EKSPRESI PROTEIN SPESIFIK DALAM BIOSINTESIS MINYAK, DAN KLONING GEN PENYANOI ht-ACCase SUBUNIT BIOTIN KARBOKSILASE DAN ENOIL-ACP REDUKTASE DARI MESOKARP KELAPA SAWIT (Elaeis guineensis Jacq.)
ASMINI BUDIANl
i) /- .
'>$\'---' 1
~,
...:'1'.
--.1>
Z
"'_. ~ ~.
.--..,,--..
\," ...
SEKOLAHPASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGaR
2005
ABSTRAK ASMINI BUDIANI. Ekspresi protein spesifik dalam biosintesis minyak, dan kloning gen penyandi ht-ACCase subunit biotin karboksilase dan enoilACP reduktase dari mesokarp kelapa sawit (Elaeis guineensis Jaq). Oi bawah bimbingan HAJRIAL ASWIDINNOOR, DJOKO SANTOSO, ANTONIUS SUWANTO DAN SUGENG SUDIATSO.
Ketersediaan gen yang terlibat dalam biosintesis minyak kelapa sawn serta pemahaman mengenai regulasi ekspresinya merupakan faktor penting dalam rekayasa genetika peningkatan produksi dan kualitas minyak sawit. Sebagai tahap awal dalam usaha rekayasa genetika metabolisme minyak, penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi dan mengklon gen-gen kunci dalam biosintesis minyak pada mesokarp buah sawit. Untuk mencapai tujuan tersebut ditempuh dua pendekatan yaitu proteomik dan genomik, yang dalam disertasi ini dituangkan dalam empat tahapan penelitian, yaitu (1) lsolasi dan ide ntifikasi protein yang terekspresi secara djferensial sesuai tahapan perkembangan buah, (2) Ekspresi ACCase dan kloning gen penyandi subunit biotin karboksilase htACCase dari mesokarp buah sawit, (3) Kloning gen penyandi enoil-ACP reduktase dari mesokarp buah sawit, dan (4) Konstruksi pustaka eDNA dari meso karp buah sawit berumur 19 minggu setelah anthesis dengan kandungan minyak 20%. Penelitian tahap pertama bertujuan untuk mendeteksi, mengisolasi dan mengidentifikasi protein yang terekspresi secara diferensial sejalan dengan tahapan perkembangan buah dan kandungan minyak, sehingga diperoleh informasi enzim-enzirn yang berperan penting dalam biosintesis minyak sawit. Pada percobaan ini dilakukan analisis minyak dan protein mesokarp dari berbagai umur buah sawit. Hasil penelitian menunjukkan terdapat variasi pada umur buah saat tanaman mulai memasuki periode aktjf sintesis minyak, yaitu antara 17 - 21 WAA. Terdeteksi dua pita protein masing-masing dengan berat molekul 31 dan 34,3 kDa yang meningkat ekspresinya secara tajam saat buah mulai aktif mensintesis minyak hingga buah masak. Sikuen asam amino dari protein 31 kOa mempunyai homologi dengan subunit biotin karboksilase ht-ACCase dan enoit-ACP reduktase, sedangkan protein 34,3 kDa memiliki homologi dengan gliseraldehid-3P dehidrogenase. Atas dasar hasil percobaan pertama dirancang primer yang digunakan pad a percobaan berikutnya untuk mengamplmkasi daerah konservatif gen penyandi subunit biotin karboksilase ht-ACCase dan enoit-ACP reduktase. Be rdasarkan hasil penelitian pada tahap pertama yang menunjukkan bahwa ht-ACcase subunit BC berperan penting dalam biosintesis minyak sawit, maka pada penelitian tahap kedua dilakukan analisis untuk mempelajari pola aktivHas ACCase selama tahapan perkembangan buah, deteksi keberadaan dan ekspresi kedua jenis ACCase pada mesokarp buah sawit, yaitu ht-ACCase dan hm-ACCase,
dan kloning gen penyandi subunit biotin karboksilase ht-ACCase menggunakan teknik RACE. Analisis aktivitas ACCase dilakukan menggunakan HPLC dengan mengukur kecepatan penurunan konsentrasi asetil-CoA dan kecepatan peningkatan konsentrasi matonil-CoA. Deteksi ht-ACCase dan hm-ACCase dilakukan dengan hibridisasi Westem. Hasil analisisi menunjukkan bahwa ACCase merupakan enzim kunci biosintesis minyak pada mesokarp buah sawit terbukti dari peningkatan aktivitasnya sejalan dengan peningkatan umur buah dan kandungan minyak mesokarp. Mesokarp buah sawit memiliki kedua jenis ACCase, heteromerik maupun homomerik. Peran ht-ACCase nampak lebih dominan dalam akumulasi minyak pada mesokarp dibandingkan dengan hm-ACCase. Gen penyandi subunit BC ht-ACCase telah dikJon dalam bentuk eDNA daerah ujung 5' dan 3'. Pada percobaan tahap ketiga dilakukan kloning gen penyandi enoilACP reduktase. Menggunakan pendekatan yang sarna dengan percobaan kedua, eDNA daerah ujung 5'- dan 3'- penyandi enoil-ACP reduktase juga telah berhasil diklon. Percobaan keempat bertujuan untuk rnengkonstruksi pustaka eDNA dari mesokarp buah sawit yang sedang aktif mensintesis minyak. Pustaka eDNA dikonstruksi dalam vektor pGEMT dan vektor ATripIEx2. Hasil analisis sebagian klon rekombinan menunjukkan bahwa ukuran insert berkisar antara 400 pb hingga 3000 pb.
ABSTRACT ASMINI BUDIANI. Expression of specmc proteins in oil biosynthesis and doning of genes encoding biotin carboxylase subunit of ht-ACCase and enoyl-ACP reductase from oil palm mesokarp (Elaeis guineensis Jaq). Under supervisor: HAJRIAL ASWIDINNOOR, DJOKO SANTOSO, ANTONIUS SUWANTO AND SUGENG SUDIATSO. The availability of genes involved in palm oil biosynthesis and the understanding on regulation of their expression are important factors in genetic engineering to improve oil productivity and quality. As a preliminary research work on genetic engineering of palm oil metabolism, this research was aimed to identify and clone genes encoding key enzymes of oil biosynthesis in the mesocarp. Four research activity covering proteomic and genomic approaches, were conducted. These were (1) Detection, isolation and identification of proteins differentially expressed during fruit development; (2) Expression of ACCase and cloning of gene encoding biotin carboxylase subunit of ht-ACCase from oil palm mesoarrp; (3) Cloning of gene encoding enoyl-ACP reductase from oil palm mesocarp; and (4) Construction of eDNA library from oil palm mesocarp of 19 week after anthesis ~ AA) with 20 % oil content. The objective of the first research activities were to detect, isolate and identify proteins differentially expressed during fruit development and oil accumulation, in order to obtain infonnation on the enzymes that played important role in palm oil biosynthesis. Analysis of oil content and total protein in the mesocarp from different fruit development were conducted. The results showed that there was variation (from 17 to 21 WAA) on the time when the active period of oil synthesis started. Two protein bands with molecular weight of 31 and 34.3 kDa were differentially expressed during fruit development. Amino acid sequence of 31 kDa-protein was found to be homologous with biotin carboxytase subunit of ht-ACCase and enoyl·ACP reductase, while the 34.4 kDa-protein was homologous with glyceraldehydes-3P dehydrogenase. Based on results gathered from the first research adivities, oligonucleotide primers were designed and subsequently used in the second and third activities involving ampliftcation of the conserved region of genes encoding biotin carboxylase subunit of ht-ACase and enoyl-ACP reductase. Considering the fact that BC subunit of ht·ACCase plays an important role on oil biosynthesis in oil palm mesocarp as shown in the previous results, the second research activities 'were directed to (1) study the pattern of ACCase activity during fruit development, (2) detect htACCase and hm-ACCase and their expression in the mesocarp of oil palm, and (3) done the gene encoding biotin carboxylase subunit of htACCase using RACE technique. Analysis of ACCase activity was determined using HPLC by measuring the rate of decrease in acetyl-CoA concentration and the rate of increase in malonyl-CoA concentration.
'~
Detection of ht-ACCase and hm-ACCase in the mesocarp was done by Western hybridization. The results showed that the increase of ACCase activity coincided with the oil accumulation in the mesocarp, indicating that this enzyme played important role in oil accumulation. Both ht-ACCase and hm-ACCase were detected in the mesocarp, however the role of htACCase on oil accumulatk>n seem to be more signiftcant than hmACCase. Gene encoding BC subunit of ht-ACCase has been partially cloned as 5'-end and 3'-end cDNAs. The third research activity was aimed to clone gene encoding enoyl-ACP reductase, a component of fatty acid synthase that catalyse last step in addition of two carbon atom. Using the same approach as that of ht-ACCase cloning, the 5'- end and 3' -end eDNA encoding that enzyme has been cloned. The fourth reseach was to construct eDNA library from the mesocarp that actively synthesizes oil. A eDNA library was constructed in pGEM-T vector and in ATriplEx2 vector. Analysis of recombinant clones of the library in pGEM-T vector revealed that the size of inserts were in the range of 400 bp - 3.000 bp.
JudulDisertasi
Ekspresi protein spesifik dalam biosintesis minyak. dan kloning gen penyandi ht-ACCase subunit biotin karboksilase dan enoil-ACP reduktase dari mesokarp kelapa sawit (Elaeis guineensis Jaq).
Nama Mahasiswa
Asmini Budiani
Nomor Pokok
985034/AGR
Program Studi
AgronomiIBiologi Molekuler Tanaman
Disetujui, 1. Komisi Pembimbing
~/C_~
7~
Dr. Ir Hajrial Aswidinnoor, MSc. Ketua
Prof. Dr. Antonius Suwanto, MSc. Anggota
Dr. Djoko Santoso, MSc. Anggota
Diketahui, 2. Ketua Program Studi Agronomi
Dr. Ir. Satriyas lIyas, MS. Tanggal ujian : 23 Desember 2004
3. Oekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Syafrida Manuwoto, MSc. Tanggallulu5:
1 1 FEB 200i
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Purwokerto pada tanggal 14 Agustus 1961 dan ayah Sandiman dan ibu Chusnijah. Penulis merupakan anak pertama dari delapan bersaudara dan ibu dan lima orang anak. Pendidikan dasar dan menengah diselesaikan di Purwokerto, Jawa Tengah, yaitu Sekolah Dasar Negeri di Purwokerto, lulus pada tahun 1973, Sekolah Menengah Pertama Negeri 1 di Purwokerto, lulus pada tahun 1976 dan pada tahun 1980 penulis lulus dari 5ekolah Menengah Atas Negeri 1 Purwokerto. Gelar Sarjana Kimia (51) diperoleh dan Fakuftas Matematika dan IImu Pengetahuan Alam Universitas Gadjah Mada di Yogyakarta pads tahun 1985. Gelar Magister Sains (S2) diperoleh dan Program Pascasarjana, Program Studi Bioteknologi Institut Pertanian Bogor di Bogor pada tahun 1998. Pada tahun yang sarna penulis melanjutkan studi ke jenjang doktor (S3) pada Program Studi AgronomiIBtologi Molekuler Tanaman di Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Penulis
Bekerja
sebagai
stat peneliti
di
Balai
Penelftian
Bioteknologi Perkebunan Bogor (Sekarang Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia) sejak tahun 1986 hingga sekarang.
PRAKATA Bismiltahirohmanirohim, Alhamdulillah, puji syukur yang tak terhingga penulis panjatkan ke hadirat Allah swt., atas pertolongan, kemudahan dan ridho-Nya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan disertasi ini. Penelitian yang berjudul "Ekspresi protein spesifik dalam biosintesis minyak dan kloning gen penyandi ht-ACCase subunit biotin karboksilase dan enoilACP reduktase dan mesokarp kelapa sawit (Elaeis gu;neensis Jaq) dilaksanakan di Laboratorium Biomolekular dan Rekayasa Genetika Balai Pene/itian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI) di Bogor dan di Lab. Biokimia dan Biofisika, Iowa State University di Ames, Amerika Senkat dari bulan September 2000 sampai Maret 2004. Penulis berharap hasil penelitian ini dapat menjadi fondasi bag; penelitian-penelitian selanjutnya,
sehingga dapat memberikan sumbangan
berarti bagi
kemajuan dunia kelapa sawit di Indonesia khususnya dan bag; kesejahteraan rakyat pada umumnya. Banyak sekali pihak yang membantu hingga penelitian ini dapat diselesaikan. Oleh karena itu dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang tulus dan penghargaan yang tinggi kepada : 1. Dr. Ir. Hajrial Aswidinnoor, MSc, sebagai Ketua Komisi Pembimbing; Dr. Djoko Santoso, MSc., Prof. Dr. Antonius Suwanto, MSc., dan Prof. Dr. Sugeng Sudiatso, MS. (aim.), masing-masing sebagai anggota komisi pembimbing, atas bimbingan dan arahan yang sangat berharga sejak perencanaan penelitian hingga selesainya disertasi ini.
2.
fr.
Basuki,
MS,
mantan
Kepala
Unit
Penelitian
Bioteknologi
PerKebunan Bogor atas ijin yang diberikan kepada penulis untuk melanjutkan studi pada jenjang Doktor, di Sekolah Pascasarjana IPB. 3.
Dr. Dannono Taniwiryono, MSc. selaku Kepala Balai Penelitian Bioteknologi PerKebunan Indonesia, atas segala bantuan dan motivasi yang diberikan.
4.
Dr. Didiek Hadjar Goenadi, MSc., selaku Direktur Eksekutif Lembaga Riset Perkebunan Indonesia, atas ijin dan dukungannya.
5.
Ir. Toto Sudjarwo, MS. dan Ina Purwantini, SE, masing-masing selaku Kepala dan Bendahara Proyek PHT Deptan atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk melaksanaan sebagian penelitian di IOWA State University, Ames - Amerika Serikat.
6.
Prof. Dr. Basil J. Nikolau di Laboratorium Biokimia dan Biofisika, Iowa State University, Ames - Amerika serikat atas bimbingan dan arahan yang diberikan kepada penulis dalam melaksanakan penelitian di laboratorium tersebut.
7.
Dr. Siswanto, DEA, Ora. Tatty Chaidamsari, MSi. serta kawan-kawan penelm BPBPI atas saran dan dorongan motivasi serta persahabatan tulus yang selalu diberikan.
8.
Seluruh stat pengajar dan pegawai di lingkup Sekolah Pascasarjana IPS, atas sagala layanan dan bantuan yang diberikan.
9.
Seluruh keluarga di laboratorium Rekayasa Genetika BPBPI, Topani, Zulva, Sri, Endang. Wiwin, Nia, Fifi, Herti. Wawan, Bakhtiar, Wahyu atas bantuan dan kerjasamanya.
10. Suami Dr. Eggi Sudjana, SH. Msi., serta anak - anak tercinta Muhammad Alfath Tauhidillah, Hizbullah Ash-Shidiqi, Athieqah AsySyahidah, Yusuf Mukhlisin dan Jihar Gifari atas segala pengertian dan doa--doanya. 11. Terakhir, secara khusus penulis mengucapkan rasa terima kasih yang tulus dan rasa hormat yang setinggi-tingginya kepada ayahanda almarhum Sandiman dan Ibunda Chusnijah yang tak pemah putus dalam berdoa; kepada Ibu dan ayah mertua, adik-adik serta kakakkakak dan adik-adik ipar yang senantiasa tulus memberikan doa, perhatian dan dorongan semangat. Semoga Allah membalas kebaikan Bapak. Ibu dan saudarasaudara semua, dan memberikan kemudahan dalam segata urusan yang dihadapi.
Bogor. September 2004
Asmini Budiani
DAFTAR GAMSAR.......... .............. ................ .................... ......................
xvii
DAFTAR LAMPIRAN ...............................................................................
xxi
BAB-I: PENDAHULUAN Latar Selakang .................................... .................... ............................ Tujuan..................................................................................................
1 4
BAS-II: TINJAUAN PUSTAKA Tanaman Kelapa Sawn ............... ................ ...................... .................. Biosintesis Triasilgliserol pada Tanaman............................................. Rekayasa Genetika Biosintesis Minyak pada Tanaman ................ ......
5 8 16
BAB-"': ISOLASI DAN IDENTIFJKASr PROTEIN YANG TEREKSPRESI SECARA DIFERENSIAL SESUAI TAHAPAN PERKEMBANGAN BUAH PENDAHULUAN ................................................................................ BAHAN DAN METODE ........... .................. ................... ...................... Bahan Penelitian ............................................................................. Analisis Kandungan Minyak dan Protein Mesokarp Ekstraksi minyak dari meso karp buah sawit............................... Ekstraksi protein dari mesokarp buah sawit ......................... ...... Pengaruh Buffer Ekstraksi temadap Kandungan Protein dan Pola SDS-PAGE.............................................................................. Deteksi Protein yang Terekspresi Secara Diferensial Sesuai Tahapan Perkembangan Buah............................................ Analisis Protein dengan elektroforesis Dua Dimensi (2-D).............. lsolasi dan Sikuensing Protein Spesifik... ........................ ................ HASIL DAN PEMBAHASAN........ .................. ............................. ........ Pola Biosintesis Minyak dan Protein Total Mesokarp Berbagai Tahapan Per1(embangan Buah Sawit....................... ........ Pengaruh Buffer Ekstraksi Temadap Pola Sds-Page dan Konsentrasi Protein.......... ................ ............... ................................ Deteksi Protein yang Terekspresi Secara Dtferensial Sesuai Tahapan Perkembangan Buah........................................................ KESIMPULAN ....................................................................................
xiii
23 25 25 25 26 26 27 28 28 29 29 33 35 42
BAB-IV: EKSPRESI ACCase DAN KLONING GEN PENYANDI SUBUNIT BIOTIN KARBOKSILA.5E ht-ACCase DARI MESO KARP BUAH SAWIT PENDAHULUAN .......... .............. ................. .................. ..................... BAHAN DAN METODE ................ .............. ... ....................... .............. Aktivitas Accase dari Mesokarp Berbagai Tahapan Per1<:ernbangan Buah................................................................................................ Deteksi Accase dengan Western Blot ............... .............................. Kfonlng Gen Penyandi Biotin Karboksilase ..................................... Amplifikasi dan kloning daerah konservatif gen penyandi BC .... Amplifikasi daerah konservatif gen penyandi BC dengan RT-PCR...................................................................................... Amplifikasi daerah ujung 5'- dan 3'-gen penyandi BC dengan teknik RACE............ ............ .................. ..................... ................ HASIL DAN PEMBAHASAN......... ................... ....................... ............ Aktivitas ACCase Mesokarp Berbagai Tahapan Per1<:embangan Buah Sawit ...................................................................................... Deteksi ACCase dengan Western BloL.......................................... Kloning Gen Penyandi Biotin Karboksilase ..................................... Amplmkasi dan kloning daerah konservatif gen penyandi BC.... 5'-RACE dan 3'-RACE untuk gen penyandi subunit BC............. KESIMPULAN .................................................................................... BAB-V: KLONtNG GEN PENYANDf ENOIL-ACP REDUKTASE DARI MESOKARP BUAH SAWIT PENDAHULUAN ..................... .................. ................. ......................... BAHAN DAN METODE ............. ................... .............. ..... .................... Bahan Tanaman.............................................................................. Metodofogi................................. ..................................... ................. Amplifikasi dan kloning DNA daerah konservatif gan penyandi ENR dengan RT-PCR ................................................................ Amplifikasi dan kloning daerah ujung 5'- dan 3'-ENR dengan teknik RACE ........... ............... ................ ........................ ............. HASfL DAN PEMBAHASAN........ ........................................................ Amplifikasi dan Kloning DNA Daerah Konservatif Gen Penyandi ENR................................................................................. Amplifikasi dan Kloning Oaerah Ujung 5'- dan 3'- Gen Penyandi ENR.. ........................... ................ ...................... .............. KESIMPULAN ..... .............. ......... .........................................................
xiv
43 46 46 46 47 47 48 50 52 52 53 56 56 60 66
68 69 69 70 70 74 76 76 79 87
BAB-VI: KONSTRUKSI PUSTAKA eDNA DARI MESOKARP BUAH SAWIT PERIODE AKTIF SINTESIS MINYAK PENDAHULUAN ................................................................................ BAHAN DAN METODE .................. ................. ...................... ............. Bahan Tanaman, Galur Balderi dan Veldor yang Digunakan. ......... lsolasi RNA Total dari Jaringan Mesokarp .... .......................... ........ Sintesis eDNA dari RNA Total... .................. ........... .................. ...... Konstruksi pustaka eDNA dalam vektor pGEM-T ............................
88
89 89 89 90 91
Konstruksi pustaka eDNA dalam veldor ATriplEx2 ..... ..................... HASIL DAN PEMBAHASAN............................................................... Isolasi RNA Total dan Sintesis eDNA dari Jaringan Mesokarp........ Konstruksi Pustaka eDNA pada Vektor pGEM-T.... .........................
92 93 93 97
Konstruksi Pustaka eDNA pada vektor ATriplEx2 .... ....................... KESIMPULAN ........... ................ ................ ................... .......... ............
100 102
BAB-VII: PEMBAHASAN UMUM .............................................................
103
BAB-VIII: KESIMPULAN UMUM DAN SARAN ........................................
108
DAFTAR PUSTAKA........... .............. ................ ....................... .............. ...
111
LAMPIRAN .......... ................ .............. ................ ........................ ..............
120
xv
DAFlAR lABEL Nomor
J udu I
Halaman
1.
Empat jenis larutan buffer yang digunakan untuk ekstraksi protein dari mesokarp buah sawit ..................
27
Konsentrasi protein total yang diekstrak menggunakan empat buffer berbeda dari 3 janis tandan kefapa sawit......
34
Hasil analisis elektroforeisis 20 ekstrak protein mesokarp umur 8, 17 dan 22 minggu.. .......... .... ....... ......
38
Sikuen pol ipeptid a yang menunjukkan homolog; dengan enzim biosintesis minyak...................................
40
Daftar primer yang digunakan untuk amplifikasi daerah ujung 5'- dan 3'-gen penyandi biotin karboksilase..........
51
Hubungan antara kandungan minyak dengan aktrvitas ACCase dalam mengubah asetil-CoA menjadi malonilCoA................................................................................
52
Daftar primer yang digunakan untuk amplifikasi daerah ujung 5'- dan 3'- gen penyandi ENR............. ..................
75
Ligasi meggunakan 3 rasio cDNAlvektor yang berbeda..........................................................................
93
Konsentrasi dan kemumian (rasio A260/A280) RNA total hasil isolasi menggunakan prosedur Chang at al. (1993) dan menggunakan Kit RNeasy Mini....................
95
Jumlah koloni rekombinan (koloni berwama putih) dan koloni biru hasil transformasi yang tumbuh pada media seleksi dan titer dari setiap pustaka eDNA yang dihasllkan........ .. ..............................................................
98
Titer pustaka eDNA yang dikonstruksi pada vektor ATripEx2 sebelum dan sesudah diamplifikasi...... ..........
101
2. 3.
4.
5. 6.
7.
8. 9.
10.
11.
XVI
DAFTAR GAMBAR Nomor
J uduI
Halaman
1.
Tahapan pembentukan asam lemak dan enzim-enzim yang berperan: (1) asetil-CoA:ACP transasilase, (2) malonil-CoA:ACP transasilase, (3) ~-ketoasil-ACP sintetase, (4) ~-ketoasil-ACP reduktase, (5) Jlhidroksiasil-ACP de hid ratase, dan (6) enoil-ACP reduktase ........................................................................
14
2.
Sintesis triasilgliserol melalui Lintasan Kennedy.............
16
3-A
Pola biosintesis minyak dan konsentrasi protein dari 3 tanaman assJ kuttur jaringan (KJ) yang diserbuk secara alamL...............................................................................
30
Pola biosintesis minyak dan konsentrasi protein dart enam tanaman assl biji (BJ) hasil penyerbukan secara alam; ...............................................................................
31
Pola biosintesis minyak dan konsentrasi protein dari tanaman asal kuttur jaringan (KJ) dan asal biji (BJ) dengan penyerbukan secara buatan ..............................
32
Pola SDS-PAGE protein mesokarp buah sawit dari 3 tandan berbeda (1-3) yang diekstrak dengan ampat tipe buffer.......................................................................
34
5-A
Hasil analisis kandungan minyak dan protein total........
36
5-8
Pola SOS-PAGE protein dan mesokarp sawit berbagai umur. ..................................................................
36
Pola IEF pada mesokarp sawit berbagai umur (A), Pola elektroforesis dua dimensi (8).........................................
37
Lokalisasi dan peran ACCase heteromenk (ht-ACCase) dan ACCase homomerik (hm-ACCase).. .... .......... ..........
45
Penampilan gratis hasil aligment daerah konservatif gen penyandi Be dari beberapa tanaman dan posisi primer BC-F dan BC-R (anak panah)..............................
49
3-8
3-C
4.
6. 7.
8.
xvii
9.
10. 11.
12.
13. 14.
15.
16.
17.
18.
Hasil analisis western Blot pada mesokarp buah yang aktif mensintesis mnyak pada berbagi konsentrasi protein total, dan perbedaan tingkat ekspresi BCCP antara buah yang aktif mensintesis ....... .......... ...........
53
Hasil deteksi hm-ACCase pada gel SDS-poliakrilamid 7%, 1ODIo dan 5 D Io ••....••......••••.....••••..•••.••••......•.....•••.••.....
55
Hasil RT-PCR untuk biotin karboksilase pada (A) berbagai temperatur annealing dan konsentrasi MgCI2 , (B) berbagai temperatur annealing dengan konsentrasi MgCI2 ; (C) pada 60°C dengan konsentrasi MgCI2 2 mM.. ........ ..... ...... ...... ..........................................
57
PCR koloni hasil transformasi fragmen daerah konservatif gen penyandi BC, dan hasil digesti plasmid rekombinan yang diisolasi dari koloni putih dengan
EcoRI...............................................................................
59
Hubungan antara primer spesifik dengan templat DNA dalam RACE....................................................................
61
Hasil RACE untuk S'BC menggunakan primer UPM dan RC-BCR pada temperatur annealing 57, 58, 59 0 C dan berbagai konsentrasi MgCI2. PCR kolani hasil transformasi s'ac dan hasil isolasi plasmid rekombinan dari koloni no. 38.............. ........................... ....................
62
(A) Hasil RACE untuk 3'-BC menggunakan primer NUPM dan NBCF pada temperatur annealing 68°C; (8) peR koloni hasil transformasi 3'BC dan (C) hasil isolasi plasmid rekombinan dari koloni no. 3, 4, 6 (Iajur 1,3 dan 5 = tidak didigesti; lajur 2,4 dan 6 = didigesti dengan EcoRI).............................................................................
64
Contig dari S'-BC dengan 3'-BC yang menghasilkan sikuen konsensus gen penyandi biotin karboksilase lengkap berukuran 2186 bp............................................
65
Penampilan Gratis daerah konservatif gen penyandi ENR hasi' aJignmen eDNA penyandi gen ENR dari berbagai tanaman dan lokasi primer........ ........... ............
72
Hasil ampfifikasi fragmen ENR (A) pada barbagi temperatur annealing; (8) konsentrasi MgCI2 (C) preparative gel pada temperatur annealing 57°C dan Mg 2,5 mM..... ...... .......... ......................... ........... ......
77
xviii
19.
20.
21 . 22.
Hasil PCR koloni hasil transformasi fragmen ENR untuk analisis adanya insert daerah konservatif gen penyandi ENR.................................................................................
78
Plasmid rekombinan hasil isolasi dari kolon; no 3, 4, 6 dan 7. (A) tanpa digesti dan (8) yang didigesti dengan EcoRI...............................................................................
79
peR untuk internal kontroI 5'-ENR dan 3'-ENR pada berbagai temperatur annealing.................. .......... ...........
80
Hasil RACE untuk 5'-ENR menggunakan kombinasi pasangan primer yang berbeda (A UPM+RC-ENR; B = NUPM+Re-ENR; e NUPM+NENR)..........................
81
Hasil analisis PCR koloni rekombinan dari hasil transformasi fragmen hasil amplifikasi menggunakan pasangan primer yang berbeda (A) primer UPM+RCENR; (8) primer NUPM+RC-ENR; dan (C) primer NUPM+NENR.................................................................
83
Plasmid rekombinan yang diisolasi dari klon-klon 5'EAR hasil transformasi tanpa digesti dan didigesli dengan EcoRI. (A) kolon; berasal dan transforrnasi fragmen hasil amplifikas; dengan primer UPM+RCENR; (8) NUPM+Re-ENR dan (e) NUPM+NENR.........
84
Hasil RACE untuk 3'-EAR pad a berbagai temperatur annealing yang berbeda menggunakan pasangan primer NUPM dan NENF.................................................
85
Hasil analisis peR kolon; hasil transformasi daerah ujung 3'-ENR........................................................
85
Plasmid hasil isolasi dari klon-klon 3'-ENR, tanpa digesti dan dengan digesti menggunakan EcoRl............
86
Contig dari sikuen konsensus daerah ujung 5'-EAR dan daerah ujung 3'-ENR.......................................................
86
Buah keJapa sawit pada liga umur yang berbeda. Dari kiri ke kanan buah muda, sedang dan tua, serta penampang melintangnya (bawah )....... ......... ............ .....
94
=
=
23.
24.
25.
26. 27. 28. 29.
xix
30.
31.
32.
33.
34.
Profit elektroforesis RNA total dan jaringan mesokarp buah kelapa sawit yang diisolasi dengan prosedur Chang et al. (1993) yang dimodifikasi (A) dan dengan kit (B). dan buah muda (1 dan 3), dan buah sedang (2 dan 4)..........................................................................
95
CA) eDNA hasit sintesis dan RNA total mesokarp buah sawit (Iajur 1= eDNA sampel; lajur 2= eDNA kontrol): CB) eDNA hasil fraksinasi kolom......................................
97
Seleksi hasil transformasi pada media LA yang mengandung ampisilin, IPTG dan x-Gal (A). dan sebagian dari pustaka eDNA yang disimpan dalam media padat LA+ampisilin (8).......... .................. .............
99
Distribusi ukuran plasmid yang diisolasi dari koloni hasit transformasi. M=DNA marker ')JHindl II , EcoRI; 1&2=koloni biru sebelum dan setelah digesti dengan Sail; 3-19=koloni putih setelah digesti dengan
Sa/l..................................................................................
100
Salah satu plate hasit pentiteran pustaka eDNA dalam vektor 1................................................................
100
xx
DAFTAR LAM PI RAN
Nornor
J uduI
1.
Hasil pengukuran aktivitas ACCase ...............................
2.
Pata restriksi vector pCR 2.1 - TOPO........................... .
3-A
Sikuen DNA daerah konservatif gen penyandi subunit BC ht-ACCase ............................................................... ..
125
Blastn DNA daerah konseNatif gen penyandi subuntl BC ht-ACCase .................................................................
126
Sikuen DNA daerah ujung 5'-gen penyandi subunit BC ht-ACCase .......................................................................
127
Blastn DNA daerah ujung 5'-gen penyandi subunit BC ht-ACCase ...................................................................... .
128
Sikuen DNA daerah ujung 3'-gen penyandi subunit BC ht-ACCase ...................................................................... .
129
Blastn DNA daerah ujung 3'-gen penyandi subunit BC ht-ACGase ...................................................................... .
130
Sikuen konsensus gan lengkap penyandi subunit BC ht-ACCase .......................................................................
131
Blastn sikuen gen lengkap penyandi subunit BC htACCase
133
Blastp sikuen asam amino hasif translasi sikuen DNA gen lengkap penyandi subunit Be ................................... .
134
Sikuen DNA daerah konservatif gen penyandi ENR tertdon .............................................................................
138
Blastn DNA daerah konservatif gen penyandi ENR terklon ............................................................................
139
Sikuen DNA daerah ujung 5'-gen penyandi ENR terklon .............................................................................
141
Blastn DNA daerah ujung 5'-gen penyandi ENR terklon ............................................................................
142
3-8
3-C 3-D 3-E 3-F 3-G 3-H 3-1
4-A 4-B 4-C 4-D
XXI
Halaman
120 124
4-E 4-F
4-G 4-H
4-1
Sikuen DNA daerah ujung 3' -gan penyandi ENR terklon..... ....... ........ ........... ....... .......... ......... .......... ..........
144
Blastn DNA daerah ujung 3'-gen penyandi ENR terkJon.............................................................................
145
Sikuen konsensus hasil analisis contig gen penyandi ENR................................................................................
147
Blastn sikuen konsensus gen penyandi ENR hasil analisis contig.................................................................
148
Blastx sikuen asam amino hasil translasi sikuen konsensus gan penyandi ENR ........................................
150
xxn
