De Nederlandse populatie van Geelbuikvuurpad in Zuid-Limburg: een genetische analyse

De Nederlandse populatie van Geelbuikvuurpad in Zuid-Limburg: een genetische analyse

Dit onderzoek is uitgevoerd in opdracht van de Provincie Limburg. Projectnummer: 5238059-01

Foto’s omslag: Ben Crombaghs (buikfoto) & Martijn Dorenbosch (amplex).

De Nederlandse populatie van Geelbuikvuurpad in Zuid-Limburg: een genetische analyse

Hugh A.H. Jansman1, Arjen de Groot1, Marinus Speelman1,2, Ivo Laros1, Wilbert Bosman3, Ben Crombaghs4 & Hans Peter Koelewijn1

1 2 3 4

Alterra, onderdeel van Wageningen UR Wageningen Universiteit RAVON Natuurbalans – Limes Divergens

Alterra, onderdeel van Wageningen UR Wageningen, 2012

Inhoud

1

Inleiding 1.1 De Geelbuikvuurpad 1.1.1 Ecologische en morfologische gegevens 1.1.2 Ontwikkeling Nederlandse populaties 1.1.3 Beschermingsstatus 1.2 Genetische processen in geïsoleerde en kleine populaties 1.3 Vraagstelling

6 6 6 8 10 11 13

2

Materiaal en Methode 2.1 Monstername 2.1.1 Bemonsterde populaties 2.1.2 Wangslijmvlies 2.1.3 Weefselmonsters 2.2 Genetische analyse 2.2.1 DNA isolatie 2.2.2 Microsatelliet-analyse 2.2.3 Data-analyse

14 14 15 16 17 18 18 18 19

3

Resultaten 3.1 Genetische diversiteit 3.2 Genetische verwantschap 3.2.1 Bayesiaanse cluster-analyse 3.2.2 Principale Coördinaten Analyse 3.2.3 Genetische differentiatie

21 21 25 25 26 30

4

Discussie, conclusies & aanbevelingen 4.1 Genetische variatie 4.2 Genetische differentiatie 4.3 Samenvatting en Conclusies 4.4 Aanbevelingen

32 32 34 36 37

5

Dankwoord

38

6. Referenties

39

Bijlage 1: Historie van de Geelbuikvuurpad in Nederland

40

Alterra-AltRapp GBV DNA.docx

5

1

Inleiding

De Geelbuikvuurpad (Bombina variegata) is momenteel zeer zeldzaam in Nederland. Het verspreidingsgebied is beperkt tot Zuid-Limburg en bestaat uit vijf leefgebieden waar het dier in dynamische milieus (voornamelijk in mergelgroeven) leeft. Vroeger was de soort vrij algemeen en kwam verspreid over het uiterste zuiden van Limburg voor. Er zijn meerdere maatregelen genomen ter bescherming van de soort, onder andere door de ontwikkeling en instandhouding van instabiele milieus bij mergelgroeven. Om een indruk te krijgen van de huidige toestand van de Geelbuikvuurpad populaties in Zuid-Limburg is een inventarisatie uitgevoerd die zowel de demografische- als populatiegenetische aspecten van de huidige populaties meeneemt. Dit verslag bevat de voornaamste bevindingen en conclusies.

1.1

De Geelbuikvuurpad

1.1.1

Ecologische en morfologische gegevens

Geelbuikvuurpad De Geelbuikvuurpad behoort tot de familie van de vuurbuikpadden (Bombinatoridae). Anders dan dat de naam doet denken, behoort deze soort tot de familie van de kikkers. Binnen de familie zijn er twee geslachten en acht soorten. Allen hebben ze een afgeplat lichaam en een pad-achtig gedrongen uiterlijk. Het geslacht Bombina staat bekend om de felle buikkleuren en kent zes soorten waarvan in Noordwest Europa de Roodbuikvuurpad (Bombina bombina), en de Geelbuikvuurpad (B. variegata), voorkomen (Bosman et al 2009). De lengte van een volwassen Geelbuikvuurpad is drie tot vijf centimeter. Vrouwtjes zijn iets groter dan de mannetjes. Gemiddeld bereiken de dieren een gewicht van 3.5 à 6.5 gram, met een maximum van circa twaalf gram (Bosman et al 2009). Zowel de buik, als de kin en de onderzijde van de ledenmaten zijn geel, met een onregelmatig patroon van zwarte vlekken. De gele kleur loopt door op de achterzijde van de dijen en de toppen van enkele vingers en tenen. Wanneer een individu zich bedreigd voelt, worden de opvallende kleur van de randen van de buik getoond, door de poten tot boven het lichaam te krommen. Dit gedrag wordt de unkenreflex genoemd. Het buikpatroon is voor ieder individueel exemplaar verschillend en veranderd nauwelijks na het eerste levensjaar, waardoor volgroeide dieren individueel herkenbaar blijven; de rugzijde is donkerbruin gekleurd en bedekt met kleine wratten (zie Figuur 1). Soms zijn er lichtbruine vlekken op de rug te zien. De ogen staan bovenop de kop en hebben een driehoekige of hartvormige pupil. De mannetjes zijn van de vrouwtjes te onderscheiden door de gespierde bovenarmen en bruinzwarte paarborstels op de binnenzijde van de onderarm en de vingers (Bosman et al 2009).

6

Alterra – Geelbuikvuurpad genetica

Figuur 1: Buik- en rugzijde Geelbuikvuurpad. (foto: RAVON) De Geelbuikvuurpad maakt gebruik van twee typen wateren. Voor de voortplanting worden instabiele wateren gebruikt; poeltjes en laagtes die in een pioniersstadium verkeren en zonnig gelegen zijn. Deze bevatten in het algemeen minder predatoren en concurrerende amfibiesoorten. Voor het verblijf buiten de voortplanting, worden sterker begroeide en soms ook diepere poelen gebruikt, beter bekend als verblijfswateren. De Geelbuikvuurpad wordt voornamelijk in waterhabitat waargenomen, maar spendeert een aanzienlijk deel van het jaar op het land, bijvoorbeeld om te overwinteren. In Nederland bestaat het landhabitat voornamelijk uit nog kale groevebodems, graslanden, ruigtevegetaties en bos. Adulte dieren zijn tijdens de actieve periode zeer plaatstrouw en blijven gemiddeld binnen 35 meter van de vindplaats. Tussen seizoenen vindt er wel verplaatsing plaats, in enkele gevallen gaat het om een afstand van 250 tot 300 meter. Wanneer ze niet actief zijn in hun zomerhabitat, schuilen geelbuikvuurpadden in muizengangen, tussen boomwortels, onder stammen, stenen, afval, in steenhopen of krimpscheuren in de bodem. Geelbuikvuurpadden voeden zich doorgaans met evertebraten, zoals insecten, rupsen en duizendpoten (Bosman et al 2009). De eerste geelbuikvuurpadden worden doorgaans in april waargenomen. De meeste waarnemingen worden tussen half mei en eind augustus gedaan. Na hevige neerslag, gevolgd door hoge temperaturen tijdens het voortplantingsseizoen, verzamelen geelbuikvuurpadden zich in korte tijd om eieren in de wateren af te zetten. Het aantal eieren dat wordt afgezet, kan oplopen tot circa 130 per vrouwtje. De eieren worden afgezet, afzonderlijk of in klein klompjes, op dode takjes, stenen of planten. Een eitje is gemiddeld anderhalf tot twee millimeter groot, met een omhulsel van vijf tot acht millimeter en bruin van kleur. De larven bereiken, na een periode van zes tot tien weken, een lengte van circa vijf centimeter. Juvenielen vertonen zwerfgedrag en geen gerichte migratie. Ze kunnen binnen enkele weken tot 800 meter van hun geboorte wateren wegtrekken. Hierdoor kan de soort nieuwe leefgebieden koloniseren. Echter, als gevolg van het geringe dispersievermogen en toegenomen fragmentatie liggen risico’s van, al dan niet genetische, isolatie op de loer en zijn risico’s van inteelt op termijn niet uit te sluiten. Jonge dieren kunnen in hun tweede zomer geslachtsrijp worden, maar deelname aan de voortplanting vindt meestal plaats in hun derde zomer (Bosman et al 2009). Geelbuikvuurpadden kunnen relatief oud worden. Er zijn exemplaren van minstens 26 jaar gevonden in het wild, maar als een gevolg van predatie en natuurlijk verval haalt lang niet ieder individu die leeftijd.

7

1.1.2

Ontwikkeling Nederlandse populaties

Een uitgebreide beschrijving van de historie van de Nederlandse populaties, met betrekking tot zowel de natuurlijke populatieontwikkeling als menselijke ingrepen door de jaren heen, is opgenomen in bijlage 1. Hieronder volgt een kort overzicht van de meest relevante historische gebeurtenissen.

Algemeen In de eerste helft van de twintigste eeuw, komen alle waarnemingen van geelbuikvuurpadden uit de streek ten oosten van de Maas en ten zuiden van de lijn Kerkrade-Maastricht. Waarnemingen buiten Zuid-Limburg worden als buiten het natuurlijke verspreidingsgebied gerekend. De soort lijkt algemeen voor te komen in ZuidLimburg. Door onderzoek ontstaat in de jaren ‘60 een nauwkeuriger beeld van de verspreiding van de soort. Tijdens de jaren ’70 wordt een drastische terugloop vastgesteld van het aantal locaties waar de soort wordt waargenomen; de soort wordt nog maar in 17 poelen waargenomen in tegenstelling tot de circa 80 poelen uit de jaren ’60. In de jaren ’80 worden er nog maar vijf poelen vermeld, waarbij slechts sprake is van één populatie met een redelijk aantal dieren (circa 25) (Bosman et al 2009; Bijlage 1). De drastische achteruitgang van de Geelbuikvuurpad leidde in 1982 tot de oprichting van de zogenaamde ‘Overleggroep poelenbeheer’. In de volgende jaren nam het aantal nieuw aangelegde en herstelde poelen in het Mergelland weer toe tot 550 in 1990. Veel soorten reageerden positief op deze actie, maar de Geelbuikvuurpad echter niet. Ondanks de graaf- en herstelwerkzaamheden waren er in 2000 nog maar vier vindplaatsen van de Geelbuikvuurpad, waarvan slechts één vitale populatie (in groeve ’t Rooth) (bijlage I).

Vanaf 1997 is er structureel populatieonderzoek verricht aan de Geelbuikvuurpad in Zuid-Limburg. In het begin alleen in groeve ’t Rooth, vanaf 2000 ook in de vier andere gebieden, namelijk Julianagroeve, Wahlwiller, Berghofwei en Gerendal (Bijlage 1).

Recente situatie per subpopulatie Groeve ’t Rooth. In de jaren ‘80 was de populatie in groeve ’t Rooth de grootste in Nederland. De populatiegrootte werd in die tijd geschat op 97 dieren (adulten en subadulten). Vanaf 2000 zijn in de groeve basishabitats aangelegd. Basishabitats hebben naast een voortplantingsgedeelte ook een verblijfsgedeelte waar de dieren kunnen foerageren. Van 41 dieren in 1997 groeide de populatie in 2003 naar 166 dieren. In de jaren daarna schommelen de aantallen tussen de 100 en 120 dieren. In 2010 betrof de populatiegrootte 115 volwassen dieren. Julianagroeve. Eind jaren ‘90 stierf de Geelbuikvuurpad uit in de Julianagroeve. Voorheen was de soort er ook al schaars. In juni 2001 werd er weer een dier gevonden. De herkolonisatie heeft vrijwel zeker plaatsgevonden vanuit groeve ‘t Rooth. Voor 2010 kwam de schatting uit op 11 dieren. In de Julianagroeve is op dit moment geen sprake van een levensvatbare populatie. Wahlwiller. De populatie in Wahlwiller is het resultaat van een introductie in 1982. In 2000 bestond de populatie uit 16 dieren. De aanleg van vier basishabitats in 2005 zorgde voor een enorm reproductiesucces wat leidde tot een populatieomvang van meer dan 70 dieren. In jaren daarna fluctueert het aantal en omvat in 2010 63 dieren. Berghofwei. Tussen 2000 en 2003 werden er in de Berghofweide nog maar sporadisch geelbuikvuurpadden gezien. De aanleg van een basishabitat in 2004 bleek van groot belang. Er bleken nog een aantal dieren aanwezig te zijn in het gebied die zich in 2004 succesvol voortplantte. Aanleg van meer basishabitats zorgde voor een groei van de populatie die in 2009 zijn voorlopig hoogte punt bereikte met 76 dieren. In 2010 daalde het aantal weer licht naar 72 dieren. Gerendal. De populatie in het Gerendal was jaren lang kwakkelend. In 2000 bestond deze nog uit 18 dieren, maar nam in de jaren daarna af tot slechts enkele exemplaren in 2004 en 2005. De populatie groeide in 2009

8


en 2010 uit naar een populatie van 69 en respectievelijk 118 dieren. Hoe deze spectaculaire groei na succesvolle voortplanting in 2008 ineens tot stand is gekomen, is niet duidelijk.

Uitzet en bijplaatsingen De afname leidde tot de uitvoering van een reeks onderzoeken, betreffende de actuele status en de omvang van de laatste populaties en het veilig stellen van het voortbestaan van deze populaties. De resultaten van die onderzoeken resulteerde onder meer in een tweetal beschermingsplannen (Lenders, 2000; Crombaghs & Bosman, 2006). Daarnaast leidde de ernstig bedreigde status van de soort tot het (zowel legaal als op particulier initiatief) uitzetten van geelbuikvuurpadden in de hoop op de ontwikkeling van nieuwe populaties. Zowel volwassen dieren, als juvenielen en larven zijn op diverse plaatsen in Zuid-Limburg uitgezet. Door middel van interviews is hiervan een zo goed mogelijk beeld geschetst voor de periode 1970-2010. Uit de interviews blijkt dat hierbij ook dieren uit het buitenland zijn uitgezet. Een overzicht van locaties waar Geelbuikvuurpad is uitgezet, of van eenmalige waarnemingen van de soort op afwijkende locaties, wordt gepresenteerd in tabel 1 en figuur 2. Voor een uitgebreide beschrijving van de uitzetting wordt verwezen naar bijlage 1. In overleg met de Provincie Limburg en het Ministerie van LNV is in de periode 2005-2010 een herintroductie uitgevoerd in drie groeves in Zuid-Limburg: Groeve Blom (2005), Meertensgroeve (2006) en Curfsgroeve (2008). Als bronmateriaal voor de uitzettingen werd een kweekgroep gebruikt (in het vervolg van dit rapport aangeduid met “Nederlandse kweekgroep” of “kweekgroep BC (Ben Crombaghs)”). De kweekgroep is in eerste instantie tot stand gekomen door het opkweken van larven , die in 2000 werden verzameld van de locatie Wahlwiller. Deze larven waren in 2000 laat in het seizoen (oktober) nog niet gemetamorfoseerd. Larven van de Geelbuikvuurpad overleven de winterperiode niet. De larven zijn daarom in gevangenschap door de winter geholpen. Rond 2005 zijn er onder soortgelijke omstandigheden enkele larven verzameld van Berghofwei en ’t Rooth, opgekweekt en toegevoegd aan de kweekgroep. Ook tijdens de herintroducties in de Meertensgroeve en de Curfsgroeve (2005-2010) werden enkele malen larven de winter doorgeholpen en in het voorjaar als subadult uitgezet. In 2008 is er een drietal subadulten aan de kweekgroep toegevoegd die werden aangetroffen in het gebied ‘Lange Akkers’, op circa 500 meter ten westen van de Meertensgroeve. De kweekgroep bestaat gemiddeld uit 15 tot 20 individuen.

Tabel 1: Overzicht van bekende uitzettingen en waargenomen individuen op onverwachte locaties, in de periode 1970-2010; voor meer informatie zie Bijlage 1. Locatie of gebied

Tijdstip

Ontwikkelings-stadium

Herkomst (indien bekend)

Indicatie aantallen

Uitzettingen en waarnemingen buiten het natuurlijke areaal, periode 1970-2010 1 Retraitehuis Spaubeek

Jaren ‘70

Larven/juvenielen

Kranske Gora (Slovenië)

onbekend

7 Bemelerberg + omgeving

Jaren ‘70

Larven/juvenielen

Kranske Gora (Slovenië)

onbekend

11 Simpelveld

1972

Adult

Mogelijk natuurlijk voorkomen

één

9 Gerendal

1974 & 1975

Juvenielen

Zuid-Limburg

1860

14 Slenaken/Schilberg

Eind jaren ‘70

Adult

Mogelijk natuurlijk voorkomen

één

5 Meertensgroeve

1985

Adult

onbekend

één

9 Gerendal

Eind jaren ‘80

Volgroeide larven en juvenielen

Waarschijnlijk variëteit uit Balkan

enkele honderden

10 Keuteberg

Eind jaren ‘90

juvenielen

Rooth

enkele tientallen

8 Rooth

1997

Volgroeide larven en juvenielen

Opgekweekt uit eitjes uit ‘t Rooth

enkele honderden

2 Bunderbos

Omstreeks 1995

Adulten

onbekend

drie adulten waargenomen

4 Curfsgroeve

1998

Adulten

onbekend

Vier

Uitzettingen in kader van een herintroductieproject, periode 2005-2010 6 Groeve Blom

2005-2007

Larven en juvenielen

kweekgroep

> 3000 in drie jaren

5 Meertensgroeve

2006-2008

Larven en juvenielen

kweekgroep


4 Curfsgroeve

2008-2011

Larven, juvenielen en subadulten

kweekgroep


9

Figuur 2: Locaties in Limburg waar in de periode 1970-2010 uitzetting van de Geelbuikvuurpad bekend is. Op vijf locaties betreft het met zekerheid uitzetting van Geelbuikvuurpadden uit voormalig Joegoslavië. In drie gevallen is de herkomst van de uitgezette Geelbuikvuurpadden onbekend. De overige uitzettingen hebben, voor zover bekend, betrekking op inheems materiaal. De nummers in de figuur corresponderen met de nummers in de tekst. Op een aantal locaties is de Geelbuikvuurpad inmiddels weer verdwenen. Voor meer informatie, zie Bijlage 1.

1.1.3

Beschermingsstatus

De Geelbuikvuurpad valt onder de Europese regelgeving van ‘de Conventie van Bern’, die zich bezig houdt met het behoud van soorten en hun natuurlijk leefomgeving. Daarnaast is de diersoort opgenomen in bijlage 2 (soorten met lidstaat-overstijgend belang) en bijlage 4 (soorten die strikte bescherming vereisen) van de Habitatrichtlijn, die zich richt op de instandhouding van natuurlijke habitats, de wilde flora en fauna en het behoud van biodiversiteit door bescherming van (semi)natuurlijke landschappen en soorten met Europees belang. Deze gebiedsbescherming wordt in Nederland verwerkelijkt via ‘Natura 2000’. In Nederland is de soort overgenomen in de Flora en Fauna-wet. Daarnaast zijn er natuurgebieden als Habitatrichtlijngebied voor de Geelbuikvuurpad aangewezen. De vereiste bescherming is landelijk geregeld, mede doordat de soort is aangewezen als beschermde inheemse diersoort in de Natuurbeschermingswet; een wet die zowel de soortbescherming als de gebiedsbescherming omvat d.m.v. het aanwijzen van gebieden als Staats- of Beschermd Natuurmonument. Als laatste is de Geelbuikvuurpad ook nog opgenomen in de Rode lijst van reptielen en amfibieën, met als status ‘ernstig bedreigd’ (Platform Geelbuikvuurpad en Vroedmeesterpad, 2006).

10


1.2

Genetische processen in geïsoleerde en kleine populaties

Biodiversiteit wordt vaak op drie niveaus gedefinieerd: op het niveau van ecosystemen en habitats, op soortsniveau en op populatie- en individu niveau (genetische biodiversiteit). Om genetische diversiteit te analyseren, zijn verschillende technieken ontwikkelt (Bijlsma, 1995). Cellen bevatten nucleair- en mitochondriaal DNA. DNA bevat de genetische informatie die nodig is om een organisme te maken. DNA is opgebouwd uit vier zogeheten baseparen (A, T, G en C) die in verschillende volgorden voorkomen. Het DNA is dan een lange keten van baseparen. Door de volgorde van de baseparen tussen individuen te vergelijken, kan gekeken worden of er variatie is en wat de frequentie van de verschillende varianten binnen een populatie is. Omdat het onnodig duur en complex is om de code van het hele genoom van elk individu te bepalen, wordt meestal gekeken naar de variatie op een aantal kleine stukjes van het DNA. Zulke stukjes DNA, die gezamenlijk een beeld geven van de totale variatie, worden loci (enkelvoud: locus) of merkers genoemd. Afhankelijk van de vraagstelling, worden merkers gebruikt in meer of minder variabele regionen van het genoom. Zo is voor een studie naar de genetische structuur in heel Europa een minder variabele merker voldoende en zelfs geschikter (bv markers uit het mitochondriale DNA, ofwel mtDNA), terwijl voor een studie naar sterk verwante individuen binnen één populatie markers nodig zijn met een hogere resolutie, zoals microsatellieten. De twee standaard parameters voor het weergeven van genetische diversiteit, zijn de mate van polymorfisme en het percentage heterozygositeit. Polymorfisme betekent dat er meerdere varianten of allelen (nucleair DNA) of haplotypen (mitochondriaal DNA) van een merker aanwezig zijn in een populatie. Indien een individu van de vader een andere allel heeft meegekregen dan van de moeder, is dit individu heterozygoot voor deze merker. Indien het twee dezelfde allelen bezit is het homozygoot. Hoe groter het aantal verschillende allelen van een merker binnen een populatie, des te groter de genetische variatie van die populatie. Hoe groter het aantal merkers waarvoor een individu heterozygoot is, des te groter is de genetische variatie in dat individu. Het belang van genetische diversiteit laat zich het beste verklaren door genen als pakketjes informatie te beschouwen. Bij een grote variatie aan allelen is er dus veel informatie binnen het individu of populatie aanwezig. Een gebrek aan variatie hoeft niet direct tot uitsterven te leiden, maar verhoogd wel de kans daartoe. Een eventueel achteruitgaan van een populatie zal een samenspel zijn van genetische en nietgenetische factoren. Een overzicht van de processen die hierbij betrokken zijn wordt gegeven in Figuur 3. Een proces dat bij kleine populaties een belangrijke rol speelt is genetische drift. Bij het doorgeven van de genetische variatie van de ene generatie naar de volgende, kan verlies van variatie optreden. Dit effect zal sterker zijn naarmate de populatie omvang kleiner is. Genetische drift kan optreden als gevolg van willekeurige sterfte van individuen, maar ook als gevolg van migratie of ‘bottlenecks’ (Nei 2005). Een demografische bottleneck is het proces waarbij een populatie in korte tijd sterk in aantal achteruitgaat. Indien dit een sterke afname van de genetische variatie tot gevolg heeft (als deze bottleneck niet snel door populatiegroei wordt gevolgd) dan spreekt men van een genetische bottleneck. Naast genetische drift kan verlies van variatie ook het resultaat zijn van selectie, of van paring tussen verwanten, oftewel inteelt (Frankham et al. 2010). Organismen beschikken dan ook over verschillende mechanismen om inteelt te voorkomen. Bij veel zoogdieren is een veel voorkomend mechanisme geslachtsafhankelijke dispersie, waarbij de mannetjes verder wegtrekken dan de vrouwtjes of juist andersom. Bij kleine, geïsoleerde populaties kan aan een belangrijke voorwaarde voor het behoud van genetische variatie, het min of meer willekeurig kiezen van een partner niet worden voldaan, omdat er daarvoor te weinig potentiële partners zijn. Op basis van populatie-genetische data kan worden nagegaan in hoeverre binnen een populatie willekeurige paring plaatsvindt, door te kijken naar de verhouding tussen het theoretisch verwachte aantal heterozygote individuen in geval van willekeurige paring en het daadwerkelijke aantal heterozygoten. Afname van de genetische variatie en een gebrek aan heterozygotie kan leiden tot een verlaagde fitness. Onder fitness wordt verstaan het reproductieve succes gedurende het leven van een individu. Hoewel dit niet eenvoudig te analyseren is, wordt het vaak gemeten aan de grootte en groei van individuen, vruchtbaarheid, levensverwachting, groeisnelheid en eventueel de metabolische efficiëntie van stoffen.

11

Van populaties die geïsoleerd raken, kunnen als gevolg van selectie en genetische drift de genetische eigenschappen zich wijzigen. De mate waarin deze locale adaptatie plaats vindt, is enigszins gerelateerd aan de populatieomvang, de duur van de isolatie en de mate waarin het nieuwe leefmilieu verschilt van het oorspronkelijke. Genen met voordelige eigenschappen voor het speciale leefmilieu gaan frequenter voorkomen dan de minder gunstige genen. Daarnaast kan co-adaptatie plaatsvinden. Dit betekent dat bepaalde genen elkaars werking kunnen verbeteren indien zij in hetzelfde individu aanwezig zijn en dus tegelijkertijd tot expressie kunnen komen. Indien een lokaal geadapteerde populatie weer in contact wordt gebracht met soortgenoten uit een andere populatie, hetzij natuurlijk door het opheffen van een migratiebarrière, hetzij kunstmatig door het uitwisselen van individuen, kan dit leiden tot uitteelt of outbreeding depression. Hiermee wordt bedoeld het opheffen van de locale adaptatie en co-adaptatie wat resulteert in een afnemende fitness (Frankham et al. 2002).

Figuur 3. De uitsterfspiraal of extinctie curve (uit: Buiteveld & Koelewijn 2006). Een gesimplificeerde weergave van processen die in gang worden gezet als een populatie in omvang afneemt. Twee feedback-loops zijn zichtbaar, die beiden hun weerslag hebben op de geboorte– en sterftecijfers van de populatie. Deze ‘loops’ kunnen elkaar versterken, wat tot een snelle afname in populatiegrootte kan leiden, en daarmee een verhoogde kans op uitsterven. De zwarte pijlen geven de richting van het effect aan (d.w.z. groter of geringer).

12


1.3

Vraagstelling

De drastische afname van de populatiegroottes van de Geelbuikvuurpad in Limburg heeft waarschijnlijk meerdere oorzaken (Platform Geelbuikvuurpad en Vroedmeesterpad, 2006). Een langdurig kleine populatieomvang heeft vrijwel altijd een afname van de genetische variatie tot gevolg. Genetische variatie is van belang voor overleving en aanpassingsvermogen van individuen en populaties. Ook is het niet uitgesloten dat vanwege de mogelijk geïsoleerde ligging van de Nederlandse Geelbuikvuurpad-populatie aan de rand van het verspreidingsgebied (in samenhang met mogelijk andere leefomstandigheden, zoals habitat of klimaat) er selectie en/of adaptatie heeft plaatsgevonden, waardoor de Nederlandse populatie mogelijk is gedifferentieerd van andere populaties. Dit is van belang indien geschikte individuen geselecteerd moeten worden, wanneer er bijplaatsing of herintroductie ter versterking van de populatie wordt overwogen. Het mengen van buitenlandse individuen met inheemse varianten is beslist niet zonder risico (zowel genetisch als wat betreft het risico op verspreiding van ziekten) (Smulders et al, 2006). In opdracht van Provincie Limburg is door Alterra onderzoek verricht naar de genetische variatie en genetische differentiatie van de Nederlandse populaties van de Geelbuikvuurpad. Het doel van dit onderzoek is het verkrijgen van inzicht in de genetische structuur van de populaties van de Geelbuikvuurpad in Nederland in vergelijking met omliggende Europese landen (België, Frankrijk en Duitsland, ook wel omschreven als Europese regio’s). Dit inzicht leidt tot mogelijke verklaringen van de genetische structuur van populaties en uiteindelijk tot aanbevelingen met betrekking tot het beheer van de Nederlandse populaties in Zuid-Limburg. Voor dit onderzoek zijn de volgende vragen geformuleerd: 1) Is de algehele Nederlandse populatie vanuit genetisch oogpunt levensvatbaar en, indien niet, hoe zou deze ondersteund kunnen worden? 2) Hoe verhoudt de genetische variatie en genetische differentiatie van de Nederlandse populaties zich onderling en ten opzichte van referentie populaties uit de Europese regio’s? 3) Zijn er vanuit genetisch oogpunt indicaties voor (illegale) bijplaatsing, en zijn deze tot een mogelijke herkomst te herleiden? Deze vragen zullen worden beantwoord door de uitvoering van populatie-genetische analyses op basis van bemonsterde populaties uit zowel Nederland als de Europese regio’s.

13

2

Materiaal en Methode

2.1

Monstername

Vaak wordt er voor genetisch onderzoek gebruik gemaakt van bloed- of weefselmonsters. Het probleem van deze monstertypes is echter dat deze niet altijd eenvoudig voor handen zijn, of dat het vanuit dierwelzijn niet wenselijk is om bloed of weefsel af te nemen. Om deze reden wordt dan ook vaak uitgeweken naar andere, vaak kwalitatief mindere monstertypes, zoals haren, veren, eischalen, wangslijmvlies en zelfs uitwerpselen. Tijdens dit onderzoek is gekozen om voornamelijk te werken met wangslijmvlies. De dieren zijn namelijk vrij gemakkelijk te vangen, en, in tegenstelling tot andere bekende methoden als teenknippen, beperkt bemonstering van wangslijmvlies de kans op schade aan de dieren tot een minimum. Naast wangslijmvlies zijn ook enkele weefselmonsters gebruikt. Dit betrof monsters van enkele doodgevonden exemplaren, exemplaren uit een museumcollectie, en monsters van gestorven larven uit een kweekgroep. Hieronder zal eerst een overzicht worden geschetst van de bemonsterde populaties. Daarna zal de wijze van bemonstering van wangslijmvlies en weefsel in meer detail worden omschreven. Een overzicht van alle bemonsterde populaties, het aantal monsters per populatie en het type bemonstering is weergegeven in Tabel 2.

Tabel 2. Herkomst, aantal gebruikte monsters (n) , tijdstip van verzamelen, en type verzameld materiaal van de in deze studie onderzochte populaties van Geelbuikvuurpad. Populatie

n

Periode

Type monster

10 17 37 36 33 35

Juni-2010 Juli-Augustus 2010 Juli-Augustus 2010 Juli-Augustus 2010 Juli-Augustus 2010 1898-1961

Wangslijmvlies Wangslijmvlies Wangslijmvlies Wangslijmvlies Wangslijmvlies Weefsel

16 15 7

Augustus-2010 Augustus-2010 Augustus-2010

Wangslijmvlies Wangslijmvlies Wangslijmvlies

11

Augustus-2010

Wangslijmvlies

5 5 5 5

2007 (zie Weimann 2007 (zie Weimann 2007 (zie Weimann 2007 (zie Weimann

Frankrijk (Creuse)

23

Augustus-2010

Wangslijmvlies

Blijdorp (Slovenië?)

10

Augustus-2010

Wangslijmvlies

NL kweekprogramma

18

Juni-2010

Wangslijmvlies (15x) Weefsel (3x)

Nederland Meertensgroeve Wahlwiller Gerendal Berghofwei ’t Rooth Museum

Duitsland, regio Aken Binsfelthammer Brockenberg Bärenstein

België (kweekprogramma Luik) Duitsland, region Hannover Liekwegen Oberkircher Sandsteinbrüche Messingberg Doberg

14


et al., 2009) et al., 2009) et al., 2009) et al., 2009)

Wangslijmvlies Wangslijmvlies Wangslijmvlies Wangslijmvlies

2.1.1

Bemonsterde populaties

Het verzamelen van monsters van Nederlandse populaties is uitbesteed aan RAVON (Wilbert Bosman) en Natuurbalans - Limes Divergens (Ben Crombaghs). Het veldwerk is uitgevoerd in de periode van Juli-Augustus 2010. Dit is gedaan door de vijf Limburgse lokaties te bezoeken waarvoor de aanwezigheid van een populatie van Geelbuikvuurpad op dat moment bekend was, en padden uit elk van de daar aanwezige poeltjes apart te bemonsteren. Vanwege het droge voorjaar is het veldwerk vertraagd omdat de voortplantingswateren vroegtijdig droogvielen. De bezochte populaties waren Julianagroeve, Meertensgroeve, Wahlwiller, Gerendal, Berghofwei, ’t Rooth. Een overzicht van de ligging van de bemonsterde Limburgse populaties is te vinden in Figuur 4. In de Julianagroeve werden echter op het moment van monsteren geen individuen aangetroffen, en deze komt dan verder niet terug in de genetische analyses. Alle individuen aanwezig in een poeltje werden gevangen en in een emmer gedaan. Als werd aangenomen dat de poel zo goed als leeg was, werd bij ieder individu wat wangslijmvlies afgenomen. Hierna werd de Geelbuikvuurpad gefotografeerd voor individuele herkenning en in een andere emmer gezet. Als alle padden waren bemonsterd, werd nog eenmaal een ronde rond het poeltje gelopen om te kijken of er mogelijk nog meer individuen aanwezig waren die tijdens de eerste ronde gemist waren. Als dit het geval was werden deze ook nog bemonsterd. Indien dit niet het geval was werden alle dieren weer los gelaten bij dezelfde poel.

Cu rfs groeve Groeve Blom

Ro oth

Me erten sgroev e Be rghof Gerend al

J ulianagroe ve

Wahlw iller

Be m onsterd e populaties Over ige bes taande popula ties in 2010

Figuur 4: Overzicht van de bestaande populaties van Geelbuikvuurpad in Limburg in 2010, en de populaties die daarvan gedurende dat jaar werden bemonsterd.

Voor dit onderzoek werden de huidige Nederlandse populaties ook vergeleken met monsters van diverse andere populaties. Hieronder volgt een overzicht van deze populaties, en de wijze waarop monsters werden verkregen.

15

Historische monsters Voor een vergelijking met de historische situatie binnen Nederland, werden weefselmonsters verzameld van exemplaren uit de collectie van Nationaal Natuurhistorisch museum Naturalis te Leiden.

Naburige populaties Door Wilbert Bosman en Ben Crombaghs werden ook wangslijmvliesmonsters verzameld van enkele naburige populaties rond Aken (Binsfelthammer, Brockenberg en Bärenstein, zie Tabel 2), volgens het hierboven besproken protocol. Verder is door Arnaud Laudelot (Natagora) een aantal Belgische monsters aangeleverd uit een kweekprogramma, met als herkomst een populatie in de regio Luik. Van de populaties in deze regio is bekend dat ze sterk bedreigd worden door fragmentatie en zeer beperkt zijn in omvang. De naburige populaties rond Aken en Luik werden als referentie gebruikt om te kijken in hoeverre de hoeveelheid variatie in Nederlandse populaties afwijkend is en om de genetische structuur in en rond Nederland te onderzoeken (zijn populaties genetische verschillend van elkaar).

Referentiepopulaties Verder werd materiaal verzameld van enkele vermeende gezonde populaties, waarvan verwacht wordt dat deze niet genetisch verarmd zijn. Deze populaties dienden ter referentie om na te gaan in hoeverre de genetische status in de Nederlandse populaties reden is tot zorg. Het betrof een populatie in de Franse Creuse, waarvoor wangslijmvlies bemonsterd werd door Ben Crombaghs (Tabel 2), en monsters vanuit een Duits studie aan Geelbuikvuurpad voor de regio rond het Duitse Hannover (Weimann et al. 2009). Deze Duitse monsters werden beschikbaar gesteld door Heike Pröhl van de Duitse Universiteit van Veterinary Medicine in Hannover. Zij heeft van enkele monsters ook aangegeven wat de allellengtes zijn voor de verschillende monsters per merker, zodat deze gebruikt kunnen worden als referenties om in de toekomst datasets uit te wisselen.

Overige populaties Ben Crombaghs leverde swabs en enkele weefselmonsters van gestorven larven aan, van individuen uit zijn eigen kweekgroep. Uit hetzelfde kweekprogramma leverde hij drie dode juvenielen aan. Verder zijn er via RAVON ook wangslijmvlies-monsters aangeleverd van de Geelbuikvuurpad uit de dierentuin van Blijdorp. Deze monsters dienen ter verificatie van het mogelijk bijplaatsen of uitzetten van dieren afkomstig uit Slovenië en/of de Balkan in Nederlandse populaties, naar aanleiding van verschillende verklaringen daaromtrent (zie paragraaf 1.1.2). Om het eventuele bijplaatsen van Balkan/Sloveense dieren in Limburg gedurende de afgelopen decennia beter te kunnen testen is DNA onderzocht van dieren die door een particuliere eigenaar in de handel werden aangeboden en waarbij werd vermeld dat ze oorspronkelijk afkomstig zijn uit Slovenië (persoonlijke mededeling Wilbert Bosman). Onder hoge druk is (een deel van?) deze kweekgroep afgestaan aan Diergaarde Blijdorp en DNA monsters daarvan zijn in dit onderzoek als de populatie “Blijdorp” opgenomen.

2.1.2

Wangslijmvlies

Bemonstering van gevangen dieren gebeurde met behulp van een katoenen swab (cotton dry swab; producent: VWR International B.V., Amsterdam) of een wattenstaaf (zie Figuur 5). Om dit mogelijk te maken, werd het individu voorzichtig in de hand genomen en werd met een stomp element voorzichtig de mond geopend en open gehouden. De zwab of wattenstaaf werd vervolgens voorzichtig in de mond rondgedraaid. Hierna werden de staafjes in een bijbehorende buisje (met daarin toegevoegd enkele silica-korrels) geconserveerd en genummerd. De Franse monsters (Cruese, zie Tabel 2) zijn, in tegenstelling tot de andere monsters, opgeslagen in 2ml epjes gevuld met 96%-ethanol.

16


Figuur 5. Afname van wangslijmvlies-materiaal bij een Geelbuikvuurpad met behulp van een takje, het achtereind van een theelepeltje en een swab (Foto: Marinus Speelman).

2.1.3

Weefselmonsters

Weefselmonsters werden verkregen van de historische exemplaren uit de museumcollectie van Naturalis, als ook van de gestorven larven en juvenielen uit het kweekprogramma van Ben Crombaghs (voor aantallen zie Tabel 2). De collectie van Naturalis bestaat uit individuen die werden gefixeerd in formaline en vervolgens in ethanol bewaard. Van deze individuen zijn de tongen voor een deel verwijderd zonder de collectie te beschadigen. Dit is gedaan door met een pincet voorzichtig de bek te openen en de tong voorzichtig los te maken van de onderkaak met behulp van een scalpel (Figuur 5). Wanneer de tong eenmaal los was werd deze met behulp van het pincet gefixeerd en werd er voorzichtig een snede gemaakt in de tong, waardoor hier een stukje van los kwam (zie figuur 6). Het afgenomen tongweefsel is voor transport en opslag bewaard in 2 ml epjes gevuld met ethanol (96%). Van de gestorven larven en juvenielen uit het kweekprogramma werd een stukje weefsel verzameld en in ethanol opgeslagen.

17

Figuur 6. Het verwijderen van een stukje tongweefsel bij in Geelbuikvuurpad uit de collectie van het Nationaal Natuurhistorisch museum Naturalis (foto: Ivo Laros).

2.2

Genetische analyse

2.2.1

DNA isolatie

Afhankelijk van het type materiaal werd DNA-isolatie uitgevoerd met behulp van de D’neasy Blood and Tissue Kit, QIAamp DNA Investigator Kit en QIAamp DNA Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) Tissue Kit (Qiagen), volgens het protocol van de producent. Voorafgaand aan de isolatie zijn van de droog bewaarde swabs de toppen afgeknipt welke in 2ml epjes werden gedaan voor verdere isolatie. Op ethanol bewaarde swabs werden voorafgaand aan de isolatie droog gedraaid. De weefselmonsters werden drooggedept om zo veel mogelijk ethanol te verwijderen en overgezet in 2 ml epjes. De D’Neasy Blood and Tissue Kit is gebruikt om DNA te isoleren uit weefselmonsters (verkregen van de dode dieren uit het kweekpgramma). Zowel uit droge als uit op ethanol bewaarde swabs werd DNA geïsoleerd met behulp van de QIAamp DNA Investigator Kit. De laatst genoemde kit, de QIAamp DNA FFPE Tissue Kit, is toegepast op de historische weefselmonsters, omdat deze kit specifiek ontworpen is voor dergelijk materiaal.

2.2.2

Microsatelliet-analyse

Zes microsatelliet primerparen voor respectievelijk loci Bobom1A, Bobom5F, Bobom8A, Bobom9H, Bobom10F, Bobom12F, ontwikkeld voor de Roodbuikvuurpad Bombina bombina (Hauswaldt et al., 2007), zijn in dit onderzoek gebruikt. De zes primerparen zijn verdeeld over twee multiplexen, namelijk multiplex A en multiplex B (zie Tabel 3). Een multiplex is een Polymerase Ketting Reactie (PCR) mix welke meerdere primerparen bevat. Stukjes van het DNA zijn met behulp van de Polymerase Ketting Reactie (PCR) vermenigvuldigd, zodat ze zichtbaar konden worden gemaakt. De PCR-reacties werden uitgevoerd met 10 maal verdund DNA-isolaat voor de weefsels en onverdund DNA-isolaat voor de swabs in een totaal volume van 10 µl met een Biometra T3000 Thermocycler. Zowel multiplex A als multiplex B werden in PCR gezet met 2 µl 5x Flexi Buffer, 0.80 µl 25 mM MgCl2, 0.22 µl 10 mM dNTP’s-cocktail, 1 µl 10X Primer Mix, 0.05 µl 5 U/µl GoTaq-DNA polymerase. De PCR condities bestonden uit een initiële denaturatie van 70 seconden bij 96 oC gevolgd door 30 cycli van 30

18


seconden van 96 oC, 30 seconden bij een annealingtemperatuur (Ta) van 58 oC (welke per cycli 0.3 oC lager werd), 30 seconden bij 72 oC en een final elongation van 15 minuten bij 72 oC. De 5’ -end van elke Forwardprimer is gesynthetiseerd met een IRD 700 of een IRD 800 nm label (zie tabel 3). Voor multiplex A werd 1 µl van het amplicon na denaturatie zowel met 29 µl loading buffer (Formamide, Na 2EDTA en Broomphenol blauw) als met 9 µl loading buffer samengevoegd (om alle loci goed zichtbaar te maken). Voor multiplex B werd 1 µl van het amplicon na denaturatie in 9 µl loading buffer gedaan. Alle drie de mengsels werden vervolgens voor 4 minuten bij 95 oC opgekookt, waarna het voor minimaal 10 minuten in de vriezer werd gezet. Dit werd vervolgens geanalyseerd op een 25 cm lange sequencing gel (6,5 % polyacrylamide premix gel en 0.8xTBE) met behulp van de LICOR 4300 DNA analyser. Tijdens de electroforese werden consequent referentiemonsters gebruikt om de globale allellengtes van de monsters te kunnen bepalen (voor het volledige protocol zie bijlage IV). De monsters uit de regio Hannover zijn gebruikt om de exacte allellengtes te kunnen bepalen en daarmee alle monsters eenduidig met de Duitse studie te kunnen scoren (Hauswaldt et al., 2007).

Tabel 3. Beschrijving van de twee multiplexen en de zes gebruikte primerparen. De primerparen staan genoteerd in de 5’ naar de 3’ richting met hun nucleotide repeat, de toegepaste annealing temperatuur (T a oC) en fragmentlengte. Multiplex

Ta

Locus

Primer sequentie (5’ – 3’)

Nucleotide repeat

Label

o

( C) A

B

58,0

58,0

Fragment Range (bp)

Bobom9H

AACAGCCATTATTTAAAACCATTAG

(GATA)9TAAA(GATA)2GAAA(GATA)6

800

147–223

Bobom8A

CAATAAAGCAGTATTTCCCAAAATG AATTTCTTAGTGCTGCCAACTTGC

(AGAT)7AAAGAGAT(GATA)9

700

314–354

Bobom12F

GGGGAAGGGACATTTTAGCTACATAC ATAGGAGGTTTATAATGAAAGGGCAAC

(GATA)9

700

206–226

Bobom5F

GATTGGATTTGGGCTATGATATTCTG ATGAATTGGAAGGTAAGAACTTACACC

(GACA)13GGCA(GACA)7(GATA)14

700

130–153

Bobom1A

CAAATGATACAAATCAAGTGGAATGG ATGTGGCTTCCATTGACCTTTGC

(GATA)12

700

320–354

Bobom10F

CATGCCAAGAAGGATTGAGTCTGTC ATCCAACTTCAAATTCACAGGTCAC

(GATA)12

800

189–229

ACAAGGGATACCAGGAGAACAAAGC

2.2.3

Data-analyse

Voor de data-analyses zijn de monsters verwijderd welke voor meer dan twee loci niet gescoord konden worden. Alle zes de loci bleken een afwijking te hebben in de score (tussen de +1 en +4 baseparen) in vergelijking met de scores van de referentiemonsters van Heike Pröhl. Er is gekeken of het mogelijk is om de Alterra scores zo aan te passen dat ze in overeenstemming zijn met de scores van Heike Pröhl maar aangezien de verschuiving in de scores niet 100% consequent is, is dit niet mogelijk gebleken. Om fouten uit te sluiten binnen het lab van Alterra zijn alle referentie een tweede keer geanalyseerd, bij deze herhaling bleken de scores 100% reproduceerbaar te zijn. Dit resulteerde in een betrouwbare dataset die in totaal 246 monsters omvatte, afkomstig uit 16 populaties. Genetische variatie is gekarakteriseerd door het gemiddelde aantal allelen (N a), het aantal effectieve allelen (Ne), het percentage verwachtte heterozygoten (He), het percentage waargenomen heterozygoten (Ho),de fixatie index (F) en het percentage polymorfisme in de verschillende populaties te bepalen (programma GenAlEx, Peakall & Smouse 2001). Het aantal allelen per microsatelliet is een maat voor het aantal varianten dat van

19

een gen aanwezig is. Ne is in vergelijking met Na een maat voor het aantal allelen gecorrigeerd voor populatie grootte en is daardoor beter geschikt voor onderlinge vergelijking. Het percentage heterozygoten geeft een indruk van het aantal individuen in de populatie dat over twee verschillende varianten van een gen beschikt (tegenover de individuen die voor een gen twee dezelfde varianten bezitten: homozygoten). De fixatie index F is een indicator voor afwijkingen van random paring: F = 1- Ho/He. Een F>0 geeft aan dat er meer homozygoten zijn dan verwacht, dit kan bijv. komen door inteelt. Een F<0 geeft aan dat er een heterozygoten overschot is. Het percentage polymorfisme is het percentage van het aantal loci welke meerdere verschillende varianten kennen (tegen een monomorf locus wat dus maar een variant kent). Om de relatie tussen populaties te onderzoeken is een Bayesiaanse clusteranalyse toegepast. Het programma Structure (Pritchard et al. 2000) veronderstelt een verdeling in K populaties, welke gekarakteriseerd worden door de allel frequenties van een set van onafhankelijke merkers. De waarde voor K is vooraf op te geven, zodat resultaten voor een aantal verschillende K-waarden kunnen worden vergeleken, en het optimale aantal clusters kan worden bepaald aan de hand van een kwaliteitsscore van het berekende model. Het resultaat is een onderverdeling van de totale dataset in een optimaal aantal clusters (genenpoelen), waarbij voor elk van de 16 vooraf gedefineerde populaties wordt aangegeven welk percentage van de monsters aan een bepaald cluster worden toegewezen. Naast deze Bayesiaanse cluster-procedure is op de dataset een PCO analyse uitgevoerd. Voor de Principale Coördinaten Analyse (PCO) is gebruik gemaakt van het programma GenAlEx (Peakall & Smouse, 2001). Hierbij wordt eerst de onderlinge genetische afstand tussen alle 246 individuen bepaald en vervolgens is daar met behulp van de PCO structuur in aangebracht. De PCO is een multivariate analyse die probeert de variatie in een dataset zo te combineren en te groeperen dat een inzichtelijker patroon ontstaat. Vaak wordt een PCO analyse grafisch weergegeven door de score van de individuele monsters op de eerste en tweede coördinaten-as weer te geven.

Foto: DNA analyse op het Alterra laboratorium (Foto Ivo Laros).

20


3

Resultaten

Van de meeste populaties zijn voldoende monsters verzameld, welke ook kwalitatief goed DNA opleverden om een helder inzicht in de genetische status van die populaties te krijgen. Van enkele populaties zijn minder dan 10 monsters verzameld of succesvol geanalyseerd, wat de betrouwbaarheid van de berekende waarden voor genetische variatie en heterozygositeit negatief beïnvloedt. Dit betreft Oberkircher Sandsteinbrüche (nabij Hannover), met slechts 3 monsters, als ook de andere Duitse populaties rond Hannover (5 monsters) en Bärenstein (Aken). Omdat ze wel indicatief zijn, worden ze wel als volwaardige populaties in dit hoofdstuk meegenomen. Echter, met betrekking tot de conclusies dient voor deze populaties dus een slag om de arm te worden gehouden. Naast enkele Duitse populaties waarvan te weinig monsters zijn verkregen, zijn helaas helemaal geen bruikbare monsters beschikbaar van het Nationaal Natuurhistorisch Museum Naturalis. De dode exemplaren in de collectie zijn naar alle waarschijnlijkheid oorspronkelijk geconserveerd in formaline, wat als bijeffect heeft dat het DNA afbreekt.

3.1 Genetische diversiteit Nederlandse populaties De waarden voor de verschillende parameters van genetische diversiteit zijn weergegeven in tabel 4. Het aantal aangetroffen allelen per locus zit voor de Nederlandse populaties in de range van 2,0 tot 3,3. Het aantal effectieve allelen per subpopulatie is iets lager, met een range van 1,8 - 2,1 allel per locus. De waargenomen heterozygositeit ligt met een range van 0,45 - 0,51 iets hoger dan de verwachte heterozygositeit (range 0,410,45), wat resulteerde in een negatieve fixatie-index F. In drie subpopulaties was het percentage polymorfisme geen 100%. Dit heeft met name betrekking op het weinig variabele locus Bobom 1A waarvan maar 3 allelen zijn aangetroffen in de gehele studie en het merendeel van de onderzochte populaties slechts 1 variant bevat.

Naburige populaties De diversiteit en heterozygositeit voor de populaties rond Aken valt in dezelfde range als voor de Nederlandse populaties. De populatie Bärenstein laat een sterk negatieve fixatie-index zien. Dit houdt mogelijk verband met de kleine steekproefgrootte. De Belgische kweekpopulatie is van alle onderzochte populaties in deze studie genetisch het meest verarmd. Het aantal aangetroffen allelen per locus (Na en Ne) is zeer gering, en dat is dan ook direct terug te zien in de heterozygositeit (Ho en He), welke ook de laagste is van deze studie.

Referentiepopulaties Van de populaties rond Hannover zijn Doberg en Oberkircher Sandsteinbrüche weinig heterogeen (lage heterozygositeitswaarden). Voor Oberkircher Sandsteinbrüche zal de geringe steekproefgrootte daarbij een rol kunnen spelen (zie ook discussie in paragraaf 4.1). Voor de populatie Liekwegen werd de hoogste diversiteit (Na = 3.33; Ne = 2.52) en heterozygositeit (Ho = 0.60) waargenomen van alle onderzochte populaties. De Franse populatie zit qua aantal allelen aan de lage kant. Dit vertaalt zich ook in de heterozygositeit, welke ook gering is.

Overige populaties Het Nederlandse kweekprogramma en ook de dieren van Blijdorp zitten qua genetische diversiteit in dezelfde range als de Nederlandse subpopulaties. In het kweekprogramma zijn vijf maal twee identieke genotypen, of te wel, vijf dieren hebben een genetisch identieke tegenhanger. Waarschijnlijk gaat het hier om eiklomp-

21

verwanten, met dezelfde ouders. Dit heeft wel tot gevolg dat de genetische diversiteit en -differentiatie enigszins beïnvloed kan worden doordat de onderlinge verwantschap verhoogd is.

Tabel 4. Genetische variatie in de Geelbuikvuurpad populaties gebaseerd op zes microsatelliet loci. n, aantal individuen; Na, gemiddeld aantal allelen per locus; Ne, effectieve aantal allelen per locus; He, verwachtte heterozygositeit; Ho, waargenomen heterozygositeit; F, Fixatie-index; %P, percentage polymorfisme. Populatie

n

Na

Ne

He

Ho

F

%P

Nederland  Meertensgroeve  Wahlwiller  Gerendal  Berghofwei  ‘t Rooth  Museum (weefsel)

10 17 36 35 33 0

3.00 2.33 3.33 2.33 2.00 -

2.07 2.00 2.10 2.04 1.83 -

0.44 0.45 0.45 0.44 0.41 -

0.48 0.47 0.51 0.45 0.45 -

-0.08 -0.04 -0.09 -0.01 -0.10 -

100.00 83.33 100.00 83.33 83.33 -

Duitsland, regio Aken o Binsfelthammer o Brockenberg o Bärenstein

16 15 7

3.00 2.83 2.50

2.19 1.80 2.10

0.46 0.36 0.45

0.49 0.36 0.60

-0.07 0.05 -0.33

83.33 83.33 83.33

België (kweekprogramma Luik)

11

1.83

1.37

0.22

0.27

-0.21

66.67

Duitsland, regio Hannover o Liekwegen o Oberkircher Sandsteinbrüche o Messingberg o Doberg

5 3 5 5

3.33 2.00 2.83 1.83

2.52 1.76 2.24 1.58

0.52 0.27 0.47 0.26

0.60 0.39 0.44 0.37

-0.13 -0.41 0.09 -0.40

100.00 50.00 83.33 50.00

Frankrijk (Creuse)

23

2.67

1.68

0.34

0.32

0.01

83.33


10

2.67

1.95

0.41

0.50

-0.21

83.33

NL kweekprogramma

15

3.00

1.91

0.41

0.43

-0.09

100.00

In tabel 5 is het aantal allelen (varianten) per locus weergegeven. Locus Bobom 10F is met 10 aangetroffen allelen het meest variabel, locus Bobom 1A is met slechts 3 allelen het minst variabel. In tabel 5 is ook de lengte van de fragmenten weergegeven in baseparen (bp) . Figuur 7 laat per locus zien welke allelen in welke populaties zijn aangetroffen. Kwam een allel voor in een populatie, dan is deze aangeven met een zwart blok. Dit geeft een indicatie van de aanwezige variatie (maar let op: het is mogelijk dat een bepaald allel slechts eenmaal is aangetroffen, en dat andere allelen veel algemener in de populatie voorkomen). Daarnaast geeft dit overzicht een beeld van de aanwezigheid van kenmerkende of unieke varianten in bepaalde populaties. Voor locus Bobom 10F is bijvoorbeeld allel 201 in alle Nederlandse subpopulaties aangetroffen, maar in geen enkele andere populatie. Daarmee is deze variant kenmerkend voor de Nederlandse populatie. Opvallend is verder dat de populatie van Gerendal voor de loci Bobom 10F, 12F, en 8A allelen kent die nergens anders worden aangetroffen (unieke allelen). Het Nederlandse kweekprogramma heeft voor Bobom 9H een variant die

22


uniek is. Daarnaast deelt de kweekgroep voor Bobom 1A en 8A gemeenschappelijke allelen met de populaties van Gerendal en Meertensgroeve. Duidelijk is ook dat de geërodeerde populatie van België nog maar weinig varianten kent voor de verschillende loci, zoals ook al bleek uit de zeer beperkte waarden voor het aantal allelen en de heterozygositeit (N en Na, Ho en He; Tabel 4).

Tabel 5. Allel diversiteit van zes microsatelliet loci gebaseerd op 246 individuen. Zie ook tabel 3. Locus Bobom 9H Bobom 8A Bobom 12F Bobom 5F Bobom 1A Bobom 10F

Allelen aantal 8 9 6 7 3 10

Range (min – max) per populatie 2-4 1-5 1-5 1-4 1-2 1-5

Fragment Range (bp) 141-201 288-332 212-232 90-154 320-340 185-225

23

Bobom 10F

Bobom 12F

185 189 193 201 205 209 213 217 221 225

Berghofweide (NL) Gerendal (NL) Meertensgroeve (NL) t Rooth (NL) Wahlwiller (NL) NL kweekprogramma (Ben Crombaghs)

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

Bärenstein (DU; Aken) Binsfelthammer (DU; Aken) Brockenberg (DU; Aken) Doberg (DU; Hannover) Liekwegen (DU; Hannover) Messingberg (DU; Hannover) Obernkirchner Sandsteinbrüche (DU; Hannover)

x x

212 216 220 224 228 232

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x x

x


x

Frankrijk (Creuse)

x

x

x

x

x

x


x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

Bobom 1A x

Bärenstein (DU; Aken) Binsfelthammer (DU; Aken) Brockenberg (DU; Aken)

x

x

x

x

Bobom 5F

320 336 340


x

90 114 118 138 142 146 154 x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x x

x

x

x

x

x

x

x

Doberg (DU; Hannover) Liekwegen (DU; Hannover) Messingberg (DU; Hannover) Obernkirchner Sandsteinbrüche (DU; Hannover)

x

x

x


x

x

x

Frankrijk (Creuse)

x

x

x

x


x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

Bobom 8A

x

x

Bobom 9H

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

141 149 153 157 161 165 169 201

x x

Bärenstein (DU; Aken) Binsfelthammer (DU; Aken) Brockenberg (DU; Aken) Doberg (DU; Hannover) Liekwegen (DU; Hannover) Messingberg (DU; Hannover) Obernkirchner Sandsteinbrüche (DU; Hannover)

x

x

288 292 296 304 316 320 324 328 332


x x

x

x

x

x x

x

x

x

België (kweekprogramma Luik) x


x

x

x

Frankrijk (Creuse)

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x x

Figuur 7. Aan of afwezigheid van allelen van zes microsatelliet loci in 16 populaties. Zwarte blokjes duiden op aanwezigheid van een allel en witte blokjes op afwezigheid. Zie tabel 5 voor specifieke informatie.

24


3.2 Genetische verwantschap Voor verdere populatie-genetische analyse van de dataset is verondersteld dat alle individuen tot één grote populatie behoren. Binnen deze populatie is structuur aangebracht door genetisch verwante dieren te groeperen in clusters (of wel genenpoelen, groepen individuen die genetisch meer op elkaar lijken), en vervolgens te kijken hoe deze clusters zich verhielden tot de oorspronkelijk gedefinieerde herkomstpopulaties. Hiervoor zijn de volgende twee methoden gebruikt: de Bayesian Cluster Analyse en de Principale Coördinaten Analyse. Beide methoden hebben hun eigen voordelen met betrekking tot het inzichtelijk krijgen van populatiegenetische structuren.

3.2.1 Bayesiaanse cluster-analyse Clusteranalyse in het programma Structure (Pritchard et al. 2000) gaf aan dat de meest optimale indeling zich rond de 7 clusters bevond. In figuur 8 zijn de resultaten weergegeven voor een indeling in 2 respectievelijk 7 clusters (met elk een eigen kleur). Elke verticale lijn betreft een individu; de hoeveelheid kleuren per balk geeft aan in welke mate dat individu tot elk van de clusters wordt gerekend. Duidelijk is dat, indien het programma een indeling in 2 groepen aanhoudt, de Nederlandse populaties samen met het kweekprogramma en Blijdorp tot één groep worden gerekend (het oranje cluster), en dat de overige populaties samen een tweede groep vormen (het blauwe cluster). Echter, in beide clusters zijn balken waarneembaar die deels een andere kleur hebben, oftewel een gedeeltelijke overeenkomst vertonen met het andere cluster. Indien daarin meer substructuur wordt aangebracht door dit uit te werken naar 7 groepen dan blijven de Nederlandse subpopulaties herkenbaar (zij het dat elk individu wordt toegewezen aan drie clusters). De overige populaties krijgen echter met name meer structuur. Om de K=7 variant in figuur 8 wat leesbaarder te krijgen is deze ook als tabel weergegeven in tabel 6. De toewijzingen van een populatie aan diverse clusters zijn hierbij vervangen door percentages, welke per populatie optellen tot 1 (100%). De Nederlandse kweekpopulatie is een heterogeen mengsel van dieren die verwant zijn aan de clusters geel, groen en blauw. De Belgische kweekpopulatie wordt prominent in één cluster ingedeeld (roze, 88%). De populaties Creuse (rood), Aken (paars) en regio Hannover (oranje) zijn nu allemaal beter uniek herkenbaar. Opvallend is echter de indeling van Doberg (regio Hannover), die voor 91% wordt toegewezen tot hetzelfde cluster als de populaties rond Aken. Ook de populatie bij Oberkircher Sandsteinbrüche heeft kenmerken van de Aken populatie.

Figuur 8. Structure analyse: volgens het programma Structure verklaart een indeling in zeven clusters het beste de aanwezige variatie (elke verticale lijn stelt een geanalyseerd monster voor). Zowel voor dit aantal clusters (K=7), als voor een opsplitsing in twee clusters (K=2) zijn hieronder de resultaten weergegeven.

25

Tabel 6. Samenvatting van de resultaten van een Bayesian cluster analyse met behulp van het programma Structure voor K=7 genetische clusters. Clusters-namen komen overeen met de kleuren in Figuur 8 (K=7). Populatie

Genetisch cluster Roze Groen

Oranje

Blauw

Geel

Nederland  Meertensgroeve  Wahlwiller  Gerendal  Berghofwei  ‘t Rooth  Museum (weefsel)

0.141 0.056 0.150 0.061 0.033 -

0.297 0.217 0.292 0.306 0.168 -

0.196 0.136 0.257 0.276 0.283 -

0.044 0.068 0.013 0.051 0.019 -

0.134 0.456 0.244 0.244 0.416 -

0.154 0.021 0.026 0.036 0.019 -

0.036 0.046 0.018 0.024 0.062 -

Duitsland, regio Aken o Binsfelthammer o Brockenberg o Bärenstein

0.072 0.113 0.027

0.042 0.040 0.023

0.034 0.027 0.016

0.321 0.352 0.124

0.027 0.032 0.011

0.469 0.351 0.780

0.035 0.085 0.020


0.025

0.012

0.009

0.883

0.014

0.017

0.040

0.867 0.369

0.016 0.043

0.018 0.030

0.043 0.365

0.015 0.029

0.019 0.127

0.021 0.039

0.812 0.016

0.024 0.017

0.032 0.019

0.058 0.009

0.047 0.014

0.011 0.908

0.016 0.017

Frankrijk (Creuse)

0.028

0.029

0.029

0.078

0.027

0.057

0.753


0.138

0.252

0.488

0.014

0.073

0.015

0.020

NL kweekprogramma

0.170

0.294

0.163

0.024

0.127

0.192

0.029

Duitsland, regio Hannover o Liekwegen o Oberkircher Sandsteinbrüche o Messingberg o Doberg

Paars

Rood

3.2.2 Principale Coördinaten Analyse Bij de Principale Coördinaten Analyse worden de verschillen in genetische samenstelling tussen individuen uitgezet op twee assen (figuren 9 t/m 13). Deze twee assen verklaren de meeste variatie in de data. Het is echter mogelijk dat individuen (punten) die dicht bij elkaar worden geplot in deze X-Y grafiek in werkelijkheid op de niet weergegeven Z-as (3e dimensie) uit elkaar liggen. In figuur 9 zijn alle bemonsterde populaties en hun genetische variatie weergegeven. Dit resulteerde in een grote brei van punten zonder goed overzicht. Figuur 10 bevat dezelfde informatie, maar dan met een weergave op landsniveau (met uitzondering van Hannover en Aken, die geografisch ver uiteen liggen). Deze figuur toont al meer structuur en komt redelijk overeen met de k=2 indeling van figuur 8, waarbij Nederland, Blijdorp en het Nederlands kweekprogramma zich als cluster wat afzonderen van de overige populaties. De volgende PCO figuren betreffen wat meer toegespitste analyses. In figuur 11 zijn de afzonderlijke Nederlandse subpopulaties weergegeven, samen met de Blijdorp populatie en de Nederlandse kweekpopulatie. Er is een grote overlap zichtbaar tussen vrijwel alle populaties. Alleen tussen de populaties ’t Rooth en Berhofweide is minder overlap, en de kweekgroep clustert deels apart in de bovenhoek. Blijdorp valt geheel midden tussen de andere populaties.

26


Mede gezien de resultaten van tabel 6, waaruit blijkt dat er een verwantschap lijkt te bestaan tussen de Nederlandse kweekgroep en de populaties rond Aken, zijn deze populaties gezamenlijk geanalyseerd in Figuur 12. Er is inderdaad vooral een sterke associatie tussen de kweekgroep en de regio Aken. Wel moet opgemerkt worden dat ook enkele Nederlandse dieren, met name afkomstig uit Berghofweide, Meertensgroeve en Gerendal, in het Aken cluster worden geplot. Vanwege de vreemde resultaten van tabel 6 waarin met name Doberg, en in mindere mate Oberkircher Sandsteinbrüche, verwantschap vertoonden met de Aken populaties zijn ook deze groepen apart geplot in Figuur 13. Hoewel enkele populaties apart clusteren (Messingberg en Doberg) is het duidelijke onderscheid tussen de clusters Hannover en Aken/Doberg/ Oberkircher Sandsteinbrüche niet uit deze figuur op te maken.

Bärenstein België Berghofwei

PCO 2

Binsfelthammer Blijdorp Brockenberg Creuse Doberg Gerendal

PCO 1 Figuur 9. Scores van individuele Geelbuikvuurpad genotypen van alle bemonsterde populaties (weergave per populatie) op de eerste twee assen van een Principale Coördinaten Analyse. De assen verklaren 47.87 % van de totale variatie. Kweek BC = Nederlandse kweekgroep.

27

PCO 2

Aken België Frankrijk Hannover Kweek BC Nederland Blijdorp

PCO 1 Figuur 10. Scores van individuele Geelbuikvuurpad genotypen van alle bemonsterde populaties (weergave per land of herkomst, met uitzondering van Duitsland, dat is opgedeeld in de regio’s Hannover en Aken) op de eerste twee assen van een Principale Coördinaten Analyse. De assen verklaren 47.81% van de totale variatie. Kweek BC = Nederlandse kweekgroep.

Figuur 11. Scores van individuele Geelbuikvuurpad genotypen van alle Nederlandse bemonsterde populaties (weergave per populatie) op de eerste twee assen van een Principale Coördinaten Analyse. De assen verklaren 48,80 % van de totale variatie. Kweek BC = Nederlandse kweekgroep.

28


Aken

PCO 2

Kweek BC Nederland

PCO 1 Figuur 12. Scores van individuele Geelbuikvuurpad genotypen van de bemonsterde populaties uit Nederland, Aken en de Nederlandse kweekgroep (kweek BC) op de eerste twee assen van een Principale Coördinaten Analyse. De assen verklaren 49.83% van de totale variatie.

Bärenstein Binsfelthammer

PCO 2

Brockenberg Doberg

PCO 1 Figuur 13. Scores van individuele Geelbuikvuurpad genotypen van de Duitse bemonsterde populaties op de eerste twee assen van een Principale Coördinaten Analyse. De assen verklaren 49.23% van de totale variatie.

29

3.2.3 Genetische differentiatie Voor de dataset is ook de mate van genetische differentiatie (Fst) tussen populaties berekend. De Fst varieert tussen de uitersten 0 (de frequenties voor de verschillende allelen zijn hetzelfde in beide populaties, wat er op wijst dat ze een geheel vormen (Fst = 0) en 1 (elke populatie gefixeerd voor eigen allelen; maximale differentiatie). Paarsgewijze differentiaties voor de bemonsterde populaties zijn terug te vinden in tabellen 6 en 7. Hartl & Clark (1997) hanteren de volgende vuistregel voor interpretatie van dergeljke Fst-waarden: Fst van 0-0.05 geringe differentiatie; 0.05-0.15 matige differentiatie; 0.15-0.25 grote differentiatie en >0.25 zeer grote differentiatie. Uit tabel 7 blijkt dat er veel populaties zijn die in redelijke tot sterke mate genetisch van elkaar gedifferentieerd zijn. Met name de Belgische kweekpopulatie, en de populaties uit Messingberg en Obernkirchner Sandsteinbrüche wijken sterk af ten opzichte van een groot aantal andere populaties (Fst van >0,15 ten opzichte van 12 van de 16 onderzochte populaties). Echter, wanneer gekeken wordt naar de onderlinge verhoudingen tussen de Nederlandse populaties blijkt er slechts sprake te zijn van een geringe tot matige differentiatie (<0.15). Op landsniveau (tabel 8) vertoont de Nederlandse populatie ook slechts een geringe genetische differentiatie ten opzichte van de buitenlandse groepen, met als enige uitzondering een afwijking van de Belgische kweekgroep (Fst=0.18). De monsters uit Blijdorp tonen een matige differentiatie ten opzichte van de Nederlandse populaties, als ook ten opzichte van het Nederlandse kweekprogramma, terwijl deze monsters een grote differentiatie vertonen te opzichte van de buitenlandse populaties. De monsters uit het Nederlandse kweekprogramma zijn zeer uniform en vertonen slechts een grote genetische differentiatie ten opzichte van drie populaties, namelijk het Belgische kweekprogramma, Messingberg en Obernkirchner Sandsteinbrüche. De populaties uit de omgeving van Aken (Binsfelthammer, Brockenberg en Bärenstein) hebben ten opzichte van elkaar een Fst van <0.15 (geringe tot matige differentiatie). Wanneer gekeken wordt naar de populaties uit de omgeving van Hannover (Liekwegen, Oberkircher Sandsteinbrücke, Messingberg en Doberg), valt de zeer grote onderlinge genetische differentiatie meteen op. Wanneer de Hannover populatie wordt vergeleken met de andere populaties op landsniveau is echter slechts geringe tot matige differentiatie zichtbaar (zie tabel 8). De meest extreme genetische differentiatie wordt waargenomen bij de populatie uit Doberg. Deze populatie vertoont vier maal een zeer grote genetische differentiatie (>0.25) waarvan twee maal ten opzichte van een naast gelegen buurpopulatie.

30


België (12) Creuse (7)

0.20

Bärenstein (7)

0.22

0.17

Binsfelthammer (2)

0.11

0.10

0.07

Brockenberg (3)

0.12

0.08

0.10

0.05

Doberg (12)

0.38

0.22

0.16

0.18

0.16

Liekwegen (1)

0.12

0.08

0.11

0.06

0.07

0.14

Messingberg (12)

0.18

0.19

0.21

0.14

0.19

0.31

0.10

Obernk.S.brüche (12)

0.20

0.17

0.21

0.12

0.11

0.28

0.12

0.21

Berghofweide (5)

0.21

0.17

0.11

0.08

0.11

0.21

0.10

0.16

0.22

Gerendal (3)

0.22

0.12

0.09

0.08

0.10

0.12

0.08

0.17

0.17

0.03

Meertensgroeve (3)

0.15

0.11

0.07

0.06

0.07

0.14

0.07

0.16

0.18

0.02

0.02

t Rooth (5)

0.25

0.12

0.15

0.10

0.13

0.18

0.09

0.16

0.22

0.06

0.03

0.06

Wahlwiller (3)

0.18

0.11

0.13

0.07

0.11

0.21

0.07

0.14

0.19

0.04

0.03

0.04

0.04

Blijdorp (9)

0.34

0.25

0.17

0.15

0.21

0.26

0.15

0.17

0.23

0.07

0.08

0.11

0.10

0.12

NL Kweek (4)

0.17

0.12

0.08

0.07

0.08

0.15

0.09

0.20

0.20

0.04

0.04

0.01

0.08

0.06

0.14

Aken (1x)

0,00

België (4x)

0,11 0,00

Frankrijk (2x)

0,09 0,20 0,00

Hannover (0x)

0,04 0,12 0,08 0,00

Blijdorp

Nederland

NL Kweek

Hannover

Frankrijk

België

Aken

Tabel 8. Genetische differentiatie (Fst) van Geelbuikvuurpad populaties per land. Vet = Fst >0,15 // Vet en onderlijnt = Fst >0,25: redelijke tot grote onderlinge genetische differentiatie, (Fst waardes staan onder de diagonaal). Achter de populatienamen staat tussen haken ten opzichte van hoeveel populaties de betreffende populatie een redelijke tot grote genetische differentiatie heeft (Fst > 0,15).

NL Kweek (1x) 0,06 0,17 0,12 0,09 0,00 Nederland (1x) 0,06 0,18 0,10 0,05 0,04 0,00 Blijdorp (3x)

0,16 0,34 0,25 0,10 0,14 0,07 0,00

31

NL Kweek

Blijdorp

Wahlwiller

t Rooth

Meertensgroeve

Gerendal

Berghofweide

Obern. Sandsteinbrüche

Messingberg

Liekwegen

Doberg

Brockenberg

Binsfelthammer

Bärenstein

Creuse

België

Tabel 7. Paarsgewijze genetische differentiatie (Fst) van Geelbuikvuurpad populaties. Vet = Fst >0,15 // Vet en onderlijnd = Fst >0,25: redelijke tot grote onderlinge genetische differentiatie, (Fst waardes staan onder de diagonaal). Achter de populatienamen (Y-as) staat tussen haken het aantal keer dat een populatie een redelijke tot grote genetische differentiatie kent ten opzichte van de andere poplaties (Fst > 0,15).

4

Discussie, conclusies & aanbevelingen

4.1

Genetische variatie

De resultaten voor de genetische variatie zoals aangetroffen in dit onderzoek zijn weergegeven in paragraaf 3.1 en tabel 4. Om deze resultaten goed te kunnen interpreteren dienen deze geplaatst te worden in de context van andere (genetische) studies naar dezelfde soort of diens naaste verwanten. Voor de Bruine kikker Rana temporaria werd in een recente microsatelliet studie naar genetische uitwisseling in Zweden (Richter-Boix et al, 2010) voor de verwachte heterozygositeit een range van 0,52-0,63 gevonden, en voor de waargenomen heterozygositeit een range van 0,53-0,65. Voor de Roodbuikvuurpad (Bombina bombina) zijn twee artikelen verschenen waarin microsatelliet merkers worden beschreven en de aanwezige heterozygositeit wordt getest. Stuckas en Tiedemann (2006) hebben acht microsatellieten ontwikkeld en getest op een kleine set monsters van Roodbuikvuurpad. De verwachte heterozygositeit lag in de range van 0,41-0,80 en de waargenomen heterozygositeit in de range van 0,27-0,70. Hauswaldt et al (2007) hebben negen extra microsatelliet-primers ontwikkeld. De verwachte heterozygositeit lag in de range van 0,50-0,87 en de waargenomen heterozygositeit in de range van 0,47-0,91. Zeven van de merkers ontwikkeld door Hauswaldt et al. (2007) bleken ook variatie op te leveren (polymorf) voor Geelbuikvuurpad en zijn dan ook in de Nederlandse studie gebruikt. Een deel van deze merkers is ook gebruikt voor de eerdere studie naar Geelbuikvuurpad in de regio Hannover (Weimann et al 2009). In deze studie is de microsatellietvariatie van 150 monsters uit 11 subpopulaties rond Hannover onderzocht. Voor een aantal merkers die zowel in de Duitse als in onze studie werden gebruikt, werd rond Hannover een groter aantal aangetroffen, voor één merker (Bobom 10F) was het omgekeerde het geval. Van de vier zeer variabele subpopulaties betrokken in de Hannover studie zijn van ieder vijf referentiemonsters ontvangen voor deze studie. In tabel 9 zijn de resultaten uit dit onderzoek afgezet tegen de resultaten uit Weimann et al (2009). Hieruit is op te maken dat vooral het aantal geanalyseerde monsters sterk verschilt, aangezien wij slechts een subset van de in de Hannover studie betrokken monsters hebben onderzocht. Dat een gering aantal monsters ook consequenties heeft voor een goede weergave van de aanwezige genetische variatie in een populatie moge duidelijk zijn. De resultaten van Oberkircher Sandsteinbrüche. verschillen het meest van elkaar maar dat kan eenvoudig worden verklaard doordat er in deze studie slecht drie monsters zijn geanalyseerd. De waarden voor het aantal effectieve allelen (Ne) en ook de Heterozygositeit (Ho en He) zijn in dit onderzoek iets lager. Dit kan worden verklaard doordat er minder monsters zijn onderzocht en dus monsters met andere allelen zijn gemist. Daarnaast zijn door Weimann et al . (2009) ook extra microsatelliet primers gebruikt in het onderzoek. Oberkircher Sandsteinbrüche buiten beschouwing latend zijn de verschillen wel consistent: Liekwegen, Messingberg en Doberg tonen ten opzichte van elkaar dezelfde resultaten waarbij Liekwegen het meest variabel is en Doberg het minst. Tabel 9: Vergelijking tussen waarden voor de populaties zoals gepubliceerd in Weimann et al (2009; Wm) en dit onderzoek (Alt). n = aantal monsters; Ne = aantal effectieve allelen; Ho = waargenomen heterozygositeit; He = verwachte heterozygositeit. n (Wm)

n (Alt)

Ne (Wm)

Ne (Alt)

Ho (Wm)

Ho (Alt)

He (Wm)

He(Alt)

Liekwegen

13

5

2,83

2,52

0,49

0,60

0,50

0,52

Oberkircher Sandsteinbrüche

14

3

3,31

1,76

0,59

0,39

0,53

0,27

Messingberg

12

5

2,53

2,24

0,57

0,44

0,51

0,47

Doberg

15

5

2,07

1,58

0,33

0,37

0,33

0,26

32


Al met al kan geconcludeerd worden dat de in dit onderzoek gevonden waarden voor genetische variatie bij Geelbuikvuurpad redelijk tot matig is ten opzichte van waarden aangetroffen bij andere soorten. Binnen onze studie aan Geelbuikvuurpad lijken de Nederlandse populaties te beschikken over een vrij redelijke genetische variatie. De variatie in de naburige populaties is ongeveer gelijk (Aken) of zelfs veel lager (Luik). De referentiepopulatie in Frankrijk, die als gezond verondersteld werd, heeft eveneens een veel lagere variatie. De door Weimann et al. (2009) aangetroffen allelen-diversiteit rond Hannover was niet duidelijk hoger dan in Nederland, en de heterozygositeit was slechts heel iets hoger. Dit alles wijst erop dat verarming van de Nederlandse populaties op dit moment meevalt. Dit is verwonderlijk, gezien de zeer kleine populatiegrootte op de diverse Limburgse locaties. Er zijn meerdere redenen te bedenken waarom de Nederlandse subpopulaties toch nog kunnen beschikken over een redelijke genetische variatie. Het zou kunnen dat de populaties toch van voldoende omvang waren en daarmee het genetische kapitaal wisten veilig te stellen. Mogelijk speelt een sterke paring tussen genetisch verschillende individuen een rol bij het behoud van diversiteit ondanks de kleine populatiegrootte. De negatieve fixatie-index, aangetroffen voor een groot aantal populaties, duidt op een hogere aantal heterozygoten dan te verwachten is bij willekeurige paring. Een andere optie is dat dieren in staat blijken om grote afstanden en barrières te overbruggen om onderling uit te wisselen. Gezien de intensieve wijze van monitoring en de fysieke beperkingen van de soort is dit niet echt aannemelijk. Een tweede, en wellicht meer waarschijnlijke verklaring is dat er op kunstmatige wijze is uitgewisseld tussen de subpopulaties. Op deze manier wordt natuurlijke dispersie vervangen door menselijk handelen, maar is het effect hetzelfde: uitwisseling van dieren en vervolgens, na voortplanting, van genen. Voor deze verklaring zijn meer aanwijzingen beschikbaar. Ten eerste zijn er de nodige persoonlijke mededelingen dat dit heeft plaatsgevonden (zie 1.2). Daarnaast laat het genetisch onderzoek zien dat de Nederlandse populaties behoorlijk op elkaar lijken, maar elk een meervoudige oorsprong lijken te hebben (toewijzing aan meerdere clusters). Bovendien wijken ze gezamenlijk sterk af van de naburige buitenlandse populaties (figuur 8 & tabel 6). Dit wijst op een verschil in herkomst. In paragraaf 4.3 zal op deze patronen verder worden ingegaan. Een voorbehoud voor te positieve conclusies over de toekomst van de Nederlandse populaties is, dat de overeenkomstige variatie in Nederland en de gezond veronderstelde referentiepopulaties in het buitenland ook tot stand kan zijn gekomen door een gelijktijdige achteruitgang in deze referentiepopulaties. Voor Nederland lijkt dit niet waarschijnlijk, gezien de geringe genetische differentiatie van de Nederlandse populaties. In geval van sterke verarming in geïsoleerde populaties zou men differentiatie verwachten als gevolg van het feit dat door kans-effecten verschillende allelen overblijven in verschillende populaties. Een sterke verarming lijkt echter wel te hebben plaatsgevonden in met name de Franse referentiepopulatie, en deze populatie is dus minder gezond dan verwacht. Waarschijnlijk speelt hier fragmentatie een grote rol, aangezien de omvang van de totale populatie nog wel van behoorlijke aard lijkt te zijn (mededeling B. Crombaghs). Mogelijk is de Franse populatie opgedeeld in meerdere geïsoleerde fragmenten, waarvan slechts een deel is bemonsterd voor deze studie. De Belgische populatie betreft een groep van dieren welke uit een verarmde populatie in de regio Luik afkomstig is. Mogelijk is de genetische verarming al opgetreden in deze kleine en geïsoleerde populatie, maar het kan ook versterkt zijn in de kweek. In ieder geval is een dergelijke geringe genetische variatie wel een schoolvoorbeeld van wat er gebeurd in te kleine en geïsoleerde populaties (H1.2), en wat dus ook voor de afzonderlijke Nederlandse subpopulaties zou zijn verwacht indien er niet kunstmatig zou zijn uitgewisseld. De dieren uit Blijdorp en de dieren uit het Nederlandse kweekprogramma zitten qua genetische variatie in dezelfde range als de Nederlandse populatie. Opmerkelijk is dat vijf dieren uit het kweekprogramma een genetisch identieke tegenhanger hebben. Waarschijnlijk betreffen het dan ook nakomelingen uit een zelfde eiklomp, met dus dezelfde ouders.

33

4.2

Genetische differentiatie

De verwantschap tussen de populaties is uitgewerkt in hoofdstuk 3.2. Uit figuur 8 blijkt dat indien de onderzochte individuen in twee groepen moeten worden verdeeld dat dan de Nederlandse dieren apart worden ingedeeld ten opzichte van de buitenlandse referentiepopulaties. Klaarblijkelijk is de genetische structuur van de Nederlandse monsters dermate anders dat ze structureel afwijken van de buitenlandse populaties, en wel zo sterk dat de onderlinge verschillen tussen de buitenlandse referentiepopulaties kleiner zijn dan het verschil tussen Nederland en het buitenland. Dit is opvallend aangezien de Geelbuikvuurpad zich waarschijnlijk vanuit de Balkan en/of Zwarte Zee-regio geleidelijk over Europa heeft verspreidt sinds de laatste ijstijd (Fijarczik et al., 2011). Bij een dergelijk kolonisatiepatroon zou je een gelijkelijk afnemende genetische gelijkenis verwachten met toenemende geografische afstand (isolation by distance). Je zou dus verwachten dat dieren uit de regio rond Aken en Luik relatief sterk verwant zijn aan de Nederlandse, terwijl de populaties rond Hannover en in de Creuse genetisch sterker zouden moeten verschillen. Dit patroon komt niet terug in de data. Een gebrek aan isolation by distance is te verklaren door sterke genetische erosie, sterke geografische barrières, of sterke selectie en adaptatie in bepaalde deelgebieden. Dit lijkt voor de populaties in Limburg en Aken echter niet echt aan de orde te zijn. Ook voor bovenstaande bevindingen is de meest waarschijnlijke verklaring het op structurele wijze kunstmatig uitwisselen van individuen. Het gegeven dat Nederland al zo sterk afwijkt van de overige populaties waaronder het naburige Aken lijkt echter niet alleen door onderlinge translocaties tussen de Nederlandse subpopulaties te kunnen worden verklaart. Vrijwel zeker zijn voor het kunstmatig bijplaatsen ook dieren van niet-lokale herkomst gebruikt die zich succesvol hebben weten te handhaven. Deze hypothese wordt versterkt door de persoonlijke verklaringen (zie H 1.2) van het meenemen van individuen van Geelbuikvuurpad uit de Balkan en het uitzetten van nakomelingen daarvan in de Nederlandse subpopulaties. Opvallend is dat de dieren uit Blijdorp, waarvan werd aangenomen dat ze van Sloveense origine zijn, geheel samen clusteren met de Nederlandse populaties. Ook qua genetische differentiatie (Fst-waarden), is de Blijdorp populatie vrijwel gelijk aan de Nederlandse subpopulaties, terwijl ze wel degelijk redelijk tot sterk verschilt van de buitenlandse populaties. Op basis van Fst-waarden is de verwantschap met de Berghofweide (Fst = 0,07) en Gerendal (Fst=0,08) het sterkst. In principe zou men inderdaad een genetische verwantschap verwachten tussen Blijdorp en de wilde Nederlandse populaties, indien de padden uit Blijdorp inderdaad relatief recent uit Slovenië zijn gehaald, en de afgelopen decennia inderdaad dieren van Sloveense- of overig Balkan herkomst zijn bijgeplaatst in Nederland. In die zin lijken de resultaten dus een uitzet van materiaal van Balkan-origine in Nederland te bevestigen. Echter, het feit dat een zo sterke overlap wordt gevonden als hier het geval is, is op zijn minst opmerkelijk. Een mogelijkheid is dat uitzet van individuen uit de Balkan in wilde Nederlandse populaties zo succesvol was, of op een zodanig grote schaal plaatsvond, dat de Nederlandse populaties genetisch inmiddels niet meer te onderscheiden zijn van materiaal uit Slovenië. Minder uitzet van dergelijke Balkan-individuen in de buurlanden (Duitsland, Frankrijk, België) zou dan de sterke scheiding verklaren tussen Nederlandse populaties en de referentiepopulaties uit deze landen. Het is op basis van de genetische data echter eveneens zeer goed mogelijk dat de in Blijdorp opgevangen dieren, die oorspronkelijk door particulieren uit het wild zijn verzameld, helemaal niet uit de Balkan komen, maar in Nederland uit het wild zijn verzameld. De meest waarschijnlijke bron zou dan Berghofweide of Gerendal zijn (deze populaties zijn genetisch zeer vergelijkbaar, gezien hun geografische nabijheid waarschijnlijk als gevolg van regelmatige onderlinge uitwisseling). Om meer duidelijkheid te krijgen over de oorzaak van dit patroon, is gekeken naar resultaten op basis van mitochondriaal DNA (mtDNA), op basis van een studie door de Universiteit van Luik (Johan Michaux). mtDNA is minder onderhevig aan mutaties (conservatiever) in vergelijking met microsatellieten en daardoor beter bruikbaar voor taxonomisch onderzoek. Vanwege het belang voor dit rapport was Johan Michaux bereid enkele resultaten met betrekking tot de onduidelijke status van de Blijdorp dieren te delen. De conceptresultaten lijken de aanwezigheid van slechts een enkel haplotype (genetische variant) aan te tonen in alle onderzochte Europese populaties, inclusief zowel materiaal uit Blijdorp als uit een populatie in Kroatië (pers. comm. Johan

34


Michaux). Hierdoor biedt dit onderzoek geen nieuwe informatie over de status van de dieren uit Blijdorp, of het bijplaatsen van dieren in het wild in Nederland. Een studie van Fijarczik et al. (2011) toonde aan dat er inderdaad in heel West-Europa weinig variatie in het mtDNA aanwezig lijkt, maar dat grotere variatie wel voorkomt in de Zuidelijke en Oostelijke Balkan. Ook voor bewijsvoering op basis van mtDNA zou dus een uitgebreidere bemonstering van populaties in deze regio uitkomt kunnen bieden. Samengevat is de genetische structuur van de Nederlandse subpopulaties opvallend homogeen. Op basis van de kleine populatiegroottes zou verwacht kunnen worden dat genetische drift heeft geleid tot een sterke differentiatie tussen populaties, maar dit blijkt niet het geval. Dit is te verklaren op basis van de vele kunstmatige bijplaatsingen die in het verleden hebben plaatsgevonden. De afwijking van de Nederlandse populaties ten opzichte van populaties in buurlanden maakt het waarschijnlijk dat hierbij ook inmenging van dieren van niet-lokale herkomst heeft plaatsgevonden, maar op basis van de Blijdorp-populatie kan niet worden bewezen dat die herkomst Slovenië/Balkan betreft. Een sluitend bewijs zowel voor de herkomst van de populaties in Blijdorp als voor inmenging van Balkan-materiaal in Nederlandse wilde populaties, vereist directe bemonstering van populaties in de Balkan en een genetische vergelijking tussen die populaties en het materiaal uit Nederland. Ook ten opzichte van de meeste overige populaties (Nederlandse kweekgroep, regio Hannover en regio Aken) is de Nederlandse populatie nauwelijks gedifferentieerd (Fst waarden <0,07). Alleen ten opzichte van Frankrijk en de Belgische kweekpopulatie is sprake van respectievelijk matige (Fst = 0,10) of sterke (Fst = 0,18) differentiatie. Dit kan worden verklaard doordat de Franse en Belgische monsters uit kleine, genetisch geërodeerde populaties komen en zodoende door kanseffecten (genetic drift) steeds verder in allelverhoudingen gaan afwijken van andere populaties. Op het niveau van subpopulaties (tabel 7) zijn er enkele opmerkelijkheden. De onderlinge Fst waarden voor de Nederlandse subpopulaties zijn gering (Fst < 0,06) en suggereren dus een goede onderlinge uitwisseling. De Nederlandse kweekgroep vond zijn oorsprong in materiaal uit Wahlwiller, maar werd later aangevuld met materiaal uit diverse andere populaties (larven uit Berghofwei, Meertensgroeve en Curfsgroeve zijn toegevoegd aan het kweekprogramma, evenals enkele subadulten uit een poeltje in het gebied Lange Akkers, tussen de Meertensgroeve en de Curfsgroeve). De voor dit onderzoek bemonsterde individuen uit de kweekgroep laten echter met name een sterke verwantschap zien met de Meertensgroeve (Fst = 0.01). Dit is te verklaren uit het feit dat regelmatig uitwisseling heeft plaatsgevonden: meermaals is materiaal uit de Meertensgroeve in de kweekgroep opgenomen, en eveneens is meermaals kweekmateriaal uitgezet in de Meertensgroeve. Opvallend is wel dat de verwantschap van de kweekgroep met Wahlwiller relatief beperkt is. Dit is mogelijk te verklaren als gevolg van de kleine populatiegrootte van de kweekgroep (10-20 individuen), wat een grote kans oplevert op toevallige extinctie van allelen. Ook kan een verschil in reproductiesucces ertoe hebben geleid dat voornamelijk de genen van later ingebrachte individuen uit andere populaties zijn doorgegeven. Opmerkelijk is dat diverse Nederlandse populaties (Berghofweide, Gerendal, Meertensgroeve) enkele individuen bevatten die genetisch sterk overeenkomen met de clusters uit ofwel de regio Aken ofwel de regio Hannover (zie figuur 8 en 9). Hetzelfde geldt voor de Nederlandse kweekgroep, waarvan enkele individuen clusteren in dezelfde groep als de populaties rond Aken (figuur 12). Een mogelijke verklaring hiervoor is dat op enig moment kunstmatige uitzet heeft plaatsgevonden van Duitse individuen in een of meer Nederlandse populaties, of in het poeltje in de Lange Akkers dat gebruikt werd als bron voor de kweekgroep. Als gevolg van de kunstmatige uitwisseling tussen de diverse populaties via de kweekgroep is het goed mogelijk dat Duits genetische materiaal zich vervolgens heeft verspreid. Door de complexe historie en gebruik van de kweekgroep is echter geen uitspraak te doen over de exacte gang van zaken. De populaties rond Aken zijn nauwelijks van elkaar verschillend. In de regio Hannover valt de populatie Doberg op, die ten opzichte van het geografisch naburige Messingberg een zeer grote genetische differentiatie kent (Fst = 0,31). Dit is in lijn met de resultaten van Weimann et al. 2009 waarin Doberg tot een ander genetisch

35

cluster wordt gerekend als Liekwegen-Messingberg. Voor de onderlinge genetische verschillen kunnen genetische en ecologische verklaringen zijn, maar het is bekend dat er ook in deze regio kunstmatig dieren zijn bijgeplaatst met onbekende herkomst. Op basis van dit onderzoek lijkt er verwantschap te zijn tussen Doberg en het Aken cluster (tabel 6, cluster 6; figuur 8, k=7), maar hier zal gezien het doel van dit rapport niet verder op in worden gegaan.

4.3

Samenvatting en Conclusies

De belangrijkste bevindingen worden hieronder kort samengevat, gerangschikt op basis van de oorspronkelijke vraagstelling (paragraaf 1.3):

1) 



In de afgelopen decennia is de Nederlandse populatie sterk in aantal en verspreiding achteruit gegaan. Als gevolg van isolatie en te kleine populatieomvang ligt genetische verarming voor de hand. Dit zou resulteren in een afgenomen genetische variatie binnen populaties en een toegenomen onderlinge genetische differentiatie tussen populaties. In tegenstelling tot deze verwachting blijkt uit dit onderzoek dat de genetische variatie van de subpopulaties in Nederland redelijk is, en dat de onderlinge differentiatie laag is.

2)   

   



36

Differentiatie t.o.v. buitenland

De genetische variatie van de Nederlandse populatie is vergelijkbaar met die van onderzochte grotere referentiepopulaties uit de regio Hannover en Aken. De genetische variatie van de Creuse populatie in Frankrijk is iets lager, waarschijnlijk als gevolg van recente fragmentatie en afname populatieomvang. De genetische variatie van de kweekpopulatie in België met herkomst regio Luik is zeer gering en vrijwel zeker het gevolg van isolatie en kleine populatieomvang. Mogelijk is die verarming in de kweek versterkt. De genetische variatie van de Belgische populatie is zorgelijk en zou op korte termijn versterking behoeven. De variatie van de Nederlandse populaties is niet hoog maar vormt vooralsnog geen reden tot zorg. Hoewel de Nederlandse populaties genetisch weinig van de Duitse referentiepopulaties zijn gedifferentieerd, worden ze toch in de analyses als uniek cluster toegewezen. Klaarblijkelijk is de genetische structuur van de Nederlandse monsters dermate anders dat ze structureel afwijken van de buitenlandse populaties, en wel zo sterk dat de onderlinge verschillen tussen de buitenlandse referentiepopulaties kleiner zijn dan het verschil tussen Nederland en het Buitenland. Dit is opvallend omdat er normaal een relatie is tussen genetische afstand en geografische afstand.

3) 

Genetische variatie in Nederland

Bijplaatsingen

Een belangrijke verklaring voor deze bevindingen is het op structurele wijze kunstmatig beheren middels translocaties van de Nederlandse populatie, eventueel met dieren van niet-lokale herkomst. Dit wordt ondersteund door de vele verklaringen over het opkweken en bijplaatsen in de afgelopen decennia ter versterking van de populatie. In enkele van deze verklaringen wordt het bijplaatsen of uitzetten van dieren van Sloveense- of Balkan origine gemeld. Om het eventuele bijplaatsen van Balkan/Sloveense dieren in Limburg gedurende de afgelopen decennia beter te kunnen testen is DNA onderzocht van een groep dieren die wordt opgevangen in Blijdorp, en waarvan een Sloveense afkomst waarschijnlijk leek. Echter, op basis van de resultaten van dit onderzoek is een herkomst van de Blijdorp dieren uit Slovenië te bewijzen noch uit te sluiten. De Blijdorp populatie bevat enkele unieke microsatelliet allelen, die niet in de Nederlandse populaties zijn aangetroffen, en dus uit een






onbekende Balkan-populatie afkomstig zouden kunnen zijn. Echter op basis van de genetische data is een Nederlandse afkomst ook goed mogelijk, aangezien de Nederlandse populaties compleet samen clusteren met de Blijdorp-populatie. Op basis van genetische afstand is de meest waarschijnlijke populatie van herkomst dan Berghofweide of Gerendal. Alleen aanvullende bemonstering van Balkanpopulaties kan definitief uitkomst bieden. Om meer bewijs te verzamelen werd DNA uit dit onderzoek beschikbaar werd gesteld voor een studie naar Europese variatie in Geelbuikvuurpad op basis van mtDNA. Echter, in alle geanalyseerde Europese populaties, inclusief de populatie uit Blijdorp, werd slechts 1 variant van deze mtDNAmerker aangetoond. Vanwege dit gebrek aan resolutie biedt deze studie geen aanvullend bewijs dat er dieren met een herkomst buiten Nederland-Frankrijk-Duitsland zijn uitgezet. Dit wil echter niet zeggen dat dergelijke uitzet niet heeft plaatsgevonden. Hoewel de belangrijkste basis voor de Nederlandse kweekgroep de subpopulatie Wahlwiller is, is dat genetisch niet terug te vinden. Invloeden van andere subpopulaties zoals Meertensgroeve, Gerendal en Berghofweide lijken bepalender voor de genetische samenstelling. Tevens is enige verwantschap met de populaties rond Aken niet uit te sluiten. Hiervoor is geen duidelijke genetische verklaring gevonden. Mogelijk spelen aspecten als betere fokprestaties en/of niet representatieve bemonstering daarbij een rol. De bevindingen vormen echter geen reden tot zorg voor verdere bijplaatsingsactiviteiten in Nederland aangezien de Nederlandse subpopulaties toch al door kunstmatig handelen zijn vermengt.

Geconcludeerd kan worden dat de Nederlandse populatie genetisch nog voldoende variatie kent en dat dat vrijwel zeker het gevolg is van structureel menselijk handelen door opkweek en uitwisseling. Als zodanig zijn er dan ook geen noemenswaardige genetische verschillen tussen de onderlinge subpopulaties inclusief het Nederlands kweekprogramma. Er zijn geen sluitende bewijzen gevonden voor het uitzetten van dieren uit andere genetische regio’s dan de regio Nederland-Duitsland-Frankrijk.

4.4

Aanbevelingen

Ondanks het feit dat op dit moment de variatie van Geelbuikvuurpad in Nederland nog voldoende is, is er toch reden tot zorg. Waarschijnlijk is de huidige variatie kunstmatig hoog als gevolg van menselijk handelen. Indien er de komende jaren niks gebeurd, is het, gezien de grote mate van isolatie tussen subpopulaties en de kleine aantallen individuen per subpopulatie, waarschijnlijk dat de genetische variatie snel zal afnemen door genetische drift. Dit kan uiteindelijk negatieve consequenties hebben voor de vitaliteit en het aanpassingsvermogen van de populatie. Het is dan ook aan te bevelen maatregelen te treffen gericht op enerzijds de vergroting van subpopulaties, en anderzijds het verbeteren van de onderlinge verbinding van subpopulaties. Mocht dat niet op korte termijn te realiseren zijn, dan kan natuurlijke dispersie nagebootst worden door het kunstmatig uitwisselen van individuen om op deze manier de populaties genetisch vitaal te houden. Om dit zo effectief mogelijk te laten plaatsvinden is genetische monitoring van belang, waarbij elke ca. 5 generaties een steekproef van de subpopulatie wordt genomen, en de genetische verwantschap opnieuw wordt geanalyseerd, in vergelijking met de in dit rapport beschreven resultaten. Op basis daarvan kan gericht beheer plaatsvinden waarbij indien noodzakelijk, de meest verarmde populatie versterkt kan worden uit een genetisch verwante en vitale populatie.

37

Dankwoord

5

Dit rapport kon niet tot stand komen zonder de prettige samenwerking en/of monstervertrekking met binnen- & buitenlandse collega’s, in het bijzonder:  

Heike Pröhl, Institute of Zoology, University of Veterinary Medicine, Hannover, Duitsland Johan Michaux & Sébastien Quennery, Faculté des Sciences, Université de Liège, België.

 

Arnaud Laudelout, Natagora, België. Jacek Metody Szymura, Institute of Zoology, Jagiellonian University, Krako´w, Polen

 

Herbert Theiβen & Josef Wegge, Biostation Aachen, Duitsland Rob Veen, Creuse, Frankrijk

 Diergaarde Blijdorp Daarnaast danken wij de opdrachtgevers van de provincie Limburg voor het meedenken en de pragmatische opstelling bij de voortgang van dit onderzoek.

38


6. Referenties

Bijlsma, R. (1995) Moleculaire genetische technieken en natuurbeheer. De Levende Natuur 96 (2).

Booy, G. (1988) Het belang van genetische diversiteit voor de overleving van populaties, literatuurstudie: 1-101. Rapport Centrum voor Plantenveredelings- en Reproductieonderzoek. Wageningen: CPRO-DLO.

Bosman, W, R.M Laan & J.C.W. van Delft (2009) Geelbuikvuurpad. In: Creemers & Van Delft, 2009.

Buiteveld, J., en H.P. Koelewijn (2006) Klein en dan? Wat kan een beheerder doen met kleine en kwijnende populaties? Wageningen: Alterra (Alterra-rapport 1250).

Fijarczik, A., K. Nadachowska, S. Hofman, S.N. Litvinchuk, W. Babik, M. Stuglik, G. Gollmann, L. Choleva, D. Cogalniceanu, T. Vukov, G. Džunic en J.M. Szymura (2011) Nuclear and mitochondrial phylogeography of the European fire-bellied toads Bombina bombina and

Bombina variegata supports their independent histories. Molecular Ecology. Volume 20, pag. 2281-3398. Frankham, R., J.D. Balou en D.A. Briscoe (2002) Introduction to Conservation Genetics. Cambridge University Press.

Hartl, D.L. en A.G. Clark (1997) Principles of population genetics. Sinauer Associates, Inc., Sunderland.

Hauswaldt, J.S., C. Schröder en R. Riedemann (2007) Nine new tetranucleotide microsatellite markers for the fire-bellied toad (Bombina bombina). Molecular Ecology Notes. Volume 7, pag 49–52.

Keller L.K. en D.M. Waller (2002) Inbreeding effects in wild populations. TREE. Volume 17, pag. 230-241.

Peakall, R. en P.E. Smouse (2001) GenAIEx V5: Genetic Analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. Australian National University, Canberra, Australia.

Platform Geelbuikvuurpad en Vroedmeesterpad (2006) Beschermingsplan vroedmeesterpad en Geelbuikvuurpad, actieplan 2006-2010. Natuurbalans - Limes Divergens BV & Stichting RAVON, Nijmegen.

Pritchard, J.K., M. Stephens en P. Donnelly (2000) Inference of population structure using multilocus genotype data. Genetics. Volume 155, pag. 945-959.

Smulders, M.J.M.; Arens, P.F.P.; Jansman, H.A.H.; Buiteveld, J.; Groot Bruinderink, G.W.T.A.; Koelewijn, H.P. (2006) Herintroduceren van

soorten, bijplaatsen of verplaatsen: een afwegingskader. Wageningen : Alterra (Alterra-rapport 1390 / PRI-rapport 128 ). Van Delft, J.J.C.W. en Creemers, R.C.M. (2009) Nederlandse Fauna, De amfibieën en reptielen van Nederland. KNNV, Uitgeverij. Richter-Boix, A., C. Teplitsky, B. Rogell en A. Laurila (2010) Local selection modifies phenotypic divergence among Rana temporaria populations in the presence of gene flow. Molecular Ecology. Volume 19, pag. 716–731.

Knopp, T. en J. Merilä (2009) Multiple paternity in the moor frog, Rana arvalis. Amphibia-Reptilia. Volume 30, pag. 515-521.

Weimann, F., R. Podloucky, S. Hauswaldr en H. Pröhl (2009) Naturschutzgenetische Untersuchungen von Populationen der Gelbbauchunke (Bombina v. variegata) in südlichen Niedersachsen. Zeitschrift für Feldherpetologie. Volume 16, pag. 183-200.

39

Bijlage 1: Historie van de Geelbuikvuurpad in Nederland

1.1 ONTWIKKELINGEN IN DE PERIODE 1950-2010

Een uitgebreid historisch overzicht van het voorkomen van de Geelbuikvuurpad in Limburg is onder meer te vinden in Van den Broek & Crombaghs, 2010. Een aantal tekstfragmenten is rechtstreeks uit deze publicatie overgenomen. De eerste waarneming van een Limburgse Geelbuikvuurpad dateert uit 1889. In de eerste helft van de twintigste eeuw komen alle waarnemingen uit de streek ten oosten van de Maas en ten zuiden van de lijn Kerkrade-Maastricht. De soort lijkt in Zuid-Limburg algemeen voor te komen (CREMERS 1911, VAN WIJK 1946). Door publicaties van TER HORST (1959,1960), Van de Bund (1964) en met name door onderzoek van VAN NIEUWENHOVEN-SUNIER et al. (1965) ontstaat in de jaren ‘60 een nauwkeuriger beeld van de verspreiding. De soort wordt aangetroffen in de omgeving van het Savelsbosch, de rand van het plateau van Margraten, de omgeving Margraten-Sibbe-Schin op Geul-Stokhem, de omgeving Eys-Wijlre-UbachsbergImstenrade, de streek tussen Geul en Gulp, de omgeving van Vijlen en de omgeving van Wolfhaag . In de artikelen van TER HORST (1959; 1960) wordt het voorkomen van amfibieën in Zuid-Limburg in algemene zin en op gemeentelijk schaalniveau besproken. Toch wordt hierin al uitgewijd over de mate van bedreiging van sommige soorten. Aangegeven wordt dat de Geelbuikvuurpad lange tijd ‘een redelijk algemeen voorkomende soort’ was die ‘plaatselijk met honderden tegelijk kon worden waargenomen’ (TER HORST, 1960). Het eerste concrete verspreidingsbeeld van de Geelbuikvuurpad wordt geschetst door VAN NIEUWENHOVENSUNIER et al. (1965). Zij vinden de soort in 80 van de 500 in de periode 1960-1961 onderzochte drinkbakken en poelen (figuur S1). De auteurs constateerden net als ter Horst dat de Geelbuikvuurpad ogenschijnlijk weinig specifieke eisen stelt aan zijn milieu: ‘Afgezien van de mogelijk oecologische binding aan bergland, schijnt de

Geelbuikvuurpad weinig eisen aan haar milieu te stellen, men vindt de dieren in helder bronwater, maar evenzeer in de meest drabbige drinkpoelen’. Echt alarmerend zijn de berichten over het voortbestaan van amfibieën in die tijd nog niet. Toch wordt er wel degelijk al een achteruitgang geconstateerd. TER HORST (1960) merkt in zijn samenvatting op: ‘Daar waar zij

zich nog hebben kunnen handhaven komen de amfibia in betrekkelijk grote aantallen voor en de populaties blijven tamelijk stabiel. Dit geldt voornamelijk voor de Geelbuikvuurpad, de Vroedmeesterpad en de Alpenwatersalamander’. De laatste zin vormt een aanwijzing dat de Geelbuikvuurpad in die tijd lokaal misschien wel net zo algemeen was als de Alpenwatersalamander ( Ichthyosaura alpestris). Rond 1960 lagen er ruim 1000 poelen in Zuid-Limburg (HANEKAMP & STUMPEL, 1984). Wanneer men bedenkt dat VAN NIEUWENHOVEN-SUNIER et al. (1965) er in die tijd ‘slechts’ 500 onderzochten en hierbij op 80 locaties Geelbuikvuurpad aantroffen, dan kan met aan zekerheid grenzende waarschijnlijkheid worden gesteld dat het werkelijk aantal vindplaatsen in die tijd ruim boven de 100 lag. Dit vermoeden wordt gesterkt door het feit dat poelen ook in die tijd niet het voorkeurshabitat voor de Geelbuikvuurpad vormden (mondelinge mededeling A.H.P. Stumpel). Helaas kwamen de verwachtingen van ter Horst niet uit en bleef de populatie Geelbuikvuurpadden in Limburg allerminst stabiel. Het aantal vindplaatsen van de soort daalde in circa 40 jaar tijd van meer dan 100 naar vier. Het dieptepunt werd bereikt rond 2000 toen er nog slechts één levenskrachtige populatie in heel Limburg resteerde, alsmede een drietal relictpopulaties met hooguit een tiental dieren. Er was in alle opzichten sprake van een dramatische achteruitgang.

40


Figuur S1. Historische verspreiding van de Geelbuikvuurpad in Limburg omstreeks 1960 (Van Nieuwen-hoven-Sunier et al., (1965) in poelen en drinkbakken. Omdat lang niet alle wateren zijn onderzocht, en poelen en drinkbakken niet altijd optimale voortplantingsplaatsen van de soort vormen, was het werkelijke aantal vindplaatsen van de soort in die tijd naar verwachting nog hoger.

1.2 VEERTIG JAAR ACHTERUITGANG IN BEELD 1.2.1

De periode 1960-1980

In het kort passeren hier een aantal relevante karteringen van de Zuid-Limburgse amfibieën de revue. TER HORST (1959) besteedde in 1959 voor het eerst uitgebreid aandacht aan de bedreigingen en bescherming van de Limburgse herpetofauna, waaronder de Geelbuikvuurpad (TER HORST, 1959; 1960). In 1960 en 1961 werd er speciaal onderzoek uitgevoerd aan de Geelbuikvuurpad (VAN NIEUWENHOVEN-SUNIER et al., 1965). In beide publicaties wordt de Geelbuikvuurpad beschouwd als een van de soorten waarbij de achteruitgang ‘nog

41

wel meevalt’. De eerstvolgende kartering in Zuid-Limburg vindt plaats in 1974 (DUIJGHUISEN et al., 1976). Dit levert voor het eerst een zeer alarmerend beeld op van de status van de Geelbuikvuurpad. Onder de 717 poelen die toen werden onderzocht bevonden zich ook de 80 poelen van VAN NIEUWENHOVEN-SUNIER et al. (1965), waarvan er maar liefst 42 verdwenen bleken (HANEKAMP & STUMPEL, 1984). In de resterende 38 poelen namen zij nog in negen poelen Geelbuikvuurpadden waar, terwijl er ook acht nieuwe vindplaatsen werden ontdekt. Slechts op één plek werd voortplanting op redelijke schaal vastgesteld. Ondanks de alarmerende conclusies die aan dit onderzoek werden verbonden duurde het nog tot 1980 voordat er echt actie werd ondernomen. De aanleiding hiervoor vormde een kartering van SMIT (1981). Hij onderzocht hetzelfde gebied als DUIJGHUISEN et al. (1976) maar trof in totaal nog maar 464 poelen en drinkbakken in het Zuid-Limburgse landschap aan, waarvan slechts vijf met Geelbuikvuurpadden. ‘Geelbuikvuurpad’ is in dit geval overigens een betere benaming, want in vier van deze wateren ging het nog maar om de vondst van slechts één individu. Ondanks het feit dat SMIT (1981) natuurlijk niet alle Geelbuikvuurpadden heeft gevonden, moet worden geconcludeerd dat in amper 20 jaar het voorkomen van de Geelbuikvuurpad afnam van minimaal een honderdtal bezette vindplaatsen, met soms honderden geelbuiken per water, naar een bezetting van slechts vijf wateren waarin nog geen tien individuen meer werden waargenomen. In amper 20 jaar tijd werd de soort in het Zuid-Limburgse cultuurlandschap geëlimineerd!

1.2.2

De periode 1980-2000

De resultaten van het onderzoek van SMIT (1981), en de dramatische achteruitgang van de Geelbuikvuurpad in het bijzonder, leidde tot de oprichting van de zogenaamde ‘Overleg-groep poelenbeheer’ in 1982. Hierin waren de terreinbeherende natuurbeschermingsorganisaties, de provincie, het voormalige RIN en niet in de laatste plaats de Herpetologische Studiegroep Limburg vertegenwoordigd. Deze laatste was opgericht door particulieren en was de eerste Herpetologische Studiegroep van Nederland, een werkgroep van het Natuurhistorisch Genootschap in Limburg. De voortvarendheid waarmee men te werk ging was groot. In de volgende jaren nam het aantal nieuw aangelegde en herstelde poelen in het Mergelland weer toe tot 550 in 1990 (HEIJKERS, 1990). Veel soorten reageerden hierop positief, maar de Geelbuikvuurpad schitterde vooral door afwezigheid. In nieuw aangelegde poelen dook de soort wel af en toe op, maar dit was slechts van korte duur. In de meeste gevallen verdween de Geelbuikvuurpad weer net zo snel als hij gekomen was en als er al sprake was van succesvolle reproductie was dat alleen in het eerste of tweede jaar na aanleg. In het beste geval kan men beweren dat de voortdurende aanleg van nieuwe poelen er voor heeft gezorgd dat de Geelbuikvuurpad op het nippertje niet volledig is uitgestorven, veel meer werd er helaas niet bereikt. Ondanks al het graaf- en herstelwerk resteerden er in 2000 nog maar vier vindplaatsen van de Geelbuikvuurpad (figuur S2), waarbij het in slechts één geval om een min of meer vitale populatie ging, namelijk in groeve ’t Rooth (BOSMAN & CROMBAGHS, 2009; BOSMAN et al., 2009).

42


Rooth Gerendal

Berghof Wahlwiller

Figuur S2. Verspreiding van de Geelbuikvuurpad in Limburg in 2000. Aanleg en herstel van een groot aantal poelen en drinkbakken in het Mergelland kon de achteruitgang van de Geelbuikvuurpad in het Mergelland niet stoppen. In 2000 resteerden er nog slechts vier vindplaatsen, waarbij alleen de populatie in het Rooth nog als min of meer vitaal kon worden aangemerkt.

De zeer sterke achteruitgang van de Geelbuikvuurpad in de periode 1980-2000 heeft twee belangrijke gevolgen gehad: 1

Op diverse plaatsen in het Mergelland zijn Geelbuikvuurpadden uitgezet. Het betreft hier zowel volwassen dieren als juvenielen en larven. Over het algemeen vonden de uitzettingen op persoonlijke titel plaats. Helaas zijn hierbij ook Geelbuikvuurpadden uit het buitenland uitgezet. Menging van buitenlandse Geelbuikvuurpadden met inheemse is beslist niet zonder risico (zowel uit genetisch oogpunt als wat betreft het risico op verspreiding van ziekten).

2

De provincie Limburg nam het initiatief tot het uitvoeren van een reeks van onderzoeken die de omvang en het reproductiesucces van de populaties op de resterende vindplaatsen in beeld dienden te brengen, en die vooral antwoord moest geven op de vraag of het voortbestaan van de laatste populaties kon worden veilig gesteld en zo ja, hoe? Dit resulteerde onder meer in het verschijnen van het beschermingsplan Vroedmeesterpad en Geelbuikvuurpad (LENDERS, 2000), later gevolgd door het Beschermingsplan Geelbuikvuurpad en Vroedmeesterpad in Limburg (CROMBAGHS & BOSMAN, 2006).

43

2

(HER)INTRODUCTIES IN LIMBURG

2.1 INLEIDING Uit diverse bronnen is bekend dat sinds de jaren ’70 van de vorige eeuw met wisselend succes uitzettingen en bijplaatsingen hebben plaatsgevonden. Dit zou de genetische verarming kunnen hebben beperkt. Helaas heeft men zich echter hierbij, hoe goed bedoeld ook, niet beperkt tot het uitzetten van inheemse Geelbuikvuurpadden. Ook zijn er dieren uit het buitenland (zoals voormalig Joegoslavië) uitgezet. Halverwege de jaren negentig was duidelijk dat het klassieke poelenbeheer in het mergelland in Zuid-Limburg ongeschikt was voor het duurzaam voortbestaan van de Geelbuikvuurpad in Nederland. Pas in 2000 kwam het daadwerkelijk tot een andere aanpak. De provincie Limburg nam het initiatief tot het uitvoeren van een aantal projecten die meer inzicht dienden te verschaffen in de sleutelfactoren die van grote invloed zijn op de duurzame instandhouding van populaties van de Geelbuikvuurpad. Omdat experimenten in de laatste leefgebieden rond 2000 onverantwoord waren, gezien de geringe omvang van deze populaties, en ook uit oogpunt van risicospreiding, is de Geelbuikvurpad in de periode 2000-2010 in een drietal groeves (groeve Blom, Meertensgroeve en Curfsgroeve) geherintroduceerd. Hier zijn in de periode 2005-2010 diverse beheersexperimenten uitgevoerd en het effect op de populatieontwikkeling van de Geelbuikvuurpad gemonitord, Zowel de resultaten van het habitatherstel, de ontwikkeling van nieuwe leefgebieden, als het uitzetten en bijplaatsen van Geelbuikvuurpadden in Limburg vanaf de jaren ’70 van de vorige eeuw, worden in het vervolg van deze bijlage besproken.

1 Spaubeek jaren ‘70 2 Bunde rbos ch circa 1995

4 Curf sgroeve

3 Ravensbosch jar en ‘80 5 Meertensgroeve 1985 & 2006

6 Groeve Blom 2005 7 Be melerber g jaren ‘7 0 8 Ro oth, 1998

9 Ger endal 1974,1975 circ a 1990

jar en ‘7 0

14 Omgeving Slenaken,

Uitzetting met inhe ems m ater iaal Uitzetting, oorsprong ma teriaal on bekend Uitzetting met b uitenlands materiaal

44

10 Berg hof Keut eber g


11 Sim pelveld 1972 12 Wahlwil ler ’jar en 70

Figuur S3. Locaties in Limburg waar in de periode 1970-2010 uitzetting van de Geelbuikvuurpad bekend is. Op vijf locaties betreft het met zekerheid uitzetting van Geelbuikvuurpadden uit voormalig Joegoslavië. In drie gevallen is de herkomst van de uitgezette Geelbuikvuurpadden onbekend. De overige uitzettingen hebben, voorzover bekend, betrekking op inheems materiaal. De nummers in de figuur corresponderen met de nummers in de tekst. Op een aantal locaties is de Geelbuikvuurpad inmiddels weer verdwenen. Voor een overzicht van de huidige populaties in Nederland, zie Figuur 4 in de hoofdtekst.

2.2 UITZETTINGEN IN DE PERIODE 1970-2000 In deze paragraaf worden vindplaatsen van de soort besproken uit de periode 1970-2000 waarvan bekend is dat ze het gevolg zijn van uitzettingen, of eenmalige waarnemingen van Geelbuikvuurpadden die zich ver buiten het natuurlijke verspreidingsgebied van de soort in Limburg bevinden. De gegevens zijn verzameld door persoonlijke interviews met lokale deskundigen. Namen van geïnterviewde personen zijn om privacyredenen niet in de tekst opgenomen als het niet legale uitzettingen betreft. De nummers achter de populatie-namen corresponderen met de nummers in figuur 3. Locatie Simpelveld (11) In 1972 werd één volwassen Geelbuikvuurpad waargenomen in een poel in de gemeente Simpelveld door F. Blezer en F. van Hoogstraten. De exacte locatie van de poel is niet meer bekend. De poel bevond zich in het kilometerhok 196-316. Latere gedocumenteerde waarnemingen van de soort uit dit kilometerhok (Ravonarchief), zijn er niet maar uit het verleden zijn meerdere waarnemingen van de soort uit de omgeving bekend. Dit maakt het aannemelijk dat het hier één van de laatste exemplaren van een natuurlijke vindplaats van de soort betreft. Retraitehuis in Spaubeek (1) Een inwoner uit Spaubeek heeft in de jaren ’70 geleden geelbuikpadden meegenomen uit voormalig Joegoslavië, uit het gebied van Kranske Gora (Slovenië). Gekweekte dieren zijn doorgegeven aan derden. Door hen zijn onder meer Geelbuikvuurpadden uitgezet bij het retraitehuis in Spaubeek (andere lokaties zijn niet meer bekend). Er werden vooral kikkervissen en juveniele Geelbuikvuurpadjes uitgezet. Aantallen zijn onbekend (zie ook populatie 14). Bemelerberg, omgeving Rooth (7) Een geïnterviewde heeft in de jaren ’70 geelbuikpadden meegenomen uit voormalig Joegoslavië. Ze zijn afkomstig uit het gebied van Kranske Gora (Slovenië). Zijn zoon heeft de dieren jarenlang in een terrarium gehouden en er mee gekweekt. De kweek verliep zo voorspoedig dat er diverse andere liefhebbers van dieren zijn voorzien. Door geïnterviewde, en door derden die via hem Geelbuikvuurpadden hebben gekweekt, zijn er op diverse plaatsen dieren uitgezet. Een van de locaties waar dit heeft plaatsgevonden is de Bemelerberg in de omgeving van ’t Rooth. Er werden vooral kikkervissen en juvenielen uitgezet ‘in diverse poelen op de Bemelerberg’. Concrete informatie over het effect van deze uitzettingen ontbreekt. Het is niet uitgesloten dat er uitwisseling heeft plaatsgevonden met de populatie in het Rooth aangezien zich in de jaren ’70 van de vorige eeuw, ook diverse vindplaatsen buiten de groeve bevonden. Eind jaren ’70 werd er met het houden van Geelbuikvuurpadden gestopt en zijn er geen dieren meer uitgezet. Omgeving Schilberg/Slenaken (14) Eind jaren ’70 werd één volwassen dier waargenomen door F. Blezer en F. van Hoogstraten. De exacte poellocatie is niet bekend. De waarneming is afkomstig uit kilometerhok 187-307. Uit het verleden zijn

45

waarnemingen van de soort uit de omgeving bekend. Dit maakt het aannemelijk dat het hier een van de laatste exemplaren van een natuurlijke vindplaats betreft. In de omgeving van Slenaken zijn ook Geelbuikvuurpadden uitgezet uit de kweekgroep van Kranske Gora (Slovenië). Er werden vooral kikkervissen en juvenielen uitgezet. Aantallen en exacte locaties zijn niet meer bekend (zie ook populatie 1, Retraitehuis Spaubeek). Wahlwiller (12) De populatie in Wahlwiller heeft geen natuurlijke oorsprong. Rond 1982 zijn hier dieren uitgezet die afkomstig waren uit de populatie bij ’t Rooth (8). Ravensbosch (3) Medio jaren ’80 heeft een geïnterviewde Geelbuikvuurpadden in het Ravensbosch aangetroffen. De heer Brands, voormalig boswachter SBB, geboren in de omgeving Ravensbosch, gaf aan op de hoogte te zijn van het feit dat de soort in de omgeving van het Ravensbosch voorkwam. Betreffende persoon ging er daarom van uit dat het hier de inheemse Geelbuikvuurpad betrof. Er zijn enkele dieren gevangen en hier is mee gekweekt. Een deel van de nakweek is doorgegeven aan liefhebbers. Nakomelingen van deze kweekgroepen zijn eind jaren ‘80 uitgezet in het Gerendal. Het gaat hier om een eenmalige uitzetting van enkele honderden metamorfoserende larven en juvenielen. Kort daarna ontstonden er twijfels over de oorsprong van deze Geelbuikvuurpadden. Op grond daarvan is er contact geweest met professor Szymura van de universiteit van Krakau. Deze bevestigde het vermoeden dat het om uitheemse Geelbuikvuurpadden ging, met grote waarschijnlijk om een variëteit uit de Balkan. Meertensgroeve (5) In 1985 is er eenmalig een Geelbuikvuurpad aangetroffen in de Meertensgroeve te Vilt. Gezien de grote afstand (minstens drie kilometer) tot de dichtstbijzijnde leefgebied in die tijd (Rooth) en het feit dat er zowel vóór als na 1985 geen meldingen meer bekend zijn geworden, betreft dit zeer waarschijnlijk een uitzetting. In genoemde periode heeft er zeer intensief onderzoek plaats gevonden naar de Vroedmeesterpad in de Meertensgroeve en het voorkomen van een populatie Geelbuikvuurpadden, voor of na 1985, zou toen beslist zijn opgemerkt. t’ Rooth (8) In deze periode ging het al bijzonder slecht met de Geelbuikvuurpad. De totale populatie aan (half)volwassen dieren werd in 1997 op maximaal 43 (sub)adulten geschat (BOSMAN, 1997). De afzet van een groot aantal eieren op één locatie die dreigde uit te drogen vormde de aanleiding om deze op te kweken en in een later stadium terug te plaatsen (BOSMAN et al., 1999). De actie vond plaats in overleg met het Natuurhistorisch Genootschap in Limburg en met een ontheffing van het ministerie van LNV. Enkele honderden eieren zijn verzameld, opgekweekt en als juveniel weer uitgezet. Uitzetting vond pas laat in het seizoen plaats. In latere jaren is van deze uitzetting vrijwel niets teruggevonden (BOSMAN et al., 1999). Bunderbos (2) Ergens omstreeks 1995 zijn door dhr. R. Gubbels aan de oostzijde en ten noorden van de spoorbrug in het Bunderbos enkele Geelbuikvuurpadden waargenomen. De dieren zaten in een ‘karrenspoorachtige’ drainagegreppel (zonbeschenen gootje met waterplanten en zandafzetting) van circa 0,5 meter breed. Er werden drie volwassen exemplaren gezien. De herkomst van dieren is onbekend. Voor zover bekend zijn er daarna geen waarnemingen meer gedaan. Groeve Curfs (4) In 1998 vond Martijn Dorenbosch vlakbij de uitgang van de Curfsgroeve vier (sub)adulte Geelbuikvuurpadden. In 1999 is hij nogmaals gaan kijken, maar trof op dat moment geen dieren meer aan.

46


Gerendal (9) In de periode 1970-1990 zijn in het Gerendal met enige regelmaat Geelbuikvuurpadden uitgezet. Deze vonden steeds plaats in overleg met Staatsbosbeheer, de beheerder van het Gerendal. Begin jaren ’70 werden door de toenmalig voorzitter van Lacerta in Maastricht, Geelbuikvuurpadden aangetroffen in een oude mestput in Zuid-Limburg (exacte locatie niet meer bekend). Het gaat hierbij vrijwel zeker om inheemse Geelbuikvuurpadden, aangezien de soort in deze omgeving in het verleden vaak was aangetroffen. De dieren zijn meegenomen en hiermee is gekweekt. Nakweek is ook ‘aan derden’ doorgegeven. Omdat het kweken voorspoedig verliep, en de Geelbuikvuurpad in de vrije natuur steeds verder achteruitging, is het idee ontstaan tot bijplaatsing in onder meer het Gerendal. Uitzetting heeft voor zover bekend twee keer massaal plaatsgevonden. Uit de jaarverslagen van de werkgroep Limburg van Lacerta (ELZENGA, 1975; RAAIJMAKERS & ELZENGA, 1976) blijkt dat er in 1974 en 1975 grote aantallen (1860 exemplaren) juveniele Geelbuikvuurpadden in het Gerendal zijn uitgezet. Daarnaast zijn er 3180 larven ‘verspreid over Zuid-Limburg’ losgelaten (archief Ravon). Eind jaren ‘80 zijn wederom nakomelingen uit een (andere) kweekgroep uitgezet in het Gerendal. Het gaat hier om een eenmalige uitzetting van enkele honderden (metamorfoserende) larven en juvenielen. Kort daarna ontstonden er twijfels over de herkomst van deze Geelbuikvuurpadden. Op grond daarvan is er door de uitzetter contact geweest met professor Szymura van de universiteit van Krakau. Zijn onderzoek bevestigd dat het om uitheemse Geelbuikvuurpadden gaat, met grote waarschijnlijk om een variëteit uit de Balkan. Toen dit eenmaal bekend was, is de uitzetting gestaakt. Uit onderzoek in 2000 (BOSMAN & CROMBAGHS, 2001a) bleek dat deze ‘Balkanvorm’ zeer waarschijnlijk nog steeds deel uitmaakte van de populatie Geelbuikvuurpadden in het Gerendal. De dieren wijken iets af van de habitus van de inheemse Geelbuikvuurpad en vertonen een afwijkende unken-reflex.

Berghofwei/Keuteberg (10) Geïnterviewde gaf aan dat hij eind jaren ’90 contact heeft gehad met een zekere heer P. Visser, woonachtig op de Keuteberg. Deze meldde dat hij een Geelbuikvuurpad in zijn tuin had aangetroffen. Het dier had zich spontaan had gevestigd in zijn ‘tuinpoeltje’. De locatie bevindt zich op enkele 100 den meters afstand van het leefgebied Berghofwei. Geïnterviewde heeft toen 20 juvenielen bijgeplaatst. Deze waren afkomstig van nakweek van dieren uit ’t Rooth en werden als inheems beschouwd.

2.3 UITZETTINGEN IN DE PERIODE 2000-2010 In de periode 2005-2009 is in overleg met de provincie Limburg en het Ministerie van LNV een drietal groeves in Limburg een herintroductie gestart, dit zijn de Meertensgroeve, de Curfsgroeve en groeve Blom (figuur 3). Daarnaast zijn er rond 2007 Geelbuikvuurpadden afkomstig van de locatie Wahlwiller uitgezet in de omgeving van Cottessen. Groeve Blom (6) In de groeve Blom, een particuliere groeve in de gemeente Berg en Terblijt, heeft in 2004 een herinrichting plaats gevonden waarbij de groeve speciaal met het oog op de ontwikkeling van nieuw leefgebied voor de Geelbuikvuurpad en Vroedmeesterpad is ingericht (CROMBAGHS & BOSMAN, 2002). Bij het Ministerie van LNV is een ontheffing aangevraagd en ontvangen voor het opstarten van een herintroductieproject. In de periode 2005, 2006 en 2007 zijn hier jaarlijks ruim 1000 larfjes van de Geelbuikvuurpad uitgezet (CROMBAGHS & BLOM, 2008). Vanaf 2007 vindt er op ruime schaal natuurlijke reproductie plaats. De populatie heeft tegenwoordig een geschatte omvang van minimaal 150 (half)volwassen Geelbuikvuurpadden en plant zich jaarlijks met succes voort. De ontwikkeling van een duurzame populatie lijkt te slagen. De larven zijn afkomstig van een kweekgroep, die sinds 2000 voor dit doel in stand wordt gehouden.

47

Meertensgroeve (5) Het uitzetproject dat sinds 2005 in groeve Blom werd opgestart, vond in 2006 een vervolg in de Meertensgroeve. Het aantal uitgezette larven in deze groeve was lager dan in groeve Blom (CROMBAGHS et al., 2009). Dit is mede een gevolg van het gelijktijdig uitvoeren van de projecten. Desondanks is het ook hier gelukt om een populatie te ontwikkelen. Tegenwoordig bestaat de populatie in de Meertensgroeve uit circa 120 (sub)adulte geelbuiken. Natuurlijke reproductie vindt hier sinds 2008 met toenemend succes plaats, met een minimale eiafzet van 1000 eieren in 2010. Al twee jaar metamorfoseren er jaarlijks enkele honderden larven succesvol tot juveniel. Dit duidt er op dat ook hier de kans op de ontwikkeling van een duurzame populatie groot is. Curfsgroeve (4) In navolging van het project groeve Blom en Meertensgroeve is vanaf 2008 gestart met een herintroductie in de Curfsgroeve (CROMBAGHS et al., 2009) na het stoppen van de exploitatie van mergel.De kans op de ontwikkeling van een grote populatie Geelbuikvuurpadden is in deze ca 40 ha grote groeve groot. In 2010 werden er minimaal 29 verschillende (sub)adulte Geelbuikvuurpadden waargenomen. In 2011 zijn er voor de laatste keer larven en juvenielen van de Geelbuikvuurpad in groeve Curfs uitgezet. Daarna dient de populatie door natuurlijke reproductie verder te groeien. De hoop is er op gevestigd dat dit, evenals in groeve Blom en in de Meertensgroeve, gaat lukken.

2.4 GEELBUIKVUURPADDEN UIT SLOVENIË. In 2009 werd aan de stichting RAVON, alsmede aan een IVN-lid uit Zuid-Limburg, Geelbuikvuurpadden aangeboden. Het ging om 20 volwassen dieren en zo’n 400 larven en juvenielen. Uit navraag bleek dat de dieren wederom afkomstig waren uit Slovenië. Ze waren tijdens een vakantie meegenomen. De exacte locatie was niet bekend. De aanbieder is kenbaar gemaakt dat het introduceren van uitheemse Geelbuikvuurpadden vanwege mogelijke ziekten en inbrengen van vreemd genetisch materiaal ongewenst is. Hem is gevraagd de dieren niet meer aan te bieden. Toen dit toch gebeurde heeft het IVN lid wederom met hem contact gezocht en is hem verzocht de dieren anoniem op een adres in te leveren. Na aandringen vond dit inderdaad plaats, maar het vermoeden bestaat dat niet alle dieren zijn ingeleverd. Op grond daarvan is de AID ingeschakeld. Wat er met de overgebleven dieren is gebeurd is niet bekend.

2.5 HABITATHERSTEL Sinds 2000 is er steeds meer inzicht ontstaan in de factoren die een belangrijke rol spelen in de duurzame instandhouding van Geelbuikvuurpad populaties. De instandhouding van extreme levensomstandigheden in het leefgebied van de Geelbuikvuurpad en het bemoeilijken van predatoren en concurrenten, leidt tot een succes. De voortplantingswateren kunnen te snel, maar vooral ook te langzaam droogvallen. De ontwikkeling van dergelijke wateren vereist dus een hoge mate van maatwerk betreffende dimensies, locatiekeuze en tijdstip van beheer en aanleg. Ook de kwaliteit van de landhabitat dient goed aan te sluiten op de specifieke eisen van de soort, in het bijzonder de hoge dichtheid aan schuilplaatsen en voldoende zon. Tijdens de herintroducties, in groeve Blom, de Meertensgroeve en groeve Curfs in de periode 2005-2011die door Natuurbalans-Limes Divergens BV is uitgevoerd,, zijn enkele sleutelfactoren, die van grote invloed zijn op de duurzame instandhouding van populaties van de Geelbuikvuurpad, nader onderzocht. Deze zijn beschreven in enkele rapporten van Natuurbalans-Limes Divergens BV (Crombaghs et al., 2009; Crombaghs & Geraeds, 2011), Deze nieuwe inzichten zijn ook doorgevoerd in de bestaande leefgebieden van de soort en leiden ook hier tot een duidelijk herstel van populaties van de Geelbuikvuurpad.

48


3

POPULATIE ONTWIKKELING VAN DE GEELBUIKVUURPAD

3.1

BESTAANDE

LEEFGEBIEDEN,

GROEVE

’T ROOTH,

JULIANA

GROEVE,

GERENDAL,

BERGHOFWEI

EN

WAHLWILLER.

Vanaf 1997 is er structureel populatieonderzoek verricht aan de Geelbuikvuurpad in Zuid-Limburg. In het begin alleen in groeve ’t Rooth, vanaf 2000 ook in de vier andere gebieden (Juliana groeve, Wahlwiller, Berghofwei en Gerendal). Eerder is er in 1985 en 1990 populatieonderzoek gedaan in groeve ’t Rooth (LAAN & VERBOOM, 1986; LAAN & VERBOOM, 1990). De Geelbuikvuurpad is individueel herkenbaar aan het zwarte vlekkenpatroon op zijn buik. Dit maakt het mogelijk aan de hand van vangst-terugvangsten jaarlijks populatieschattingen te berekenen. Voor de bepaling van de populatieschatting worden alleen adulte dieren (≥ 30 mm) betrokken in de berekening. In de eerste jaren zijn de buikpatronen handmatig vergeleken. Tegenwoordig wordt het ‘Automated Photo-ID for YBT photographs’ programma, ontwikkeld door dhr. Lex Hiby, gebruikt dat buikpatronen digitaal vergelijkt (CLEMENTS et al., 2010).

Groeve ‘Rooth In de jaren ‘80 was de populatie in groeve ’t Rooth de grootste in Nederland. Zowel in 1985 als in 1990 is er in die tijd populatieonderzoek verricht (LAAN & VERBOOM, 1986; 1990). De populatiegroottes zijn in die tijd geschat op 97 dieren. De schattingen van Laan & verboom zijn gebaseerd op adulten en subadulten in de populatie. De onderzoeken in de periode 1997-2010, hebben uitsluitend betrekking op adulten.

250

Populatiegrootte

200

150

100

50

0 1985 1990 1997 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010

Figuur S5. De geschatte populatiegrootte van de Geelbuikvuurpad in groeve ‘t Rooth in de periode 1997-2010. In de jaren 1985 en 1990 is eveneens populatieonderzoek verricht maar toen zijn de schattingen berekend inclusief subadulten. Deze jaren zijn daarom niet in de grafiek opgenomen.

Figuur S5 geeft voor de periode 1997 – 2010 de geschatte populatiegroottes in groeve ’t Rooth. In 1997 bestond de populatie uit 41 dieren en was dus fors afgenomen ten opzichte van 1985 en 1990. Door aanleg

49

van nieuwe wateren groeide de populatie in 1999 naar 75 dieren (in 1998 is er geen populatieonderzoek verricht). In 2000 startte het beschermingsplan vroedmeesterpad en Geelbuikvuurpad. De eerste basishabitats werden aangelegd. Na een afname in 2000 en 2001 groeide, na een succesvol voortplantingsjaar in 2000, de populatie in 2002 naar 124 dieren. Die groei zette in 2003 door en de schatting kwam dat jaar uit op 166 Geelbuikvuurpadden. Mede door een slechtere reproductie onder andere door een aantal drogere zomers nam de populatie in de jaren daarna af tot 49 dieren in 2006. Een goede reproductie in 2005 zorgde weer voor een groei die in 2007 zichtbaar werd (BOSMAN & CROMBAGHS, 2006). Na een kleine daling in 2008 groeide de populatie in 2009 naar een aantal van 129 dieren, gelijk aan het niveau van 2007. In 2010 kromp de populatie weer iets naar een grootte van 115 volwassen dieren.

Julianagroeve Eind jaren ‘90 stierf de Geelbuikvuurpad uit in de Julianagroeve. In juni 2001 werd er echter weer één dier gevonden (BOSMAN & CROMBAGHS, 2001b). In 2002 is de populatie geschat op drie dieren (figuur 6). In 2004 groeide de populatie naar zeven dieren. In 2005 en 2006 liep deze weer terug naar drie dieren. In 2008 nam de populatie toe naar 9 dieren. Voor 2009 kwam de schatting op 6 dieren uit en in 2010 op 11. In de Julianagroeve is op dit moment geen sprake van een levensvatbare populatie. Gezien de ligging ten opzichte van groeve ’t Rooth, hemelsbreed op 450 m., is de populatie erg afhankelijk van dispersie vanuit dat gebied. 50 45 40

Populatiegrootte

35 30 25 20 15 10 5 0 2000

2001

2002

2003

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

Figuur S6. De geschatte populatiegrootte van de Geelbuikvuurpad in de Julianagroeve in de periode 2000-2010.

Gerendal

50


De populatie in het Gerendal was jaren lang kwakkelend (figuur 7). In 2000 bestond deze nog uit 18 dieren maar nam in de jaren daarna af tot enkele exemplaren in 2004 en 2005 op grond waarvan geen betrouwbare populatieschattingen konden worden berekend. In 2006 en 2007 werden er weer wat meer dieren aangetroffen en kwamen de schattingen uit op 5 respectievelijk 4 adulten. In 2008 groeide de populatie naar 15 dieren om in 2009 en 2010 uit te groeien naar een populatie van 69 en respectievelijk 118 dieren. Hoe deze spectaculaire groei na succesvolle voortplanting in 2008 ineens tot stand is gekomen, is niet duidelijk. De populatie zit nu uiteraard wel flink in de lift.

130 120 110 100

Populatiegrootte

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2000

2001

2002

2003

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

Figuur S7. De geschatte populatiegrootte van de Geelbuikvuurpad in het Gerendal in de periode 2000-2010. In 2004 en 2005 is wel populatieonderzoek verricht maar zijn niet voldoende dieren gevonden om een populatiegrootte te bepalen.

Berghofwei Berghofwei was samen met het Gerendal het zorgenkindje van de gebieden waar populaties van Geelbuikvuurpad voorkomen. Zowel in 2000 als in 2001 zijn er in de Berghof geen dieren meer waargenomen. Wel werden er in de omgeving in een tuinvijver nog wat dieren gezien (zie elders dit rapport). Gedacht werd dat de populatie was uitgestorven. Tot er in 2002 toch weer een oud vrouwtje dieren opdook. Het dier werd twee keer waargenomen (BOSMAN & CROMBAGHS, 2003a) (figuur 8). In 2003 werden in het kader van het toen lopende monitoring dertien bezoeken gebracht maar geen Geelbuikvuurpadden waargenomen.

51

100 90 80

Populatiegrootte

70 60 50 40 30 20 10 0 2000

2001

2002

2003

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

Figuur S8. De geschatte populatiegrootte van de Geelbuikvuurpad in de Berghof in de periode 2000-2010. In 2000, 2001 en 2003 is wel populatieonderzoek verricht maar zijn geen dieren waargenomen.

De aanleg van een basishabitat in 2004 in het kader van het project LIFE-AMBITION (BOSMAN et al., 2008) bleek een habitatverbetering van ontzettend groot belang te zijn. Gedurende het seizoen werden er drie, al oudere, dieren meermaals waargenomen. Dat seizoen was er ook voor het eerst sinds de start van de beschermingsplan periode in 2000 succesvolle voortplanting. Er werden 56 juvenielen geteld (BOSMAN & CROMBAGHS, 2003b). De populatie groeide in 2005 naar 15 dieren. In de jaren daarna groeide mede door de aanleg van nog meer nieuwe basishabitats de populatie naar 26 dieren in 2008. De goede reproductie in 2007, nadat een nieuw basishabitat in een dal nabij de Berghof werd aangelegd, zorgt voor de enorme groei van de populatie in 2009 die dat jaar uit 76 dieren bestond. In 2010 daalde het aantal weer licht naar 72 dieren.

Wahlwiller In 2000 bestond de populatie van de Geelbuikvuurpad Wahlwiller uit 16 dieren. In de periode 2001 – 2006 fluctueerde de populatie tussen 12 en de 20 dieren. De aanleg van vier nieuwe basishabitats in 2005 zorgde voor een enorm reproductiesucces dat jaar en groei van de populatie in 2007. In 2008 en 2009 nam de populatie weer iets af tot respectievelijk 64 en 50 dieren om in 2010 weer te groeien naar het niveau van 2008 met 63 dieren.

52


90 80

Populatiegrootte

70 60 50 40 30 20 10 0 2000

2001

2002

2003

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

Figuur S9. De geschatte populatiegrootte van de Geelbuikvuurpad in Wahlwiller in de periode 2000-2010.

53

LITERATUUR BOSMAN, W., 1997. De Geelbuikvuurpad in groeve ’t Rooth in 1997. Stichting Ark. BOSMAN, W. R. BRONCKERS & D.P.E.M. FRISSEN, 1999. De Geelbuikvuurpad in Nederland: kan het nog steeds? Natuurhistorisch Maandblad. Jaargang 88, 108-112. BOSMAN, W. & B. CROMBAGHS, 2001a. De Geelbuikvuurpad in Limburg. Een onderzoek naar populatieomvang en voortplantingssucces in het mergelland in 2000. Bureau Groenlanden & Natuurbalans – Limes divergens BOSMAN, W. & B. CROMBAGHS, 2001b. De Geelbuikvuurpad in Limburg. Een onderzoek naar populatieomvang en voortplantingssucces in het mergelland in 2001. Bureau Groenlanden & Natuurbalans – Limes divergens. BOSMAN, W & B.CROMBAGHS, 2003a. De Geelbuikvuurpad in Limburg in 2002. Een onderzoek naar populatieomvang en voortplantingssucces in de laatste leefgebieden. Bureau Groenlanden – Natuurbalans – Limes Divergens. 48 p. BOSMAN, W & B.CROMBAGHS, 2003b. De Geelbuikvuurpad in Limburg in 2004. Een onderzoek naar populatieomvang en voortplantingssucces in de laatste leefgebieden. Bureau Groenlanden – Natuurbalans – Limes Divergens. 40 p. BOSMAN, W & B.CROMBAGHS, 2006. De Geelbuikvuurpad in Limburg in 2005. Een onderzoek naar populatieomvang en voortplantingssucces in de laatste leefgebieden. Stichting RAVON – Natuurbalans – Limes Divergens. 25 p. BOSMAN, W. & B. CROMBAGHS, 2009. Geelbuikvuurpad Bombina variegata. In: H.J.M. van Buggenum et al. (red.), Herpetofauna van Limburg. Verspreiding en ecologie van amfibieën en reptielen in de periode 19802008. Stichting Natuurpublicaties Limburg, Maastricht: 126-137. BOSMAN, W., R. ZOLLINGER & J. JANSE, 2008. LIFE AMBITION – Amphibian Biotope Improvement in the Netherlands. Monitoring in de periode 2004-2008. Stichting RAVON. 51 p. BOSMAN, W., R.M. LAAN, J.J.C.W. VAN DELFT, 2009. Geelbuikvuurpad Bombina variegata. In: Creemers, R.C.M. & J.J.C.W. van Delft (redactie), De amfibieën en reptielen van Nederland. – Nederlandse Fauna 9. Nationaal Natuurhistorisch Museum Naturalis, European Invertebrate Survey – Nederland, Leiden: 142-153. BUND, C.F., VAN DE, 1964. Vierde Herpetegeografisch Verslag. De verspreiding van de reptielen en amfibieën in Nederland. Nederlandse Vereniging voor Herpetologie en Terrariumkunde Lacerta. 1 – 72. CLEMENTS, G., M. SPAN & L. HIBY (2010): Handleiding ‘Automated Photo-ID for YBT photographs’. Stichting RAVON. CREMERS, J., 1911. Vuurpadden (Bombina igneus). Ons eigen blad 3: 90-94. CROMBAGHS, B. & M. BLOM, 2008. Agrarisch natuurbeheer met geiten en landvarkens voor het beheer van groeves, een reëel alternatief? Natuurbalans - Limes Divergens BV en Beheer en Exploitatie Blom, Nijmegen/Berg en Terblijt. CROMBAGHS, B. & W. BOSMAN. 2002. Inrichtingsplan Groeve Blom. Bureau Natuurbalans-Limes Divergens BV - Bureau Groenlanden, Nijmegen.

54


CROMBAGHS, B. & W. BOSMAN (red.), 2006. Beschermingsplan Geelbuikvuurpad en vroedmeesterpad in Limburg 2006-2010. Platform Geelbuikvuurpad en Vroedmeesterpad, Natuurbalans/Limes Divergens& Stichting RAVON, Nijmegen. CROMBAGHS, B., D. SCHUT & A. KLOOR, 2009. HERINTRODUCTIE GEELBUIKVUURPAD IN ZUID-LIMBURG. PROJECT OP WEG NAAR EENDUURZAAM BEHOUD VAN DE GEELBUIKVUURPAD IN HET MERGELLAND, 2009. Natuurbalans - Limes Divergens BV, Nijmegen. DUIJGHUISEN, T., B. HEUKESHOVEN, P. VAN DER MEYDEN & T. RAATELAND, 1976. Een inventarisatie van de amfibieënfauna van Zuid-Limburg, met de nadruk op de ekologie van de Vroedmeesterpad (Alytes obstetricans) en de Geelbuikpad (Bombina variegata). Instituut voor Taxonomische Zoölogie, Amsterdam / Zoölogisch Laboratorium Afdeling Dieroecologie, Katholieke Universiteit Nijmegen, Nijmegen / RIN, Leersum. ELZENGA, E.F., 1975. Herpetologische waarnemingen in Zuid-Limburg 1974. Werkgroep Limburg van Lacerta. HANEKAMP, G. & A.H.P. STUMPEL, 1984. De Geelbuikvuurpad, Bombina variegata (L.), in Nederland met uitsterven bedreigd. Natuurhistorisch Maandblad 73 (4): 84-89 HEIJKERS, L. 1990 Poelenaanleg in Limburg 1980-1990. Natuurhistorisch Maandblad 79 (12): 288-291. HORST, J.TH. TER, 1959. Iets over de bescherming van reptielen en amfibieën in Zuid-Limburg. De Levende Natuur 62 (5-6): 138-144. HORST, J.TH. TER, 1960. De verspreiding der Amphibia en Reptilia in Zuid-Limburg. Natuurhistorisch Maandblad 49 (9-12): 105-118. LAAN, R. & B. VERBOOM, 1986. De Geelbuikvuurpad (Bombina variegata) in Zuid-Limburg.Het kan nog! Rapport 259. Zoologisch Laboratorium, afdeling Dieroecologie, Katholieke Universiteit Nijmegen, Nijmegen. LAAN, R. & B. VERBOOM, 1990. De Geelbuikvuurpad en de Vroedmeesterpad. Verleden heden en toekomst. Ministerie van Landbouw, directie Natuur, Milieu en Faunabeheer. 38 p. LENDERS, A.J.W. 2000 Beschermingsplan vroedmeesterpad en Geelbuikvuurpad 2000-2004. Ministerie van Landbouw, Natuurbeheer en Visserij, ’s Gravenhage. NIEUWENHOVEN-SUNIER, L. VAN, P.J.H. VAN BREE & S. DAAN 1965. Notities over de geelbuikpad Bombina variegata (Linnaeus, 1758) in Nederland. Natuurhistorisch Maandblad 54 (1): 7-14. RAAIJMAKERS, C.J. & E.F. ELZENGA, 1976. Herpetologische waarnemingen in Zuid-Limburg 1975. Werkgroep Limburg van Lacerta. SMIT, R.C.J., 1981. Verspreiding en biotopen van amfibieën in Zuid-Limburg e.o. De situatie in1980. Instituut voor Taxonomische Zoölogie, Universiteit van Amsterdam / Rijksinstituut voor Natuurbeheer, Amsterdam / Leersum. WIJK, D.P., VAN, 1946. Herpetogeografische Dienst. Verslag over de ontvangen opgaven in de jaren 1944. Lacerta Nieuws 4 (1). 3 -5.

55

De Nederlandse populatie van Geelbuikvuurpad in Zuid-Limburg: een genetische analyse

Recommend Documents