J. Sains MIPA, Edisi Khusus Tahun 2007, Vol. 13, No. 1, Hal.: 39 - 43 ISSN 1978-1873
PENDEKATAN KLONING GEN UTUH DENGAN PENDEKATAN HIBRIDISASI DNA KROMOSOM MENGGUNAKAN PENANDA FRAGMEN GEN BERSANGKUTAN Mulyono Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung Jl. Soemantri Brojonegoro No.1 Bandar Lampung 35145 Email:
[email protected] Diterima 28 Agustus 2007, perbaikan 10 Desember 2007, disetujui untuk diterbitkan 27 Desember 2007
ABSTRACT A bacterium named Bacillus cereus strain 10-L-2, which grew well in a medium containing 0.07% (w/v) p-fenilendiamin and 1% (w/v) Polypepton, showed a broad acetylation activity toward aniline and its derivatives. The enzyme, arylamine N-acetyltransferase (NAT) had been isolated and purified. To clone the whole gene a hibridization approach was conducted. By using an optimized PCR method, a fragment encoding of NAT gene had been amplified. The fragment then used as probe in a hibridization of the chromosomal DNA strain 10-L-2 digested by several restriction enzymes. The result showed that the chromosomal DNA digested with HindIII, ClaI, EcoRI and XbaI showed positive signal with varies of fragments sizes. The positive signal means these fragment contain a complete gene or fragment of the gene. Further advanced experiment needed to clone the whole gene of NAT by investigating which of those fragment contains the whole gene. Keywords: hibridisasi, kloning gen, Bacillus, metabolisme anilin
1. PENDAHULUAN Anilin dan senyawa turunannya (Gambar 1) dikenal sebagai bahan baku dasar dan senyawa antara yang digunakan dalam produksi pewarna, pestisida, herbisida, industri karet, zat peledak dan lain-lain. Senyawa ini dapat lolos ke lingkungan baik secara tidak sengaja dalam penggunaanya ataupun melalui pembuangan rutin air limbah yang tidak terolah dengan baik. Senyawa ini kemudian dapat ditransformasi ke dalam bentuk yang lebih toksik baik secara kimia, fisika, maupun mikrobiologi 1).
Gambar 1. Aniline dan senyawa turunannya. a: anilin, b: toluidin, c: asam aminobenzoat, d: kloroanilin, e: aminofenol, f: fenilendiamin, dan g: nitroanilin. Posisi gugus pensubstitusi dapat terletak pada posisi orto, meta atau para 4).
2007 FMIPA Universitas Lampung
39
Mulyono Pendekatan Kloning Gen Utuh dengan Pendekatan Hibridisasi
Fenilendiamin adalah senyawa utama yang banyak dipakai dalam industri pewarna dan pewarna rambut 2) dan telah dilaporkan berkaitan erat dengan bertambahnya kasus kanker kandung kemih yang dialami para pekerja pabrik zat pewarna. Fenilendiamin juga dilaporkan bersifat karsinogen pada Salmonella typhimurium strain TA98 yang diuji oleh Garrigue et al.3). Belum adanya publikasi yang menjelaskan bagaimana metabolisme fenilendiamin oleh mikroorganisme mendorong penelitian ini dilakukan. Sebelumnya telah dilaporkan keberhasilan amplifikasi fragmen DNA pendek 0.2 kb yang mengkode gen NAT dari Bacillus cereus strain 10-L-2, pada kesempatan ini hasil hibridisasi menggunakan fragmen tersebut terhadap DNA kromosom strain 10-L-2 yang telah dipotong dengan berbagai enzim restriksi, dilaporkan.
2. METODE PENELITIAN Isolasi bakteri dari tanah dilakukan dengan teknik diperkaya (enrichment culture) dengan para-fenilendiamin (PPD) sebagai senyawa target. Identifikasi morfologi isolat dilakukan dengan metode sebagaimana yang dilaporkan sebelumnya oleh Komagata, 1985 5). Analisis gen penyandi 16S rRNA mengikuti metode yang dilaporkan oleh Edward et al., 1989 6). Analisis senyawa metabolit dilakukan dengan HPLC dan GC-MS 4). Isolasi DNA kromosom dilakukan dengan metode standar yang dilaporkan sebelumnya 7). Amplifikasi DNA dengan teknik PCR dilakukan dengan metode standar. Kloning fragmen DNA hasil amplifikasi dilakukan dengan metode standar 7). Probe disiapkan dengan memotong DNA sisipan (insert) pada plasmid rekombinan menggunakan enzim EcoRI, dan kemudian dimurnikan dengan kit [QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden)]. DNA murni yang diperoleh kemudian dilabel alkaline phosphate [Gene Images AlkPhos Direct Labeling and Detection System (GE Healthcare, UK)], mengikuti instruksi protokol yang diberikan. Hibridisasi DNA dilakukan dengan beberapa tahapan. Sekitar 10 g molekul DNA kromosom dari strain 10-L-2 dipotong dengan 20 unit masing-masing enzim restriksi (Gambar 4). Setelah elektroforesis pada gel agarosa, sampel kemudian ditransfer ke membran filter nylon Hybond-N menggunakan alat bloting vakum VacuGene XL (GE Healthcare), mengikuti intruksi protokol yang diberikan. Setelah proses transfer, membran dikeringkan dan digunakan untuk proses hibridisasi. Proses hibridisasi dilakukan pada suhu 50°C selama 1 malam dengan pengocokan (60 putaran per menit) menggunakan larutan probe dalam larutan yang mengandung NaCl 0.5 M dan blocking reagent 4% (w/v). Membran kemudian dicuci dua kali masing-masing selama 10 menit dengan bufer pencuci primer [urea 2 M SDS 0.1% (w/v) -sodium phosphate 50 mM (pH 7.0)-NaCl 150 mM -MgCl2 1 mM dan blocking agent 0.2% (w/v)], diikuti dengan pembilasan dengan bufer pencuci kedua [Tris 50 mM NaCl 100 mM - MgCl2 2 mM ] sebanyak 2 kali masing-masing selama 5 menit. Deteksi signal dari membran dilakukan menggunakan membran Hyperfilm (FujiFilm, Tokyo), dengan inkubasi selama satu malam.
3. HASIL DAN PEMBAHASAN Satu isolat lokal bakteri, strain 10-L-2, berhasil diisolasi dari tanah menggunakan teknik kultur-diperkaya (enrichment culture) dengan media yang mengandung fenilendiamin. Isolat ini tumbuh optimum pada medium yang mengandung 0.07% PPD. Berdasarkan hasil identifikasi secara morfologi, sifat-sifat biokimia, dan gen 16S rRNA-nya menunjukkan bahwa bakteri tersebut termasuk dalam kelompok Bacillus cereus. Isolat ini kemudian dinamai Bacillus cereus strain 10-L-2 8). Kemampuan strain 10-L-2 dalam mendegradasi PPD diselidiki pada variabel media, suhu, pH dan konsentrasi PPD, untuk mengetahui kondisi optimum degradasinya. Pada kondisi optimum pertumbuhannya pada medium: pH medium 5.5, suhu 30°C, mengandung 0.07% (w/v) PPD dan 1%(w/v) Polypepton, strain 10-L-2 mampu mendegradasi PPD secara total dari medium kultur dalam waktu 30 jam. Hilangnya puncak spektrum PPD pada HPLC diikuti oleh munculnya sebuah puncak utama di posisi lain yang mempunyai perbandingan secara stokiometris. Produk ini tetap berada di dalam media kultur meskipun masa inkubasi strain 10-L-2 dalam medium tumbuh telah berakhir. Dari hasil analisis metabolit yang terakumulasi tersebut, strain 10-L-2 terbukti mampu mengasetilasi secara luas (braod specificity) pada senyawa anilin dan turunannya 4), 8). Enzim yang bertanggung jawab dalam proses asetilasi, arylamine N-acetyltransferase, yang lebih dikenal dengan nama NAT, telah berhasil dimurnikan dan ditentukan urutan asam amino N-terminalnya sebagaimana dilaporkan sebelumnya 9-10). Mekanisme reaksi asetilasi yang dikatalisis oleh enzim NAT dari strain 10-L-2 digambarkan pada Gambar 2. Berdasarkan spesifitas yang luas yang dimiliki oleh enzim NAT strain 10-L-2 ini, yang berpeluang digunakan untuk aplikasi reaksi asetilasi senyawa organik, yang dapat dilakukan dengan lebih cepat, spesifik, dan biaya-rendah (low cost),
40
2007 FMIPA Universitas Lampung
J. Sains MIPA, Edisi Khusus Tahun 2007, Vol. 13, No. 1
maka dipandang perlu untuk mengklon dan mengekspresikan gen penyandi NAT dari strain 10-L-2 ini. Pendekatan yang digunakan dalam kloning adalah dengan mengamplifikasi fragmen gen NAT dari strain ini yang kemudian akan digunakan untuk penanda (probe) dalam proses hibridisasi untuk kloning gen utuh NAT dari strain 10-L-2. Amplifikasi fragmen DNA dari kromosom strain 10-L-2 dengan teknik PCR, diperoleh dua fragment DNA (Gambar 4). Satu fragment berukuran sekitar 1.3 kb dan satu fragment berukuran sekitar 0.2 kb. Fragmen 0.2 kb lebih mendekati sebagai target, kemudian dimurnikan dan diligasikan ke vektor kloning pGEM-T Easy. Molekul rekombinan ini kemudian ditrasformasi ke sel Escherichia coli, dan ditumbuhkan pada medium luria bertani-ampisilin (LBA) dengan inkubasi selama semalam. Koloni yang berwarna putih diseleksi. Selanjutnya plasmid rekombinan tersebut dimurnikan dan ditentukan urutan nukleotidanya (sekuensing).
Gambar 2. Mekanisme reaksi asetilasi oleh strain 10-L-2 pada senyawa anilin dan turunannya yang diusulkan sebagaimana yang dilaporkan oleh Mulyono et al. 2007b 10). R1 : H, CH3, NH2, COOH, NO2, OH atau Cl.
Gambar 3. Hasil amplifikasi fragment gen NAT dari strain 10-L-2 dengan teknik PCR. Ukuran DNA standar digambarkan pada bagian kiri, sedangkan posisi fragmen target, berukuran sekitar 200 pb, ditunjukkan dengan tanda panah. Pada analisis urutan nukeotida hasil sekuensing menggunakan fasilitas BLAST pada DDBJ, EMBL, dan GeneBank, ditemukan bahwa pada fragmen 0.2 kb hasil amplifikasi tersebut mengandung urutan basa nukleotida yang mempunyai homologi tinggi dengan urutan DNA penyandi NAT beberapa organisme baik dari mulai prokariot hingga eukariot. Urutan nukleotida dari fragment tersebut kemudian ditranslasikan ke dalam kode asam amino secara universal. Urutan asam amino hasil deduksi ini kemudian dianalisis homologikan dengan database asam amino menggunakan fasilitas BLAST pada DDBJ, EMBL, dan GeneBank. Hasil homologi menunjukkan bahwa urutan asam amino tersebut pun memiliki homologi yang tinggi, khususnya terhadap NAT dari kelompok Bacillus. Hibridisasi terhadap molekul DNA kromosom strain 10-L-2 yang telah dipotong dengan beberapa enzim restriksi (Gambar 4) menunjukkan beberapa fragmen memberikan hasil positif. Secara berurutan, fragmen DNA yang dipotong dengan ClaI, HindIII, EcoRI, dan XbaI dengan ukuran masing-masing 2.0 kb, 1.5 kb, 4.0 kb dan 3.5 kb. Hasil ini menunjukkan bahwa probe yang digunakan dalam hibridisasi berinteraksi dengan potongan molekul DNA oleh keempat
2007 FMIPA Universitas Lampung
41
Mulyono Pendekatan Kloning Gen Utuh dengan Pendekatan Hibridisasi
enzim tersebut, karena mempunyai urutan nukleotida yang memungkinkan terjadinya pasangan antara keduanya. Potongan molekul DNA kromosom tersebut mempunyai daerah yang homolog pada sebagiannya pada posisi yang dapat terletak baik di tepi maupun di tengah molekul. Berdasarkan data gen NAT mikroba lain, gen NAT berukuran sekitar 0.8 kb. Dengan demikian sangat mungkin dari beberapa potong fragmen yang memberikan hasil positif tersebut mengandung gen utuh NAT. Terjadinya interaksi dalam hibridisasi ini menunjukkan bahwa urutan nukleotida fragmen 0.2 kb pada probe mempunyai kesamaan dengan urutan nukleotida pada potongan molekul DNA kromosom tersebut. Dengan demikian dari urutan nukleotida tersebut yang dapat digunakan lebih lanjut untuk perancangan lebih lanjut primer untuk amplifikasi dengan fragmen positif hasil hibridisasi sebagai cetakan (template). Teknik yang akan digunakan adalah dengan teknik amplifikasi secara inversi (balik). Dengan cara tersebut, maka urutan nukleotida total dari fragmen positif pada hasil hibridisasi ini dapat diketahui, sehingga urutan nukleotida yang mengkode gen untuh NAT dapat diperoleh. Hasil eksperimen dengan metode ini akan dilaporkan di kesempatan yang akan datang. Penggunaan teknik hibridisasi menggunakan bagian potongan gen untuk memperoleh gen utuh seluruhnya, dapat memudahkan dibandingkan dengan membuat pustaka genom dari mikroba yang bersangkutan. Metode ini dapat langsung memberikan pemilihan yang spesifik terhadap potongan molekul DNA berukuran besar, untuk ke tahap berikutnya. Efesiensi pekerjaan ini dapat lebih mempercepat perolehan dalam usaha mengklon gen tertentu.
Gambar 4. Hasil hibridisasi (southern hybridization) dengan probe 0.2 kb terhadap DNA kromosom strain 10-L-2 yang telah dipotong dengan berbagai enzim restriksi . Satu kb DNA standar (M), DNA kromosom yang dipotong dengan KpnI (kolom1), ApaI (kolom 2), XhoI (kolom3), SalI (kolom4), ClaI (kolom 5), HindIII (kolom6), EcoRI (kolom 7), PstI (kolom 8), BamHI (kolom 9), XbaI (kolom 10), SacII (kolom 11), and SacI (kolom 12), and positive control (kolom 13) plasmid rekombinan yang mengandung fragmen 0.2 kb, yang telah ditransfer pada membran. Fragment-fragmen tersebut kmudian dihibridisasi dengan probe 0.2 kb.
42
2007 FMIPA Universitas Lampung
J. Sains MIPA, Edisi Khusus Tahun 2007, Vol. 13, No. 1
4. KESIMPULAN DAN SARAN Pendekatan menggunakan fragment suatu gen yang diamplifikasi dengan metode PCR menggunakan teknik hibridisasi dapat memudahkan untuk tahapan kloning gen secara utuh dibandingkan dengan cara pembuatan pustaka genom (library). Hanya fragment-fragmen DNA yang memberikan signal positif dalam hibridisasi yang akan diklon dan diselidiki keberadaan gen utuh dalam fragmen itu.
DAFTAR PUSTAKA 1.
Takenaka, S., Ogawa, S., Kadowaki, M., Murakami, S., Aoki, K. (2003). The metabolic pathway of 4-aminophenol in Burkholderia sp. Strain AK-5 differs from than of aniline and aniline with C-4 sub- stituents. Appl. Environ. Microbiol., 69, 5410 5413
2.
Kunisako, S. (2002). Aromatic compounds and heterocyclic compounds. In Kunishako, S. (ed.), 14102 manufactured chemical products. The chemical daily, Tokyo, pp. 634 733.
3.
Garrigue, J. L., Ballantyne, M., Kumaravel, T., Lloyd, M., Nohynek, G. J., Kirkland, D., and Toutain H. (2006). In vitro genotoxicity of para-phe nylenediamine and its N-monoacetyl or N,N'-diacetyl metabolites. Mutat Res., 19, 58 71.
4.
Mulyono. (2007a). Analisis biokonversi aniline dan senyawa derivatnya oleh Bacillus cereus strain 10-L-2 menggunakan HPLC dan GC-MS. Dalam Analisis dan karakterisasi Senyawa Kimia. Monograf Jurusan Kimia FMIPA Unila, pp. 303-312.
5.
Komagata, K. (1985). Aerobic bacteria. In Hasegawa, T. (ed.), Classification and identification of microorganism. Japan scientific societies press, Tokyo
6.
Edward, U., Rogall, T., Blocker, H., Emde, M., Bottger, E. C. (1989). Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes. Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA. Nucleic Acids Res., 17, 7843 7853.
7.
Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (2001). Molecular cloning. A Laboratory Manual. 3rd ed., Cold Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, NY.
8.
Mulyono, S. Takenaka, Y. Sasano, S. Murakami, and K. Aoki. (2005). Microbial metabolism of aniline derivatives XXX: Metabolism of p-phenylenediamine by Bacillus cereus 10-L-2. Proceeding, JSBBA Annual meeting, Hokkaido, Japan. pp. 84.
9.
Mulyono, S. Takenaka, S. Muraka mi, and K. Aoki. (2006a) Microbial metabolism of aniline derivatives XXXV: Purification and characterization of arylamine N-acetyltransferase isozymes from Bacillus cereus 10-L-2. Proceeding, JSBBA Annual meeting, Kyoto, Japan pp. 81.
10. Mulyono, S. Takenaka, Y. Sasano, S. Murakami, and K. Aoki. (2007b). Bacillus cereus Strain 10-L-2 produces two arylamine N-acetyltransferase that transform 4-phenylenediamine into 4-Aminoacetanilide. J. Biosci. Bioeng., J. Biosci. Bioeng., 103, 147 154.
2007 FMIPA Universitas Lampung
43
