wordt een deel van het vrije cholesterol gebruikt voor de synthese van VLDL, en een deel wordt geëxcreteerd in de gal.

De opname van cholesterol uit de perifere cellen en het transport ervan door HDL naar de lever wordt het “omgekeerd cholesterol transport” genoemd, en speelt een belangrijke rol bij cellulaire cholesterol homeostase. Er zijn drie belangrijke stappen te onderscheiden (Figuur 6): - de efflux van vrij cholesterol uit de perifere cellen en de opname door precursor HDL partikels - de verestering van vrij cholesterol door het LCAT enzyme met hermodellering van de HDL - de opname van LDL en HDL cholesterol door de lever

18

Figuur 6: Schematische voorstelling van het omgekeerd cholesterol transport : 1) de efflux door ABCA1 van vrij cholesterol uit de cel naar apo AI, met vorming van prebeta HDL 2) de verestering van vrij cholesterol in HDL door het LCAT enzyme, 3) transfer van de bekomen cholesterolesters naar apo B-bevattende lipoproteïnen door CETP, 4) opname van de cholesterolesters door de lever.

1. Efflux van cholesterol uit de cel.

De efflux van cholesterol uit de cel naar extracellulaire acceptoren is de eerste stap van het omgekeerd cholesterol transport, en gebeurt via twee verschillende mechanismen: passieve diffusie en apolipoproteïne gemedieerde efflux. Het aandeel van beide mechanismen in de totale efflux van cholesterol is afhankelijk van de toestand van de cel; passieve diffusie speelt vooral een rol in groeiende cellen terwijl apolipoproteïne gemedieerde efflux belangrijker is in cholesterolrijke en nietgroeiende cellen (Oram en Yokoyama, 1996).

19

De apolipoproteïne-gemedieerde cholesterol efflux (Oram en Yokoyama, 1996) wordt hoofdzakelijk gemedieerd door de belangrijkste proteïnecomponent van HDL, apo AI. In serum komen een klein deel van apo AI en apo AIV voor als vrije apolipoproteïnen die niet met lipoproteïne partikels geassocieerd zijn (Lefevre et al., 1988). Deze lipide-vrije apolipoproteïnen mediëren de cellulaire cholesterol efflux en de hiermee nauw geassocieerde fosfolipide efflux door interactie met cellulaire receptoren of door binding met specifieke componenten in de celmembraan. Dit leidt niet enkel tot de efflux van cholesterol uit de celmembraan, maar stimuleert bovendien de mobilisatie van intracellulair cholesterol dat door inwerking van het acylCoA : acyltransferase (ACAT) enzyme in de cel opgeslagen werd als cholesterolesters. In tegenstelling tot de passieve diffusie is deze apolipoproteïne gemedieerde cholesterol efflux een actief proces dat ATP afhankelijk is, waarbij proteïne kinase C (PKC) geaktiveerd wordt en dat geïnhibeerd wordt door inhibitoren van het Golgi transport (Mendez et al., 1991; Mendez en Uint, 1996; Mendez, 1997).

Verschillende membraangebonden proteïnen werden geïdentificeerd als mogelijke apolipoproteïne receptoren:

- HDL bindend proteïne (HBP): het overladen van cellen met cholesterol leidt tot overexpressie van HBP en tot een verhoogde HDL binding (McKnight et al., 1992).

- ATP-binding cassette A1 (ABCA1): in 1999 werd aangetoond dat mutaties in het ABCA1 gen verantwoordelijk zijn voor de ziekte van Tangier (Brooks-Wilson et al., 1999; Bodzioch et al., 1999; Rust et al., 1999). Deze ziekte wordt gekarakteriseerd door verlaagde concentraties plasma HDL-cholesterol en apo AI. Fibroblasten met niet functionele ABCA1 hebben een defectieve apolipoproteïne gemedieerde cholesterol efflux, terwijl de niet-specifieke diffusie van cholesterol uit de cel behouden blijft (Francis et al., 1995). Door middel van immunoprecipitatie en fluorescentie energie transfer metingen werd een directe interactie tussen ABCA1 en apo AI gesuggereerd (Wang et al., 2000; Chambenoit et al., 2001).

20

De belangrijkste initiële acceptoren van cellulair cholesterol zijn de apo AI bevattende pre-β1 HDL partikels (Castro en Fielding, 1988). Efflux van cholesterol via deze partikels maakt 60% uit van de totale cholesterol efflux en gebeurt via het apolipoproteïne gemedieerde proces, en niet via diffusie van cholesterol (Kawano et al., 1993).

Na de passieve diffusie van cholesterol vanuit de plasmamembraan naar de waterige fase rondom de cellen kan het cholesterol vervolgens binden aan extracellulaire acceptoren zoals de HDL partikels (Phillips et al., 1987).

Deze niet-selectieve

cholesterol diffusie vereist geen directe interactie tussen de acceptor partikels en de celmembraan en vertoont een brede acceptorspecificiteit: vrijwel elk partikel dat cholesterol kan binden kan op deze manier cellulair cholesterol opnemen (Kilsdonk et al., 1995). Bovendien gebeurt de diffusie van cholesterol zowel van de cel naar de acceptor als omgekeerd, de richting waarin netto efflux gebeurt is afhankelijk van de hoeveelheid vrij cholesterol in de celmembraan en in het acceptor partikel.

2. Hermodellering van HDL.

Door opname van fosfolipiden en cholesterol uit de cel worden de pre-β1 HDL partikels snel omgezet in pre-β2 partikels en vervolgens in pre-β3 partikels (Francone et al., 1989). Deze pre-β3 partikels vormen een goed substraat voor de verestering van cholesterol door het LCAT enzyme (Wong et al., 1992). LCAT zet amfifiele cholesterolmoleculen om in apolaire cholesterolesters die migreren naar de hydrofobe kern van het partikel. Dit draagt bij tot de omzetting van de schijfvormige pre-β partikels in sferische α-HDL3 (Glomset, 1968). Cholesterolverestering door LCAT en incorporatie van cholesterol en fosfolipiden, die vrijgesteld worden uit triglyceriderijke lipoproteïnen door inwerking van lipoproteïne lipase, zorgen ervoor dat de HDL3 partikels omgezet worden in grotere HDL2 partikels (Patsch et al., 1978). Deze omzetting wordt bevorderd door het fosfolipide

21

transfer proteïne (PLTP) dat fusie van HDL3 partikels induceert waarbij HDL2 en pre-β1 HDL partikels gevormd worden (Tu et al., 1993).

CETP transfereert vervolgens cholesterolesters van HDL2 naar LDL en VLDL in ruil voor triglyceride moleculen (Tall, 1993). Deze triglyceriderijke HDL2 vormen een goed substraat voor het hepatisch triglyceride lipase (HTGL) dat de triglyceriden in de kern van deze HDL2 partikels hydrolyseert. Hierdoor worden ze opnieuw omgezet in kleinere HDL3, in pre-β1 HDL en in vrij apo AI (Barrans et al., 1994) (Figuur 7).

Figuur 7: Hermodellering van HDL. LCAT : lecithine:cholesterol acyltransferase; CETP : cholesterolester transfer proteïne; LPL : lipoproteïne lipase; PLTP : fosfolipide transfer proteïne; HTGL : hepatisch triglyceride lipase; FL : fosfolipide; VC : vrij cholesterol; TG : triglyceride; CE : cholesterolester.

22

3. Transport van HDL cholesterolesters naar de lever.

Opname van cholesterolesters in de lever kan gebeuren door verschillende mechanismen:

- selectieve opname van HDL cholesterol gebeurt waarschijnlijk na binding van het HDL partikel op de SR-BI receptor in de lever (Acton et al., 1996). Deze opname zonder endocytose gebeurt zonder degradatie van de HDL apolipoproteïnen zodat deze kunnen gerecycleerd worden.

- door inwerking van CETP wordt een belangrijk deel van de HDL cholesterolesters getransfereerd naar de apoB bevattende lipoproteïnen LDL en VLDL, die via de apo B/E receptor door de lever opgenomen worden (Tall, 1993).

- apoE bevattende HDL partikels kunnen via de specifieke apoE receptor opgenomen worden in de lever (Koo et al., 1985).

4. De beschermende rol van HDL.

Klinische studies hebben aangetoond dat er een omgekeerd verband bestaat tussen de plasma HDL cholesterol concentratie en het voorkomen van coronaire aandoeningen (Gordon et al., 1977). Dit beschermend effect van HDL wordt vooral toegeschreven aan hun rol in het omgekeerd cholesterol transport. Toch hebben HDL mogelijks ook een beschermend effect op het endothelium van de vaatwand, waardoor het endothelium intact blijft en de adhesie van leukocyten en bloedplaatjes en de groei van gladde spiercellen wordt tegengegaan (Zeiher et al., 1994). De HDL kunnen eveneens ook de LDL beschermen tegen oxidatieve beschadiging (Bowry et al., 1992). Bovendien kunnen de met HDL geassocieerde enzymes paraoxonase, platelet activating

factor

(PAF)

acetylhydrolase

en

LCAT,

de

schadelijke

fosfolipidehydroperoxiden hydrolyseren (Klimov et al., 1989).

23

V. Apolipoproteïne AI. 1. Algemeen.

Matuur humaan apo AI is een niet geglycosileerd eiwit opgebouwd uit 243 aminozuren en met een moleculair gewicht van 28 kDa (Brewer et al., 1978). De sequentie van apo AI werd voor het eerst bepaald door Brewer in 1978 door directe proteïne sequenering en werd later bevestigd door cDNA sequenering (Cheung en Chan, 1983). Apo AI wordt in de lever en de dunne darm gesynthetiseerd. In de dunne darm wordt het samen met de chylomicronen (CM) gesecreteerd. Na lipolyse van de CM wordt het snel getransfereerd naar de HDL (Green en Glickman, 1981). Bij synthese in de lever wordt apo AI samen met fosfolipiden gesecreteerd onder de vorm van discoïdale ‘nascente’ HDL partikels (Tall en Small, 1978; Nichols et al., 1980). Het primaire translatieprodukt, het prepro apo AI is 267 aminozuren lang (Gordon et al., 1983; Law et al., 1983). Het signaalpeptide van 18 aminozuren wordt tijdens de translatie afgeknipt en het propeptide (6 aminozuren) wordt gehydrolyseerd tijdens de secretie van apo AI. In plasma kunnen eveneens modificaties zoals fosforylatie en myristoylatie (Chan en Li, 1991) voorkomen.

2. De strucuur van humaan apo AI.

Het apo AI gen is opgebouwd uit 4 exons. Exon 3 en 4, die coderen voor het matuur apolipoproteïne, zijn voornamelijk opgebouwd uit repetitieve segmenten van 33 baseparen die coderen voor 11 aminozuren lange repeats. Twee dergelijke repeats vormen in de primaire structuur van apo AI een basissegment (Figuur 8). Deze opeenvolgende herhalingen van 22 aminozuren lang beginnen meestal met een proline (Boguski et al., 1986), en staan in voor de vorming van amfipatische helices (Li et al., 1988).

24

D E P P Q S P W D R …………..Q L N 1

helix 1

43

L K L L D N W D S V T S T F S K L R E Q L G 44

helix 2

65

P V T Q E F W D N L E K E T E G L R Q E M S 66

87

K D L E E V K A K V Q 88

98

helix 3

P Y L D D F Q K K W Q E E M E L Y R Q K V E

helix 4

P L R A E L Q E G A R Q K L H E L Q E K L S

99

120

121

142

helix 5

P L G E E M R D R A R A H V D A L R T H L A

helix 6

P Y S D E L R Q R L A A R L E A L K E N G G

helix 7

A R L A E Y H A K A T E H L S T L S E K A K

143

164

165

186

187

204

P A L E D L R Q G L L 209

helix 8

219

P V L E S F K V S F L S A L E E Y T K K L N 220

241

T Q 243

Figuur 8: De primaire structuur van apo AI, opgebouwd uit 22 aminozuren lange herhalingen die meestal beginnen met een proline.

De secundaire structuur van apo AI bestaat dus uit een opeenvolging van α-helices, gescheiden door 4 à 5 residu’s die een antiparallelle oriëntatie van de α-helices mogelijk maken (Boguski et al., 1986; Li et al., 1988). Door het amfipatisch karakter van de α-helices bindt apo AI zeer sterk aan fosfolipiden (zie eigenschappen van apo AI). Een vergelijking van de primaire en secundaire structuur van apo AI in verschillende species toont een sterke conservatie aan van de 22 aminozuren lange herhalingen en van hun amfipatisch en helicoïdaal karakter (Figuur 9).

25

Figuur 9: Edmundson wheel voorstelling van de 8 helices van apo AI, met een vergelijking van de aminozuursequentie tussen verschillende species (van binnen naar buiten: mens, aap, varken, koe, hond, konijn, spitsmuis, muis, rat, hamster, egel, kip, kwartel en eend). Rood: negatief geladen hydrofiele residu’s; donkerblauw: positief geladen hydrofiele residu’s; lichtblauw: neutrale hydrofiele residu’s; groen: hydrofobe residu’s.

26

In 1997 werd door Borhani en medewerkers de kristalstructuur van apo ∆(1-43)AI bepaald (Borhani et al., 1997). Apo ∆(1-43)AI bestaat uit residu’s 44 tot 243 van apo AI en bevat alle tien klasse A amfipatische α-helices van het intacte apo AI. Deze verkorte vorm van het proteïne bindt lipiden, net zoals intact apo AI, en werd gekristalliseerd in afwezigheid van lipiden en bij een hoge zout concentratie. In deze kristalstructuur vormen de eerste 9 helices van monomeer apo ∆(1-43)AI een pseudocontinue amfipatische α-helix die telkens een buiging vertoont ter hoogte van de proline residu’s aan het begin van elke repeat. Hierdoor krijgt de molecule een hoefijzervormige structuur waarbij de N- en C-terminus slechts 23 Å van elkaar verwijderd zijn (Figuur 10A).

Figuur 10A: Monomere kristalstructuur van apo ∆(1-43)AI (figuur werd overgenomen uit Borhani et al., 1997).

27

Twee monomeren interageren in een antiparallelle manier waarbij een ellipsvormig dimeer ontstaat (Figuur 10B). In het dimeer zijn de amfipatische helices met hun hydrofobe zijde naar het centrum van de ellips gericht.

Figuur 10B: Dimere kristalstructuur van apo ∆(1-43)AI (figuur werd overgenomen uit Borhani et al., 1997).

28

3. Conformatie van apo AI in HDL partikels.

Er werden twee modellen voorgesteld voor de conformatie van het apo AI in de schijfvormige HDL partikels : het “picket-fence” model en het “riem” model.

Figuur 11 : Twee mogelijke modellen voor de conformatie van de amfipatische helices van apolipoproteïnen in schijfvormige HDL; A: picket-fence; B: riem model.

A. Het “picket-fence” model. In het picket-fence model vormen de apolipoproteïnen een ring van antiparallelle amfipatische helices die verbonden zijn via korte beta-strengen. (Brasseur et al., 1990; Brasseur et al., 1992; Ji et al., 1997) (Figuur 11A). Deze antiparallelle oriëntatie van de amfipatische helices ten opzichte van elkaar werd gesuggereerd door epitoopmapping studies met monoclonale anti-apoAI antilichamen (Marcel et al., 1991), door kristallisatie van twee insect apolipoforines met X-straal diffractie en NMR spectroscopie (Breiter et al., 1991; Wang et al., 1997a) en door kristallisatie van het N-terminaal receptorbindingsdomein van apoE in afwezigheid van fosfolipiden met behulp van X-straal diffractie (Wilson et al., 1991). In dit picket-fence model zijn de helices parallel georiënteerd ten opzichte van de acylketens van de fosfolipiden. Een dergelijke parallelle oriëntatie van de helices van apolipoproteïne AI en de vetzuurketens van de fosfolipiden in een schijfvormig complex wordt gesuggereerd door “Polarized Attenuated Total Reflection” infrarood spectroscopie (Wald et al., 1990; Vanloo et al., 1991).

29

B. Het “riem” model. In het riem model vormen de apolipoproteïnen een doorlopende riem van gebogen αhelices rond de schijf. Hierbij zijn de helices loodrecht georiënteerd ten opzichte van de acylketens van de fosfolipiden (Figuur 11B). Deze conformatie werd voor het apolipoforine bevestigd door Attenuated Total Reflection infrarood spectroscopie (Raussens et al., 1995). De kristalstructuur van apo AI suggereert eveneens een riem model voor de structuur van apo AI in HDL partikels (Borhani et al., 1997).

4. Eigenschappen van het apo AI.

Apo AI is de belangrijkste proteïne component van de hoge densiteit lipoproteïnen en is bepalend voor de structuur en functie van deze lipoproteïne klasse. De antiatherogene eigenschappen van HDL zijn voornamelijk toe te schrijven aan hun rol bij het omgekeerd cholesterol metabolisme. Verschillende stappen bij dit proces zijn afhankelijk van de eigenschappen van apo AI : apo AI bindt aan cellulaire receptoren (Xu et al., 1997) en transporters (Wang et al., 2000), het activeert eveneens het lecithine cholesterol acyltransferase (LCAT) wat resulteert in de verestering van cholesterol op de HDL (Jonas, 1991), apo AI medieert naast de transfer van lipiden tussen verschillende lipoproteïnen ook de hermoddelering van HDL door activatie van LCAT en PLTP (Rye et al., 1992), en tenslotte is het betrokken bij de opname van cholesterol esters door de steroïdogene weefsels en de lever (Fidge, 1999). Om de eigenschappen en de functie van apo AI te bestuderen wordt gebruik gemaakt van discoïdale gereconstrueerde HDL partikels (r-HDL). Deze disks hebben een dikte die gelijk is aan deze van een fosfolipide dubbellaag en hun diameter wordt bepaald door

het

aantal

helices

rondom

het

discoïdaal

partikel,

door

de

fosfolipide/apolipoproteïne samenstelling, alsook door het moleculair gewicht van het apolipoproteïne en zijn conformatie (Jonas et al., 1990). De eenvoudigste en best gekarakteriseerde r-HDL partikels bevatten 2 apo AI moleculen en zijn opgebouwd uit één type fosfolipide. De fosfolipiden met verzadigde acylketens (DMPC, DPPC) vormen grotere en meer homogene partikels, de fosfolipiden met zowel verzadigde als onverzadigde vetzuren (POPC) vormen meer heterogene partikels, terwijl de

30

fosfolipiden met lange poly-onverzadigde ketens (diarachidonyl-PC) de kleinste partikels vormen. De verhouding van het fosfolipide ten opzichte van apo AI in het oorspronkelijke incubatiemengsel beïnvloedt eveneens de grootte van het partikel : een stijgende molaire verhouding fosfolipide/apo AI doet de gemiddelde grootte van het partikel toenemen (Zorich et al., 1987; Jonas et al., 1990). Indien eveneens cholesterol in de rHDL disk wordt geïncorporeerd leidt dit tot de vorming van kleinere partikels dan de r-HDL, die enkel uit fosfolipide en apo AI bestaan (Jonas et al., 1983).

4.1. Lipide binding. De diverse functies van apo AI zijn een gevolg van z’n unieke structurele eigenschappen, vooral in een lipid gebonden toestand. Door het amfipatisch karakter van de α-helices bindt apo AI zeer sterk aan fosfolipiden waarbij het percentage helix toeneemt. De rol van de amfipatische helix als een fundamenteel lipidbindend motief van de apolipoproteïnen werd bevestigd door enerzijds de synthese van amfipatische peptiden die gemakkelijk lipide binden (Sparrow et al., 1981), en anderzijds de directe observatie van α-helices in de kristallijne structuur van apo AI (Borhani et al., 1991) en het N-terminaal domein van humaan apo E (Wilson et al., 1991). Alle amfipatische helices van het apo AI (ongeveer 80% van de sequentie) kunnen potentieel binden aan lipiden, maar het zijn vooral de laatste 3 helices (helix 8-10) die een essentiële rol spelen bij de lipide binding (Minnich et al., 1992; Holvoet et al., 1995; Davidson et al., 1996).

4.2. Activatie van LCAT. Het LCAT enzym is verantwoordelijk voor de vorming van het grootste deel van de cholesterolesters in ons lichaam (zie Hoofdstuk VI). Apo AI is de belangrijkste activator van LCAT (Fielding et al., 1972), maar ook andere wateroplosbare apolipoproteïnen kunnen in mindere mate LCAT activeren (Tabel 3). Synthetische peptiden, bestaande uit een potentiële amfipatische α-helix, kunnen eveneens het LCAT enzym activeren (Chung et al., 1985; Anantharamaiah et al., 1990).

31

Apolipoproteïne

Relatieve LCAT activiteit (%)

Apo AI

100

Apo AVI

25-38

Apo E

18-40

Apo CI

12

Apo CIII

4-5

Apo CII

3

Apo AII

1.5

Tabel 3 : LCAT activering door verschillende apolipoproteïnen in schijfvormige lipide/apolipoproteïne complexen (Jonas et al., 1984; Chen et al., 1985; Steinmetz et al., 1985; Zorich et al., 1985; Jonas, 1987).

Om het LCAT activerend gebied in apo AI te bepalen werden in meerdere labo’s deletiemutanten van apo AI gemaakt. Hierbij werden één of meerdere amfipatische helices in de apo AI sequentie volledig of gedeeltelijk verwijderd (Figuur 12; overgenomen uit Jonas et al., 1998).

Figuur 12: LCAT activering door deletiemutanten van apo AI. Deze figuur is een samenvatting van de resultaten van verschillende studies (Minnich et al., 1992; Sorci-Thomas et al., 1993; Holvoet et al., 1995; Ji et al., 1995; Rogers et al., 1997). Op de x-as wordt de lineaire sequentie van apo AI voorgesteld met aanduiding van de amfipatische helices. De verschillende staven in het diagram duiden de positie en lengte van de deleties aan.

32

De resultaten van deze studies tonen aan dat deleties in het C-of N-terminaal gedeelte van apo AI slechts een beperkt effect hebben op de LCAT activering, en dat het voornaamste LCAT activerend gebied gelegen is tussen residu’s 143 en 186 (Figuur 12; overgenomen uit Jonas et al., 1998). Dit gebied omvat twee amfipatische helices, tussen residu’s 143-164 en tussen residu’s 165-186. Deze resultaten stemmen overeen met het gedeeltelijk verlies van LCAT activering door apo AI Seattle, een natuurlijk voorkomende apo AI mutant die een deletie tussen residu’s 146 en 160 vertoont (Lindholm et al., 1998).

4.3. Apo AI als ligand voor de ATP binding cassette A1 (ABCA1) transporter. ABCA1

speelt

een

belangrijke

rol

bij

de

apolipoproteïne

gemedieerde

cholesterolefflux (zie hoofdstuk VII). Het exact mechanisme voor de efflux van cellulair cholesterol en fosfolipiden naar apolipoproteïne AI is echter nog niet gekend.

Het feit dat korte synthetische peptiden, die de secundaire structuur van apo AI nabootsen, ook cellulaire cholesterol efflux kunnen bevorderen (Davidson et al., 1994; Mendez et al., 1994) suggereert een niet specifiek mechanisme waarbij vooral de affiniteit van apo AI voor lipiden van belang zou zijn. Omdat de initiële binding van apo AI aan lipiden gebeurt via de C-terminale helices, wordt vermoed dat deze helices eveneens een belangrijke rol spelen bij het efflux proces.

Door middel van immunoprecipitatie en fluorescentie energie transfer metingen werd echter wel een directe interactie tussen ABCA1 en apo AI gesuggereerd (Wang et al, 2000; Chambenoit et al., 2001).

5. Natuurlijke mutanten van humaan apo AI.

Er werden reeds meer dan 40 natuurlijke mutaties beschreven in humaan apo AI, meestal zijn het puntmutaties die zelden voorkomen. In apo AI Milano is de arginine op positie 173 gemuteerd naar een cysteïne. Een analoge mutatie wordt teruggevonden bij apo AI Paris, op residu 151. Door de aanwezigheid van een cysteïne residu kunnen beide apo AI mutanten zowel

33

homodimeren als heterodimeren met apo AII vormen. Hoewel patiënten met één van deze mutaties duidelijk verlaagde plasma HDL-concentraties hebben, wordt er bij deze personen geen toename van atherosclerotische letsels aangetroffen. Patiënten met de apo AI Giessen mutatie (P143R) vertonen een sterk gereduceerde LCAT-activering, maar een normale HDL-cholesterol concentratie. Ook bij deze personen wordt geen toename van atherosclerotische letsels geobserveerd. Ook apo AI Seattle, waar het gebied tussen residu’s Glu146 en Arg160 gedeleteerd is, leidt niet tot vroegtijdige atherosclerose, alhoewel een duidelijke HDL-deficiëntie en een sterk verlaagde LCAT-activering waargenomen worden. Waarom dergelijke mutaties, die ondanks hun abnormale concentraties aan HDL en apo AI, geen indicatie vertonen van vroegtijdige atherosclerose is nog onbekend.

Een overzicht van de meest relevante natuurlijke apo AI mutanten, met aanduiding van de mutatie en de geassocieerde clinische gevolgen, wordt gegeven in Tabel 4.

34

Specifieke

Mutatie

benaming

HDL

Verhoogd

LCAT

concentratie

risico op

activatie

(% t.o.v.

atherosclerose (% t.o.v.

normaal

apo AI

HDL)

WT)

AI Milano

R173C

10

Neen

100

AI Paris

R151C

50

Neen

100

AI Pisa

L141R

50

Ja

100

AI Giessen

P143R

100

Neen

45%

AI Oita

V156E

60

Ja

100

AI Zavalla

L159P

10-20

Ja

100

AI Fin

L159R

15-25

Neen

100

AI Oslo

R160L

40

Neen

50%

10

Neen

35%

100

Neen

60%

AI Seattle E146∆R160 AI Marburg

∆K107

Referentie

Weisgraber et al., 1983 Bruckert et al., 1997 Miccoli et al., 1996 Utermann et al., 1982 Huang et al., 1998 Miller et al., 1998 Miettinen et al., 1997 Leren et al., 1997 Deeb et al., 1991 Rall et al., 1984

Tabel 4 : Overzicht van de meest relevante natuurlijke apo AI mutaties.

35

VI. Het lecithine : cholesterol acyltransferase (LCAT). 1. Algemeen.

Het LCAT enzym speelt een centrale rol in het extracellulair metabolisme van plasma lipoproteïnen. Het humaan LCAT gen is gelocaliseerd op chromosoom 16 (16q22) (Azoulay et al., 1987) en komt voornamelijk tot expressie in de lever, waarna het enzyme in de bloedstroom gesecreteerd wordt.

In plasma is LCAT grotendeels

gebonden op de HDL, terwijl een kleine hoeveelheid (1%) geassocieerd is met LDL (Chen et al., 1982). In zijn mature, gesecreteerde vorm bestaat het enzym uit 416 aminozuren en heeft het een berekend moleculair gewicht van 47091 Dalton. In het LCAT preproteïne wordt deze sequentie voorafgegaan door een hydrofoob signaalpeptide van 24 aminozuren dat afgesplitst wordt (McLean et al., 1986). Na synthese wordt het enzym gemodificeerd door N-glycosilatie op positie Asn 20, Asn 84, Asn 272 en Asn 384, en door O-glycosilatie op positie Thr 407 en Ser 409 (Schindler et al., 1995).

Deze glycosilaties verhogen het schijnbaar moleculair

gewicht van LCAT in SDS-PAGE tot 65000-69000 Dalton (Yang et al., 1987). Heterogeniteit in de glycosilaties leidt tot minstens zes isovormen van het LCAT enzym (Doi et al., 1983). De sequentie van het LCAT enzym is zeer sterk geconserveerd tussen verschillende species, zo is er 85% similariteit tussen mens en muis LCAT en 75% similariteit tussen mens en kip LCAT.

2. De enzymatische werking van het LCAT enzym.

Ongeveer 70% van het cholesterol in de plasma lipoproteïnen komt voor als cholesterolesters. Het grootste deel van deze cholesterolesters wordt gevormd door de werking van het LCAT enzym. LCAT bevindt zich aan het oppervlak van de plasma lipoproteïnen waar het een vetzuurketen afsplitst van een fosfatidylcholine, fosfatidylserine of fosfatidylethanolamine, en deze transfereert naar de 3hydroxylgroep van cholesterol (Figuur 13). Het overgebleven lysofosfolipide wordt door albumine opgenomen.

36

Figuur 13: Schematische voorstelling van de LCAT reactie waarbij een vetzuurketen van fosfatidylcholine wordt afgesplitst en getransfereerd naar cholesterol, met de vorming van een cholesterolester als gevolg.

Hoewel het LCAT enzym een voorkeur heeft voor de transacylatie van het vetzuur op de sn-2 positie van fosfatidylcholine, fosfatidylserine of fosfatidylethanolamine, kunnen ook vetzuren op de sn-1 positie als substraat dienen (Jonas et al., 1987). Bij zoogdieren en mensen heeft LCAT de voorkeur voor lange onverzadigde vetzuren zoals linoleïne zuur (18:2) (Jonas et al., 1987). Door zijn hoge concentratie in de HDL (74% van de fosfolipiden) is fosfatidylcholine (PC) de belangrijkste natuurlijke donor van de acylketen voor de LCAT reactie. Fosfatidylethanolamine (PE) is echter een beter substraat dan PC, maar PE maakt slechts 7% uit van de HDL fosfolipiden en treedt dus in mindere mate op als donor (Pownall et al., 1985). Amide of ether gebonden vetzuren kunnen niet afgesplitst worden door LCAT (Pownall et al., 1985; Jonas et al., 1987) omdat een esterbinding tussen de acylketen en de fosfoglyceride backbone vereist is.

Het moleculair mechanisme van de LCAT reactie is nog niet volledig opgehelderd, maar het staat wel vast dat er voor de activiteit op het HDL substraat een activator vereist is. Dit is niet het geval voor monomerische substraten of voor LDL. De belangrijkste activator van LCAT is het apolipoproteïne AI (Fielding et al., 1972).

37

3. Het katalytisch mechanisme van LCAT.

Het LCAT enzym vertoont functionele gelijkenissen met lipasen. Bij de lipasen vormt een serine samen met een histidine en een asparagine- of glutaminezuur de katalytische triade (Warshel et al., 1989), zoals voorgesteld in Figuur 14.

Figuur 14: Schematische voorstelling van het katalytisch mechanisme van lipasen.

In LCAT werd serine 181, gelegen in een Gly-X-Ser-X-Gly motief zoals bij lipasen, geïdentificeerd als catalytisch residu (Farooqui et al., 1988). Naast Ser 181 werden Asp 345 en His 377 als actieve site residu’s geïdentificeerd, samen met Phe 103 en Leu 182 die deel uitmaken van de oxyanion holte (Peelman et al., 1998). In verdere analogie met lipasen werd een domein geïdentificeerd dat mogelijk betrokken is bij de binding van het enzym aan zijn substraat. In analogie met de lidstructuur van de lipasen is ook dit gebied gesloten door een disulfidebrug, tussen cysteïne 50 en 74 (Peelman et al., 1998).

Net zoals lipasen en fosfolipasen is LCAT een wateroplosbaar enzym dat actief is aan het oppervlak van geaggregeerde lipide substraten.

De LCAT reactie op een

38

lipoproteïne substraat verloopt via verschillende stappen die schematisch voorgesteld worden in Figuur 15:

-

Binding van LCAT aan het lipidenoppervlak (1), met activatie van het enzym door een apolipoproteïne cofactor (2).

-

Binding van één enkele fosfolipidemolecule in het actief centrum van LCAT (3).

-

Afsplitsing van een vetzuurketen van het fosfolipide, met vorming van een LCAT Ser 181 O-acylintermediair en van een lyso-fosfolipide (4).

-

Binding van een cholesterolmolecule in het actief centrum van LCAT (5).

-

Transfer van de vetzuurketen naar de 3-β hydroxylgroep van cholesterol met vorming van een cholesterolester (6).

-

Migratie van het gevormde cholesterolester naar de hydrofobe kern van het lipoproteïnepartikel (7).

Figuur 15: De verschillende stappen in het reactiemechanisme van LCAT (overgenomen uit Jonas, 1998). E : vrij LCAT; E* : substraat gebonden en geactiveerd LCAT; PL : fosfolipide; E*-PL : fosfolipide gebonden in LCAT; E*-Acyl : Ser 181 O-acylintermediair; C : vrij cholesterol; CE : cholesterolester.

39

4. Structuur van het LCAT enzym.

Figuur 16: Schematische voorstelling van de α/β hydrolase opvouwing, met aanduiding van de residu’s van de katalytische triade en de oxyanionholte residu’s.

Steunend op de homologie van LCAT met de lipasen werd aan de hand van structurele homologie berekeningen via ‘threading’ methoden en secundaire structuur predictiemethoden de opvouwing van het LCAT geïdentificeerd en werd een driedimensioneel model gebouwd (Peelman et al., 1998). Hierbij werd aangetoond dat LCAT, zoals lipasen, behoort tot de α/β hydrolase familie. Het centrale deel van het enzym bestaat uit zes parallelle en één anti-parallel georiënteerde β-strengen die verbonden worden door lussen en vier amfipatische α-helices (Figuur 16). 5. Substraten van LCAT.

Hoewel LCAT ‘in vitro’ activiteit vertoont op monomerische (niet geaggregeerde) substraten, is het enzym ‘in vivo’ vooral actief op geaggregeerde lipiden in de lipoproteïnen.

De activiteit wordt beïnvloed door verschillende fysicochemische

parameters van het substraat, zoals de grootte en samenstelling van de partikels. In het plasma is LCAT voornamelijk actief aan het oppervlak van HDL (α-activiteit), die

40

de belangrijkste co-factor, het apo AI, bevatten.

Hoewel LCAT voornamelijk

gebonden is op de grotere HDL2 partikels (Chen et al., 1982), vormen de kleinere HDL3 partikels in plasma een meer efficiënt substraat dan HDL2 (Fielding et al., 1971).

Hierbij is de LCAT activiteit omgekeerd evenredig met de HDL3

partikelgrootte (Barter et al., 1985). Naaste de HDL vormen ook de LDL (β-activiteit), die geen activator vereisen, en VLDL in mindere mate een substraat voor LCAT (Barter, 1983), 73 % van de door LCAT gevormde cholesterolesters worden aangetroffen in HDL, terwijl 25 % in LDL en slechts 1 % in VLDL (Rajaram et al., 1985).

6. Natuurlijke mutanten van LCAT.

Het belang van LCAT in het lipide metabolisme wordt verder bevestigd door de expressie van mutaties in het gen, die aanleiding geven tot de ontwikkeling van enerzijds Familiale LCAT Deficiëntie (FLD) of anderzijds Fish Eye Disease (FED). Beide ziekten worden overgeërfd op een autosomaal recessieve manier en zijn zeldzaam.

Familiale LCAT Deficiëntie (FLD) werd voor het eerst beschreven in 1967 door Norum en Gjone (Norum et al., 1967) en wordt biochemisch gekarakteriseerd door afwezigheid van α- en β-LCAT-activiteit, een sterk gereduceerde concentratie plasma cholesterolesters en sterk verlaagde plasma LCAT concentraties. Verder zijn ook HDL deficiëntie en veranderingen in VLDL- en LDL samenstelling kenmerkend voor FLD.

Het klinisch fenotype bij FLD patiënten bestaat voornamelijk uit een

vertroebeling van het hoornvlies te wijten aan afzetting van cholesterol, bloedarmoede en nierproblemen. Er zijn minstens 27 verschillende homozygote of heterozygote mutaties die leiden tot FLD.

Fish Eye Disease (FED) werd bestudeerd door Carlson en medewerkers in twee Zweedse families (Carlson et al., 1979) en wordt gekarakteriseerd door afwezigheid van α-activiteit, maar een intacte β-activiteit (Glomset et al., 1995). Net zoals bij FLD, vertonen de patiënten verhoogde triglyceride concentraties, HDL deficiëntie, abnormale lipoproteïnen en een vertroebeling van het hoornvlies. In tegenstelling tot

41

FLD is er een vrijwel normale cholesterolverestering met een normale concentratie plasma cholesterolesters.

Er zijn minstens 6 verschillende homozygote of

heterozygote mutaties die leiden tot FED. De 33 FLD en FED mutaties worden in vier verschillende klassen ingedeeld (Kuivenhoven et al., 1997) (Tabel 5).

42

Klasse 1

2

3

4

Mutatie

Biochemisch fenotype

null mutaties die leiden tot FLD 1 2 3 4 5 6

geen catalytische activiteit LCAT massa: geen

7 8 9 missense mutaties die leiden tot FLD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 missense mutaties die leiden tot FED 1 2 3 missense mutaties die leiden tot FED 1 2 3

Defect

30 bp insertie (codon 4) C-insertie (codonc 9,10) Y83-STOP G141-insertie intron 4 defect A-T substitutie / C-deletie (codon 120) C-deletie (codon 168) G-deletie (codon 264) A-insertie (codon 376) geen catalytische activiteit LCAT massa: normaal/ gereduceerd/geen G30S L32P G33R A93T R135W R135Q R140H R147W Y156N G183S L209P N228K R244G M252K T321M G344S T347M R399C gereduceerde catalytische activiteit op LDL of op LDL en HDL LCAT massa: gereduceerd N131D L300 deletie N391S gereduceerde catalytische activiteit op HDL LCAT massa: gereduceerd P10L P10Q T123I

Tabel 5: Classificatie van FLD en FED LCAT deficiënties volgens Kluivenhoven et al. (Kluivenhoven et al., 1997).

43

Aan de hand van het conservatieprofiel en het 3D-model van het LCAT enzyme, werd het effect van een aantal van deze mutaties verklaard (Peelman et al., 1999). Een aantal FLD mutaties bevinden zich in de geconserveerde gebieden rond het actief centrum van LCAT (Figuur 17) :

Figuur 17: Positie van enkele Familiale LCAT Deficiëntie mutaties in het 3D-model van LCAT.

-

De G183S mutatie verstoort het GXSXG motief rond de actieve site serine,

waardoor de correcte configuratie van dit serine onmogelijk wordt. -

De L209P mutatie in β-streng 6 verstoort mogelijks de correcte opvouwing

van het enzyme. -

De G334S en T347M mutaties liggen vlakbij de actieve site Asp 345, en de

T347M mutatie blokkeert hierbij deels de toegang tot het actief centrum. -

De Y156N en R158C mutaties bevinden zich in de amfipatische helix tussen

residu’s 154 en 171. Y156N introduceert een hydrofiel residu in de hydrofobe kern

44

van LCAT, wat aanleiding geeft tot een verminderde interactie met lipiden. De lipide-bindende helix in LCAT (helix α4-5) interageert namelijk met zijn hydrofobe zijde met de hydrofobe residu’s in de kern. De R158C mutatie vindt plaats in de hydrofiele zijde van de helix, en deze mutant behoudt dan ook grotendeels zijn activiteit in vitro.

De FED mutaties worden opgedeeld in twee groepen : mutaties die voornamelijk de activiteit op het HDL substraat verminderen, en mutaties die een gelijkaardig effect hebben op de activiteit van LCAT op zowel HDL als LDL : De T123I, N131D en N391S mutaties behoren tot de eerste groep en bevinden zich aan de hydrofiele zijde van de parallelle amfipatische α3-4 en αHis helices. Het verschillend effect van deze mutaties op HDL en LDL, suggereert dat deze helices een belangrijke rol spelen bij de interactie van LCAT met HDL.

Figuur 18: Positie van de T123I, N131D en N391S mutaties in het 3D-model van LCAT.

45

VII. De ATP-bindende cassette A1 (ABCA1) transporter. 1. ABC transporters : algemeen.

Transport van specifieke moleculen doorheen de celmembraan is een essentieel proces voor alle levende organismen. De ATP-bindende cassette transporters vormen een super-familie van proteïnen die zowel in pro- als eukaryoten verantwoordelijk zijn voor het ATP-afhankelijk transmembranair transport van een groot aantal substraten, waaronder suikers, aminozuren, metaalionen, peptiden, proteïnen, galzuren, vitaminen, componenten.

steroïdhormonen,

fosfolipiden,

cholesterol

en

farmaceutische

Er bestaan verschillende klassen van ABC transporters, die elk

specifiek zijn voor een bepaalde klasse van substraten. De ABC transporters binden ATP en gebruiken de energie van ATP-hydrolyse voor het transport van hun substraat door de membraan. ABC transporters komen in de cel voor in de plasmamembraan, peroxisomen, het Golgi-apparaat, het endoplasmatisch reticulum en in intracellulaire secretorische vesikels (Bauer et al., 1999).

In

prokaryoten vindt men hoofdzakelijk “importers” die nutriënten in de cellen transporteren terwijl er bij de eukaryoten voornamelijk “exporters” actief zijn die hydrofobe componenten zoals lipiden en toxische stoffen naar buiten pompen, bidirectionele ABC transporters zijn niet gekend.

Humane ABC transporters worden geclassificeerd in zeven verschillende subfamilies, gaande van ABCA tot ABCG (Higgins, 1992; Holland et al., 1999). De classificatie van deze transporters vindt men op http://nutrigen.4t.com/humanabc.htm. Defecten in verschillende humane transporters werden reeds geïdentificeerd als de oorzaak van genetische ziekten, een overzicht hiervan wordt gegeven in Tabel 6 (Dean et al., 2001).

46

subfamilie transporter

Substraat

Ziekte ziekte van Tangier

ABCA

ABCA1

cholesterol en fosfolipiden

ABCA

ABCA4

ABCB

TAP

antigene peptiden

HLA klasse I deficiëntie

ABCC

CFTR

Cl-ionen

cystische fibrose

ABCC

MDR

hydrofobe farmaca

multidrug resistentie

ABCD

ABCD1

lange vetzuurketens

adrenoleuko-dystrofie

ABCG

ABCG5

sterolen

sitosterolemie

ABCG

ABCG8

sterolen

sitosterolemie

N-retinylideen-fosfatidylethanolamine

en HDL deficiëntie genetische blindheid

Tabel 6 : Overzicht van verschillende humane ABC transporters die in verband staan met genetische ziekten, met aanduiding van hun subfamilie, naam, hun specifieke substraat en de ziekte waarmee ze geassocieerd worden.

2. De structuur van een ABC transporter.

Een functionele ABC transporter

(‘full transporter’) is opgebouwd uit twee

Nucleotide Bindende Domeinen (NBD’s), die instaan voor ATP-binding en – hydrolyse, en twee Membraan Overspannende Domeinen (MSD’s), die elk zes transmembranaire helices bevatten. Bij prokaryoten worden de vier subeenheden aanvankelijk afzonderlijk gecodeerd en tot expressie gebracht, waarna de domeinen samenkomen om een functionele transporter te vormen. Bij sommige transporters zijn in de evolutie één NBD en één MSD gefusioneerd. functioneren dan als homo- of heterodimeren.

Deze halftransporters

Bij eukaryoten zijn beide

halftransporters meestal evolutionair samengebracht in één genstructuur (Higgins, 1992) (Peelman, niet gepubliceerde data, zie VII.4. evolutie van ABC transporters).

47

De Nucleotide Bindende Domeinen (NBDs).

De sterkst geconserveerde delen van de ABC transporters zijn de intracellulair gelocaliseerde ATP bindende en hydrolyserende domeinen of NBDs. Elk NBD heeft één ATP bindingsplaats, en beide NBDs zijn nodig om een functionele transporter te bekomen (Hiles et al., 1987; Azzaria et al., 1989). De NBDs vertonen eveneens een coöperativiteit waarbij de binding en hydrolyse van ATP door één NBD, de affiniteit van de tweede NBD voor ATP verhoogt (van Veen et al., 2001). ATP hydrolyse induceert op zijn beurt een conformationele verandering, gevolgd door transport van het substraat doorheen de membraan (Schneider et al., 1998). Elk NBD domein is ongeveer 200-250 aminozuren lang en de homologie tussen de aminozuursequentie van de NBD’s van de verschillende ABC transporters ligt tussen 35 en 60 % (Figuur 19).

Figuur 19 : Sequentie-alignering van de nucleotide bindende domeinen van humane ABC transporters met aanduiding van de voorkomende motieven. De strict geconserveerde residu’s zijn in rood gekleurd, homologe residu’s in groen (alignering met CLUSTAL).

Alle NBDs van de gekende ABC transporters bevatten een Walker A motief (GAXXGXGK(S/T)T), een Walker B motief (vier hydrofobe aminozuren gevolgd

48

door DE) (Walker et al., 1982), en een ‘signatuur motief’ (SGG) (Schneider et al., 1998) dat kenmerkend voorkomt bij de ABC transporters. De eerste structuur van een NBD werd in 1998 door Hung en medewerkers bepaald door kristallisatie en X-straal diffractie analyse van het ATP-bindend domein van het Salmonella typhimurium histidine permease (HisP) (Hung et al.,1998). De structuur is opgebouwd uit twee armen in een L-vorm. De eerste arm bestaat voornamelijk uit β-strengen en bevat de Walker A en B motieven die in de driedimensionele structuur dicht bij elkaar komen om zo de P-loop (fosfaat bindende loop) te vormen. Hierdoor wordt een holte gevormd waarin ATP kan gebonden worden. De tweede, kortere arm is opgebouwd uit α-helices en bevat het signatuur motief. De topologie van deze structuur en de interacties van HisP met ATP worden weergegeven in Figuur 20A en 20B.

Figuur 20: A: Schematische voorstelling van de secundaire structuur van HisP, de cilinders geven de α-helices weer, en de pijlen geven de β-strengen weer. ATP wordt vereenvoudigd weergegeven in deze figuur; A = adenine, R = ribose en P = de fosfaatgroep.

49

B: interacties van HisP met ATP, met aanduiding van de gevormde waterstofbruggen (stiplijn) en aromatische interacties (vertikale lijnen).

De transmembranaire domeinen (MSDs).

De ‘full’ ABC transporters bestaan uit twee transmembranaire domeinen die in een functionele transporter met elkaar interageren om zo een transmembranair kanaal te vormen waardoor het substraat getransporteerd wordt.

Bij de meeste ABC

transporters is elk transmembraan domein opgebouwd uit zes helices die verbonden zijn door drie extracellulaire en twee intracellulaire lussen. De sequentie van de transmembrane domeinen is weinig geconserveerd tussen verschillende transporters, en de substraat-specificiteit van de transporter wordt grotendeels bepaald door de MSDs.

3. Interactie tussen verschillende domeinen tijdens transport van het substraat.

Hoe de verschillende domeinen van een ABC transporter met elkaar interageren tijdens het transport van hun specifiek substraat is nog niet precies gekend. De kristalstructuur van individuele NBDs en de coöperativiteit tussen NBDs suggereerde een model waarbij de nucleotide bindende domeinen dimeriseren op een manier waarbij de ATP bindingsplaatsen naar elkaar gericht zijn. Zo toonde Hopfner aan dat, in aanwezigheid van ATP, het Rad50 ATPase van Pyrococcus furiosus een dimeer vormt waarbij twee antiparallelle Rad50 proteïnen met elkaar associëren. Tijdens deze associatie interageert het N-terminale NBD van een Rad50 proteïne met het Cterminale NBD van het tweede Rad50 ATPase (Hopfner et al., 2000). Bij de recent opgehelderde structuur van de vitamine B12 transporter, BtuCD, van Escherichia coli interageren beide NBDs van het proteïne met elkaar (Locher et al., 2002). Een algemeen model voor substraattransport wordt schematisch weergegeven in Figuur 21.

50

Figuur 21: Schematische voorstelling van substraattransport door ABC transporters. Na binding en hydrolyse van ATP kan het substraat, door middel van een conformationele verandering in de transporter, getransporteerd worden.

In de kristalstructuur van de lipide transporter, MsbA, van Escherichia coli (Chang et al., 2001) lijken de NBDs echter niet met elkaar te interageren, en zijn de ATP bindingsplaatsen van elkaar weg gericht. Het feit dat de NBDs niet interageren wordt door de auteurs verklaard doordat de kristallisatie een momentopname is tijdens de conformationele veranderingen die de transporter ondergaat bij het transport van het substraat. Deze hypothese wordt gesteund door de structuur van een MsbA homoloog uit Vibrio cholerae waarbij de NBDs wel dicht bij elkaar gelocaliseerd zijn, maar eveneens met de ATP bindingsplaatsen van elkaar weg gericht (Chang, 2003). De residu’s en de manier waarmee de NBDs met elkaar interageren kunnen dus sterk verschillen van transporter tot transporter.

4. Evolutie van de ABC transporters.

ABC transporters bestaan uit functionele domeinen die worden gecodeerd door verschillende genen. Deze verschillende domeinen komen na translatie samen om zo een functionele transporter te vormen. Waarschijnlijk zijn door middel van gen-

51

duplicaties en onafhankelijke fusies van de NBD’s en MSD’s de verschillende families ABC transporters ontstaan en verder geëvolueerd. Zowel bij prokaryoten als bij eukaryoten bestaat er een grote diversiteit in de organisatie van de genen in operons, waarbij de genen vaak gefusioneerd zijn en zo coderen voor halftransporters of volledige transporters (Figuur 22).

Figuur 22: Organsiatie van prokaryote (a) en eukaryote (b) ABC genen in operons ; wit: MSD; grijs: NBD; gestreept: R-domein.

Door sequenering van het genoom van talrijke organismen werd het mogelijk om een overzicht te krijgen over de evolutie van de ABC transporters.

Verschillende

vergelijkende studies van genomen van prokaryoten leidde tot een classificatie op basis van structuur en functie van de transporters (Linton et al., 1998; Tomii et al., 1998; Quentin et al., 1999). Prokaryote en eukaryote ABC transporters kunnen zo samen onderverdeeld worden in 22 subfamilies (Peelman, niet gepubliceerde data). Deze classifacatie van prokaryote samen met eukaryote transporters geeft een beter inzicht in de evolutie van de ABC transporters en toont aan hoe eukaryote transporters ontstaan zijn uit de prokaryote subfamilies door verschillende onafhankelijke fusies en duplicaties van NBD en MSD proteïnen.

Humane ABC transporters worden

geclassificeerd in zeven verschillende subfamilies, gaande van ABCA tot ABCG

52

(Higgins, 1992; Holland et al., 1999), en hun ontstaan wordt schematisch voorgesteld in Figuur 23 (Peelman, niet gepubliceerde data).

Figuur 23: Schematische voorstelling van de evolutie van prokaryote naar eukaryote ABC transporters, met aanduiding van de verschillende fusies en duplicaties van de NBD (oranje) en MSD (groen) proteïnen. De overgang tussen pro –en eukaryoten wordt voorgesteld als een stippelijn. R-domein : rood.

53

5. De rol van humane ABC transporters bij het lipide metabolisme.

Verschillende humane ABC transporters spelen een belangrijke rol bij het transport van lipiden door de membraan:

De ABCA1 transporter staat in voor het transport van cellulaire fosfolipiden en cholesterol doorheen de plasmamembraan. Deze transporter speelt een cruciale rol bij het ‘omgekeerd cholesterol transport’ en de bescherming tegen atherosclerose (zie verder).

ABCB1 (ook multi drug resistance protein of MDR1) en de ABCB4 (MDR3) zijn betrokken bij het actief transport van fosfolipiden doorheen de plasmamembraan. ABCB1 stimuleert verestering van cholesterol in de plasmamembraan (Luker et al., 1999). Een verhoogde ABCB1 mRNA expressie in patiënten met atherosclerose (Batetta et al., 2001), en in ABCA1-deficiënte fibroblasten bevestigen dat deze transporter betrokken is bij de accumulatie van intracellulair cholesterol in atherosclerotische letsels. ABCB4 staat in voor het transport van fosfatidylcholine (Smith et al., 1994) bij de secretie in gal.

ABCD2 (adrenoleukodystrophy-related gene, ALDR) is betrokken bij het transport van lange keten vetzuren in de peroxisomen.

Verder werd recent aangetoond dat mutaties in de ABCG5 en ABCG8 transporters betrokken zijn bij de ontwikkeling van sitosterolemia, een ziekte waarbij plantensterolen abnormaal gemetaboliseerd worden.

Beide half-transporters

heterodimeriseren tot een functionele transporter die absorptie van sterolen in de darm vermindert, en secretie van sterolen in gal stimuleert (Graf et al., 2003).

6. De ABCA subfamilie.

De ABCA subfamilie bevat 12 transporters (Prades et al., 2002) (Tabel 7), die onderverdeeld worden in twee subgroepen (Broccardo et al., 1999).

54

De eerste subgroep (ABCA1-A4, A7, A12-A13) bevat zeven genen die op zes verschillende chromosomen gelocaliseerd zijn. Deze genen zijn allen opgebouwd uit 50 exons. De tweede subgroep van ABCA genen (ABCA5-A6, A8-A10) is gelocaliseerd in een cluster op chromosoom 17q24. Deze genen zijn opgebouwd uit 37-38 exons, en in tegenstelling tot de eerste subgroep, zijn er nog geen genetische aandoeningen gekend die veroorzaakt worden door mutaties in deze genen. Een analyse van de spliceplaatsen van deze genen toont aan dat de lokalisatie van de introns, en de grootte van de exons zeer gelijkaardig zijn.

Samen met het feit dat deze cluster eveneens

voorkomt op het genoom van de muis, maar niet teruggevonden wordt bij Drosophila of C. elegans, wordt vermoed dat deze genen in de evolutie later voorkomen dan die van subgroep 1.

Transporter

Chromosoom

Belangrijkste plaatsen van expressie

ABCA1

9q31

lever, nieren, uterus

ABCA2

9q34

hersenen

ABCA3

16p13.3

lever, longen, nieren

ABCA4

1p22

retina

ABCA5

17q24

spieren

ABCA6

17q21

lever

ABCA7

19p13.3

milt

ABCA8

17q24

eierstokken

ABCA9

17q24

hart

ABCA10

17q24

spieren

ABCA12

2q34

maag

ABCA13

7p12.3

luchtpijp, testis, beenmerg

Tabel 7: Overzicht van de 12 gekende humane ABCA transporters, hun chromosomale lokalisatie en belangrijkste plaatsen van expressie.

55

Zowel genetisch als structureel is er een sterke conservatie tussen de verschillende leden van de ABCA subfamilie. De verschillende genen zijn 60% identiek, en de conservatie tussen homologen bij andere species is eveneens extreem hoog, tot 85% identiek (Broccardo et al., 1999).

Ook de intron-exon organisatie is zeer sterk

geconserveerd, vooral in de regio’s die coderen voor de nucleotide bindende domeinen en voor de transmembranaire domeinen (Allikmetz et al., 1998).

De ABCA subfamilie onderscheidt zich van de andere humane ABC transporters door het feit dat er geen homologen gekend zijn in gist. Eveneens bevatten de ABCA transporters karakteristiek een sterk geconserveerd domein na de NBD’s, aan dit domein wordt een regulatorische functie toegeschreven (R-domein).

7. De ABCA1 transporter.

7.1. Algemeen. Het ABCA1 gen, bestaande uit 49 exons en gelocaliseerd op chromosoom 9q31, codeert voor een proteïne van 2261 aminozuren met een moleculair gewicht van 220 kDa (Langmann et al., 1999).

De ABCA1 transporter komt voornamelijk tot

expressie in de lever, placenta, longen, nieren en foetale weefsels en is het prototype van ABC transporters die behoren tot de ABCA subfamilie (Broccardo et al., 1999). Een functionele ABCA1 transporter bestaat uit twee sterk geconserveerde nucleotide bindende domeinen, twee transmembranaire domeinen (Figuur 24) en twee regulerende domeinen (Peelman et al., 2003). De NDB’s bevatten de Walker A en Walker B motieven en het signatuur motief, en de MSD’s zijn elk opgebouwd uit zes membraan overspannende helices.

56

Figuur 24: Schematische voorstelling van de structuur van de ABCA1 transporter, opgebouwd uit twee nucleotide bindende domeinen (NBD), twee regulerende domeinen (R) en twee transmembranaire domeinen (MSD).

7.2. Functies van de ABCA1 transporter.

7.2.1. De rol van ABCA1 bij het cholesterol transport.

7.2.1.1. De ziekte van Tangier. In 1999 werd in drie onafhankelijke publicaties aangetoond dat mutaties in het ABCA1 gen verantwoordelijk zijn voor de ziekte van Tangier (Bodzioch et al., 1999; Brooks-Wilson et al., 1999; Rust et al., 1999). De ziekte van Tangier is een zeldzame autosomaal recessieve genetische aandoening die bij homozygoten biochemisch gekarakteriseerd wordt door een verlaagde concentratie aan plasma HDL-cholesterol, een verlaagde concentratie aan LDL, een verlaagde concentratie apolipoproteïne AI en AII en meer triglyceriden.

Het klinisch fenotype van deze patiënten bestaat

voornamelijk uit een accumulatie van cholesterolesters in de amandelen, de milt, het

57

perifere zenuwstelsel en in macrofagen en vroegtijdige cardiovasculaire aandoeningen (Assmann et al., 1995). Door mutaties in ABCA1 hebben de patienten met de ziekte van Tangier een defectieve apolipoproteïne gemedieerde cholesterol efflux, terwijl de niet-specifieke diffusie van cholesterol uit de cel behouden blijft (Francis et al., 1995). Bij deze patiënten wordt lipide-vrij apo AI dus niet gemetaboliseerd tot nieuwe pre-beta HDL partikels, wat leidt tot een snelle degradatie van apo AI en een abnormaal HDL metabolisme waarbij cholesterol en cholesterolesters in de macrofaagcellen van verschillende weefsels accumuleren. Mutaties in ABCA1 werden ook geassocieerd met Familiale HDL Deficiëntie (FHD) (Brooks-Wilson et al., 1999). Hierbij komen de mutaties voor in slechts één ABCA1 allel waardoor de patiënten minder ernstige fenotypische kenmerken vertonen.

Er zijn reeds 50 gekende mutaties die leiden tot de ziekte van Tangier en FHD (Singaraja et al., 2003), 23 missense mutaties, 6 nonsense mutaties en 21 inserties of deleties. 49 van deze mutaties komen voor in exons en één mutatie in intron 2 leidt tot een abnormaal gespliced transcript waarbij exon 2 en/of exon 4 ontbreken. Hoewel deze mutaties verspreid zijn over bijna het volledige proteïne (Figuur 25), bevinden de meeste mutaties zich in de nucleotide bindende domeinen of in de extracellulaire lussen tussen helix 1 en 2, en tussen helix 7 en 8 (Hayden et al., 2000). Mutaties in de NBDs leiden vaak tot een defectieve ATPase activiteit waardoor de transporter niet meer functioneel is. Mutaties in de extracellulaire lussen zorgen ervoor dat ABCA1 niet aan de plasmamembraan gelokaliseerd wordt of dat de interactie met het apo AI verhinderd wordt.

58

Figuur 25: Mutaties in ABCA1 die leiden tot de ziekte van Tangier of FHD.

7.2.1.2. Lokalisatie van de ABCA1 transporter in de cel. ABCA1 is verantwoordelijk voor het transport van cholesterol en fosfolipiden naar de apolipoproteïnen aan het celoppervlak (Hamon et al., 2000).

Om een beter inzicht te krijgen in het mechanisme van deze lipide-efflux werd de exacte lokalisatie van de ABCA1 transporter in de cel bepaald. Studies die gebruik maakten van het ‘green fluorescent protein’ (GFP) gekoppeld aan de ABCA1 transporter toonden aan dat ABCA1 voornamelijk aan de plasmamembraan gelocaliseerd is, en dat het transport van ABCA1 naar de plasmamembraan vereist is voor zijn functionaliteit (Neufeld et al., 2001). Dit werd eveneens bevestigd door studies met Monensine en Brefeldine A, inhibitoren van het Golgi-transport. Cholesterol en fosfolipiden worden in het endoplasmatisch reticulum gesynthetiseerd en vervolgens via het Golgi apparaat getransporteerd naar cholesterol-rijke domeinen in de binnenste schil van de plasmamembraan. Bij normale fibroblasten induceert Brefeldine A een defectieve apolipoproteïne-gemedieerde cholesterol efflux, het heeft

59

nochtans geen effect op het intracellulair transport van cholesterol naar de plasmamembraan (Liscum et al., 1992) en op de cholesterol efflux bij fibroblasten van patiënten met de ziekte van Tangier (Remaley et al., 1997). Dit wijst erop dat bij deze patiënten een defectief transport van een functionele ABCA1 transporter naar de membraan zelf aan de oorzaak ligt. Behalve aan de plasmamembraan werd de ABCA1 transporter eveneens gelocaliseerd in intracellulaire endocytische compartimenten van de cel (Hamon et al., 2000). De functionele relevantie hiervan is nog steeds onduidelijk, en endocytose van apolipoproteïnen gevolgd door binding aan lipiden en vervolgens export naar het celoppervlak werd gesuggereerd (Takahashi et al., 1999).

7.2.1.3. Het mechanisme van de lipide-efflux door ABCA1. a) De “interactie” van ABCA1 met apo AI. De defectieve apolipoproteïne-gemedieerde cholesterol efflux bij patiënten met de ziekte van Tangier en het feit dat ABCA1 overexpressie in cellen resulteert in een verhoogde binding van apo AI aan het celoppervlak (Oram et al., 2000; Wang et al., 2000) toont aan dat het apolipoproteïne AI een belangrijke rol speelt bij deze efflux.

Cross-linking van apo AI en ABCA1 suggereert een directe interactie tussen beide proteïnen (Wang et al., 2000) waarbij deze complexvorming de eerste stap zou zijn van het ABCA1 efflux mechanisme. Een alternatief model werd voorgesteld door Chambenoit et al..

In dit model

induceert ABCA1 expressie een redistributie van lipiden in de plasmamembraan waardoor apo AI moleculen, in de nabijheid van de ABCA1 transporter, kunnen binden aan de fosfolipiden aan het celoppervlak (Chambenoit et al., 2001). Smith en medewerkers suggereerden echter dat apo AI niet aan de fosfolipiden in de plasmamembraan bindt, maar aan een niet geïdentificeerd membraan proteïne dat aanwezig is in cellen die ABCA1 tot expressie brengen (Smith et al., 2002). Een interactie tussen ABCA1 en apo AI, die onafhankelijk is van de redistributie van de lipiden in de plasmamembraan, wordt eveneens verondersteld door studies van de functionaliteit van ABCA1 mutanten die leiden tot de ziekte van Tangier. ABCA1

60

heeft twee grote extracellulaire lussen waarin zich veel ABCA1 Tangier missense mutaties bevinden (Figuur 25). De meeste van deze mutanten vertonen een defectieve apo AI binding en cellulaire lipide-efflux. De W590S mutatie leidt echter tot een defectieve lipide-efflux maar een verhoogde apo AI binding, wat suggereerd dat er een interactie bestaat tussen ABCA1 en apo AI, maar dat die interactie onafhankelijk is van de lipide-efflux door ABCA1 (Fitzgerald et al., 2002). Apo AI binding zou dan voornamelijk bepaald worden door een optimale structurele conformatie van de ABCA1 transporter.

Aangezien ABCA1 mutanten met een defectieve ATPase

activiteit eveneens een defectieve apo AI binding vertonen, lijkt de goede structurele conformatie van de transporter op zijn beurt afhankelijk te zijn van zijn ATPase activiteit (Wang et al., 2001).

b) Fosfolipiden en cholesterol. Het mechanisme van cholesterol -en fosfolipiden efflux door ABCA1 is nog steeds niet volledig opgehelderd. Fosfolipide- en cholesterol efflux door ABCA1 kunnen van elkaar gedissocieerd worden (Wang et al., 2001; Yamauchi et al., 2002; Sun et al., 2003).

Een eerste model veronderstelde dan ook een 2-staps mechanisme waarbij ABCA1 verantwoordelijk is voor de efflux van fosfolipiden naar apo AI. De vorming van een initieel fosfolipide/apo AI complex zou dan een ABCA1-onafhankelijke cholesterol efflux promoten (Fielding et al., 2000).

Verschillende data suggereren echter een alternatief model waarbij de efflux van cholesterol en fosfolipiden door ABCA1 gelijktijdig gebeurt.

Hierbij wordt de

verhouding cholesterol/fosfolipide bepaald door de concentratie en/of door de beschikbaarheid van het substraat.

Sun en medewerkers suggereren dat dit

mechanisme deels gereguleerd wordt door het stearyol CoA desaturase (SCD), een enzyme dat betrokken is bij de cellulaire synthese van mono-onverzadigde uit verzadigde vetzuren (Sun et al., 2003). Bij SCD expressie zou dan minder cholesterol beschikbaar zijn voor ABCA1.

61

Studies over de kinetiek van de apo AI gemedieerde lipide efflux steunen dit model en tonen aan dat cholesterol- en fosfolipide efflux parallel verlopen in cellen die ABCA1 overexpresseren (Yancey et al., 1995; Chen et al., 2000).

7.2.1.4. Regulatie van de ABCA1 transporter. De cellulaire expressie en de activiteit van de ABCA1 transporter zijn sterk gereguleerd.

Een hoge expressieniveau van de transporter leidt tot meer

apolipoproteïne gemedieerde cholesterol- en fosfolipide efflux waardoor de concentratie aan cellulaire cholesterol en fosfolipiden daalt. Een strikte regulatie van dit systeem is dus essentieel voor het behoud van de cholesterol en fosfolipide homeostase in de cel.

De ‘turnover’ van het ABCA1 proteïne is zeer snel, met een halfwaarde tijd van minder dan 1 uur (Oram et al., 2000). Regulatie van deze turnover gebeurt op verschillende niveau’s in de cel: Zoals bij vele ABC transporters (Cheng et al., 1991) is bij ABCA1 het expressieniveau afhankelijk van de aan– of afwezigheid van het substraat. Langmann en medewerkers demonstreerden dat de hoeveelheid ABCA1 mRNA en proteïne in macrofagen stijgt na opladen van de cellen met cholesterol door incubatie met geacetyleerd LDL (Langmann et al., 1999). Deze cholesterol-geïnduceerde stijging in ABCA1 expressie wordt gemedieerd door twee receptoren die behoren tot de nucleaire receptor superfamilie, de lever X receptor (LXR) en de retinoid X receptor (RXR). Nucleaire receptoren zijn intracellulaire transcriptie factoren die, na binding met hun specifiek ligand, een welbepaald gen activeren. ABCA1 expressie wordt gereguleerd door binding van LXR/RXR heterodimeren op de promotor.

62

Figuur 26: Regulatie van ABCA1 expressie door LXR en RXR. Nadat LXR en RXR heterodimeriseren, binden ze hun herkenningssequentie (DR-4 genaamd) op de ABCA1 promotor. Binding van het LXR en/of RXR ligand leidt tot een verhoogde ABCA1 gen transcriptie, wat resulteert in een verhoogde cellulaire cholesterol efflux.

Vervolgens leidt binding van het LXR en/of het RXR ligand (22-hydroxycholesterol en 9-cis retinolzuur respectievelijk) tot een verhoogde transcriptie van het ABCA1 gen (Figuur 26) (Costet et al., 2000; Schwartz et al., 2000).

Een verhoogde binding van apo AI aan het celoppervlak resulteert eveneens in een stijging van de hoeveelheid ABCA1 proteïne maar heeft geen invloed op de hoeveelheid mRNA (Wang et al., 2003). Dit effect is een gevolg van de rol van apo AI bij de bescherming tegen ABCA1 degradatie (Arakawa et al., 2002). Zoals vele proteïnen met een snelle turnover, heeft ABCA1 een sterk geconserveerde PEST sequentie, verrijkt met proline (P), glutaminezuur (E), serine (S) en threonine (T) residu’s (Rechsteiner et al., 1996) (Figuur 27), die de degradatie van het proteïne door calpaine bevordert (Wang et al., 2003).

63

Figuur 27: Schematische voorstelling van de ABCA1 transporter, met aanduiding van de sterk geconserveerde PEST sequentie.

Wang en medewerkers toonden aan dat interactie van ABCA1 met extracellulair apo AI de calpaine gemedieerde degradatie van ABCA1 inhibeert (Wang et al., 2003), waardoor het ABCA1 proteïne meer stabiel wordt.

Yamauchi en medewerkers

toonden aan dat apo AI het proteïne kinase C (PKC) activeert (Yamauchi et al., 2003). Deze auteurs stellen een model voor waarbij de apo AI-gemedieerde lipide efflux door ABCA1 resulteert in een verminderde sphingomyeline concentratie in de plasmamembraan. De hydrolyse van fosfatidylcholine zorgt er vervolgens voor dat de membraan terug verrijkt wordt met sphingomyeline. Tijdens deze hydrolyse wordt diacylglycerol (DAG) gevormd. DAG activeert vervolgens het PKC, wat leidt tot de fosforylatie van ABCA1 (Figuur 28). Deze fosforylatie van een nog onbekend residu inhibeert calpaine degradatie en stabilizeert het ABCA1 proteïne.

64

Figuur 28: Model voor de stabilizatie van ABCA1 door apo AI: interactie van apo AI met ABCA1 leidt tot efflux van cellulair vrij cholesterol (VC), fosfolipiden (FL) en sfingomyeline (SPM), waardoor de concentratie sfingomyeline in de plasmamembraan daalt. Hydrolyse van fosfatidylcholine (PC) zorgt voor verrijking van de membraan met sfingomyeline. Het diacylglycerol (DAG), gevormd tijdens deze hydrolyse, activeert het proteïne kinase C (PKC) waarna PKC het ABCA1 proteïne fosforyleert. Fosforylatie van ABCA1 beschermt de transporter tegen degradatie door calpaine. Figuur werd overgenomen uit Yamauchi et al., 2003.

Martinez en medewerkers toonden aan dat threonine 1286 en threonine 1305 in de PEST sequentie van ABCA1 constitutief gefosforyleerd worden. Beide threonines zijn potentiële fosforylatieplaatsen van het caseine kinase 2 (CK2) en proteïne kinase A (PKA) respectievelijk. Hoewel beide threonine residu’s constitutief gefosforyleerd zijn, hebben inhibitoren van CK2 of PKA geen effect op de fosforylatie van de PEST sequentie en op de stabilizatie van ABCA1. Mutatie van beide residu’s resulteert echter wel in een hoger expressieniveau van ABCA1 en een stijging in apo AIgemedieerde cholesterol efflux (Martinez et al., 2003). CK2 en PKA fosforylatie van ABCA1 zorgen dus niet voor regulatie van de ABCA1 stabiliteit, maar beide kinasen spelen waarschijnlijk een andere, nog onbekende, regulerende rol. De rol van PKA

65

werd bevestigd door See et al., die aantoonden dat ABCA1 door PKA gefosforyleerd wordt op serine 2054. Mutatie van deze serine leidt tot een sterk verminderde apo AIgemedieerde lipide efflux (See et al., 2002). Behalve ABCA1, worden ook de ‘cystic fibrosis transmembrane regulator’ (CFTR) (Cheng et al., 1991; Piciotto et al., 1992) en het P-glycoproteïne (Goodfellow et al., 1996) gefosforyleerd door proteïne kinase A (PKA) en proteïne kinase C.

Eveneens werd voor transporters van de humane ABCA subfamilie een regulerend domein gesuggereerd (Sheppard et al., 1999). In analogie met de CFTR transporter (Winter et al., 1997) bevat ABCA1 een sterk geconserveerde sequentie van 80 aminozuren gelocaliseerd C-terminaal van de nucleotide bindende domeinen. Over de functie van dit domein bij ABCA1 is echter nog niets gekend.

Cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP) speelt eveneens een belangrijke rol bij de regulatie van de gen expressie en activiteit van ABCA1. Incubatie van fibroblasten en macrofagen met 8-Br-cAMP resulteert in een 10-voudige stijging van de hoeveelheid ABCA1 mRNA, een stijging van de hoeveelheid ABCA1 proteïne, meer apo A1gemedieerde cholesterol efflux en meer binding van apo A1 aan het celoppervlak (Lawn et al., 1999; Oram et al., 2000).

In tegenstelling tot cAMP, reduceert interferon-gamma (IFN-γ) de hoeveelheid ABCA1 mRNA en de lipide efflux activiteit van ABCA1. IFN-γ zou hierdoor de omzetting van macrofagen naar schuimcellen stimuleren en dus het proces van atherosclerose versnellen (Panousis et al., 2000).

Tenslotte heeft de groeiconditie van de cel ook een invloed op de ABCA1 expressie. Condities die de celgroei onderdrukken, zoals groeimedia zonder serum, verhogen het ABCA1 expressieniveau, terwijl serum-bevattende media het expressieniveau verlagen (Lawn et al., 1999).

66

7.2.2. ABCAI flippase activiteit, fosfolipiden en apoptose. De ABCA1-transporter is betrokken bij de translocatie van fosfolipiden (voornamelijk fosfatidylserine)

en

cholesterol

naar

de

exoplasmatische

zijde

van

de

plasmamembraan. Bij de translocatie van negatief geladen fosfatidylserine verandert de organisatie van de celmembraan.

Fosfolipiden zijn asymmetrisch verdeeld over de plasmamembraan (Op, 1979). Deze asymmetrische verdeling werd voornamelijk bestudeerd in humane erythrocyten (Bretscher, 1972; Gordesky et al., 1973; Verklije et al., 1973) (Figuur 29). De aminofosfolipiden (fosfatidylserine en fosfatidylethanolamine) zijn voornamelijk gesitueerd aan de binnenzijde van de plasmamembraan vergeleken met fosfatidylcholine en sfingomyeline, die voornamelijk aan de buitenzijde van de plasmamembraan te vinden zijn. Het behoud van deze asymmetrie is van groot fysiologisch belang. Zo toonden Tanaka en Schroit reeds aan dat het verschijnen van fosfatidylserine aan de buitenzijde van de membraan van erythrocyten een signaal kan zijn voor verwijdering uit de bloedbaan (Tanaka et al., 1983; Schroit et al., 1985). Eveneens wordt de fagocytose van apoptotische cellichaampjes door macrofagen in gang gezet door een herverdeling van de plasmamembraan fosfatidylserine bij zowel de fagocyt als bij de te fagocyteren celresten (Marguet et al., 1999).

67

Figuur 29: Asymmetrische verdeling van fosfolipiden in de membraan van humane erythrocyten. Boven: de verdeling wordt gegeven als een percentage van elke fosfolipide. Onder: de verdeling wordt gegeven als een percentage van de totale hoeveelheid fosfolipide. Afkortingen: SM, sfingomyeline; PC, fosfatidylcholine; PE, fosfatidylethanolamine; PS, fosfatidylserine; PI, fosfatidylinositol; PIP, fosfatidylinositol 4-fosfaat; PIP2, fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat; PA, fosfatidylzuur.

De link naar de ABCA1-transporter werd gelegd door de groep van Chimini die aantoonde dat deze transporter, waarvan de expressie tijdens de embryologische ontwikkeling overeenkomt met het verschijnen van geprogrammeerde celdood, vereist is voor macrofagen die de apoptotische cel resten opnemen (Ellis et al., 1991; Luciani et al., 1996; Hamon et al., 2000). Bovendien werd aangetoond dat ABCA1-knock-out macrofagen een verminderde capaciteit vertonen om apoptotische cellen te fagocyteren en dat dit hersteld werd na overexpressie van ABCA1.

68

Doelstelling

69

VIII. Doelstelling Apolipoproteïne AI speelt naast zijn structurele rol in HDL eveneens een belangrijke rol in het ‘omgekeerd cholesterol transport’ waarbij het overtollige cholesterol vanuit de perifere weefsels naar de lever getransporteerd wordt. Verschillende stappen in dit proces zijn afhankelijk van de eigenschappen van apo AI : Apo AI is de belangrijkste activator van het lecitine cholesterol acyltransferase (LCAT). Het LCAT enzyme is voornamelijk actief aan het oppervlak van de HDLpartikels, waar het instaat voor de verestering van cholesterol. Door de verestering van vrij cholesterol in de HDL-partikels ontstaat een concentratiegradiënt waardoor de opname van vrij cholesterol uit de celmembraan en het transport ervan naar de lever gestimuleerd wordt. Apo AI is het belangrijkste ligand voor de ATP-bindende cassette transporter A1 (ABCA1). ABCA1 staat in voor de efflux van vrij cholesterol en fosfolipiden uit de cellen. Interactie van apo AI met de celmembraan stimuleert deze efflux, waarna de fosfolipiden en het cholesterol door apo AI gebonden worden, wat resulteert in de vorming van nieuwe pre-beta HDL-partikels. In dit werk wordt getracht een beter inzicht te krijgen in het mechanisme van deze twee belangrijke stappen van het omgekeerd cholesterol transport, waarbij het apo AI een cruciale rol speelt.

Het mechanisme van LCAT activering door apo AI.

Studies van de LCAT activering door deletiemutanten van apo AI toonden reeds aan dat het gebied tussen residu’s 143 en 165 in apo AI hierbij een belangrijke rol speelt (Jonas et al., 1998). Om na te gaan welke specifieke residu’s in dit gebied instaan voor LCAT activering, wordt de conservatie en de positie van de residu’s in de αhelix, en de elektrische potentiaal van dit gebied bestudeerd.

Na plaatsgerichte

mutagenese, waarbij de residu’s die mogelijks betrokken zijn bij de activering van LCAT vervangen worden, worden de apo AI mutanten tot expressie gebracht in E. coli en gezuiverd door middel van affiniteitschromatografie.

Het effect van de

mutaties op de lipide-binding, structuur en LCAT activering wordt bestudeerd.

70

Hoe wordt cholesterol efflux door ABCA1 naar apo AI gereguleerd ?

In 1999 werd aangetoond dat mutaties in het ABCA1 gen verantwoordelijk zijn voor de ziekte van Tangier (Bodzioch et al., 1999; Brooks-Wilson et al, 1999; Rust et al., 1999).

Deze ziekte wordt gekenmerkt door een defecte apo AI-gemedieerde

cholesterol efflux. Bij de aanvang van dit werk was echter nog weinig gekend over het mechanisme van cholesterol transport door ABCA1 naar apo AI. Om een beter inzicht te krijgen in de manier waarop dit proces gereguleerd wordt, worden de regulerende domeinen van de ABCA1 transporter meer in detail geanalyseerd. In het regulerend domein na Nucleotide Bindend Domein 1 (NBD1) en NBD2 bevinden zich geconserveerde proteïne kinase CK2 fosforylatieplaatsen, die kenmerkend zijn voor de ABCA transporters.

In een eerste fase worden de NBD1+R1 en NBD2+R2 domeinen van ABCA1 tot expressie gebracht in E. coli. Om aggregatie te minimaliseren worden verschillende constructen met variabele lengte tot expressie gebracht en gezuiverd via affiniteitschromatografie.

Na zuivering van deze domeinen van de ABCA1

transporter, wordt hun ATPase activiteit, de ATP binding en hun in vitro fosforylatie door CK2 bestudeerd. Het belang van de geconserveerde CK2 fosforylatie plaatsen wordt in vivo bestudeerd door transfectie van wild type ABCA1 en ABCA1 mutanten in HEK293 cellen. Het effect van de mutaties op de ABCA1 flippase-activiteit, op de binding van apo AI aan de cel en op de cellulaire efflux van fosfolipiden en cholesterol naar apo AI wordt bestudeerd.

71

Resultaten

72

IX. Drie arginine residu’s in apolipoproteïne A-I zijn belangrijk voor de activatie van lecithine:cholesterol acyltransferase. Three arginine residues in apolipoprotein A-I are critical for activation of lecithin:cholesterol acyltransferase.

J Lipid Res. 2001 Jan;42(1):31-40.

Apolipoproteïne AI is de belangrijkste activator van het LCAT enzyme. Studies van de LCAT activering door deletiemutanten van apo AI toonden reeds aan dat het gebied tussen residu’s 143 en 165 in apo AI (helix 6) hierbij een belangrijke rol speelt (Jonas et al., 1998).

Figuur 30: Detail van de helix 143-164 (helix 6) in het dimeer van apo AI ∆(1-43). A: vooraanzicht, met aanduiding van de drie arginines (R149, R153 en R160) waarvan de zijketens naar buiten gericht zijn. B: zijaanzicht van het helixpaar, met aanduiding van de hydrofobe en de hydrofiele zijde van de amfipatische helices. A en B: zwart: hydrofobe residu’s; grijs: niet geladen hydrofiele residu’s; rood: negatief geladen residu’s; blauw: positief geladen residu’s.

73

Een meer gedetailleerde studie van deze zesde amfipatische helix van apo AI in de kristalstructuur van apo AI ∆(1-43), toont aan dat de drie arginines op posities 149, 153 en 160 gesitueerd zijn aan de rand van de hydrofobe en de hydrofiele zijde van de helix (Figuur 30). Vergelijking van deze helix 6 tussen verschillende species toont bovendien aan dat deze drie arginine residu’s sterk geconserveerd zijn (Figuur 30). Een dergelijke cluster van drie opeenvolgende arginines komt eveneens niet voor in de andere helices van apo AI en wordt bovendien niet teruggevonden in andere apolipoproteïnen. Studie van de elektrische potentiaal rond apo AI toont aan dat apo AI hoofdzakelijk negatief geladen is, behalve ter hoogte van helix 6 en 7, waar een positieve potentiaal aanwezig is (Figuur 31).

Figuur 31: Weergave van de elektrische potentiaal van apo AI ∆(1-43). Rood: negatieve potentiaal, -1 kt/e; blauw: positieve potentiaal, +0.5 kt/e.

De interactie van het LCAT enzyme met HDL partikels wordt hoofdzakelijk bepaald door de fosfolipide samenstelling van de HDL (Bolin et al., 1994). Bij schijfvormige HDL partikels, het beste substraat van LCAT, bindt het enzyme voornamelijk aan het fosfolipide oppervlak van de HDL schijf. Een interactie tussen apo AI en LCAT is

74

enkel mogelijk aan de rand van deze schijf. In helix 6 van apo AI is een interactie mogelijk tussen de cluster van de drie positief geladen arginines (R149, R153 en R160) in apo AI met negatieve residu’s van het HDL-gebonden LCAT. Deze drie arginines kunnen dus een belangrijke rol spelen bij de activering van LCAT.

Om deze hypothese te bevestigen, werd gebruik gemaakt van verschillende mutanten van apo AI. De drie arginines op positie 149, 153 en 160 werden gemuteerd naar een neutraal aminozuur (glutamine, Q). Er werden mutanten geconstrueerd met één, twee of drie gemuteerde arginines. Binnen de helix 6 van apo AI kunnen deze drie arginines mogelijks zoutbruggen vormen met de residu’s E146, D150 en D157 respectievelijk. Om mogelijke effecten van de mutatie van de arginines op de stabiliteit van helix 6 uit te sluiten, werden deze negatief geladen residu’s gemuteerd naar een neutraal aminozuur : E146Q, D150N en D157N. Na helix 143-164 bevindt er zich in apo AI nog een gebied met een positieve potentiaal, tussen residu’s R171 en K182 in helix 7 (Figuur 31). Om de rol van deze residu’s bij LCAT activatie na te gaan werden mutanten geconstrueerd die de positieve potentiaal in dit gebied verlagen (R171Q) of verhogen (A175R).

Wild type apo AI en mutanten werden tot expressie gebracht in E. coli.

De

recombinante eiwitten werden N-terminaal voorzien van een poly-histidine staart (6 histidine residu’s), waardoor ze efficiënt gezuiverd konden worden via Niaffiniteitschromatografie.

Na zuivering werd gemiddeld 10 mg apo AI per liter

medium bekomen. De recombinante eiwitten werden vervolgens geïncorporeerd in een complex bereid met een fosfolipide/cholesterol/apo AI verhouding van 2/0.2/1 (w/w/w).

Deze

complexen vormen een modelsysteem voor schijfvormige HDL-partikels, en zijn dus een goed substraat voor het LCAT enzyme. Uit gelfiltratie experimenten op een Superose 6PG kolom bleek dat alle gevormde complexen homogeen zijn, en natieve gelelektroforese toonde aan dat de complexen een vergelijkbare grootte hebben. Eventuele verschillen in LCAT activering door de apo AI mutanten is dus niet te wijten aan een verschillende grootte van de gevormde complexen.

75

Uit fluorescentiemetingen bleek dat de maximale tryptofaan emissie golflengte en de ‘blue shift’ vergelijkbaar zijn voor wild type apo AI en mutanten. De recombinante eiwitten binden dus op een gelijkaardige manier aan de fosfolipiden in het complex. Ook waren er geen structurele verschillen, aangezien uit circulair dichroïsme metingen bleek dat het percentage α-helix en de toename van dit percentage bij binding aan fosfolipiden vergelijkbaar was voor de verschillende eiwitten.

Na incubatie van de verschillende complexen met het LCAT enzyme werden de Vmax en Km waarden berekend. De Vmax waarden voor de arginine mutanten waren significant lager dan die voor wild type apo AI. Substitutie van één arginine leidde tot een 6-10 keer lagere Vmax. Dit effect was nog meer uitgesproken voor de dubbele en triple mutanten, 12-25 en 30 keer respectievelijk. Dit effect was niet te wijten aan het verbreken van zoutbruggen, aangezien de E146Q, D150N en D157N mutanten een zeer beperkt effect hadden op de Vmax waarde. Het belang van de arginine residu’s werd verder bevestigd door de Vmax waarde van een apo AI mutant waarbij de arginine op positie 153 vervangen werd door een lysine.

Hoewel de positieve lading behouden blijft,

heeft deze

substitutie hetzelfde effect als de R153Q mutant. Mutaties in het gebied na helix 143-164 hebben geen effect op de Vmax waarde. Het effect van de mutaties op de Michaëlis-Menten constante Km was beperkt, aangezien binding van het LCAT enzyme op HDL voornamelijk gebeurt via de fosfolipiden. Het berekenen van de katalytische efficiëntie (Vmax/Km) toonde duidelijk aan dat mutatie van één of meerdere arginines in de 149-153-160 cluster de enzymatische activiteit van LCAT op de apo AI/lipide complexen drastisch vermindert, tot 10% van wild type apo AI.

Uit deze experimenten kan worden besloten dat de drie sterk geconserveerde arginines in helix 6 van apo AI (R149, R153 en R160) een belangrijke rol spelen bij de activering van het LCAT enzyme. Een model werd voorgesteld waarbij LCAT bindt aan HDL door interactie met de fosfolipiden. Activatie van LCAT door apo AI gebeurt vervolgens door interactie met de drie arginines aan de rand van het HDL partikel. Verdere analyse van deze resultaten toont aan dat een dergelijke interactie

76

tussen de drie arginines in apo AI en het LCAT enzyme enkel mogelijk is wanneer apo AI zich op de HDL partikels in de riem conformatie bevindt.

77

Three arginine residues in apolipoprotein A-I are critical for activation of lecithin:cholesterol acyltransferase Stein Roosbeek,* Berlinda Vanloo,* Nicolas Duverger,§ Hans Caster,* Joke Breyne,* Iris De Beun,* Hetal Patel,** Joël Vandekerckhove,† Carol Shoulders,** Maryvonne Rosseneu,1,* and Frank Peelman* Laboratory for Lipoprotein Chemistry,* Department of Biochemistry, Ghent University, B-9000 Ghent, Belgium; Department of Medical Protein Research,† Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology, B-9000 Ghent, Belgium; Aventis,§ Vitry-sur-Seine 94403, France; MRC Molecular Medicine Group,** Clinical Sciences Centre, Hammersmith Hospital, London W12 ONN, UK

Abstract Previous studies have suggested that the helical repeat formed by residues 143–164 of apolipoprotein A-I (apoA-I) contributes to lecithin:cholesterol acyltransferase (LCAT) activation. To identify specific polar residues involved in this process, we examined residue conservation and topology of apoA-I from all known species. We observed that the hydrophobic/hydrophilic interface of helix 143–164 contains a cluster of three strictly conserved arginine residues (R149, R153, and R160), and that these residues create the only significant positive electrostatic potential around apoA-I. To test the importance of R149, R153, and R160 in LCAT activation, we generated a series of mutant proteins. These had fluorescence emission, secondary structure, and lipid-binding properties comparable to those of wild-type apoA-I. Mutation of conserved residues R149, R153, and R160 drastically decreased LCAT activity on lipidprotein complexes, whereas control mutations (E146Q, D150N, D157N, R171Q, and A175R) did not decrease LCAT activity by more than 55%. The markedly decreased activities of mutants R149, R153, and R160 resulted from a decrease in the maximal reaction velocity Vmax because the apparent Michaelis-Menten constant Km values were similar for the mutant and wild-type apoA-I proteins. These data suggest that R149, R153, and R160 participate in apoA-Imediated activation of LCAT, and support the “belt” model for discoidal rHDL. In this model, residues R149, R153, and R160 do not form salt bridges with the antiparallel apoA-I monomer, but instead are pointing toward the surface of the disc, enabling interactions with LCAT. — Roosbeek, S., B. Vanloo, N. Duverger, H. Caster, J. Breyne, I. De Beun, H. Patel, J. Vandekerckhove, C. Shoulders, M. Rosseneu, and F. Peelman. Three arginine residues in apolipoportein A-I are critical for activation of lecithin:cholesterol acyltransferase J. Lipid Res. 2001. 42: 31–40. Supplementary key words

HDL • enzyme • lipoprotein • cholesterol

The role of apolipoprotein A-I (apoA-I) in the metabolism and maturation of different subclasses of high density lipoproteins (HDL) has been well documented (1). ApoA-I is synthesized as a prepropeptide, and is cleaved in plasma

to a 243-amino acid residues protein. ApoA-I associates with phospholipids and cholesterol, and acts as acceptor of cellular lipids to promote “reverse cholesterol transport” (2). In this process, lipid-free apoA-I “solubilizes” cellular lipids through a direct interaction with the donor plasma membrane, or specific receptors, such as the scavenger receptor class B type I (SR-BI) receptor (3) and the adenosine triphosphate (ATP)-binding cassette transporter ABC-A1 (4–6). ApoA-I also mediates the maturation of HDL through the activation of lecithin:cholesterol acyltransferase (LCAT). LCAT converts cholesterol to cholesteryl esters (7), through the hydrolysis of the sn-2 fatty acid of lecithin and esterification of the hydroxyl group of cholesterol. The cholesteryl esters are incorporated into the core of HDL, and exchanged with either low density lipoprotein (LDL) or very low density lipoprotein lipids, or taken up by the liver through the action of the SR-BI receptor (3). ApoA-I has been sequenced both at the protein and cDNA level (8, 9), and the occurrence of 11- and 22-residue helical repeats has been predicted by internal homology calculations (10). These bind lipids and have a unique amphipathic character, with separate hydrophilic and hydrophobic faces (11). A crystal structure for lipid-free apoA-I, apoD(1–43)A-I, has been determined at 4-Å resolution (12). ApoA-I forms a nearly continuous nonplanar amphipathic helix, with dimensions of 125 3 80 3 40 Å, in the shape of a horseshoe. The structure comprises 10

Abbreviations: apo, apolipoprotein; apoD(1–43)A-I, lipid-free apoA-I; DMPC, 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine; HDL, high density lipoprotein; HPLC, high performance liquid chromatography; LCAT, lecithin:cholesterol acyltransferase; LDL, low density lipoprotein; PCR, polymerase chain reaction; PLPC, 1-palmitoyl-2-linoleoyl-sn -glycero-3phosphatidylcholine; rHDL, reconstituted high density lipoprotein; SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; SR-BI, scavenger receptor class B type I. 1 To whom correspondence should be addressed.

Journal of Lipid Research Volume 42, 2001

31

helical segments, named A1–A10, which are punctuated by small or pronounced kinks at regularly spaced proline residues. In the unit cell of the crystal, four apoA-I monomers form two antiparallel dimers that are associated via their hydrophobic faces. Such a structure is predicted to be conserved in lipid-associated apoA-I, as the dimensions of the dimer are compatible with those of discoidal and spherical HDL (12). Two general models have been proposed for discoidal nascent HDL, the preferred substrate for LCAT. The “belt” model, proposed by Segrest et al. (13), consists of an apoA-I dimer made of two antiparallel monomers. These monomers surround the edge of the disc and are oriented parallel to the face of the discoidal particle. This is reminiscent of the “horseshoe” structure of crystalline apoA-I. In the alternative “picket-fence” model proposed by Brasseur et al. (14) and by Phillips et al. (15), the helical repeats are oriented perpendicular to the faces of the disc, and are parallel to the phospholipid acyl chains. This model is supported by attenuated total reflection infrared measurements, performed on a Ge plate (14, 16), whereas the belt model is favored by infrared measurements at an air-water interface (17). Previous studies have suggested that helical repeats 6 and 7 of apoA-I are critical for the activation of LCAT by apoA-I, but the specific residues that mediate this activation have not been identified. Thus, it is well established that monoclonal antibodies directed against residues 143–164 of apoA-I suppress the activation of LCAT by apoA-I, while synthetic peptides that encompass helical repeats 6 and 7 activate LCAT. Conversely, the activation of LCAT by apoA-I is impaired by naturally occurring or genetically engineered apoA-I proteins that lack helical repeat 6 and 7. Sorci-Thomas et al. (18) have further demonstrated that rotation of the hydrophobic face of helix 143–164 of apoA-I by about 808 markedly reduces LCAT activation. Finally, this region of apoA-I harbors three naturally occurring missense mutations, R151C, R160L, and H162Q, associated with decreased LCAT activation. In the present study, we have used the crystal structure of apoA-I, comparative sequence analysis, and site-directed mutagenesis to address the issue of LCAT activation by apoA-I. We demonstrate that helical repeat 6 contains a cluster of three strictly conserved arginine residues (Arg-149, Arg-153, and Arg-160), and that these are critical for LCAT activation. Importantly, the data provide experimental support for the belt model conformation of discoidal HDL.

MATERIALS AND METHODS Sequence analysis and computer modeling The electrostatic potential calculations were per formed on monomer A in the crystalline structure of apo( D1–43)A-I (12), using the Delphi program (19), as implemented in the MSI Insight97 software package (Molecular Simulations, San Diego, CA). Calculations were performed with actual atomic charges, as defined by the CHARMM atomic force field (20), a dielectric constant of 8 for the solute, and 80 for the solvent. A focusing approach was used to reduce grid boundary effects, where the

32

Journal of Lipid Research Volume 42, 2001

monomer filled 23% of a 63 3 63 3 63 points grid, during the first coarse calculation, and 80% of the 63 3 63 3 63 points grid in the focusing calculation. Sequences of human (P02647), cynomolgus monkey (P15568), pig (P18648), cow (P15497), dog (P02648), rabbit (P09809), tree shrew (O18759), mouse (Q00623), rat (P04639), golden hamster (Q9Z2L4), hedgehog (Q9TS49), chicken (P08250), quail (P32918), and duck (O42296) apoA-I were aligned by CLUSTAL W (21), available at http://www.ebi.ac.uk/clustalw/. For sequence comparison between the helices of human apoA-I, apoA-IV, apoA-II, apoE, apoC-I, apoC-II, and apoC-III, these sequences were divided in overlapping stretches of 36 residues, which were displayed in a helical wheel projection.

Site-directed mutagenesis Polymerase chain reaction (PCR) and the appropriate restriction sites were used to manipulate the apoA-I sequence. Mutagenesis was performed by a two-step PCR-based strategy using Pfu DNA polymerase in accordance with the manufacturer’s instructions (Stratagene, UK). The template was the plasmid pALTER/ apoA-I, which encompasses nucleotides 1887 –2292 of the apoA-I sequence (GenBank accession number J0098). To facilitate cloning, the SstI site at nucleotides 1923 –1928 of apoA-I was mutated; this did not alter the encoded sequence. The first-round PCRs were performed with a forward mutagenic oligonucleotide .35 bases in length. The sequence of the reverse oligonucleotide was 59-GACTATGGATCCTCACTGGGTGTTGAGCTTCTT39. The sequence of the forward primer for the second-round PCR was 59-AGATGGAGCTCTACCGCCAGAAGGTGGAGCCG CTGCGCGCAGAACTGCAAGAGGGCGCGCGCCAG-3 9. The reverse primer was the product of the first-round PCR. The mutant apoA-I cDNAs were introduced into the PXL2769.apoA-I vector (22). The sequences of all constructs were confirmed.

Expression and purification of the recombinant proteins The expression system under the control of the T7 promotor had been described previously for apoA-IV (22). The expression vector pXL2769 for wild-type apoA-I, and the corresponding vectors for the apoA-I mutants, were introduced into Escherichia coli BL21(DE3) pLysS cells, for expression of histidine-tagged apoA-I mutants. Bacteria were grown overnight at 37 8C in Terrific Broth medium, supplemented with ampicillin (100 mg/ml) and chloramphenicol (50 mg/ml). Five milliliters of this culture was used to inoculate 1 liter of the same medium. Cultures were grown at 378C until an absorbance at 610 nm of about 0.7 was reached. Isopropyl- b-d-thiogalactoside was then added to a final concentration of 1 mM, followed by a 15-min incubation at 30 8C to induce apoA-I expression. Rifampicin was added to a concentration of 100 mg/ml, and the cells were incubated for 60 min, harvested by centrifugation, and frozen at 2208C. ApoA-I expression was verified by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). For protein extraction, the pellets were resuspended by addition of 5 ml of a 100 mM sodium phosphate lysis buffer, pH 7.4, containing 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride per gram of bacteria. The cells were disrupted by five 5-min cycles of sonication at 70 W, using a Vibracell TM sonifier (Sonics, Newtown, CT). Whole cells and cellular debris were removed by centrifugation at 2,000 g for 15 min at 48C, in an Eppendorf centrifuge. Nucleic acids were precipitated by addition of 10 ml of a 100 g/l solution of streptomycin sulfate, per gram of bacterial protein in the supernatant fraction. The mixture was incubated overnight at 4 8C, and centrifuged at 6,000 g for 15 min at 48C in an Eppendorf centrifuge, to remove the precipitated material. The apoA-I proteins were purified in the supernatant by affinity chromatography on a Ni-Probond column (InVitrogen, San Diego,

CA), equilibrated in a 100 mM phosphate buffer, pH 8.0, containing 6 M guanidium hydrochloride. The wild-type and mutant apoA-I proteins were eluted from the column by a stepwise decrease in the elution buffer pH, from 8.0 down to 6.0, 5.0, and 4.0. The eluted fractions were tested for the presence of apoA-I protein by SDSPAGE. The fractions eluting at pH 4.0, containing pure apoA-I, were dialyzed against a 5 mM NH 4HCO3 buffer and lyophilized.

Preparation and isolation of the apolipoprotein-lipid complexes Reconstituted HDL (rHDL) consisting of 1-palmitoyl-2-linoleoylphosphatidylcholine/cholesterol/apoA-I at a ratio of 2:0.1:1 (w/ w/w) were prepared by the cholate dialysis method (23). The homogeneity and yield of the reconstituted HDL were tested by separation on a Superose 6PG column equilibrated in a 10 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0, containing 150 mM NaCl in a fast protein liquid chromatography system. Composition and size determination were performed on the top fractions of the elution peak of the complex. The lipid and apolipoprotein compositions of the complexes were obtained by an enzymatic colorimetric assay for phospholipid and cholesterol (bioMérieux, Charounieres-les-Bains, France; Boehringer, Mannheim, Germany) and by protein quantification of apoA-I by phenylalanine assay by high performance liquid chromatography (HPLC) (24).

Physicochemical characterization of the reconstituted HDL

The initial velocities were determined in the linear portion of the curves, that is, between 0 and 25% cholesteryl ester formation. The assay mixture consisted of variable amounts of rHDL complexes at cholesterol concentrations var ying between 2 and 20 mM, defatted bovine serum albumin (4 mg/ml; Sigma, St. Louis, MO), and 6 mM 2-mercaptoethanol. Tris-HCl buffer (0.01 M, pH 8.0), 0.15 M NaCl, 0.3 mM Na 1-ethylenediaminetetraacetic acid, and 1 mM NaN 3 were added to a final reaction volume of 0.5–1.5 ml. Complexes were preincubated for 20 min at 37 8C, before addition of 50 –150 ml of BHK rLCAT, to initiate the enzymatic reaction. The reaction was per formed at 378C, and it was stopped by extraction of the incubation mixture with hexane – isopropanol 3:2 (v/v), containing cholesteryl heptadecanoate (Sigma) as an internal standard, for cholesteryl ester quantification. HPLC separation and quantification of the cholesteryl esters were carried out as described previously (27). The apparent kinetic parameters Vmax and Km, together with the estimated error on the parameters, were determined for each apoA-I/rHDL complex. These values were calculated by fitting the initial velocity Vo, as a function of the cholesterol concentration, to the Michaelis-Menten equation, using the SigmaPlot software (SPSS, Chicago, IL).

RESULTS

The intrinsic fluorescence of the tryptophan residues of apoA-I wild-type and mutants, either lipid free or in rHDL complexes, was measured with an AMINCO-Bowman series 2 spectrofluorimeter (Spectronic Unicam, Rochester, NY) at an excitation wavelength of 280 nm, with 4-nm excitation and emission slit widths. Spectra were recorded between 310 and 450 nm. The maximal wavelengths of tryptophan fluorescence emission were calculated from the corrected spectra. Circular dichroism spectra of the apoA-I mutants and their rHDL complexes were measured on a JASCO (Tokyo, Japan) 710 spectropolarimeter at wavelengths between 186 and 250 nm. Measurements were carried out at a protein concentration of 50 mg/ml in a 0.01 M sodium phosphate buffer, pH 7.4. Nine spectra were collected and averaged for each sample. The secondary structure was estimated by curve fitting with the Circular Dichroism Deconvolution by back propagation Neural Networks program (25).

Production of wild-type rLCAT in BHK cells Recombinant LCAT was produced by a baby hamster kidney (BHK) cell line, stably transfected with the LCAT cDNA, under control of the mouse metallothionein promotor (26). Stably transfected BHK cells were incubated with Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM; GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) containing 10% fetal bovine serum, streptomycin (100 mg/ml), and penicillin (100 units/ml). After 48 h, the confluent cells were washed with Opti-MEM and the DMEM was replaced by serumfree Opti-MEM (GIBCO-BRL). After 48 h of incubation the medium was collected, filtered through a 0.22- mm pore size filter (Millipore, Bedford, MA), and dialyzed against 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0. The rLCAT was purified on a Resource TM Q HR column (Pharmacia, Uppsala, Sweden) with an NaCl gradient between 0 and 500 mM. rLCAT was collected in 1-ml fractions and stored at 2808C, at a concentration of about 150 mg/ml.

LCAT activation properties of the rHDL complexes The activity of the LCAT enzyme with the various rHDL complexes as substrates was determined by measuring the amount of cholesteryl esters, generated during the enzymatic reaction, by HPLC (27).

Selection of the mutants The electrostatic potential around an apoA-I monomer is predominantly negative (Fig. 1). The exception is a positive electrostatic potential around the arginine cluster R149, R153, and R160 of helix 6, and around residues R171 and K182 of helix 7. We examined the conservation and location of these arginine residues in all known apoA-I sequences of different species. The Edmundson wheel representation of eight helical repeats is shown in Fig. 2, for human, cynomolgus monkey, pig, cow, dog, rabbit, tree shrew, mouse, rat, golden hamster, hedgehog, chicken, quail, and duck apoA-I (28). There is high sequence conservation among apoA-I of the different species, and the amphipathic character of all helices is especially well conserved. A specific feature of the repeat at residues 145–162 is clearly demonstrated in Fig. 2, as the hydrophilic face of this amphipathic helix is characterized by a cluster of three arginine residues at positions 149, 153, and 160. These residues, which account for the positive electrostatic potential described above, are totally conserved among the different species. This cluster of three adjacent arginine residues on the Edmundson wheel representation is unique to helix 145 –162, as repeats 101–118, 123–140, and 189–206 have only two adjacent lysines, which are not perfectly conserved among the different species (Fig. 2). A close inspection of the repeats of apoA-IV, apoA-II, apoE, apoC-I, apoC-II, and apoC-III did not reveal any similar cluster of three arginine residues either (data not shown). In the crystal structure of an apoA-I dimer, consisting of two antiparallel monomers, helix 143–164 interacts with repeat 99–120 of the other monomer (Fig. 3). R149, R153, and R160 are not part of the dimer interface and cannot interact with the other repeat. The same holds true for the belt model of an rHDL particle proposed by Segrest et al. (13).

Roosbeek et al. Arginine residues in apoA-I critical for LCAT activation

33

Fig. 1. Electrical potentials around a molecule of apoA-I(D1–43), calculated by the Delphi program on the basis of the coordinates of Borhani and co-workers (12). Red, negative potential at 21 kt/e; blue, positive potential at 10.5 kt/e.

To test the contribution of residues R149, R153, and R160, and of the electrostatic potential around the 22-residue repeats 143–164 and 165–186 of apoA-I to LCAT activation, we constructed the mutants listed in Table 1. R149, R153, and R160 were mutated to glutamine, either as single, double, or triple mutants. In addition, acidic residues E146, D150, and D157, which might form ionic interactions with R149, R153, and R160 to stabilize the helical structure, were mutated to a glutamine or an asparagine (Table 1). The requirement for an arginine residue at position 153 was tested by the R153K substitution. An R171Q mutation was performed to decrease the positive electrostatic potential around repeat 167–184. In addition, A175 was mutated to an arginine, in order to increase the positive potential around this helix. Expression and characterization of the apoA-I mutants Wild-type and mutant apoA-I proteins were expressed in E. coli, and comparable yields were obtained (data not shown). The affinity-purified proteins migrated as a single band on SDS-PAGE, with a molecular weight corresponding to that of apoA-I, carrying the N-terminal histidine tag. The secondary structure of the mutant apoA-I proteins was checked by circular dichroism (Table 1), and the percentages of a helix, b sheet, b turns, and coil were found to be similar to wild-type apoA-I. The secondary structure is characterized by a high percentage of helical structure and low b-sheet content, in agreement with the crystallized structure of apoD(1–43)A-I. 34

Journal of Lipid Research Volume 42, 2001

Lipid-binding properties of wild-type and mutant apoA-I The association of plasma, wild-type, and mutant apoA-I with 1,2-dimyristoyl- sn -glycero-3-phosphatidylcholine (DMPC) vesicles was followed by turbidity measurements at 325 nm, as a function of temperature. As shown in Fig. 4, wild-type recombinant apoA-I, the single mutant R153Q, the double mutant R153Q 1 R160Q, the triple mutant R149Q 1 R153Q 1 R160Q, and the D157N mutant, all reacted similarly with DMPC. Around the transition temperature of DMPC, the large multilamellar vesicles were converted into smaller lipid-protein complexes. We also prepared rHDL particles consisting of 1-palmitoyl2-linoleoyl-sn -glycero-3-phosphatidylcholine (PLPC), cholesterol, and recombinant apoA-I and examined their size and homogeneity (Fig. 5). The yield of rHDL formed from the mutant proteins was comparable to that of wildtype apoA-I, and each became fully associated with lipids. No peak of lipid-free apoA-I was detected by sensitive tryptophan fluorescence detection, at an elution volume larger than that of the lipid-apolipoprotein complex. The rHDL particles were about 8 nm in diameter and contained 40–60 mol of phospholipid, 3–5 mol of cholesterol per mole of apoA-I, and two molecules of apoA-I. The size of the complexes was further estimated by native gradient gel electrophoresis, in a 4–20% polyacrylamide gradient. The sizes of complexes from the major protein fraction in the gel were comparable for all apoA-I proteins ( Table 2).

Fig. 2. Edmundson wheel representation of 18-residue helical repeats in apoA-I. Residues from left to right: human, cynomolgus monkey, pig, cow, dog, rabbit, tree shrew, mouse, rat, golden hamster, hedgehog, chicken, quail, and duck apoA-I. Red, negative; dark blue, positive; light blue, neutral hydrophilic; green, hydrophobic residues. For convenient graphical representation, the 22-amino acid repeat s are truncated by 2 residues at each end.

Roosbeek et al. Arginine residues in apoA-I critical for LCAT activation

35

Fig. 3. Representation of helix 143–164 of apoA-I in a dimer of apo(D1–43)A-I, together with the complementary helix 99–120 in the antiparallel dimer. Representation: (A) parallel and (B) perpendicular to the long axis of the helix.

They were relatively small, as they were prepared at a 2:1 (w/w) ratio of phospholipid to protein, to increase the homogeneity of the preparation. Incubation of lipids with wild-type and mutant apoA-I at a 2.5:1 (w/w) ratio yielded a more heterogeneous population of particles (data not shown). To characterize further the lipid-binding properties of the mutant apoA-Is, we measured the maximal wavelength for the tryptophan fluorescence emission of lipid-free apoA-I and rHDL. Consistent with the insertion of the tryptophan residues in apoA-I into a more hydrophobic environment, the tryptophan fluorescence of each apoA-I complex was characterized by a blue shift of 2 –3 nm, com36

Journal of Lipid Research Volume 42, 2001

pared with the lipid-free protein (Table 2). The secondary structure of lipid-bound apoA-I, determined by circular dichroism (Table 1), shows an increased helical content of about 15% for all complexes. This is due to the helix stabilization of the helical repeats by the lipids, accompanied by a decrease of the percentage of coil structure, while b-sheet and b-turn content remain unchanged (Table 1). LCAT activation properties of wild-type and mutant apoA-I Initial velocity measurements showed a linear increase of up to 20–25% cholesterol esterification in the substrate. All subsequent measurements were carried out within that

TABLE 1. Percentages of secondary structure of apoA-I mutants, lipid-free and in PLPC/cholesterol/apoA-I complexes, determined by circular dichroism Lipid-Free ApoA-I ApoA-I Mutant

a Helix

b Sheet

58 65 43 53 64 61 61 57 39 48 52 55 31 58 44 30

7 5 12 8 5 8 7 7 13 11 10 6 18 7 11 18

PLPC/Cholesterol/ApoA-I Complexes

b Turn

Coil

a Helix

b Sheet

14 13 16 15 13 13 14 14 17 15 15 18 17 14 16 17

21 17 29 24 18 18 18 22 31 26 23 19 34 21 29 35

76 70 74 68 74 71 68 77 55 64 61 66 77 79 65 54

3 4 3 4 3 4 4 3 7 5 6 4 3 3 5 7

% Wild type R149Q R153Q R153K R160Q R149Q 1 R153Q R153Q 1 R160Q R149Q 1 R153Q 1 R160Q E146Q D150N D157N E146A 1 R149A R149A 1 D150A R153A 1 D150A R171Q A175R

range. Vmax and Km were determined for wild-type and mutant apoA-I, from Vo measurements at varying cholesterol concentrations. The parameters were calculated by fitting the experimental data to a Michaelis-Menten equation, using SigmaPlot software (SPSS). Table 3 summarizes the values obtained for Vmax and Km and the enzymatic efficiency Vmax/Km, for wild-type and mutant apoA-I. Compared with wild-type apoA-I, we observed a decreased Vmax for all mutants in which one or more residues of the arginine cluster R149, R153, and R160 was mutated to a glutamine. This effect increased with the number of substitutions in the mutant protein. Mutation of a single arginine, either R149, R153, or R160, resulted in a 6- to 10-fold decrease in Vmax, compared with a 12- to 25-fold decrease for a double mutant, and a 30-fold decrease for a

b Turn

Coil

10 11 10 11 10 11 12 10 13 12 13 20 10 9 12 14

11 15 13 17 13 14 16 10 25 19 20 11 10 9 18 25

%

triple mutant. Conversely, mutations of acidic residue E146, D150, or D157 had only limited effect, as Vmax values were about 50% of wild-type apoA-I. Mutation of both an arginine residue and an acidic residue decreased Vmax to a value similar to that of a single arginine mutation, in agreement with the limited effect of mutating an acidic residue of helix 143–160. Surprisingly, substitution of R153 with a lysine residue was almost as deleterious as the R153Q substitution for LCAT activity. Mutation of R171 in the next C-terminal helix had no effect on Vmax, while substitution of A175 by an arginine did not affect this parameter either. The effect of the apoA-I mutations on the dissociation constant Km was more limited, as Km values were of the same order of magnitude, and varied at most 2- to 3-fold. Calculation of the catalytic efficiency Vmax/Km clearly shows that mutation of one or more arginine residues of the R149, R153, R160 cluster drastically decreases LCAT enzymatic activity on the mutant apoA-I/lipid complexes, to less than 20% of wild-type apoA-I. As the composition, size, and structure of the complexes are comparable, this can be attributed to loss of activation of LCAT by mutation of the cofactor apoA-I.

DISCUSSION

Fig. 4. Turbidity decrease of mixtures of apoA-I mutants with DMPC as a function of temperature, monitored by absorption measurements at 325 nm. Plasma apoA-I (open squares); wild-type apoA-I (solid squares); R153Q mutant (open diamonds); R153Q 1 R160Q mutant (solid trianges); R149Q 1 R153Q 1 R160Q mutant (solid circles); D157N mutant (3).

We have used the crystal structure of apoD(1–43)A-I, sequence conservation calculations, and sequence alignment programs to detect a unique feature in the hydrophilic face of helix 143–164. This helix had been previously implicated in the activation of LCAT by apoA-I. It contains a cluster of three conserved arginine residues, at matching positions on three turns of this helix. We therefore generated mutations of polar residues in this helix, and measured the biochemical, biophysical, and LCAT activation properties of the mutants. We showed that the secondary structure and lipid-binding properties of the

Roosbeek et al. Arginine residues in apoA-I critical for LCAT activation

37

Fig. 5. Elution profiles of PLPC/cholesterol/apoA-I mutants separated on a Superose 6 PG column, monitored by tryptophan fluorescence measurement. Wild-type apoA-I (solid squares); R153Q mutant (open diamonds); R153Q 1 R160Q mutant (solid triangles); R149Q 1 R153Q 1 R160Q mutant (solid circles); D157N mutant (3).

mutants were comparable to those of wild-type apoA-I. Mutations of conserved residues R149, R153, and R160 in helix 6 drastically reduced LCAT activation by the mutants, due to a Vmax decrease. In contrast, mutations of acidic residues in this helical repeat, or of R171 in the next C-terminal repeat, did not have such an effect. Taken together, these data suggest that residues R149, R153, and R160 mediate the activation of LCAT by apoA-I. We have compared the orientation and hydrogen bonding of R149, R153, and R160 in the apoD(1–43)A-I crystal structure, in the belt model proposed by Segrest et al. (13), and in the picket-fence model of Phillips et al. (15). In the belt model, as well as in the crystal structure of apoD(1–43)A-I, R149, R153, and R160 do not form interhelical salt bridges with the corresponding antiparallel repeat 99–120. However, these arginines can form intrahelical salt bridges with E146, D150, and D157. Mutations of the negatively charged residues decreased Vmax only by

50%, whereas mutation of any of the conserved arginine residues in helix 143–164 caused a 10-fold decrease of Vmax. According to these data, putative intrahelical salt bridges in helix 143–164 would not be critical for the structure and cofactor activity of apoA-I in rHDL. This is suggested by the similar helical content of all mutant proteins, and in addition by the finding that the R153K mutation, which would preserve the potential salt bridge formation between K153 and D150, impairs LCAT activation. In the picket-fence model proposed by Phillips et al. (15), R149, R153, and R160 do not form a cluster of residues, as in the belt model. They are located further apart, as R149 and R160 are at about 20 Å from each other. R153 forms an intrahelical salt bridge with D150, while R149 can form a salt bridge with E179 in the antiparallel helical repeat at residues 165–186. Similarly, D157 and R171 can form an interhelical salt bridge with each other. The decrease in Vmax observed with the arginine mutants cannot be due to

TABLE 2. Maximal wavelength of tryptophan fluorescence of apoA-I lipid free and in rHDL; diameter and composition of rHDL particles consisting of PLPC/cholesterol/apoA-I Diameter

lmax ApoA-I Mutant

Lipid Free

Wild type R149Q R153Q R153K R160Q R149Q 1 R153Q R153Q 1 R160Q R149Q 1 R153Q 1 R160Q E146Q D150N D157N E146A 1 R149A R149A 1 D150A R153A 1 D150A R171Q A175R

331 331 335 336 335 335 335 331 336 336 335 335 331 331 335 336

rHDL

Gradient Gel Electrophoresis

329 329 332 333 333 333 333 329 333 334 332 333 329 329 332 334

7.8 7.2 7.6 8.3 7.4 7.6 8.1 8.1 7.6 7.9 7.7 7.3 8.2 8.1 8.3 7.6

nm

Gel Filtration

PLPC/ Cholesterol Apo/A-I

8.0 7.3 7.8 8.4 7.6 7.8 8.2 8.2 7.8 8.0 8.0 7.4 8.2 8.2 8.4 7.8

mol/mol/mol 52/4/01 41/4/01 49/4/1 67/5/1 46/4/1 50/4/1 59/5/1 60/5/1 50/5/1 55/4/1 53/4/1 42/4/1 64/6/1 63/5/1 65/3/1 49/3/1

nm

Diameter was determined by native gradient gel electrophoresis (GGE), and by gel filtration on a Superose 6PG column.

38

Journal of Lipid Research Volume 42, 2001

TABLE 3. Apparent kinetic constants for the reaction of LCAT with various rHDL consisting of PLPC/cholesterol/apoA-I complexes, prepared with wild-type and mutant apoA-I ApoA-I Mutant in rHDL

Wild type R149Q R153Q R153K R160Q R149Q 1 R153Q R153Q 1 R160Q R149Q 1 R153Q 1 R160Q E146Q D150N D157N E146A 1 R149A R149A 1 D150A R153A 1 D150A R171Q A175R

Apparent Vmax

Apparent Km

Apparent Vmax/ Apparent Km

nmol/h?ml 256 6 14 19.1 6 1.2 22.5 6 1.1 36.2 6 4.5 41.2 6 2.8 10.8 6 1.3 9.6 6 1.2 7.9 6 0.3 128.2 6 3.5 113 6 11 172.1 6 6.6 19.7 6 1.7 17.5 6 1.3 15.7 6 1.1 268 6 12 217.9 6 6.5

mM 6.4 6 0.7 2.4 6 0.7 2.0 6 0.4 5.2 6 1.9 10.5 6 1.5 3.5 6 1.9 6.6 6 2.5 5.8 6 0.6 2.2 6 0.2 3.8 6 1.3 3.0 6 0.4 8.4 6 1.7 4.4 6 1.0 3.3 6 1.0 4.2 6 0.5 3.1 6 0.4

nmol/ml?h/mM 40.0 6 4.9 8.0 6 2.4 11.3 6 2.3 7.0 6 2.7 3.9 6 0.6 3.1 6 1.7 1.5 6 0.6 1.4 6 0.2 55.7 6 11 30 6 11 57.4 6 8.0 2.3 6 0.5 4.0 6 0.9 4.8 6 1.5 63.8 6 1.8 70.3 6 9.3

The composition and diameter of the complexes are listed in Table 2.

a disruption of these salt bridges, as the R171Q mutation has only a limited effect on Vmax, while residue E179 is not conserved in the different apoA-I sequences. The present study and previous results suggest a model for the activation of LCAT on discoidal rHDL. Jonas (29) previously proposed that LCAT associates with the upper face of the discoidal particle, and that this involves hydrophobic interactions with lipids, and/or more polar proteinprotein interactions with apoA-I. Most published studies suggest that LCAT interacts directly with phospholipids, as the association constants are similar for lipid-protein complexes containing either apoA-I or apoA-II (30). These constants are of the same order of magnitude as measured for pure phospholipid vesicles. However, apoA-I specifically increases the apparent Vmax for cholesterol esterification by LCAT. ApoA-IV and apoE are less reactive, whereas apoA-II suppresses LCAT activity on the complexes, by displacing other apolipoproteins (31, 32). Specific interactions between the enzyme and its cofactor might induce a conformational change in LCAT, which is required for full enzymatic activity. Such interactions probably have an electrostatic component, as LCAT has optimal activity at 150 mM NaCl (33). If so, R149, R153, and R160 in apoA-I could either form salt bridges with negative residues of LCAT, or hydrogen bonds with other polar residues of the enzyme (Fig. 6). As R149, R153, and R160 are located at the hydrophobic/hydrophilic boundary of the amphipathic helix, their side chains are in the right position to interact with a molecule of LCAT bound to the surface of the disc (Fig. 6). On a spherical HDL particle, “snorkeling” of the arginine side chains would enable similar interactions. In the crystal structure of apoA-I, the distribution of interhelical salt bridges is asymmetric (12). Most salt bridges are formed between antiparallel apoA-I molecules A and B, which probably represent the functional dimer, as also proposed in the model of Segrest et al. (13) for rHDL. Only this configuration is compatible with the orientation of the three mutated arginine residues toward the surface of the disc, in contrast to the A–C

and A–D dimers and to the picket-fence model of Phillips et al. (15). In the a/b-hydrolase model built for LCAT (34, 35), we previously proposed that the N-terminal part of helices a 3–4 (residues 115–132) and a His (residues 385–401) might be involved in LCAT activation by apoA-I (36). This was based on the location of natural and LCAT mutants causing fish-eye disease, the biochemical phenotype of engineered mutations, and the similarities with cofactor activation processes in lipases. A direct interaction between these residues and apoA-I has not been demonstrated yet. In conclusion, the data reported here are consistent with the belt model proposed for apoA-I in a discoidal lipid-apolipoprotein particle. They represent the first experimental link between the apoA-I conformation in the belt model and the functional activity of the apolipoprotein as a cofactor of LCAT. Mutations of R149, R153, and

Fig. 6. Schematic representation of the proposed mode of interaction of LCAT with apoA-I arginine residues 149, 153, and 160, in a discoidal rHDL particle.

Roosbeek et al. Arginine residues in apoA-I critical for LCAT activation

39

R160 of apoA-I do not inhibit LCAT activation through loss of internal salt bridges or decreased hydrophobic interactions with the phospholipid acyl chains. As demonstrated in this article, loss of activity can probably be ascribed to modification of polar interactions between apoA-I and LCAT. The role of the arginine cluster in the helical repeat 143–164 for the interaction of apoA-I with other ligands, such as cellular receptors or lipid transfer proteins, is currently being tested. Manuscript received 17 July 2000 and in revised form 29 August 2000.

REFERENCES 1. Frank, P. G., and Y. L. Marcel. 2000. Apolipoprotein A-I. Structurefunction relationships. J. Lipid Res. 41: 853–872. 2. Yokoyama, S. 1998. Apolipoprotein-mediated cellular cholesterol efflux [erratum in Biochim. Biophys. Acta. 1998;1393: 222]. Biochim. Biophys. Acta. 1392: 1–15. 3. Acton, S., A. Rigotti, K. T. Landschulz, S. Xu, H. H. Hobbs, and M. Krieger. 1996. Identification of scavenger receptor SR-BI as a high density lipoprotein receptor. Science. 271: 518–520. 4. Bodzioch, M., E. Orso, J. Klucken, T. Langmann, A. Bottcher, W. Diederich, W. Drobnik, S. Barlage, C. Buchler, M. Porsch-Ozcurumez, W. E. Kaminski, H. W. Hahmann, K. Oette, G. Rothe, C. Aslanidis, K. J. Lackner, and G. Schmitz. 1999. The gene encoding ATP-binding cassette transporter 1 is mutated in Tangier disease. Nat. Genet. 22: 347–351. 5. Rust, S., M. Rosier, H. Funke, J. Real, Z. Amoura, J. C. Piette, J. F. Deleuze, H. B. Brewer, N. Duverger, P. Denefle, and G. Assmann. 1999. Tangier disease is caused by mutations in the gene encoding ATP-binding cassette transporter 1. Nat. Genet. 22: 352–355. 6. Brooks-Wilson, A., M. Marcil, S. M. Clee, L. H. Zhang, K. Roomp, M. van Dam, L. Yu, C. Brewer, J. A. Collins, H. O. Molhuizen, O. Loubser, B. F. Ouelette, K. Fichter, K. J. Ashbourne-Excoffon, C. W. Sensen, S. Scherer, S. Mott, M. Denis, D. Martindale, J. Frohlich, K. Morgan, B. Koop, S. Pimstone, J. J. Kastelein, and M. R. Hayden. 1999. Mutations in ABC1 in Tangier disease and familial highdensity lipoprotein deficiency. Nat. Genet. 22: 336–345. 7. Glomset, J. A. 1968. The plasma lecithin:cholesterol acyltransferase reaction. J. Lipid Res. 9: 155–167. 8. Brewer, H. B., Jr., T. Fairwell, A. LaRue, R. Ronan, A. Houser, and T. J. Bronzert. 1978. The amino acid sequence of human APOA-I, an apolipoprotein isolated from high density lipoproteins. Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 623–630. 9. Shoulders, C. C., and F. E. Baralle. 1982. Isolation of the human HDL apoprotein A1 gene. Nucleic Acids Res. 10: 4873–4882. 10. McLachlan, A. D. 1977. Repeated helical pattern in apolipoprotein-A-I. Nature. 267: 465–466. 11. Segrest, J. P., R. L. Jackson, J. D. Morrisett, and A. M. J. Gotto. 1974. A molecular theory of lipid-protein interactions in the plasma lipoproteins. FEBS Lett. 38: 247–258. 12. Borhani, D. W., D. P. Rogers, J. A. Engler, and C. G. Brouillette. 1997. Crystal structure of truncated human apolipoprotein A-I suggests a lipid-bound conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 12291–12296. 13. Segrest, J. P., M. K. Jones, A. E. Klon, C. J. Sheldahl, M. Hellinger, H. De Loof, and S. C. Harvey. 1999. A detailed molecular belt model for apolipoprotein A-I in discoidal high density lipoprotein. J. Biol. Chem. 274: 31755–31758. 14. Brasseur, R., J. De Meutter, B. Vanloo, E. Goormaghtigh, J. M. Ruysschaert, and M. Rosseneu. 1990. Mode of assembly of amphipathic helical segments in model high-density lipoproteins. Biochim. Biophys. Acta. 1043: 245–252. 15. Phillips, J. C., W. Wriggers, Z. Li, A. Jonas, and K. Schulten. 1997. Predicting the structure of apolipoprotein A-I in reconstituted high-density lipoprotein disks. Biophys. J. 73: 2337–2346. 16. Wald, J. H., E. Coormaghtigh, J. De Meutter, J. M. Ruysschaert, and A. Jonas. 1990. Investigation of the lipid domains and apolipoprotein orientation in reconstituted high density lipoproteins by fluorescence and IR methods. J. Biol. Chem. 265: 20044–20050. 17. Koppaka, V., L. Silvestro, J. A. Engler, C. G. Brouillette, and P. H. Axelsen. 1999. The structure of human lipoprotein A-I. Evidence for the “belt” model. J. Biol. Chem. 274: 14541–14544.

40

Journal of Lipid Research Volume 42, 2001

18. Sorci-Thomas, M. G., L. Curtiss, J. S. Parks, M. J. Thomas, M. W. Kearns, and M. Landrum. 1998. The hydrophobic face orientation of apolipoprotein A-I amphipathic helix domain 143–164 regulates lecithin:cholesterol acyltransferase activation. J. Biol. Chem. 273: 11776–11782. 19. Gilson, M. K., and B. Honig. 1988. Calculation of the total electrostatic energy of a macromolecular system: solvation energies, binding energies, and conformational analysis. Proteins. 4: 7–18. 20. Brooks, B. R., R. E. Bruccoleri, B. D. Olafson, D. J. States, S. Swaminathan, and M. Karplus. 1983. CHARMM: a program for macromolecular energy, minimization, and dynamics calculations. J. Comput. Chem. 4: 187–217. 21. Thompson, J. D., D. G. Higgins, and T. J. Gibson. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22: 4673–4680. 22. Emmanuel, F., A. Steinmetz, M. Rosseneu, R. Brasseur, N. Gosselet, F. Attenot, S. Cuine, S. Seguret, M. Latta, and J. C. Fruchart. 1994. Identification of specific amphipathic alpha-helical sequence of human apolipoprotein A-IV involved in lecithin:cholesterol acyltransferase activation. J. Biol. Chem. 269: 29883–29890. 23. Matz, C. E., and A. Jonas. 1982. Micellar complexes of human apolipoprotein A-I with phosphatidylcholines and cholesterol prepared from cholate-lipid dispersions. J. Biol. Chem. 257: 4535–4540. 24. Vanloo, B., J. Taveirne, J. Baert, G. Lorent, L. Lins, J. M. Ruyschaert, and M. Rosseneu. 1992. LCAT activation properties of apoA-I CNBr fragments and conversion of discoidal complexes into spherical particles. Biochim. Biophys. Acta. 1128: 258–266. 25. Bohm, G., R. Muhr, and R. Jaenicke. 1992. Quantitative analysis of protein far UV circular dichroism spectra by neural networks. Protein Eng. 5: 191–195. 26. Hill, J. S., X. Wang, S. Paranjape, D. Dimitrijevich, A. G. Lacko, and P. H. Pritchard. 1993. Expression and characterization of recombinant human lecithin:cholesterol acyltransferase. J. Lipid Res. 34: 1245–1251. 27. Vercaemst, R., A. Union, M. Rosseneu, I. De Craene, G. de Backer, and M. Kornitzer. 1989. Quantitation of plasma free cholesterol and cholesteryl esters by high performance liquid chromatography. Study of a normal population. Atherosclerosis. 78: 245–250. 28. Collet, X., Y. L. Marcel, N. Tremblay, C. Lazure, R. W. Milne, B. Perret, and P. K. Weech. 1997. Evolution of mammalian apolipoprotein A-I and conservation of antigenicity: correlation with primary and secondary structure. J. Lipid Res. 38: 634–644. 29. Jonas, A. 1998. Regulation of lecithin cholesterol acyltransferase activity. Prog. Lipid Res. 37: 209–234. 30. Bolin, D. J., and A. Jonas. 1994. Binding of lecithin:cholesterol acyltransferase to reconstituted high density lipoproteins is affected by their lipid but not apolipoprotein composition. J. Biol. Chem. 269: 7429–7434. 31. Labeur, C., G. Lambert, T. Van Cauteren, N. Duverger, B. Vanloo, J. Chambaz, J. Vandekerckhove, G. Castro, and M. Rosseneu. 1998. Displacement of apoA-I from HDL by apoA-II or its C-terminal helix promotes the formation of pre-beta1 migrating particles and decreases LCAT activation. Atherosclerosis. 139: 351–362. 32. Durbin, D. M., and A. Jonas. 1999. Lipid-free apolipoproteins A-I and A-II promote remodeling of reconstituted high density lipoproteins and alter their reactivity with lecithin:cholesterol acyltransferase. J. Lipid Res. 40: 2293–2302. 33. Jonas, A., J. L. Daehler, and E. R. Wilson. 1986. Anion effects on the reaction of lecithin-cholesterol acyltransferase with discoidal complexes of phosphatidylcholines ? apolipoprotein A-I ? cholesterol. Biochim. Biophys. Acta. 876: 474–485. 34. Peelman, F., N. Vinaimont, A. Verhee, B. Vanloo, J. L. Verschelde, C. Labeur, M. S. Seguret, N. Duverger, G. Hutchinson, J. Vandekerckhove, J. Tavernier, and M. Rosseneu. 1998. A proposed architecture for lecithin cholesterol acyl transferase (LCAT): identification of the catalytic triad and molecular modeling. Protein Sci. 7: 587–599. 35. Peelman, F., J. Vandekerckhove, and M. Rosseneu. 2000. Structure and function of lecithin cholesterol acyl transferase: new insights from structural predictions and animal models. Curr. Opin. Lipidol. 11: 155–160. 36. Vanloo, B., K. Deschuymere, F. Peelman, J. Taveirne, A. Verhee, C. Gouyette, C. Labeur, J. Vandekerckhove, J. Tavernier, and M. Rosseneu. 2000. Relationship between structure and biochemical phenotype of lecithin:cholesterol acyltransferase (LCAT) mutants causing fish-eye disease. J. Lipid Res. 41: 752–761.

X. Expressie en activiteit van de Nucleotide Bindende Domeinen van de humane ABC-A1 transporter. Expression and activity of the Nucleotide Binding Domains of the human ABC-A1 transporter.

Protein Expr Purif. 2004 May;35(1):102-110.

ABC transporters zijn opgebouwd uit 2 Nucleotide Bindende Domeinen (NBD’s), die instaan voor ATP-binding en –hydrolyse, en 2 Membraan Overspannende Domeinen (MSD’s), die elk zes transmembranaire helices bevatten. Beide NBD’s functioneren op een coöperatieve manier, en activiteit van beide domeinen is vereist voor transport van het substraat.

Via allosterische regulatie van deze coöperativiteit wordt de

transporter activiteit gereguleerd. Bij leden van de ABCA subfamilie, bevindt zich Cterminaal van NBD1 en NBD2 een regulerend domein (R-domein). Bij expressie in E. coli van de afzonderlijke NBD domeinen van ABC transporters worden de NBD’s, door hun sterke zelf-associatie en aggregatie, vaak als onoplosbare proteïnen aangetroffen in inclusielichaampjes. De zuivering van deze eiwitten vereist hierdoor het gebruik van verschillende denaturatie-renaturatie stappen. Om de NBD domeinen van de ABCA1 transporter als oplosbare eiwitten tot expressie te brengen in E. coli, werd onderzocht of de gebieden stroom op- en afwaarts van de NBD’s een goede opvouwing en oplosbaarheid van de eiwitten bevorderen. Na expressie en zuivering van de NBD domeinen in oplosbare vorm, werden de ATPbinding en ATPase activiteit getest. Ook het effect van mutaties van geconserveerde residu’s in de NBD’s op de expressie, ATP-binding en ATPase activiteit werd onderzocht.

Expressie en zuivering van oplosbare NBD proteïnen en hun activiteit.

ABCA transporters vertonen een MSD-NBD-MSD-NBD topologie. Beide NBD’s zijn gelocaliseerd in het cytoplasma. Elk cytoplasmatisch domein na het MSD is opgebouwd uit een loop, een NBD, een zwak geconserveerd gebied, het R-domein en tenslotte een C-terminale loop. Allignering van de verschillende ABCA transporters toont de sterke conservatie aan van de NBD’s en van de R-domeinen, en laat een

78

accurate bepaling toe van de grenzen van deze domeinen. Om de oplosbaarheid en correcte opvouwing van de NBD’s van de ABCA1 transporter te bevorderen werd gebruik gemaakt van constructen met variabele lengte, die naast het NBD eveneens flankerende gebieden bevatten (Figuur 32).

Figuur 32: Schematische voorstelling van de verschillende cytoplasmatische NBDflankerende domeinen, met aanduiding van de verschillende constructen met variabele lengte.

De verschillende constructen voor NBD1 en NBD2 werden tot expressie gebracht in E. coli en opgezuiverd door middel van Ni-affiniteitschromatografie gevolgd door ontzouting.

Voor NBD1 en NBD2 wordt de oplosbaarheid sterk verhoogd door

aanwezigheid van: - de flankerende loops, die waarschijnlijk helpen bij de correcte opvouwing van de NBD’s - het R-domein, waardoor het NBD gestabiliseerd wordt in een conformatie die gunstig is voor dimerisatie - een deel van de loop C-terminaal van het R-domein, die mogelijk een rol speelt bij de correcte opvouwing van het R-domein

79

Na expressie en zuivering van de oplosbare NBD1+R1 (residu’s T861-D1306) en NBD2+R2 (residu’s R1877-D2232) werden de grootte en homogeniteit bepaald door Dynamic Light Scattering. De gemiddelde grootte van de eiwitten was 30nm en 50nm voor NBD1 en NBD2 respectievelijk. De proteïnen associëren dus nog steeds met elkaar, aangezien een grootte van 4-10 nm verwacht wordt voor de monomere vorm.

Vervolgens werden hun ATP-binding en ATPase activiteit onderzocht. Door de aanwezigheid van drie en twee tryptofaan residu’s in NBD1+R1 en NBD2+R2 respectievelijk, kon de ATP-binding bepaald worden door het meten van de maximale Trp fluorescentie intensiteit, die daalt bij binding van ATP door het NBD. Aan de hand van titratiecurven, met stijgende hoeveelheden ATP, werd door Scatchard analyse de dissociatieconstante (Kd) bepaald. De Kd waarde voor beide proteïnen was vergelijkbaar. De ATPase activiteit werd bepaald door een colorimetrische techniek waarbij de hoeveelheid fosfaat, die vrijkomt bij ATP hydrolyse, gemeten werd. NBD1 vertoonde hierbij een drie maal hogere ATPase activiteit dan NBD2.

Effect van mutaties op de expressie, ATP-binding en ATPase activiteit van ABCA1 NBD’s.

De coöperativiteit tussen NBD1 en NBD2 wordt gereguleerd door interactie tussen beide domeinen in de 3D-structuur van de volledige transporter.

Verschillende

mutanten, waarbij sterk geconserveerde residu’s werden vervangen in het potentieel interactiegebied tussen beide NBD’s van ABCA1, werden geconstrueerd. Naast een allosterische regulatie, wordt ABC transporter activiteit eveneens gereguleerd door fosforylatie door kinasen. Ook de voorspelde proteïne kinase CK2 fosforylatieplaatsen in het R-domein na NBD1 (T1242 en T1243) en NBD2 (T2211 en T2212) werden gemuteerd (Figuur 33).

80

Figuur 33 : ABCA1 cytoplasmatische domeinen, met aanduiding van de verschillende geteste mutanten.

Geen van de bestudeerde mutanten had echter een effect op de expressie, ATPbinding of ATPase activiteit.

81

Protein Expression and Purification 35 (2004) 102–110 www.elsevier.com/locate/yprep

Expression and activity of the nucleotide-binding domains of the human ABCA1 transporter Stein Roosbeek,a,* Hans Caster,a Qing Zhou Liu,b Pierre-Francßois Berne,b Nicolas Duverger,b Bart Christiaens,a Jo€el Vandekerckhove,a Frank Peelman,a Christine Labeur,a and Maryvonne Rosseneua a

Department of Biochemistry, Faculty of Medicine and Health Sciences, Ghent University, Ghent, Belgium b Aventis Pharma, Vitry sur Seine, France Received 4 November 2003, and in revised form 23 December 2003

Abstract The aim of this study was the expression and production in Escherichia coli of the nucleotide-binding domains (NBDs) of the human ABCA1 transporter, in a soluble, non-denatured form. To increase the protein solubility, and avoid expression in E. coli inclusion bodies, we extended the length of the expressed NBD domains, to include proximal domains. The corresponding cDNA constructs were used to express the N-terminal His-tagged WT and mutant proteins, which were purified by Ni2þ -affinity chromatography. Optimal expression of soluble proteins was obtained for constructs including the NBD, the downstream 80-residue domain, and about 20 upstream residues. The size homogeneity of WT and mutant NBDs was determined by Dynamic Light Scattering, and ATP-binding constants and ATPase activities were measured. The NBD1 and NBD2 domains bound ATP with comparable affinity. The ATPase activity of WT His-NBD1 was about three times higher than that of NBD2 and amounted to 5913 compared to 1979 nmol Pi /lmol NBD/min for WT His-NBD2. All engineered mutants had comparable ATPase activity to the corresponding WT protein. The optimisation of the length of the expressed proteins, based upon the boundary prediction of NBDs and neighbour domains, enables the expression and purification of soluble ABCA1 NBDs, with high ATPase activity. This approach should prove useful for the study of the structural and functional properties of the NBDs and other domains of the ABC transporters. Ó 2004 Elsevier Inc. All rights reserved. Keywords: ATP-binding cassette transporter; Nucleotide-binding domain; Purification; ATPase

ATP-binding cassette (ABC)1 transporters are found in all organisms [1], where they represent one of the largest and best conserved protein families. These proteins transport a wide range of compounds through biological membranes and they function either as importers of essential nutrients into cells or as exporters of a broad variety of compounds. ABC transporters further signal the presence of infectious agents and regulate development in micro-organisms and mammals [1–3]. Mutations affecting human ABC transporters are *

Corresponding author. Fax: +32-9-264-94-96. E-mail address: [email protected] (S. Roosbeek). 1 Abbreviations used: ABC, ATP-binding cassette; NBD, nucleotide-binding domain; MSD, membrane spanning domain; IPTG, isopropyl-b-D -thiogalactosidase. 1046-5928/$ - see front matter Ó 2004 Elsevier Inc. All rights reserved. doi:10.1016/j.pep.2003.12.015

associated with inherited diseases, such as those in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) [4,5] causing cystic fibrosis, and those in ABCA1 underlying Tangier disease [6–9]. Other transporters, such as the P-glycoprotein or multidrug resistance gene product (MDR1), confer multidrug resistance and hamper drug treatment efficacy [10]. ABC transporters comprise two basic subunits: a nucleotide-binding domain (NBD), which hydrolyses ATP and provides the energy required for substrate transport, and a membrane spanning domain (MSD) which forms a channel and confers substrate specificity. Most ABC transporters function as oligomers consisting of two ATPase and two transmembrane domains, which are either encoded separately or tandemly replicated within a single polypeptide [1,3,5]. Mutations in the

S. Roosbeek et al. / Protein Expression and Purification 35 (2004) 102–110

conserved Walker A, Walker B or signature motifs of the nucleotide-binding domains, or ADP trapping in the catalytic sites, suppress ATPase activity [11,12]. NBD1 and NBD2 function cooperatively and the inactivation of one catalytic site abolishes ATPase activity and transport function [13]. Allosteric regulation of the cooperativity between the two NBD domains represents a ‘‘fine’’ regulation of ABC transporter activity [14–17]. Besides the NBD and transmembrane domains, a 80residue sequence downstream of NBD1 and of NBD2, separated from the NBDs by a low-conservation region, was identified in the ABCA subfamily [18]. It includes predicted phosphorylation sites for casein kinase CK2 and it might have a regulatory function in analogy with the R-domain of CFTR [5]. The NBD domains of the human ABCA4, MDR, and CFTR transporters have been expressed in bacteria [19–21]. These domains are prone to self-association and aggregation, and are often found in bacterial inclusion bodies. Protein recovery then requires treatment with detergents or denaturing agents, which have to be removed during purification. Removal of detergent, urea or guanidine hydrochloride decreases protein solubility and increases aggregation, thus decreasing the yield of native protein. The aim of this study was the expression and purification of the nucleotide-binding domains of human ABCA1, in a soluble form, to compare their ATPase activity. Extending the length of the expressed constructs beyond the NBD boundaries was used as a strategy to facilitate protein folding, enhance solubility, and avoid denaturation–renaturation steps during purification. This approach was applied to the expression of both WT ABCA1 NBD1 and NBD2, and of engineered mutants. Mutations of conserved NBD residues outside the Walker A, B and signature motives were designed to modulate NBD association, while mutations in the conserved downstream 80-residue sequence effected the putative CK2 phosphorylation sites. The effect of these mutations upon protein expression, ATP-binding, and ATPase activity was investigated.

Materials and methods Alignment of human ABCA transporters and design of the mutants Human ABCAs are full-transporters, with a MSDNBD-MSD-NBD topology, consisting of two symmetrical halves [18]. The alignment of the ABCA1-A10 and ABCA12 sequences, using the T-COFFEE program, showed that ABCA subfamily consists of several highly conserved domains, including the membrane spanning and the nucleotide-binding domain, separated by lower conservation sequences. The nucleotide-binding do-

103

mains NBD1 and NBD2 are the best conserved segments in ABCA transporters, each followed by an R-domain, containing potential CK2 phosphorylation sites. The NBDs are flanked both upstream and downstream by low-conservation sequences forming the MSD-NBD and NBD-R domain separations. The sequence alignment of the entire ABCA subfamily [18] provided an accurate prediction of the boundaries of the NBDs and flanking domains. In the 3D structure of the full ABCA transporters, the NBD1 and NBD2 domains probably come close to each other, as in the crystal structure of the BtuCD transporter [22], providing cooperativity between these domains. Mutations in the ABCA1 NBD1 and NBD2 were aimed at modifying the putative interface between NBD1 and NBD2 at residues 1061–1064 and 2073–2076, respectively. The predicted CK2 phosphorylation sites in NBD1 (residues T1242 and T1243) and in NBD2 (T2211 and T2212) were also mutated. Construction of the expression vectors Vectors were constructed using the pET28a (Novagen, Madison, WI, USA) plasmid, for expression of variable length constructs of the His-NBD1 domain between residues T861 and G1346, and of His-NBD2 between residues T1877 and V2261. DNA fragments encoding the protein sequences were PCR amplified and cloned into the pET28a vector, and mutant plasmids were made by overlapping PCR. WT and mutant plasmids were checked by sequencing and by restriction analysis. Expression of soluble recombinant His-NBD1 and His-NBD2 in Escherichia coli Analytical expression. To optimise the length of the expressed constructs to yield soluble NBD proteins, the E. coli expression products of 18 variable-length constructs were first analysed by Ni–NTA affinity chromatography, according to the micro-purification procedure on a Quiagen BioRobot (Qiagen Instruments, Switzerland). The level of expression of soluble protein in a 1.5 mL culture was estimated by SDS–PAGE. Nine constructs which gave promising results were further expressed in a 200 mL cell culture, and the protein yield was analysed either batchwise on the Quiagen Robot using a Ni-affinity column or by gradient elution using a Hi-trap column. Seven constructs yielding sufficient amounts of soluble protein were further expressed in 1 L cultures. Preparative expression. Transformation of BL21(DE3)pLysS E. coli was performed by heat-shock at 42 °C during 30 s. The transformed E. coli were grown as follows: 100 mL Luria Broth medium (LB medium, Gibco SPRM, Paisley, Scotland) containing 100 lg/mL

104

S. Roosbeek et al. / Protein Expression and Purification 35 (2004) 102–110

kanamycin (Sigma) was inoculated with 10 ll glycerol stock and incubated on a shaker overnight at 22 °C until an O.D. between 0.5 and 1.0 at 600 nm. Cells were centrifuged, resuspended in fresh LB medium, and used to inoculate a 1 L culture. After medium growth until an OD600 around 0.4, 0.5 mM IPTG was added and the cells were incubated on a shaker for 3 h at 22 °C. Cells were centrifuged at 9000g for 10 min, washed with PBS (10 mM Na2 HPO4 , 10 mM NaH2 PO4 , and 150 mM NaCl, pH 7.5), and stored at )20 °C. Purification of His-NBD1 and His-NBD2 Both His-NBD1 and His-NBD2 were purified by affinity chromatography on a Ni-chelating column (NiPROBOND, Invitrogen, Merelbeke, Belgium). As much as 1.5 g cell pellet was resuspended in 10 mL lysis buffer (50 mM Tris–HCl, pH 8.4, 500 mM NaCl, 1 mM bmercaptoethanol, 1 mM PMSF, 2 lg/mL leupeptin, 2 lg/ mL aprotinin, and 1 mM ATP) and sonicated on ice for 3
5 min at 60 W, and the cell residues were removed by centrifugation (16,000g, at 4 °C for 25 min). The Ni-PROBOND column was equilibrated with loading buffer A (50 mM Tris–HCl, pH 8, 500 mM NaCl, 1 mM b-mercaptoethanol, and 1 mM ATP, and 5% glycerol (v:v), containing 10 mM imidazole) and incubated overnight at 4 °C with the cell lysate, under mixing. The column was washed with buffer A containing 100 mM imidazole and the His-NBD proteins were eluted with the same buffer containing 500 mM imidazole. The eluate was immediately applied to a HiTrap Sepharose desalting column (Amersham) equilibrated in a desalting buffer (50 mM Tris–HCl, 150 mM NaCl, 1 mM b-mercaptoethanol, 5% glycerol, and 1 mM Na EDTA, pH 7.6) and eluted with the same buffer. The elution profile was determined by following both the optical density at 280 nm and the Trp fluorescence emission (excitation 280 nm, emission 333 nm) on a Jasco Fluorescence detector. Samples were stored either at 4 °C for a few days or at )80 °C for longer periods. Sample purity was checked by 12% SDS–PAGE. Protein content was determined by the BCA method (Pierce), or by optical density measurement at 280 nm, using an extinction coefficient of 0.69 g/L for His-NBD1 and 0.55 g/L for His-NBD2. Size determination of the His-NBD proteins The NBD size and size distribution were determined by Dynamic Light Scattering on a Malvern 4800 photon correlation spectrometer equipped with an Ar laser (488 nm). Hydrodynamic diameters (d H , nm) were calculated from the diffusion coefficient (D) using the Stokes–Einstein equation: dH ¼ ðkB T Þ=ð3pgDÞ with k B the Boltzmann constant; T the absolute temperature (K), and g the buffer viscosity.

ATP binding to His-NBD1 and His-NBD2 His-NBD1, His-NBD2, and mutants, at a concentration of 1.0 lM in a buffer containing 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM b-mercaptoethanol, 5% glycerol, and 1 mM Na EDTA, pH 7.6, were titrated by addition of 2 ll aliquots of a 250 lM ATP stock solution and incubated for 1 min at 22 °C. The Trp fluorescence emission spectra of the NBDs were recorded between 310 and 450 nm on an Aminco Bowmann Series2 fluorimeter (excitation 280 nm). The association constants of ATP to His-NBD1 and His-NBD2 were calculated from a Scatchard plot of the Trp fluorescence emission intensity at 333 nm, as a function of the ATP concentration. ATPase activity measurement of the His-NBD proteins WT His-NBD1, His-NBD2, and mutants were incubated at a concentration of 0.1 mg/mL in the presence of 2 mM ATP (diluted from a 5 mM stock solution prepared in 40 mM Tris–HCl buffer, 2 mM MgCl2 , 150 mM NaCl, and 1 mM b-mercaptoethanol, pH 7.6) for 30 min at 37 °C. A sample containing only 2 mM ATP was incubated in parallel for 30 min at 37 °C, to correct for spontaneous hydrolysis. Hydrolysis was stopped by placing the samples on ice. The phosphate released during hydrolysis was measured with the enzymatic ‘‘Enzchek Phosphate Assay Kit’’ (Molecular Probes) with a sensitivity between 2 and 150 lM Pi , at a pH between 6.5 and 8.0. The absorbance was read at 360 nm after 30 min incubation at room temperature and the ATPase activity is expressed as nmol Pi /lmol His-NBD/min.

Results Definition of the NBD and flanking domains of human ABCA1 To select the boundaries for the NBD and flanking domains in human ABCA1, we aligned the sequences of the cytoplasmic domains of the human ABCA transporters using the T-COFFEE program [18]. In the ABCA subfamily, the cytoplasmic domains are found downstream of the membrane spanning domains. The cytoplasmic domains consist of a loop, followed by the nucleotide-binding domain, a low-conservation region, a regulatory domain containing potential CK2 phosphorylation sites, and a C-terminal loop. According to the definition of an ATPase domain, the human ABCA1 NBD1 and NBD2 sequences encompass residues 898– 1130 and 1911–2143, respectively. The NBD boundaries correspond to intron–exon boundaries in the ABCA1 gene [2]. To enhance the NBD folding and to decrease protein self-association and aggregation, we expressed

S. Roosbeek et al. / Protein Expression and Purification 35 (2004) 102–110

several constructs including either one or more of the NBD flanking domains (Fig. 1). Mutations were carried out in conserved NBD residues, excluding the Walker A/B and the signature motif. A highly conserved sequence of around six residues ending with a glutamic acid was detected in all ABCA transporters, immediately downstream of the Walker B motif. As for the Rad50 dimerisation [23], this motif might regulate the interaction between NBD1 and NBD2. To test if these residues are important for ATP binding and ATPase activity, we engineered and expressed the following mutations: A1061N, G1062N, D1064A, G1062Q + D1064A in NBD1, and T2073N, G2074N, D2076A, G2074Q+ D2076A in NBD2. The potential CK2 phosphorylation sites at T1242 and T1243 in NBD1 and T2211 in NBD2 were also mutated to an alanine (Fig. 2).

105

firmed for nine constructs by the yields of a 200 mL cultures and for seven of the constructs by the yield of a 1 L culture (Table 1). About 70% of the expressed recombinant protein is in the soluble fraction (Fig. 3). In all subsequent experiments, the T867-D1306 NBD1 and the R1877-D2232 NBD2 constructs were used for production of the WT and mutant proteins. After cell lysis, the proteins were purified on a Ni2þ affinity column, with stepwise elution, as shown by Fig. 4A. Washing with buffers containing 10 and 100 mM imidazole elutes only contaminants (Fig. 4B, lanes 1 and 2), while His-NBD1 elutes at 500 mM imidazole (lane 3), with the expected molecular weight of 49 kDa. The amount of purified protein was around 4 mg/L cell culture for both WT His-NBD and mutants. Size determination of the His-NBD proteins

Expression and purification of the His-NBD proteins Analytical expression of pET28a_His-NBD1 in BL21(DE3)pLysS E. coli yielded high levels of an insoluble protein, which was found in the E. coli inclusion bodies. We therefore tested a series of 18 elongated constructs, encompassing residues either upstream, downstream of NBD or both (Fig. 1). The extension of the ABCA1 NBD sequences with about 20 upstream and 80 downstream residues increases the levels of expression of soluble protein in a 1.5 mL culture up to around 6–10 mg/L (Table 1). These residues include the low-conservation regions between the MSD and NBD, between NBD and the R-domain, and the R-domain itself. These results of the 1.5 mL cultures were con-

Dynamic Light Scattering measurements (Fig. 5) demonstrate that the size distribution of the His-NBD constructs 867–1306 and 1877–2232 is fairly homogeneous, except for a small amount of larger size material for NBD2. The mean size of the major peak corresponds to particles of 30 and 50 nm for NBD1 and NBD2, respectively, indicating that these proteins with an MW of around 40 kDa are self-associated, as a size of 4–10 nm would be expected for monomers. ATP binding to His-NBD proteins and mutants ATP binding was monitored by measuring the fluorescence emission intensity of the Trp residues in NBD1

Fig. 1. Domain boundaries of the human ABCA1 transporter and length of the various constructs used to optimise the expression of soluble ABCA1 NBD1 and NBD2 proteins.

106

S. Roosbeek et al. / Protein Expression and Purification 35 (2004) 102–110

Fig. 2. ABCA1 domains and mutations in the NBD1 and NBD2 constructs.

Table 1 Level of expression of the recombinant His-NBD1 and His-NBD2 proteins in the soluble fraction Construct

Level soluble recombinant protein (mg/L culture) 1.5 ml culture

200 ml culture

1 L culture

NBD1 E843-K1133 T861-K1133 T861-L1221 T861-D1263 T861-D1306 T861-G1346 E891-K1133 E891-D1263 E891-D1306 E891-D1346

<2 0 <7 <7 <10 <2 0 <5 <5 0

n.d. n.d. <7 <7 <7 n.d. n.d. <1 <2 n.d.

n.d. n.d. 5.6 5.7 6.2 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.

NBD2 R1877-N2149 R1877-D2232 R1877-V2261 N1889-N2149 N1889-V2261 G1905-N2174 G1905-D2232 G1905-V2261

<5 <10 <10 <2 <10 0 <2 <2

<5 <5 <5 n.d. <5 n.d. n.d. n.d.

2.5 2.6 2.8 n.d. 3.6 n.d. n.d. n.d.

Fig. 3. Coomassie stained 12% SDS–PAGE gel comparing the amount of WT ABCA1 NBD1 in the total cellular fraction, in the soluble and the insoluble fractions. Lane 1, protein amount in 20 ll of the E. coli culture (total fraction); lane 2, 20 ll of the supernatant after centrifugation (soluble fraction); and lane 3, 20 ll of the pellet resuspended in a volume equal to the supernatant (insoluble fraction).

rescence intensity, are depicted in Fig. 6B. The corresponding Kd values, calculated by Scatchard analysis, were comparable for all expressed proteins (Table 2). ATPase activity of the His-NBD proteins and mutants

and NBD2, containing, respectively, three and two Trp residues. ATP binding decreases the Trp fluorescence intensity, while the maximal emission wavelength remains unchanged at 333 nm (Fig. 6A). Titration curves of NBD1, NBD2, and mutants with increasing amounts of ATP, showing the decrease of the relative Trp fluo-

The ATPase activity was determined by colorimetric measurement of the amount of phosphate (Pi ) released during incubation of the NBD proteins with ATP, using freshly purified samples (Table 2). NBD storage at 4 °C decreased the ATPase activity by only 10% after 2

S. Roosbeek et al. / Protein Expression and Purification 35 (2004) 102–110

107

Fig. 4. Separation of WT ABCA1 NBD1 by affinity chromatography on a Ni Probond column. Peak 1, column eluate at 10 mM imidazole; peak 2, column eluate at 100 mM imidazole; and peak 3, His-NBD1 eluted at 500 mM imidazole. Inset: Coomassie stained 12% SDS–PAGE gels showing purification steps on the Ni-affinity column. Lane 1 (10 mM imidazole), 20 ll loaded, corresponding to 0.1% of the total fraction; lane 2 (100 mM imidazole), 20 ll loaded, corresponding to 0.2% of the eluate; and lane 3 (500 mM imidazole), 20 ll loaded, corresponding to 2% of the eluate.

Fig. 5. Size determination of WT and mutant ABCA1 His-NBD proteins by Dynamic Light Scattering: (s) His-NBD1 WT; (m) His-NBD1 (G1062Q + D1064A); (j) His-NBD1 (T1242 + T1243); () His-NBD2 WT; and () His-NBD2 (G2074Q + D2076A).

weeks. The ATPase activity of His-NBD1 was higher than that of His-NBD2 and all mutants had activities comparable to that of the corresponding WT His-NBD.

The ATPase activity of mixtures of NBD1 and NBD2 at a 1/1 molar ratio was comparable to the mean NBD1 + NBD2 activity.

108

S. Roosbeek et al. / Protein Expression and Purification 35 (2004) 102–110

Fig. 6. (A) Trp Fluorescence emission spectra between 310 and 450 nm (excitation at 280 nm) of 0.5 lM His-NBD2 WT, in the absence (D) and presence (m) of 30 lM ATP. (B) Relative Trp fluorescence emission intensity at 333 nm after stepwise addition of ATP to 1.5 lM His-NBD proteins: (s) His-NBD1 WT; () His-NBD2 WT.

Conclusions In this paper, we developed a strategy to express and purify high yields of soluble nucleotide-binding domain of human ABCA1. This relied upon a combination of a

theoretical analysis of the ABCA1 sequence together with an experimental approach. Constructs of various lengths were generated and used to test the level of expression of soluble protein. The location of the ABCA1 NBD domains was estimated from the sequence

S. Roosbeek et al. / Protein Expression and Purification 35 (2004) 102–110 Table 2 ATP binding and ATPase activity of NBD1 and NBD2 WT and mutants Mutation

NBD1 NBD1 WT (T861-D1306) A1061N G1062Q D1064A G1062Q + D1064A T1242A T1243A T1242A + T1243A E1245Q + E1246Q NBD2 NBD2 WT (R1877-D2232) R1923D + K1924G + R1925M T2073N G2074N D2076A G2074Q + D2076A T2211A T2212A T2211A + T2212A D2214N NBD1 + NBD2 NBD1 WT + NBD2 WT (G1062Q + D1064A) + (G2074 + D2076A) NBD1 WT + (G2074 + D2076A) (G1062Q + D1064A) + NBD2 WT

ATP binding Kd (lM)

ATPase activity (nmol Pi /lmol NBD/min)

6.1  0.9 5  0.9 9.3  1.9 5.9  1.1 8.1  1.8 6.1  1.5 7.1  1.2 3.8  0.3 4.9  0.8

5913  80 3711  56 5996  71 6956  134 5564  89 5412  102 6676  129 5870  114 5281  109

6  1.6 8.8  1.6 7.4  2.6 7.1  1.8 12  2.4 8.4  1.6 10.3  3.1 4.6  0.7 6  1.9 11.6  2.5

1979  31 2190  54 2064  49 2092  37 2515  63 1426  28 2067  32 1827  36 1463  29 2263  61

n.d. n.d.

4230  118 3656  123

n.d. n.d.

3736  104 3851  136

Results represent mean values  standard deviation for three independent experiments.

alignment of the human ABCA transporter subfamily. The boundaries of the NBD and neighbour domains were determined by plotting the degree of residue conservation along the ABCA sequence. An optimal selection of the domain boundaries enhanced the level of expression of soluble and active recombinant proteins. Although the boundaries of the strictly defined ABCA1 NBD1 and NBD2 domains were accurately predicted, His-tagged NBD proteins expressed in E. coli were directed to the inclusion bodies yielding insoluble proteins. To avoid denaturation/renaturation of the recombinant NBD, which might affect ATP binding and ATPase activity [21], we extended the NBD boundaries to include neighbour domains, as proposed for the CFTR and MDR transporters [20,21]. The expression in E. coli of the NBD1 and NBD2 domains, extended by upstream and downstream residues, significantly increased the yield of soluble proteins. These proteins were, however, still prone to self-association, as they represent only the cytoplasmic part of a whole ABCA transporter, which is stabilised through inter-

109

actions with the transmembrane domain in the native transporter. Protein purification by affinity chromatography on a Ni-column with stepwise elution, followed by desalting by column chromatography, yielded sufficient quantities of recombinant protein for characterisation. We demonstrated that both ABCA1 NBD domains bind ATP, with a Kd of around 6 lM, compared to 180–800 nM, for TNP-ATP binding to CFTR NBD1 and NBD2 [15,16]. The ABCA1 NBD1 and NBD2 ATPase activities lie in the range reported for other ABC transporters, between 580 and 13000 nmol/lmol/min. We measured a higher ATPase activity for ABCA1 NBD1 compared to NBD2, in contrast to the observations of Biswas and co-worker [19,24], who reported that ABCA4 NBD1 hydrolyzes ATP less efficiently than NBD2. Mutations in the D-loops did not affect either ATP binding or ATPase activity. Mutations in the predicted CK2 phosphorylation sites had no effect either. In summary, our data show that ABCA1 His-NBD1 and His-NBD2 can be expressed as soluble proteins in E. coli and subsequently purified by Ni2þ -affinity chromatography to yield WT and mutant proteins, which efficiently bind and hydrolyze ATP. The strategy chosen here demonstrates that large amounts of pure and active NBD domains can be produced by extending the NBD boundaries to include flanking loops, which probably help in proper folding and decrease protein aggregation, to include the R-domain, which stabilises the NBDs in a conformation which is favourable for dimerisation, and to include part of the loop downstream of the R-domain, which might help in folding of the R-domain. Such a strategy should prove valuable for expression of separate functional domains of ABCA1 and other ABC transporters.

Acknowledgments We thank Sophie Plantard, Josette Clot, and Isabelle Coquery for technical assistance. We are also grateful to V
eronique Stoven (Institut Pasteur, Paris) for helpful discussions. This work was supported by a research grant of the Ghent University.

References [1] C.F. Higgins, ABC transporters: physiology, structure and mechanism—an overview, Res. Microbiol. 152 (2001) 205–210. [2] M. Dean, Y. Hamon, G. Chimini, The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily, J. Lipid Res. 42 (2001) 1007–1017. [3] I.B. Holland, M.A. Blight, ABC-ATPases, adaptable energy generators fuelling transmembrane movement of a variety of molecules in organisms from bacteria to humans, J. Mol. Biol. 293 (1999) 381–399.

110

S. Roosbeek et al. / Protein Expression and Purification 35 (2004) 102–110

[4] J.R. Riordan, J.M. Rommens, B. Kerem, N. Alon, R. Rozmahel, Z. Grzelczak, J. Zielenski, S. Lok, N. Plavsic, J.L. Chou, Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA, Science 245 (1989) 1066–1073. [5] D.N. Sheppard, M.J. Welsh, Structure and function of the CFTR chloride channel, Physiol. Rev. 79 (1999) S23–S45. [6] S. Rust, M. Rosier, H. Funke, J. Real, Z. Amoura, J.C. Piette, J.F. Deleuze, H.B. Brewer, N. Duverger, P. Denefle, G. Assmann, Tangier disease is caused by mutations in the gene encoding ATPbinding cassette transporter 1, Nat. Genet. 22 (1999) 352–355. [7] M. Bodzioch, E. Orso, J. Klucken, T. Langmann, A. Bottcher, W. Diederich, W. Drobnik, S. Barlage, C. Buchler, M. PorschOzcurumez, W.E. Kaminski, H.W. Hahmann, K. Oette, G. Rothe, C. Aslanidis, K.J. Lackner, G. Schmitz, The gene encoding ATP-binding cassette transporter 1 is mutated in Tangier disease, Nat. Genet. 22 (1999) 347–351. [8] A. Brooks-Wilson, M. Marcil, S.M. Clee, L.H. Zhang, K. Roomp, M. van Dam, L. Yu, C. Brewer, J.A. Collins, H.O. Molhuizen, O. Loubser, B.F. Ouelette, K. Fichter, K.J. Ashbourne-Excoffon, C.W. Sensen, S. Scherer, S. Mott, M. Denis, D. Martindale, J. Frohlich, K. Morgan, B. Koop, S. Pimstone, J.J. Kastelein, M.R. Hayden, Mutations in ABC1 in Tangier disease and familial highdensity lipoprotein deficiency, Nat. Genet. 22 (1999) 336–345. [9] R.M. Lawn, D.P. Wade, M.R. Garvin, X. Wang, K. Schwartz, J.G. Porter, J.J. Seilhamer, A.M. Vaughan, J.F. Oram, The Tangier disease gene product ABC1 controls the cellular apolipoprotein-mediated lipid removal pathway, J. Clin. Invest. 104 (1999) R25–R31. [10] D.R. Hipfner, R.G. Deeley, S.P. Cole, Structural, mechanistic and clinical aspects of MRP1, Biochim. Biophys. Acta 1461 (1999) 359–376. [11] F. Becq, Y. Hamon, A. Bajetto, M. Gola, B. Verrier, G. Chimini, ABC1, an ATP binding cassette transporter required for phagocytosis of apoptotic cells, generates a regulated anion flux after expression in Xenopus laevis oocytes, J. Biol. Chem. 272 (1997) 2695–2699. [12] M. Gao, H.R. Cui, D.W. Loe, C.E. Grant, K.C. Almquist, S.P. Cole, R.G. Deeley, Comparison of the functional characteristics of the nucleotide binding domains of multidrug resistance protein 1, J. Biol. Chem. 275 (2000) 13098–13108. [13] C.F. Higgins, ABC transporters: from microorganisms to man, Annu. Rev. Cell Biol. 8 (1992) 67–113. [14] K. Nikaido, P.Q. Liu, G.F. Ames, Purification and characterization of HisP, the ATP-binding subunit of a traffic ATPase (ABC

[15]

[16]

[17]

[18]

[19]

[20]

[21]

[22]

[23]

[24]

transporter), the histidine permease of Salmonella typhimurium. Solubility, dimerization, and ATPase activity, J. Biol. Chem. 272 (1997) 27745–27752. D.C. Neville, C.R. Rozanas, B.M. Tulk, R.R. Townsend, A.S. Verkman, Expression and characterization of the NBD1-R domain region of CFTR: evidence for subunit–subunit interactions, Biochemistry 37 (1998) 2401–2409. N.T. Lu, P.L. Pedersen, Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator: the purified NBF1 + R protein interacts with the purified NBF2 domain to form a stable NBF1 + R/NBF2 complex while inducing a conformational change transmitted to the Cterminal region, Arch. Biochem. Biophys. 375 (2000) 7–20. O. Daumke, M.R. Knittler, Functional asymmetry of the ATPbinding-cassettes of the ABC transporter TAP is determined by intrinsic properties of the nucleotide binding domains, Eur. J. Biochem. 268 (2001) 4776–4786. F. Peelman, C. Labeur, B. Vanloo, S. Roosbeek, C. Devaud, N. Duverger, P. Denefle, M. Rosier, J. Vandekerckhove, M. Rosseneu, Characterization of the ABCA transporter subfamily: identification of prokaryotic and eukaryotic members, phylogeny and topology, J. Mol. Biol. 325 (2003) 259–274. E.E. Biswas, Nucleotide binding domain 1 of the human retinal ABC transporter functions as a general ribonucleotidase, Biochemistry 40 (2001) 8181–8187. C. Wang, A.F. Castro, D.M. Wilkes, G.A. Altenberg, Expression and purification of the first nucleotide-binding domain and linker region of human multidrug resistance gene product: comparison of fusions to glutathione S-transferase, thioredoxin and maltosebinding protein, Biochem. J. 338 (1999) 77–81. F. Duffieux, J.P. Annereau, J. Boucher, E. Miclet, O. Pamlard, M. Schneider, V. Stoven, J.Y. Lallemand, Nucleotide-binding domain 1 of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator production of a suitable protein for structural studies, Eur. J. Biochem. 267 (2000) 5306–5312. K.P. Locher, A.T. Lee, D.C. Rees, The E. coli BtuCD structure: a framework for ABC transporter architecture and mechanism, Science 296 (2002) 1091–1098. K.P. Hopfner, A. Karcher, D.S. Shin, L. Craig, L.M. Arthur, J.P. Carney, J.A. Tainer, Structural biology of Rad50 ATPase: ATPdriven conformational control in DNA double-strand break repair and the ABC-ATPase superfamily, Cell 101 (2000) 789–800. E.E. Biswas, S.B. Biswas, The C-terminal nucleotide binding domain of the human retinal ABCR protein is an adenosine triphosphatase, Biochemistry 39 (2000) 15879–15886.

XI. Karakterisering van de ABCA transporter subfamilie: identificatie van prokaryote en eukaryote leden en topologie. Characterization of the ABCA transporter subfamily: identification of prokaryotic and eukaryotic members, phylogeny and topology.

J Mol Biol. 2003 Jan;325(2):259-274.

ATP-bindende cassette (ABC) transporters vormen een superfamilie van proteïnen die voorkomen in alle organismen. Een functionele ABC transporter (‘full transporter’) is opgebouwd uit 2 Nucleotide Bindende Domeinen (NBD’s) en 2 Membraan Overspannende Domeinen (MSD’s).

Bij prokaryoten worden deze subeenheden

afzonderlijk gecodeerd en tot expressie gebracht, waarna de domeinen samenkomen om een functionele transporter te vormen. Bij sommige transporters zijn 1 NBD en 1 MSD gefusioneerd. heterodimeren.

Deze halftransporters functioneren dan als homo- of

Bij eukaryoten zijn beide halftransporters meestal evolutionair

samengebracht in 1 genstructuur die leidt tot expressie van een full-transporter. De 48 geïdentificeerde humane ABC transporters worden onderverdeeld in zeven klassen, ABCA tot ABCG.

De humane ABCA subfamilie bevat 12 leden die

mogelijke homologen bevatten in Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans en Arabidopsis thaliana.

Interne symmetrie in de ABCA full-transporters.

Allignering van de sequentie van humane ABCA1-10 en ABCA12, muis ABCA1, ABCA2, ABCA4 en ABCA7, rat ABCA2 en koe ABCA4 voorspelde een gemeenschappelijke topologie voor de ABCA transporters. Zij zijn allen opgebouwd uit: - een N-terminaal MSD bestaande uit zes helices, met een grote lus tussen helix1 en helix2, waarbij de lengte van deze lus zeer variabel is bij zoogdieren. - een sterk geconserveerd NBD1 - een sterk geconserveerd gebied van 80 residu’s (regulerend domein) De C-terminale helft van de ABCA full-transporters vertoont een zelfde organisatie.

82

Karakteristiek voor de ABCA subfamilie zijn de grote lus tussen helix1 en helix2, en het 80 residu’s lange gebied C-terminaal van de NBD’s. De sequentie van deze domeinen werd dan ook gebruikt om nieuwe ABCA homologen te identificeren. Voor de kandidaat ABCA homologen die op deze manier in de SWALL database gevonden werden, werd vervolgens bevestigd dat deze proteïnen weldegelijk tot de ABC transporter familie behoren. Door gebruik van deze strategie werden 34 ABCA homologen geïdentificeerd, 21 full-transporters en 13 half transporters. Eveneens werd een uitgesproken interne homologie en symmetrie vastgesteld in de ABCA full-transporter sequenties.

Identificatie van eukaryote ABCA homologen.

De 21 geïdentificeerde full-transporters werden vervolgens in twee helften verdeeld en samen met de 13 geïdentificeerde halftransporters gealligneerd met de gekende zoogdier ABCA transporters. Vervolgens werden deze alligneringen gebruikt om Hidden-Markov Modellen (HMM) te bouwen voor de NBD’s, de MSD’s en de 80 residu’s domeinen na NBD1 en NBD2. Op basis van deze HMM’s werden nieuwe eukaryote ABCA transporters gezocht in Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Arabidopsis thaliana en in de SWALL database met enkel eukaryote proteïne sequenties.

Deze strategie liet toe om 3

bijkomende ABCA transporters te identificeren, één in Caenorhabditis elegans en twee in Macaca fascicularis. Er werden dus in totaal 37 nieuwe leden van de ABCA subfamilie geïdentificeerd.

Evolutionair verband tussen eukaryote ABCA en prokaryote subfamilie 7 transporters.

Op basis van de allignering van de NBD’s van de ABCA halftransporters, werd een fylogenetische stamboom opgesteld. Er zijn drie duidelijk gescheiden groepen te onderscheiden die overeenkomen met de NBD domeinen van de halftransporters, de full-transporter NBD1 en NBD2 domeinen.

83

De halftransporter NBD’s worden verder opgedeeld in twee groepen, een groep met acht Arabidopsis thaliana transporters, en een groep met één Entamoeba histolytica transporter en drie Arabidopsis thaliana transporters. De twee groepen met NBD’s van de full-transporters zijn gelijkaardig, en worden elk onderverdeeld in twee groepen. De eerste groep bevat de humane ABCA5,6,8,9 en 10 transporters gelocaliseerd op chromosoom 17 en één transporter van Leishmania tropica, Leishmania major en Trypanosoma cruzi, maar bevat geen homologen bij Caenorhabditis elegans of Drosophila melanogaster. De tweede subgroep bevat de humane ABCA1,2,3,4,7 en 12 transporters, en verschillende transporters van Caenorhabditis elegans en Drosophila melanogaster.

Sequentie homologie en fylogenetische analyse van eukaryote en prokaryote ABC transporters laten vermoeden dat de eukaryote ABCA transporters evolutionair afkomstig zijn van de subfamilie 7 prokaryote transporters. Deze hypothese werd bevestigd door een fylogenetische stamboom op te stellen van de NBD’s van alle ABC transporters, geïdentifeceerd in 5 eukaryote en 20 prokaryote genomen. De ABCA full-transporters zijn dan waarschijnlijk ontstaan door gen duplicaties, wat reeds gesuggereerd werd door de hoge interne homologie bij deze transporters.

Een topologisch model voor de ABCA transporters.

De allignering van alle eukaryote ABCA transporters, inclusief de nieuw geïdentificeerde, gaf eveneens een beter inzicht in de structurele eigenschappen van de MSD’s, de NBD’s en het regulerend domein.

Uit de hydrofobiciteit berekeningen werd duidelijk dat bij leden van de ABCA subfamilie de MSD’s opgebouwd zijn uit een N-terminaal intracellulair gebied, gevolgd door een eerste transmembrane helix die via een variabele extracellulaire loop verbonden is met een cluster van vijf transmembrane helices. Eveneens werd de conservatie van de residu’s in de MSD’s bestudeerd. In de ABCA subfamilie bevatten helix 1, 6, 7 en 12 van de full-transporters sterk geconserveerde geladen residu’s, waarvan de zijketens inter-helicale waterstofbindingen of zoutbruggen kunnen vormen. Ook in de intracellulaire lussen tussen helix 2 en 3 en

84

tussen helix 8 en 9 bevinden zich sterk geconserveerde residu’s die in analogie met de MsbA en de BtuC transporters kunnen interageren met residu’s in de NBD’s.

De nucleotide bindende domeinen zijn de best geconserveerde regio’s in ABCA transporters. In NBD2 van de ABCA1, 2, 5-10 transporters bevindt er zich een cluster van 5 positief geladen residu’s (RRKRK) die mogelijks de affiniteit voor ATP verhoogt. Het feit dat deze cluster niet teruggevonden wordt in de respectievelijke NBD1 domeinen kan een verklaring zijn voor de cooperativiteit tussen de NBD’s.

C-terminaal van NBD1 en NBD2 wordt karakteristiek bij de ABCA transporters een geconserveerd domein van 80 residu’s teruggevonden, het regulerend domein. Dit Rdomein

bevat

een

sterk

geconserveerde

potentiële

proteïne

kinase

CK2

fosforylatieplaats die mogelijks een rol speelt bij de regulatie van de transporter.

85

doi:10.1016/S0022-2836(02)01105-1

J. Mol. Biol. (2003) 325, 259–274

Characterization of the ABCA Transporter Subfamily: Identification of Prokaryotic and Eukaryotic Members, Phylogeny and Topology Frank Peelman1, Christine Labeur1, Berlinda Vanloo1, Stein Roosbeek1 Catherine Devaud2, Nicolas Duverger2, Patrice Dene`fle2, Marie Rosier2 Joe¨l Vandekerckhove3 and Maryvonne Rosseneu1* 1

Laboratory for Lipoprotein Chemistry, Faculty of Medicine Department of Biochemistry Ghent University, B-9000 Ghent, Belgium 2

Aventis Pharma, Quai Jules Guesde, F94400 Vitry sur Seine France 3

Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology Department of Medical Protein Research, Faculty of Medicine Department of Biochemistry Ghent University, B-9000 Ghent, Belgium

An alignment of the mammalian ABCA transporters enabled the identification of sequence segments, specific to the ABCA subfamily, which were used as queries to search for eukaryotic and prokaryotic homologues. Thirty-seven eukaryotic half and full-length transporters were found, and a close relationship with prokaryotic subfamily 7 transporters was detected. Each half of the ABCA full-transporters is predicted to comprise a membrane-spanning domain (MSD) composed of six helices and a large extracellular loop, followed by a nucleotide-binding domain (NBD) and a conserved cytoplasmic 80-residue sequence, which might have a regulatory function. The topology predicted for the ABCA transporters was compared to the crystal structures of the MsbA and BtuCD bacterial transporters. The alignment of the MSD and NBD domains provided an estimate of the degree of residue conservation in the cytoplasmic, extracellular and transmembrane domains of the ABCA transporter subfamily. The phylogenic tree of eukaryotic ABCA transporters based upon the NBD sequences, consists of three major clades, corresponding to the half-transporter single NBDs and to the full-transporter NBDls and NBD2s. A phylogenic tree of prokaryotic transporters and the eukaryotic ABCA transporters confirmed the evolutionary relationship between prokaryotic subfamily 7 transporters and eukaryotic ABCA half and full-transporters. q 2003 Elsevier Science Ltd. All rights reserved

*Corresponding author

Keywords: ABC transporter; sequence alignment; homology; phylogeny; evolution

Introduction ATP-binding cassette (ABC) transporters form a large protein family, and are well represented in all species from prokaryotes to man. ABC transporters bind and hydrolyse ATP, and utilise the energy of ATP hydrolysis to mediate the translocation of a wide variety of substances across cellular membranes. Forty-eight human ABC transporters have been identified, and subdivided into seven phylogenic groupings, subfamily ABCA through to ABCG†.1,2 Several ABC transporters are linked to genetic diseases such as ABCA1 to Tangier disAbbreviation used: ABC, ATP-binding cassette. E-mail address of the corresponding author: [email protected] † http://nutrigene.4t.com/humanabc.htm

ease and HDL deficiency, ABCA4 to Stargardt disease, ABCC2 to Dubin– Johnson syndrome, ABCC7 (CFTR) to cystic fibrosis, ABCD1 to adrenoleukodystrophy, ABCG5 and ABCG8 to sitosterolemia.3 A functional ABC transporter comprises two membrane spanning domains (MSD1 and MSD2), which form a single transmembrane pore through which the substrate is presumably translocated, and two cytoplasmic nucleotide-binding domains (NBDl and NBD2).2 MSD domains are predicted to contain six to ten transmembrane helices, consistent with a high resolution structure of MsbA and BtuC from Escherichia coli.4,5 The NBDs contain the Walker A/B motif together with the ABC signature motif.1 Certain ABC transporters, referred to as full-transporters, consist of a single polypeptide, while others are formed by two

0022-2836/03/$ - see front matter q 2003 Elsevier Science Ltd. All rights reserved

260

Structure and Evolution of the ABCA Transporters

Figure 1. Schematic representation of an ABCA transporter showing the query segments Q1, Q2, Q3 (bold), with residues numbers corresponding to the ABCA1 sequence, used as input for PSIBLAST and SSEARCH searches of the SWALL database, to identify new ABCA homologues. Structural elements: H1 – H12: transmembrane helices; EC1-6: extracellular loops; IC1-6: intracellular loops; NBD1, NBD2: nucleotide binding domains.

half-transporters, as is the case for MsbA of E. coli, which has high sequence similarity with the mammalian P-glycoproteins of subfamily B. Halftransporters contain one MSD and one NBD, and assemble as functional homo- or heterodimers.6 The human ABCA transporter subfamily consists of 12 members.7 Among these, the putative lipid transporter ABCA1 plays a key metabolic role in reverse cholesterol transport from peripheral tissues to the liver, and in HDL synthesis.6 Mutations in human ABCA1 were described in patients with Tangier disease,8 with familial hypoalphalipoproteinemia, and early-onset development of atherosclerosis. ABCA4 is a putative transporter of retinoids in rod cells, and mutations in the ABCA4 gene cause retinal degenerative disorders such as Stargardt disease, age-related macular dystrophy, retinitis pigmentosa RP19, and cone rod dystrophy.9 ABCA2 is a lysosome-associated transporter found in brain oligodendrocytes.10 Human ABCA3 is expressed in the lung alveolar type II cells, while ABCA7 is expressed mainly in the spleen and in hematopoietic tissues.6 A cluster of five new members of the ABCA family was recently identified on chromosome 17.7,11 These transporters, named ABCA5, 6, 8, 9 and 10 are expressed in skeletal muscle (ABCA5 and 10), liver (ABCA6), heart (ABCA9), and ovary (ABCA8).7 The functional properties and substrate specificity of the ABCA12 transporter are still unknown.7 Putative homologues of the human ABCA subfamily members were identified in Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans and in Arabidopsis thaliana.3,12 The ced7 transporter in C. elegans was proposed as the orthologue of human ABCA1 since both transporters seem involved in the phagocytic engulfment of apoptotic cell bodies and translocation of phosphatidylserine.13 Here, we identified new members of the ABCA subfamily in different eukaryotic species, and ABCA homologues in prokaryotes. Multiple sequence alignments of ABCA transporters enabled the study of the phylogeny and evolution of the ABCA subfamily. These multiple alignments provide better insight into the conservation, and domain organization of the ABCA transporters,

and will facilitate future studies of the ABCA structure– function relationship.

Results Internal symmetry within the ABCA full transporters Here, we first identified putative new members of the ABCA subfamily among the eukaryotic and prokaryotic species and confirmed that they belong to this ABC subfamily. The search for new ABCA homologues first required the definition of query sequences that are specific to the ABCA subfamily only. These query sequences were then used in a combination of the SSEARCH, PSI-BLAST and SAM-t99 search algorithms, in order to detect a maximal number of ABCA homologues.14 In order to detect both eukaryotic and prokaryotic ABCA homologues, cytoplasmic, TM and extracellular query sequences were required, as prokaryotic ABC transporters often consist of separate NBD and MSD proteins.2 NBDs are not appropriate cytoplasmic query sequences, as they are highly conserved among different ABC subfamilies, whereas on the contrary, entire MSD domains are poorly conserved, and detect unrelated membrane proteins. We first established a CLUSTALX15 sequence alignment of human ABCA1-10, and ABCA12, of mouse ABCA1, mouse and rat ABCA2, mouse and cow ABCA4, and mouse ABCA7. The alignment predicts a common topology for the ABCA transporters. It comprises a membrane spanning domain (MSD) of 6 –7 TM helices, with a long loop between helix 1 and helix 2 (Figure 1). The length of this loop is highly variable among the mammalian ABCA sequences, comprising 598 residues in ABCA1, compared to 1026 in ABCA12 and only 171 in ABCA5. The MSD domain is followed by a cytoplasmic region containing the first nucleotide-binding domain (NBD1), and by a conserved domain of about 80 residues, downstream of NBD1. The second half of the ABCA full-transporters has a similar organization. Part of the sequence alignment of the human ABCA transporters, encompassing the

Structure and Evolution of the ABCA Transporters

C-terminal parts of NBD1 and NBD2 and the immediate downstream residues is shown in Figure 2. The NBDs and the 80-residue downstream sequences are the most highly conserved elements of the ABCA sequences. These elements correspond to residues 1186– 1255 and 2158 –2224 of ABCA1. We first used Q1, encompassing the ABCA N-terminal residue up to the first residue of the predicted TM2 helix, and Q2 and Q3 corresponding to the conserved 80-residue sequences downstream of NBD, as query sequences to search for ABCA homologues. SSEARCH, and PSI-BLAST searches of the SWALL database, using Q1, Q2 and Q3 as a query identified a series of candidate ABCA homologues. We verified that these homologues all belonged to the ABC transporter family, by comparison with the annotation in databases for specific organisms (see Materials and Methods). The topology of the candidate transporters was checked using SMART, and their authenticity confirmed by their ability to detect ABCA transporters as their closest homologues using the FASTA3 program. This strategy identified 34 ABCA transporter homologues (Table 1), consisting of 21 fulltransporters and of 13 half transporters, which contained only one MSD and one NBD. The search results also demonstrated internal homology and symmetry in the ABCA full-transporter sequences, as PSI-BLAST searches using Q1 detected the corresponding sequence, in the second half of the same transporter with E-values typically around 1025. Similarly, the Q2 query sequences detected Q3, and vice versa with E-values around 1029. Further, searches with MSDl detected MSD2 with E-values of 10220, while searches with NBDl or NBD2 as query sequences, detected ABCA NBDs at scores of E ¼ 10284. These E-values were significantly lower than those obtained for the comparison with NBDs of other transporter subfamilies, and thus demonstrate the high similarity between the N and C-terminal half of the ABCA full-transporters. Identification of eukaryotic ABCA homologues and related prokaryotic sequences To obtain an alignment of the 34 newly identified full and half-transporters with the mammalian ABCA transporters, we divided the sequences of all ABCA full-transporters into two halves, which were aligned with T-COFFEE. This program improved the alignment of low conservation segments in the transporter sequences, compared to CLUSTALX or DIALIGN. Thus, the alignment demonstrated the sequence similarity between the corresponding TM helices predicted in the N and C-terminal halves of the full-transporter sequences, as H1 aligns with H7, H2 with H8, and so on (data not shown). This alignment was then used to build separate SAM-t99 alignments for the MSD, NBD and the conserved Q2 and Q3 sequences downstream of NBD, part of which is shown in Figure

261

3(B). The degree of conservation along the ABCA full-transporter sequences is shown in Figure 3(A), and is highest for the NBDs and the Q2 and Q3 sequences. There is further high conservation of the hydrophobic residues in the TM helices as shown in Figure 3(B), and also of some residues in the loops connecting the TM helices, as shown by the alignment of the first transmembrane domain MSD1, of the ABCA full-transporters (Figure 4). The SAM-t99 alignments were converted into three Hidden –Markov Models (HMM), for the NBDs, MSDs and the Q2 and Q3 query sequences, and these were used to search for additional eukaryotic ABCA transporters. The searches were carried out in the Saccharomyces cerevisiae, A. thaliana, C. elegans and D. melanogaster proteomes, and in a restricted SWALL database including only eukaryotic protein sequences. Three additional ABCA transporters were detected using SAM-t99: one in C. elegans (Q21213) and two in Macaca fascicularis (BAB62978 and BAB63135), thus increasing the number of ABCA subfamily members identified in this paper up to 37, and the total number, including the mammalian ABCA transporters, up to 55, as listed in Table 1. The 37 ABCA subfamily members comprise 22 full-transporters: nine in D. melanogaster; eight in Caenorhabitis elegans, one in Trypanosoma cruzi, one in Leischmania tropica; one in Dictyostelium discoideum, one in the Amsacta moorei entomopoxvirus, and one (Q9SDBl) in A. thaliana (Table 1). The C. elegans transporters include the AF10131 and AF003146 sequences reported by Broccardo et al.,16 together with six new ABCA members including three isoforms CAA82383, CAA82384 and O76287 of the ced7 protein. In A. thaliana, we identified one full-length ABCA homologue Q9SBD1, identical to the AtAOHl protein.12 The D. discoideum transporter Q94479 had been previously identified as the U66526 protein.16 The newly identified ABCA homologues in other eukaryotic species had not been assigned to a particular ABC subfamily. We further identified 15 ABCA half-transporters, two in M. fascicularis (BAB62978 and BAB63135), one in Entamoeba histolytica, 11 in A. thaliana, while the Q9NNG7 half-transporter in Leischmania major might be a fragment of a full-transporter. The BAB62978 and BAB63135 sequences from M. fascicularis testis share 97% identity but are only 48% identical to human ABCA3 and therefore may represent orthologues to a putative human half-transporter located on chromosome 16p13.11. The 11 A. thaliana transporters listed in Table 1, are part of the 16 ABCA transporters reported by Sanchez-Fernandez.12 The five extra sequences include the AtATH12 transporter which resembles more an ABCB transporter, while the AtATH8, 9, 10 and 13 sequences are Ser/Thr/Tyr kinases, incorrectly annotated as ABC transporters in the databases. One of the Drosophila melanogaster transporters, Q9VAU1, identified as a putative ABCA homologue, has the topology of an ABCG

Figure 2. Fragment of the T-COFFEE sequence alignment of human ABCA transporters, including the C-terminal region of the nucleotide binding domains and the downstream residues. Sequences in the upper and lower half of the alignment correspond to NBD1 and NBD2 domains, respectively.

263

Structure and Evolution of the ABCA Transporters

Table 1. Mammalian ABCA transporters and eukaryotic homologues Species

Name or Swiss Prot entry no.

NCBI protein entry no.

Code phyl. tree8

Size (#AA)

Exons no.

Human

ABCA1 ABCA2 ABCA3 ABCA4 ABCA5 ABCA6 ABCA7 ABCA8 ABCA9 ABCA10 ABCA12 ABCA13 ABCA1 ABCA2 ABCA4 ABCA7 ABCA2 ABCA4 BAB62978 BAB63135 Q9NKF0 Q9V912 Q9VRG3 Q9VRG4 Q9VRG5 Q9VVJ9 Q9VVK7 Q9VRF4 Q9VXP7 Q9VAU1 (??) CAA82383 CAA82384 O76287 Q9TXV8 Q9XW49 Q9XUD4 O01790 Q21213 AAK14943 Q9NNG7 Q9GQS2 Q24811 Q94479 Q9EMR9 Q9SDB1 Q9STT4 Q9STT5 Q9STT6 Q9STT7 Q9STT8 Q9STT9 Q9STU0 Q9FLT4 Q9FLT5 Q9FLT8 Q9FKF2

AAF86276 AAG09372 AAC50967 AAC51144 AAK30022 AAM 77558 AAF85794 NP_009099 XP_085646 NP_525021 AAK54355

HA1 HA2 HA3 HA4 HA5 HA6 HA7 HA8 HA9 HA10 HA12 HA13 n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i. n.i n.i. DM1 DM2 DM3 DM4 DM5 DM6 DM7 DM8 DM9 DM10 CE1 CE1 CE1 CE2 CE3 CE4 CE5 CE6 TC1 LM1 LTl EH1 DD1 EV1 AT1 AT2 AT3 AT4 AT5 AT6 AT7 AT8 AT9 AT10 AT11 AT12

2261 2436 1704 2273 1642 1617 2146 1581 1624 1543 2516 4909 2201 2435 2310 2159 2434 2281 602 581 1544 1382 1197 1713 1511 1660 1981 1500 2556 808 1689 1691 1704 1802 1564 1431 1447 1429 1750 1231 1843 808 1336 1384 1816 727 900 722 664 895 925 1011 907 950 917 953

49 47 32 50 n.d. 38 46 37 38 37 53 n.d. 48 48 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 14 6 7 9 10 2 14 6 16 ? 14 14 14 16 20 20 21 ? n.d. n.d. n.d. n.d. n d. n.d. 40 12 15 12 11 15 15 15 16 16 16 14

Mouse

Rat Cow Macaca fascicularis D. melanogaster

C. elegans

T. cruzi L. major L. tropica E. histolytica D. discoideum A.M. entomopoxvirus A. thaliana

AAG39073 P41234 NP_031404 AAK56862 BAB16596 AAC48716 BAB62978 BAB63135 AAF44814 AAF57490 AAF50838 AAF50837 AAF50836 AAF49312 AAF49304 AAF50847 AAF48511 AAF56807 CAA82383 CAA82384 AAC24116 AAC69223 CAA22142 CAB05222 AAK21369 CAA18775 AAKl4943 CAC00243 AAG35594 AAA21451 AAB06789 AAG02836 AAC02761 CAB41862 CAB41861 CAB41860 CAB41859 CAB41858 CAB41857 CAB41856 BAB10074 BAB10073 BAB10070 BAB09013

Abbreviations and symbols: 8 identification code of each member in the alignments (Figures 3(B) and 4) and in the phylogenic tree (see Figure 5). n.i., not included; n.d., not determined. D. melanogaster, Drosophila melanogaster; C. elegans, Caenorhabditis elegans; T. cruzi, Trypanosoma cruzi; L. major, Leishmania major; L. tropica, Leishmania tropica; E. histolytica, Entamoeba histolytica; D. discoideum, Dictyostelium discoideum; A.M. entomopoxvirus, Amsacta Moorei entomopoxvirus; A. thaliana, Arabidopsis thaliana.

transporter, as NBD is upstream of MSD. It might not belong to the ABCA, but rather to a new ABCH subfamily, according to Dean et al.3 The PSI-BLAST algorithm further detected prokaryotic transporters with e-value scores around 1026, even lower than for some eukaryotic ABCA transporters, suggesting that these are prokaryotic

homologues to the eukaryotic ABCAs. Searches were therefore conducted on the proteomes of 20 prokaryotic species which had been annotated for ABC transporters.17 Using the Hidden Markov Model (HMM) built for ABCA NBDs, we found that the 40 highest scoring sequences matched the prokaryotic ABC NBDs of the 7a subfamily.17

264

Structure and Evolution of the ABCA Transporters

Figure 3. (A) Schematic representation of the degree of conservation in the T-COFFEE38 alignment of ABCA fulltransporter sequences. The conservation index was calculated using the CLUSTALX15 quality scores, with the PAM 250 matrix. The best conserved features are indicated by symbols: A, P-loop; W, signature motif; D, walker B-motif; þ, H-loop; p , S/T S/T Pho D/E D/E consensus motif. (B) Part of the SAM-t99 alignment of the N and C-terminal half of ABCA full-transporters with ABCA half-transporters, showing transmembrane helices 2 and 3 in MSDl and helices 8 and 9 in MSD2.

Similarly, using the HMM for the ABCA MSD, the 15 highest scoring sequences were MSD proteins of subfamily 7 (Table 2). These data are internally consistent, as NBDs of the 7a subfamily associate with MSDs of the 7b and 7c subfamily, to form active ABC transporters, as for example the E. coli NBD protein YBHF, which forms an active transporter complex with the MSD protein YBHR (Table 2).

Evolutionary relationship between eukaryotic ABCA and prokaryotic subfamily 7 transporters To establish the evolutionary relationships between the members of the ABCA subfamily, we used the SAM-t99 alignment of the ABCA NBDs to build a consensus phylogenic tree (Figure 5). The tree consists of three well separated phylogenic

Figure 4. Alignment of the MSD1 domain of ABCA full-transporters. Residue conservation and position of the TM helices, intra- and extracellular loops are shown, except for the long extracellular loop EC1.

266

Structure and Evolution of the ABCA Transporters

Table 2. Homologues of the ABCA transporter subfamily detected in prokaryotic species Species Escherichia coli K12 Pyrococcus horikoshii

Pyrococcus abyssi Methanobacterium thermautotrophicum Bacillus subtilis Pseudomonas aeruginosa Archaeoglobus fulgidus

MSD

Size (AA)

NBD

Size (AA)

Ecol.YBHR Phor.PH1848 Phor.PH1531 Phor.PH1365 Phor.PH1369 Paby.PAB0435 Mthe.MTH1372 Mthe.MTH1371 Mthe.MTH1486 Bsub.YFIM Paer.41246 Aful.AF1005

368 255 420 310 330 420 374 355 383 396 916 366

Ecol.YBHF Phor.PH1849 Phor.PH1532 Phor.PH1366 Phor.PH1366 Paby.PAB0434 Mthe.MTH1370 Mthe.MTH1370 Mthe.MTH1487 Bsub.YFIL Paer.41246 Aful.AF1006

583 318 226 308 308 244 319 319 350 311 916 285

clades, corresponding to the half-transporter single NBD domains, and the full-transporter NBD1 and NBD2 domains. The half-transporter NBD domains are subdivided into two groups: one consists of eight A. thaliana transporters, while the second comprises the E. histolytica Q24811 (EHl) and three A. thaliana transporters. The distribution of the transporters within the different subclades is similar for NBD1 and NBD2 (Figure 5), and therefore only the NBD1 subgroupings will be described. The first subclade of the NBD1s comprises the recently identified human ABCA5, 6, 8, 9 and 10 transporters,7 whose genes are located on chromosome 17q24. This grouping also contains the NBDs of the putative L. tropica Q9GQS2 (LT1), L. major Q9NNG7 (LM1), T. cruzi AAK1493 (TC1) homologues, but no homologues for either

C. elegans or Drosophila. The second subclade includes human ABCA1, 2, 3, 4, 7, 12 and the C. elegans transporters Q9TXV8 (CE2), and O01790 (CE5). The third subclade contains three C. elegans (ced7 (CE1), Q9XW49 (CE3), and Q9XUD4 (CE4)) transporters, while a fourth subclade contains eight D. melanogaster (DM2-9) transporters. These two subclades are well separated from those containing the human transporters. The C. elegans ced7 transporter is as close to ABCA2, 3, 4, 7 and 12 as to ABCA1, while Q9TXV8 (CE2) and O01790 (CE5) seem closer than ced7 to ABCA1, 2, 3, 4, 7, 12 and 13. From an evolutionary point of view, ABCA1 and ced7 are therefore probably paralogues, and not orthologues. Sequence homology searches and the phylogenic analysis of both eukaryotic and prokaryotic ABC transporters, suggest that the eukaryotic ABCA

Figure 5. Cladogram of the eukaryotic ABCA transporters subfamily, derived from the PROTPARS phylogenic analysis using the PHYLIP package, showing three clades corresponding to half-transporter NBDs, and fulltransporter NBD1s and NBD2s.

267

Structure and Evolution of the ABCA Transporters

Figure 6. Schematic representation of a PROTPARS phylogenic tree based upon the alignment of the NBD’s of all human, Bacillus subtilis, Archaeoglobus fulgidus, E. coli, and Pyrococcus abyssi ABC transporters. The prokaryotic subfamily 7 transporters and the human ABCA transporters emerge as a single branch, which is shown in this Figure.

transporters originated from the subfamily 7 prokaryotic transporters. To confirm these data, we built a phylogenic tree consisting of the NBDs of all ABC transporters, identified in five eukaryotic and 20 prokaryotic genomes (see Materials and Methods). The PHYLIP and PAUP methods supported the filiation of the family 7 prokaryotic ABC transporters with the ABCA subfamily, and showed the correspondence between prokaryotic subfamilies 3, 6, 19 and 20 and eukaryotic subfamilies F, B/C/D, E, and G, respectively (F. Peelman, unpublished results). This is shown in Figure 6, depicting the ABCA branch of the consensus tree built for the human ABCs and the ABC transporters of four prokaryotic genomes, as a graphic representation of the entire tree for the ABCs of all genomes is impossible. The closest prokaryotic homologues to human ABCAs in the phylogenic trees include the daunorubycin resistance protein DRRA of Mycobacterium tuberculosis and of Pseudomonas aeruginosa and the Nodulation factor Nod1 from Rhizobium sp. strain 33. For most prokaryotic ABC transporters, the MSDs and NBDs are separate proteins expressed from the same operon, while eukaryotic ABC transporters are encoded as one protein.1,2 In agreement with previously proposed schemes for the general evolution of the ABC transporters,6,18 in the particular case of the ABCA subfamily, gene fusion of a subfamily 7-like MSD and NBD might have generated ABCA half transporters, such as in A. thaliana and E. histolytica. The ABCA full-transporters might have evolved through gene duplications, as suggested by the high internal homology detected in these transporters.

Topology model for the ABCA transporters The multiple alignment of the 55 eukaryotic ABCA transporters, combined with the analysis of the prokaryotic subfamily 7 transporters, provides further structural insights into MSDs, NBDs, and the C-terminal regulatory domains. The MSDs are predicted by all algorithms to contain six transmembrane a-helices, well-conserved with respect to position (Table 3), and well aligned in the fulltransporters MSD1 and MSD2. Using the TMHMM, PHD, MPEX and TMPRED algorithms, two additional helices, labelled 5b and 11b on Figure 7(A) and (B), are predicted at low confidence scores, for half of the ABCA sequences. The mean hydrophobicity of the TM helices of the entire ABCA subfamily was calculated by averaging the Eisenberg mean residue hydrophobicity along the sequences using a 21-residue window, and calculating the mean hydrophobicity of the helices in the entire sequence alignment. The TM helices labelled 5b and 11b have a mean hydrophobicity of only 0.4 on the Eisenberg’s scale, compared to 0.7 or higher, for the other predicted TM helices (Figure 7(A) and (B)). According to the MPEX prediction method,19 helices 5b and 11b would lie parallel rather than perpendicular to the lipid interface. In the alignment of the prokaryotic family 7 ABC transporters, the residues corresponding to helices 5b and 11b are poorly conserved, and they are even more hydrophilic than in the eukaryotic ABCAs. This suggests that all MSD1s and MSD2s of the ABCA transporter subfamily consist of six transmembrane helices, as shown in Figures 1 and 4). However, like in human ABCA10, the sequences of the Q9VRG3,

268

O01790, Q9V912 homologues lack the first transmembrane helix,7 possibly due to incomplete sequence translation or incomplete sequencing. The position of the six TM helices, predicted by the different algorithms is consistent with the internal symmetry in the ABCA full-transporters illustrated in Figure 3(B). The predicted ABCA topology (Figure 1) is consistent with the even number of TM helices, and the orientation of TM helix 6, 7 and 12, flanking the cytoplasmic NBDs. In the ABCA subfamily, the MSDl domain thus consists of intracellular N-terminal residues upstream of TM helix 1, followed by a variable extracellular loop and a cluster of five TM helices 2 –6 (Figure 4), while MSD2 has a similar topology. This topology agrees with the prediction of the TM helix orientation, based upon the charge distribution and net charge differences between N and C-terminal flanking residues of each TM helix.20 In agreement with the “positive inside”21 and the “charge differences” rules,21 when averaged over the entire alignment, the mean charge of the 15 cytosolic residues flanking each ABCA TM helix is more positive than that of the counterpart extracellular residues. The largest charge differences are found between the N and C-terminal loops around helix 1 and 7, due to conserved arginine and lysine residues on the cytosolic side. To validate these prediction methods for ABCAs, similar calculations were carried out for the MsbA and BtuC transporter homologues. The outcome of the TM predictions was compared with the position and orientation of the TM helices in the crystal structures of the MsbA and BtuC bacterial transporters.4,5 In the MsbA subfamily, the position of five of the six TM helices was predicted correctly using the Eisenberg hydrophobicity scale and the TMHMM algorithm, as was their orientation using the charge difference rule. The more hydrophilic C-terminal helix was only predicted in some MsbA homologues, stressing the importance of predicting the transmembrane helices in a multiple sequence alignment. In the crystal structure of BtuC, helices H7 and H8 do not span but rather insert partially into the membrane.5 They were predicted as a single helix by the hydrophobicity prediction methods, which correctly identified the position of helices 1– 6, 9 and 10. The charge difference rule assigned a correct orientation to helices 1– 6. We also examined the conservation of charged residues in the helices of the crystalline MsbA and BtuC structures, and the occurrence of intrahelical hydrogen bonds and salt bridges, which stabilize the architecture of the transmembrane domain. In MsbA and BtuC, conserved polar residues form a network of inter-helical hydrogen bonds and salt bridges. In the ABCA subfamily, the helices H1, H6, H7 and H12 contain highly conserved charged residues, whose side-chains might form interhelical hydrogen bonds or salt bridges. The crystal structures of MsbA and BtuC further show that the intracellular loops between H2 and

Structure and Evolution of the ABCA Transporters

H3 in MsbA, and between H6 and H7 in BtuC make close contact with residues around the Q loops in the NBD domains.4,5 Sequence alignments of the MsbA and BtuC subfamilies show high degree of conservation in these loops (data not shown), suggesting that hydrophobic interactions and hydrogen bonds between conserved residues in the NBD and in the loops, might stabilize these contacts. Alignment of the MSD domains of the eukaryotic ABCA subfamily (Figures 3(B) and 4), shows high sequence conservation in the intracellular loop IC2 between H2 and H3 and in IC5 between H8 and H9, including both hydrophobic and polar residues. As in bacterial transporters, the ABCA IC2 and IC5 loops might thus interact with NBD residues around the Q loops, to ensure contacts between TM and NBD domains. The long extracellular (EC) loops between helices 1 and 2 (EC1) and helices 7 and 8 (EC4) represent a typical feature for the topology of the ABCA transporters. They are not predicted in other ABC subfamilies and are not found in the crystal structure of MsbA and BtuC, which belong to ABC subfamilies 6 and 8 in Quentin’s ABC classification,17 respectively. Differences in the length of the extracellular loops account mainly for the differences in sequence length between the human ABCA transporters (Table 3). The loops are longest in the phylogenic group including the ABCA1, 2, 3, 4, 7 and 12 transporters. We compared the conservation of cysteine residues and predicted N-glycosylation sites in extracellular loops (EC) ABCA1-10 and ABCA12. Fifteen cysteine residues are conserved in ABCA1, A4, A7 and A12, seven of which (C54, 75, 84, 309, 355, 504, and C826, in ABCA1) are found in EC1, while three (C1463, 1465, and 1477, in ABCA1) are located in EC4. The four human ABCA1 homologs, ABCA2, A4, A7, and A12, contain conserved predicted glycosylation sites at N400, N1453, and N1637 of ABCA1. N400 is located on EC1, while N1453, and 1637 belong to EC4, the first extracellular loop of MSD2. The nucleotide-binding domains are the best conserved segments in ABCA transporters. The P-loop, H-loop, the Walker B, and signature motif are highly conserved in all sequences (Figure 3(A)). In NBD2 of ABCA1, the b1 – b2 loop at residues 1922– 1926, consists of five basic residues (RRKRK), which line and create a strong positive electrostatic potential around the ATP-binding site in a molecular model for NBD2 (data not shown). The same is observed in the NBD2 of the ABCA2, 5, 6, 7, 8, 9 and 10 transporters, but not in the other members of the ABCA subfamily (Figure 8). These basic residues might increase the affinity of ATP for NBD2 compared to NBD1, and possibly determine the cycle of ATP binding and hydrolysis and the cooperativity between the two NBD domains in the ABCA full-transporters. The NBD1 and NBD2 domains are followed by the conserved 80-residue segments Q2 and Q3, specific for the ABCA subfamily (Figure 2) and

Table 3. Position of TM helices and length of the connecting loops, in human ABCA transporters Transporter

Helix 1

Helix 2

Helix 3

Helix 4

Helix 5

Helix 6

Helix 7

Helix 8

Helix 9

Helix 10

Helix 11

Helix 12

ABCA1 ABCA2 ABCA4 ABCA7

25–42 25–42 25–42 25–42

639–662 707–730 654–677 549–572

681 –703 479 –771 696 –718 591 –613

718–740 786–808 733–755 628–651

745 –767 813 –836 760 –782 655 –677

820 –842 892 –914 835 –857 729 –751

1348–1368 1458–1478 1373–1393 1239–1259

1655–1677 1793–1815 1680–702 1536–1558

1698–1724 1836–1862 1725–1749 1579–1605

1737– 1759 1875– 1897 1762– 1784 1618– 1640

1769–1791 1907–1929 1794–1816 1650–1671

1849–1870 1989–2010 1875–1896 1730–1751

ABCA3

25–42

262–285

304 –326

346–368

373 –395

448 –470

926–946

1098–1120

1141–1167

1180–1202

1212–1234

1303–1324

ABCA12

26–43

1069–1092

1110–1132

1147–1169

1174 –1196

1249–1271

1747–1767

1987–2006

2030–2056

2069– 2091

2101–2122

2186–2207

ABCA5 ABCA6 ABCA8 ABCA9 ABCA10

32–49 30–47 30–47 30–47 –

262 –284 263 –285 265 –287 265 –287 176 –198 IC1 18 18 18 18

299–321 300–322 302–324 303–325 213–235 EC2 14 14 14 14

326 –348 327 –349 329 –351 330 –352 240-263 IC2 4 4 4 3

395 –417 395 –417 397 –419 398 –420 308 –330 EC3 54 55 52 51

862–882 854–875 862–882 863–883 773–793

ABCA1 ABCA2 ABCA4 ABCA7

219–243 221–244 224–247 225–248 135–158 ECI 598 666 613 508

1023–1041 1015–1036 1021–1044 1022–1045 934 –955 EC4 286 314 286 276

1065–1091 1057–1083 1065–1091 1066–1091 976–1002 IC4 20 20 20 20

1104– 1126 1097–1119 1104– 1125 1106– 1128 1015– 1037 EC5 12 12 12 12

1147–1168 1129–1149 1136–1157 1137–1159 1047–1067 IC5 9 9 9 9

1207–1228 1196 –1217 1199 –1220 1202–1223 1115 –1136 EC6 56 59 58 58

ABCA3 ABCA12

181 1026

18 17

19 14

4 4

52 52

151 219

20 20

12 12

9 9

68 63

ABCA5 ABCA6 ABCA8 ABCA9 ABCA10

171 175 168 169 –

18 18 17 16 17

14 14 14 14 14

4 4 4 4 4

56 55 56 55 54

140 139 138 138 140

20 20 20 20 20

12 13 12 13 12

20 9 9 9 9

38 46 41 42 47

Residue numbers correspond to the PHD prediction in each transporter sequence.

270

Structure and Evolution of the ABCA Transporters

Figure 7. Transmembrane helices in ABCA full-transporters: Eisenberg hydrophobicity plots of the MSDl (A) and MSD2 (B) domains.44 The mean hydrophobicity was calculated using a 21-residue window, summed for the aligned sequences, and plotted versus the ABCA1 residue number. Predicted transmembrane helices are numbered.

contains the consensus sequence S/T-S/T-Pho-D/ E-D/E, where Pho represents a hydrophobic residue (Figure 2). This sequence is predicted as a potential serine or threonine casein kinase II phosphorylation site. We further checked upon the conservation of this motif in the prokaryotic transporters homologues of ABCAs, and observed that it is strictly conserved in 23 of the 72 prokaryotic family 7 ABCA homologues. These include the DRRA daunorubicin resistance protein, the nodulation factor NodI, an antigen exporter, a polysialic acid and a lipopolysaccharide exporter and in a predicted DNA-repair enzyme of the structural maintenance of chromosomes (SMC) family.22 This consensus casein kinase II phosphorylation site was therefore probably present early in evolution and might represent a typical feature of the eukaryotic ABCAs and their precursors.

Discussion The sequence alignment of 17 mammalian ABCA transporters, enabled the identification of sequence segments specific to the ABCA subfamily, which were used to search for new ABCA transporters. Using PSI-BLAST, SSEARCH and SAM-t99 Hidden Markov Models, we identified 37 eukaryotic ABCA transporters, including both half and full-ABCA transporters, demonstrated the high internal symmetry in ABCA full-transporters and proposed a general topology for the ABCA subfamily. We also detected prokaryotic homologues in subfamily 7 ABC transporters, as the precursors of eukaryotic ABCAs. The phylogenic analysis of the ABCA subfamily demonstrated that the human ABCA1, 2, 3, 4, 7, 12 transporters cluster in a subgroup, distinct from ABCA5, 6, 8, 9 and 10, as reported by Dean et al.6 Phylogenic analyses suggest that ABCA transporters originated from the prokaryotic sub-

family 7 ABCs, and that half-transporters resulted from MSD and NBD gene fusion. Full-transporters resulted either from half-transporter duplication, or from duplication of separate MSD and NBD genes, followed by gene fusion. The parallel evolution of NBD1s and NBD2s in mammalian, insect, nematode, trypanosome and plant transporters suggests that duplication events occurred before or early in metazoan evolution. Duplication events probably account for the internal homology and symmetry in the ABCA full-transporters. The close relationship between the eukaryotic ABCA subfamily and the prokaryotic ABC transporters subfamily 7 agrees with the similarity previously reported between human ABCA transporters, and the bacterial daunorubicin resistance protein DRRA, and the nodulation factor NodI of Rhizobium, which belong to the prokaryotic ABC transporter subfamily 7.18 The combination of sequence alignment and transmembrane predictions provided the topology typical for ABCA transporters. It consists of N-terminal intracellular residues, followed by a transmembrane helix, a long extracellular loop of variable length, typical for this subfamily, and a cluster of five transmembrane helices, preceding the intracellular NBD and a conserved 80-residue domain downstream of the NBD. The orientation of the first transmembrane helix and the extracellular location of the first loop in ABCA1, were recently determined experimentally,23 and support our proposed model.24 A similar topology was proposed for ABCA4 by Bungert et al.25 who stressed the high internal symmetry of ABCA4 and of its homologues, including ABCA1. As discussed by Schmitz & Langmann,8 alternative models had been proposed for ABCA1. Rust et al.,26 first cloned ABCA1 and demonstrated that mutations in this transporter caused Tangier disease. In their model, the first 60 residues including the first membrane-spanning helix Hl were missing due to the incorrect location of the first

Figure 8. SAM-t99 aligment of the N-terminal residues of human ABCA NBD1 and NBD2. b-strands: arrow, a-helices: box, are according to Hung et al.45 for HisP. The P-loop and cluster of positive charges between b1 and b2 are indicated under the alignment.

272

codon, so that the N-terminal residues were located extracellularly. Helix H8 was not correctly predicted, and it was described as only halfspanning the membrane, due to its lower hydrophobicity.27 The analysis of the completed ABCA1 sequence, and the recent experimental data28 suggest that ABCA1 shares the same topology as proposed for the other members of the ABCA subfamily. The crystal structure of the MsbA dimer4 shows that this full-transporter contains two symmetrical clusters of six transmembrane helices, while the BtuC transporter consists of two clusters of ten transmembrane helices.5 Interhelical hydrogen bonds and salt bridges were identified between conserved charged residues in the transmembrane helices of the two bacterial transporters. By analogy, ionic interactions between conserved polar residues in helices Hl, H6, H7 and H12, might also contribute to the stability of the MSD domains of the ABCA subfamily. In the MsbA dimer, the two ˚ apart,4 whereas in NBD domains are about 50 A BtuC they are close to each other and can form inter-domain association, such as in the Rad50 protein.29 Homology modelling of the ABCA1 NBD1 and NBD2 suggests that the two NBD domains can interact with each other, such as in BtuC and Rad50. The crystal structures of the MsbA and BtuC transporters4,5 show that the inter-helical loops play an important structural and functional role. The intracellular loops between H2 and H3 in MsbA, and between H6 and H7 in BtuC form a cytoplasmic domain, linking the MSD and NBD, through hydrophobic interactions and hydrogen bonds. This domain might couple NBD conformational changes accompanying ATP hydrolysis, to transmembrane helix rearrangements in the MSD. In the ABCA subfamily, the intracellular (IC) loops, and especially the H2 – H3 and H8 – H9 loops, are highly conserved and some residues are even conserved in the prokaryotic subfamily 7 MSDs. Conserved hydrophobic and polar residues in these loops might couple MSD to NBD as in the bacterial transporters. The structure of the P-glycoprotein,30 also suggests that conformational changes of the transmembrane domains are associated with solute translocation. In the ABCA subfamily, the long variable extracellular loops might function as binding sites for specific ligands, such as apo AI to ABCA1. Mutations of conserved residues in EC1 and EC4 of ABCA1 and ABCA4, are accompanied by either Tangier or Stargardt disease.6 Such missense mutations affect R587 in ABCA1 and the corresponding R602 in ABCA4, S1506 in ABCA1, (corresponding the glycosylated N1525 in ABCA425), and the conserved cysteine residues Cl477 in ABCA1, C54, C75, C230, C1488 and C1490 in ABCA4. Conserved cysteine residues in ABCA1, A7 and A12 might contribute to the proper folding or to interactions between the EC1 and EC4 loops, as proposed by Bungert et al.25 for ABCA4. These

Structure and Evolution of the ABCA Transporters

cysteine residues are not conserved in ABCA2, in agreement with the intracellular location of this transporter.10 Sequence alignment of the ABCA transporters and homologues also detected an 80-residue conserved domain downstream of each NBD, specific for the ABCA subfamily. This domain contains a highly conserved S/T-Pho-D/E-D/E consensus motif for a casein kinase phosphorylation site. Similar regulatory domains, containing putative phosphorylation sites, were reported downstream of the NBD, especially in human CFTR,31 and in the bacterial MalK transporter.32 In conclusion, the identification of new members of the ABCA family and the recognition of the internal symmetry of these transporters enabled us to propose a general topology and an evolutionary scheme for this class of proteins. These results will be useful for structure – function studies and for molecular modelling of the ABCA transporters.

Materials and Methods Mammalian ABCA transporter sequences were aligned with DIALIGN,33 and CLUSTALX,15 using the BLOSUM substitution matrix series with a gap opening penalty of 5, and a gap extension penalty of 0.05. Residue conservation calculations along the sequences helped identify conserved segments, which were used as query sequences, Q1, Q2, Q3, to search for mammalian ABCA homologues. These were detected using SSEARCH,34 PSI-BLAST (– B option),35 combined with the OCTOPUS editing tool, and SAM-t9936 programs. Searches were carried out in the SWALL database, supplemented with the newly sequenced human ABCA5, 6, 8, 9, 10, and 12 transporters.7 The topology of the 200 best-scoring sequences in the SSEARCH queries, and of those with an expect value less or equal to 10 in the PSI-BLAST searches, were verified by SMART.37 These sequences were further used as input in FASTA3, to verify that they detected ABCA transporters as their closest homologues. Only the sequences that passed the SMART and FASTA3 tests were included into a PSI-BLAST PSSM (Position Specific Substitution Matrix), for the next PSI-BLAST search, and this process was continued until convergence. The ABCA homologues detected by SSEARCH and PSI-BLAST were aligned using T-COFFEE.38 Segments were cut-out using JALVIEW†, and aligned using the SAM-target99 program in the – tuneup mode. Alignments were converted into Hidden Markov model (HMM),36 and used to search for additional ABCA homologues. An eukaryotic protein sequence subdatabase was extracted from the SWALL database using the sequence retrieval system (SRS) program. Entire proteomes were downloaded from the website‡. The homologues were further checked with organismspecific databases annoted for ABC transporters§. Prokaryotic ABC sequences of 20 different genomes † http://circinus.ebi.ac.uk:6543/jalview/ ‡ http://www.ebi.ac.uk/genomes/ § http://wormbase.org, http://fruitfly.org, and http://arabidopsis.org

Structure and Evolution of the ABCA Transporters

were used from the ABCdb database of Quentin & Fichant.17 The SAM-t99 alignment of the nucleotide-binding domains of the ABCA subfamily was used for phylogenic analysis, after deletion of the columns corresponding either to insertion states in the HMM or to low conservation residues. Translation errors in nucleotide sequences were corrected with GENEWISE (Wise2 package), using the ABCA NBD HMM as input. Phylogenic analysis was carried out with the PAUP and PHYLIP39 packages. Maximum likelihood distances between protein sequences were calculated using PROTDIST, with the PAM250 matrix. Phylogenic trees were inferred from FITCH and from the NEIGHBOR program, using the neighbor-joining algorithm.40 Maximum parsimony analysis was carried out using PROTPARS.39 DNAPARS was used for maximum parsimony analysis of the DNA sequence alignment. Bootstrap analysis with 500 resamplings, was performed using SEQBOOT, consensus trees were calculated using CONSENSE. For similar phylogenic analyses of the NBDs of the entire ABC family, we first extracted the ABC transporter sequences out of five eukaryotic genomes (human, Arabidopsis, Drosophila, C. elegans and Saccharomyces) and the 20 prokaryotic genomes included in Quentin’s database.17 The eukaryotic ABC transporters were identified using a SAMt-99 HMM based upon the PFAM NBD alignment. All ABC NBDs were aligned using HMM and the phylogenic analysis was carried out as described above. TM helices were predicted using MPEX,19 TMHMM2.0,41 PHD,42 and TMPRED.43 The mean hydrophobicity index was calculated according to Eisenberg et al.44 Homology modelling of ABCA1 NBDl and NBD2 was performed using the HOMOLOGY software (Accelrys, Cambridge, UK). The crystal structures of the Salmonella typhimurium HisP (1B0U),45 Thermoccocus litoralis MalK (1G29),32 and of the Pyrococcus furiosis Rad50 NBDs (1F2T/1F2U),29 were used as templates. Crystal structures of MsbA4 and BtuC5 were used as templates for temptative modelling of ABCA1 using the HOMOLOGY software.

Acknowledgements This work was supported by Grant of the Funds for Scientific Research-Flanders 3G032202. S.R. is a recipient of a doctoral Research Grant of the University Gent (011V0201-VEO). We are grateful to Dr C. Shoulders (London) for her comments and suggestions about the manuscript.

References 1. Higgins, C. F. (1992). ABC transporters: from microorganisms to man. Annu. Rev. Cell Biol. 8, 67 – 113. 2. Holland, I. B. & Blight, M. A. (1999). ABC-ATPases, adaptable energy generators fuelling transmembrane movement of a variety of molecules in organisms from bacteria to humans. J. Mol. Biol. 293, 381– 399. 3. Dean, M., Rzhetsky, A. & Allikmets, R. (2001). The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. Genome Res. 11, 1156– 1166.

273

4. Chang, G. & Roth, C. B. (2001). Structure of MsbA from E. coli: a homolog of the multidrug resistance ATP binding cassette (ABC) transporters. Science, 293, 1793– 1800. 5. Locher, K. P., Lee, A. T. & Rees, D. C. (2002). The E. coli BtuCD structure: a framework for ABC transporter architecture and mechanism. Science, 296, 1091 –1098. 6. Dean, M., Hamon, Y. & Chimini, G. (2001). The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. J. Lipid Res. 42, 1007– 1017. 7. Arnould, I., Schriml, L. M., Prades, C., Lachtermacha-Truinfol, M., Schneider, T., Maintoux, C. et al. (2001). Identifying and characterizing a five-gene cluster of ATP-binding cassette transporter mapping to human chromosome 17q24: a new subgroup within the ABC-A sub-family. Gene Screen 1, 157– 164. 8. Schmitz, G. & Langmann, T. (2001). Structure, function and regulation of the ABC1 gene product. Curr. Opin. Lipidol. 12, 129–140. 9. Allikmets, R. (2000). Simple and complex ABCR: genetic predisposition to retinal disease. Am. J. Hum. Genet. 67, 793– 799. 10. Zhou, C., Zhao, L., Inagaki, N., Guan, J., Nakajo, S., Hirabayashi, T. et al. (2001). Atp-binding cassette transporter ABC2/ABCA2 in the rat brain: a novel mammalian lysosome-associated membrane protein and a specific marker for oligodendrocytes but not for myelin sheaths. J. Neurosci. 21, 849– 857. 11. Kaminski, W. E., Wenzel, J. J., Piehler, A., Langmann, T. & Schmitz, G. (2001). ABCA6, a novel a subclass ABC transporter. Biochem. Biophys. Res. Commun. 285, 1295 –1301. 12. Sanchez-Fernandez, R., Davies, T. G., Coleman, J. O. & Rea, P. A. (2001). The Arabidopsis thaliana ABC protein superfamily, a complete inventory. J. Biol. Chem. 276, 30231– 30244. 13. Marguet, D., Luciani, M. F., Moynault, A., Williamson, P. & Chimini, G. (1999). Engulfment of apoptotic cells involves the redistribution of membrane phosphatidylserine on phagocyte and prey. Nature Cell Biol. 1, 454– 456. 14. Sauder, J. M., Arthur, J. W. & Dunbrack, R. L. J. (2000). Large-scale comparison of protein sequence alignment algorithms with structure alignments. Proteins: Struct. Funct. Genet. 40, 6 – 22. 15. Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F. & Higgins, D. G. (1997). The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucl. Acids. Res. 25, 4876– 4882. 16. Broccardo, C., Luciani, M. & Chimini, G. (1999). The ABCA subclass of mammalian transporters. Biochim. Biophys. Acta, 1461, 395– 404. 17. Quentin, Y. & Fichant, G. (2000). ABCdb: an ABC transporter database. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2, 501 –504. 18. Saurin, W., Hofnung, M. & Dassa, E. (1999). Getting in or out: early segregation between importers and exporters in the evolution of ATP-binding cassette (ABC) transporters. J. Mol. Evol. 48, 22 – 41. 19. White, S. H. & Wimley, W. C. (1999). Membrane protein folding and stability: physical principles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 319– 365. 20. von Heijne, G. (1992). Membrane protein structure prediction. Hydrophobicity analysis and the positive-inside rule. J. Mol. Biol. 225, 487– 494. 21. Hartmann, E., Rapoport, T. A. & Lodish, H. F. (1989). Predicting the orientation of eukaryotic

274

22.

23.

24.

25.

26.

27.

28.

29.

30.

31. 32.

Structure and Evolution of the ABCA Transporters

membrane-spanning proteins. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 5786– 5790. Cobbe, N. & Heck, M. M. (2000). Review: SMCs in the world of chromosome biology—from prokaryotes to higher eukaryotes. J. Struct. Biol. 129, 123– 143. Fitzgerald, M. L., Mendez, A. J., Moore, K. J., Andersson, L. P., Panjeton, H. A. & Freeman, M. W. (2001). ATP-binding cassette transporter A 1 contains an NH2-terminal signal anchor sequence that translocates the protein’s first hydrophilic domain to the exoplasmic space. J. Biol. Chem. 276, 15137– 15145. Tanaka, A. R., Ikeda, Y., Abe-Dohmae, S., Arakawa, R., Sadanami, K., Kidera, A. et al. (2001). Human ABCA1 contains a large amino-terminal extracellular domain homologous to an epitope of Sjogren’s Syndrome. Biochem. Biophys. Res. Commun. 283, 1019– 1025. Bungert, S., Molday, L. L. & Molday, R. S. (2001). Membrane topology of the ATP binding cassette transporter ABCR and its relationship to ABC1 and related ABCA transporters. J. Biol. Chem. 276, 23539– 23546. Rust, S., Rosier, M., Funke, H., Real, J., Amoura, Z., Piette, J. C. et al. (1999). Tangier disease is caused by mutations in the gene encoding ATP-binding cassette transporter 1. Nature Genet. 22, 352–355. Luciani, M. F., Denizot, F., Savary, S., Mattei, M. G. & Chimini, G. (1994). Cloning of two novel ABC transporters mapping on human chromosome 9. Genomics, 21, 150– 159. Fitzgerald, M. L., Mendez, A. J., Moore, K. J., Andersson, L. P., Panjeton, H. A. & Freeman, M. W. (2001). ATP-binding cassette transporter A1 contains an NH2-terminal signal anchor sequence that translocates the protein’s first hydrophilic domain to the exoplasmic space. J. Biol. Chem. 276, 15137– 15145. Hopfner, K. P., Karcher, A., Shin, D. S., Craig, L., Arthur, L. M., Carney, J. P. & Tainer, J. A. (2000). Structural biology of Rad50 ATPase: ATP-driven conformational control in DNA double-strand break repair and the ABC-ATPase superfamily. Cell, 101, 789– 800. Rosenberg, M. F., Velarde, G., Ford, R. C., Martin, C., Berridge, G., Kerr, I. D. et al. (2001). Repacking of the transmembrane domains of P-glycoprotein during the transport ATPase cycle. EMBO J. 20, 5615– 5625. Winter, M. C. & Welsh, M. J. (1997). Stimulation of CFTR activity by its phosphorylated R domain. Nature, 389, 294– 296. Diederichs, K., Diez, J., Greller, G., Muller, C., Breed, J., Schnell, C. et al. (2000). Crystal structure of MalK,

33. 34. 35.

36. 37.

38.

39.

40. 41.

42. 43. 44.

45.

the ATPase subunit of the trehalose/maltose ABC transporter of the archaeon Thermococcus litoralis. EMBO J. 19, 5951– 5961. Morgenstern, B. (1999). DIALIGN 2: improvement of the segment-to-segment approach to multiple sequence alignment. Bioinformatics, 15, 211– 218. Smith, T. F. & Waterman, M. S. (1981). Identification of common molecular subsequences. J. Mol. Biol. 147, 195– 197. Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D. J. (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucl. Acids. Res. 25, 3389– 3402. Karplus, K., Barrett, C. & Hughey, R. (1998). Hidden Markov models for detecting remote protein homologies. Bioinformatics, 14, 846– 856. Schultz, J., Milpetz, F., Bork, P. & Ponting, C. P. (1998). SMART, a simple modular architecture research tool: identification of signaling domains. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 95, 5857 –5864. Notredame, C., Higgins, D. G. & Heringa, J. (2000). T-Coffee: a novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. J. Mol. Biol. 302, 205– 217. Felsenstein, J. (1993). PHYLIP (Phylogeny Inference Package) Version 3.5c, Department of Genetics, University of Washington, Seattle, distributed by the author. Saitou, N. & Nei, M. (1987). The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4, 406– 425. Sonnhammer, E. L., von Heijne, G. & Krogh, A. (1998). A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. Proc. Int. Conf. Intell. Syst. Mol. Biol. 6, 175– 182. Rost, B., Casadio, R., Fariselli, P. & Sander, C. (1995). Transmembrane helices predicted at 95% accuracy. Protein Sci. 4, 521– 533. Hofmann, K. & Stoffel, W. (1993). TMbase—a database of membrane spanning protein segments. Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 374, 166– 175. Eisenberg, D., Schwarz, E., Komaromy, M. & Wall, R. (1984). Analysis of membrane and surface protein sequences with the hydrophobic moment plot. J. Mol. Biol. 179, 125–142. Hung, L. W., Wang, I. X., Nikaido, K., Liu, P. Q., Ames, G. F. & Kim, S. H. (1998). Crystal structure of the ATP-binding subunit of an ABC transporter. Nature, 396, 703– 707.

Edited by I. B. Holland (Received 22 July 2002; received in revised form 27 September 2002; accepted 1 October 2002)

XII. Fosforylatie door proteïne kinase CK2 moduleert de activiteit van de ATPbindende cassette A1 (ABCA1) transporter. Phosphorylation by protein kinase CK2 modulates the activity of the ATP-binding Cassette A1 (ABCA1) transporter.

J Biol Chem. 2004 Sept;279(36):37779-37788.

Humane ABC transporters zijn opgebouwd uit twee cytoplasmatische ATP-bindende domeinen (NBDs), die instaan voor de binding en hydrolyse van ATP, en twee transmembrane domeinen (MSDs) waardoor het substraat getransloceerd wordt. Bij leden van de ABCA subfamilie wordt elk NBD gevolgd door een sterk geconserveerd domein van 80 aminozuren (R-domein), waaraan een regulatorische functie toegeschreven wordt. De ABCA1 transporter, een lid van de ABCA subfamilie, staat in voor de efflux van cholesterol en fosfolipiden uit de cel, en speelt hierdoor een cruciale rol bij het omgekeerd cholesterol transport. Over de regulatie van ABCA1 is slechts weinig gekend.

In analogie met andere ABC transporters wordt de ABCA1 activiteit

gereguleerd door proteïne kinase A (PKA) en C (PKC) fosforylatie. PKA fosforylatie van residu’s in NBD1 en NBD2 speelt een rol bij de regulatie van de ABCA1 activiteit, terwijl PKC fosforylatie waarschijnlijk een rol speelt bij de bescherming tegen degradatie. De functie van het R-domein in ABCA1 is echter nog niet gekend. Naast de PKA en PKC fosforylatie plaatsen, bevat de ABCA1 transporter eveneens 39 potentiele proteïne kinase CK2 fosforylatie plaatsen (Peelman et al., 2003). CK2 is een constitutief actief serine/threonine kinase waarvoor reeds meer dan 200 substraten gekend zijn. Van de 39 potentiële CK2 fosforylatie plaatsen in ABCA1 is er één gelocaliseerd in NBD1, drie in het R1-domein, vier in NBD2 en twee in het R2domein. Alignering van de ABCA transporters toont aan dat de threonines op positie 1242 en 1243 in het R1-domein na NBD1, en op posities 2211 en 2212 in R2 na NBD2, sterk geconserveerd zijn. De serine op positie 1255 in R1 is eveneens een potentiële CK2 fosforylatie plaats, maar is minder sterk geconserveerd en is afwezig in R2. De mogelijke regulerende rol van CK2 fosforylatie van residu’s in de R1 en R2 domeinen van de ABCA1 transporter werd onderzocht.

86

1) In vitro CK2-fosforylatie van de R-domeinen in ABCA1.

NBD1+R1 en NBD2+R2 werden tot expressie gebracht in E. coli en gezuiverd door middel van Ni-affiniteitschromatografie (Roosbeek et al., 2004). Beide recombinante proteïnen werden geïncubeerd met recombinant CK2 in de aanwezigheid van [γ32 P] ATP en de gefosforyleerde proteïnen werden gedetecteerd door SDS-PAGE gevolgd door autoradiografie. Enkel NBD1+R1 werd in vitro door CK2 gefosforyleerd. De gefosforyleerde residu’s in NBD1+R1 werden bepaald door middel van MALDI/MS massa spectrometrie. Enkel T1242, T1243 en S1255 in het R1-domein worden door CK2 gefosforyleerd.

2) Het effect van CK2 fosforylatie op de ABCA1 transporter activiteit.

Om het effect van de CK2 fosforylatie op de ABCA1 transporter activiteit werden mutanten geconstrueerd waarbij de sterk geconserveerde threonines of de serine gemuteerd werden, of waarbij de downtream cluster van zure residu’s na de threonines, die eveneens deel uitmaken van de CK2 consensus sequentie, gemuteerd werden.

Eveneens werden mutanten gemaakt waarbij de threonines gemuteerd

werden naar een asparaginezuur waardoor een gefosforyleerd residu wordt nagebootst (Tabel 8).

Mutatie

Doel van de mutatie

T1242A

CK2 fosforylatie voorkomen

T1243A

CK2 fosforylatie voorkomen

T1242A + T1243A

CK2 fosforylatie voorkomen

S1255A

CK2 fosforylatie voorkomen

E1245Q + E1246Q

CK2 fosforylatie voorkomen

T1242D

Fosforylatie plaats nabootsen

T1243D

Fosforylatie plaats nabootsen

T1242D + T1243D

Fosforylatie plaats nabootsen

Tabel 8: De verschillende geconstrueerde mutanten van ABCA1 om het effect van CK2 fosforylatie in het R1-domein van ABCA1 te onderzoeken.

87

Alle mutanten werden gemaakt in de volledige ABCA1 transporter, uitgaand van een bidirectionele pBI-ABCA1/GFP vector die codeert voor een ABCA1-GFP fusieproteïne. Het effect van de mutaties op de ABCA1 flippase activiteit, op de apo AI binding aan de cel en op de lipide efflux activiteit werd bestudeerd na transfectie in Hek-293 Tet-Off cellen.

In een eerste fase werd aangetoond dat er een lineair verband bestaat tussen de transporter activiteit en het expressieniveau van ABCA1.

Aangezien alle

experimenten uitgevoerd werden met transiënt getransfecteerde cellen, werden dit lineair verband gebruikt om de bekomen data te normaliseren.

Na transfectie in Hek-293 Tet-Off cellen werd de flippase activiteit van ABCA1 wild type en mutanten onderzocht.

Getransfecteerde cellen werden geïncubeerd met

fluorescent gemerkt fosfatidylethanolamine of fosfatidylserine, waarna het percentage gemerkt fosfolipide in de buitenste schil van de plasmamembraan bepaald werd door middel van dithionite quenching. In vergelijking met mock-getransfecteerde cellen, werd in ABCA1 wild type getransfecteerde cellen meer fosfolipide in de buitenste schil aangetroffen, te wijten aan de flippase activiteit van ABCA1. De ABCA1 mutanten die geconstrueerd werden om CK2 fosforylatie te voorkomen vertoonden een sterk verhoogde flippase activiteit, terwijl de mutanten waarbij een gefosforyleerd residu nagebootst werd een gelijkaardige activiteit aan wild type ABCA1 vertonen. Incubatie van de getransfecteerde cellen met specifieke CK2 inhibitoren, TBB en apigenine, resulteerde eveneens in een verhoogde flippase activiteit van wild type ABCA1, terwijl de flippase activiteit van de threonine/serine naar alanine mutanten bijna onveranderd bleef.

Omdat de ABCA1 transporter een belangrijke rol speelt in de apolipoproteïne gemedieerde cholesterol efflux, werd eveneens de binding van apo AI en apo AII (de belangrijkste acceptoren van lipiden na efflux) aan de getransfecteerde cellen onderzocht. Voor de bindingstudies werd gebruik gemaakt van carboxyrhodamine gemerkte apolipoproteïnen. Binding werd bestudeerd door middel van FACS analyse waarbij de ABCA1-GFP getransfecteerde cellen onderverdeeld werden in drie populaties, afhankelijk van hun expressieniveau bepaald door de GFP-fluorescentie.

88

Voor ABCA1 wild type en de mutanten werd een analoog effect waargenomen als bij de flippase activiteit; als de threonine of serine residu’s niet meer door CK2 kunnen gefosforyleerd worden, resulteert dit in een verhoogde binding van apo AI en apo AII aan de cel. Mutanten die een gefosforyleerd residu nabootsen op de plaats van de threonine residu’s, vertonen een vergelijkbare apolipoproteïne binding aan de cel als het wild type ABCA1.

In een laatste fase werd het effect van de mutaties op de fosfolipide en cholesterol efflux bestudeerd.

Na incubatie met fluorescent gemerkt fosfatidylethanolamine,

fosfatidylserine of cholesterol werden de ABCA1 getransfecteerde cellen geïncubeerd met apo AI. De hoeveelheid gemerkt lipide in de plasmamembraan werd vόόr en na incubatie met apo AI bepaald, en het percentage lipide efflux werd bepaald. De resultaten van de efflux studies waren analoog aan die van de flippase activiteit en de apolipoproteïne binding aan de cel.

Om na te gaan of dit effect van de mutaties niet te wijten is aan een gewijzigde cellulaire lokalisatie van de mutanten, werd hun lokalisatie bepaald door middel van confocale microscopie.

Zowel wild type als mutanten werden hoofdzakelijk

teruggevonden in de plasmamembraan.

Deze data suggereren dus dat CK2 fosforylatie van de geconserveerde threonine en serine residu’s in het R1-domein van ABCA1 instaat voor een in vivo down-regulatie van de transporteractiviteit.

Hoe deze regulatie juist gebeurt is echter nog niet

geweten. De X-straal structuur van de vitamine B12 transporter ButCD suggereert dat de twee NBDs met elkaar interageren.

Deze interactie wordt waarschijnlijk

gestabiliseerd door interacties tussen de R-domeinen waardoor de coöperativiteit tussen beide helften van de transporter versterkt wordt. Fosforylatie van het proteïne zou een invloed kunnen hebben op deze interacties en zo zorgen voor de regulatie van de activiteit.

89

THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY © 2004 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.

Vol. 279, No. 36, Issue of September 3, pp. 37779 –37788, 2004 Printed in U.S.A.

Phosphorylation by Protein Kinase CK2 Modulates the Activity of the ATP Binding Cassette A1 Transporter* Received for publication, February 19, 2004, and in revised form, June 18, 2004 Published, JBC Papers in Press, June 24, 2004, DOI 10.1074/jbc.M401821200

Stein Roosbeek‡§, Frank Peelman‡, Annick Verhee‡, Christine Labeur‡, Hans Caster‡, Marc F. Lensink‡, Claudia Cirulli¶, Johan Grooten储, Claude Cochet**, Joe¨l Vandekerckhove‡, Angela Amoresano¶, Giovanna Chimini‡‡, Jan Tavernier‡, and Maryvonne Rosseneu‡ From the ‡Department of Biochemistry, Faculty of Medicine and Health Sciences, Ghent University, B-9000 Ghent, Belgium, ‡‡Centre d’Immunologie F-13288 Marseille-Luminy, France, **Commissariat a` l’Energie Atomique (Saclay, France), F-38054 Grenoble, France, ¶University of Naples, I-80126 Naples, Italy, and 储Department of Molecular Biology, Ghent University, B-9000 Ghent, Belgium

In a previous characterization of the ABCA subfamily of the ATP-binding cassette (ABC) transporters, we identified potential protein kinase 2 (CK2) phosphorylation sites, which are conserved in eukaryotic and prokaryotic members of the ABCA transporters (Peelman, F., Labeur, C., Vanloo, B., Roosbeek, S., Devaud, C., Duverger, N., Denefle, P., Rosier, M., Vandekerckhove, J., and Rosseneu, M. (2003) J. Mol. Biol. 325, 259 –274). These phosphorylation residues are located in the conserved cytoplamic R1 and R2 domains, downstream of the nucleotide binding domains NBD1 and NBD2. To study the possible regulation of the ABCA1 transporter by CK2, we expressed the recombinant cytoplasmic domains of ABCA1, NBD1ⴙR1 and NBD2ⴙR2. We demonstrated that in vitro ABCA1 NBD1ⴙR1, and not NBD2ⴙR2, is phosphorylated by CK2, and we identified Thr-1242, Thr-1243, and Ser-1255 as the phosphorylated residues in the R1 domain by mass spectrometry. We further investigated the functional significance of the threonine and serine phosphorylation sites in NBD1 by site-directed mutagenesis of the entire ABCA1 followed by transfection into Hek-293 Tet-Off cells. The ABCA1 flippase activity, apolipoprotein AI and AII binding, and cellular phospholipid and cholesterol efflux were enhanced by mutations preventing CK2 phosphorylation of the threonine and serine residues. This was confirmed by the effect of specific protein kinase CK2 inhibitors upon the activity of wild type and mutant ABCA1 in transfected Hek-293 Tet-Off cells. The activities of the mutants mimicking threonine phosphorylation were close to that of wild type ABCA1. Our data, therefore, suggest that besides protein kinase A and C, protein kinase CK2 might play an important role in vivo in regulating the function and transport activity of ABCA1 and possibly of other members of the ABCA subfamily. The role of the ABCA11 transporter, a member of the subfamily A of the ATP binding cassette transporters, in the efflux * The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page charges. This article must therefore be hereby marked “advertisement” in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact. § To whom correspondence should be addressed: University of Ghent, Department Biochemistry, Hospitaalstraat 13, B-9000 Ghent, Belgium. Tel.: 32-9-264-92-73; Fax: 32-9-264-94-96; E-mail: stein.roosbeek@ UGent.be. 1 The abbreviations used are: WT, wild type; ABCA1, ATP binding cassette A1; MALDI, matrix-assisted laser desorption ionization time; NBD, nucleotide binding domain; PKA and PKC, protein kinase A and This paper is available on line at http://www.jbc.org

of cellular phospholipids and cholesterol has become well established (2). Several studies link ABCA1 mutations to impaired cellular cholesterol and phospholipid efflux characteristic of Tangier disease and high density lipoprotein-deficiency patients (3–5). Expression of WT and mutant ABCA1 in cultured cells demonstrated the correlation between the level of expression and activity of the ABCA1 transporter, the extent of binding to the apolipoprotein AI (apoAI) acceptor and the efflux of cellular lipid (6). Human ABC transporters consist of a cytoplasmic nucleotide binding domain (NBD), which binds and hydrolyzes ATP, and of a membrane-spanning domain through which the substrate is translocated (7– 8). Besides these elements, regulatory domains with putative phosphorylation sites were described in several human transporters (7). We carried out an extensive analysis of the subfamily A of the ABC transporters and showed that this subfamily consists of 13 human ABCA and of many eukaryotic and prokaryotic ABCA homologues (1). Multiple alignments of the subfamily A transporters demonstrated the high degree of sequence conservation and the particular topology of this subfamily. In the ABCA subfamily, the intracellular N-terminal residues are followed by a first transmembrane helix, by a long extracellular loop, and by a downstream cluster of five transmembrane helices separated by short loops. The transmembrane domain is followed by a cytoplasmic nucleotide binding domain NBD1 and by a downstream sequence of 80 conserved residues. In the full ABCA transporters, which have a high internal symmetry, these elements are repeated in the second half of the transporter (1). Among the human transporters of the ABCA subfamily, mutations in ABCA1 have been linked to Tangier disease, whereas mutations in ABCA2 impair the transport of retinyldiene and cause retinal degeneration (9). In both transporters, mutations in the nucleotide binding domains decrease the ATPase activity and thereby impair the transport activity of the mutants. Point mutations in the ABCA1 and ABCA2 extracellular loops probably affect the three-dimensional structure of the transporters and decrease their association with acceptor proteins required for substrate export (10). The 80-residue segments downstream of the NBDs are conserved in the eukaryotic ABCAs and in the prokaryotic subfamily 7 precursors (1). In ABCA1 none of the natural mutations causing either Tangier disease or familial hypo-␣C, respectively; CK2, protein kinase 2; Hek, human embryonic kidney; PS, phosphatidylserine; PE, phosphatidylethanolamine; GFP, green fluorescent protein; DMEM, Dulbecco’s modified Eagle’s medium; FBS, fetal bovine serum; PBS, phosphate-buffered saline.

37779

37780

Protein Kinase CK2 Phosphorylation Modulates ABCA1 Activity

lipoproteinemia occur in these sequences, although one of the Tangier mutations is located close to this domain (11). The functional significance of the conserved sequences downstream of the NBDs is still unknown; they might have a regulatory function, as proposed for other transporters (12). Phosphorylation by protein kinase A or C has been demonstrated for several ABC transporters, including cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (13), P-glycoprotein (14), and recently ABCA1 (15–17). According to See et al. (15) serines 1042 and 2054 in NBD are phosphorylated by PKA in vitro and may potentially regulate ABCA1 function (15). Yamauchi et al. (16) report that apoAI activates PKC, resulting in phosphorylation and stabilization of ABCA1 (16). According to Martinez et al. (17), the potential phosphorylation sites for protein kinase 2 (CK2) and PKA in the ABCA1-PEST sequence, threonine 1286 and 1305, respectively, are constitutively phosphorylated and protect ABCA1 against calpain-mediated degradation. PKA and CK2 inhibitors did not, however, alter phosphorylation of these residues. Among the kinases, protein kinase 2 or CK2 is a constitutively active Ser/Thr protein kinase essential for cell viability (18). CK2 can target at least 200 proteins (19) and is implicated in a wide variety of cellular functions such as tRNA and rRNA synthesis, apoptosis. and cell survival and transformation (20). The CK2 phosphoacceptor sites consist of clusters of acidic residues located mostly downstream from phosphorylatable seryl or threonyl residues. Prediction of consensus sequence motives in human ABCA1 using PROSITE identified 39 potential CK2 phosphorylation sites in ABCA1. Among these, the 1242 TTLEE and 2211TTLDQ motives within the 80-residue R1 and R2 domains, downstream of, respectively, NBD1 and NBD2, were conserved in most members of the human ABCA subfamily (1). Another potential CK2 phosphorylation site, 1255 SGVD, is conserved in ABCA4, ABCA6 –10, and ABCA12 but is absent in all NBD2s. Thus, it is conceivable that modulation of the ABCA1 transport activity might occur through serine or threonine phosphorylation by protein kinase CK2. In this report we demonstrate that in vitro the NBD1⫹R1 and not the NBD2⫹R2 domain of ABCA1 is phosphorylated by CK2, and we used mass spectrometric methods to directly identify Thr-1242, Thr-1243, and Ser-1255 as the phosphorylated residues. We further investigated the functional significance of these CK2 phosphorylation sites in NBD1⫹R1 by site-directed mutagenesis of ABCA1. The ABCA1 flippase activity, the transporter ability to bind apolipoproteins AI and AII and to induce cellular phospholipid and cholesterol efflux, were enhanced by mutations preventing phosphorylation at that site. The specific CK2 inhibitors 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole and apigenin also enhanced the activity of ABCA1 transfected into Hek-293 Tet-Off cells, thus confirming the effect of the mutations. Our data, therefore, suggest that besides PKA and PKC, protein kinase CK2 might play an important role in vivo in regulating the function and transport activity of ABCA1 and possibly other members of the ABCA subfamily. EXPERIMENTAL PROCEDURES

Materials—Tosylphenylalanyl chloromethyl ketone-treated trypsin, barium hydroxide, and ␣-cyano-4-hydroxycinnamic acid were from Sigma. Other mass spectrometry reagents and solvents were of highest purity from Carlo Erba (Milan, Italy). NBD-labeled cholesterol, phosphatidylserine (PS), phosphatidylethanolamine (PE), and phosphatidylcholine were purchased from Aventi Polar Lipids (Alabaster). Rhodamine hydrochloride and concanavalin A Alexa Fluor 633 were obtained from Molecular Probes (Leiden, The Netherlands). Doxycycline was purchased from Sigma. [methyl-3H]Choline and [7-3H]cholesterol were purchased from Amersham Biosciences. Hek-293 Tet-Off cells were purchased from Clontech (Erembodegem, Belgium). Recombinant apoAI was expressed in Escherichia coli (21), and plasma apoAII

was prepared by ultracentrifugal isolation of high density lipoprotein, delipidation, and purification by DEAE chromatography as previously described (22). The CK2 inhibitor 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole was a gift of Dr. Shugar (Poland), Apigenin in Me2SO was purchased from Sigma. Construction of the Expression Vectors—For expression of the HisNBD1⫹R1 domain between residues 861 and 1306 and of HisNBD2⫹R2 between residues 1877 and 2232, vectors were constructed using the pET28a plasmid (Novagen, Madison, WI). DNA fragments encoding the protein sequences were PCR-amplified and cloned into the pET28a vector, and mutant plasmids were made by overlapping PCR. WT and mutant plasmids were checked by sequencing and by restriction analysis. A bidirectional pBI-ABCA1/GFP vector encoding a hemagglutinintagged ABCA1/GFP fusion protein (23) was used to generate eight constructs encoding the threonine and serine ABCA1 mutants. The SplI/SplI fragment (nucleotides 3626 – 4535) was inserted into the SplI site of a pMCS5 vector (Molecular Biologische Technologie). Mutagenesis was performed by standard PCR, and mutated SplI fragments were transferred back into the SplI-digested pBI-ABCA1/GFP vector. All constructs were verified by restriction analysis and sequencing. Expression and Purification of Soluble Recombinant His-NBD1⫹R1 and His-NBD2⫹R2 in E. coli—The length of the NBD1⫹R1 and NBD2⫹R2 constructs were selected to obtain soluble recombinant proteins and to avoid expression in the E. coli inclusion bodies (24). Proteins were expressed in transformed BL21(DE3)pLysS E. coli grown in LB medium (Invitrogen) under isopropyl-1-thio-␤-D-galactopyranoside induction. Cells were centrifuged at 9000 ⫻ g for 10 min, washed with PBS, resuspended in 10 ml of lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 300 mM NaCl, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 2 ␮g/ml leupeptin, 2 ␮g/ml aprotinin), and sonicated on ice 3 ⫻ 5 min at 60 watts. Both His-NBD1⫹R1 and His-NBD2⫹R2 were purified by affinity chromatography on a Ni-PROBOND™ column. The column was equilibrated in a 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, buffer containing 300 mM NaCl, 1 mM ␤-mercaptoethanol, 5% glycerol (v:v), 10 mM imidazole and incubated overnight at 4 °C with the cell lysate. Stepwise elution with 100 mM imidazole eliminated E. coli protein contaminants, whereas the His-NBD⫹R proteins eluted at 500 mM imidazole. The eluate was desalted on a HiTrap-Sepharose column and stored either at 4 °C or ⫺80 °C. Sample purity was checked by 12% SDS-PAGE. In Vitro Phosphorylation Assays—Recombinant CK2 and its ␣- and ␤-subunits were expressed in Sf9 cells and purified to homogeneity (25). For electrophoretic experiments, 2 or 8 ␮g of recombinant NBD1⫹R1, NBD2⫹R2, or mutants were incubated at 22 °C with either [␥-32P]ATP or 10 ␮M ATP and 10 mM MgCl2 in the presence of 0.3 ␮g of oligomeric CK2 or 1.0 ␮g of CK2␣. The phosphorylated proteins were analyzed by SDS gel electrophoresis and autoradiography after 15 min. For mass spectrometric analysis, recombinant NBD⫹R proteins were incubated with CK2 for 30 min at 30 °C in the presence of 0.2 mM ATP. The reaction was terminated by 5 min of boiling and drying the samples. Mass Spectrometric Analysis of the Phosphopeptides—Purified NBD⫹R proteins before and after treatment with CK2 were subjected to reduction with an excess of dithiothreitol, alkylation using iodoacetamide, and digestion with trypsin. To obtain the corresponding alkene moiety from the phosphate esters, the ␤-elimination reaction was optimized and simplified by incubating the peptide mixture in 5 M Ba(OH)2 at 37 °C for 90 min under nitrogen. Solid carbonic dioxide was then added to eliminate the precipitated barium carbonate, which was removed by centrifugation at 13,000 ⫻ g for 5 min (26). MALDI mass spectra were recorded using a Applied Biosystem Voyager DE-PRO instrument operating in reflector mode. A mixture of the analyte and of ␣-cyanohydroxycinnamic acid (10 mg/ml) in acetonitrile, ethyl alcohol, 0.1% trifluoroacetic acid (1:1:1, v/v/v) was applied to the metal sample plate and dried under vacuum. Mass calibration was performed with insulin at 5734.5 Da and a matrix peak at 379.3 Da as internal standards. Raw data were analyzed by using computer software provided by the manufacturer and reported as average masses. Cell Cultures—Hek-293 Tet-off cells were cultured in DMEM media plus 10% fetal bovine serum (FBS), L-glutamine, and Geneticin on 12-well plates coated with poly-D-lysine. Cells were transfected for 24 h with the GFP-ABCA1 constructs using a mixture of polyethyleneimine and DNA at a 2/1 polyethyleneimine/DNA charge ratio and subsequently grown for 24 h. Cells were washed twice with phosphatebuffered saline (PBS) and incubated for 1 min with 500 ␮l of trypsin (Invitrogen). After the addition of 1 ml of PBS, 1% FBS and 0.5 mM EDTA, cells were filtered and kept on ice for flow cytometry. The percentage of transfected cells was determined by fluorescence-activated cell sorter

Protein Kinase CK2 Phosphorylation Modulates ABCA1 Activity

37781

FIG. 1. Topology of the N-terminal half of an ABCA full-transporter. Six transmembrane helices are followed by the cytoplasmic NBD and the conserved regulatory R domain. The C-terminal half has an identical topology. The alignment of the R1 and R2 domains showing conservation of the potential CK2 phosphorylation sites at residues Thr-1242, Thr-1243 and Ser-1255 are shown for several species of ABCA1. analysis on a FACScalibur (BD Biosciences) with an excitation wavelength of 488 nm and an emission wavelength of 530 nm. Measurement of the ABCA1 Flippase Activity—Mock- and ABCA1transfected Hek-293 Tet-Off cells were incubated at 37 °C for 45 min with 5 ␮M NBD lipid, washed with PBS at 4 °C, and incubated with 64 ␮M sodium dithionite in a Tris-HCl buffer, pH 10, for 5 min at 4 °C. The fluorescence intensity of the NBD probe before (Imax) and after (Iq) dithionite quenching was measured on a Bio-Tek FLX 800 microplate reader with excitation and emission wavelengths of 485 and 528 nm, respectively. Percent quenching was calculated as (Imax ⫺ Iq)/(Imax) ⫻ 100. Similar measurements were performed in the presence of 50 ␮M 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole and apigenin CK2 inhibitors on Mocktransfected and Hek-293 cells transfected with WT ABCA1 and with the T1242A, T1243A, T1242A/T1243A, and T1242D/T1243D ABCA1 mutants. Monitoring of ApoAI and -AII Binding to Hek-293 Tet-Off Cells— After transfection with WT ABCA1, cells were washed twice with a 10 mM HEPES buffer, pH 7.4, containing 1.8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM KCl, 150 mM NaCl and incubated with carboxyrhodamine-labeled re-

combinant apoAI or -AII at concentrations between 0 and 50 ␮g/ml for 1 h at 4 °C to monitor extent of binding. In subsequent experiments cells transfected with WT and mutant ABCA1 were incubated with 20 ␮g/ml apoAI or -AII for 1 h at 4 °C. Cells were detached by mild trypsinization for 2 min at 37 °C using 0.05 g/liter trypsin in PBS and kept on ice, and flow cytometric recordings were performed. Cells were subdivided into three populations as a function of their level of ABCAI expression, reflected by the GFP fluorescence intensity. Apoprotein binding data were calculated for each cell population based upon the mean carboxyrhodamine fluorescence intensity (27). Phospholipid and Cholesterol Efflux to ApoAI and ApoAII Induced by ABCA1—Phospholipid and cholesterol efflux were measured using both radioactivity and fluorescence. For radioactive measurements, Hek-293 Tet-Off cells transfected with WT and mutant ABCA1 were washed twice with DMEM and incubated either with 1 ␮Ci/ml [methyl-3H]choline or [3H]cholesterol in DMEM plus 2.5% FBS. After 24 h cells were washed twice with DMEM and incubated with 1 ml of DMEM plus 0.2% bovine serum albumin for 16 h at 37 °C. Cells were washed twice with DMEM and incubated at 37 °C with 20 ␮g/ml recombinant apoAI for 4 h

37782

Protein Kinase CK2 Phosphorylation Modulates ABCA1 Activity

for [methyl-3H]choline efflux or 6 h for [3H]cholesterol efflux. Supernatant was collected and centrifuged for 10 min at 810 ⫻ g. 500 ␮l of supernatant was transferred into 5 ml of scintillation liquid (Optiphase Hisafe 3). Cells were washed with PBS and lysed with 1 ml of NaOH (0.1 N). 500 ␮l of cell suspension was transferred into 5 ml of scintillation liquid (Optiphase Hisafe 3). 3H counts per minute (cpm) were measured in a liquid scintillation counter (Wallac 1409), and % lipid efflux was calculated as (cpm in supernatant/(cpm in supernatant ⫹ cpm in cells)) ⫻ 100. For measurements using fluorescence, Hek-293 Tet-Off cells transfected with WT and mutant ABC-A1 were labeled with either 5 ␮M NBD phospholipid or 2.5 ␮M NBD cholesterol for 45 min at 4 °C. Cells were washed 3 times with 1 ml of PBS and incubated with 500 ␮l of DMEM containing either 20 ␮g/ml recombinant apoAI or 40 ␮g/ml apoAII. Efflux was measured either after 4 h of incubation at 37 °C for NBD phospholipids or after 6 h for NBD cholesterol by measuring NBD fluorescence intensity. Percentage efflux was calculated as ((Icontrol ⫺ IapoAI)/Icontrol) ⫻ 100. Confocal Microscopy—Cellular localization of the expressed ABCA1 WT and mutants was analyzed by confocal microscopy using GFP fluorescence at excitation and emission wavelengths of, respectively, 488 and 509 nm. Hek-293 Tet-Off cells were plated on poly-D-lysinecoated Lab-Tek® German borosilicate confocal microscope slides at a density of 2.5 ⫻ 104 cells/chamber in 400 ␮l in DMEM plus 10% FBS, transfected, grown for 48 h in DMEM plus 10% FBS and washed twice with PBS. Cells were incubated with 25 ␮g/ml concanavalin A Alexa fluor 633, an endoplasmic reticulum-specific fluorescence dye, for 30 min. Cells were washed with PBS, and the Alexa fluor 633 fluorescence was measured using the excitation and emission wavelengths of, respectively, 632 and 647 nm. ABCA1 Half-life Measurement—To determine the half-life of WT and mutant ABCA1, the transporter flippase activity was measured as a function of time in transfected Hek-293 Tet-Off cells, which were treated with 100 ng/ml doxycycline to stop transcription of the ABCA1 constructs (28, 29). The ABCA1 flippase activity for phosphatidylethanolamine was measured as described above using NBD PE after 0, 30, 60, 90, and 120 min. The half-life was estimated from half the total activity decay (28). RESULTS

Identification of Protein Kinase CK2 Phosphorylation Sites on ABCA1—Fig. 1 shows a schematic diagram of the N-terminal half of ABCA1, consisting of a membrane-spanning domain made of six helices followed by the cytoplasmic NBD and the regulatory R domain. The C-terminal half of ABCA1 has an identical topology (1). Among the 39 potential CK2 phosphorylation sites predicted by PROSITE in ABCA1, we focused upon those located in NBD1, NBD2, and in the conserved downstream R1 and R2 domains (1). Eight potential CK2 sites are predicted within the cytoplasmic NBD1⫹R1 domain between residues 861 and 1306. One site at 989TVEE is in NBD1, whereas three sites at 1242TTLE, 1243TLEE, and 1255SGVD are located in the R1 domain. By comparison, seven CK2 sites are predicted between the C-terminal residues 1877–2232, four of which are in NBD2 and two, 2211TTLD and 2225SDDD, are in the R2 domain. We examined the conservation of the human ABCA1 Thr-1242, Thr-1243, and Ser-1255 residues in ABCA sequences of other species (Fig. 1). As previously reported for other transporters of the ABCA family (1), the threonine residues are better conserved in the N-terminal R1 compared with the R2 domain, whereas Ser-1255 is conserved only in mammalian ABCA. To investigate the in vitro phosphorylation properties of the ABCA1 cytoplasmic domains, we expressed the NBD⫹R domains in E. coli and used the purified recombinant proteins as substrates for protein kinase CK2 assays in vitro using both the CK2 holoenzyme or its isolated ␣ catalytic subunit. Fig. 2 shows that only ABCA1 NBD1⫹R1 and not NBD2⫹R2 is phosphorylated in vitro by CK2. Interestingly, only the CK2 holoenzyme but not its ␣-subunit was able to phosphorylate the NBD1⫹R1 substrate, indicating that the presence of the CK2␤ regulatory subunit is required for efficient phosphorylation. As the 1242TTLE, 1243TLEE, and 1255SGVD are the best

FIG. 2. In vitro phosphorylation of recombinant NBD1ⴙR1 (residues 861–1306) and NBD2ⴙR2 (residues 1877–2232) proteins by the CK2 holoenzyme (␣2␤2) and by its ␣ catalytic subunit. Either 1 or 4 ␮g recombinant NBD⫹R were incubated with 0.3 ␮g of CK2␣2␤2 or 1.0 ␮g of CK2␣ and P32-labeled ATP. Phosphorylated proteins were detected by autoradiography.

conserved potential CK2 phosphorylation sites in NBD1, we carried out site-directed mutagenesis at these positions both in the recombinant NBD1⫹R1 protein and in the entire ABCA1 construct. In both systems we engineered several mutants designed at preventing phosphorylation by mutation either of the target threonines and serine, T1242A, T1243A, T1242A/ T1243A, S1255A, or of the downstream cluster of acidic residues, E1245Q, E1246Q, E1245Q/E1246Q. Mutants were also designed to mimic phosphorylated residues as T1242D, T1243D, T1242D/T1243D. All NBD1⫹R1 mutants were expressed as soluble proteins in E. coli and purified at yields comparable with WT NBD1⫹R1 (24). Using recombinant CK2, phosphorylation of the Thr-Ala mutants was not completely abolished, suggesting the presence of multiple CK2 phosphorylation sites within this domain (data not shown). This was confirmed by MALDI mass spectrometric analysis of the native and phosphorylated recombinant NBD⫹R proteins (Table I). The phosphopeptides were identified by their mass differences due to the presence of phosphate moieties compared with the peptide masses expected from the protein sequence. In agreement with the phosphorylation assays, we observed no phosphorylation of NBD2⫹R2; in WT NBD1⫹R1 we observed that the signal at m/z 4542.5 corresponds to the ABCA1 peptide 1229 –1269, carrying three phosphate groups at Thr-1242, Thr-1243, and Ser-1255. The peptide mixture was then submitted to the ␤-elimination reaction followed by MALDI mass spectrometric analysis. Under strong alkaline conditions elimination of the phosphate moiety on Ser(P) and Thr(P) to form dehydroalanine (⌬Ser) or dehydroalanine-2butyric acid (⌬Thr) yields new signals corresponding to the ␤-eliminated peptides. The signal at m/z 4249.5 was assigned to the 1229 –1269 ABCA1 peptide, occurring 299 Da lower, thus confirming phosphorylation at the three positions. Analysis of the T1242A, T1243A, and T1242A/T1243A NBD1 mutants supports the loss of either one or two threonine phosphorylation sites in the mutated peptides, whereas the Ser-1255 site is preserved. Analysis of the S1255A mutant demonstrates the loss of one phosphorylation site in the Val-1251—Arg-1272 tryptic peptide (Table I). These data confirm that besides Thr1242 and Thr-1243, Ser-1255 is another CK2 phosphorylation site in ABCA1. None of the predicted CK2 phosphorylation sites in the NBD1 (residues 866 –995) or between NBD1 and the R1 domain was phosphorylated. ABCA1 Activity Increases Linearly with Protein Expression— Hek-293 Tet-Off cells were transfected with varying amounts

Protein Kinase CK2 Phosphorylation Modulates ABCA1 Activity

37783

TABLE I Mass spectrometric analysis of NBD1⫹R1 phosphorylation Molecular mass after ␤-elimination

NBD1⫹R1

Tryptic peptide

Molecular mass Da

Da

WT T1242A T1242A T1243A T1243A T1242A/T1243A T1242A/T1243A S1255A

Leu-1229–Arg-1269 Leu-1229–Lys-1250 Val-1251–Arg-1272 Leu-1229–Lys-1250 Val-1251–Arg-1272 Leu-1229–Lys-1250 Val-1251–Arg-1272 Val-1251–Arg-1272

4542.5 2483.6 2411.6 2483.1 2411.2 2356.1 2411.6 2297.7

4249.5 2385.9 2313.7 2385.2 2313.2 2356.1 2313.7 2297.7

of ABCA1-GFP DNA, between 1 and 10 ␮g. Extent of transfection was estimated as the product of the GFP fluorescence intensity and the number of transfected cells, both measured by fluorescence-activated cell sorter analysis (23). As a result of an increased flippase activity, the percentage of NBD PE in the plasma membrane outer leaflet increased linearly between 20 and 58% for a 5-fold increase of WT ABCA1 transfection (Fig. 3A). Parallel data were obtained for both apoAI binding to transfected cells (Fig. 3B) and phospholipid efflux (Fig. 3C). This linear relationship between ABCA1 expression and activity was used to normalize the activity of ABCA1 mutants compared with WT ABCA1. Mutation of the CK2 Phosphorylation Sites Increases ABCA1 Flippase Activity—To assess the effect of CK2 phosphorylation on the ABCA1 flippase activity we measured phospholipid flipflop by WT ABCA1 and the mutants. Incubation of ABCA1transfected Hek-293 Tet-Off cells with NBD phospholipids at 37 °C and subsequent quenching of the fluorescence with sodium dithionite at 4 °C yielded the percentage of labeled phospholipid in the outer leaflet of the plasma membrane. In mocktransfected cells there was around 30 and 25% NBD PE and NBD PS, respectively, in the plasma membrane outer leaflet. After transfection with 3 ␮g of ABCA1-GFP DNA, these percentages increased to 38 and 35%, indicative of phospholipid flip-flop by ABCA1. Compared with WT ABCA1, set as 100%, the PE and PS content in the outer leaflet of the plasma membrane increased up to 130 ⫾ 14 and 123 ⫾ 8% for the T1242A mutant, 154 ⫾ 15 and 148 ⫾ 11% for the T1243A mutant, 170 ⫾ 15 and 207 ⫾ 16% for the T1242A/T1243A mutant, 141 ⫾ 11 and 136 ⫾ 10% for the S1255A mutant, and 141 ⫾ 13 and 120 ⫾ 9% for the E1245Q/E1246Q mutant, respectively (Fig. 4). All measurements were performed in triplicate, and the differences were significant at p ⬍ 0.01 using a Student t test. In contrast, when the threonine residues were mutated to aspartic acid to mimic a phosphorylated residue, the phospholipid content in the membrane outer leaflet decreased compared with that of the Thr-Ala mutants and came closer to that of WT ABCA1 (Fig. 4). The effect of the specific CK2 inhibitors 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole and apigenin on the flippase activity in Hek-293 Tet-Off cells transfected with WT ABCA1 and with the T1242A, T1243A, T1242A/T1243A, S1255A, and T1242D/ T1243D mutants was consistent with the above data. Incubation with 50 ␮M either 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole or apigenin increased the flippase activity of WT ABCA1 by 30 ⫾ 2.6 and 25 ⫾ 3.4% (n ⫽ 3, p ⬍ 0.001), respectively, whereas the flippase activity increased only by around 5 ⫾ 0.7% (n ⫽ 3, p ⬍ 0.01) in cells transfected with ABCA1 mutants. Mutations of the 1242TTLEE and 1255SGVD CK2 Phosphorylation Sites Modulate the Binding of ApoAI and ApoAII to ABCA1—We compared the binding of carboxyrhodamine-labeled apoAI and apoAII to the Hek-293 Tet-Off cells transfected with WT and ABCA1 phosphorylation mutants by flow cytometric analysis (27). We analyzed apolipoprotein binding to

Phosphorylated residues

Thr-1242, Thr-1243, Ser-1255 Thr-1243 Ser-1255 Thr-1242 Ser-1255 Ser-1255

FIG. 3. Relationship between WT ABCA1 activity and the extent of WT ABCA1 transfection into Hek-293 Tet-Off cells. A, percentage of NBD PE quenching by sodium dithionite as a measure of the NBD PE flip-flop from the membrane inner to outer leaflet. B, specific binding of apoAI to ABCA1-transfected cells. A.U., absorbance units. C, NBD PE efflux to apoAI.

three cell populations, with low, middle, and high levels of transfection, estimated from the GFP fluorescence, with cutoffs at ⬎7 and ⬍20 for population 1 (ABCA1⫹), ⬎21 and ⬍90 for population 2 (ABCA1⫹⫹), and ⬎91 for population 3 (ABCA1⫹⫹⫹) (27). Subtraction of the carboxyrhodamine fluorescence intensity of Mock-transfected cells yielded saturation curves, with a plateau above 10 ␮g/ml for apoAI/Rho and apoAII/Rho binding to WT ABCA1 (Fig. 5). Apparent binding constants to the three cell populations were 7, 30, and 24 ⫻ 10⫺8 M for apoAI binding compared with 4, 16, and 17 ⫻ 10⫺8 M for apoAII binding. These values are comparable with those measured for apoAI/Cy5 binding to WT ABCA1 (27). The carboxyrhodamine fluorescence intensity due to specific binding of 20 ␮g/ml apoAI or apoAII to cells transfected with ABCA1 mutants was expressed relative to WT ABCA1 (Fig. 6). ApoAI- and apoAII-specific binding to the cells transfected with the single threonine and serine ABCA1 mutants increased

37784

Protein Kinase CK2 Phosphorylation Modulates ABCA1 Activity

FIG. 4. NBD phospholipid quenching in the plasma membrane of Hek293 Tet-Off cells transfected with WT and mutant ABCA1. Quenching by the ABCA1 mutants is expressed relative to WT ABCA1 after normalization. 䡺, NBD PS; f, NBD PE.

FIG. 5. Fluorescence intensity of carboxyrhodamine-labeled-apoAI (䡺) and -apoAII (f) bound to Hek-293 TetOff cells transfected with WT ABCA1 as a function of the apoprotein concentration. Binding was calculated for three cellular populations transfected at a high (ABCA1⫹⫹⫹; ABCA1-GFP fluorescence ⬎91), intermediary (ABCA1⫹⫹; 91⬎ ABCA1-GFP fluorescence ⬎21), and low level (ABCA1⫹; 21 ⬎ ABCA1-GFP fluorescence ⬎7) A.U., absorbance units.

compared with WT ABCA1. This increase was more pronounced for the T1243A mutation either alone or in combination with the T1242A mutation, whereas the effect of the T1242A and S1255A mutants was similar. The E1245Q/ E1246Q mutation of the downstream acidic residues, which also impairs CK2 activity, similarly increased cellular apoAI and apoAII binding. The T1242D, T1243D, T1242D/T1243D mutations, which mimic CK2 phosphorylation, had an opposite effect to the Thr-Ala mutations, as apoprotein binding to cells transfected with these mutants amounted to around 110% of WT ABCA1. Mutation of the CK2 Phosphorylation Sites in ABCA1 Modulates Phospholipid and Cholesterol Efflux to ApoAI and ApoAII—Phospholipid and cholesterol efflux to apoAI and apoAII together with phospholipid distribution across the plasma membrane were measured for Hek-293 Tet-Off cells transfected with WT ABCA1 and with the phosphorylation mutants. Data were normalized to account for differences in expression levels between WT ABCA1 and mutants. ABCA1 lipid efflux was measured using both radioactive-labeled and

fluorescent-labeled lipids, yielding comparable data. Only the results for NBD-labeled lipids are given in Fig. 7, A and B. Incubation of the transfected Hek-293 Tet-Off cells, labeled with NBD phospholipids or NBD cholesterol with either unlabeled apoAI or apoAII decreased the NBD lipid fluorescence intensity due to the efflux of labeled lipids to the unlabeled apoprotein acceptors. The saturation curves for the percentage of phospholipid efflux were similar to the apoprotein binding curves and reached a plateau around 20 ␮g/ml apoAI or apoAII. The percentages of NBD-labeled phosphatidylethanolamine and cholesterol efflux to apoAI induced by WT ABCA1 were around 7 and 4%, respectively. Using radioactive-labeled PE and cholesterol, efflux percentages were, respectively, 8.5 and 4.7%, comparable with those measured using fluorescence. PE and PS efflux to apoAI and apoAII (Fig. 7A) and cholesterol efflux to apoAI (Fig. 7B) were expressed relative to WT ABCA1 for all mutants after normalization. The T1242A and T1243A mutations either alone or in combination and the E1245Q/ E1246Q mutation, which all decrease CK2 activity, increased phospholipid and cholesterol efflux (Fig. 7, A and B). The effect

Protein Kinase CK2 Phosphorylation Modulates ABCA1 Activity

37785

FIG. 6. Carboxyrhodamine-labeledapoAI (f) and -apoAII (䡺) binding to Hek-293 Tet-Off cells transfected with WT and mutant ABCA1. The apoprotein binding to mutant transfected cells is expressed relative to WT ABCA1 after normalization.

of the S1255A mutant on lipid efflux was comparable with the single threonine mutants. The T1242D, T1243D, and T1242/ T1243D mutations had an opposite effect as the efflux induced by that mutant was close to WT ABCA1. These effects parallel those observed for apoprotein binding to the mutant-transfected cells (Fig. 6). Cellular Localization of the ABCA1 WT and Mutants—Using confocal microscopy, we observed the same cellular localization of WT and mutant ABCA1, which were mainly found at the plasma membrane of transfected Hek-293 Tet-Off cells. Incubation of the ABCA1-transfected cells with the endoplasmic reticulum-specific fluorescence dye concanavalin A Alexa fluor 633 showed that only a small percentage of ABCA1 WT and mutants is localized in the endoplasmic reticulum (Fig. 8). These results indicate that mutations of the CK2 phosphorylation sites have little effect upon the cellular trafficking of the ABCA1 transporter. ABCA1 WT and Mutants Have Similar Half-lives—The decrease of ABCA1 flippase activity as a function of time was used to estimate the transporter half-life. In agreement with previous reports, we observed a short half-life of ⬃40 min for WT ABCA1 (30). All mutants had similar half-lives compared with wild type ABCA1, varying between 35 and 50 min (data not shown), indicating that mutations of the CK2 phosphorylation sites do not significantly affect the ABCA1 turnover. DISCUSSION

In this paper we showed that besides PKA (15) and PKC (16 –17), protein kinase CK2 is an important kinase to regulate ABCA1 activity. We further demonstrated that phosphorylation occurs at conserved threonine and serine residues in the R1 domain, downstream of NBD1. CK2-specific phosphorylation in the R1 domain affects the major functions of the ABCA1 transporter, including phospholipid flip-flop, ABCA1 binding to apoAI and apoAII, and cellular phospholipid and cholesterol efflux, in a coordinated manner. Mutations aimed at suppressing the phosphorylation sites increase these activities, whereas the activity of mutants mimicking phosphorylation of the threonine residues is close to that of WT ABCA1. Cellular treatment with specific CK2 inhibitors further supports these data. Using recombinant WT and mutant NBD1⫹R1 proteins, we further showed that they are in vitro substrates for CK2. Combined mutation of either the two threonines or the downstream

acidic residues in the recombinant NBD1⫹R1 domain did not completely suppress protein phosphorylation. This is in agreement with the mass spectrometric identification of the CK2 phosphorylation sites in NBD1⫹R1, identifying residue Ser-1255 besides Thr-1242 and Thr-1243 as a putative ABCA1 phosphorylation site. This was then confirmed by the engineering of the S1255A mutant, whose activities are comparable with those of the T1242A mutant. Threonines 1242 and 1243 had been identified as some of the best conserved residues belonging to potential CK2 phosphorylation sites in cytoplasmic ABCA1 domains. These residues are conserved in most of the human and mammalian ABCA transporters and in several other species and even in family 7 bacterial transporters (1). The serine 1255 residue is not as highly conserved as the threonines among the different ABCA1 species or within the ABCA family. However, because serine is often the preferred substrate of CK2 (20), it might constitute a primary phosphorylation site in ABCA1, in analogy with the data obtained for PTEN phosphatidylinositol 3⬘phosphatase (31). The alignment of the R1 and R2 domains shows the correspondence between the consensus CK2 phosphorylation sequence around residue Thr-1242 in R1 and residue Thr-2211 in R2. Threonine 2212 in NBD2 does not belong to a CK2 consensus sequence, whereas Ser-1255 in R1 has no counterpart in R2. As shown both by autoradiography and mass spectrometry, CK2 phosphorylation seems restricted to the Nterminal R1 domain of ABCA1. Because mutations of the CK2 phosphorylation sites and treatment with specific CK2 inhibitor both increase the ABCA1 flippase and cellular efflux activities as well as apoprotein binding, CK2 phosphorylation of the ABCA1 R1 domain might contribute to the in vivo regulation of ABCA1 functionality. Although there is a high degree of sequence homology between the N- and C-terminal cytoplasmic domains of ABCA1, several reports suggest that NBD1 and NBD2 might have specific functions. There are differences between the NBDs ATPase activity, as we measured a 3-fold higher activity for recombinant ABCA1 NBD1 compared with NBD2 (24). Folding and association of the two NBD domains are not identical (32–33), and several reports suggest that NBD1 and NBD2 share a common interface in ABC full transporters (32–33). The activation cycle of the ABCA transporters consists of ATP binding and hydrolysis, ADP dissociation accompanied by con-

37786

Protein Kinase CK2 Phosphorylation Modulates ABCA1 Activity

FIG. 7. A, NBD phospholipid efflux to apoAI and apoAII after incubation of transfected Hek-293 Tet-Off cells with 20 ␮g/ml apoAI or apoAII for 6 h at 37 °C. Efflux by ABCA1 mutants is expressed relative to WT ABCA1 after normalization. Open squares, NBD PS efflux to apoAI; gray squares, NBD PE efflux to apoAI; filled squares NBD PE efflux to apoAII. B, NBD cholesterol efflux to apoAI (filled squares) after incubation of the transfected cells with 20 ␮g/ml apoAI for 6 h at 37 °C. Efflux by ABCA1 mutants is expressed relative to WT ABCA1 after normalization.

formational changes in the NBD domains, and finally, of substrate transport across the membrane. This process is not random but is probably initiated through ATP binding to the nucleotide binding domain with highest affinity (34). It is quite conceivable that phosphorylation of the R1 domain by CK2 could bring a conformational change to this domain and consequently to NBD1 to start the activation cycle. The recent x-ray structure of the vitamin B12 transporter BtuCD (33) suggests that the two NBD domains interact with each other in an anti-parallel way and that these interactions are stabilized by interactions between the NBD downstream domains. The NBD downstream domains in the maltose transporter correspond to the conserved R1 and R2 domains identified in the ABCA subfamily. Interactions between R1 and R2 in the ABCA subfamily might enhance the cooperativity between the N- and C-terminal half of the ABCA transporters and, thus, contribute to a fine regulation of the transporter activity. These interactions are likely to be dependent upon the phosphoryla-

tion state of the protein domain. Serine and threonine phosphorylation by a cytoplasmic CK2 kinase might, thus, represent another mechanism for the intracellular regulation of the transporter activity. Protein kinase CK2 is a constitutively active kinase that is implicated in a variety of cellular functions including cell proliferation, differentiation, and survival (19). Our experiments showed that the regulatory ␤ subunit of CK2 is required to achieve optimal phosphorylation of the ABCA1 substrate. Thus, this transporter belongs to the class I of the CK2 substrates whose phosphorylation is strictly dependent upon the presence of the CK2␤ subunit (35). On the other hand, we observed an increased functionality of the protein when its phosphorylation is abrogated, suggesting that CK2 acts as a down-regulator of ABCA1 function. A similar function of CK2 was previously described for Engrailed 2 secretion (36). Regulation of ABCA1 might occur in different ways; phosphorylation might change the expression or cellular location of

Protein Kinase CK2 Phosphorylation Modulates ABCA1 Activity

37787

porter (16). PKC␣ is activated by apoAI, and it subsequently phosphorylates and stabilizes ABCA1. According to Martinez et al. (17), a PEST sequence in ABCA1 is critical for apoAI protection against ABCA1 degradation by calpain. This sequence includes the casein kinase CK2 and PKA potential phosphorylation sites Thr-1286 and Thr-1305, respectively. These authors found little effect of the casein kinase inhibitors on ABCA1 phosphorylation, in contrast with our findings, and concluded that CK2 probably does not phosphorylate the Thr-1286 residue in the PEST sequence. Although this residue belongs to a potential CK2 phosphorylation site in ABCA1, it is localized in a low conservation sequence in the ABCA family and might not become phosphorylated, in contrast to the conserved Thr-1242, Thr-1243, and Ser-1255 residues tested in our study. Furthermore, we measured the effect of the CK2 inhibitors on the specific ABCA1 activity, whereas Martinez et al. (17) investigated the extent of total ABCA1 phosphorylation by autoradiography. Besides PKA and PKC, which increase ABCA1 activity, CK2 might play an opposite role and act as a down-regulator of ABCA1 in the cell. REFERENCES

FIG. 8. Cellular localization of GFP-tagged ABCA1 WT and mutants studied by confocal microscopy. Green fluorescence corresponds to the GFP fluorescence, and red fluorescence corresponds to the endoplasmic reticulum-specific probe concanavalin A Alexa fluor 633. Yellow fluorescence indicates the colocalization of the GFP-tagged ABCA1 and the endoplasmic reticulum. A, ABCA1 WT; B, T1243A mutant; C, T1242A/T1243A mutant; D, T1242D/T1243D mutant; E, S1255A mutant.

ABCA1. This is, however, not likely as 1) our confocal microscopic data showed similar locations at the plasma membrane, and 2) the expression of the Thr-Ala and Ser-Ala mutants was lower than of WT ABCA1. We also showed that ATP binding and ATPase activity are not affected by the threonine to alanine or by the glutamic acid to glutamine mutations (23). The Trp exposure and the secondary structure of the various mutants of the NBD1⫹R1 domain were quite similar. The structural changes due to phosphorylation are, therefore, probably minimal, and a likely effect of CK2 phosphorylation is, therefore, the modulation of the cooperativity between NBD1 and NBD2 in native ABCA1. The activities of several ABC transporters are regulated by their phosphorylation, as demonstrated for the cystic fibrosis transmembrane regulator, which is phosphorylated both by PKA and PKC (13). Phosphorylation of the P-glycoprotein by PKA and PKC seems to modulate swelling-activated Cl⫺ currents (14), not drug transport (37). PKA activation by cAMP analogues increased ABCA1 phosphorylation and cellular cholesterol efflux (15). Mutation of a PKA phosphorylation site in ABCA1 impaired apoAI-mediated release of cellular lipid (15). According to Yamauchi et al. (16) ABCA1 phosphorylation is, furthermore, critical for the stability and integrity of the trans-

1. Peelman, F., Labeur, C., Vanloo, B., Roosbeek, S., Devaud, C., Duverger, N., Denefle, P., Rosier, M., Vandekerckhove, J., and Rosseneu, M. (2003) J. Mol. Biol. 325, 259 –274 2. Schmitz, G., and Kaminski, W. E. (2002) Curr. Atheroscler. Rep. 4, 243–251 3. Brooks-Wilson, A., Marcil, M., Clee, S.M., Zhang, L.H., Roomp, K., van Dam, M., Yu, L., Brewer, C., Collins, J.A., Molhuizen, H. O., Loubser, O., Ouelette, B.F., Fichter, K., Ashbourne-Excoffon, K. J., Sensen, C. W., Scherer, S., Mott, S., Denis, M., Martindale, D., Frohlich, J., Morgan, K., Koop, B., Pimstone, S., Kastelein, J. J., and Hayden, M. R. (1999) Nat. Genet. 22, 336 –345 4. Bodzioch, M., Orso, E., Klucken, J., Langmann, T., Bottcher, A., Diederich, W., Drobnik, W., Barlage, S., Buchler, C., Porsch-Ozcurumez, M., Kaminski, W. E., Hahmann, H. W., Oette, K., Rothe, G., Aslanidis, C., Lackner, K. J., and Schmitz, G. (1999) Nat. Genet. 22, 347–351 5. Rust, S., Rosier, M., Funke, H., Real, J., Amoura, Z., Piette, J. C., Deleuze, J. F., Brewer, H. B., Duverger, N., Denefle, P., and Assmann, G. (1999) Nat. Genet. 22, 352–355 6. Chen, W., Sun, Y., Welch, C., Gorelik, A., Leventhal, A. R., Tabas, I., and Tall, A. R. (2001) J. Biol. Chem. 276, 43564 – 43569 7. Higgins, C. F. (1992) Annu. Rev. Cell Biol. 8, 67–113 8. Holland, I. B., and Blight, M. A. (1999) J. Mol. Biol. 293, 381–399 9. Dean, M., Hamon, Y., and Chimini, G. (2001) J. Lipid Res. 42, 1007–1017 10. Allikmets, R. (2000) Am. J. Hum. Genet. 67, 793–799 11. Schmitz, G., and Langmann, T. (2001) Curr. Opin. Lipidol. 12, 129 –140 12. Winter, M. C., and Welsh, M. J. (1997) Nature 389, 294 –296 13. Picciotto, M. R., Cohn, J. A., Bertuzzi, G., Greengard, P., and Nairn, A. C. (1992) J. Biol. Chem. 267, 12742–12752 14. Vanoye, C. G., Castro, A. F., Pourcher, T., Reuss, L., Altenberg, G. A. (1999) Am. J. Physiol. 276, C370 –C378 15. See, R. H., Caday-Malcolm, R. A., Singaraja, R. R., Zhou, S., Silverston, A., Huber, M. T., Moran, J., James, E. R., Janoo, R., Savill, J. M., Rigot, V., Zhang, L.H., Wang, M., Chimini, G., Wellington, C. L., Tafuri, S. R., and Hayden, M. R. (2002) J. Biol. Chem. 277, 41835– 41842 16. Yamauchi, Y., Hayashi, M., Abe-Dohmae, S., and Yokoyama, S. (2003) J. Biol. Chem. 278, 47890 – 47897 17. Martinez, L. O., Agerholm-Larsen, B., Wang, N., Chen, W., and Tall, A. R. (2003) J. Biol. Chem. 278, 37368 –37374 18. Sarno, S., Moro, S., Meggio, F., Zagotto, G., Dal Ben, D., Ghisellini, P., Battistutta, R., Zanotti, G., and Pinna, L. A. (2002) Pharmacol. Ther. 93, 159 –168 19. Litchfield, D. W. (2003) Biochem. J. 369, 1–15 20. Meggio, F., and Pinna, L. A. (2003) FASEB J. 17, 349 –368 21. Roosbeek, S., Vanloo, B, Duverger, N., Caster, H., Breyne, J., De Beun, I., Patel, H., Vandekerckhove, J., Shoulders, C., Rosseneu, M., and Peelman, F. (2001) J. Lipid Res. 42, 31– 40 22. Lopez, J., Latta, M., Collet, X., Vanloo, B., Jung, G., Denefle, P., Rosseneu, M., and Chambaz, J. (1994) Eur. J. Biochem. 225, 1141–1150 23. Rigot, V., Hamon, Y., Chambenoit, O., Alibert, M., Duverger, N., and Chimini, G. (2002) J. Lipid Res. 43, 2077–2086 24. Roosbeek, S., Caster, H., Zhou, Liu Q., Berne, P. F., Duverger, N., Christiaens, B., Vandekerckhove, J., Peelman, F., Labeur, C., and Rosseneu, M. (2004) Protein Expression Purif. 35, 102–110 25. Filhol, O., Cochet, C., Wedegaertner, P., Gill, G. N., and Chambaz, E. M. (1991) Biochemistry 30, 11133–11140 26. Amoresano, A., Cirulli, C., Quemeneur, E., and Marino, G. (2004) Eur. J. Mass Spectrom. 10, 401– 412 27. Chambenoit, O., Hamon, Y., Marguet, D., Rigneault, H., Rosseneu, M., and Chimini, G. (2001) J. Biol. Chem. 276, 9955–9960 28. Cheng, H. H., Xu, L., Kumagai, H., and Simoni R. D. (1999) J. Biol. Chem. 274,

37788

Protein Kinase CK2 Phosphorylation Modulates ABCA1 Activity

17171–17178 29. Harkin, D. P., Bean, J. M., Miklos, D., Song, Y. H., Truong, V. B., Englert, C., Christians, F. C., Ellisen, L. W., Maheswaran, S., Oliner, J. D., and Haber, D. A. (1999) Cell 97, 575–586 30. Oram, J. F., Lawn, R. M., Garvin, M. R., and Wade, D. P. (2000) J. Biol. Chem. 275, 34508 –34511 31. Miller, S. J., Lou, D. Y., Seldin, D. C., Lane, W. S., and Neel, B. G. (2002) FEBS Lett. 528, 145–153 32. Chang, G., and Roth, C. B. (2001) Science 293, 1793–1800

33. Locher, K. P., Lee, A. T., and Rees, D. C. (2002) Science 296, 1091–1098 34. Van Veen, H. W., Higgins, C. F., and Konings, W. N. (2001) J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 185–192 35. Martel, V., Filhol, O., Nueda, A., and Cochet, C. (2002) Ann. N. Y. Acad. Sci. 973, 272–277 36. Maizel, A., Tassetto, M., Filhol, O., Cochet, C., Prochiantz, A., and Joliot, A. (2002) Development 129, 3545–3553 37. Goodfellow, H. R., Sardini, A., Ruetz, S., Callaghan, R., Gros, P., McNaughton, P. A., and Higgins, C. F. (1996) J. Biol. Chem. 271, 13668 –13674

Besluit

90

XIII. Samenvatting en besluiten. De hoge densiteits lipoproteïnen (HDL) hebben een beschermende functie in de ontwikkeling van atherosclerose. Dit wordt vooral toegeschreven aan de rol van deze HDL in het ‘omgekeerd cholesterol transport’ , waarbij een teveel aan cholesterol uit de perifere cellen wordt opgenomen en naar de lever wordt getransporteerd. Het apolipoproteïne AI (apo AI) is betrokken bij verschillende stappen van dit proces. Naast zijn structurele rol in de HDL, is het apo AI ook de belangrijkste activator van het lecithine cholesterol acyltransferase (LCAT). Het LCAT enzyme staat in voor de verestering van cholesterol aan het oppervlak van de HDL-partikels.

Hierdoor

ontstaat een concentratiegradiënt waardoor de opname van vrij cholesterol uit de celmembraan en het transport ervan naar de lever gestimuleerd wordt. Apo AI is eveneens het belangrijkste ligand voor de ATP-bindende cassette transporter A1 (ABCA1). ABCA1 staat in voor de efflux van vrij cholesterol en fosfolipiden uit de cellen. Deze efflux wordt gestimuleerd door interactie van apo AI met de celmembraan, waarna de fosfolipiden en het cholesterol door apo AI gebonden worden, wat resulteert in de vorming van nieuwe pre-beta HDL-partikels.

1. De activatie van het LCAT enzyme door apo AI.

De verschillende parameters die de LCAT reactie beïnvloeden werden reeds uitvoerig bestudeerd, toch was het mechanisme voor de activatie van LCAT door apo AI nog steeds niet volledig opgehelderd. Studies met deletiemutanten van apo AI toonden reeds aan dat het gebied tussen residu’s 143 en 165 (helix 6) in apo AI een belangrijke rol speelt bij de activatie.

Door een gedetailleerde studie van de conservatie en de positie van de residu’s, en de elektrische potentiaal in dit gebied toonden we aan dat er een cluster van drie sterk geconserveerde arginines (R149, R153 en R160) gesitueerd is aan de rand van de hydrofobe en hydrofiele zijde van deze amfipatische helix. LCAT activiteitsmetingen met apo AI mutanten, waarbij één, twee of drie van deze arginines naar een neutraal aminozuur (Q) gemuteerd werden, toont aan dat de Vmax waarden voor de LCAT activatie door de apo AI arginine mutanten significant lager

91

zijn dan die voor wild type apo AI. Dit effect is meer uitgesproken voor de dubbele en triple mutanten. Het effect van de mutaties op de Michaëlis-Menten constante (Km) is beperkt, aangezien de binding van het LCAT enzyme op HDL voornamelijk via de fosfolipiden gebeurt.

Berekening van de katalytische efficiëntie (Vmax/Km) toont

duidelijk aan dat mutatie van één of meerdere arginines in de 149-153-160 cluster de enzymatische activiteit van LCAT op de apo AI/lipide complexen drastisch vermindert, tot 10% van wild type apo AI. Eveneens toonden we aan dat dit effect niet te wijten is aan het verbreken van stabiliserende zoutbruggen. E146Q, D150N en D157N mutanten, die de mogelijke vorming van zoutbruggen met de drie arginines verhinderen, hebben namelijk een zeer beperkt effect op de Vmax waarde. Het belang van de arginine residu’s wordt verder bevestigd door de Vmax waarde van een apo AI mutant waarbij de arginine op positie 153 vervangen werd door een lysine. Hoewel de positieve lading behouden blijft, heeft deze substitutie hetzelfde effect als de R153Q mutant. De drie geconserveerde arginines in helix 6 van apo AI spelen dus een belangrijke rol bij de activering van het LCAT enzyme. Een model werd voorgesteld waarbij LCAT bindt aan HDL door interactie met de fosfolipiden.

LCAT Interaction with Arg 149, 153 and 160

Binding to phospholipids

Apo A-I 160 153 149

HDL

Figuur 34 : Schematische voorstelling van het vooropgestelde model voor de activatie van het LCAT enzyme door apo AI; binding van LCAT aan HDL wordt gevolgd door een interactie met de drie arginine residu’svan apo AI.

92

Activatie van LCAT door apo AI gebeurt, door interactie met de drie arginines aan de rand van het HDL partikel.

Dergelijke interacties gebeuren mogelijks door de

vorming van waterstofbruggen met LCAT residu's zoals T121, waarvan de mutaties gepaard gaan met Fish Eye Disease.

Verdere analyse van deze resultaten toont aan

dat een dergelijke interactie tussen de drie arginines in apo AI en het LCAT enzyme enkel mogelijk is wanneer apo AI zich op de HDL partikels in de riem conformatie bevindt. 2. De rol van de ABCA1 transporter bij het omgekeerd cholesterol transport.

In 1999 werd aangetoond dat mutaties in het ABCA1 gen verantwoordelijk zijn voor de ziekte van Tangier, gekenmerkt door een defecte apo AI-gemedieerde cholesterol efflux.

Bij de aanvang van dit werk was echter nog weinig gekend over het

mechanisme van cellulaire cholesterol efflux door ABCA1 naar apo AI.

In een eerste fase werd een uitgebreide analyse uitgevoerd van de subfamilie A van de ABC transporters waarin aangetoond wordt dat, naast de 13 humane ABCA transporters, deze subfamilie een groot aantal eukaryote en prokaryote ABCA homologen bevat. Allignering van deze subfamilie A toont een hoge graad van conservatie in de sequentie en in de topologie aan. In de ABCA subfamilie worden de intracellulaire N-terminale residu’s gevolgd door een eerste transmembrane helix die door een lange extracellulaire loop verbonden is met een cluster van vijf transmembrane helices. Dit membraan-overspannend domein (MSD) wordt gevolgd door een cytoplasmatisch Nucleotide Bindend Domein (NBD1) waarna zich een gebied van 80 geconserveerde aminozuren (R-domein) bevindt.

In de volledige

ABCA transporters, die een hoge interne symmetrie bezitten, worden deze domeinen herhaald in de tweede helft van de transporter. Het 80 aminozuren lange gebied na de NBDs is geconserveerd in de eukaryotische ABCAs en in de prokaryotische familie 7 precursoren. Een voorspelling van de consensussequentie motieven in ABCA1 identificeerde de TTLEE en TTLDQ motieven in dit R-domein na NBD1 en NBD2 respectievelijk, als een potentiële

93

fosforylatieplaats voor het caseïne kinase II. Daarnaast werd het SGVD motief in het R1-domein eveneens als potentiële CKII fosforylatieplaats geïdentificeerd.

Na expressie en zuivering van de NBD1+R1 en NBD2+R2 domeinen van de ABCA1 transporter werd door middel van massaspectrometrie aangetoond dat beide threonine residu’s in het regulerend domein na NBD1 (TTLEE) in vitro gefosforyleerd worden door het caseïne kinase II (CK2), terwijl NBD2+R2 niet gefosforyleerd wordt. Het belang van de geconserveerde CK2 fosforylatie plaatsen werd in vivo bestudeerd door transfectie van wild type ABCA1 en ABCA1 mutanten in HEK293 cellen. De threonine residu’s werden gemuteerd naar een alanine of de glutaminezuur residu’s naar een glutamine, waardoor de CK2 fosforylatieplaats bij deze mutanten verloren gaat.

Eveneens werden de threonine residu’s naar een asparaginezuur residu

gemuteerd om de fosforylatieplaats na te bootsen, en om de activiteit van de wild type transporter te herstellen.

Het serine residu in het R1-domein werd eveneens

gemuteerd naar een alanine. Mutaties waarbij de CK2 fosforylatieplaats verloren gaat vertonen een sterk verhoogde ABCA1 flippase-activiteit, verhoogde binding van apo AI aan de cel en verhoogde cellulaire efflux van fosfolipiden en cholesterol naar apo AI. Mutaties waarbij een fosforylatieplaats nagebootst wordt, vertonen een activiteit die gelijkaardig is aan die van wild type ABCA1.

Deze data suggeren dus dat CK2 fosforylatie van de geconserveerde threonine en serine residu’s in het R1-domein van ABCA1 instaat voor een in vivo down-regulatie van de transporteractiviteit.

Hoe deze regulatie juist gebeurt is echter nog niet

geweten. De fosforylatie van het R1-domein zou een invloed kunnen hebben op de interactie tussen beide NBDs en zo zorgen voor de regulatie van de transporter activiteit.

94

XIV. English summary.

Besides its structural role in high density lipoproteins (HDL), apolipoprotein AI (apo AI) plays a crucial role in the “reverse cholesterol transport”. Different steps in this proces, where cholesterol is transported from periferal cells to the liver, depend upon the properties of apo AI : Apo AI is the most important activator of the lecithin cholesterol acyltransferase (LCAT) enzyme. The LCAT enzyme esterifies cholesterol at the surface of the HDL. This results in a cholesterol concentration gradient that stimulates the uptake of free cholesterol from the cell membrane and the transport of this free cholesterol to the liver. Apo AI is also the most important ligand for the ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1). ABCA1 mediates the cellular efflux of free cholesterol and phospholipids. Interaction of apo AI with the cell membrane stimulates this efflux, resulting in the formation of new pre-beta HDL particles. In this work, we want to obtain a better insight in the mechanism of these two important, apo AI dependent, steps of the reverse cholesterol transport.

activation of LCAT by apo AI.

Studies of deletion mutants of apo AI indicated that the domain between residues 143 and 165 in apo AI is crucial for LCAT activation (Jonas et al., 1998). To identify the specific LCAT activating residues in this domain, the conservation (Figure 9) and position (Figure 30) of these residues in the alpha-helix, and the electrostatic potential (Figure 31) were studied. These data indicated a cluster of three conserved arginines (R149, R153 and R160) that is situated at the hydrophobic/hydrophilic interface of the amphipatic helix. After site-directed mutagenesis of one, two or all three of these arginines to a neutral amino acid (Q), these mutants were expressed in E. coli and purified by affinity chromatography. The effect of the mutations on lipid binding, structure and LCAT activation was studied. Vmax values for LCAT activation by these arginine apo AI mutants were significantly lower compared to wild type apo AI. This effect was more pronounced for the double and triple mutants. The effect of

95

these mutations on the Michaëlis-Menten constant Km was only limited, because binding of LCAT on HDL mainly occurs via the phospholipids. Calculation of the catalytic efficiency (Vmax/Km) clearly shows that mutation of one or more of the arginines in the 149-153-160 cluster decreases the enzymatic activity of LCAT on apo AI/lipid complexes, down to only 10% compared to wild type apo AI. Moreover, we showed that this effect is not due to destabilisation of apo AI by loss of intra-helical salt bridges, because mutation of residues E146Q, D150N and D157N only have a very limited effect on the Vmax value. The importance of these arginine residues is also confirmed by the Vmax value of the R153K apo AI mutant.

In this mutant the

positive charge is unchanged and it can still form an intra-helical salt bridge with residue D150, nevertheless this substitution has the same effect as the R153Q mutation. These three conserved arginines in helix 6 play an important role in the activation of the LCAT enzyme and we proposed a model for LCAT activation by apo AI (Figure 34), where LCAT binds HDL, followed by interaction with these three conserved arginines.

Regulation of ABCA1 by apo AI.

Mutations in the ABCA1 transporter are associated with Tangier disease and a defect in apo AI-mediated cholesterol efflux (Bodzioch et al., 1999; Brooks-Wilson et al, 1999; Rust et al., 1999). To study the regulation of ABCA1 cholesterol transport to apo AI, we analysed the regulatory domains of the ABCA1 transporter.

First we studied the ABC subfamily A, and showed that this subfamily contains a lot of eucaryotic and procaryotic homologues besides the 13 human ABCA transporters. Allignment of the members of the ABCA subfamily shows a high degree conservation in both sequence and topology. In the ABCA proteins, the intracellular N-terminal residues are followed by a first transmembrane helix that is connected with a long extracellular loop to a cluster of five transmembrane helices.

This Membrane

Spanning Domain (MSD) is followed by a cytoplasmic Nucleotide Binding Domain (NBD), and downstream of the NBD is a domain of 80 conserved residues

96

(Regulatory domain, R-domain).

In full ABCA transporters, these domains are

repeated in the C-terminal half of the protein (Figure 24). In ABCA1, we identified conserved potential protein kinase CK2 phosphorylation sites, both in the R1 and R2-domain.

After optimization of the expression and purification of the NBD+R domains of the ABCA1 transporter, we showed by mass-spectrometry that both threonine residues in the R1 domain after NBD1 (TTLEE) are phosphorylated by CK2, whereas NBD2+R2 was not phosphorylated. The serine residue (SGVD) in the R1 domain was also phosphorylated by CK2.

The importance of these threonine and serine residues in vivo was studied after transfection of wild type and mutant ABCA1 in HEK293 cells.

The threonine

residues were mutated to an alanine, or the glutamic acid residues were mutated to a glutamine, both resulting in a loss of the CK2 consensus sequence. In addition we mutated the threonine residues to an aspartic acid, to mimic a phosphorylated residu and restore the wild type activity. The serine residue was mutated to an alanine. Mutations that result in a loss of phosphorylation, clearly have an increased ABCA1 flippase-activity, a strong increase in apo AI binding to the cell, and an increased cellular phospholipid and cholesterol efflux to apo AI. Mutations that mimick a phosphorylation site, have activities close to wild type ABCA1. These data thus suggest that CK2 phosphorylation of the conserved threonine and serine residues in the R1-domain of ABCA1 mediates in vivo regulation of the ABCA1 activity.

97

Referentielijst

98

XV. Referentielijst.

Acton S., Rigotti A., Landschulz K.T., Xu S., Hobbs H.H., Krieger M. (1996) Identification of scavenger receptor SR-BI as a high density lipoprotein receptor., Science, 271, 518-520. Allikmetz R., Wasserman W.W., Hutchinson A., Smallwood P., Nathans J., K R., Schneider T.D., Dean M. (1998) Organization of the ABCR gene: analysis of promotor and splice junction sequences., Gene, 215, 111-122. Anantharamaiah G.M., Venkatachalapathi Y.V., Brouillette C.G., Segrest J.P. (1990) Use of synthetic peptide analogues to localize lecithin:cholesterol acyltransferase activating domain in apolipoprotein A-I., Arteriosclerosis, 10, 95-105. Arakawa R., Yokoyama S. (2002) Helical apolipoproteins stabilize ATP-binding cassette transporter A1 by protecting it from thiol pretease-mediated degradation., J. Biol. Chem., 277, 22426-22429. Assmann G., von Eckardstein A., Brewer H.B. (1995) The metabolic and molecular bases of inherited didease., (Scriver C.R., Beaudet A.L., Sly W.S., Valle D., Eds.) pp 2053-2072, McGraw-Hill Book Co., New York. Atkinson D., Davis M.A., Leslie R.B. (1974) The structure of a high density lipoprotein (HDL3) from porcine plasma., Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 186, 165-180. Azzaria M., Schurr E., Gros P. (1989) Discrete mutations introduced in the predicted nucleotide-binding sites of the mdr1 gene abolish its ability to confer multidrug resistance., Mol. Cell. Biol., 9, 5289-5297. Azoulay M., Henry I., Tata F., Weil D., Grzeschik K.H., Chaves M.E., McIntyre N., Williamson R., Humphries S.E., Junien C. (1987) The structural gene for lecithin:cholesterol acyl transferase (LCAT) maps to 16q22., Ann. Hum. Genet., 51,129-136. Barrans A., Collet X., Barbaras R., Jaspard B., Manent J., Vieu C., Chap H., Perret B. (1994) Hepatic lipase induces the formation of pre-beta 1 high density lipoprotein (HDL) from triacylglycerol-rich HDL2. A study comparing liver perfusion to in vitro incubation with lipases., J Biol Chem, 269, 11572-11577. Barter P.J. (1983) Evidence that lecithin:cholesterol acyltransferase acts on both high- density and low-density lipoproteins., Biochim. Biophys. Acta, 751, 261-270. Barter P.J., Hopkins G.J., Gorjatschko L. (1985) Lipoprotein substrates for plasma cholesterol esterification. Influence of particle size and composition of the high density lipoprotein fraction 3., Atherosclerosis, 58, 97-107. Batetta B., Mulas M.F., Petruzzo P., Putzolu M., Bonatesta R.R., Sanna F., Cappai A., Brotzu G., Dessi S. (2001) Opposite pattern of MDR1 and caveolin-1 gene expression in human atherosclerotic lesions and proliferating human smooth muscle cells., Cell. Mol. Life Sci., 58, 1113-1120.

99

Bauer B.E., Wolfger H., Kuchler K. (1999) Inventory and function of yeast ABC proteins: about sex, stress, pleiotropic drug and heavy metal resistance., Biochim. Biophys. Acta., 1461, 217-236. Beisiegel U., Weber W., Ihrke G., Herz J., Stanley K.K. (1989) The LDL-receptor-related protein, LRP, is an apolipoprotein E-binding protein., Nature, 341, 162-164. Bevers E.M., Comfurius P., Dekkers D.W., Zwaal R.F. (1999) Lipid translocation across the plasma membrane of mammalian cells., Biochim. Biophys. Acta, 1439, 317-330. Bodzioch, M., Orso, E., Klucken, J., Langmann, T., Bottcher, A., Diederich, W., Drobnik, W., Barlage, S., Buchler, C., Porsch-Ozcurumez, M., Kaminski, W.E., Hahmann, H.W., Oette, K., Rothe, G., Aslanidis, C., Lackner, K.J. & Schmitz, G. (1999) The gene encoding ATP-binding cassette transporter 1 is mutated in Tangier disease., Nature Genet., 22, 347-351. Boguski M.S., Freeman M., Elshourbagy N.A., Taylor J.M., Gordon J.I. (1986) On computerassisted analysis of biological sequences: proline punctuation, consensus sequences and apolipoproteins repeats., J Lipid Res, 27, 1011-1016. Borhani D.W., Rogers D.P., Engler J.A., Brouillette C.G. (1997) Crystal structure of truncated human apolipoprotein A-I suggests a lipid-bound conformation., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 94, 12291-12296. Bowry V.W., Stanley K.K., Stocker R. (1992) High density lipoprotein is the major carrier of lipid hydroperoxides in human blood plasma from fasting donors., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 10316-10320. Brasseur R., De Meutter J., Vanloo B., Goormaghtigh E., Ruysschaert J.M., Rosseneu M. (1990) Mode of assembly of amphipathic helical segments in model high-density lipoproteins., Biochim. Biophys. Acta, 1043, 245-252. Brasseur R., Lins L., Vanloo B., Ruysschaert J.M., Rosseneu M. (1992) Molecular modeling of the amphipatic helices of the plasma apolipoproteins., Proteins, 13, 246-257. Breiter D.R., Kanost M.R., Benning M.M., Wesenberg G., Law J.H., Wells M.A., Rayment I., Holden H.M. (1991) Molecular structure of an apolipoprotein determined at 2.5-A resolution., Biochemistry, 30, 603-608. Bretscher M.S. (1972) Asymmetrical lipid bilayer structure for biological membranes., Nat. New Biol., 236, 11-12. Brewer H.B., Fairwell T., Larue A., Ronan R., Houser A., Bonzert T.J. (1978) The amino acid sequence of human apo A-I, an apolipoprotein isolated from high density lipoproteins., Biochem Biophys Res Comm, 80, 623-630. Broccardo C., Luciani M.F., Chimini G. (1999) The ABCA subclass of mammalian transporters., Biochim. Biophys. Acta., 1461, 395-404. Brooks-Wilson A., Marcil M, Clee S.M., Zhang L.H., Roomp K., Van Dam M., Yu L., Brewer C., Collins J.A., Molhuizen H.O., Loubser O., Ouelette B.F., Fichter K., AshbourneExcoffon K.J., Sensen C.W., Scherer S., Mott S., Denis M., Martindale D., Frohlich J., Morgan K., Koop B., Pimstone S., Kastelein J.J., Hayden M.R. (1999) Mutations in ABC1 in Tangier disease and familial high-density lipoprotein deficiency., Nature Genet., 22, 335-345.

100

Brown M.S., Goldstein J.L. (1983) Lipoprotein metabolism in the macrophage: implications for cholesterol deposition in atherosclerosis., Annu. Rev. Biochem., 52, 223-261. Bruckert E., von Eckardstein A., Funke H., Beucler I., Wiebusch H., Turpin G., Assmann G. (1997) The replacement of arginine by cysteine at residue 151 in apolipoprotein A-I produces a phenotype similar to that of apolipoprotein A-IMilano., Atherosclerosis, 128, 121-128. Carlson L.A., Philipson B. (1979) Fish-eye disease. A new familial condition with massive corneal opacities and dyslipoproteinaemia., Lancet, 2, 922-924. Castro G.R., Fielding C.J. (1988) Early incorporation of cell-derived cholesterol into pre-betamigrating high-density lipoprotein., Biochemistry, 27, 25-29. Chambenoit O., Hamon Y., Marguet D., Rigneault H., Rosseneu M., Chimini G. (2001) Specific docking of apolipoprotein A-I at the surface requires a functional ABCA1 transporter., J. Biol. Chem., 276, 9955-9960. Chang G., Roth C.B. (2001) Structure of MsbA from E. coli: A homolog of the multidrug resistance ATP binding cassette (ABC) transporters., Science, 293, 1793-1800. Chang G. (2003) Structure of MsbA from Vibrio cholera: A multidrug resistance ABC transporter homolog in a closed conformation., J. Mol. Biol., 330, 419-430. Chan L., Li W-H. (1991) Apolipoprotein variation among different species., Curr Opin Lipidol, 2, 96-103. Chen C.H., Albers J.J. (1982) Distribution of lecithin-cholesterol acyltransferase (LCAT) in human plasma lipoprotein fractions. Evidence for the association of active LCAT with low density lipoproteins., Biochem. Biophys. Res. Commun., 107, 1091-1096. Chen C.H., Albers J.J. (1985) Activation of lecithin: cholesterol acyltransferase by apolipoproteins E-2, E-3, and A-IV isolated from human plasma., Biochim. Biophys. Acta, 836, 279-85. Chen S.H., Yang C.Y., Chen P.G., Setzer D., Tanimura M., Li W.H., Gotto A.M., Chan L. (1986) The complete cDNA and amino acid sequence of human apolipoprotein B100., J. Biol. Chem., 261, 12918-12925. Chen W., Silver D.L., Smith J.D., Tall A.R. (2000) Scavenger receptor-BI inhibits ATPbinding cassette transporter 1-mediated cholesterol efflux in macrophages., J. Biol. Chem., 275, 30794-30800. Cheng S.H., Rich D.P., Marshall J., Gregory R.J., Welsh M.J. (1991) Phosphorylation of the R domain by cAMP dependent protein kinase regulates the CFTR chloride channel., Cell, 66, 1027-1036. Cheung P., Chan L. (1983) Nucleotide sequence of cloned cDNA of human apolipoprotein AI., Nucleic Acids Res, 11, 3703-3717. Chung B.H., Anantharamaiah G.M., Brouillette C.G., Nishida T., Segrest J.P. (1985) Studies of synthetic peptide analogs of the amphipatic helix. Correlation of structure with function., J. Biol. Chem., 260, 10256-10262.

101

Costet P., Luo Y., Wang L., Tall A.R. (2000) Sterol-dependent transactivation of the human ABC1 promotor by LXR/RXR., J. Biol. Chem., 275, 28240-28245. Davidson W.S., Lund-Katz S., Johnson W.J., Anantharamaiah G.M., Palgunachari M.N., Segrest J.P., Rothblat G.H., Phillips M.C. (1994) The influence of apolipoprotein structure on the efflux of cellular free cholesterol to high density lipoprotein., J. Biol. Chem., 269, 2297522982. Davidson W.S., Hazlett T., Mantulin W.W., Jonas A. (1996) The role of apolipoprotein A-I domains in lipid binding., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 13605-13610. Dean M., Rzhetsky A., Allikmets R. (2001) The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily., Genome Res., 11, 1156-1166. Deeb S.S., Cheung M.C., Peng R.L., Wolf A.C., Stern R., Albers J.J., Knopp R.H. (1991) A mutation in the human apolipoprotein A-I gene. Dominant effect on the level and characteristics of plasma high density lipoproteins., J. Biol. Chem., 266, 13654-13660. De Loof H., Rosseneu M., Yang C.Y., Li W.H., Gotto A.M., Chan L. (1987) Apolipoprotein B: analysis of internal repeats and homology with other apolipoproteins., J. Lipid Res., 28, 1455-1465. Dietschy J.M., Turey S.D., Spady D.K. (1993) Role of liver in the maintenance of cholesterol and low density lipoprotein homeostasis in different animal species, including humans., J. Lipid Res., 34, 1637-1659. Doi Y., Nishida T. (1983) Microheterogeneity and physical properties of human lecithincholesterol acyltransferase., J. Biol. Chem., 258, 5840-5846. Dolphin P.J. (1992) Lipolytic enzymes and the role of apolipoproteins in the regulation of their activity, in: Structure and function of apolipoproteins (Rossneu M.) p 295-362, CRC press, Boca Raton, FI. Ellis R.E., Jacobson D.M., Horvitz H.R. (1991) Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans., Genetics, 129, 79-94. Fadok V.A., Bratton D.L., Frasch S.C., Warner M.L., Henson P.M. (1998) The role of phosphatidylserine in recognition of apoptotic cells by phagocytes., Cell Death. Differ., 5, 551-562. Farooqui J.Z., Wohl R.C., Kezdy F.J., Scanu A.M. (1988) Identification of the active-site serine in human lecithin: cholesterol acyltransferase., Arch. Biochem. Biophys., 261, 330335. Fidge N.H. (1999) High density lipoprotein receptors, binding proteins, and ligands., J. Lipid Res., 40, 187-201. Fielding C.J., Fielding P.E. (1971) Purification and substrate specificity of lecithin-cholesterol acyltransferase from human plasma., FEBS Lett., 15, 355-358. Fielding C.J., Shore V.G., Fielding P.E. (1972) A protein cofactor of lectithin:cholesterol acyltransferase., Biochim. Biophys. Res. Commun., 46, 1493-1498.

102

Fielding P.E., Nagao K., Hakamata H., Chimini G., Fielding C.J. (2000) A two-step mechanism for free cholesterol and phospholipid efflux from human vascular cells to apolipoprotein A-1., Biochemistry, 39, 14113-14120. Francis G.A., Knopp R.H., Oram J.F. (1995) Defective removal of cellular cholesterol and phospholipids by apolipoprotein A-I in Tangier disease., J Clin Invest, 96, 78-87. Francone O.L., Gurakar A., Fielding C. (1989) Distribution and functions of lecithin:cholesterol acyltransferase and cholesteryl ester transfer protein in plasma lipoproteins. Evidence for a functional unit containing these activities together with apolipoproteins A-I and D that catalyzes the esterification and transfer of cell-derived cholesterol., J Biol Chem, 264, 7066-7072. Glomset J.A. (1968) The plasma lecithin:cholesterol acyltransferase reaction., J Lipid Res, 9, 155-167. Glomset J.A., Assmann G., Gjone E., Norum K.R. (1995) Lecithin:cholesterol acyltransferase deficiency and fish-eye disease., In: The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. (Scriver C.R., Beaudet A.L., Sly W.S., Valle D., Eds.) pp 1933-1951, McGraw-Hill Book Co., New York. Goodfellow H.R., Sardini A., Ruetz S., Callaghan R., Gros P., McNaughton P.A., Higgens C.F. (1996) Protein kinase C-mediated phosphorylation does not regulate drug transport by the human multidrug resistance P-glycoprotein., J. Biol. Chem., 271, 13668-13674 Gordesky S.E., Marinetti G.V. (1973) The asymetric arrangement of phospholipids in the human erythrocyte membrane., Biochem. Biophys. Res. Commun., 50, 1027-1031. Gordon T., Castelli W.P., Hjortland M.C., Kannel W.B., Dawber T.R. (1977) High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: Framingham study., Amer. L. Med., 62, 707-714. Gordon V., Innerarity T.L., Mahley R.W. (1983) Formation of cholesterol- and apo Eenriched high density lipoproteins in vitro., J Biol Chem, 258, 6202-6212. Graf G.A., Yu L., Li W.P., Gerard R., Tuma P.L., Cohen J.C., Hobbs H.H. (2003) ABCG5 and ABCG8 are obligate heterodimers for protein trafficking and biliary cholesterol excretion., J. Biol. Chem., 278, 48275-48282. Green P.H., Glickman R.M. (1981) Intestinal lipoprotein metabolism., J. Lipid Res., 22, 1153-1173. Hamon Y., Broccardo C., Chambenoit O., Luciani M.F., Toti F., Chaslin S., Freyssinet J.M., Devaux P.F., McNeish J., Marguet D., Chimini G. (2000) ABC1 promotes engulfment of apoptotic cells and transbilayer redistribution of phosphatidylserine., Nat. Cell Biol., 2, 399406. Hara H., Hara H., Komaba A., Yokoyama S. (1992) α-Helix requirement for free apolipoproteins to generate HDL and to induce cellular lipid efflux., Lipids, 27, 302-304. Hara H., Yokoyama S. (1991) Interaction of free apolipoprotein with macrophages: formation of high density lipoproteinlike lipoproteins and reduction of cellular cholesterol., J. Biol. Chem., 266, 3080-3086.

103

Havel R.J. (1984) The formation of LDL: mechanisms and regulation., J. Lipid Res., 25, 1570-1576. Havel R.J., Eder H.A., Bragdon J.H. (1995) The distribution and chemical composition of ultracentrifugally seperatedlipoproteins in human serum., J. Clin. Invest., 34, 1345. Hayden M.R., Clee S.M., Brooks-Wilson A., Genest Jr. J., Attie A., Kastelein J.J. (2000) Cholesterol efflux regulatory protein, Tangier disease and familial high-density lipoprotein deficiency., Curr. Opin. Lipidol., 11, 117-122. Higgens C.F. (1992) ABC transporters: from microorganisms to man., Annu. Rev. Cell. Biol., 8, 67-113. Hiles I.D., Gallagher M.P., Jamieson D.J., Higgens C.F. (1987) Molecular characterization of the oligopeptide permease of Salmonella typhimurium., J. Mol. Biol., 195, 125-142. Holland I.B., Blight M.A. (1999) ABC-ATPases, adaptable energy generators fuelling transmembrane movement of a variety of molecules in organisms from bacteria to humans., J. Mol. Biol., 293, 381-399. Holvoet P., Zhao Z., Vanloo B., Vos R., Deridder E., Dhoest A., Taveirne J., Brouwers E., Demarsin E., Engelborghs Y. (1995) Phospholipid binding and lecithin-cholesterol acyltransferase activation properties of apolipoprotein A-I mutants., Biochemistry, 34, 1333413342. Hopfner K., Karcher A., Shin D.S., Craig L., Arthur L.M., Carney J.P., Tainer J.A. (2000) Structural biology of Rad50 ATPase: ATP-driven conformational control in DNA doublestrand break repair and the ABC-ATPase superfamily., Cell, 101, 789-800. Huang W., Sasaki J., Matsunaga A., Nanimatsu H., Moriyama K., Han H., Kugi M., Koga T., Yamaguchi K., Arakawa K. (1998) A novel homozygous missense mutation in the apo A-I gene with apo A-I deficiency., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 18, 389-396. Hung L.W., Wang I., Nikaido K., Liu P.Q., Ferro-Luzzi Ames G., Kim S.H. (1998) Crystal structure of the ATP-binding subunit of an ABC transporter., Nature, 396, 703-707. Ji Y., Jonas A. (1995) Properties of an N-terminal proteolytic fragment of apolipoprotein AI in solution and in reconstituted high density lipoproteins., J. Biol. Chem., 270, 11290-11297. Ji Y., Jian B., Wang N., Sun Y., Moya M.L., Phillips M.C., Rothblat G.H., Swaney J.B., Tall A.R. (1997) Scavenger receptor BI promotes high density lipoprotein-mediated cellular cholesterol efflux., J Biol. Chem., 272, 20982-20985. Johnson W.J., Mahlberg F.H., Rothblat G.H., Philips M.C. (1991) Cholesterol transport between cells and high density lipoproteins., Biochim. Biophys. Acta, 1085, 273-298. Jonas A., McHugh H.T. (1983) Reaction of Lectithin: cholesterol acyltransferase with micellar complexes of apo A-I and phosphatidylcholine, containing variable amounts of cholesterol., J. Biol. Chem., 258, 10335-10340.

Jonas A., Sweeny S.A., Herbert P.N. (1984) Discoidal complexes of A and C apolipoproteins with lipids and their reactions with lecithin: cholesterol acyltransferase., J. Biol. Chem., 259, 6369-6375.

104

Jonas A., Hefele Wald J., Harms Toohill K.L., Krul E.S., Kezdy K.E. (1990) Apolipoprotein structure and lipid properties in homogeneous reconstituted spherical and discoidal high density lipoproteins., J Biol Chem, 265, 22123-22129. Jonas A. (1987) Lecithin cholesterol acyltransferase., in Plasma lipoproteins 14 (Gotto A.M., Ed.) pp 299-335, Elsevier Science Publishers. Jonas A. (1991) Lecithin-cholesterol acyltransferase in the metabolism of high-density lipoproteins., Biochim. Biophys. Acta, 1084, 205-220. Kawano M., Miida T., Fielding C.J., Fielding P.E. (1993) Quantitation of pre beta-HDLdependent and nonspecific components of the total efflux of cellular cholesterol and phospholipid., Biochemistry, 32, 5025-5028. Kilsdonk E.P., Yancey P.G., Stoudt G.W., Bangerter F.W., Johnson W.J., Phillips M.C., Rothblat G.H. (1995) Cellular cholesterol efflux mediated by cyclodextrins., J Biol. Chem., 270, 17250-17256. Klimov A.N., Nikiforova A.A., Pleskov V.M., Kuz’min A.A., Kalashnikova N.N. (1989) [Protective effect of high density lipoproteins, their subfractions and lecithin-cholesterolacyltransferases on the peroxidation modification of low density lipoproteins] Zashchitnoe deistvie lipoproteidov vysokoi plotnosti, ikh podfraktsii I letsitin-kholesterinatsiltransferazy v perekisnoi modifikatsii lipoproteidov nizkoi plotnosti., Biokhimiia, 54, 118123. Kluivenhoven J.A., Pritchard H., Hill J., Frohlich J., Assmann G., Kastelein J. (1997) The molecular pathology of lecithin:cholesterol acyltransferase (LCAT) deficiencey syndromes., J. Lipid Res., 38, 191-205. Koo C., Innerarity T.L., Mahley R.W. (1985) Obligatory role of cholesterol and apolipoprotein E in the formation of large cholesterol-enriched and receptor-active high density lipoproteins., J Biol Chem, 260, 11934-11943. Langmann T., Klucken J., Reil M., Liebisch G., Luciani M.F., Chimini G., Kaminski W.E., Schmitz G. (1999) Molecular cloning of the human ATP-binding cassette transporter 1 (hABC1); evidence for sterol-dependent regulation in macrophages., Biochem. Biophys. Res. Commun., 257, 29-33. Law S.W., Gray G., Brewer H.B. (1983) cDNA cloning of human apo A-I: amino acid sequence of preproapo A-I., Biochem Biophys Res Comm, 112, 257-264. Lawn R.M., Wade D.P., Garvin M.R., Wang X., Schwartz K., Porter J.G., Seilhamer J.J., Vaughan A.M., Oram J.F. (1999) The Tangier disease gene product ABC1 controls the cellular apolipoprotein-mediated lipid removal pathway., J. Clin. Invest., 104, R25-R31. Lefevre M., Sloop C.H., Roheim P.S. (1988) Characterisation of dog prenodal peripheral lymph lipoproteins. Evidence for the peripheral formation of lipoprotein-unassociated apo AI with slow pre-β electrophoretic mobility., J Lipid Res, 29, 1139-1148. Leren T.P., Bakken K.S., Daum U., Ose L., Berg K., Assmann G., von Eckardstein A. (1997) Heterozygosity for apolipoprotein A-I(R160L)Oslo is associated with low levels of high density lipoprotein cholesterol and HDL-subclass LpA-I/A-II but normal levels of HDLsubclass LpA-I., J. Lipid Res., 38, 121-131.

105

Li W.H., Tanimura M., Luo C.C., Datta S., Chan L. (1988) The apolipoprotein multigene family: biosynthesis, structure, structure-function relationschips, and evolution., J. Lipid Res., 29, 245-271. Linton K.J., Higgins C. (1998) The eschericia coli ATP binding cassette (ABC) proteins., Mol. Microbiol., 28, 5-13. Liscum L., Dahl N.K. (1992) Intracellular cholesterol transport., J. Lipid Res., 33, 1239-1254. Locher K., Lee A.T., Rees, D.C. (2002) The E. coli BtuCD structure: a framework for ABC transporter architecture and mechanism., Science, 296,1091-1098. Luciani M.F., Chimini G. (1996) The ATP binding cassette transporter ABC1, is required for the engulfment of corpses generated by apoptotic cell death., EMBO J., 15, 226-235. Luker G.D., Nilsson K.R., Covey D.F., Piwnica-Worms D. (1999) Multidrug resistance (MDR1) P-glycoprotein enhances esterification of plasma membrane cholesterol., J. Biol. Chem., 274, 6979-6991. Luo C.C., Li W.H., Moore M.N., Chan L. (1986) structure and evolution of the apolipoprotein multigene family., J. Mol. Biol., 187, 325. Marcel Y.L., Provost P.R., Koa H., Raffai E., Vu Dac N., Fruchart J.C., Rassart E. (1991) The epitopes of Apolipoprotein A-I define distinct structural domains including a mobile middle region., J Biol. Chem., 266, 3644-3653. Marguet D., Luciani M.F., Moynault A., Williamson P., Chimini G. (1999) Engulfment of apoptotic cells involves the redistribution of membrane phosphatidylserine on phagocyte and prey., Nat. Cell Biol., 1, 454-456. Martinez, L.O., Agerholm-Larsen, B., Wang, N., Chen, W., and Tall, A.R. (2003) Phosphorylation of a pest sequence in ABCA1 promotes calpain degradation and is reversed by ApoA-I., J. Biol. Chem., 278, 37368-37374. McKnight G.L., Reasoner J., Gilbert T., Sundquist K.O., Hokland B., McKernan P.A., Champagne J., Johnson C.J., Bailey M.C., Holly R. (1992) Cloning and expression of a cellular high density lipoprotein-binding protein that is up-regulated by cholesterol loading of cells., J Biol Chem, 267, 12131-12141. McLean J., Fielding C.,Drayna D., Dieplinger H., Baer B., Kohr W., Henzel W., Lawn R. (1986) Cloning and expression of human lecithin-cholesterol acyltransferase cDNA., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83, 2335-2339. Mendez A.J., Oram J.F., Bierman E.L. (1991) Protein kinase C as a mediator of high density lipoprotein receptor-dependent efflux of intracellular cholesterol., J Biol. Chem., 266, 1010410111. Mendez A.J., Anantharamaiah G.M., Segrest J.P., Oram J.F. (1994) Synthetic amphipatic helical peptides that mimic apolipoprotein A-I in clearing cellular cholesterol., J. Clin. Invest., 94, 1698-1705. Mendez A.J, Uint L. (1996) Apolipoprotein-mediated cellular cholesterol and phospholipid efflux depend on a functional Golgi apparatus., J Lipid Res, 37, 2510-2524.

106

Mendez A.J. (1997) Cholesterol efflux mediated by apolipoproteins is an active cellular process distinct from efflux mediated by passive diffusion., J Lipid Res, 38, 1807-1821. Miccoli R., Bertolotto A., Navalesi R., Odoguardi L., Boni A., Wessling J., Funke H., Wiebusch H, Eckardstein A., Assmann G. (1996) Compound heterozygosity for a structural apolipoprotein A-I variant, apo A-I(L141R)Pisa, and an apolipoprotein A-I null allele in patients with absence of HDL cholesterol, corneal opacifications, and coronary heart disease., Circulation, 94, 1622-1628. Miettinen H.E., Gylling H., Miettinen T.A., Viikari J., Paulin L., Kontula K. (1997) Apolipoprotein A-IFin. Dominantly inherited hypoalphalipoproteinemia due to a single base substitution in the apolipoprotein A-I gene., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 17, 83-90. Miller M., Aiello D., Pritchard H., Friel G., Zeller K. (1998) Apolipoprotein A-I(Zavalla) (Leu159-->Pro): HDL cholesterol deficiency in a kindred associated with premature coronary artery disease., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 18, 1242-1247. Miller N.E. (1980) HDL cholesterol . Tissue cholesterol and coronary atherosclerosis: Epidemological correlation., Atherosclerosis V. Minnich A., Collet X., Roghani A., Cladaras C., Hamilton R.L., Fielding C.J., Zannis V.I. (1992) Site-directed mutagenesis and structure-function analysis of the human apolipoprotein A-I. Relation between lecithin-cholesterol acyltransferase activation and lipid binding., J. Biol. Chem., 267, 16553-16560. Neufeld E.B., Remaley A.T., Demosky S.J., Stonik J.A., Cooney A.M., Comly M., Dwyer N.K., Zhang M., Blanchette-Mackie J., Santamarina-Fojo S., Brewer H.B. (2001) Cellular localization and trafficking of the human ABCA1 transporter., J. Biol. Chem., 276, 2758427590. Nichols A., Miller N.E., Lewis B. (1980) High density lipoprotein metabolism., Adv Lipid Res, 19, 53-58. Norum K.R., Gjone E. (1967) Familial serum-cholesterol esterification failure. A new inborn error of metabolism., Biochim. Biophys. Acta, 144, 698-700. Op .K.J. (1979) Lipid asymmetry in membranes., Annu. Rev. Biochem., 48, 47-71. Oram J.F.,Yokoyama S. (1996) Apolipoprotein-mediated removal of cellular cholesterol and phospholipids., J Lipid Res, 37, 2473-2491. Oram J.F., Lawn R.M., Garvin M.R., Wade D.P. (2000) ABCA1 is the cAMP-inducible apolipoprotein receptor that mediates cholesterol secretion from macrophages., J. Biol. Chem., 275, 34508-34511. Panousis C.G., Zuckerman S.H. (2000) Interferon-gamma induces downregulation of Tangier disease gene (ATP-binding cassette transporter 1) in macrophage-derived foam cells., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 20, 1565-1571. Patch J.R., Gotto A.M.J., Olivercrona T., Eisenberg S. (1978) Formation of high density lipoprotein2-like particles during lipolysis of very low density lipoproteins in vitro., Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 4519-4523.

107

Peelman F., Vinaimant N., Verhee A., Vanloo B., Verschelde J.L., Labeur C., Seguret-Mace S., Duverger N., Hutchimson G., Vandekerckhove J., Tavernier J., Rosseneu M. (1998) A proposed architecture for LCAT: Identification of the catalytic triad and molecular modeling., Protein Science., 7, 587-599. Peelman F., Verschelde J.L., Vanloo B., Ampe C., Labeur C., Tavernier J., Vandekerckhove J., Rosseneu M. (1999) Effects of natural mutations in lecithin:cholesterol acyltransferase on the enzyme structure and activity., J. Lipid Res., 40, 59-69. Philips M.C., Johnson W.J., Rothblat G.H. (1987) Mechanism and consequence of cellular cholesterol exchange and transfer., Biochim. Biophys. Acta, 906, 223-276. Picciotto M.R., Cohn J.A., Bertuzzi G., Greengard P., Nairn A.C. (1992) Phosphorylation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator., J. Biol. Chem., 267, 12742-12752 Pownall H.J., Pao Q., Massey J.B. (1985) Acyl chain and headgroup specificity of human LCAT. Separation of matrix and molecular specificities., J. Biol. Chem., 260, 2146-2152. Prades C., Arnould I., Annilo T., Shulenin S., Chen Z.Q., Orosco L., Triunfol M., Devaud C., Maintoux-Larois C., Lafargue C., Lemoine C., Denefle P., Rosier M., Dean M. (2002) The human ATP binding cassette gene ABCA13, located on chromosome 7p12.3, encodes a 5058 amino acid protein with an extracellular domain encoded in part by a 4.8-kb conserved exon., Cytogenet. Genome Res., 98, 160-168. Quentin Y., Fichant G., Denizot F. (1999) Inventory, assembly and analysis of Bacillus subtilis ABC transport systems., J. Mol. Biol., 287, 467-484. Rajaram O.V., Barter P.J. (1985) Reactivity of human lipoproteins with purified lecithin:cholesterol acyltransferase during incubations in vitro., Biochim. Biophys. Acta, 835, 41-49. Rall S.C. Jr., Weisgraber K.H., Mahley R.W., Ogawa Y., Fielding C.J., Utermann G., Haas J., Steinmetz A., Menzel H.J., Assmann G. (1984) Abnormal lecithin:cholesterol acyltransferase activation by a human apolipoprotein A-I variant in which a single lysine residue is deleted., J. Biol. Chem., 259, 10063-10070. Raussens V., Narayanaswami V., Goormaghtigh E., Ryan R.O.,Ruysschaert J.M. (1995) Alignment of the apolipophorin-III alpha-helices in complex with dimyristoylphosphatidylcholine. A unique spatial orientation., J Biol. Chem., 270, 1254212547. Rechsteiner M., Rogers S.W. (1996) PEST sequences and regulation by proteolysis., Trends Biochem. Sci., 21, 267-271. Remaley A.T., Schumacher U.K., Stonik J.A., Farsi B.D., Nazih H.B., Brewer H.B. (1997) Decreased reverse cholesterol transport from Tangier disease fibroblasts: acceptor specificity and effect of brefeldin on lipid efflux., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 17, 1813-1821. Reuben M.A., Elovson J. (1985) Biosynthesis of apolipoprotein B in rat liver and intestine., Fed. Proc., 44, 1455-1459. Rogers D.P., Brouillette C.G., Engler J.A., Tendian S.W., Roberts L., Mishra V.K., Anantharamaiah G.M., Lund-Katz S., Phillips M.C., Ray M.J. (1997) Truncation of the amino

108

terminus of human apolipoprotein A-I substantially alters only the lipid-free conformation., Biochemistry, 36, 288-300. Rust, S., Rosier, M., Funke, H., Real, J., Amoura, Z., Piette, J.C., Deleuze, J.F., Brewer, H.B., Duverger, N., Denefle, P. & Assmann, G. (1999) Tangier disease is caused by mutations in the gene encoding ATP-binding cassette transporter 1. Nature Genet., 22, 352-355. Rye K.A., Barter P.J. (1992) in structure and function of Apolipoproteins (Rosseneu M., Ed.) pp 401-426, CRC Press, Boca Raton, FL. Schindler P.A., Settineri C.A., Collet X., Fielding C.J., Burlingame A.L. (1995) Site-specific detection and structural characterization of the glycosylation of human plasma proteins lecithin:cholesterol acyltransferase and apolipoprotein D using HPLC/electrospray mass spectrometry and sequential glycosidase digestion., Protein Sci., 4, 791-803. Schneider E., Hunke S. (1998) ATP-binding cassette (ABC) transport systems: funtional and structural aspects of the ATP-hydrolyzing subunits/domains., FEMS Microbiol Rev., 22, 120. Schroit A.J., Madsen J.W., Tanaka Y. (1985) In vivo recognition and clearance of red blood cells containing phosphatidylserine in their plasma membranes., J. Biol. Chem., 260, 51315138. Schwartz K., Lawn R.M., Wade D.P. (2000) ABC1 gene expression and apoA-I-mediated cholesterol efflux are regulated by LXR., Biochem. Biophys. Res. Commun., 274, 794-802. See R.H., Caday-Malcolm R.A., Singaraja R.R., Zhou S., Silverston A., Huber M.T., Moran J., James E.R., Janoo R., Savill J.M., Rigot V., Zhang L.H., Wang M., Chimini G., Wellington C.L., Tafuri S.R., Hayden M.R. (2002) Protein kinase A site-specific phosphorylation regulates ATP-binding cassette A1 (ABCA1)-mediated phospholipid efflux., J. Biol. Chem., 277, 41835-41842 Segrest J.P., Jackson R.L., Morrisette J.D., Gotto A.M.J. (1974) A molecular theory of lipidprotein interactions in the plasma lipoproteins., FEBS Lett., 38, 247-258. Sheppard D.N., Welsh M.J. (1999) Structure and function of the CFTR chloride channel., Physiol.Rev., 79, S23-S45. Singaraja R.R., Brunham L.R., Visscher H., Kastelein J.J.P., Hayden R.M. (2003) Efflux and atheriosclerosis: the clinical and biochemical impact of variations in the ABCA1 gene., Arterioscler. Thromb.Vasc. Biol., 23, 1322-1332. Smith A.J., Timmermans-Hereijgers J.L., Roelofsen B., Wirtz K.W., van Blitterswijk W.J., Smit J.J., Schinkel A.H., Borst P. (1994) The human MDR3 P-glycoprotein promotes translocation of phosphatidylcholine through the plasma membrane of fibroblasts from transgenic mice., FEBS Lett., 354, 263-266. Smith J.D., Waelde C., Horwitz A., Zheng P. (2002) Evaluation of the role of phosphatidylserine translocase activity in ABCA1-mediated lipid efflux., J. Biol. Chem., 277, 17797-17803. Sorci-Thomas M., Kearns M.W., Lee J.P. (1993) Apolipoprotein A-I domains involved in lecithin-cholesterol acyltransferase activation. Structure:function relationships., J. Biol. Chem., 268, 21403-21409.

109

Sparrow J.T., Gotto A.M. (1981) Apolipoprotein-lipid interactions: studies with synthetic polypeptides., Crit Rev Biochem, 13, 87-107. StaryH.C., Chandler A.B., Glagov S., Guyton J.R., Insull W., Rosenfeld M.E., Schaffer S.A., Schwartz C.J., Wagner W.D., Wissler R.W. (1995) A definition of initial, fatty streak, and intermediate lesions of atherosclerosis. A report from the Committee on Vascular Lesions of the Council on Atherosclerosis, American Heart Association., Arterioscler. Thromb., 14, 840856. Steinmetz A., Utermann G. (1985) Activation of lecithin: cholesterol acyltransferase by human apolipoprotein A-IV., J. Biol. Chem., 260, 2258-2264. Sun Y., Hao M., Luo Y., Liang C.P., Silver D.L., Cheng C., Maxfield F.R., Tall A.R. (2003) Stearoyl-CoA desaturase inhibits ATP-binding cassette transporter A1-mediated cholesterol efflux and modulates membrane domain structure., J. Biol. Chem., 278, 5813-5820. Takahashi Y., Smith J.D. (1999) Cholesterol efflux to apolipoprotein AI involves endocytosis and resecretion in a calcium-dependent pathway., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96, 1135811363. Tall A.R., Small D.M. (1980) Body cholesterol removal. Role of plasma HDL., Adv Lipid Res, 17, 1-51. Tall A.R. (1993) Plasma cholesteryl ester transfer protein., J Lipid Res, 34, 1255-1274. Tanaka Y., Schroit A.J. (1983) Insertion of fluorescent phosphatidylserine into the plasma membrane of red blood cells. Recognition by autologous macrophages., J. Biol. Chem., 258, 11335-11343. Tomii K., Kanehisa M. (1998 A comparative analysis of ABC transporters in complete microbial genomes., Genome Research, 8, 1048-1059. Tu A.Y., Nishida H.I., Nishida T. (1993) High density lipoprotein conversion mediated by human plasma phospholipid transfer rpotein., J Biol Chem, 268, 23098-23105. Utermann G., Feussner G., Franceschini G., Haas J., Steinmetz A. (1982) Genetic variants of group A apolipoproteins. Rapid methods for screening and characterization without ultracentrifugation., J. Biol. Chem., 257, 501-507. Vanloo B., Morrison J., Fidge N., Lorent G., Lins L., Brasseur R., Ruysschaert J.M., Baert J., Rosseneu M. (1991) Characterization of the discoidal complexes formed between apoA-ICNBr fragments and phosphatidylcholine., J Lipid Res, 32, 1253-1264. van Veen H.W., Higgins C.F., Konings W.N. (2001) Molecular basis of multidrug transport by ATP-binding cassette transporters: a proposed two-cylinder engine model., J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 185-192. Verkleij A.J., Zwaal R.F., Roelofsen B., Comfurius P., Kastelijn D., van Deenen L.L. (1973) The asymmetric distribution of phospholipids in the human red cell membrane. A combined study using phospholipases and freeze-etch electron microscopy., Biochim. Biophys. Acta, 323, 178-193.

110

Wald J.H., Goormaghtigh E., De Meutter J., Ruysschaert J.M., Jonas A. (1990) Investigation of the lipid domains and apolipoprotein orientation in reconstituted high density lipoproteins by fluorescence and IR methods., J Biol. Chem., 265, 20044-20050. Walker J.E., Saraste M., Runswick M.J., Gay N.J. (1982) Distantly related sequences in the alpha- and beta-subunits of ATP synthase, myosin, kinases and other ATP-requiring enzymes and a common nucleotide binding fold., EMBO J., 1, 945-951. Wang J., Gagne S.M., Sykes B.D., Ryan R.O. (1997) Insight into lipid surface recognition and reversible conformational adaptations of an exchangeable apolipoprotein by multidimensional heteronuclear NMR techniques., J Biol. Chem., 272, 280-286. Wang N., Silver D.L., Costet P., Tall A.R. (2000) Specific binding of ApoA-I, enhanced cholesterol efflux, and altered plasma membrane morphology in cells expressing ABC1., J. Biol. Chem., 275, 33053-33058. Wang N., Silver D.L., Thiele C., Tall A.R. (2001) ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) functions as a cholesterol regulatory protein., J. Biol. Chem., 276, 23742-23747. Wang N., Chen W., Linsel-Nitschke P., Martinez L.O., Agerholm-Larsen B., Silver D.L., Tall A.R. (2003) A PEST sequence in ABCA1 regulates degradation by calpain protease and stabilization of ABCA1 by apoA-I., J. Clin. Invest.,111, 99-107.

Weisgraber K.H., Rall S.C. Jr., Bersot T.P., Mahley R.W., Franceschini G., Sirtori C.R. (1983) Apolipoprotein A-IMilano. Detection of normal A-I in affected subjects and evidence for a cysteine for arginine substitution in the variant A-I., J. Biol. Chem., 258, 2508-2513. Wilson C., Wardell M.R., Weisgraber K.H., Mahley R.W., Agard D.A. (1991) Threedimensional structure of the LDL receptor-binding domain of human apolipoprotein E., Science, 252, 1817-1822. Winter M.C., Welsh M.J. (1997) Stimulation of CFTR activity by its phosphorylated R domain., Nature, 389, 294-296. Wlodawer A., Segrest J.P., Chung B.H., Chiovetti R.J., Weinstein J.N. (1979) High-density lipoprotein recombinants: evidence for a bicycle tire micelle structure obtained by neutron scattering and electron microscopy., FEBS Lett., 104, 231-235. Wong L., Curtiss L.K., Huang J., Mann C.J., Maldonado B., Roheim P.S. (1992) Altered epitope expression of human interstitial fluid apolipoprotein A-I reduces its ability to activate lecithin cholesterol acyl transferase., J Clin Invest, 90, 2370-2375. Xu S., Laccotripe M., Huang X., Rigotti A., Zannis V.I., Krieger M. (1997) Apolipoproteins of HDL can directly mediate binding to the scavenger receptor SR-BI, an HDL receptor that mediates selective lipid uptake., J. Lipid Res., 38, 1289-1298. Yamauchi Y., Abe-Dohmae S., Yokoyama S. (2002) Differential regulation of apolipoprotein A-I/ATP binding cassette transporter A1-mediated cholesterol and phospholipid release., Biochim. Biophys. Acta., 1585, 1-10. Yamauchi Y., Hayashi M., Abe-Dohmae S., Yokoyama S. (2003), Apolipoprotein A-I activates protein kinase Cα signaling to phosphorylate and stabilize ATP binding cassette transporter A1 for the high density lipoprotein assembly., J. Biol. Chem., 278, 47890-47897.

111

Yancey P.G., Bielicki J.K., Johnson W.J., Lund-Katz S., Palgunachari M.N., Anantharamaiah G.M., Segrest J.P., Phillips M.C., Rothblat G.H. (1995) Efflux of cellular cholesterol and phospholipid to lipid-free apolipoproteins and class A amphipathic peptides., Biochemistry, 34, 7955-7965. Yang C., Manoogian D., Pao Q., Lee F., Knapp R.D., Gotto A.M. Jr., Pownall H.J. (1987) Lecithin:cholesterol acyltransferase. Functional regions and a structural model of the enzyme., J. Biol. Chem., 262, 3086-3091. Young S.G., Bertico S.J., Scott T.M., Dubois B.W., Curtiss L.K., Witztum J.L. (1986) Parallel expression of the MB19 genetic polymorphism in apo B-100 and apo B-48. Evidence that both apoproteins are products of the same gene., J. Biol. Chem., 261, 2995-2998. Zeiher A.M., Schachlinger V., Hohnloser S.H., Saurbier B., Just H. (1994) Coronary atherosclerotic wall thickening and vascular reactivity in humans. Elevated high-density lipoprotein levels ameliorate abnormal vasoconstriction in early atherosclerosis., Circulation, 89, 2525-2532. Zorich N., Jonas A., Pownall H.J. (1985) Activation of lecithin cholesterol acyltransferase by human apolipoprotein E in discoidal complexes with lipids., J. Biol. Chem., 260, 8831-8837. Zorich N.L., Kézdy K.E., Jonas A. (1987) Properties of discoidal complexes of human apolipoprotein A-I with phosphatidylcholines containing various fatty acid chains., Biochim. Biophys. Acta, 919, 181-189.

112

Een woord van dank...

Bij het beëindigen van deze thesis wil ik graag alle mensen bedanken die bijgedragen hebben tot het realiseren van dit werk.

In de eerste plaats wil ik Prof. Dr. Joël Vandekeckhove bedanken om, als promotor van deze thesis, mij de kans te geven om dit werk tot een goed einde te brengen.

Een zeer speciale dank gaat uit naar mijn co-promotor Prof. Dr. Maryvonne Rosseneu, voor de deskundige begeleiding van dit werk, de steun, het vele naleeswerk en het advies. Tijdens deze jaren in het labo heb ik veel bijgeleerd, niet alleen over een correcte manier van wetenschappelijk werken en denken maar ook over doorzetten en relativeren. Gedurende deze periode heb ik veel bewondering en respect gekregen voor uw vechtlust om het labo draaiende te houden. Bedankt en geniet met volle teugen van de fantastische zeil-avonturen, de Franse keuken, de kleinkinderen, en nog zoveel meer…

Graag wil ik ook Prof. Dr. Jan Tavernier bedanken voor de aangename en productieve samenwerking. Een bijzondere dank ook aan Annick Verhee voor het maken van de talrijke mutanten. Ik sta nog steeds versteld van je kennis van zake en van de korte periode waarin je steeds opnieuw een volgende reeks constructen afwerkte.

I would also like to thank Prof. Dr. Giovanna Chimini for the opportunity to learn a lot about DNA-manipulation during the two months I spent in your lab in Marseille, and thank you for the cooperation in the ABCA1-project.

Een oprechte dank aan Dr. Frank Peelman. “Frankje”, bedankt voor de steun en de leuke tijd op het labo en ook buiten het labo. Ik heb veel bewondering voor je wetenschappelijke kennis gecombineerd met je bescheidenheid. Deze thesis zou nooit tot stand gekomen zijn zonder jou. Graag wil ik ook de andere medewerkers en ex-medewerkers van het labo bedanken. Hans, bedankt voor de leuke babbels en practische zoektochten naar de oplossing.

113

Berlinda, bedankt voor de kennis, de sfeer en de steun. Claudia-tje, wat hebben we daar samen gelachen… en soms ook gevloekt… bedankt voor die plezante tijden. Bedankt ook aan Nathalie, Inge, Kristof, Christine, Josée, Nicole,… voor de aangename sfeer op het labo. En natuurlijk ook merci aan Bart voor de wetenschappelijke… en niet wetenschappelijke discussies… maar vooral voor de afgelegde weg.

Uiteraard wil ik ook m’n vrienden bedanken om het met mij vol te houden, voor de steun en energie. In het bijzonder wil ik Nick en Katrien bedanken, niet enkel voor de computerbijstand, maar vooral voor die ontelbare andere momenten… bedankt omdat de deur steeds open staat. Bedankt ook aan Stephanie, om op dezelfde golflengte te zitten, om me het gevoel te geven dat we de wereld aankunnen… Kathleen, bedankt om m’n engelbewaarder te zijn, voor het zelfvertrouwen en de onbreekbare band.

Een speciale dank ook aan Greet, Kristel en Carine… ‘k weet niet wat ik zonder jullie zou doen. Bedankt voor het land van duizend dromen, het enthousiasme, het begrip en jullie glimlach!

En laatst, maar zeker niet minst, wil ik m’n ouders bedanken voor de onvoorwaardelijke steun, de thuis, het begrip en de warmte. Bedankt om me te leren genieten van de eenvoudige dingen in het leven en van de stilte, om me duidelijk te maken dat de wereld niet rond mij alleen draait. Ik zie jullie graag.

Bedankt,

Stein

114