Genetické testování chronické pankreatitidy Iveta Valášková Iva Bartejsová
ivalaskova@fnbrno,cz
[email protected]
Fakultní nemocnice Brno Oddělení lékařské genetiky
Chronická pankreatitida (CP) trvale progredující zánětlivé onemocnění pankreatu vedoucí k destrukci pankreatického parenchymu
je důsledkem pankreatické autodigesce konverze pankreatických zymogenů v aktivní enzymy v pankreatickém parenchymu iniciace zánětlivého procesu
Chronická pankreatitida
Příčiny chronické pankreatitdy
toxické – alkohol (kouření) anatomické anomálie metabolické – hyperlipidemie, hypercalcemie genetické
Comfort a Steinberg, 1952 CP nahromaděná v rodinách naznačuje genetický podklad choroby
Genetické faktory CP Několik různých genů je zahrnuto v patogenezi CP •
gen CFTR chromozom 7 (7q31) gen SPINK1 chromozom 5 (5q31) gen PRSS1 chromozomu 7 (7q35)
-
ti
Genetické a enviromentální faktory CP ACP SPINK1
TCP SPINK1
ICP SPINK1 CFTR (PRSS1)
(dosud neznámé)
alkohol jiné enviromentální faktory
HP PRSS1 (SPINK1) jiné
výživa?
?
? genetické faktory
genetické faktory se liší u různých subtypů CP různé mutace v různých genech vedou k různým CP fenotypovým projevů a typům dědičnosti stejné mutace ve stejných genech mohou vést k různým důsledkům v závislosti na genetickém pozadí a vnějších faktorech Witt,2006
Normální pankreas normální pankreas trypsinogen
SPINK1
-
-
mesotrypsin trypsin
trypsin
Trypsin vznikající autoaktivací trypsinogenu v pankreatickém parenchymu je inhibován • SPINK1 • mesotrypsin nebo trypsin
enzymová kaskáda autodigesce
Witt,2000
Chronická pankreatitida genetické faktory chronická pankreatitida
inbalance proteáz a jejich inhibitorů v pankreatickém parenchymu
trypsinogen SPINK1
Mutace v PRSS1 a SPINK1
mesotrypsin trypsin
konverze pankreatických zymogenů na aktivní enzymy
AP
autodigesce
trypsin
+
zánět
CFTR enzymová kaskáda autodigesce
Witt,2000
Chronická pankreatitida genetické faktory chronická pankreatitida
Mutace v CFTR sníženo duktální pH
trypsinogen SPINK1
defektní rozpustnost proteinů mesotrypsin trypsin
defektní apikální transport zymogenových granulí
AP trypsin
+
zvýšená autoaktivace trypsinogenu autodigesce
CFTR enzymová kaskáda autodigesce
zánět Witt,2000
PRSS1 cationic trypsinogen (serine protease 1) V lidském pankreatu byly popsány 3 různé trypsinogeny • kationický trypsinogen nejsnadněji se autoaktivuje je více rezistentní k autolýze
• anionický trypsinogen • mesotrypsinogen PRSS1 mutace
„gain-of-function“ produkt s abnormální funkcí dominantní
„gain of function“ způsobují zvýšení intrapankreatické autoaktivace trypsinogenu, což může být první fáze procesu rozvinutí pankreatitidy
PRSS1 mutace Mutace N29I – nepřímo zvyšuje frekvenci autoaktivace Mutace R122H -inaktivuje hydrolýzu trypsinu a tím stabilizuje jeho aktivní formu hereditární pankreatitida autozomálně dominantní dědičnost
Riziko rakoviny pankreatu je až 50% v 70 letech Howes,2004
Mutace A16V - postihuje transport trypsinogenu typicky detekována u pacientů bez rodinné historie CP
PRSS1 gen •lokalizován na chromozomu 7 (7q35) •DNA 3.59 kb •5 exonů •mRNA 800bp •CDS 744 bp
5´UTR 1
N29I
R122H
2
3
K23R
4
5 3´UTR
SPINK1 serine protease inhibitor Kazal typ 1 (pankreatic secretory inhibitor, PST1)
•specifický substrát pro trypsin •inhibuje 20% intrapankratické trypsinové aktivity SPINK1 mutace
„loss-of-function“ produkt se sníženou až nulovou funkcí recesivní
„loss of function“ •snižují inhibiční kapacitu SPINK1 •různé SPINK1 mutace mají různou dědičnost např. mutace M1T – zasahuje start kodon „nulová alela“ dominantní dědičnost mutace N34S – snižuje SPINK1 kapacitu méně recesivní nebo komplexní dědičnost
SPINK1 mutace N34S přenašeči 0,5%-2% evropské populace, u většiny z nich se nikdy nerozvine CP pouze kombinace N34S a jiných genetických defektů nebo enviromentálních faktorů vede k rozoji CP 5% - 10% CP pacientů je homozygotů N34S (1:10 000 – 1: 40 000 v populaci)
N34S silně ovlivňuje patogenezi CP
SPINK1 gen •lokalizován na chromozomu 5 (5q31) •DNA 7.05 kb •4 exony •mRNA 378 bp •CDS 240bp
-53C>T 5´UTR
1 L14P
N34S 2
3 P55S
4 3´UTR
Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein CFTR •chloridový kanál regulující transport iontů přes buněčnou membránu •lokalizovaný v apikální membráně epiteliálních buněk
• 2 membránové domény (TMD1,2) • 2 nukleotid vázající domény (NBD1,2) • intrabuněčná regulační doména
CFTR Buňky pankreatu produkují trávicí enzymy a sekretují je do pankreatického duktu odkud jsou exportovány do střeva Normální CFTR exprese udržována rozpustnost sekretovaných enzymů Chybějící nebo snížená CFTR exprese -obstrukce duktu hustým sekretem -enzymy natravují parenchym pankreasu zánět I mírná redukce CFTR funkce, jako je u heterozygotů, zvyšuje susceptibilitu CP zesílením intrapankreatické aktivace trávicích enzymů
CFTR mutace popsáno více než 1000 mutací nejčastější mutace F508del 66% CF patologických alel 50% CF pacientů je homozygotních
typ a fenotypový projev choroby závisí - na typu CFTR mutace - jejím vlivu na strukturu a funkci CFTR proteinu (třídy mutací) - pozici mutace v genu - na přítomnosti jiných genetických změn na stejné alele, které samy nemají fenotypový efekt
Typy chorob způsobených CFTR mutacemi Klasická cystická fibróza kombinace genetických změn na 2 CFTR alelách redukuje CFTR funkci na 5% fyziologické úrovně Atypická „like“cystická fybróza „mild“ mutace – je udržena vyšší funkce CFTR Chronická pankreatitda nejenom homozygoti, složení heterozygoti, ale také nositelé jedné patologické CF alely – - signifikantně zvýšené riziko
CFTR gen •lokalizován na chromozomu 7 (7q31) •DNA 188.7 kb •27 exonů •mRNA 6128 bp •CDS 4443 bp F508del
5´UTR
1
2
3
4
5
CFTRdele2,3(21kb
6a 6b
7
8
9
G551D
10 11 12
G542X
R553X
13
14a 14b 15 16 17a 17b 18
19
20 21 22 23 24 3´UTR
Genetické testování CP
Genetické testování CP Biologický materiál pro izolaci DNA lymfocyty z periferní krve
Detekce mutací genů CFTR, SPINK1, PRSS1 Základní analýza • analýza teploty tání fluorescenčně značených sond po vysokorychlostní PCR amplifikaci gen CFTR, SPINK1, PRSS1
Pacienti – nositelé jedné patologické alely genu CFTR, SPINK1, PRSS1 vyšetřováni dále pro vyloučení • smíšené heterozygozity • transheterozygozyty Rozšířená analýza 2. multiparametrový screeningový test INNO-LiPA CFTR gen CFTR 2. sekvenace kódujících oblastí gen CFTR, SPINK1, PRSS1
Detekce mutací genů CFTR, SPINK1, PRSS1 analýza teploty tání fluorescenčně značených sond po vysokorychlostní PCR amplifikaci LightCycler instrument (Roche)
rychlé
přesné
jednoduše interpretovatelné
Analýza teploty tání Set 8 separovaných reakcí u jednoho testovaného jedince
PRSS1
SPINK1
CFTR
Detekce 12 mutací genů CFTR, SPINK1, PRSS1 1F508del 1G542X,
G551D, R553X 2CFTRdele2,3(21kb) 2N1303K 353C>T,
L14P
4N34S 3P55S 3N29I,K23R 3R112H
Burggraf at al 3 Bhatia at al 1
OLG ve spolupráci s TIB MOLBIOL 4 Truninger at al
2
Analýza teploty tání
rychlé
přesné
jednoduše interpretovatelné
Sekvenace Analýza kódujících oblastí genu CFTR, SPINK1, PRSS1
Genetické testování pacientů s chronickou pankreatitidou •pomáhá determinovat etiologii onemocnění •naznačuje vhodnou léčbu (mutace v různých genech postihují různé kroky aktivace a inhibice pankreatických enzymů – léčba podle pacientova defektu) •umožňuje částečně zvýšit přežívání rakoviny pankreatu •členové rodin s výskytem chronické pankreatitidy mohou být testováni a následně konsultováni – snížení rizika rozvinutí choroby
