Chronická pankreatitida a hvězdicovité buňky pankreatu

Disertační práce

Chronická pankreatitida a hvězdicovité buňky pankreatu Exprese Insulin - like growth factor II receptoru na povrchu hvězdicovitých buněk pankreatu – potenciální cíl antifibrotické terapie ?

MUDr. Hana Nechutová Interní hepatogastroenterologická klinika v Brně

2006

Školitel: Prof. MUDr. Petr Dítě, DrSc.

1. OBSAH 1. Obsah……………………………………………………………………………………......2 2. Přehled prezentací dílčích výsledků této práce……………………..................................4 3. Seznam použitých zkratek s vysvětlivkami………………………....................................6 4. Úvod……………………………………………………………………………………........8 5. Pankreas……………………………………………………………………………….......10 5.1. Anatomie, histologie, embryologie pankreatu................................................................10 5.2. Vrozené abnormity v utváření pankreatu, jejich vývodů,topografická pozice ductus choledochus.....................................................................................................................12 5.3. Nově identifikované buněčné druhy v parenchymu pankreatu.......................................13 6. Onemocnění trávicího systému, onemocnění slinivky břišní…………………..............14 6.1. Dělení nemocí slinivky břišní………………….............................................................14 6.2. Karcinom pankreatu........................................................................................................14 6.3. Akutní pankreatitida........................................................................................................17 7. Chronická pankreatitida…………………………………………………………............19 7.1. Chronická pankreatitida - definice, klasifikace……………………………...................19 7.1.1. Definice.............…………………………............................................................19 7.1.2. Klasifikace............................................................................................................19 7.2. Chronická pankreatitida – charakteristika.......................................................................20 7.3. Chronická pankreatitida – jednotlivé typy onemocnění.................................................21 7.4. Chronická pankreatitida –klinika....................................................................................22 8. Chronická pankreatitida- společné histopatomorfologické znaky pro definované typy chronických pankreatitid....................................................................................................27 8.1. Vlastní funkční parenchym – exo + endokrinní složka pankreatu..................................27 8.2. Změny vývodů................................................................................................................28 8.3. Fibroza............................................................................................................................28 8.3.1. Vazivo...................................................................................................................28 8.3.1.1. Buněčná skladba.....................................................................................29 8.3.1.2. Mezibuněčná hmota (extracelulární matrix, ECM)................................30 8.3.1.3. Typy vaziva.............................................................................................32 8.4. Zánět a imunitní odpověď...............................................................................................34 8.4.1. Buňky zánětu..........................................................................................................34 8.4.2. Cytokiny.................................................................................................................35 8.5. Poškození cév pankreatu.................................................................................................36 8.6. Poškození nervů pankreatu.............................................................................................36 9. Hvězdicovité buňky, úloha hvězdicovitých buněk při chronických fibroproduktivních onemocněních ( jater, slinivky břišní), hvězdicovité buňky jater....................................40 9.1. Úvod k hvězdicovitým buňkám......................................................................................40 9.2. Hvězdicovité buňky ( stellate cells, SC).........................................................................40 9.2.1. Definice.................................................................................................................40 9.2.2. Lokalizace hvězdicovitých buněk.........................................................................41 9.2.3. Společná charakteristika hvězdicovitých buněk...................................................42 9.2.4. Obecný průkaz odpovědnosti stellate cells za fibroprodukci................................43 9.3. Hvězdicovité buňky jater (Itovy buňky, tuk/vitamín A skladující buňky, hepatic stellate cells, HSC)......................................................................................................................44 9.3.1. Základní charakteristika........................................................................................44 9.3.2. Lokalizace hepatic stellate cells............................................................................44 9.3.3. Akutní jaterní léze a HSC.....................................................................................44 9.3.4. Chronické jaterní léze a HSC................................................................................45 2

9.3.5. Nádory v jaterním parenchymu a HSC.................................................................47 9.3.6. Portální hypertenze a HSC....................................................................................48 9.3.7. Důležité vlastnosti jaterní formy hvězdicovitých buněk ......................................49 9.3.8. Nové poznatky na úrovni receptorů HSC.............................................................50 9.3.9. HSC a apoptoza.....................................................................................................50 10. Hvězdicovité buňky pankreatu (pancreatic stellate cells, PSC)...................................52 10.1. Charakteristika hvězdicovitých buněk pankreatu.......................................................52 10.1.1. Identifikace hvězdicovitých buněk pankreatu.................................................53 10.1.2. Embryonální původ HSC................................................................................53 10.1.3. Získávání a aktivace hvězdicovitých buněk pankreatu....................................3 10.2. Identifikace hvězdicovitých buněk pankreatu, průkaz jejich aktivace........................54 10.2.1. Průkaz aktivace izolovaných hvězdicovitých buněk pankreatu laboratorního Potkana - primokultura....................................................................................54 10.2.2. Průkaz přítomnosti hvězdicovitých buněk pankreatu člověka........................54 Obrazová dokumentace (experimenty 10.2.1. a 10.2.2.)...............................55 10.3. Extracelulární signály zavzaty do aktivace pancreatic stellate cells...........................60 10.3.1. Cytokiny/růstové faktory................................................................................60 10.3.2. Ethanol a jeho metabolity...............................................................................61 10.4. Experiment: PDGFβ stimulace navyšuje proliferaci izolovaných hvězdicovitých buněk pankreatu laboratorního potkana ( primokultura)............................................62 Obrazová dokumentace (experiment 10.4.)................................................................64 10.5. Intracelulární přenos aktivačních signálů...................................................................65 10.5.1. MAPK (mitogen activated protein kinases)....................................................65 10.5.2. Phosphatidylinositol 3 (PI 3) – kináza............................................................65 10.5.3. Rho- Rho kináza (ROCK)...............................................................................65 10.5.4. Transkripční faktory........................................................................................66 10.6. Hvězdicovité buňky pankreatu – další charakteristiky...............................................67 10.6.1. Produkce matrix metalloproteináz ( MMP) a jejich inhibitorů (TIMP)..........67 10.6.2. Další matrixcelulární proteiny produkované PSC..........................................68 10.7. Vztah PSC k ostatním buněčným komponentám pankreatického parenchymu.........69 11. Experiment : Insulin –like growth factor II receptor ( IGF II) R/ mannosa 6fosfátem modifikovaný receptor pro lidský albumin (M6P(28)-HSA) R na povrchu hvězdicovitých buněk pankreatu (PSC). Nový cíl antifibrotické terapie ?.................71 11.1. Cíl experimentu...........................................................................................................71 11.2. Materiál,metody..........................................................................................................71 11.2.1. Reagencie, izolace a kultivace hvězdicovitých buněk pankreatu....................71 11.2.2. Metodika experimentů.....................................................................................72 11.3. Výsledky.....................................................................................................................73 11.3.1.Obrazová dokumentace- popis..........................................................................73 11.3.2.Komentář...........................................................................................................73 11.4. Závěr...........................................................................................................................74 11.5. Diskuze........................................................................................................................74 Obrazová dokumentace (experiment 11)............................................................................75 12. Závěr..................................................................................................................................83 12.1. Souhrn výsledků experimentů prezentovaných v disertační práci..............................83 12.2. Hvězdicovité buňky pankreatu ve vztahu k pankreatopatiím – současné trendy výzkumu......................................................................................................................83 12.3. Závěr disertační práce.................................................................................................87 13. Poděkování.........................................................................................................................88 14. Literatura...........................................................................................................................89

3

2. PŘEHLED PREZENTACÍ DÍLČÍCH VÝSLEDKŮ TÉTO PRÁCE 2003 Mezinárodní kongresy – aktivní prezentace- přednáška 1) Hana Nechutová, Libor Páč, Petr Dítě, Jan Brázdil : Stellate cells, 5th European Bridging Meeting in Gastroenterology, November 28-29, 2003, Bratislava: European Association for Gastroenterology and Endoscopy 2003, Abstracts, p.23 Kongresy – aktivní prezentace- přednáška 2) Hana Nechutová, Petr Dítě, Libor Páč, Brázdil Jan : Stellate cells- charakteristika, význam, výhledy do budoucna, XXII. Dny mladých internistů, Olomouc 29.-30. května 2003, Abstrakta, ISBN 80-244-0645-4, s.50-51 3) Hana Nechutová, Petr Dítě, Libor Páč, Jan Brázdil : The pancreatic stellate cells, Morphology 2003, 41st Symposium of the Czech Anatomical Society with International Participation, Abstracts, September 15-16,2003, Hradec Králové, Morphology Abstracts LF UK Hradec Králové 2003, ISBN 80-239-1412-X, Str. 53 Publikace v časopisech 4) Hana Nechutová, Petr Dítě, Libor Páč, Jan Brázdil : The pancreatic stellate cells, Scripta Medica 2003, vol. 76, No.4, s.260-261, ISSN 1211-3395

2004 Mezinárodní kongresy – aktivní prezentace- poster 5) Hana Nechutová, Libor Páč, Petr Dítě, Jan Brázdil : Stellate cells ( SC), Verhandlungen der Anatomischen Gesselschaft 99, Versammlung in Wien, München, Jena: Urban iund Fisher Verlag 2004, p.141, ISSN 0066/1562 Kongresy – aktivní prezentace – přednáška 6) Hana Nechutová, Petr Dítě, Markéta Hermanová, Libor Páč : Chronická pankreatitida, fibrogeneze a stellate cells, Sborník přednášek, Aktuální gastroenterologie XV, str. 17, ISBN : 80-85977-53-2

2005 Mezinárodní kongresy- aktivní prezentace- poster 7) Hana Nechutová: Pancreatic stelate cells as targets for antifibrotic therapy. 7th European Bridging Meeting 2005 and EAGE Postgraduate Course November 24th-26th Magdeburg, Germany, Abstract and Lecture Book.

4

European Association of Gastroenterology and endoskopy Award for the Best Abstract ( Poster) Presentation at the 7th European Bridging Meeting

2006 Mezinárodní kongresy – aktivní prezentace- přednášky 8) Hana Nechutová, Petr Dítě : Analysis of Insulin- like growth factor type II receptor ( IGF II R) / manose 6- phosphate modified albumin ( M6P(28)-HSA) receptor in pancreatic stellate cells – Novel target for the antifibrotic therapy ?, 8th European Bridging Meeting in gastroenterology, 23-25 November 2006, Naples, Italy, Abstract Book, p.27 Oral Presentation Winner at 8th European Bridging Meeting in Gastroenterology Mezinárodní kongresy - aktivní prezentace- poster 9) Hana Nechutová, Petr Dítě, Libor Páč : Hepatic stellate cells selective carrier mannoses 6phosphate modified albumin (M6P(28)-HSA), the attempt to prove the existence of the analogy for teh Pancreatic stellate cells in Chronical Pancreatitis , poster prezentace 38th European Pancreatic Club (EPC) Meeting, June 7-10,2006, Tampere, Finland; abstrakta publikována v Pancreatology 2006;6:323-405 (DOI: 10.1159/000093601) , IF 1,564 Kongresy – aktivní prezentace- přednáška 10) Hana Nechutová, Robert Jaster : IGF2 receptor – možný receptor pro antifibrotickou terapii u pancreatic stellate cells, VI. Novinky v Pankreatologii, Brno, 8.9. 2006 11) Hana Nechutová, Robert Jaster : Hvězdicovité buňky, hvězdicovité buňky pankreatu, exprese IGF II receptoru na povrchu hvězdicovitých buňek pankreatu, výsledky experimentu. Moravské dny hepatologie a gastroenterologie, 1.-2.12.2006, Kravsko Kapitoly v knihách 12) Vlastimil Válek, Zdeněk Kala, Igor Kiss a kolektiv : Maligní ložiskové procesy jater, str. 20-22 ,Grada Publishing, a.s., 2006., Praha . ISBN 80-247-0961-9. Publikace v časopisech 13) Hana Nechutová: IGF2 receptor – možný receptor pro antifibrotickou terapii u pancreatic stellate cell, Bulletin HPB Chirurgie ISSN 1210-6755, ročník 14/2006/3, str. 96 14) Brit Fitzner a, Peter Brock a, Hana Nechutova a, Änne Glass b, Thomas Karopka b, Dirk Koczan c, Hans-Jürgen Thiesen c, Gisela Sparmann a, Jörg Emmrich a, Stefan Liebe a, and Robert Jaster a,* Inhibitory effects of interferon-gamma on activation of rat pancreatic stellate cells are mediated by STAT1 and involve down-regulation of CTGF expression; Cell Signal. 2006 Nov 17; [Epub ahead of print], IF 4,398

5

3. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK S VYSVĚTLIVKAMI AP-1....................... activator protein -1, transkripční faktor, účastní se aktivace PSC αSMA......................alpha smooth muscle actin, alfa aktin hladké svaloviny, intermedirání filamentum, kontraktilní součást cytoskeletu buňky ATRA......................all-trans retinoid acid BB............................beta buňky Langerhansových ostrůvků pankreatu BSA..........................bovine serum albumin, bovinní plazmatický albumin cJun N –terminal kinase (JNK).........podrodina MAPK ECM........................extracellular matrix, mezibuněčná matrix EGF……………….epidermal growth factor ERK....................... .extracelular signal - regulated kinases, podrodina MAPK ET............................endothelin GFAP.......................glial fibrilar acidic protein, intermediární filamentum přítomné v hvězdicovitých buňkách hPSC........................human pancreatic stellate cells; hvězdicovité buňky izolované z pankreatického parenchymu člověka HSA.........................human serum albumin, lidský plazmatický albumin HSC.........................hepatic stellate cells, hvězdicovité buňky jater IGF………………..Insulin-like growth factor IGF II R..................receptor pro Insulin-like growth factor typ II IFNα, β, γ................interferony alfa, beta, gama; chemokiny ovlivňující aktivity hvězdicovitých buněk IMDM.....................Iscove modified Dulbecco medium; základní medium používané pro kultivaci izolovaných hvězdicovitých buněk pankreatu laboratorního potkana IL1, IL6…………..interleukin 1 a 6 LM, EM..................light, electron microscopy; světelná, elektronová mikroskopie MAPK.....................mitogen activated protein kinases, rodina kináz účastnící se intracelulárního přenosu aktivančích signálů v PSC mRNA.....................messenger RNA MMP(s)...................matrix metalloproteinases, zinek dependentní proteázy produkované hvězdicovitými buňkami M6P(28)-HSA R.....receptor pro lidský plazmatický albumin, obohacený dvaceti osmi manosa-6- fosfátovými zbytky; receptor shodný s IGF II receptorem NF- kappaB............nukleární faktor kappaB, transkripční faktor zapojený do aktivace PSC NO...........................nitric oxid pICC........................pancreatic interstitial cells of Cajal, intersticiální Cajalovy buňky pankreatu (PI 3) kináza...........phosphatidytinositol 3 kináza, intracelulární aktivační kaskáda PDGFβ....................platelet derived growth factor beta, prozánětlivý chemokin s významným biologickým účinkem na aktivitu hvězdicovitých buněk PPARgamma R......peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) nukleární hormonální receptor, receptor v buněčném jádře, po jehož aktivaci navázáním příslušného ligandu, dochází k inhibici aktivace hvězdicovitých buněk jater a pankreatu PSC..........................pancreatic stellate cells, hvězdicovité buňky pankreatu p38...........................podrodina MAPK,intracelulární přenašeč aktivačního signálu v PSC Rho- Rho kináza (ROCK)...intracelulární aktivační kaskáda RT PCR..................real time polymerase chain reaction, postup pro sledování přítomnosti 6

daných úseků nukleových kyselin metodou polymerázové řetězové reakce rPSC........................rat pancreatic stellate cells; hvězdicovité buňky izolované z pankreatického parenchymu laboratorního potkana SC............................stellate cells, hvězdicovité buňky Smad........................skupina transkripčních faktorů, zapojena do regulace aktivace hvězdicovitých buněk pankreatu (STAT)3..................signal transducer and activator of transcription (STAT)3, transkiripční faktor v PSC; přenašeč signálu a aktivátor transkripce v hvězdicovitých buňkách pankreatu TGFβ.......................transforming growth factor beta, cytokin s významným biologickým účinkem na činnost hvězdicovitých buněk TIMP(s)...................tissue inhibitors of matrix metalloproteinases, tkáňové inhibitory matrix metaloproteináz, soubor enzymů s převážně inhibičním efektem na funkce matrix metalloproteináz; jsou produkovány hvězdicovitými buňkami TNF……………….tumor necrosis factor WB..........................Western blotting, metoda pro analýzu přítomnosti sledovaných proteinů

7

4. ÚVOD „Chronická nemoc se mnohdy přibližuje pomalu - plíživě. Častokrát si daný člověk ani není s to uvědomit, že je vlastně nemocen. V řadě případů nejde o vážné onemocnění, ale chronické onemocnění zde je. Jsou však chronická onemocnění, která jsou tak vážná, že pacientům - a nejen jim - nedávají spát. Za těchto okolností je možné pozorovat mnoho problémů - nejen fyzických , ale i psychických a sociálních - jak u toho, kdo chronickým onemocněním trpí, tak u lidí kolem něho.“ (J.Křivohlavý, Psychologie nemoci)

Statistika nemocných lidí ukazuje, že v řadě oblastí až polovina lidí trpí určitým chronickým onemocněním (Taylor a Aspinwall, 1993). Vzhledem k vysokým incidencím výskytu chronických onemocnění tak zřejmě každý člověk přijde do kontaktu s nějakým chronickým onemocněním sám, nebo přeneseně při sdílení takové životní příhody s někým sobě blízkým. Lidé postižení akutním onemocněním jsou zpravidla celou událostí zaskočeni, prožívají klasicky se odvíjející celkovou odpovědˇ vlastního organismu na různě intenzivní stresor, jímž nepopiratelně vznik, rychlý a mnohdy dramatický klinický nástup nové nemoci je. Takoví pacienti následně zažívají většinou dočasné omezení rozsahu a možností seberealizace; stejně tak pozměněné zastávání všech svých dosavadních sociálních rolí. Místo toho většinou získávají roli novou - roli hospitalizovaného, vyšetřovaného a léčeného pacienta. Prožívání lidí zasažených chronickým onemocněním je (pro diverzní charakter vývoje jednotlivých typů takovýchto nemocí) daleko obtížněji definovatelné. Následující dojem není zdaleka pouze mým. Je zřejmě přirozeným následkem vlivu mnoha faktorů, že přetrvává určitý stupeň dysbalance mezi celkovým zájmem a mírou všech forem pozornosti, věnovanými lidem postiženým obecně akutně probíhajícím akutním onemocněním a lidem žijícím (někdy i celoživotně) s různými nemocemi dlouhodobé povahy. Některé vlivy toto způsobující jsou vcelku jasně čitelné: Vnímavost pacientova okolí se časem, chtě nechtě, také určitým způsobem mění a otupuje a má tedy charakter sestupný. Potíže při chronických onemocněních mohou být také spíše nespecifického charakteru a menší tíže; ne vždy alarmující ke změně přístupu a snaze pacientovy potíže opět aktuálněji a intenzivněji řešit. Pro pacienta může též být zatěžující fakt obecně platící nemožnosti stoprocentně sdělit všechny své subjektivní potíže, jimiž trpí, jakékoliv druhé osobě. Z dlouhodobého hlediska pro pacienta vyplývá daleko větší zátěž v podobě častého, každodenního… tichého srovnávání se s dlouhodobými potížemi. Velmi důležité jsou - základní „ psychický habitus „ takového člověka, jeho aktuální komponovanost; dlouhodobá a vybalancovaná, stacionární podpora jeho nejbližšího okolí; někdy i možnost sdílení potíží v rámci např. skupiny podobnými životními příhodami prověřovaných lidí. Fakt, že diagnostické možnosti dnešní medicíny jasně převyšují možnosti teapeutické a že pacientovi ve většině případů nelze pomoci kauzální léčbou (s vyléčením ad integrum), je pro daného člověka také překážkou, se kterou se musí vypořádat. Současná medicína tedy ve většině případů chronických onemocnění disponuje terapií substituční či symptomatickou.

8

Alespoň se tedy lze snažit jejím uváženým, adekvátním časováním a výběrem zmírnit potíže, zlepšit celkové prožívání a „kvalitu zivota „ takto postiženého člověka. Míra vědeckého poznání narůstá exponenciální řadou. Úroveň vědeckého výzkumu se přesunula do oblasti molekulární biologie. Znalost morfologických, funkčních a povrchových buněčných charakteristik; buněčné komunikace s okolím a seberegulačních schopností; nitrobuněčných aktivačních a metabolických kaskád; působků regulujících buněčný cyklus a transkripci, mutageny a onkogeny a konečně znalost genomu; proteomika,……jsou současnými prostředky a klíči k nalézání nových léků. Stejně tak je tomu v oblasti pankreatologie. Pankreatopatie jsou dnes již v drtivé většině etiopatogeneticky , histopatomorfologicky definované vyčerpávajícím způsobem. Výzkumné záměry tak získaly nové cíle. Jedním z takovýchto nových směrů je výzkum hvězdicovitých buněk pankreatu (pancreatic stellate cells, PSC). Po téměř deseti letech analýz tohoto buněčného typu se už rozhodně nejedná o izolovanou podrobnou charakteristiku nově popsaného typu buněk, jejichž další využití by nemělo jasné rysy. Další popisy těchto buněk více potvrzují představu, že hvězdicovité buňky pankreatu jsou významně zapojeny nejen do chronických pankreatopatií ( prezentovaných především fibrotizací slinivky a s tím spojenými změnami), což je hlavním tématem této práce. Pancreatic stellate cells se velmi pravděpodobně, ať „dobrovolně či nedobrovolně „ podílejí na rozvoji a expanzi primarního pankreatického nádoru. Objasnění jejich vztahu k endokrinní složce pankreatu, intrapankreatickým nervovým zakončenim, také přinášejí nové představy cest k objevům nových farmakologických terapeutických přístupů.

9

5. PANKREAS 5.1. Anatomie, histologie, embryologie pankreatu Pankreas je složená tuboalveolární žláza serozního charakteru. Makroskopicky má za normálních podmínek povahu šedavěrůžového laločnatého orgánu houbovité konzistence.( Páč L - Dítě Pet al., Chronická pankreatitida, 2002) Topografická pozice v dutině břišní a jeho retroperitoneální uložení dávají pankreatu charakteristické a vyjímečné vlastnosti stran limitované dostupnosti pro některé diagnostické zobrazovací metody (ultrazvuk), stran mechanismu vzniku některých mechanických poškození, a v neposlední řadě dosažitelnosti pro kurativu ať již chirurgickou, radiologickou či endoskopickou. Arteriální krev je slinivce břišní přiváděna větvemi truncus coeliacus a arteria mesenterica superior (arteria lienalis a arteriae pancreaticoduodenales). Venozní drenáž zajišťují přítoky vena portae (vena lienalis, vena mesenterica superior). Inervace je zajištěna autonomním nervovým systémem, smíšeným plexus pancreaticus (pregangliová parasympatická nervová vlákna ( zdroj nervus vagus) jsou interpolována v gangliích uložených v interlobulárních septech, postgangliová sympatická vlákna sem přicházejí z plexus coeliacus; aferentní vlákna jsou vázána na sympaticus – cestou nn.splanchnici). .( Páč L, Dítě P et al., Chronická pankreatitida, 2002) Zevně sekretorický oddíl je vystavěn z acinů (každý tvořen 6-8 acinárními buňkami). Slinivkové vývody začínají jako intercelularní kanálky mezi centroacinozními buňkami v luminech acinů. Pokračují jako vsunuté vývody pankreatu: intercelulární (vystlané – tvořené - jednovrstevným plochým epitelem). Konvergentní průběh vede k jejich spojení a vzniku intralobulárních a interlobulárních vývodů (vystlaných jednovsrtevným kubickým až cylindrickým epitelem). Ty už probíhají v interlobulárním vazivu. Hlavní vývody - ductus pancreaticus maior (Wirsungi) a minor (Santorini) jsou vnitřně kryty dvouvrstevným cylindrickým epitelem, který také obsahuje drobné intramurální tubulozní žlázky, pohárkové buňky a nečetné buňky enterochromafinní. Ze zevní strany je kryje vrstva kolagenního vaziva obsahující buňky hladké svaloviny. Sekrety acinárních buněk –pankreatická šťáva (amyláza, lipáza, prokarboxypeptidáza A, B, pepsinogen, chymotrypsinogen, kolipáza, proelastáza, minerály, hydroxyuhličitany) jsou odváděny do lumina trávicího traktu (do duodena), v pravý moment, na správném místě aktivovány k plnění svého úkolu. Tím je pokračování / dokončení trávení cukrů, tuků a bílkovin, tak aby mohly být dále dále zpracovány a vstřebány nasledujícími úseky travící trubice. Seskupením více acinů jsou utvářeny pankreatické lalůčky (lobuli), které jsou vzájemně odděleny neobjemnými vazivovými septy, která sem zasahují jako výběžky sept interlobárních. Obsahem těchto sept jsou probíhající četné cévy a nervy (nervová ganglia), dále úseky pankreatických vývodů menšího průsvitu. Buněčná septální komponenta je reprezentována buňkami vaziva. .( Páč L – Dítě P et al., Chronická pankreatitida, 2002) Právě periacinárně, ale i v dalších vazivových pruzích a septech (interlobulárních, interlobárních), stejně tak na povrchu celého pankreatu, v okolí pankreatických vývodů i Langerhansových ostrůvků; jsou uloženy hvězdicovité buňky pankreatu (pancreatic stellate cells, PSC). Mají povahu myofibroblastů. (viz dále) Endokrinní komponenta - Langerhansovy ostrůvky (insulae pancreaticae) je lokalizována především v kaudě pankreatu. Alfa buňky produkují glukagon, beta buňky inzulín, D buňky

10

somatostatin ( nejvíce produkován v žaludku a duodenu ), PP(F) buňky – pankreatický polypeptid (tlumí sekreci HCl, funkčně antagonista gastrinu). Pro vnitřně sekretorickou funkci je uzpůsobeno bohaté cévní zásobení, v podobě hustých sítí širokých sinusoid, obklopujících jednotlivé ostrůvky. V blízkosti ostrůvků se také vyskytují nemyelinizovaná vlákna z plexus pancreaticus s širokými zakončeními. Jejich funkce zůstávala donedávna ne zcela jasná. V současnosti je přezkoumáván vztah těchto nervových vláken k v okolí uloženým pancreatic stellate cells, jejich vzájemná chemická komunikace, především ve vztahu ke vzniku pankreatické bolesti. Mezi exokrinní a endorkinní složkou existuje parakrinní vazba. Inzulín má inhibiční vliv (cestou uvolnění somatostatinu a jeho navýšením v portálním řečišti ) na exokrinní stimulaci. Jak bude dále uvedeno detailněji, zdá se, že v pankreatu probíhá i za fyziologických podmínek mnohem vice důležitých parakrinních smyček, než bylo doposud známo. Znatelnější jsou pak v podmínkách probíhajících patologických procesů, a jejich poznání se tedy logicky odvíjí retrospektivně od analýz poměrů ve stavu nemoci. Identifikace a celé studium pancreatic stellate cells navíc rozšířila tento náčrt sítí parakrinních buněčných vazeb uvnitř pankreatu, o nový - neméně významný a vlivný prvek. Při vědomí původních i nových okolností a faktů je tedy studium parakrinních vazeb oblastí velmi zajímavou a v součanosti jedním z bodů hlavního zájmu. Vnitřní sekrece hraje důležitou roli především v regulaci přítomnosti a distribuce hlavního krevního cukru - glukozy. Z hlediska diagnostiky a ohodnocení pokročilosti postižení pankreatického parenchymu degenerativními a degradujícími procesy v rámci chronické pankreatitidy lze využít i nástup klinické manifestace vnitřně sekretorické insuficience a diabetu mellitu. Ten svědčí už pro dost rozsáhlé postižení slinivky, uvádí se okolo 80 % objemu pankreatu ( Dítě P et al., 2002) . Jak je v textu dále uvedeno, tomuto (klinickou zkušeností získanému) empirickému údaji náleží jasné vysvětlení. Je jedním z velmi zajímavých výsledků vyšetření vzájemných interakcí acinárních buněk, hvězdicovitých buněk pankreatu a B buněk Langerhansových ostrůvků. Stejně jako přibývá výsledků vyšetření na tato témata, přibývá i otázek. Dříve (jak je znatelné z popisu např. před zveřejněním objevu pancreatic stellate cells, 1997-8), nebyl jejich vzájemným interakcím přikládán zásadnější význam. Současné nálezy naopak ale vedou k myšlenkám na jejich např. i nečekané ontogenetické souvislosti, také možné společné cíle aktivit a přibuzná předurčení. V roce 2004 (Seaberg RM, et al, 2004) informovali o klonální identifikaci multipotentních prekurzorů z pankreatu dospělé myši, jež generují mimo jiné beta-like buňky a pankreatické hvězdicovité buňky. S ohledem na biologii hvězdicovitých buněk je velmi pravděpodobné, že tyto buňky sdílejí s endokrinními liniemi společnou progenitorovou buňku. Vazby pankreatic stellate cells a beta buněk jsou i nadále jedním z horkých témat současného základního výzkumu v pankreatologii. Hvězdicovité buňky pankreatu jsou z hlediska svých některých povrchových buněčných charakteristik a složek cytoskeletu ( např. glial fibrilar acidic protein GFAP) velmi blízké také komponentám pocházejícím z nervové tkáně. Proto i jejich návaznost, těsná vazba k nervovým zakončením má příčinu, jejímuž plnému významu však ještě dosud nebylo porozuměno. Histogeneze exokrinní složky : Po spojení obou slinivkových základů, pancreas ventrale a dorzale, proliferuje entoderm z primitivního zakladu travící trubice do okolního mezenchymu v podobě větvících se tubulů, jež se postupně luminizují a utvářejí tak výsledné pankreatické vývody. V jejich terminálních oblastech vznikají rozšířená kulovitá zakončení. Tyto pupeny se vyvíjí v serozní aciny a v 5. měsíci prenatálního vývoje fetu již začíná jejich sekretorická aktivita. Endokrinní komponenta slinivky břišní se utváří oddělením neluminizovaných entodermálních pupenů od konečných částí proliferujících entodermálních výběžků. Z buněk

11

se diferencují alfa buňky, následně buňky beta. Ve 12.týdnu nitroděložního (IU) vývoje lidského organismu obsahují cytoplazamticky skladovaná alfa a beta granula, ve 4.měsíci IU pak již produkují inzulín a glukagon.( Horký D- Dítě P et al., Chronická pankreatitida, 2002)

5.2. Vrozené abnormity v utváření pankreatu, jejich vývodů, topografická pozice ductus choledochus Vrozené abnormity v utváření pankreatu, jejich vývodů, stejně tak topografická pozice ductus choledochus patří mezi rizikové faktory pro vznik některých pankreatopatií, jež mohou vést ke vzniku chronické pankreatitidy. Variace pankreatu souvisejí s vývojem dvou samostatných základů pankreatu. Samostatný processus uncinatus: části pankreatu jsou odděleny od celého orgánu průběhem cév. Pancreas accessorium: tělo pankreatu může být rozštěpeno,může být oddělena i zadní část hlavy pankreatu,ležící za vasa mesenterica superior Akcesorní pankreaty: mohou být uloženy v mesenteriu, ve stěně střeva, žlučníku nebo ve slezině. Mají různou velikost ( od několika mm do 5 cm ) a mohou obsahovat také Langerhansovy ostrůvky. (Páč, Dokládal,2000) Zvýšené riziko pro rozvoj pankreatopathií je u : Pancreas divisum: hlavním vývodem je ductus Santorini, který drenuje podstatnou část pankreatu. Gracilní ductus Wirsungi odvádí sekret jen z části hlavy pankreatu. U 5-10 ti % populace je pancreas divisum příčinou akutní pankreatitidy. (Špičák, 2004) U části nositelů této odchylky nestačí kapacita papily minor pro množství odváděného sekretu a dochází k atakám pankreatitidy, případně se vyvíjí chronická pankreatitida obstruktivního typu. (recidivující ataky akutních iritací pankreatu pro složité a často nefunkční odtékání pankreatického sekretu přes až někdy meandrovité utváření hlavního vývodu) Pancreas annulare: Pancreas anullare patří k nejčastějším kongenitálním anomáliím pankreatu, jež se obyčejně manifestují v dětství, a to abdominalgiemi, pankreatitidou a obstrukcí duodena z důvodu topografické pozice pankreatu vůči trávící trubici, jež pankreas jako celek v takovéto situaci obkružuje a bývá příčinou jeho stenozy. Jako příklad dlouhodobého dopadu těchto kongenitálních vad na postižení a funkčnost pankreatu můze posloužit např. kazuistika z roku 2005 (Cunha JE, 2005). 22 letý muž, jemuž bylo časně v dětství diagnostikováno pancreas annulare, a stav byl chirurgicky zajištěn duodenostomií z důvodu duodenální obstrukce, se i po následných dalších zajišťujících výkonech, s charakterem prevence postižení pankreatu, plně rozvinula v obou slinivkových segmentech chronická pankreatitida. Pozice ductus choledochus je také, z hlediska rizikových faktorů rozvoje pankreatopatií, velmi důležitá. Rozdělíme-li ductus choledochus do tří přibližně stejně dlouhých úseků ( úsek probíhající v ligamentum hepatoduodenale, úsek ležící za pars superior a pars descendent duodeni a část vstupující do více či méně úzkých vztahů s hlavou pankreatu), nejdůležitější je z daného úhlu pohledu část poslední. Následující statistické údaje vychází ze sekčních nálezů. Koncová část ductus choledochus,která tedy navazuje na jeho retroduodenální úsek, probíhá nejčastěji (62,4%) parenchymem pankreatu.V 7,2 procentech sledovaných případů společný žlučovod probíhal převážně za hlavou pankreatu a v parenchymu pankreatu byl uložen pouze krátkou částí, před vyústěním do duodena. Další častou pozicí společného žlučovodu vůči slinivce břišní je retropankreatická ( 10,3 %), ve žlábku za pankreatem, krytém fascií. Ve 13,5% byl ductus choledochus nalezen v pozici vpravo od hlavy pankreatu, také krytý společnou fascií žlázy. V 6,2 procentech byl ductus choledochus uložen ve speciálním lůžku

12

v pozici před hlavou pankreatu a za duodenem, toto lůžko tedy představoval žlábek na povrchu ventrálního povrchu hlavy pankreatu.Ve 48,9 procentech ( 95 případů) vyústil ductus choledochus do duodena zcela nezávisle vůči pankreatickému vývodu. V 17 % vyústil v těsné blízkosti na duktus Wirsungi, ve 34 % oba vývody vytvořily uvnitř pankreatu společný vývod s následným vyústěním do duodena. (Lurje A, 1937) V knize Chirurgické anatomie a techniky z r. 1994 jsou uvedeny tyto možné pozice ductus choledochus vůči pankreatu s jejich četnostmi zastoupení: (Skandalakis E, 1995) -Ductus choledochus částečně překrytý jazykovitým výběžkem parenchymu pankreatu (44%) -Ductus choledochus kompletně uložený uvnitř pankreatického parenchymu (30%) -Ductus choledochus volně uložený na povrchu pankreatu (16,5%) -Ductus choledochus kompletně překrytý dvěma jazykovitými výběžky pankreatu (9%) Recidivující i drobné iritace ductus choledochus způsobené intraduktálně probíhajícím zahuštěným obsahem (písek, drobné konkrementy), také reflux biliárních sekretů při predispozičním uspořádání žlučovod - ductus pancreaticus major a jejich vyústění na papila Vateri; může vést k refluxu žlučového obsahu do vývodu slinivkového a následně vedoucí k jeho podráždění a možnému dalšímu šíření změn dál do pankreatického parenchymu. Transformace a probíhající patologické procesy ( při fibroproduktivních onemocněních) jsou čitelné na pankreatu i makroskopicky . Orgán či jeho zasažené okrsky se mění v bělavěšedý, zvýšeně tuhý orgán, s jasně vyjádřenou atrofií žlázového parenchymu, setřelou lobulizací. Postupně se stává volumově dominantní složka zmnožené povrchové či interlobulární vazivové masy, ať už v podobě plochých tuhých ložisek či do hloubky orgánu zasahujících zbytněných sept. Z pohledu celkového objemu pankreatu však může dojít, i přes výraznou atrofizaci žlázového parenchymu, k výsledné objemové expanzi.

5.3. Nově identifikované buněčné druhy v parenchymu pankreatu Hvězdicovité buňky pankreatu (Bachem, 1998), (Apte MV, 1998) viz dále Intersticiální buňky Cajalovy pankreatu. Stejně jako nově přicházející identifikace stellate cells lokalizovaných v různých dalších systémech a orgánech (ORL - larynx,…..viz dále), recipročně i v pankreatu byly identifikovány nové buněčné druhy. V roce 2005 (Popescu LM et al., 2005) byl uveřejněn popis nově identifikovaného buněčného typu v pankreatu - vykazující fenotypové znaky intersticiálních buněk Cajalových (interstitial cells of Cajal, ICC). Tím by mimo jiné, přestalo pro tento buněčný typ platit dlouhodobě vžité dogma :“ ICC jen v dutých orgánech „ . K identifikaci byla použita klasická světelná mikroskopie, nekonvenční světelná mirkoskopie, transmisní elektronová mikroskopie a dvojdimensionální rekonstrukce ze sériových fotografií potvrzující síťovité rozložení ICC v prostoru. Pankreatické ICC (pICC) dle tohoto sdělení representují necelá 3,5 procenta (3,3+/- 0.5%) ze všech buněk pankreatu. Zdá se, že navazují blízký prostorový vztah s: kapilárami (43% všech vyhodnocených situací), aciny (40%), stellate cells (14%), nervovými vlákny (3%). Většina z pICC (88%) má 2 nebo 3 dlouhé výběžky (desítky mikrometrů) vynořující se z buněčného těla. Obrazy z trasmisního elektornového mikroskopu také potvrzují, že tyto pICC splňují kriteria pro pozitivní diagnozu ICC (např.četné mitochondrie, 8,7+/- 0.8% cytoplasmy), taktéž pozitivni imunocytochemické vysledky CD117/c-kit a CD34 pozitivit podporuji identifikaci ICC.Další pozitivity v pICC nalezené byly ve 40-50% pozitivní pro alfaSMA nebo S-100; a ojediněle pro CD 67, NK1 neurokininový receptor a vimentin. Desmin a chromogranin A nebyl v těchto pICC detekován. Jejich role v pankreatickém parenchymu, ontogenetický a funkční vztah k hvězdicovitým buňkám , nejsou objasněny.

13

6. ONEMOCNĚNÍ TRÁVICÍHO SYSTÉMU, ONEMOCNĚNÍ SLINIVKY BŘIŠNÍ Kromě obecných nespecifických příznaků nemoci (bolest, únava, snížená celková výkonnost....) zatěžují onemocnění trávicího systému nemocného různými pocity gastrointestinálního dyskomfortu (z toho častěji též odvozenými nepříjemnými společenskými limitacemi), významnějším celkovým neprospíváním z důvodu např. malasimilace (malabsorpce, maldigesce,…. ne tedy nezbytně podmíněné malignitou gastrointestinálního systému). Slinivka břišní je vysoce výkonný a esenciální producent působků s významným postavením v celkovém „prospívání“ lidského organismu a jeho vlastním zachování při životě. Onemocnění slinivky břišní představují většinou velmi vážné orgánové patie. Nejen vzhledem k topografickému uložení pankreatu (např. z důvodu na pankreas přímo naléhající abdominální aorty, dalších velkých cév.....) a agresivní lytické povaze jeho exokrinních produktů vůči okolí (jež se při jeho onemocnění zpravidla uvolňují do prostor vůči jejich účinkům nechráněným – např. do štěrbinovitých prostor peritoneální dutiny) představuje jeho onemocnění téměř prakticky jistě a velmi záhy navazující postižení systémové. A to z hlediska přímého poškození a ohrožení organismu jako celku probíhajícím procesem, tak z hlediska dlouhodobého.

6.1. Dělení nemocí slinivky břišní Nemoci pankreatu dělíme základně do dvou skupin, na: - záněty : akutní, chronický - nádory : benigní, maligní Hvězdicovité buňky slinivky břišní se svojí činností aktivně zapojují do patologických procesů všech uvedených nozologických jednotek.

6.2. Karcinom pankreatu Karcinom pankreatu z mnoha důvodů stále zastává smutné čtvrté místo v celosvětových mortalitních statistických údajích, prakticky stejně pro muže i ženy.( čtvrtá nejčastější příčina úmrtí na malignitu u mužů, pátá u žen) ( Ševčíková, 2005) (Bray F, 2002) Vyskytuje se nejčastěji mezi 40-49 a 75-79 lety. (Bray F, 2002),(Zavoral M., 2002) Je rychle rostoucí malignitou s prakticky 100%-ní mortalitou, v porovnání s ostatními malignitami zřejmě vůbec nejvyšší (Bray F, 2002), (Michaud DS,2004) (Löhr J.-M. et al., 2003) ročně zemře na karcinom pankreatu ve světě celkem asi 200 000 lidí. V posledních 40 letech vzrostl výskyt karcinomu pankreatu více než o 300% a jeho výskyt stále narůstá (Zavoral M., 2002). V porovnání celosvětovém, nejnižší incidenci mají signifikantně africké a asijské oblasti. Byla též pozorována korelace s geografickou pozicí, rovníkové oblasti mají nižší incidenci. (SEER Program, Cancer Incidence and Mortality in the United States 1973-81). Největší incidence a mortalitní četnost je v rozvinutých zemích. Incidence tedy závisí na životním prostředí a životní úrovni.V USA je karcinom pankreatu 4. příčinou úmrtí na karcinom (z toho nejvyšší incidence a mortalita je u Afroameričanů), v Evropě 6. U Afroameričanů byla realizována migrační studie, jejímž výsledkem bylo zjištění, že riziko karcinomu pankreatu se u imigrantů z této skupiny lidí srovnalo s incidencí nové země ve druhé následující generaci. (Thomas DB, 1987) V Japonsku i nadále pokračuje 14

vzrůst incidence tohoto karcinomu, zatímco v jiných industrializovaných zemích s vysokou četností stagnuje. V Evropě má nejvyšší mortalitu Maďarsko, Česká Republika a Rakousko, zatímco Litva a Albanie nejnižší. (Löhr J.-M. et al., 2003) V roce 1999 dosáhla incidence onemocnění v České republice 18/100 000. Rizikovými faktory obecně známými jsou : Kouření tabáku (zvyšuje riziko vzniku karcinomu 2-3 krát, u hereditární pankreatitidy zvyšuje ještě dvojnásobně a bylo prokázáno, že pak karcinom pankreatu vznikne v průměru o 20 let dříve, než u nekuřáků. ( Ševčíková, 2005) ,(Zavoral M., 2002) Účinek tabákového kouře a vznik karcinomu pankreatu je vysvětlován orgánově specifickým efektem tabákových Nnitrosaminů nebo sekrecí těchto sloučenin do žluče a jejich refluxem do pankreatického vývodu. Kouření cigaret je spojováno s dvoj až trojnásobným zvýšením rakoviny slinivky břišní, kouření dýmky a doutníků s dvojnásobným zvýšením rizika) Role dědičnosti: Karcinom pankreatu je popisován v rámci celé řady hereditárních syndromů. Pantří mezi ně především chronická hereditární pankreatitida (Michaud DS, 2004). .(Zavoral M., 2002) s identifikovanou mutací genu kodujícího kationický trypsinogen na chromosomu 7q35, Až u 1/3 pacientů těchto pacientů je v průběhu nemoci diagnostikován karcinom pankreatu. Další AD syndromy: Lynchův syndrom II, Gardnerův syndrom,atypický familiární mnohočetný melanom, retinoblastom, mnohočetná endokrinní neoplazie II typu a neurofibromatoza. Molekulární biologie: Souběžná mutace onkogenů (K-ras, HER 2/neu) a tumorsupresorových genů (p16, p53, SMAD4, BRCA2 a ztrátu18q chromozomu (DCC) (Zavoral M., 2002) ) Velmi pravděpodobně inzulínová rezistence (Michaud DS, 2004), obezita, množství masa v potravě (hlavně uzeniny), a hladina cholesterolu. ( Ševčíková A., 2005), (Zavoral M., 2002) Z exogenních faktorů je nejrozšířenějším a nejčastěji působícím vlivem těžká konzumace alkoholu. (Go VL,2005) Ta je primárně známa jako hlavní příčina chronické pankreatitidy a rizikový faktor pro vznik diabetu mellitu typ II. .(Zavoral M., 2002) U alkoholu je těmito cestami výsledně také vyšší relativní riziko karcinomu pankreatu. Nicméně i u nealkoholických forem chronické pankreatitidy je relativní riziko významně vyšší. Diagnostické možnosti v současnosti dostupných morfologických a funkčních vyšetření, která jsou pro diagnostiku karcinomu pankreatu v kombinaci využívána, jsou velké. Pro odhalení nádorového bujení v relativně časných stadiích jsou dostačující. Pankreatický karcinom je však diagnostikován zpravidla velmi pozdě (porovnáno s časovým obdobím vzniku event. progrese nádoru, kdy ještě existuje možnost pacienta plně této nemoci zbavit). Nádor je diagnostikován zpravidla až při klinické manifestaci zásadních potíží, plynoucích bohužel nezřídka už z disseminace primárního ložiska karcinomu. .(Zavoral M., 2002) V době diagnózy jsou přítomny vzdálené metastázy u 80 % nemocných. Potíže mají často charakter akutního onemocnění. Jsou jimi například ikterus při zevní kompresi ductus choledochus nádorovou masou, ikterus při obstrukci ductus hepaticus communis metastazami karcinomu pankreatu lokalizovanými v oblasti jaterního hilu; jaterní dysfunkce různé závažnosti při výraznější progresi disseminovaných ložisek pankreatického nádoru v játrech. .(Zavoral M., 2002). Sérologické vyšetření onkomarkerů CA 19-9 v kombinaci s CT vyšetřením může vést k celkové senzitivitě až 97% v primární diagnostice karcinomu pankreatu a 85% citlivosti při detekci nádorových ložisek menších než 3 cm. Velký přínos stanovení CA 19 9 je také pozorován při hodnocení účinku neoadjuvantní terapie. Význam

15

CA 19 9 pro určení resekability a prognózy onemocnění je též nezpochybnitelný. Ki-ras onkogen je detekován v pankreatické šťávě u 90 % nemocných s karcinomem pankreatu. Proto se ke zvýšení efektivity a přesnosti diagnostických postupů nabízí vyšetření pankreatické šťávy během ERCP a stanovení Ki-ras mutace v pankreatickém sekretu. Histologicky se jedná o maligní onemocnění s vysoce agresivním chováním, v 95 % případů je to duktální adenokarcinom.(Zavoral M., 2002) ( Bray F, 2002) Ročně je celosvětově dle autopsií 200 000 karcinomů nejasné etiologie, 30 procent z toho jsou pankreatické. Méně než 25 % nálezů je chirurgicky řešitelných, až u 95% pacientů je zjištěna recidiva do dvou let.( Ševčíková A., 2005) Většina pacientů umírá do 1 roku od stanovení diagnózy, pouze 0.4 až 2.0 % nemocných přežívá více než 5 let. Léčba za poslední desetiletí – respektive její pokrok významným způsobem neovlivnily – neprodloužily čas přežívání. (Michaud DS,2004),(Zavoral M., 2002) Vzhledem k pozdní diagnóze onemocnění karcinomu pankreatu a jeho nízké resekabilitě, zůstává endoskopická paliace často jedinou možnou terapeutickou modalitou. Nejčastějším důvodem pro endoskopickou intervenci je obstrukční ikterus, který doprovází až 70% onemocnění. Chirurgická léčba: Při lokalizaci nádoru v těle a kaudě pankreatu je resekabilních 30% nádorů, ten ale bývá zpravidla ve velmi pokročilém stadiu. Za současný standardní chirurgický resekční výkon při lokalizaci nádoru v hlavě pankreatu je považována proximální duodenopankreatektomie (hemipankreatoduodenektomie), při dalších dobrých faktorech indikujících tento výkon. Ve 25-30% případů karcinomu pankreatu je nádor lokalizovaný v oblasti těla a kaudy pankreatu. Vzhledem k tomu, že se klinicky karcinom většinou projeví pozdě, je indikováno k resekčnímu výkonu jako k operaci radikální – distální pankreatektomii - pouze 10 % nemocných. Při nádorové infiltraci těla pankreatu nebo v případě multilokulární nádorové infiltrace pankreatu může být indikována totální pankreatektomie. Radikální odstranění nádoru je racionální při stadiu T1-3,N0-1,M0. Chemoterapie aplikováním jednoho i více cytostatik má pro léčbu karcinomu pankreatu jen malý terapeutický efekt. Vzhledem k pozdní diagnóze nádoru se chemoterapie většinou aplikuje až ve značně pokročilém stadiu onemocnění, což vysvětluje jen malý dopad na délku přežití a kvalitu života nemocných. V současné době existuje více jak dvacet cytostatik používaných v léčbě karcinomu pankreatu. Procento účinnosti v monoterapii se pohybuje mezi 10-30 %. 5-fluorouracil (5-FU) zůstává nejrozšířenějším cytostatikem pro karcinom pankreatu s udávanou 28 % odpovědí. Skupina GITSIG ukázala prospěch léčby zářením kombinované s chemoterapií u lokálně pokročilé choroby. Adjuvantní onkologickou léčbu je třeba indikovat přísně individuálně u pacientů s lokoregionálně pokročilými nádory (T3) nebo karcinomy jakéhokoliv T stadia při postižení regionálních mízních uzlin. U těchto nemocných je riziko lokoregionální recidivy nejvyšší. Velké naděje se vkládají do zatím experimentálních manipulací ovlivňujících molekulárně biologické pochody kancerogeneze. Z prezentovaných údajů jasně vyplývá, že jakýkoliv nový směr nesoucí v sobě možnost posunu v léčbě, bytˇ v sebemenším rozsahu, je víc než vítán. Úloha hvězdicovitých buněk pankreatu při rozvoji karcinomu pankreatu je dnes již nepopiratelným faktem. Zajímavé údaje vycházeji z nově získaných popisů chování karcinomových buněk vůči svému okolí, i např. právě vůči pancreatic stellate cells. (Löhr J.M. et al., 2003) Buňky pankreatického karcinomu si totiž proti svému hostiteli vytvářejí mechanismy, pomocí nichž předcházejí vlastní programované buněčné smrti (napr. navýšená exprese specifického receptoru s výsledným antiapoptotickým efektem, navýšená exprese růstových faktorů takovéto antiapoptotické schopnosti umožňující a podporující, jako jsou Insulin like growth factor IGF, epidermal growth factor EGF ,….) V rámci toho také s jasnou 16

strategií cílevědomostí pracují na uzpůsobení si okolního prostředí tak, aby mohly za co nejideálnějších podmínek pokračovat v rozvoji své maligní fenotypizace. Významnou mírou ke svým záměrům využívají právě pancreatic stellate cells (např. indukují v nich tvorbu specifického kolagenu typu I, jež určitým mechanismem výsledně podporuje jejich maligní růst a další utváření autonomního prostředí v hostiteli, lidském organismu). Za předpokladu farmakologického ovládnutí (i nekompletního) fibroprodukce v pancreatic stellate cells, by z tohoto úhlu pohledu mohlo vést k efektivnímu protinádorovému zásahu a terapeutickému posunu . Další údaje jsou uvedeny u popisu pancreatic stellate cells a jejich vztahu k nádoru lokalizovaném ve slinivce břišní obecně (neodvisejícího od primární histologické povahy nádorového procesu) a karcinomu pankreatu (v přesném histopatologickém smyslu).

6.3. Akutní pankreatitida Stejně jako u pankreatitidy chronické, i ustavení klasifikace akutni pankreatitidy jako nozologické jednotky trvalo téměř tri desetiletí (1963-1992).Tímto pojmem dnes rozumíme prudce probíhající zánětlivé onemocnění (s celkovou velmi variabilní tíží a rozsahem), nastupující ihned po působení vyvolávajícího stimulu. 95% všech případů je způsobeno nejčastěji cholelithiasou, alkoholismem, nebo příčina zůstává neobjasněna. (Špičák J., 2005).Velmi dramatický bývá průběh traumatické akutní pankreatitidy (děti- pád z kola na řídítka,dospělí - náraz na volant při autonehodě, poranění při kontaktních sportech. Ventrodorzální složka působícího tlaku udělí pankreatu závažné zhmoždění nárazem na páteř). Oproti tomu většinou benigním průběhem se vyznačuje u infekčních pankreatitid (dětské virové infekce – parotitis), vzácněji se vyskytující polékové pankreatitidy. Etiopatogeneze: Již přes sto let platí stručná a výstižná definice - pankreatitida je autodigesce pankreatu způsobená vlastními enzymy.(Špičák J., 2005) Pomocí lyzosomálních substancí intracelulárně skladovaných v acinárních buňkách (Cathepsin B), dochází k předčasné aktivaci v endoplazmatickém retikulu dotvářejících se proteáz (trypsinová kaskáda), je porušena rovnováha vůči inhibičním mechanismům trypsinogenu, jako je pancreatic secretory trypsin inhibitor, alfa -1 protease inhibitor, alfa 2-makroglobulin. Trypsin pak aktivuje proteázu, chymotrypsinogen a fosfolipázu. Také jsou aktivovány leukocytárni proteázy a C3a a C5a složky komplementu a kallikrein-kininový systém.(Špičák J., 2005) Počáteční patofyziologické změny a tkáňové poškození jsou způsobeny aktivovanými pankreatickými enzymy. Ty spouští další kaskádové reakce akutních změn zánětu se stimulací makrofágů, fibroblastů a endoteliálních buněk. Uvolňují se cytokiny akutní fáze interleukin 1 a 6 ( IL1, IL6), interferon (IFN) a tumor necrosis factor (TNF). Další fáze zánětové reakce zahrnuje leukocytozu, aktivaci komplementu zvysenou hladinu glukokortikoidu a zvysenou tvorbu proteinů akutni fáze. Měření krevního průtoku pankreatem při pankreatitidě poskytuje podle jednotlivých studií různé výsledky, většina autorů se však shoduje, ze je hypoperfundován a ischemie přispívá ke vzniku nekrózy. Kapiláry a objemné cévy jsou poškozeny patrně působením pankreatické a leukocytární elastázy. Zvýšená permeabilita cévního řečiště obecně vede k extravazaci tekutiny, hemokoncentraci a oběhovému kolapsu. U těžké pankreatitidy je klinickým důsledkem těchto pochodů hypovolemický šok i multiorgánové selhání. Běžné jsou pleurální, perikardiální a peritoneální transudáty a infra- a retroperitoneální exsudáty. Systémový efekt aktivovaných enzymů může vést přímo či nepřímo k poškození plic, ledvin, jater, srdce a mozku, krevní koagulaci a elektrohydrátového a karbohydrátového a lipidového metabolismu. Respirační dysfunkce je prokazatelná až u 50 % nemocných. V naprosté většině případů je reversibilní, ale u těžké akutní pankreatitidy se může prohlubovat až do vzniku ARDS (adult respiratory distress syndrome) s respirační insuficienci. Do obrazu těžké akutní pankreatitidy patří hypokalcemie. Její příčina je multifaktoriální - ukládání kalcia v tukových

17

nekrozách, snížení hladiny parathormonu v důsledku jeho štěpení pankreatickými proteázami, uvolnění kalcitoninu glukagonem a snížení kalcia vázaného na albumin a posun v poměru jeho intra- a extra- celulární koncentrace. Histopatomorfologie akutní pankreatitidy Patologický nález při akutní pankreatitidě je stejně variabilní jako její průběh. Lehkému průběhu odpovídá edematozní pankreatitida. Dominuje intersticiální edém bez zjevného poškození jednotlivých struktur pankreatické tkáně, leukocytární infiltrát bývá nevýrazný a mohou být přítomné řídce roztroušené drobné tukové nekrozy a nekrozy peripankreatického tuku. Pouzdro pankreatu je intaktní, struktura je dobře patrná. Těžkému průběhu odpovídá nekrotizující pankreatitida. Nejcharakterističtějším nálezem je rozsáhlá nekroza pankreatu často s hemorhagiemi a vždy s masivní infiltrací buňkami akutního zánětu. Vzniká nejprve na periferii pankreatu na několika místech současně a může se šířit do okolních orgánů. (Špičák J., 2005) V okolí adherují k endotheliím buňky zánětu (lymfocyty a neutrofily) (Frossard JL,2002), stávají se jedněmi z producentů cytokinových zánětlivých působků, jež pak s dalšími chemokiny drží společně klíč k lokální i systémové tíži pankreatitidy. (Kim CD, 2005) V této práci (Frossard JL,2002) je úloha PSC a cytokinu typu transforming growth factor beta (TGFbeta) a Insuline like growth factor -1 (IGF –1) uvedena až v případě, kdy po atace nedojde ke kompletní restauraci pankreatického parenchymu a následuje rozvoj fibrotických procesů v rámci rozvoje chronické pankreatitidy. Vzhledem k obecně vysoké komunikační a interaktivní aktivitě PSC si ale lze dnes jen ztěží představit, jak tyto buňky intraparenchymaticky netečně přihlížejí v okolí probíhající bouři akutní pankreatitidy, aniž by do celého procesu vstoupily. Spíš se dnes nabízí otázka stran jejich pozice v celém algoritmu běhu akutní pankreatitidy. Vztah hvězdicovitých buněk pankreatu k vzniku a rozvoji akutní pankreatitidy je tedy víc než velmi pravděpodobný. Jak bylo uvedeno v předcházejícím popisu.PSC se buňky záhy, po primárním uvolnění cytokinů a chemokinů při akutní pankreatitidě, velmi aktivně zapojují do celého procesu. Především přechází do aktivované fenotypové formy a zastupují mimo jiné roli hlavních producentů kolagenních vláken. Stejně tak vykazují i další charakteristické vlastnosti (viz popis pancreatic stellate cells dále), jako v jiných případech probíhajících patologických procesů, v rámci nichž jsou aktivovány.

18

7. CHRONICKÁ PANKREATITIDA 7.1. Chronická pankreatitida - definice, klasifikace 7.1.1. Definice Ve svých základních rysech lze povahu chronické pankreatitidy specifikovat pomocí např. patologicko- anatomické definice chronického onemocnění (Bednář et al., 1982): jedná se o chronické –vleklé onemocnění, s buď opakující se příčinou nemoci nebo jejím trvalým působením, nebo nedostatečnou přizpůsobivostí organismu; nebo konečným přechodem do stavu, který nazývame relativní zdraví (při větší zátěži se projeví nedostatečné kompenzační rezervy a funkční porucha). Jiným důvodem chronicity je circulus vitiosus - vyvolává –li samotná adaptace na škodlivý podnět podmínky k dalšímu poškození. Co se týká konkrétního a co nejpřesnějšího vymezení chronické pankreatitidy jako nozologické jednotky – zdá se, že současná klasifikace a definování je konečně odměnou za několik desetiletí snah, definovat tak obsáhlou a pestrou skupinu pankreatopatií. Ani dnes, porovnáme-li několik definicí uveřejněných v současných evropských a světových pankreatologických publikacích, absolutní významovou identitu nezískáme. Nezbytným základním minimem pro definování chronické pankreatitidy ( významově přítomným v každé z definic) je tento výrok: Chronická pankreatitida je zánětlivý proces, který ničí exokrinní i endokrinní tkáň a v orgánu vyvolává fibrozní změny.( Silbernagel S., Lang F., 2001) Dalším jasně definovaným, pravdivým výrokem o chronické pankreatitidě, ale také ještě obecnější povahy a spíš ke klinickym projevům nemoci se vážící, je: Chronickou pankreatitidu chápeme jako progresivní onemocnění z dlouhodobého pohledu s převažující chronickou symptomatologií, příslušnými nálezy funkčních vyšetření a zobrazovacích metod a s patologickým nálezem chronického zánětu s případnými chronickými komplikacemi (diabetes mellitus, stenoza distálního úseku choledochu, stenoza duodena atd.). S přihlédnutím k současným znalostem o principech odlišných mechanismů poškození zevně a vnitřně sekretorické komponenty, se zdá velmi výstižnou tato definice: Chronická pankreatitida je trvale progredující proces, při kterém je postupně funkční pankreatický parenchym nahrazován vazivem. Důsledkem tohoto procesu je snížení zevněsekretorické a v terminálních stadiích i vnitřně-sekretorické funkce slinivky břišní.(Dítě, 2002b) 7.1.2. Klasifikace Podle Marseille-Rome klasifikace (1988) je chronická pankreatitida definovaná jako kontinuální zanětlivé onemocnění pankreatu charakterizované irreverizbilní destrukcí exokrinního parenchymu a fibrozou a přinejmenším v pozdějších stadiích, destrukcí endokrinního parenchymu. Klinicky toto onemocnění typicky zapříčiňuje bolest a po několika letech přichází exokrinní insuficience, manifestující se steatorhoeou. Endokrinní insuficience, která je následkem úbytku buněk pankreatických ostrůvků, se odehrává přibližně u 60 % pacientů s chronickou pankreatitidou, je ale pozdní manifestací této nemoci. (Sarles H, 1990) Modification of the 10th World Health Organization I.C.D. classification ( Keith G, 2003): „Hlavním účelem mezinárodních klasifikací stavu nemoci je poskytnout společný jazyk pro účely klinické, výzkumné a pro studie, zabývající se výsledky působení na zdraví.“

19

V současnosti pro dělení chronické pankreatitidy platí tzv. „ TIGARO „ klasifikace, jejíž název vznikl spojením počátečních písmen anglických adjektiv charakterizujících jednotlivé podtypy chronické pankreatitidy, v jednoslovný pojem. Především pro klinickou praxi však stále zůstává k primárnímu použití klasifikace Marseillsko – římská (1988), vycházející z původní klasifikace Marseillské z r. 1963. Marseillsko - římská klasifikace( 1988): Chronická kalcifikující pankreatitida Obstrukční chronická pankreatitida Primárně zánětlivá chronická pankreatitida (+ pank. fibroza idiopatická, u cystické fibrozy ) „TIGARO„ klasifikace chronických pankreatitid (2002) T I G A R O

toxicko- metabolická idiopatická genetická autoimunní rekurentní akutní pankreatitidy u osob s chronickou pankreatitidou obstrukční forma

7.2. Chronická pankreatitida- charakteristika Incidence nemoci je geograficky rozdílná, od 1.9/100 000 obyvatel/rok ve Švýcarsku, až k hodnotě 23 /100 000 obyvatel/rok ve Finsku. V České republice dosahla v oblasti jižní a střední části Moravy hodnoty 7.9/100 000 obyvatel/rok, což je vyšší incidence, než např.v Něměcku, Polsku nebo Maďarsku. (Dítě P., 2002a ) CP je ale třeba brát jako komplexní nemoc s mnohočetnými rizikovými kofaktory (na podkladě genetických změn, návyků, životního prostředí, event. kouření, přidružených nemocí). ( Ševčíková A.,2005) Etiologicky je tedy multifaktoriální záležitostí, kdy nejčastějším etiolgickým agens je alkohol (70-90% všech onemocnění) (Dítě P., 2002a ) V r. 2001 studie organizována WHO zobjektivizovala celosvětovou míru abusu alkoholu a kouření cigaret u mladých lidí. Výsledky byly celkově zneklidňující a alarmující, ať už celosvětově či pro Českou Republiku samostatně. Ve věkové kategorii 15-16 let byli nejčastějšími konzumenty alkoholu ( více jak 20 krát za poslední rok) ve skupině chlapců Dánové, ve skupině dívek „ zvítězilo „ Irsko. Česká Republika byla v obou kategoriích na 5.místě, česká mládež tak „ předstihla“ stejněvěké mladé lidi např.z Ruska, Finska, Polska, Švédska, Itálie, Portugalska a Maďarska. Vnavýšení kouření cigaret v letech 1995-2001 se česká mládež ( věková kategorie 15-16 let) ocitla společně s Litevci na prvním místě. (Mayor S, 2001) Z dalších faktorů jsou významné vlivy nutriční (tropická chronická pankreatitida, vlivy genetické (mukoviscidoza, hereditární pankreatitida), tupá poranění břišní dutiny, vrozené anatomické odchylky, vlivy metabolické, imunologické a další.. (Dítě P., 2002a ) (Kim CD, 2005)K doposud známým mutacím vedoucím k hereditární pankreatitidě: mutace pro gen cystic fibrosis transmembrane conductance regulátoru ( CFTR), serin proteázového inhibitoru, Kazal type 1 (SPINK1) a kationického trypsinogenu; a nově mutace trypsinogenu anionického. Vznik, nástup chronické pankreatitidy

20

Podle obecně přijaté teorie SAPE (sentinel acute pancreatitis event ) ( Dítě P et al., Chronická pankreatitida, 2002) je pro vznik chronické pankreatitidy nezbytné, aby její vývoj v úvodu iniciovala ataka akutní pankreatitidy, na jejíž formě ( lehká, těžká,…) nezáleží. Klíčovým bodem této teorie se zdá být „přilákání„ (pozitivní chemotaxe) monocytů do ohniska poškození, k chronické kolonizaci pankreatu, aby pak (jako rezidentní makrofágy) svými působky stimulovaly hvězdicovité buňky pankreatu k aktivaci a fibroprodukci. Při uvážení i té nejlehčí formy akutní pankreatitidy (v podobě intersticiálního edemu, bez poškození vlastního funkčního parenchymu), a současně vysoké senzitivity hvězdicovitých buněk pankreatu vůči minimálním dávkám chemokinů (in vitro demonstrovaným) vedoucí k následné aktivaci, …..dále při schopnosti vcestováni hvězdicovitých buněk do ložiska poškození (prokázaná schopnost buněčného transportu -migrace prostředím pod vlivem pozitivní chemotaxe). Z hlediska přesného popisu procesu vzniku chronické pankreatitidy pro její prvotní iniciaci, je postačující přítomnost cytokinové složky zánětu,……I když in vivo samozřejmě výskyt chemokinů bez doprovázející přítomnosti buněk zánětu, není reálný. Navíc, hvězdicovité buňky pankreatu jasně vykazují minimálně jednu pozitivní autokrinní smyčku (prostřednictvím transforming growth factor beta TGFbeta cytokinu). Pomocí takovéto vazby udržují, navyšují aktivaci vlastní a také i hvězdicovitých buněk v okolí. Je velmi pravděpodobné, že aktivace hvězdicovitých buněk pankreatu do myofibroblastové fenotypové podobě skutečně nevyžaduje podnět rozměru např. hemorhagické pankreatitidy.

7.3. Chronická pankreatitida- jednotlivé typy onemocnění Toxicko - metabolická (chronická kalcifikující) Důsledkem dlouhodobého působení alkoholu ( vice než 80 g/den po léta) na pankreas je chronická pankreatitida. (Špičák J., 2005 Do této skupiny by měli být automaticky zařazeni pacienti s denní konzumaci alkoholu (70g muži a 45 g ženy). (Ševčíková A., 2005) Spotřeba alkoholu na osobu a rok v České Republice v roce 2001 byla cca 10 litrů 100 % ethanolu, což je cca 159.9 litrů piva, 8.2 litru.destilátů, 16.2 litru vína) (Csemy L, Nespor K, 2004) U 80 % nemocných se chronická alkoholická pankreatitida manifestuje atakami, jejichž průběh, prognoza, léčba i bezprostřední důsledky jsou ve shodě s obrazem skutečné pankreatitidy akutní. U 30 % nemocných s chronickou pankreatitidou (obvykle na jejím počátku) jsou ataky, mající shodné rysy se skutečnou pankreatitidou akutni, jedinou manifestací bez progresivního vývoje. (Špičák J., 2005) Jednorázový exces alkoholu u nealkoholika však nevede v naprosté většině případů ke vzniku ani akutní ani chronické pankreatitidy. Chronická kalcifikující pankreatitida představuje 70-80 % ze všech pankreatitid. Je charakterizována ložiskovitým postižením, s nepravidelně rozmístěnými parenchymovými lézemi, jež obsahují bíkovinné kapénky. Pro vývody je typická přítomnost lithiasy, atrofie a stenotizace. (Silbernagel S., Lang F., 2001) Mechanismus vzniku histologického obrazu chronické kalcifikujícíc (alkoholické) pankreatitidy: Stimulované aciny produkují na enzymy bohatý sekret. Ten je za normálních podmínek ve vývodech doprovázen a ěeděn pomocí zvýšené sekrece HCO3- a vody. Při chronické pankreatitidě je však tato komponenta snížena. Dochází k zahušťování obsahu vývodů, bílkoviny jsou přítomny v nezvyklé koncentraci, potencované každým dalším stimulem sekretorické aktivity acinů. Následně dochází k intraduktální bílkovinné precipitaci, a to v podobě kapének a uloženin. Do takto vysrážených bílkovin se ukládají soli vápníku, tvoří se kameny v luminu malých vývodů a koncentrické vápenaté usazeniny na stěnách větších vývodů.

21

Možnou příčinou je snížené množství dvou důležitých látek v pankreatické šťávě, jež normálně brání před tvorbou lithiasy v pankreatických vývodech. Je to jednak citrát (normálně tvořící s kalciem komplexy, vyvazující jej tak z jinych vazebných aktivit) a lithostatin (pancreatic stone protein, PSP,14kD bílkovina), který za fyziologických podmínek udržuje při přesycení soli vápníku ve formě roztoku.(Dítě P.,2002c) Forma chronické kalcifikující pankreatitidy je považována za pokročilé stadium nemoci, což nepochybně platí pro přítomnost konkrementů v pankreatickém vývodu, kde mohou způsobit obstrukci. Ale v klinické praxi nemá vždy již tak alarmující efekt v situaci, kdy kalcifikace jsou nalezeny v parenchymu žlázy. Obstrukční chronická pankreatitida Příčinou obstrukční pankreatitidy je omezení odtoku exokrinních sekretů zúženým či uzavřeným pankreatickým vývodem.Příčinou zúženého či uzavřeného lumen pankreatického vývodu může být intraparenchymatická jizva po akutní pankreatitidě (zasahující přímo i stěnu vývodu nebo svou trakční silou tvarově vývod alteruje a deviuje), intraduktální konkrement, stejně tak extraduktální útlak cystoidem, nádorem. Další příčinou může být opět multietiologicky navozená stenoza Vaterovy papily (nejčastěji však papilomem). Charakteristická je abscence intraduktálních i jiných intrapankreatických kalcifikací, a mechanicky - přetlakem „proximálně„ od stenozy navozené rozšíření pankreatického vývodu. Při včasném odstranění příčiny obstrukce je tato forma pankreatitidy uváděna jako reverzibilní. Je ale jasné, že rozsah reverzibilních změn a dosažení např. plné restaurace orgánu je limitovano již rozvinutými procesy nevratnými, mezi něž patří především nově vytvořené vazivo. Idiopatická (chronická idiopatická) pankreatitida Tuto skupinu dnes predstavuje cca 10 % pacientů s chronickou pankreatitidou. Dříve sem byly řazeny i případy chronické pankreatitidy vzniklé na podkladě dysfunkce Oddiho svěrače (15% všech chronických pankreatitid), pankreas divisum (1%) a z hyperkalcemie při hyperaldosteronimu. Hereditární pankreatitida představuje 1-5% všech případů chronické pankreatitidy. (Silbernagel S., Lang F., 2001) Je zatížená nejvyšším rizikem pro vznik karcinomu pankreatu - genetickým podkladem této predispozice jsou: mutace genu pro cystickou fibrozu a skupinu hereditárních pankreatitid (CFTR a SPINK, PRSS1), kationický a anionický trypsinogen.. Mutace genu pro CFTR a SPINK jsou dědičné autozomálně recesivně, proto výsledné postižení pankreatu má heterogenní charakter. Skupina pacientů s mutací PRSS1 (autozomálně dominantní forma dědičnosti) je stran vzniku karcinomu pankreatu v terenu této pankreatitidy nejvíce ohrožena, riziko je asi 50-60 krat vyšší než u ostatních typů chronické pankreatitidy, včetně alkoholické. (Ševčíková A., 2005) Autoimunní chronická pankreatitida tvoří přibližně 5% všech případů chronických pankreatitid. Dříve byla řazena k idiopatickým chronickým pankreatitidám. Jejím hlavním rysem a zároveň velkým pozitivem je významná responzibilita na terapii steroidy, s možností úplné regrese onemocnění a zhojení ad integrum.

7.4. Chronická pankreatitida-klinika Symptomatika nastupující chronické pankreatitidy ve svém úvodu (nerozvíjí-li se následkem nějaké těžké akutní pankreatitidy) může být i do určitého momentu vágní a záludná.

22

Dramatičností svého úvodního vývoje většinou (za karcinomem pankreatu a akutní pankreatitidou) zaostává. Nemusí být tedy intenzivně zářícím signálem, alarmujícím a mobilizujícím terapeutické a prognostické zaujetí pacientovych blízkých a lékařů přicházejících s pacientem do prvního kontaktu. V následném vývoji se ale dříve nebo později projeví v plném rozsahu, a to především formou výrazně trápících silných abdominalgií (přítomných kontinuálně či v atakách), malasimilací s celkovým neprospíváním a strádáním pacienta. Chronická pankaretitida je tedy nemocí, která významně ovlivňuje kvalitu života nemocných a invalidizuje je. (Dítě P., 2002a ) Dovršením celého vývoje choroby a plným projevem jejího zhoubného potenciálu pak může být vyústění v maligní onemocnění - se stejně nesmlouvavými pravidly chování, jako jakýkoliv jinak započatý pankreatický neoplastický proces. Chronická pankreatitida byla celou řadou studií potvrzena jako významný rizikový faktor vzniku karcinomu pankreatu (Dítě P., 2002a), prevalence je asi 4 %. Je zřejmé, že největší vliv má doba trvání nemoci, riziko se zvyšuje významně po pěti letech. (Ševčíková A., 2005) Klinické příznaky nemoci jsou pestré, jednoznačně ovlivňující kvalitu života nemocných. Bolest je vůdčím příznakem. Je většinou dlouhodobá (i týdny), trvalého charakteru, s epizodami intenzivnějších atak, vedoucích pacienta k zaujmutí charakteristické flekční úlevové polohy trupu (tzv. „ Jack knife“). Nástup bolesti, popř. její maxima jsou často odpoledne a v podvečer. Vyvolávajícím momentem je nejčastěji strava ( časově i druhově). Etiologie bolesti je zřejmě komplexnější, než-li čistě mechanické vysvětlení – nevratné uzamykání volných nervových zakončení v postupně se zmenujících prostorách, jež jsou zaplňovány a retrahovány novotvořeným vazivem.(viz dále – postižení nervů u chronické pankreatitidy). Mezi další důležité známky intenzity a průběhu nemoci patří hubnutí, celkové neprospívání. Má dvě příčiny: jednak nástup zevně sekretorické insuficience (malprodukce amylázy, lipázy, peptidázy, malabsorpce); jednak z prostého důvodu nemalých obav pacienta přijmout potravu, neboť s ní má spojený nástup abdominalgií. Sížená produkce pankreatických šťáv acinárními buňkami je přímým následkem atakování těchto bunkě hvězdicovitými buňkami pankreatu. Hvězdicovité buňky jednak svou navýšenou fibroprodukcí vedou k mechanickému útlaku a destrukci acinů nove tvořeným a ukládajícícm se vazivem. Jedním ze současných témat studia hvězdicovitých buněk pankreatu je ale také snaha o definování a regulaci jejich chemických vazeb s acinárními buňkami. V obecných rysech je výsledným zaměrem omezit produkci faktorů negativně ovlivňujících acinární buňky a tím snížit povšechné degenerativní procesy buněk acinů, mimo jiné vedoucí a projevující se právě sekretorickou nedostatečností. Přirozeným následkem této insuficience jsou další příznaky jako diarrhoe, steatorrhoea, kopiozní objemnější stolice s obsahem zbytku nestrávené potravy. Toto je výsledkem malasimilačních procesů, zvláště v oblasti lipidového metabolismu. Nauzea, zvracení. Jsou časté, zvláště u alkoholické formy. Porušená glukozová tolerance, diabetes mellitus. Provázejí většinou morfologicky pokročilá stadia. Údaje získané z retrospektivně stavěných studií, vycházející z klinických záznamů o pacientech, uvádějí výskyt diabetu mellitu celkem u 1/3 pacientů s chronickou pankreatitidou. Klinicky se porušená glukozová tolerance a následně pankreatogenní diabetes mellitus typu II manifestuje až při destrukci 85-90% objemu Langerhansových ostrůvků. Krom této vysoké kapacity Langerhansových ostrůvků funkčně kompenzovat jejich množstevní úbytek a dlouho tak setrvat bez klinicke manifestace vlastnich potíží, zde sehrávají významnou roli ještě další specificke obranné mechanismy, jimiž endokrinní složka (v porovnání se složkou exokrinní) disponuje. (viz dále postiženi endokrinní složky pankreatu). K utváření si těchto specifických podmínek zřejmě využívají interakci s hvězdicovitými buňkami pankreatu. Vzájemná komunikace a senzitivita vůči vysílaným

23

stimulům mezi hvězdicovitými buňkami pankreatu a beta bunkami Langerhansových ostrůvků je jedním z aktualne in vitro studovaných témat. Střevní dyskineze, pseudocysty, ascites, krvácení. Příznaky střevní obstrukce, portální hypertenze - na vzniku obou těchto příznaků se samozřejmě přinejmenším mechanicky spolupodílejí kolagen navýšeně produkující aktivované pancreatic stellate cells. Jako prognostický marker aktuálního a dalšího vývoje chronické pankreatitidy je dnes klinickou medicínou považována za významnou přítomnost masivní steatorhoey (vedoucí ke kachexii). Ostatní projevy exokrinní insuficience nesehrávají z tohoto úhlu pohledu hlavní roli. ( Johnson, Imrie, 2004) Diagnostické možnosti v rámci chronických pankreatopatií jsou založeny na průkazu změn morfologických a okrajově funkčních testů.(Dítě P.,2002c) V oblasti včasné diagnostiky se s postupujícím výzkumem (s významným podílem výzkumu hvězdicovitých buněk pankreatu) naskýtají nove otázky, hypotézy a cíle k dosažení.V porovnání s nimi by se současná diagnostika (založená na znamkách klinické, morfologické či laboratorní manifestace insuficience pankreatu) ocitla v pozici komplexu diagnostických vyšetření a stagingu chronické pankreatitidy. Ne však v pozici markeru nastupující fibroprodukce. Identifikování toho by vedlo nejen k velmi časné diagnostice nastupujícího vazivovatění, hlavně by ale poskytlo možnost terapeutické intervence antifibrotiky, jež by působila atenuaci či dokonce úplné pozastavení aktivace PSC nebo alespoň jejich výrazné proteosyntetické nadprodukce kolagenu. Poslední uvedené předpoklady jsou zatím metami pro budoucnost. Brzká diagnostika za použití serologického měření fyziologicky se odštěpujících fragmentů z nově tvořeného kolagenu, již byla prověřována.V roce 1996 byla k ohodnocení intenzity probíhající pankreatické fibrozy využita sérová hladina amino-konce typ III procolagen propeptidu (PIIIP), která by mohla odrážet stupeň fibrogenní aktivity u některých chorob asociovaných s fibrozou. Prolylhydroxylasová aktivita byla vzata jako index pankreatické fibrogeneze , Bentiromide (BT)-PABA test jako index exokrinní pankreatické funkce. PIIIP korelovala s pankreatickou prolylhydroxylazovou aktivitou, ale ne s BT-PABA či s délkou onemocnění. Sérové PIIIP hladiny byly zvýšené u pacientů s chronickou pankreatitidou a reflektovaly intenzitu pankreatické fibrogenní aktivity. Žádný vztah mezi hladinami sérového PIIIP a pankreatickou exokrinní funkcí a délkou onemocnění nebyly nalezeny. (Navarro S, 1996) Pro tuto chvíli je metoda pro praxi nepoužitelná, neboť je nespecifická. Naměřené hodnoty těchto fragment by pouze informovaly o celkové míře ( rozsahu ) fibroproduktivních procesů aktuálně se v organismu odehrávajících, bohužel ale bez upřesnění lokalizace. Pokud by se ale podařilo uzpůsobit fibroprodukci v pancreatic stellate cells alespoň tak, aby jejich kolagenní produkty byly jasně orgánově speicifické (a tim i identifikovatelné), v tom momentě (např.s ohledem na stadium vývoje metodik buněčné adresace u pancreatic stellate cells) by takovýto objev přispěl alespoň k časnější diagnostice a správnému načasování dnes známé léčby. Z klinického úhlu pohledu je v současnosti diagnostika chronické pankreatitidy především diagnostikou morfologickou. Funkční testy ovšem v některých případech mohou přispět k bližší specifikaci nemoci, tj. zda morfologický nález je provázen exokrinní pankreatickou nedostatečností, nebo ne. Je evidentní, že není absolutní paralela mezi nálezem morfologickým a exokrinní kapacitou žlázy. .(Dítě P.,2002c) Terapie Symptomatická

24

Terapie chronické pankreatitidy je založena především na dietních opatřeních (především ukončení abusu alkoholu). (Dítě P., 2002a ) Dieta zahrnuje doporučení častějšího příjmu stravy, v menších porcích, s redukovaným mnozžstvím tuku (zvláště živočišných). Denní příjem bílkovin v potravě by se měl pohybovat mezi 1.5-2.0 g/kg tělesné hmotnosti. Pokud není nemoc provázena diabetem mellitem, příjem cukru ve stravě není nijak limitován. Konzervativní terapie spočívá v podávání preparátů s obsahem pankreatických enzymů a v terapii dalších příznaků, především bolestí. Preparáty s obsahem enzymů obsahují definované množství živočišné amylázy, lipázy a proteáz. Podávají se zásadně během jídla, a musí splňovat principy tzv. řízeného uvolňování enzymů. Nejčastěji se jedná o kapsle, obsahující mirkočástice o velikosti 1.0 - 2.0 mm, kryté acidorezistentním obalem.Tato galenická forma umožňuje, aby došlo po uvolnění mikročástic z kapsle v žaludku k jejich promíchání se s chymem a k současnému vstupu (chymu) tráveniny a z částic uvolněnými pankreatickými enzymy do duodena. To zajišťuje, aby postup trávení byl co nejvíce fyziologickým, a aby využití mirkočástic uvolněných enzymů bylo co největší. (za normálních podmínek je výdej pankreatických enzymů stimulován enterohormonem cholecystokininem - pankreatozyminem, který se do krve uvolňuje ze sliznice duodena po jejím kontaktu se střevním obsahem). (Lüllmann H, 2001),(Dítě P.,2002c) Abdominální bolest je přítomna v 90 % všech případů tohoto onemocnění. Farmakologicky ji léčíme obecně jako každou jinou bolest, vycházejíc z klasického schematu třístupňové úrovně analgetické farmakoterapie. Navíc, jistý analgetický efekt, u některých nemocných, mohou mít i kapsle s obsahem enzymů, v nichz převažují proteázy. Při užití pouze léčby farmakologické by ovšem stav neměl dospět do stadia, kdy účinnými léky jsou již pouze opiáty. Další alternativou je málo používaná lýza ganglií (ganglion coeliacum), stále častěji je používána metoda hrudní splanchnektomie. Efektivní může být ovšem i drenážní výkon endoskopický anebo léčba chirurgická. Z dlouhodobého pohledu se zdají chirurgické výsledky lepší než u léčby endoskopické, ovšem chirurgická terapie je zatížena závažnějšími komplikacemi, než je tomu u terapie endoskopické. Z uvedeného vyplývá, že léčíme až symptomaticky a morfologicky rozvinutá stádia nemoci. Neumíme dosud diagnostikovat a tím ani léčit časná stadia nemoci. Nadějným je ovšem směr vyhledávání stavů, o kterých je známo, že jsou se vznikem nemoci spojeny, především vyhledávání aberací genetických. (Dítě P., 2002a ) Na hranici mezi symptomatickou a kauzální léčbou se do jisté míry pohybují léky protizánětlivé, některá imunosupresiva a antivirotika. Nejvíc se k opravdu kauzální léčbě blíží použití steroidů u autoimunní formy chronické pankreatitidy, jehož následkem může být, jak se zdá, i úplné vymizení histopatomorfologických známek přítomnosti nemoci v původně zánětem postiženém pankreatickém parenchymu. Kauzální terapie Kauzální léčba chronické pankreatitidy v současnosti neexistuje. Cílem je získat léčbu především protifibrotickou, právě proto jsou v ohnisku maximálního vědeckého úsilí v oblasti pankreatologie hvězdicovité buňky pankreatu (a stejně tak hepatic stellate cells v oblasti hepatologie, u především chronických a hlavně fibroproduktivních jaterních onemocnění). Pod pojmem antifibrotická léčba se skrývá stále více léků, lišících se cílovým místem svého terapeutického zásahu. Především se jedná o antifibrotickou léčbu odvíjející se od znalosti buněčné biologie hvězdicovitých buněk pankreatu. S narůstajícími informacemi o jejich povrchových, intracelulárních a intranukleárních vlastnostech, ale i o jejich chování a interakcích vůči jiným buněčným typům,...se i v této oblasti snažení naskýtá více možností vhodných k pokusům adekvátně je regulovat a dovést tak hvězdicovité buňky hlavně do stavu opět snížené fibroprodukce a tvorby vysoce účinných chemokinů, které uvolní do svého okolí. Jedním z

25

nezbytných předpokladů pro izolované a cílené ovlivnění pancreatic stellate cells je ale získání „ přesné buněčné adresy„ hvězdicovitých buněk, jedinečně se vyskytující právě jen u nich (pravděpodobně v podobě povrchového buněčného receptoru). Tím by bylo umožněno podání prakticky jakéhokoliv léčiva fixovaného na vysoce selektivní nosič, jež by tento lék doručil právě jedinému buněčnému typu – hvězdicovitým buňkám pankreatu. Jinými oblastmi možného úspěchu při hledání léčby chronických onemocnění pankreatu jsou pokračující analýzy genových mutací acinárních buněk, jejichž přítomnost zvyšuje u daného pacienta riziko vzniku a klinické manifestace hereditární pankreatitidy, dále pak pankreatického karcinomu. Na konci tohoto zmapováni totiž čeká pestrá škála možností dnes už rozvinuté (a stále se rozvíjející) genové terapie.

26

8. CHRONICKÁ PANKREATITIDA – SPOLEČNÉ HISTOPATOMORFOLOGICKÉ ZNAKY PRO DEFINOVANÉ TYPY CHRONICKÝCH PANKREATITID Jak již bylo uvedeno, základním principem uplatňujcím se ve vývoji některých chronických ogranových onemocnění např. jater, pankreatu, plic, ledvin…..) je ztráta vlastního funkčního parenchymu (nezřídka vysoce progresivně probíhající) a zároveň masivně navýšená fibroprodukce. Jejím následkem je ukládání objemných depozit vazivových komponent do intersticia, odkud mechanicky utlačují okolní přetrvávající struktury vlastního funkčního parenchymu, ale společně s dalšími složkami celého patologického procesu (zánět, imunitní reakce jako taková,….., celá škála přítomných chemicky aktivních látek) se spolupodílejí na expanzi procesu a destrukci právě původních funkčních (orgánu vlastních) buněčných komponent. Vztaženo na pankreas a chronickou pankreatitidu - současné možnosti léčby protizánětlivé, imunosupresivní, protivirové; poskytují kauzální lécču pouze v případě autoimunní pankreatitidy (steroidy), jinak kromě symptomatické léčby (viz výše), nemáme co pacientům poskytnout. TIGARO klasifikace a Marseillsko- římská klasifikace dělí chronické pankreatitidy na základě společných etiologických činitelů a vůdčích morfologických znaků typických pro jednotlivé podskupiny. Následující text se pokusí shrnout naopak společné procesy a znaky, pro jednotlivé složky pankreatu s již probíhající chronickou pankreatitidou, bez ohledu na typ chronické pankreatitidy.

V průběhu chronické pankreatitidy dochází tedy k těmto změnám jednotlivých složek pankreatu:

8.1. Vlastní funkční parenchym- exo + endokrinní složka pankreatu Exokrinní složka: U chronické pankreatitidy je signifikantně vyšší apoptotický index i proliferační index u acinárních buněk – v porovnání s tímto celulárním kompartmentem v normálním pankreatu. Buněčný obrat této složky je tedy navýšený. (Bateman AC, 2002) Acinární buňky obecně podléhají mnoha různým, ať už extra- či intra- celulárním vlivům. Škála jejich transformací je pestrá, obsahuje kvantitativně odstupňované buněčné změny, přes tzv. rediferenciační změny ( teorie epitelial to mesenchym transformation, EMT) směrem k buňkám mesenchymu, přes vlastní programovanou smrt - apoptozu až k v horším případě změny anaplastické - metaplastické, stadia prekarcinomových a karcinomových buněk. Už v brzkých stadiích rozvoje chronické pankreatitidy je patrná progresivně nastupující destrukce exokrinního parenchymu pankreatu a oproti tomu zachovávání endokrinních ostrůvků. (Bhanot UK, 2006) Apoptoza je programovanou smrtí buněk (Kerr et al. 1972); proces, jímž zanikají buňky jako jednotlivá individua ve zdravých a nemocných tkáních. V gastrointestinálním systému byla její role identifikována u epiteliálních a mesenchymálních buněk jater a epiteliálních buněk tenkého a tlustého střeva. Nově je zjištěno, že apotpoza hraje také zásadní roli v acinárním úbytku při chronické pankreatitidě, významná je při tom makrofágová lymfocytární (CD3 T

27

lymfo, CD20 B lymfocytární) infiltrace, která je v exokrinní složce přítomná v daleko větším množství, nežli v endorkinních ostrůvcích. (Bateman AC, 2002) V průběhu chronické pankreatitidy, jak uvádí nove informace z července 2006, totiž pankreatické aciny ztratí svůj imunoprotektivni status, neboť na svém buněčném povrchu začnou exprimovat proapoptotické receptory. Tím se tedy stávají senzitivními pro spuštění apoptozy, a to pomocí ligandů exprimovaných na lymfocytech v okolí a uvolňovaných z pancreatic stellate cells.( Fas/ Fas ligand interakce, dále jsou v interakcích zapojeny členové Bcl-2 rodiny regulátorů apoptozy a Retionoblastoma protein) Oproti tomu Endokrinní složka Langerhansovy ostrůvky, si zachovávají svůj imunoprotektivni status a aktivují nukleárním faktorem-kappaB ( NF-kappaB) – indukované anti-apoptotické faktory, jež jim ješte navýší schopnost přežívat. Navíc, z hlediska zachováni funkčnosti si zaslouží Langerhansovy ostrůvky také obdiv - jak už bylo uvedeno, jejich insuficience se manifestuje porušenou oGTT a DM az při destrukci 85-90 % jejich celkového počtu(Dítě P. et al., 2002b), přičemž u chronické nekalcifikující pankreatitidy je výskyt porušené oGTT a DM nižší.

8.2. Změny vývodů: Epitel pankreatických vývodů Se při různých formách pankreatitidy též vyskytuje v celé škále patologických změn, v rámci buněčných transformačních procesů (atrofie, metaplazie, prekanceroza, karcinom, apoptoza). Např. při chronické obstrukční pankraetitidě je epiteliální výstelka vystavena mechanickému tlaku hromadícího se sekretu, před obstrukcí či stenozou vývodu. Nasledkem toho podléhá také buněčným degenerativním změnám, jež mohou vést k rozvoji neoplastických změn a adenokarcinomu pankreatu, jež je histologickým nálezem ve více jak 90 procentech autopsií z ložisek pankreatického karcinomu na svete. ( viz výše karcinom pankreatu). Vlastní vazivo vývodu se postupně spojuje s okolním novotvořeným vazivem a působí ruzně směřovanými trakčními silami na vývody. Následkem jsou různé deformace lumina vývodu, stenotizace může vést k potížím odtoku acinárního sekretu směrem do duodena, s dilatací před stenozou, případně až obstrukci vývodu.

8.3. Fibroza Pankreatická fibroza, charakteriský histopatologický děj u chronické pankreatitidy, už není povazovana pouze za epifenomen chronického poškození, ale za aktivní procese, jenž – ve svých časných stadiích (jak se předpokládá) - může být reverzibilní. Identifikace a charakteristika PSc v současných letech měla významný dopad na výzkum v oblasti, problematice pakreatické fibrogeneze. Akumulační důkaz z obojího - in vivo studií (za použití lidských pankreatických vzorků - řezů a experimentálních modelů pankraetické firbozy) a in vitro studií (za použití kultur PSC) dokazuje klíčovou roli aktivovaných PSC ve firbotických procesech. (Apte MV, 2004) Fibroza je reprezentována zmnožením vaziva. 8.3.1. Vazivo

28

Skladba vaziva vychází z obecných pravidel struktury pojivových tkání, do nichž je řazena, společně s chrupavkou a kostí. Vazivo pochází z mesenchymu, tedy z „primární embryonální pojivové tkáně“, vznikající z mezodermu, přeneseně ale vzhledm k mezodermálnímu původu tedy ze všech tří zárodečných listů). Mesenchym je složen z nečetných, síťovitě uspořádaných buněčných elemetnů hvězdicovitého tvaru, uložených v mezibuněčné hmotě složené ze základní hmoty amorfní a vláknité komponenty představované retikulárními vlákny. Možnosti další diferenciace mesenchymu jsou bohaté, dávají vznik lymfatickým, hemopoetickým komponentám, svalové tkáni, endotelu a pojivu (vazivo, chrupavka, kost). Embryonální původ pancreatic stellate cells ještě není plně objasněn, neboť tyto buňky vykazují jednak na svém buněčném povrchu ale i intracelulárně (např. přímo pro identifikaci používané značení intermediárního filamenta GFAP) znaky typické pro různé deriváty z odlišných zárodečných listů. Jejich původ je tedy zamýšlen ze dvou zdrojů - mesenchym a neuroektoderm. Pro druhé svědčí i na příklad blízká topografická návaznost a chemická komunikace se synaptickými zakončeními nervových vláken v pankreatu (pouze některé PSC). Pankreas je při chronické pankreatitidě morfologicky a funkčně deformován explozivně se novotvořícím vazivem. Vazivo je složeno z buněk a mezibuněčné hmoty. Mezibuněčná hmota je tvořena vazivovými vlákny (několik druhů, vzájemně se odlišujících složením a topografickým uspořádáním) a základní hmotou amorfní, jež má tekutý až rosolovitý charakter a vyplňuje okolí buněk a vláken. Pro vazivo je charakteristické, že ve skladbě mezibuněčné hmoty jednoznačně dominuje vláknitá komponenta. Vazivo plní dvě základní funkce,mechanickou a vitální (zásoba a střádání látek, regulace vodního a iontovího zastoupení v daných intersticiích, tvorba protilátek a další obrana vůči škodlivým noxám). 8.3.1.1. Buněčná skladba Buněčná skladba jednotlivých typů vaziva se odlišuje přítomností a kvantitou různých druhů buněk vaziva. Fibrocyty, fibroblasty představují plně diferencované buňky bez možnosti transformace v jiné buňky vaziva. Jsou hlavními producenty základní hmoty amorfní a prekurzorů vláknité komponenty, jež po uvolnění do extracelulárního prostoru polymerizují v definitivní kolagenní vlákna. Tvarově jsou zpravidla hvězdicovitého až vřetenovitě protáhlého vzhledu. Cytoarchitektonika s navýšeným množstvím granulárního endoplazmatického retikula a Golgiho aparátu v cytoplazmě korelují s popsanými buněčnými funkcemi. V podmínkách dlouhodobé iritace těchto buněk jsou schopny fagocytozy. Retikulocyty jsou hvězdicovitě utvářené buňky, dotýkající se vzájemně svými výběžky. Jsou producenty retikulárních vláken. Nachazíme je především ve struktuře lymfatických uzlin, sleziny a krvetvorné kostní dřeně, jejichž stavby utvářejí. Dalším specifikem je možnost uvolnit se z mezibunečné vazby a měnit se na makrofágy Podél krevních cév jsou ve vazivu uloženy tukové buňky s intracytoplazmaticky skladovanými tukovými komponentami, ať už univakuolárně nebo multivakuolárně. Plně diferencované tukové buňky ztrácejí schopnost se dělit. Pocházejí z mesenchymu. I u těchto buněk lze hledat určité společné charakteristické rysy s PSC (stejně jako melanocyty vazivové tkáně, jež jsou původem neuroektrodermálního), důležité rysy je ale zcela jednoznačně (dělení, kontraktilita, fibroprodukce) od nich oddělují.

29

Histocyty (makrofágy) – většinou se vysyktuje v tkáni jako rezidentní buněčné komponenty, při reakci na podnět se zakulacují a stávají volnými. Intracytoplazamticky je zcela logickou charakteristikou bohatá lyzosomální výbava. Heparinocyty (žírné buňky) se vyskytují všude v řídkém vazivu, i v trávicí trubici, játrech,…, jsou producenty několika významných působků jako heparinu, histaminu a serotoninu, jejichž vliv dozajista napomáhá i lokální invazi a expanzi zánětlivých procesů (heparin anitkoagulace, histamin - uvolňování působků z dalších proinflamačních buněk histamin sekretujících, serotonin - vasokonstrikce, tedy alterace podmínek prostředí s akutně probíhajím zánětem, ale i obecně patologickým procesem, se změněnými podmínkami krevních plynů v intersticiu, pH, distribucí tekutin - krevní cévy (arterie, žíly ) – intersticium lymfatická cévní drenáž). Plazmatické buňky ( vyvinuly se z B lymfocytů), jakožto producenti humorální buněčné imunity - výskyt i trávicí trubice, omentum maius, a slinné žlázy - pravděpodobně i slinivka břišní. Lymfocyty se zmnožují při chronických zánětech. Monocyty mají schopnost diapedezy a změnit se v makrofágy; za určitých podmínek na epiteloidní buňky či obrovské buňky. Eosinofilní granulocyty: …jsou též totožné z krevními, mohou z kapilár a venul vycestovat do intersticia a usadit se v okolí cév. (v gastrointestinálním traktu se vysyktují v omentu, charaktetristickou lokalizací je plicní intersticium, kde se jejich počet navyšuje při alergických reakcích a v pozdní fázi zánětlivé reakce. Inkorporují a destruují komplex antigen -protilátka). Nediferencované buňky vaziva (mezenchymocyty)…i v dospělosti buňky nedifencované s charakteritikami mezenchymocytů, podél cév - krevních apilár, arterií a vén menšího průsvitu. Morfologicky jsou podobné fibroblastům, vlastnostmi buňkám hemopoetického vaziva a kmenových buněk lymfatické tkáně. 8.3.1.2. Mezibuněčná hmota (extracelulární matrix, ECM) Mezibuněčná hmota (extracelulární matrix, ECM) je schematicky rozdělena na složku vláknitou a základní hmotu amorfní. Základní hmota amorfní Bezbarvá, transparentní, homogenní substance rosolovité konzistence, je prostředím, jímž prochází vešerá látková komunikace mezi buňkami a cévami. Vyplňuje veškeré prostory kolem buněk a vláknité složky intercelulárních prostor. Základní hmota amorfní je tvořena glykosaminoglykany ( k. hyaluronová,chondroitin, heparan-sulfát) a glykorpoteiny ( fibronectin, chodronektin, laminin). In vivo, in vitro (labor.potkan) realizovana studie fibronectinu (peptid, 22mer) prokazala, ze jeho část , nazvaná FNIII14 má antimetastatický potenciál. Experiment se zaměřil i na inhibici jaterních a slezinných metastáz buněk lymfomu. Princip této ropoznane inhibice může mít ale obecnější dosah. FNIII14 přerušil beta1integrinem mediovanou adhezi bez vazby na integriny, a tímto nepředal dále intracelulárně signál k tyrosinové fosforylaci intracelulárních kaskád (včetně focal adhesion kinase (p125(FAK)) a paxillinu). (Kato R, 2002) FNIII14 může být aplikovaný jako nový typ antimetastatické léčby odlišné od integrin - vážících peptidů.FNIII14 by tedy potenciálně mohl bránit i lokálnímu usazení, etablování metastáz pankreatického karcinomu při disseminaci do jiných orgánů. Naopak negativní roli, tedy progresi a expanzi nádoru usnadňující, se aktivně podílejí víc než samotné komponenty vaziva specifické chemické látky (např.sekrety pancreatic stellate cells),

30

jež tyto vláknité struktury ( některé typy kolagenu ) svou proteázovou aktivitou narušují a bortí tím mechanická „ opevnění „ vůči lokální expanzi nádoru. Uvedená studie tedy potvrzuje oprávněnost zájmu (v rámci studia pankreatopatií) nejen o vlastní parenchym (jeho buňky podléhají např. nádorovým transformacím) ale veškerým dalším komponentám, jež tvoří součást pankreatu. Jak se nyní předpokládá, většina těchto složek totiž spolu vzájemně komunikuje, interaguje, a to jak za „ fyziologických tak patologických podmínek. Sehrávají roli i v iniciaci některých patologických procesů. Vláknité komponenty extracelulární matrix (ECM) jsou dle světelné mikroskopie klasifikovány do tří typů vláken:kolagenní, retikulární a elastická. Je vyzdvihována především jejich funkce mechanická. Každý typ vláken a také jejich uspořádání uděluje dané oblasti vaziva určité rysy stran míry pružnosti a tažnosti, pevnosti a tuhosti. Vazivo velmi pravděpodobně i významněji zasahuje do metabolických vlastností dané oblasti,…např. novotvořené vazivo může vést k lokální, byť reverzibilní ( dočasné) ischemizaci, následné změně pH, tím vlivu na aktivitu některých enzymů… Vláknité kompenty ECM jsou tedy morfologicky kategorizovány do dvou systémů: kolagenní fibrilární systém sehrávající roli podpůrné konstrukce tkání a buněk, a mikrofibrielastinový systém sloužící pro uniformně distribující stres k udržování pevnosti, tažnosti a pružnosti, adaptované na lokální tkáňové požadavky. (Ushiki T, 2002) Z hlediska chemické struktury jsou to polypeptidy, v neutrálních roztocích nerozpustné. Kolagenní vlákna (= fibra), o šíři 1-20 µm, s průběhem přímým či mírně vlnitým, jsou přítomna ve všech typech pojiva. Vlákno je utvářeno z jednotlivých 0.3-.5 um širokých fibril, pozorovatelných stále ještě světelným mikroskopem. Fibrily jsou sestaveny z menších mikrofibril (o průměru 75 nm), jež mají vzhled příčného pruhování. Jedná se o glykoprotein, obsahující glycin, prolin, hydroxyprolin, hydroxylysin. Řetězec tvoří trojitou šroubovici, jež se ve strukřtuře mikrofibrily uspořádají paralelně a nad sebou se překrývají i ¼, což spůsobuje dojem příčného pruhování.(charakteristický D- vazebný vzorec jehož délka je v rozmezí 64 do 67 nm, v závislosti na tkáních a orgánech., (Ushiki T, 2002) ) Typy kolagenních vláken: typu I (představuje 90% veškerých kolagenních vláken v lidském organismu, je produkován fibro-, osteo-, odonto - blasty)… Je tedy typickým kolagenním vláknem v dermis, šlachách, kostech, zubech a vazivu. Typ II koalgenu je produkován chondroblasty, typ III je typický pro embryonální vývoj pojiv. V dospělosti se s ním pak setkáváme již pouze v retikulárním vazivu podél cév, v uteru, GIT, dermis. Tam je produkován fibroblasty. V ostatních okrscích je tvořen (Horký D. et al., 1995) buňkami hladké svaloviny (tedy v souvislosti se současnými znalostmi do této skupiny kolagenních producentů velmi pravděpodobně spadají také stellate cells). Kolagen typu IV je nazýván „ kolagenem bazálních membrán„, neboť je jejich charakteristickou a velmi významnou strukturální složkou. Je produkován „ buňkami na bazální membránu nasedajícími „ , tedy epiteliemii a endoteliemi. Velmi pravděpodobně se opět mezi epiteliemi a endoteliemi nalézají i další producenti kolagenu typu IV (v játrech a pankreatu téměř jistě),….stellate cells. Pro úplnost výčtu všech typů kolagenu: kolagen typu V utváří stěnu krevních cév a fetální membránu Synteza kolagenu probíhá klasickým schematem buněčné proteosyntezy. Přičemž hydroxylace a glykosylace prolinu a lysinu je zrealizována ještě před granulárním endoplazmatickým retikulem. Na jeho povrchu je realizována synteza polypeptidických alfa řetězců. Následně je meziprodukt kolagenní syntezy internalizován v cisternách endoplazmatického retikula, kde vzniká prokolagen. Ten následně putuje do Golgiho komplexu. Odtud už je pomocí sekrečních vakuol „exportován„ do extracelulárních prostor.

31

Z prokolagenu pak za přítomnosti enzymu prokolagenpeptidázy vzniká tropokolagen, který charakteristickým zpusobem (viz výse) agreguje a dává vzniku mikrofibril. Vazba mezi tropokolagenovými molekulami je katalyzována enzymem lysyloxidázou. Přesná znalost této proteosynteticke cesty, ať už jenotlivých meziproduktů či enzymů na synteze se podílejících je důležitá. Jednak může sloužit jako potenciální cíl pro antifibrotickou terapii zaměřenou proti zmíněným enzymům či kolagenním meziproduktům v pancreatic stellate cells. Smysl aplikovat tuto antifibrotickou terapii by tedy mělo pouze v situaci nové ataky fibrogenních pochodů, ať už se jedná o chronickou pankreatitidu či jiná fibroproduktivní onemocnění pankreatu. V současnosti se ale snaží klinická praxe spíše nalézt uplatnění těchto znalostí pro zlepšení diagnostiky. A to diagnostiky nastupujících pankreatopatií, jež jsou provázené navýšenou fibroprodukci,…..ta je ale typická nejen pro chronickou pankreatitidu a rozvíjející se demosplastickou reakci v okolí pankreatického nádoru, ale přinejmenším i pro iniciální fáze akutní pankreatitidy. Návaznost komplexního popisu vaziva…na pancreatic stellate cells, jakožto na hlavní producenty kolagenu v pankreatu, je tedy zřejmá. Studium kolagenu dalo v r.1996 vzniku velké naděje pro brzkou laboratorní diagnostiku nastupující pankretopatjie s ohledem na rozsah bezici probíhající fibroprodukce. Jak bylo již dřívě naznačeno,v r. 1996 vznikl pokus o snadnější a včasnější diagnostiku (Navarro S., 1996), za využití měrění plazmatických hladin specifického fragmentu (aminokoncovy fragment, nazvaný PIIIP) z nově tvořeného kolagenu (z prokolagenu typu III Výsledná použitelnost pro praxi byla ale jasně limitována orgánovou nespecifičností tohoto znaku. Plného docenění by se tomuto experimentu mohlo dostat případnou identifikaci čistě pankreatické komponenty kolagenních produktů, dané např. specifickými posttranslačními modifikacemi. Pokud takovéto existují, mohly by být díky posunu za poslední desetiletí v proteomice, identifikovány. Elastická vlákna jsou 1-4 µm široká, charakteristická je pro ně výraznější délka vláken, jejich časté větveni a také sdružování se a tvoření plochých, fenestrovaných membrán (např. stěny krevních cév elastického typu). Jsou snadno hydrolyzovatelná pankreatickým enzymem elastazou (tato reakce je jedním z rychle běžících lytických procesů při intrapankreatické aktivaci pankreatických sekretů při rozvoji akutni pankreatitidy). Elastická vlákna jsou složena z 10-12 nm silných mikrofibril a amorfní hmoty, jež je uložená ve vláknu centrálně a na povrchu obklopena vlastní fibrilární komponentou. S věkem ubývá fibril a přibývá amorfní substance. Amorfní hmota (elastin je tvořen z aminokyselin desmosinu a isodesmosinu, jež nejsou v kolagenu přítomny), fibrily jsou vystaveny z hydrofilních aminokyselin; nejsou identické ani s kolagenovými ani elastinovými strukturalními aminokyselinami. Retikulární vlákna jsou vlastně velmi jemnými vlákny kolagenními (hlavně kolagen typu III), tvořící podpůrnou síťovinu okolo svalových vláken, nervových vláken, resp. Schwannových buněk (Ushiki T, 2002), tukových buněk, malých krevních cév. Slouží také jako spojovací článek mezi vazivem a tkáněmi jiného typu (např. v lamina basalis). Z pohledu elektronově mikroskopického má retikulární vlákno shodné uspořádání jako vlákno kolagenní, je příčně pruhované. Rozdílné funkční vlastnosti vůči kolagenním fibrilám jsou dány vyšším obsahem hexos (6%, zatímco kolagenni fibrily 1%). 8.3.1.3. Typy vaziva: Rídké kolagenní vazivo obecně slouží jako „výplň„ mezi orgány, čímž umožňuje jejich posun vůči sobě navzájem. Jako součást orgánových intersticií pojí jednotlive části orgánu, je lokalizovaná obecně ve veškerém parenchymu orgánů. Zastává především funkci vitální (střádání látek, fagocytoza,..). Celkově tak tvoří určitý filtr mezi vlastním parenchymem a

32

cévami orgánu, jímž musí ať už výživné látky, zplodiny metabolismu, či jiné působky prostoupit. Husté kolagenní vazivo se utváří v místech, jež jsou zvýšeně exponovány zvýšenému tahu a tlaku. Kolagenní vlákna v nich obsažena mohou tvořit zcela nahodile uspořádání, vytvářející sítě a nakupení. Tam, kde na toto vazivo působí převažující tah a tlak,mají uspořádání buď plsťovitě neuspořádané ( capsulae fibrosae orgánů) . Při jednosměrném a takto téměř konstantně orientovaném působení sil jsou pak seřazena paralelneě ( šlachy, vazy). (Horký D. et al.,1995) Během chronické pankreatitidy se pravděpodobně mění i kvalitativní složení vaziva - mění se zastoupení jednotlivých složek extracelulární matrix, ať už složky vláknité či základní hmoty amorfní. Zřejmě bude existovat analogie se situací hepatální. Tím byly , na modelu indukované jaterní fibrozy u laboratorního potkana, prokázány morfologické změny a změny plazmatických hladin hyaluronové kyseliny (HA), laminimu (LN), typu IV kolagenu ( výrazné navýšení hladin od 7. do 28. dne ).Současně narůstalo množství alfaSMA pozitivních buněk ( aktivované hvězdicovité buňky jater), tvořících síť uvnitř parenchymu jater, s maximy v centrálních oblastech fibrozních sept (Li CH, 2005) V květnu 2006 bylo opublikováno sdělení (Grzesiak JJ, 2006) potvrzující doměnky, že v průběhu rozvoje karcinomu pankreatu dochází ke změnám kvalitativního složení vaziva.Charakteristické znaky desmoplastické odpovědi v okolí nádoru zahrnují navýšení exprese extracelulární matrix, a jak uvádí tato studie, kolagenu typu I především. Za tuto selektivní nadprodukci jsou zodpovědné buňky pankreatického karcinomu, jež indukují tvorbu těchto vláken v přilehlých stellate cells. Důvodem je skutečnost, že kolagen typu I podporuje maligní fenotyp v nádorových buňkách (definovaný navýšenou proliferací, rezistencí k chemicky indukované apoptoze a navýšenou tumorogenezí). Integrinová specifita této interakce mezi kolagenem typu I a bunečnými liniemi pankreatického karcinomu dosud nebyla identifikována. Testováním osmi buněčných linií karcinomu pankreatu stran adheze, proliferace, a migrace; v závislosti na expresi typu I and IV kolagenu, fibronectinu, mamininu (stejně tak integritu) bylo ověřeno, že typ I kolagenu podporuje maligní fenotypizaci a jeho efekt je mediován specificky pomocí α2β1 integrinu. α2β1 integrin-mediovana adheze kolagenu typu I by se tedy mohla státá potenciálním terapeutickým cílem v léčbě pankreatického karcinomu. Tématem interakce nádorových buněk karcinomu pankreatu a kolagenu typu I se zabývala také studie z r. 2004.(Armstrong T, 2004) Záměrem bylo definovat funkční vztah formující se desmoplastické reakce okolo nádoru i vůči hvězdicovitým buňkám pankreatu. Byly analyzovány série tkáňových kultur buněčných linií karcinomu pankreatu (MIA PaCa-2, Panc-1, and AsPC-1), primokultur lidských pancreatic stellate cells a kolagen typ I. Bylo ověřeno, že desmoplastická reakce způsobuje těžkou deformaci pankreatu, umožňující blízký kontakt nádorových buněk a hvězdicovitých buněk produkujících nadbytečné množství kolagenu typu I. Nádorové buňky navýšily proliferaci hvězdicovitých buněk (více než 6x) a navýšily v nich syntézu kolagenu typu I (asi 1,3 krát). Kolagen typu I způsobil navýšení dlouhodobého přežívání ( až o 62 %) pankreatických nádorových buněk léčených 5fluorouracilem. Kolagen typu I totiž navýšil proliferaci nádorových buněk (2,8 krát) a redukoval apoptozu AsPC-1 buněčných linií při odpovědi na 5-FU . Tímto mechanismem desmoplastická reakce může podporovat a formovat maligní genotyp v pankreatickém karcinomu. Od definování, průkazu a kvantifikace zastoupení jednotlivých typů kolagenních vláken se také odvíjí pokusy nalézt specifické znaky charakterizující jednotlivé typy chronické pankreatitidy a využít tyto poznatky pro některé budoucí antifibrotické léky.

33

Autoimunní chronická pankreatitida se od osatatních skupin chronické pankreatitidy odlišuje výraznou senzitivitou a histologickým zotavením při léčbě steroidy. (Song MH, 2005) Porovnáním 15 parenchymových vzorků od pacientů s prokázanou autoimunní chronickou pankreatitidou ( AIP ) a 8 vzroků od chirurgicky léčených pacientů s chronickou alkoholickou pankreatitidou ( ACP) byly zjištěny tyto rozdíly: pro autoimunní pankreatitidu je typická fibroza bez výrazného zastoupení fibrilární komponenty ( s nízkou koncentrací vláken) a spíš dominujícícm stromálním edémem; u alkoholické CP je evidentní přítomnost fibrozy s hustě nakupenými fibrilárními komponentami intersticia. Atrofie acinů byla jasně těžší a difuzně lokalizovaná u autoimunní CP. Celkově se zánětlivý proces u autoimunní chronické pankreatitidy odehrává difuzně, zatímco u alkoholické CP multifokálně s různým stupněm aktivity. Porovnáním skladby mezibuněčné hmoty bylo zjištěno, že kolagen typu III byl častěji přítomen u ACP než u AIP (P < 0.05), naopak u ACP bylo méně kolagenu typu IV než u AIP (P=0.001).

8.4. Zánět a imunitní odpověď Zánět je reprezentován buňkami zánětu a mediátory. Zánět je součástí imunitní odpovědi. Reakce specifických T lymfocytů nebo protilátek s antigenem způsobuje „přivolání“ buněk zánětu do daného prostoru a tvorbu endogenních mediátorů ( následnou neutralizací antigenu nebo cytotoxickou reakcí). Na počátku zánětu ale nemusí být jen imunologické stimuly. Buňky a mediátory mohou být stimulovány např. fyzikálními mechanismy (mechanické trauma, teplo), nebo exogenními či endogenními látkami poškozujícími tkáně. Zánětové imunitní odpovědi se účastní jak buňky (neutrofily, eosinofily, bazofily, makrofágy, žírné buňky, trombocyty a endoteliální buňky), tak cirkulující proteiny (složky komplementu, faktory koagulačního, fibrinolytického a kininového systému). Obecně je klinický obraz zánětu závislý na lokalizaci (plíce, klouby, cévy) a druhu buněk, které se na něm podílejí (neutrofily nebo eozinofily). V rámci chronické pankreatitidy může zánět propuknout a šířit se pankreatem bez zásadnějších překážek. Zánět je trvalou součástí již jednou iniciované chronické pankreatitidy, a to i v minimální míře a podobě (rezidentní buňky zánětu uvnitř pankreatického parenchymu, bazální produkce cytokinů udržujících „minimální plamínek„ zánětlivé aktivity). Jak bylo uvedeno v rámci popisu míry postižení exo- a endo- krinní složky pankreatu, je distribuce buněk zánětu v podobě T a B lymfocytů (ale i makrofágů) dokonce jedním z klíčových bodů vedoucích k odlišné dynamice úbytku acinů a Langerhansových ostrůvků. Pro hvězdicovité buňky pankreatu představují jak buňky zánětu tak cytokiny zdroje velkého množství stimulů, vedoucí především k jejich aktivaci a tedy fibroprodukci, migraci ,…. Podnětů vysílaných probíhajícícm zánětem vůči hvězdicovitým buňkám pankreatu, jež by vedly spíš k utlumení aktivit těchto buněk, je minimum. 8.4.1. Buňky zánětu „Buněčná zánětlivá odpověď je meč s dvojím ostřím: je základním obranným mechanismem těla, avšak je-li nepřiměřená nebo nadměrná, může mít i vážné nežádoucí účinky.“ (Stites DP, Terr AI,1994) Mezi společné znaky zánětlivých buněk patří povrchové receptory (receptory pro imunoglobuliny a komplement), cytoplazmatická granula obsahující účinné hydrolytické enzymy, produkce metabolitů kyseliny arachidonové a schopnost fagocytozy a sekrece.

34

Buněčná zánětlivá odpověď je mechanismus, jímž se organismus brání obecně proti infekcím a napravuje poškození tkání. Přetrvávající zánět však může být sám příčinou chorobného stavu, a tudíž pro pacienta škodlivým. K rychlé aktivaci zánětlivé buněčné odpovědi , a zároveň ochraně organismu před účinky zánětu v nevhodnou chvíli a neadekvátním místě, jsou mediátory přechovávány v cytoplazmatických granulech nebo jsou syntezovány až při zánětu (z fosfolipidů buněčných membrán). Rychlý nástup zánětlivé odpovědi je zajištěn i existencí mobilních (cirkulujících) a stacionárních (necirkulujících) zánětlivých buněk. Zanětu se tedy účastní jednak krátce žijící cirkulující zánětlivé buňky (neutrofily, eozinofily, bazofily) jednak dlouhožijící rezidentní necirkulující zánětlivé buňky (žírné buňky a makrofágy), které drží pohotovost ve tkáních. Primární funkcí některých těchto buněk (neutrofily a makrofágy) je fagocytoza, jiných (žírných buněk a bazofilů) sekrece mediátorů zánětu. Fagocyty odstraňují cizorodé částice a organismy, které vnikají do těla. Tím se podílejí na vytváření obranné bariery mezi tělem a vnějším prostředím. Vedle fagocytární schopnosti některé buňky uvolňují sekreční mediátory zánětu, které zvyšují propustnost cév, a chemotaktické faktory, které přivolávají ostatní zánětové buňky. Sekreční buňky se tedy podílejí na obraně těla jednak přímými účinky na cílové buňky, jednak potenciací aktivit fagocytů. Lokální protsředí zánětu je velmi komplexní, nachází se v něm mnoho druhů zánětlivých buněk a plazmatických proteinů, což zvyšuje pravděpodobnost existence vzájemného ovlivňování. Takovéto pouze in vivo pozorovatelné interakce tedy studiem in vitro – kultivovaných buněčných linií, nelze v plném rozsahu odhalit.Navzdory složitosti zánětu jsou zakladni pravidla patrná- jednotlivé druhy buněk vzájemně významnou měrou spolupracují a svoji činnost koordinují, a to prostřednictvím mediátorů zánětu a společných druhů receptorů. 8.4.2. Cytokiny (Stites DP, Terr AI,1994) Cytokiny jsou polypeptidické mediátory imunitní odpovědi, s vysokou účinnností a tedy nízkou koncentrací potřebnou k buněčné stimulaci (10 10-15 mol/L), což snižuje možnost jejich detekce. První cytokiny byly definovány cca před 40 lety. Celkové množství informací týkajících se klasifikace a funkce jednotlivých druhů cytokinů rychle a neustále narůstá. Existuje mnoho druhů cytokinů, prokazatelně geneticky nepříbuzných. Zatímco endorkinní hormony jsou produkovány specializovanými parenchymy, cytokiny jsou produkovány širokou škálou buněk. Zpravidla působí parakrinně nebo autokrinně, většinou nejsou přítomny v plazmě a nedisponují tedy takovým dosahem své aktivity jako hormony. Cytokiny jsou tedy určeny pro zajištění mezibuněčné signalizace sousedících buněk. Regulují lokální, někdy i systémovou zánětlivou odpověď.Cytokiny ovliňují reakce hostitele na cizí antigeny nebo poškozující agens regulací růstu, pohyblivosti a diferenciace leukocytů a dalších buněk imunitního systému. Exogenní i jako endogenní agens mohou indukovat nebo inhibovat produkci cytokinů, které modulují imunologické reakce. Exogenní stimuly mají prvořadý význam jako induktory endogenních cytokinů. Většina cytokinů je produkována více typy buněk jako odpověď na škodlivé nebo fyziologické podněty, zatímco lymfokiny jsou produkovány výhradně lymfocyty a mají převážně imunoregulační funkce. Bylo prokázáno, že některé transformované lymfocytární, makrofágové linie a linie fibroblastů a keratinocytů produkují cytokiny spontánně, většina klidových buněk a buněčných linií ale produkuje cytokiny až po předchozí stimulaci. Mezi cytokiny jsou řazeny monokiny (produkovány monocyty, makrofágy), lymfokiny (lymfocyty).

35

Lymfokiny, produkované převážně buňkami T, tj. IL-2, IL-4, IL-5 a INF gamma, působí hlavně na lymfoidní buňky. Jsou imunologicky indukovanými regulátory imunitní odpovědi. I přes tuto specializovanou funkci mohou také IL-2, IL-4 a IL-5 ovlivňovat funkci dalších leukocytů, jako jsou makrofágy, žírné buňky a eozinofily. INF gamma působí vedle lymfoidních buněk na široké spektrum buněk dalších. Na rozdíl od těchto lymfokinů působí IL-3 pouze jako hematopoetický růstový faktor. Další cytokiny, které ovlivňují aktivity lymfoidních a nelymfoidních buněk, jsou produkovány mnoha buněčnými typy. Mezi tyto patří IL-1, IL-6, IL-7, IL-8, TNF, INF alfa, INFbeta a TGF beta. Tyto molekuly zajištují mezibuněčné signály, které umožňují pojivovým tkáním, kůži, nervovému systému a dalším tkáním komunikovat s imunitním systémem. Cytokiny regulují své aktivity vzájemnou kompeticí, interakcí, indukcí vedoucí ke vzniku cytokinových sítí, spojujících pozitivní a negtivní zpětné účinky. Např. cytokiny jako IL-1 a IL-2 indukují tvorbu dalších, tj. TNF a interferonu, IL-1 a IL-2 se indukují navzájem. Mezi cytokiny stimulující aktivaci hvězdicovitých buněk patří především platelet derived growth factor (PDGF), transforming growth factor beta (TGFbeta) rodina působků, hlavně TGFbeta1 a activin A , TGF-alpha , dále basic fibroblast growth factor, tumor necrosis factor –alpha (TNFalpha), interleukin (IL)-1 a IL-6 . Zatímco TGFbeta1 účinně podporuje ECM syntezu, PDGF je považován za nejefektivnější mitogen pro pancreatic stellate cells. PDGF také zvyšuje migratorní kapacitu těchto buněk. Hlavními potenciálními zdroji cytokinů stimulujících aktivaci hvězdicovitých buněk pankreatu v zaníceném pankreatu jsou např. aktivované makrofágy (sekretující TGFbeta1), krevní destičky (obsahující PDGF a TGFbeta1) (Luttenberger T, 2000), a pravděpodobně acinární buňky (exprimující, vedle jiných cytokinů, TNFalpha , IL-1 a IL-6). U hvězdicovitých buněk pankreatu byla s jistotou identifikována autokrinní smyčka, zprostředkovaná TGFbeta. Hvězdicovité buňky jsou producenty tohoto působku, po zevní stimulaci dochází k zahájení jeho syntezy a sekrece ( není podmínkou, že zevní stimul musí být opět TGFbeta). Výsledkem je velmi efektivní podpora syntezy proteinů extracelulární matrix ( hlavně kolagenu ) u okolních aktivujících se hvězdicovitých buněk, tak vlastní. U hvězdicovitých buněk pankreatu existuje takovýchto smyček pravděpodobně víc.Ucelenější výčet a popis cytokinů vážících se k činnosti hvězdicovitých buněk pankreatu bude uvedenu vlastního popisu pancreatic stellate cells.

8.5. Poškození cév pankreatu Cévy se při vývoji chronické pankreatitidy spolupodílejí na zánětlivých změnách : ovlivněním regionálního průtoku přes zánětem postiženou oblast pomocí změny cévního průsvitu změnou propustnosti cévní stěny, následkem tohoto spolupodíl na alteraci lokálních chemických a fyzikálních parametrů tvorbou růstových a dalších faktorů endothelimi s – např. pozitivním chemotaktickým vlivem na vcestování dalších buněk zánětu, také hvězdicovitých buněk pankreatu (schopnost migrace), do ložiska probíhajícího zánětu Cévy samotné podléhají mechanickým silám ( kompresním, trakčním) způsobeným okolním novotvořeným vazivem. Zánětlivě jsou deformovány obliterujícíc endovaskulitidou. Pojivové složky jejich stěn jsou také potenciálními cíly pro lytické působení enzymů, produkovaným při zánětu v nemalém množství také hvězdicovitými buňkami pankreatu ( matrix metalloproteinázy ).

8.6. Poškození nervů pankreatu

36

Irreverzibilně se hromadící kolagenní depozita poškozují v blízkosti uložené nervy a nervová ganglia. Vyvolávají, iniciují tedy perineurální, periganglionární fibrozu a dakší změny na toto navazující. Nasledkem mechanických útlaků nervových vláken jsou těžké abdominalgie, v různých formách a intenzitách zatěžující pacienta s chronickou pankreatitidou. Léčba těchto bolestí je symptomatická. U nesnesitelných či na farmakologickou léčbu nereagujících bolestí břicha pak přichází v úvahu léčba chirurgická. Buď je realizováno pouze přerušení pankreatické vegetativní aferentace nebo je analgetická chirurgická léčba součástí indikované různě rozsáhlé resekce slinivky břišní. Současné studie patogeneze bolesti u chronické pankreatitidy předpokládají neuroimunitní inetrakce intrapankreatických nervů a buněk zánětu a nárust v hodnotách neurotransmiterů bolesti jako je substance P (SP). (Shrikhande SV, 2001)Tato studie analyzovala expresi a lokalizaci neurokinin 1 receptoru (NK-1R), jenž váže substanci P a jeho asociaci s bolestí a zánětem u chronické pankreatitidy. Bylo vyšetřeno 31 vzorků pacientů s chronickou pankreatitidou (22 mužů, 9 žen , průměrný věk 45,9 +/- 9,4 roků) a 9 pacientů s „ fyziologickým “ nálezem, tedy bez prokázané pankreatopatie (pět mužů, čtyři ženy, průměrný věk 42,9 +/- 9,5 roku) jako kontroly.Ve vzorcích chronické pankreatitidy se NK-1R mRNA exprese a náležitý proteinový produkt vyskytovaly především v nervech, gangliich, krevních cévách, buňkách zánětu a příležitostně ve fibroblastech. U paceintů s mírnou a střední intenzitou bolesti, byly hodnoty NK-1R mRNA zvýšeny 14- a 30-násobně (v tomto pořadí). Byl nalezen také významný vztah mezi NK-1R mRNA hladinami a intenzitou bolesti (r=0.46, P=0.03), NK-1R mRNA a frekvencí atak bolesti (r=0.51, P=0.04), a NK-1 mRNA a trváním bolesti (r=0.46, P=0.01) u pacientů s chronickou pankreatitidou; nebyl vypozorován vztah ke stupni zánětlivého postižení parenchymu pankreatu. Zda se tedy, že u chronické pankreatitidy je do algické signalizace zapojen receptor pro neurokinin 1(NK-1R). Exprese tohoto receptoru v buňkách zánětu a krevních cévách také ukazuje na interakci mezi nervy -substance P imunoreaktivními, buňkami zánětu a krevními cévami. To podporuje a nevylučuje existenci neuroimunitní interakce, jež velmi pravděpodobně ovlivňuje algický syndrom a chronické zánětlivé změny, které jsou charakteristické pro chronickou pankreatitidu. Vztahem hvězdicovitých buněk jater a nervových zakončení ( na modelu indukované cirhozy jater laboratorního potkana ) se zabývá např. studie z roku 1998. (Akiyoshi H, 1998) Záměrem experimentu bylo ověřit vztah mezi mastocyty, myofibroblasty ( hepatic stellate cells) a cholinergními neurotransmitery v nervových zakončeních lokalizovaných v jaterním parenchymu cirhotických jater laboratorního potkana.U „fyziologickych„ jater laboratorniho potkana bylo pouze několik málo nervových zakončení spojeno s fibroblasty v blízkosti cévních stěn v portálních traktech. U cirhotickcýh jater laboratorniho potkana, byla ve fibroznich septech pozorována četná, síť utvářející, acetylcholinesterása-pozitivní nervová vlákna. Nervová zakončení byla nalezana v blízkém kontaktu s mastocyty a myofibroblasty ve fibrozních septech, tvořící charakteristické komplexy :mastocyt- myofibroblast -nervove zakončení. V cirhotických nodulech byla nervová zakončení situována v blízkém kontaktu s myofibroblasty v periseptálních sinusoidách. Tato axonová zakončení obsahovala četné malé jasné váčky, a v prostoru synaptických membrán byly pozorovány acetylcholinesterasapozitivní produkty. Z výsledků těchto pozorování vyplývá určitá role komplexu mastocytmyofibroblast- cholinergní nervová zakončení, velmi pravděpodobně jako následkem či z důvodu produkce komponent extracelulární matrix přítomnými fibroblasty.. Analogicky se nabízí další studie s cílem exaktního morfologického dodefinování pozice intrapankreaticky lokalizovaných nervových vláken, jejich zakončení; ve vztahu k hvězdicovitým buňkám pankreatu a jejich aktivaci a aktivitám; v různých stadiích rozvoje fibrozních změn pankreatu, a samozřejmě kompletní identifikace transmiterů účastnících se této (velmi pravdepodobně) obosutranně iniciované interakce.

37

Tabulka charakteristik podskupin chronických pankreatitid, vycházející z Marseillskořímské klasifikace ( se zvýrazněním morfologických kriterií), vycházející ze základní diferencialni diagnostiky nově nastupující chronické pankreatitidy užívané v běžné klinické praxi. Chronická kalcifikující etiologie

Alkohol Výživa (poměr bílkovin a tuků ve stravě)

Postižení vývodů

Eosinofilní precipitáty, litostatin H, Intraduktální proteinové zátky + následná kalcifikace Modifikace duktálního epitelu vývodů, cystická transformace vývodů

Obstrukční chronická

Idiopatická ( + ostatní )

Tumor hlavy pankreatu Tumor Vaterovy papily Choledocholithiasa (pancreaticolithiasa) Vrozeně abnormálně utvářené pankreatické vývody Různé primární patologie ductus choledochus, zvláště jeho intrapankreatické části Makroskopie Pankreas: zvětšený, tuhý, Pankreas: tuhý, lobulizovaný, Zduřelý, tuhý setřelá povrchová kresba, zmnožená vazivová septa pankreas, místy interseptálně vtažený bělavěšedé parenchym splývající Vazivová septa: objemově povrchové zmnožená fibrozní okrsky vystupující z interlobií. Histologie, Ložiskovité změny Difuzní atrofie exokrinní Intersticiální zánětlivá Aciny: redukce počtu a složky fibroza, zánik infiltrace velikosti, dysplazie Obstrukce s prestenotickou zevně acinárních buněk., dilataci vývodu, okolní sekretorických zvětšení, zmnožení atrofie exokrinniho lobulů. endoplazmatickeho retikula parenchymu Pseudocysty, a Golgiho aparátu. Zřejmě Lymfocytární infiltrace které vznikly jako dvojí vliv ethanolu na reparační acinární buňky: přímý, a následky nepřímý cestou: nekrotických ethanol + tuk okrsků (VLDL)….indukce oxidativního stresu působícího na acinární buňky. Cysty, kalcifikace Lymfocytární infiltrace Následkem obstrukce je postupná dilatace vývodů směrem „proximálním„ (směrem ke kaudální části pankreatu). Atrofie okolního exokrinního parenchymu. Po vymizení obstrukce regrese

Dilatované vývody s eosinofilním obsahem, jeho stagnace, kalcifikace. Adenomatoidní

38

Postižení Perineurální fibroza nervů Postižení cév Obliterující endovaskulitida

celého nálezu, především duktálního. Hyperplastické periduktální změny. Papilární intraduktální hyperplazie epitelu – metaplasie, hyperplasie, dysplazieprekanceroza. Časté sekundární infekce duktu a periduktálně. Nekrozy, kaménky Perineurální, periganglionární fibroza Perivaskulární fibroza

proliferace epitelu, dlaždicová metaplazie…vše irritačního původu.

Perineurální fibroza Obliterující endovaskulitida

( Dítě et al., 2002), (Johnson CD, Imrie CW, 2004)

39

9. HVĚZDICOVITÉ BUŇKY, ÚLOHA HVĚZDICOVITÝCH BUNĚK PŘI CHRONICKÝCH FIBROPRODUKTIVNÍCH ONEMOCNĚNÍCH (JATER, SLINIVKY BŘIŠNÍ), HVĚZDICOVITÉ BUŇKY JATER 9.1. Úvod k hvězdicovitým buňkám Pro některá chronická onemocnění určitých orgánů (např.játra, slinivka břišní) je typická fibrotizace a ztráta vlastního funkčního parenchymu. Novotvorba vaziva je často velmi progresivní, a to přes veškeré současné možnosti protizánětlivé, imunosupresivní a protivirové terapie. Výsledné poškození zasahuje zpravidla část orgánu nebo orgán celý, vyjímečně má i dopad systémový. Cílem současného vědeckého úsilí je získat protifibrotickou terapii aplikovatelnou do klinické praxe, splňující tedy podmínky dostatečné účinnosti a dobré snášenlivosti pacientem. Středem zájmu jsou hvezdicovité buňky, které jsou (v játrech a pankreatu) nejvíce zodpovedne za novotvorbu vaziva. Stále větší význam je stellate cells přikládán i při nádorových onemocněních. Díky možnostem současných výzkumných metod exponenciálně narůstá množství informací o vlastnostech hvězdicovitých buněk a jejich interakcích s okolím. Existuje již velké množství údajů o jejich povrchových buněčných receptorech, nitrobuněčných signál – přenášejících kaskádách,o metabolických kaskádách, jaderných faktorech regulujících transkripci DNA. Genomové knihovny obsahují tisíce identifikovaných genů hvězdicovitých buněk člověka, s možností následného využití pro genovou terapii. Získáním nových léčebných možností založených na regulaci činnosti hvězdicovitých buněk by se mohly pozměnit vyhlídky pacientů s onemocněními jako jsou steatofibroza a cirhoza jater, portální hypertenze, chronická pankreatitida, desmoplastické reakce v okolí patologických procesů jater a slinivky břišní (cysty, nádory) a nádorová onemocnění lokalizovaná v jaterním a pankreatickém parenchymu (primárně hepatální a pankreatické, nebo procesy sem disseminované – metastázy). Pankreatické hvězdicovité buňky prokazatelně interreagují i s beta buňkami Langerhansových ostrůvků. Terapie odvíjející se od regulace činnosti hvězdicovitých buněk slinivky břišní by mohla přinést i novou léčbu některých forem diabetes mellitus (odvíjejících se od získané malfunkce či destrukce primárně fyziologicky utvářených Langerhansových ostrůvků). Už dříve uvedená těsná a ne úplně popsaná vazba pancreatic stellate cells na intrapankreatická nervová zakončení by mohla přinést nové směry analgetické léčby.

9.2. Hvězdicovité buňky (stellate cells, SC) 9.2.1. Definice: Stellate cells jsou buňky mesenchymového původu, i když některé jejich buněčné znaky svědčí pro jejich příbuznost s buněčnými liniemi pocházejícími z neuroektodermu. Určitá buněčná podskupina hvězdicovitých buněk (zcela poprávu k nim náležící) má zřejmě původ dokonce přímo neuroektodermový. Z toho vyplývá, že jejich původ není dosud zcela jasný a je dokonce otevřená možnost, že existují dvě odlišné linie SC – mesenchymová a neuroektodermová.

40

Typickým a nejvíc patrným projevem činnosti hvězdicovitých buněk je schopnost (za určitých podmínek) buněčné aktivace, jejímž následkem je především navýšená produkce proteinu extracelulární matrix, hlavně typu kolagenu. Nově vzniklá depozita proteinů extracelulární matrix nejsou výsledkem pouze nekontrolovaně probíhající produkce těchto vazivových komponent. Odráží spíš vzniklou nerovnováhu mezi produkcí a redukcí (destrukcí) vazivových součástí. Procesy produkce, destrukce a celkově regulace množství vláknité složky extracelulární hmoty vaziva probíhají kontinuálně, i v podmínkách relativního klidu (tedy i v situaci bez zásadnho poškození orgánu - např. slinivky břišní). Do regulace fibroprodukce je zapojeno přímo i nepřímo (cestou regulace činnosti např. právě hvězdicovitých buněk) mnoho chemických působků a jejich inhibitorů (hlavně matrix metalloproteinazy –MMPs, matrix metalloproteinases a jejich tkanove inhibitory, TIMPs, tissue inhibitors of matrix metalloproteinases), dále také cytokiny a buňky zánětu. Nově je v případě fibroproduktivních nemocí slinivky břišní definitivně potvrzen významný regulační vliv (na tvorbu vaziva) buněk vlastního funkčního parenchymu (exokrinních i endokrinních především beta buněk Langerhansových ostrůvků). 9.2.2. Lokalizace hvězdicovitých buněk: Pro výskyt hvězdicovitých buněk jsou zkoumány parenchymatózní orgány člověka, laboratorního potkana, myši, prasete a kočky domácí. Výzkum využívá hvězdicovité buňky člověka, laboratorního potkana, prozatím vyjímečně myši. Pro prospektivně zaměřený výzkum je základní podmínkou schopnost buňky izolovat a kultivovat tak, aby si po co největší počet buněčných pasáží zachovaly své specifické vlastnosti ( primokultury, immortalizované buněčné linie). Stran vymezení orgánové lokalizace se v posledních několika letech objevují texty dokumentující nález nových orgánových forem hvězdicovitých buněk člověka. Obecně jsou přijímány za skutečně dostatečně ověřené a potvrzené hvězdicovité buňky jater a slinivky břišní. První zmínka o jaterní lokalizaci je starší více než sto let (viz dále jaterni hvezdicovite bunky, hepatic stellate cells, HSC), pankreatická forma je známa necelých deset let (viz dále hvězdicovité buňky slinivky břišní, pancreatic stellate cells, PSC). Ve vědecké literatuře různých specializací a oborů lidské medicíny je možné se (zejména v posledních 5 letech) dočíst o těchto dalších orgánových formách hvězdicovitých buněk: V prosinci 2005 byly popsány hvězdicovité buňky oblasti hlasivek u člověka. (Fuja TJ, 2005) V článku je uvedena kompletní základní buněčná charakteristika splňující kriteria pro zařazení těchto nově popsaných buněk do skupiny stellate cells . Je jim přiřazován spolupodíl na metabolismu extracelulární matrix - jako esenciálního faktoru v udržování hlasivkové viskoelasticity potřebné pro fonaci. Do jejich dalšího výzkumu jsou pak vkládány naděje pro následnou budoucí možnost korekce laryngeální fibrozy, vazivovatění hlasivek, stárnutí hlasivek a myofibroblastomu této oblasti. Dle sdělení z roku 1999 se nacházejí v intersticiu ledvinného parenchymu člověka buňky hvězdicovitého tvaru, v jejichž podrobnějším popisu lze nalézt některé ze základních znaků stellate cells jako takových. (Whiting PH, 1999) Znovu se k tématu ledvin a buněk vlastnících charakteristiky stellate cells vrací experiment německých autorů v r. 2002.(Buniatian GH, 2002)Tyto glial fibrilar acidic protein (GFAP, determinující intermediární filamentum pro identifikaci stellate cells) pozitivní, a alfa aktin hladké svaloviny ( alfaSMA) pozitivní buňky byly nalezeny mezi endotheliemi fenestrovaných kapilár, perivaskulárními buňkami a buňkami glomerulárními. Za jejich funkci je považován spolupodíl na regulačních mechanismech v udržování biochemické rovnováhy mezi krví a intersticiem.

41

Z roku 1988 pochází studie zabývající se fibrozou kolon při kolagenní kolitidě. (Widgren S,1988) Ve 129 bioptických vzorcích kolon od 21 pacientů s kolagenní kolitidou byly (vedle subepiteliálně umístěných kolagenních depozit) zachyceny fusiformní anebo hvězdicovité buňky s depozity, a identifikovány imunohsitochemicky jako myoidní buňky, s pozitivitou pro alfaSMA. Utrastruktura buněk odpovídala charakteristikám myofibroblastů. Podobné buňky jsou přítomny podél krypt, kde byly dříve popisovány jako perikryptální myofibroblasty. Dalšími a už méně pravděpodobnými jsou lokalizace hvězdicovitých buněk v kůži (BarryLane PA,1997) a intersticiu plic.Při porovnání nukleotidů PSC, HSC a kožních fibroblastů pomocí metodiky real time PCR se objevuje mnoho shod a podobností mezi HSC a PSC. Kožní fibroblasty vykazují také vysoký stupeň příbuznosti. Na straně druhé- nález mnoha odlišností je jednoznačně odděluje od hvězdicovitých buněk. (Buchholz M, 2005) 9.2.3. Společná charakteristika hvězdicovitých buněk Stellate cells představují buněčný typ, jenž se vyskytuje ve dvou základních fenotypových podobách; klidové (quiescent) a aktivované (activated). Přechod mezi těmito dvěma buněčnými stavy byl donedávna považován za nevratný proces. V poslední době se objevují in vitro experimenty, potvrzující možnost deaktivace aktivovaných stellate cells, tedy jejich návrat zpět ke klidové formě. Hvězdicovitá buňka reaguje svou aktivací na různé typy podráždění: mechanické (poranění jater, slinivky břišní při sportu, autonehodě,…), mikrobiální (virové - hepatitidy, bakteriální bakteriální superinfekce v rámci např. cholangitidy navozené procházejícím konkrementem či zahuštěným obsahem žlučovodu), chemické (alkohol, acetaldehyd, zplodiny při kouření cigaret, cytokiny, chemokiny, působky oxidativního stresu – zejména volné kyslíkové radikály,…např.ale i nadbytečné množství vitamínu A, jež se může projevit různou mírou hepatotoxicity a aktivací jaterních hvězdicovitých buněk). Při aktivaci se původně kulovitá buňka mění v hvězdicovitou, s dlouhými, vřetenovitě utvářenými cytoplazmatickými výběžky, vyzařujícími do okolí. Tyto cytoplazmatické výběžky sehrávají úlohu jak v mezibuněčných komunikacích, tak při pohybu stellate cells (ten byl prokázán teprve nedávno pomocí seriového snímkování dynamiky pancreatic stellate cells, hlavně ve fázi brzké buněčné aktivace).(Bachem MG,1998) Tvarová změna celé buňky je podmíněna změnami některých cytoarchitektonických složek, jako např. nově vzniklou přítomností filament alfa aktinu hladké svaloviny (alfaSMA) . Jeho procentuální zastoupení se změní z téměř absolutní nuly na 100 % v buňkách aktivovaných, s maximem v sedmém dni aktivace. Alfa SMA svou expresí přináší buňkám i další důležité změny, mezi něž patří hlavně možnost buněčné kontraktility. Zastoupení dalších sledovaných složek cytoskeletu se aktivací významně nemění. Dalším z dějů, který se odrazí i v buněčném tvaru, je změna obsahu tukových kapének v těchto buňkách. Hvězdicovité buňky jater a pankreatu v klidových podmínkách intracytoplazmatikcy skladují hojná množství tukových kapének s obsahem vitaminu A a jeho esterů. Na aktivační podnět buňky reagují zbavovaním se těchto tukových kapének exocytozou do svého okolí. Jedním ze zamýšlených směrů v dosažení deaktivace hvězdicovitých buněk je právě snaha o „znovunasycení„ těchto buněk tukovými kapénkami s vitamínem A, a tím, snad, následnými procesy vedoucími hlavně k omezení produkce kolagenních fibril. Aktivace stellate cells je doprovázena významným navýšením jejich mitotické aktivity. Proteosyntetická aktivita hvězdicovitých buněk je aktivací směřována především k nadprodukci prekurzorů kolagenních vláken (především kolagenu typu I, III a IV).

42

Stellate cells také syntezují početnou skupinu zinek dependentních proteáz, které se nazývají matrix metalloproteinázy (matrix metalloproteinases…..MMPs), a jejich inhibitory (TIMPs…..tissue inhibitors of matrix metalloproteinases). Jejich hlavní funkcí je (po uvolnění do okolního intersticia) regulace množství kolagenních komponent. MMPs a TIMPs sehrávají důležitou úlohu při lokální expanzi karcinomů a velmi pravděpodobně i při nádorových buněčných transformacích jako takových. Stellate cells jsou schopny autoaktivace, pro niž jim slouží jejich autokrinní TGFbeta sekreční smyčka. Stellate cells – přehled buněčných znaků

Fenotypová forma Buněčný tvar Tukové kapénky + vitamín A

Prokolagen mRNA, kolagen I, III

Mitotická, syntetická aktivita Intermediární filamenta - přítomnost

Kontraktilita

Membránové receptory

Další charakteristitika: Produkce MMP, TIMP, autokrinní aktitiva, intracelulární aktivační kaskády, jaderná charakteristika, apoptoza, motilita, fagocytoza, vliv oxidativního stresu, konkrétních cytokinů a chemokinů……

Klidová (quiescent) Aktivace…reverzibilní ??? Kulovitý Bohaté intracytoplazmatické skladování Proteosyntetická aktivita fyziologického rozsahu

Aktivaná ( activated)

Hvězdicovitý Uvolňování do extracelulárního prostoru, exocytoza Nadprodukce, synteza převažuje degradaci kolagenu extracelulárně nízká Výrazně navýšená, vysoká 100% vimentin, 30 % 100% vimentin, desmin, GFAP desmin, GFAP beze změny Ne, 0% alfa aktinu hladké Ano, ve 100% svaloviny přítomen alfa aktin hladké svaloviny ( alphaSMA) Fyziologická povrchová Navýšená exprese exprese receptorů pro PDGF, TGFbeta, IL Podrobněji v textu Podrobněji v textu hvězdicovité buňky hvězdicovité buňky slinivky břišní slinivky břišní

9.2.4. Obecný průkaz odpovědnosti stellate cells za fibroprodukci Na základě shodné lokalizace procollagen messengerRNA v oblastech aktuálně novotvořeného vaziva a alfa aktinu hladké svaloviny (alfaSMA, identifikující aktivované hvězdicovité buňky, s vysokou proteosyntetickou aktivitou) byly stellate cells (hepatic, pancreatic) identifikovány jako hlavní producenti kolagenních vláken. Ta jsou hlavní komponentou nově tvořeného vaziva charakteristického pro probíhající chronické fibroproduktivní onemocnění (steatofibroza -cirhoza jater, chronická pankreatitida slinivky břišní). 43

9.3. Hvězdicovité buňky jater (Itovy buňky, tuk/vitamín A skladující buňky, hepatic stellate cells, HSC) Historie popisu jaterních hvězdicovitých buněk je stará víc než sto let. Díky výrazným technickým pokrokům ve vývoji analytickych pristroju (v 90. letech 19. stoleti) byly rozpoznavany a popisovany biologicke struktury až k limitu obrazove rozlišitelnosti světelné mikroskopie. Koncem 19.století (1898) dr. Karl Wilhelm von Kupffer, profesor Anatomie v Kielu a následně Mnichově, poprvé popsal v textu Über die sogenannten Sternzellen der Säugethierleber stellate cells jako perisinusoidálně lokalizované buňky s protáhlými cytoplazmatickými výběžky a určitou vazbou na jedné straně na endothelie sinusoid a na straně druhé na hepatocyty. Následně se tyto buňky vžily jako Browicz-Kupffer-Zellen .Tyto buňky jsou ale specializované makrofágy jater, náležející do retikuloendotheliálního systému. Kuppfer je nazýval Sternzellen (hvězdové nebo hvězdicovité buňky) kvůli jejich tvaru. Falešně se však domníval , že jsou integrální součástí endothelií jaterních krevních cév sinusoid, a že z nich pochází (buňky totiž naléhají nebo se i vmezeřují mezi endothelie sinusoid, ze strany Disseho prostor). Po mnoha letech výzkumu je pak Tadeusz Browicz identifikoval správně jako makrofágy. Buňky současně známé pod názvem hvězdicovité buňky jater tedy nejsou identické s původními Browicz-Kupffer buňkami. 9.3.1. Základní charakteristika Jak lze vyvodit z obecné charakteristiky stellate cells, na akutní nebo chronické poškození jaterního parenchymu (alkohol, acetaldehyd, virový infekt, mechanická traumatizace) hepatic stellate cells reagují svojí aktivací. Jejím hlavním projevem je nadprodukce proteinů extracelulární matrix, zejména kolagenu typu I a III , který se ukládá do okolí buněk a zapřičiňuje tak jeho fibrotizaci. 9.3.2. Lokalizace HSC HSC jsou lokalizovány v játrech perivaskulárně, interlobárně, interlobulárně a v oblasti Disseho prostor. Tvoří 5-8% všech buněk jaterního parenchymu, 13% všech buněk oblasti sinusoid. (Reynaert H, 2002) Histologický popis perisinusoidálních prostor jater:Disseho prostory představující štěrbinovitý systém vmezeřený mezi hepatocyty a krevní tok; s titmo strukturálním uspořádáním: krevní prostory ohraničují fenestrované sinusoidální endotheliální buňky a mezi nimi do krevního toku se vyklenující Kupfferovy buňky (jaterní makrofágy). Obsahem perisinusoidálního protoru jsou dále tzv. „Pit cells“ (specifičtí natural killers jater) a právě hepatic stellate cells. 9.3.3. Akutní jaterní léze a HSC Bezprostředním následkem vlivu různých cizorodých činitelů (alkohol, acetaldehyd, infekce virem hepatitidy C), patologických procesů probíhajících v organismu (cholestáza, metabolický syndrom s postižením metabolismu glukozy, alterací metabolismu tuků s akumulací tuku) dochází k akutnímu poškození jaterního parenchymu (většiny buněčných typů tam zastoupených - hepatocyty, buňky žlučového systému (Battaler R, 2005), Kupfferovy buňky, T buňky, endotelie).

44

Hvězdicovité buňky jater jsou v takovéto situaci atakovány: - přímo: vlastní působící noxou - nepřímo: metabolickými zplodinami z jiných buněčných druhů v játrech zastoupených, jejich cytokiny jako IL-6 (interleukin 6), IFN γ (interferon γ), TGF β (transforming growth factor β), EGF (endothelin growth factor), IGF (inzulin like growth factor), TNF α (tumor necrosis factor α), ET-1 (endothelin 1),PDGF (platelet derived growth factor); stejně tak volnými kyslíkovými radikály a dalšími sloučeninami vznikajícími v navýšeně probíhajících reakcích oxidativního stresu v okolí . Aktivované hvězdicovité buňky především zvyšují fibroprodukci, stávají se kontraktilními, migrují k ložisku probíhajícího zánětu, produkují a do svého okolí uvolňují pestrou škálu cytokinů. Některé z těchto cytokinů (TGFbeta (Bachem MG,1992)), velmi pravděpodobně endothelin- 1, angiotenzin II) působí autokrinně a také parakrinně - stimulují a aktivují další hvězdicovité buňky v okolí. Vytvořením pozitivně zpětnovazebné autokrinní smyčky dochází k exponenciálnímu nárůstu množství aktivovaných hvězdicovitých buněk a také množství utvářeného kolagenu. Mechanismy, jimiž jsou hvězdicovité buňky jater aktivovány, jsou (v porovnání s hvězdicovitými buňkami pankreatu) popsány v daleko větší míře. Jsou popsány extracelulární stimuly (cytokiny, chemokiny), přenos jejich signálu přes membránový receptor na specifickou (specifické, k tomu určené) intracelulární aktivační kaskádu, až k efektu na nukleární faktory. U hvězdicovitých buněk jater je nejznámější a nejlépe popsanou intracelulární aktivační kaskádou MAP (mitogen activated protein) pathway - kaskada. Má 3 podrodiny: Extracelular signal regulated kinases (ERK1,2) (Fan J, 2006) Stress aktivated protein kinases (SAPK,c-jun NH2kinasa- JNK) P38 kinasy. Aktivace MAPK vede k aktivaci jaderných trasnkripčních faktorů (Tibbles LA, 1999) a alterované genové expresi v buňkách. Současné studie určují nukleární hormonální receptor peroxisome proliferator-activted receptor gamma (PPARgamma) jako klíčový v inhibici stellate cells aktivace v játrech a pankreatu. Jeho ligandy a tedy potenciálně využitelnými terapeutiky jsou např. troglitazone (antidiabetikum thiazolidindionové skupiny) (Diep QN, 2002) Středem zájmu jsou též faktory ovlivňující traskripci některých genů vedoucích k transdiferenciaci stellate cells v myofibroblast-like fenotyp. Byl prověřen antifibrogenní efekt dvou histon deacetylasa inhibitorů -sodium butyratu a trichostatinu A (TSA). TSA inhibuje transdiferenciaci stellate cells do myofibroblastu interferencí s hladinou acetylace histonu H4.(Niki T, 1999) Genová analýza je také zaměřena na identifikaci genů indukovaných v časné fázi aktivace hepatic stellate cells,jako např. transforming growth factor beta receptoru typ II, glutathione peroxidasy I, transferinu9 a také několika genů kodujících buněčné retrotransposony. (Lalazae A,1997) 9.3.4.Chronické jaterní léze a HSC Při dlouhodobějším působení škodlivin pak na úvodní fázi zánětu navazují kvalitativně odlišné procesy, typické pro určitá chronická onemocnění některých orgánů (jater, pankreatu). Zatímco pro akutní poškození je typický a v nálezu dominující zánět, při chronickém poškození je to jaterní fibroza. Je dynamickou a vysoce sofistikovaně regulovanou odpovědí v rámci reparačních procesů, provázejících hepatocelulární poškození, tak poškození biliárního systému či systému krevních cév. Fibrotický proces je následkem intraparenchymatické akumulace proteinů extracelulární matrix jako kolagenu, proteoglykanu a adhezivních glykoproteinů, které jsou především produkovány hvězdicovitými buňkami

45

jater. (Sarem M, 2006) Hvězdicovité buňky jater (hepatic stellate cells, HSC) však nejsou jediným producentem extracelulární matrix v jaterním parenchymu. I u přítomných jaterních myofibroblastů nevykazujících známky hvězdicovitých buněk (což je pozitivita na GFAP (gliar fibrilar acidic protein), desmin, také vascular cell adhesion 1) a produkují jinou škálu cytokinů (jako např.IL-6 (interleukin 6)) byl in vitro identifikován také významný fibroproduktivní potenciál. (Knittel T,1999) Při kongenitální jaterní fibroze se zdá, že fibroprodukce je výsledkem hlavně činnosti portálních myofibrolastů, které nejsou totožné hvězdicovitými buňkami jater. (Ozaki S, 2005) Při chronickém orgánovém onemocnění dochází k produkci mediátorů i nadále indukujících odpověď zánětem, včetně aktivace rezidentních makrofágů v podobě Kupfferových buněk, a náboru T buněk z cirkulující krve.Ty uvolňují cytokiny (IFNγ (interferon γ), IL-6 (interleukin 6)). Poškozené, destruované hepatocyty (např.podléhající apoptoze) také uvolňují cytokiny. Na základě stimulace všech těchto proliferačních, profibrogenních, proinflamačních faktorů, navýšenou produkcí oxidativního stresu , i přímým mechanickým vlivem dojde k aktivaci, proliferaci a průběžné korekci aktivit rezidentních hvězdicovitých buněk jater. Jednoznačně u nich však převládá aktivace, která se projevuje masivní nadprodukcí proteinů extracelulární matrix, především kolagenu, kontraktilitou, a produkcí chemokinů. Po vymizení původního stimulu si HSC (stejně PSC) i nadále udržují aktivovaný stav a potencují fibrozu (Apte M, 2004b) pomocí autokrinních smyček. HSC i PSC odpovídají na podaný TGFbeta1 samoprodukcí TGFbeta1. (Fine, 2004) (Apte MV, 1998) Intracelulární přenos TGFbeta signálu se odehrává cestou Smad3 kaskády. (Liu X, 2006) Profibrogenní TGFbeta intracelulárně interaguje s antifibrogenním IFN-gamma. (Breitkopf K, 2006) Další HSC migrují k místu poškození a spolupodílí se na objemovém nárustu vaziva. Složky novotvořené extracelulární matrix (ECM) mají také svoji pozici při ovlivnění činnosti HSC (regulátor reverzibility morfologických změn HSC v rámci aktivace, proliferace a funkce HSC). Molekulární mechnismy v reverzibilní regulaci HSC pomocí ECM v sobě zahrnují povrchový integrin vážící se na komponenty extracelulární matrix, intracelulární odezvou je nakupení cytoskeletu v dané oblasti. (Senoo H, 1998) Paralelně na podnět reagují též portální myofibroblasty, jejichž fibroprodukce zvětšuje celkový objem vzniklé vazivové tkáně. (Battaler R, 2005) Důležitými chemokiny produkovanými hvězdicovitými buňkami patří dvě rodiny zinek dependentních proteáz - matrix metalloproteinazy (MMP) a jejich inhibitory (TIMP). V současnosti je v obou skupinách definováno několik podtypů, stejně tak je objasněná vysoká selektivita mezi některými MMP a TIMP a jejich vliv na fibroprodukci či fibrodestrukci. Výsledkem jejich aktivit je za normálních, fyziologických podmínek, udržování rovnováhy mezi nově tvořeným vazivem a jeho destrukcí. Při chronickém onemocnění však, jak již bylo uvedeno, výsledně převládne fibroprodukce s ukládáním kolagenu v intercelulárních prostorech. (Sarem M, 2006) MMP a TIMP také způsobí dezintegraci kolagenu bazálních membrán, čímž umožní expanzi fibroprodukce do okolních oblastí v jaterním parenchymu. Progrese fibroprodukce s úbytkem vlastního funkčního parenchymu tak nastoupí známou cestu jaterních a systemových transformací: fibroza, cirhoza jater,portální hypertenze a systemové změny. Alkohol a jaterní fibroza (Reeves HL, 1996) V r. 1996 byla popřena nezbytnost nekroinflamace nebo nárustu a aktivace Kupfferových buněk pro aktivaci a poliferaci hvězdicovitých buněk jater. Korelaci mezi aktivací HSC a tíží steatofibrozy je nezbytné spíše hledat v souvislostech s metabolismem ethanolu, hlavně s koncentrací acetaldehydu a lipidovou peroxidací. V experimentu (Wang XD, 1999) je na modelu alkoholem indukované chronické pankreatitidy rozpoznána aktivace hvězdicovitých buněk jater cestou navýšení exprese activator proteinu-1 (dále c- Jun,c-Fos). 46

V hvězdicovitých buňkách jater člověka působí alkohol a acetaldehyd přímou aktivaci cestou ERK1,2, MAPK (mitogen activated protein kinasa) přes protein kinasu C, c-jun, c-fos. (Lu SC, 2002) Chronický abusus alkoholu vede k alteracím metabolismu methioninu v HSC, hepatocytech a Kupfferoých buňkách. To má za následek poškozenou antioxidační buněčnou obranu, změněnou genovou expresi, iniciaci fibrogeneze i vznik karcinomu pankreatu. Alkoholová jaterní nemoc (alcoholic liver disease, ALD) je charakterizována nahromaděním neutrálních lipidů v hepatocytech vedoucí k mikro a makrovesikulární steatoze a „balloon cell“ degeneraci. Hyperkalorická strava a výsledná obezita také zapřičiňují podobné změny jako jsou vidět v non-alkoholickém tukovém onemocnění jater (NAFLD). Tedy akumulace lipidů v hepatocytech je patologickým znakem obou. Kontrastem je, že klidové HSC jsou charakterizované intracelulárním obsahem nejen vitamínu A ale také triglyceridů, a aktivace hvězdicovitých buněk je spjata s uvolňováním, úbytkem těchto lipidů. Adipogenní/lipogenní trasnkripční regulace je zajištěna pomocí nukleárních faktorů jako PPARgamma, LXRa ,a SREBP-1c, je esenciálním pro udržování tuk skladujícího, klidového fenotypu HSC. Tyto adipogenní transkripční faktory nejsou exprimoványv aktivovaných hěvzdicovitýc buňkách jater, a substituční léčba s adipocyt diferenciačním „koktailem“ nebo ektopickou expresí PPARgamma nebo SREBP-1c by mohla vést k návratu buněk do klidového stavu. Je možné, že aktivované HSC v steatotických játrech mohou mít defektní inzulínovou signalizaci nebo lipogenní regulaci. (Tsukamoto H, 2005) HSC exprimují na svém buněčném povrchu LDL and HDL receptory, mohou hrát významnou roli v metabolismu lipoproteinů a regulaci cholesterolu. (Lu L, 2000) Hepatitis C a jaterní fibroza (Schuppan D, 2003) Chronická hepatitida C vede asi u 30 % pacientů k cirhoze jater do 20 let průběhu nemoci. Některé proteiny HCV mohou indukovat poruchu metabolismu nebo pozměnit vedení signálů v postižených hepatocytech, což vede k produkci reaktivních oxidativních radikálů a profibrogenních mediátorů (TGFbeta-nejsilnější známý induktor fibroprodukce aktivovaných HSC). Příklady protifibrotické terapie při hepatitidě C: Modifikovaný interferon, ribavirin (nákladná léčba, s vedlejšími účinky, navíc eradikuje HCV pouze u 50 % pacientů). Interferony (gamma s větším efektem než alpha a beta) jsou dobře tolerovené, finanční náročnost takovéto léčby má dostačující odraz v efektivnosti léčby. Kombinace cytokinové terapie (inhibitory profibrogenních faktorů jako TGFbeta) a přídatných látek (Silymarin…extrakt z mléka bodláku – aktivní komponenta je silybinin. Sho-saiko – halofuginone…japonská bylinná medicina účinkující cestou inhibice oxidativního stresu v hepatocytech a HSC, aktivní komponenty jsou baicalin a baicalein, chemicky velmi podobné silybininu. Inhibitor fosfodiesterazy, endothelin E receptor,antagonisté angiotensinu). ) (Shimizu I, 2001) Hepatocyte growth factor (HGF) ..hepatotrofní faktor, se u živočichů jeví jako supresor jaterní fibrogeneze .Inhibitory prolyl- 4 hydroxylazy (enzymu nezbytného pro syntezu kolagenu):HOE 77, Safironil, S4682 9.3.5. Nádory v jaterním parenchymu a HSC V okolí nádorového procesu se rozvíjí desmoplastická reakce, na jejímž rozvoji se výrazně podílí hvězdicovité buňky jater. Dochází k proliferaci vlastních nádorových buněk s proliferací vazivové tkáně a degradací extracelulární matrix. HSC se aktivují, vlivem faktorů uvolněných z monocyto - makrofágového systému, ale i z dysplastických hepatocytů. (Johnson SJ, 1998), (Yang ZF, 2004) Jsou producenty kolagenu (hlavně typu I,III, IV) v okolí neopouzdřeného hepatocelulárního karcinomu (stejně tak i v okolí metastáz např. kolorektálního karcinomu). (Ooi LP, 1997) HSC tedy reagují na rozvoj primárního jaterního

47

nádoru i metastáz jiných nádorů stejným způsobem. Z tohoto úhlu pohledu tak mohou mechanicky regulovat – snižovat expanzi nádoru do okolí. Produkcí MMPs a TIMPs, které destruují kolagennní i nekolagenní komponenty extracelulární matrix (včetně kolagenu typu IV bazální mebrány) nakonec vykazují efekt přesně opačný. HSC tak produkcí enzymů degradující komponenty extracelulární matrix a produkcí angiogenních faktorů umožňují lokální expanzi nádorů i šíření vzdálených metastáz nádorů jiných. Předpokládá se též aktivní spolupodíl HSC při dysplastických změnách hepatocytů v rámci vziku primárních jaterních nádorů. Podle teorie epithelial – mesenchymal transition (EMT) (Veerle L., 2002), kdy epitheliální buňky (včetně buněk nádorově transformovaných, a to v primární lokalitě nádoru i metastatickém umístění) jsou schopné ztratit svůj maligní fenotyp, postupně se transdiferencovat v buňky mesenchymální (tedy i fibroblasty a HSC) a konstituovat mesenchymální stroma, které je esenciální pro nádorový růst, invazi a metastazování. (Breitkopf K, 2006) 9.3.6. Portální hypertenze a HSC (Reynaert H, 2002) Aktivované hvězdicovité buňky jater disponují intracelulárním mechanismem (alfa aktin hladké svaloviny, alpha-SMA), který odpovídá kontrakcí a relaxací na různé vasoaktivní substance. Současné studie blíže popisují intracelulární signální cesty a proteiny, které se účastní na procesu kontrakce HSC. Jaterní sinusoida, která je nejužší cévní intrahepatální strukturou, je hlavním místem regulace hepatálního krevního průtoku. Nejvyšší cévní odpor krevnímu toku se uskutečnuje právě zde. (Nakata K, 1960) Komponenty sinusoid, které lez využít k regulaci krevního průtoku: portální venuly, hepatální a centrální venuly, přívodné a odvodné sfinktery sinusoid. Především ale kontraktilní HSC a endotheliální buňky sinusoid. Intracelulární signální mechanismy regulující kontrakci: Ca2+ signální cesta se více vyskytuje u hladké svaloviny, GTPasa, rho přenos..hlavní vliv na nesvalové buňky. Endotheliny: jsou oligopeptidy vzniklé odštěpením z větších prekurzorů pomocí endothelin konvertujícího enzymu. Existují 3 homologní oligopeptidy (ET-1,-2,-3). (Inoue M, 1989) ET A recpetor: se vyskytuje hlavně na hladkosvalových buňkách s vasokonstrikčním efektem, ET B1 receptor indukuje endothelial cell nitric oxide synthetasu (eNOS) s uvolněním NO a výslednou relaxací, ET B2 receptor zapřičiňuje vasokonstrikci.ETA, ETB jsou přítomny na HSC a hepatocytech, ETB na endotheliích sinusoid a Kupfferových buňkách. Hepatic stellate cells byly immunoreaktivní pro oba - ET(A) i ET(B) receptory, hlavně na plasmatické membráně perisinusoidálních a interhepatocelulárních výběžků. Z toho vyplývá, že kontrakce hvězdicovitých buněk jater navozená cestou ET-1 receptoru je zapojená do regulace krevního průtoku v sinusoidách, jak už bylo dříve uvedeno u jaterní cirhozy savců. (Fukushige H, 2000) NO (oxid dusnatý): silný vasodilatátor, na HSC působí cestou indukovatlené NOS (syntézy oxidu dunsatého, navýšením cGMP, snížením Ca2+ a výslednou relaxací. Další sloučeniny působící na kontraktilní aparát HSC: Relaxace HSC: Adrenomedullin, iloprost, prostglandin E2 navýšením cAMP; lipopolysacharidy, interferon gama, interleukin beta, ANP, NO navyšují cGMP . Kontrakce HSC: vasopresin (cestou V1 receptoru), trombin. Renin - angiotensinový systém hraje roli v navýšení itrahepatální cévní rezistence, jeho aktivita koreluje se stupněm portální hypertenze. HSC též exprimují nukleotidové receptory které predominantně reagují s extracelulárními UTP a ATP. Odezva na tyto stimuly je rychlá a výrazná - už po půlhodině narůstá intracelulární hladina inositolmonofosfátu (IMP) 1318 krát vůči kontrolní skupině, nárust

48

hladin inositol bi- a tri- fosfátu není tak markantní. Tím se zrychluje receptorem mediovaná kontrakce těchto buněk. (Takemura S, 1994) Farmakologické cíle: blokáda endothelin A receptoru (ověřeno na experimentu laboratorního potkana), agonisté ET B2 receptoru, inhibitory endothelin convertujícího enzymu. Prokázaný efekt smíšeného ETA a ETB antagonisty bosentanu na redukci portálního tlaku u zvířat s portální hypertenzí cestou inhibice kontrakce hepatic stellate cells. (Rockey DC, 1996) Lidské hepatic stellate cells a regulace kontraktility: ET1 a látky vedoucí ke zvýšení cAMP (např. agonista ET1 na ETB receptoru sarafotoxinS6C) jsou možným cílem zájmu pro omezení proliferace aktivovaných HSC při chronických onemocněních jater a tím i jejich kontraktility. (Mallat A, 1996) Losartan: specifický AT1 receptor antagonista kompletně blokující efekt angiotenzinu II (ANGII) na kontrakci a proliferaci HSC, indukoval významný pokles portální hypertenze u pacientů s jaterní cirhozou. Pro vedlejší účinky ( mmj. hypotenze, pokles glomerulární filtrace) zřejmě nebude pro léčbu použitelný. (Gonzalez – Abraldes J, 2001) Somatostatin: je využíván při skutním krvácení pro vasokonstrikční efekt na mesenteriální arterie. Na modelu lab. potkana je dnes prokázán relaxační a antifibrotický efekt na HSC. (Song SH, 2004) Thiazolidindiony (což jsou PPAR-gamma aktivátory - pioglitazone a rosiglitazone) mohou být použitelné v prevenci nebo léčbě hypertenze (oslabily vývoj hypertenze, korigovaly strukturální abnormity, normalizovaly buněčný růst, a zlepšily endotheliální dysfunkce indukované ATII a preventovaly upregulaci (angiotensin II ) ATII typ1 receptorů, proteinů buněčného cyklu, a mediátory zánětu), zejména když je asociována s insulínovou rezistencí nebo diabetes mellitus. (Diep QN, 2002) 9.3.7. Důležité vlastnosti jaterní formy hvězdicovitých buněk: Vitamín A a jaterní parenchym Hvězdicovité buňky jater skladují 80 % tělesných retinoidů jako retinyl palmitat v intracytoplasmatických tukových kapénkách. Za fyziologických podmínek hrají tyto buňky klíčovou roli v regulaci homeostazy retinoidů v organismu, exprimují specifický retinolbinding protein (RBP), na svém buněčném povrchu a cestou receptor - mediované endocytozy přijímájí intracelulárně komplex RBP- retinol. (Senoo H, 1998) Při (v experimentu exogenně navozené) hypervitaminoze A dochází k rozvoji perisinusoidalni fibrozy, která je výsledkem činnosti aktivovaných hvězdicovitých buněk. Stupeň takovýchto dosažených transformačních procesů (vedoucích až k cirhoze jater), je závislý na přijaté denní dávce vitaminu A. (Nollevaux MC, 2006) Podobný podklad ma i fibroza jater při hemochromatoze, kdy nadbytek železa vede k tukové peroxidaci organel hepatocytů a jejich následné nekroze či apoptoze; tyto děje pak vedou (Ramm GA, 2005) k aktivaci hvězdicovitých buněk jater. Vztah HSC k nervovým zakončením Hvězdicovitý tvar aktivované buňky je dán dlouhými cytoplazmatickými výběžky, běžícími paralelně s endotheliální stěnou sinusoid. Výběžky z nich vycházející se obtáčejí okolo sinusoid, běží mezi hepatocyty, popř. jsou v blízkém kontaktu s nervovými zakončeními, která absahují neuropeptidy (substance P, neuropeptid Y,…) (Reynaert H, 2002) Na modelu jaterní firbozy laboratorního potkana bylo prokázáno, že mastocyty/ myofibroblasty/ a nervová zakončení, utvářejí v portálních a periportálních sinusoidálních prostorech charakteristické komplexy, v nichž se s rostoucí fibrozou navyšuje počet nervových výběžků, s obsahem acetylcholinu. Toto vedlo k předpokladu pozitivního vlivu cholinergní stimulace na jaterní fibrozu, a to cestou navýšení produkce extracelulární matrix myofibroblasty. (Akiyoshi H, 1998)

49

Další experiment potvrzující pozitivní efekt neuronálního proteinu na fibroprodukci dokonce vyvrací nezbytnost TGFbeta1 pro transformaci fibroblastů v myofibroblasty. P311 (protein přítomný v neuronech, a in vivo identifikován v myofibroblastech a jejich aktivovaných prekurzorech v oblastech hojení ran), má podle této studie dokonce modulační efekt na fibroprodukci (cestou regulace činnosti hvězdicovitých buněk jater). (Desi Pan, 2002) 9.3.8. Nové poznatky na úrovni receptorů HSC Endoglin Endoglin (CD105) je přídatná komponenta TGFbeta receptor komplexu, hlavně exprimovaná v endotheliálních buňkách. Je specifickým a senzitivním znakem nádorové angiogeneze v kolorektálním karcinomu.(Saad RS, 2004) Přítomnost endoglinu v hvězdicovitých buňkách jater laboratorního potkana má klíčovou roli v nitrobuněčném přenosu signálu z TGFbeta povrchového buněčného receptoru. (Meurer SK, 2005) Vliv hormonální regulace na činnost HSC - leptin Leptin je 16 kD peptidový hormon exprimovaný hlavně v adipocytech (Marti A, 1999), jeho hypotalamické receptory jsou integrálními komponentami komplexního fyziologického systému vyvinutého pro regulaci energetického výdeje. Objev leptinu tedy vytvořil velký zlom v porozumění regulace tělesné hmotnosti a v roli tukové tkáně jako endokrinního orgánu. S narůstajícím se množstvím vědeckých dat o leptinu se zdá, že leptin má rozsáhlý , komplexní vliv na metabolismus. Leptin mRNA a samotný protein jsou produkovány placentou, plodovými tkáněmi, žaludeční sliznicí a HSC a mohou se spolupodílet na fyziologických funkcích jako je růst plodu, od trávicího systému odvozený pocit sytosti,imunitní a zánětlivé odpovědi, reprodukce, střevní absorpce živin, anigogenze a lipolýza. Leptin zprostředkovává celou škálu metabolických efektů , přičemž používá transdukční cestu přes dlouhou formu leptinového receptoru Ob-R(l), (Ikejima K, 2002) přes Janus kinasa-signální přenašeč a aktivátor transkripce (Jak-Stat) signální komponenty. Leptin je proudukován aktivovanými hvězdicovitými buňkami jater a má profibrogenní vliv na tyto buňky (Jak-Stat kaskáda, experiment s lidskými hvězdicovitými buňkami jater). (Tang M, 2002) Vyšší produkce a množství leptinu v játrech může přispět k navýšené fibrogenezi. (Saxena NK, 2002) 9.3.9. HSC a apoptoza Zdá se velmi pravděpodobné, že indukce apoptozy hvězdicovitých buněk jater by mohla vést k regresi jaterní fibrozy. (Hagens WI, 2006) Hepatic stellate cells však disponují vícevrstevným chemickým obranným štítem proti navození apoptozy. Lidské aktivované HSC/myofibroblasty jsou rezistentní vůči většině pro-apoptotických stimulů z důvodu Bcl-2 navýšené exprese. Tento děj může hrát klíčovou roli v progresi fibrozy u chronických jaterních nemocí. (Novo E, 2006) Při působení oxidativního stresu podléhají hepatocyty apoptoze. Glutathion ethyl ester nedovolí produkci reaktivních kyslíkových substancí uvnitř hvězdicovitých buněk jater a zabraňuje tak jejich apoptoze. (Siegmund SV, 2006) Apoptozu hvězdicovitých buněk jater indukuje také gliotoxin. Jeho klinické použití je limitováno nedostatkem buněčné a tkáňové specifity, vedoucí k vysokému risku potenciálních těžkých vedlejších účinků (poškození jaterních endothelií, Kupfferových buněk a hepatocytů. (Hagens WI, 2006) Stejná skupina autorů (Nizozemí) se nalezením případného specifického nosiče pro antifibrotickou léčbu (cíleně nesenou k HSC) úspěšně zabývá od roku 1999, v těchto publikacích: Insulin-like growth factor receptor (IGF II) R /mannosa 6-fosfátem modifikovaný receptor pro albumin (M6P(28)-HSA) R. (Beljaars L, 2001), (Beljaars L, 1999), (Greupink R, 2006)

50

Z výsledků těchto experimentů realizovaných pro hepatic stellate cells vychází i hlavní ( v tomto textu dále prezentovaný) experiment realizovaný na kultivovaných hvězdicovitých buňkách pankreatu laboratorního potkana.

51

10. HVĚZDICOVITÉ BUŇKY PANKREATU ( PANCREATIC STELLATE CELLS, PSC) Navýšená produkce molekul vazivové tkáně formujících extracelulární matrix je patologický děj, který se odehrává při nemocech v mnoha orgánových systémech, zahrnujících játra, slinivku břišní, trávicí trubici, ledviny a plíce. Fibrogenetický proces je v posledních dvou desetiletích studován velmi intenzivně. Objektivizace takovýchto procesů ve slinivce však donedávna mírně zaostávala, a to i přes to, že už poměrně dlouho jsou přijaty jako centrální děj chronické pankreatitidy a karcinomu pankreatu. (Pinzani M, 1999), (Jesnowski R, 2005), (Longnecker DS, 1982), (Etemad B, 2001) Buněčná a molekulární podstata těchto dějů však ještě před několika léty nebyla téměř vůbec známa. V roce 1998 byl dvěma nezávislými autorskými skupinami objeven a popsán fibroblast –like buněčný typ v pankreatu. (Bachem MG, 1998), (Apte MV, 1998) Veškeré charakteristiky tohoto buněčného typu (kromě orgánově specifických ) vykazovaly velkou podobnost s cytologickými a imunohistochemickými znaky hvězdicovitých buněk jater (hepatic stellate cells, HSC; vysoký stupeň příbuznosti následně prokázán detailním porovnáním genetické informace obou). Hepatic stellate cells v té době už byly jednoznačně přijaty jako hlavní producent extracelulární matrix ve fibrotických játrech. (Gressner AM, 1995),(Friedman SL, 1993) Postupně se stávalo stále více evidentním, že fibroblastové buňky pankreatu s nápadným hvězdicovitým tvarem (pojmenované pancreatic stellate cells ) jsou hlavními efektorovými buňkami při fibroze pankreatu. (Jaster R, 2004) V posledních několika letech, byly nashromážděny důkazy, že aktivované pancreatic stellate cells (PSCs) jsou hlavním zdrojem proteinů extracelulární matrix (ECM) při nemocech s probíhající fibroproduktivní složkou (chronická pankreatitida, karcinom pankreatu). (Jaster R, 2004) Jejich aktivity jsou ale daleko rozsáhlejší (interakce s parenchymovými buňkami, s karcinomovými buňkami, význam při regeneračních dějích pankreatitidy akutní (Frossard JL, 2002) (u člověka (Zimmermann A, 2002)). Jedním z hlavních důvodů, proč se dodnes nepodařilo vyvinout účinnou a dobře snášenou specifickou antifibrotickou terapii, je přetrvávající nekompletní znalost molekulárních principů, které jsou podkladem fibrogeneze v pankreatu. 10.1. Charakteristika hvězdicovitých buněk pankreatu Hvězdicovité buňky pankreatu jsou vitamín A skladující buňky charakteru myofibroblastů. Jejich morfologické a biochemické vlastnosti jsou velmi blízké hvězdicovitým buňkám jater (známé také jako Ito cells ).(Buchholz M, 2005) Hvězdicovité buňky pankreatu reagují na akutní nebo chronické poškození pankreatu svojí aktivací. V rámci této aktivace se v buňce odehrává celá řada změn. Především výrazně navyšují svoji proteosyntetickou aktivitu a produkují prekurzory kolagenu, které se pak po uvolnění do extracelulárního prostoru organizují, ukládájí a tvoří tak vazivo. Toto bylo prokázáno na základě shodné lokalizace exprimovaného genu pro prekurzor kolagenu a aktivovaných hvězdicovitých buněk pankreatu ( metoda dvojího značení). (Neuschwander-Tetri BA, 2000b) Schopnost izolovat, kultivovat a vyvíjet imortalizované linie pancreatic stellate cells z pankreatu laboratorního potkana a člověka plynule uvedla analýzu těchto buněk na úroveň analýzy buněčných a molekulárních mechanismů pankreatické fibrogeneze. (Jesnowski R, 2005), (Sparmann G, 2004), (Masamune A, 2003) Hvězdicovité buňky jsou ve zdravém pankreatu nejvíce zastoupeny periacinárně a představují pouhá 4 % celkové buněčné populace slinivky břišní. S rozvojem fibrozy pankreatu jejich množství exponenciálně vzrůstá. (Vogelmann R, 2001) Nacházíme je difuzně zastoupené

52

v různě objemných vazivových septech periacinárních, interlobulárních, interlobárních a také jako součást povrchového vazivového obalu slinivky břišní. 10.1.1. Identifikace hvězdicovitých buněk pankreatu Imunohistochemická identifikace přítomných cytoskeletálních komponent (intermediární filamenta): GFAP (glial fibrillary acidic protein) - hlavní intermediární filamentum neuroglie (astrocyty, ependymové buňky, Schwannovy buňky,…..enterální gliální elementy) a neoplastmat z ní derivovaných Desmin - intermediární filamentum hladkého, kosterního a srdečního svalstva i neoplastických derivátů svalové tkáně. Je přítomen v myofibroblastech,…..jen v některých fenotypových fázích této buněčně- typové oscilace. Dalším vhodným intermediárním filamentem pro značení je i vimentin - je proteinem intermediárních filament pojiva, mezenchymálních a mezoblastických derivátů; tedy vaziva, chrupavky, kosti; elementů krevních řad a endotelu. A to jak v diferencovaných tkáních, tak i v jejich neoplastických derivátech. αSMA (alfa aktin hladké svaloviny) - aktin obecně je významným proteinem všech živých buněk potřebný pro řadu funkcí; jako změnu buněčného tvaru, pohyb buňky a účast při buněčném dělění v průběhu mitozy. Aktinová filamenta jsou důležitou součástí buněčných spojů mezi buňkami a nebuněčnou substancí. Vyskytuje se v několika izoformách,. Alfa je přítomen pouze v hladkém svalu. Cytoplazmatické tukové kapénky bohaté na vitamín A jsou přítomny především v neaktivovaných hvězdicovitých buňkách pankreatu 10.1.2. Embryonální původ PSC: Vzhledem k velmi pestrému zastoupení intracelulárních komponent v PSC (fibroblastové, svalové, neurální linie) stále zůstává embryonální původ PSC ne zcela objasněn. Také se zdá, že PSC sdílejí s endorkinními liniemi (zahrnující beta-like buňky) společnou progenitorovou buňku. (Seaberg RM, 2004), (Kruse C, 2004) 10.1.3. Získávání a aktivace hvězdicovitých buněk pankreatu: Izolace a kultivace: Hvězdicovité buňky jsou pro experimentální účely nejčastěji izolovány z intaktního pankreatu laboratorního potkana, nově i myši. K indukci pankreatické fibrozy je většinou aplikován jeden z těchto postupů: - Infuze trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) do pankreatického vývodu laboratorních potkanů způsobuje pankreatickou nekroinflamaci následovanou fibrozou. (Puig-Divi, 1996) - Jednorázová intravenozní aplikace dibutylin dichloridu (8mg/kg tělesné váhy), ústící v rozvoj chronické pankreatitidy asociované s fibrozou ( laboratorní potkan). (Sparmann G, 1997) - Opakovaná intraperitoneální aplikace nefyziologických dávek ceruleinu, vedoucí k poškození pankreatu a následné fibroze (myš). (Neuschwander – Tetri BA, 2000a), (Neuschwander-Tetri BA, 2000b) Izolované hvězdicovité buňky v kultuře (na plastové kultivační misce) velmi snadno spontánně proliferují (Apte MV, 1998) a změní se z klidového fenotypu do myofibroblast-like buněk.

53

Aktivace hvězdicovitých buněk pankreatu Hvězdicovité buňky s aktivací : - Nově exprimují alfa aktin hladké svaloviny, v kultuře s maximem jeho exprese v 6.-7. dnu (primokultura). Buňky se tak stávají kontraktilními. - Produkují velké množství proteinů extracelulární matrix , především kolagenu typu I, lamininu a fibronectinu. (Bachem MG, 1998) Navýšení těchto komponent je vlastně způsobeno porušením rovnováhy mezi jejich kontinuálně běžící produkcí a destrukcí (jsou regulovány matrix metalloproteinázami a jejich inhibitory, viz dále). - Exocytozou se zbavují intracytoplazmaticky skladovaných tukových kapének , obsahujících vitamín A a jeho estery. (Bachem MG, 1998),(Apte MV, 1998) - Navyšují proliferační, mitotickou aktivitu, expresi povrchových buněčných receptorů pro cytokiny a chemokiny vedoucím k takovýmto efektům.

10.2. Identifikace hvězdicovitých buněk pankreatu, průkaz jejich aktivace 10.2.1. Průkaz aktivace izolovaných hvězdicovitých buněk pankreatu laboratorního potkana – primokultura Materiál: izolované hvězdicovité buňky z intaktiního pankreatu laboratorního potkana, primokultura Metody: kultivace ( postup viz experiment 11.4. a kapitola 12) Výsledky: obrazová dokumentace- komentář I (strana 56) A Světlená mikroskopie: 6. den kultivace, primokultura, hvězdicovité buňky lab. potkana B Imunofluorescence vimentin II ( strana 57) Značení tukových kapének obsahujících vitamín A. (oil red staining) Aktivace hvězdicovitých buněk je doprovázena uvolňováním tukových kapének z cytoplazmy do extracelulárního prostoru (exocytoza) A 1. den primokultura B 3. den primokultura C 6. den primokultura III (strana 58) imunofluorescence alfaSMA. Aktivace hvězdicovitých buněk je doprovázena postupnou manifestací intracytoplazmaticky se rodících složek pro alfaSMA cytoskeletální komponentu. A 1. den primokultura, difusně se vyskytující alfa aktin hladké svaloviny B 3. den primokultura, postupně se formující stresová vlákna alfaSMA, patrná i proliferační aktivita buněk C 6. den primokultura, nárůst celkového množství uspořádaných stresových vláken alfaSMA uvnitř PSC D 7. den primokultura, pokračující proliferace PSC, vrchol aktivačních změn PSC směrem k myofibroblastovému fenotypu Závěr: Izolované hvězdicovité buňky pankreatu laboratorního potkana v kultuře na plastovém podkladu se spontánně aktivují. 54

Při aktivaci: - uvolňují do svého okolí ( oxocytoza) původně intracytoplazmaticky skladované tukové kapénky - nově exprimují alfa aktin hladké svaloviny, intermediární filamentum, díky němuž disponují novými buněčnými vlastnostmi, především kontraktilitou 10.2.2. Průkaz přítomnosti hvězdicovitých buněk pankreatu člověka Materiál: histologické vzorky pankreatu člověka, odběr při chirurgickém resekčním zákroku ( hemipankreatiduodenektomie), Tu hlavy pankreatu, akutní klinická komplikace obstrukčním ikterem. Vzorek odebrán z resekční linie, v palpačně denzním pásmu cca 1 cm čirokém, oblklopujícím hlavní infiltrát ( oblast s přítomnou desmoplastickou reakcí v okolí nádoru) Metody: světelná mirkoskopie, fixace vzorku a barení na alfa aktin hladké svaloviny a glial fibrilar acidic protein. Použitá zvětšení -200x, detail 400x. Výsledky: Obrazová dokumentace (strana 59) A imunofluorescence – vimentin B imunofluorescence- desmin C imunofluorescence – GFAP, zvětšení 200x D imunofluorescence – GFAP, detail, zvětšení 400x E imunofluorescence – αSMA, zvětšení 200x F imunofluorescence - αSMA, detail, zvětšení 400x Závěr: Pomocí značení na GFAP a αSMA byly v parenchymu pankreatu člověka v oblasti s dominující desmoplasitckou reakcí s charakteristicky zmnoženým vazivem, identifikovány buňky s protáhlými cytoplazamtickými výběžky, odpovídající stellate cells.

55

56

57

58

59

10.3. Extracelulární signály zavzaty do aktivace pancreatic stellate cells (Jaster R, 2004) Faktory, které svou extracelulární vazbou na hvězdicovité buňky zapříčiní aktivaci hvězdicovitých buněk, lze rozdělit na cytokiny/ růstové faktory a alkohol a jeho metabolity. 10.3.1. cytokiny/ růstové faktory (Bachem MG, 1998), (Apte MV, 1999), (News P, 2002), (Luttenberger T., 2000), (Schneider E, 2001) Cytokiny jsou vysoce účinné polypeptidové mediátory (i při nízké, až nedetekovatelné koncentraci), působící často parakrinně nebo autokrinně; většinou tedy nejsou přítomny v séru. a) platelet derived growth factor (PDGF) ...stimuluje aktivaci PSC (Bachem MG, 1998), (Apte MV, 1999), (Luttenberger T., 2000), (Schneider E, 2001), především je považován za nejefektivnější mitogen PSC (Schneider E, 2001) (Kordes C, 2005) b) rodina transforming growth factor (TGF); zvyšuje migratorní aktivitu PSC (Phillips PA, 2003a) - TGFbeta1...aktivace PSC(Bachem MG, 1998), (Apte MV, 1999), (Luttenberger T., 2000), (Schneider E, 2001), velmi účinná podpora proteosyntezy ECM. (Kordes C, 2005) Modulace TGF-beta1 signalizace by mohla být terapeutickým cílem pro prevenci chronické fibrotizující pankreatitidy. (Yoo BM, 2005) - activin A….aktivace PSC (Ohnishi N, 2003) - TGFalpha ...aktivuje PSC (Bachem MG, 1998), (Schneider E, 2001) c) basic fibroblast growth factor (FGF)...aktivace PSC (Bachem MG, 1998), (Schneider E, 2001) d) tumor necrosis factor –alpha (TNFalpha) ...aktivace PSC (Schneider E, 2001), stimulace proliferace a proteosyntezy u PSC(Mews P, 2002) e) interleukin (IL) -1…aktivace PSC (News P, 2002) f) interleukin (IL) -6 …aktivace PSC (Friedman SL, 1993), inhibice proliferace PSC (Mews P, 2002) g) connective tissue growth factor 2 (CCN2)…. stimuluje fibroprodukci , adhezi, migraci a proliferaci PSC. (Gao R, 2005a),(Gao R, 2005b ) Samy PSC tento faktor syntezují (po své aktivaci), CCN2 působí přes povrchové receptory PSC integrin alpha5beta1 a heparan sulfat proteoglykan. h) basic fibroblast growth factor(bFGF) ….aktivace PSC i) insulin –like growth factor 1 (IGF 1)…aktivace, proteosynteza j) angiotensin II (AT II) in vitro: stimuluje PSC proliferaci (Hama K, 2004), (Reinehr R, 2004), (Hama K, 2006) a indukuje buněčnou kontrakci. (Reinehr R, 2004) Pankreatický renin-angiotensinový systém (Chappell MC, 1991), (Leung PS, 1997): aplikace inhibitoru angiotensin-konvertujícího enzymu lisinoprilu (Kuno A, 2003), stejně tak antagonisty angiotensin II receptoru candesartanu (Nakazawa T, 2003), (Ko SH, 2006)), suprimovalo pankreatickou zánět a fibrozu v živočišném modelu spontánně se vyskytující chronické pankreatitidy, Wistar/Bonn/Kobori rats. U angiotensin II receptor typu 1a-deficitní myši(AT1a(-/-)), pankreatická firboza indukovaná opakovanými epizodami akutní pankreatitidy ( následující ceruleinové injekce) byla tímto utlumena. (Nagashio Y, 2004) Losartan: jeho efekt retardace progrese experimentální chronické pankreatitidy a fibrozy byl prokázán na zvířecím modelu. (Talukdar R, 2006) Také r. 2005 byl ověřen antifibrotický efekt Losartanu, antagonisty typu 1 Angiotensin II receptoru, na lidské hvězdicovité buňky slinivky břišní, dle sdělení je antifibrotická aktivita zprostředkována inhibicí hybnosti a indukcí apoptozy těchto buněk. (Liu WB, 2005) 60

k) interferony: Poprvé byl popsán efekt interferonů na hepatic stellate cells. U hepatic stellate cells byl prokázán efekt IFN alfa - obrana HSC před lipidovou peroxidací navyšováním biologických aktivit proti oxidativnímu stresu, vedoucímu k inhibici aktivace.(Lu G, 2002) Stejně tak byly ověřeny antiproliferativní efekty v IFN-alfa (Saile B, 2003), IFN-beta a IFN-gamma na HSC. (Shen H, 2002) IFN-alfa také inhibuje spotánní apoptózu aktivovaných hvězdicovitých buněk jater. (Saile B, 2003) U hvězdicovitých buněk slinivky břišní došlo k plnému ozřejmení efektu těchto cytokinů teprve nedávno. IFN beta a IFN gamma částečně ( cestou STAT1 signální cesty) vykazují in vitro inhibiční efekty na PSC aktivaci, proliferaci a syntezu kolagenu. (Baumert J-T, 2006) l) velmi pravděpodobně P311 - protein přítomný v neuronech, a in vivo pouze v myofibroblastech a jejich aktivovaných prekurzorech v oblastech hojení ran. P311 mohou myofibroblast aktivovat (navýšení alfa SMA, indukce tvorby aktivačních faktorů, navýšení receptorů pro PDGF, navýšení integrinů alfa3 a alfa 5, navýšení míry proliferace. Výsledný efekt může být ale i opačný- snížení expresi kolagenních vláken a jejich prekurzorů a remodelace fibroprodukce směrem k jejímu poklesu. (Desi Pan, 2002) Potenciální zdroje cytokinů , které ovlivňují činnost PSC, v pankreatu s probíhajícím zánětlivým procesem.: - např. aktivované makrofágy ( sekretující TGFbeta1) (Schmid-Kotsas A, 1999) - krevní destičky ( obsahující PDGF a TGFbeta1) (Luttenberger T., 2000) - velmi pravděpodobně acinární buňky (exprimující mimo jiné TNFalpha (Gukovskaya AS,1997), IL-1 a IL-6. (Yu JH, 2002) - hvězdicovité buňky pankreatu : po iniciálním exokrinním signálu dochází v hvězdicovitých buňkách k vlastní produkci některých cytokinů a ustavení autokrinních smyček. Většina z nich má posilující a násobící efekt na rozvoj fibrozy, sebepotenciaci produkce. Jsou to TGFbeta1 (Shek FW, 2002), (Krause ML, 2000)), activin A (Ohnishi N, 2003) a IL-1. (Apte M, 2001)Vazby mezi produkcí jednotlivých cytokinů jsou uvnitř hvězdicovitých buněk vzájemně síťovitě vázány, existuje např. autokrinní smyčka i mezi mezi TGF-beta1 a IL-1beta (cestou Smad3 aERK dependentní cesty. (Aoki H, 2005)- viz dále, a mezi TGFbeta1 a IL-6 (dříve označován jako IFNbeta2). (Bateman AC, 2002) - zřejmě neurony (nervová intrapankreatická zakončení) 10.3.2. ethanol a jeho metabolity, především acetaldehyd (Apte MV, 2000) Patogenetický podklad fibroproduktivních dějů a chronické pankreatitidy - jako vážné komplikace při abusu alkoholu, nebyl dlouho znám a definován. V současnosti se předpokládají dvě hlavní cesty jejich vlivu na hvězdicovité buňky pankreatu a tedy fibroprodukci ve slinivce břišní. - nepřímý efekt: jednotlivé alkoholické excesy (způsobující závažnější poškození slinivky – zánět , nekroza) vedou k uvolňování proinflamatorních cytokinů a následné aktivaci PSC (Apte MV, 2003) - přímý efekt: in vitro - přímé působení ethanolu na PSC a jejich aktivace. (Apte MV, 2000) PSC obsahují alkohol dehydrogenázu, tedy uvnitř PSc se tvoří acetaldehyd. Oba působky již samy o sobě se vyskytují ve formě nestabilních radikálů a navozují oxidativní stres. Etanol a acetaldehyd působí intracelulárními aktivačními cestami všech 3 podrodin z MAPK cest( 3 hlavní podrodiny : ERK1, ERK2, JNK a p38 kinázy, viz dále) v PSC. (McCarroll JA, 2003)

61

10.4.Experiment PDGFβ stimulace navyšuje proliferaci izolovaných hvězdicovitých buněk pankreatu laboratorního potkana (primokultura) Cíl experimentu průkaz navýšení proliferační aktivity izolovaných hvězdicovitých buněk slinivky břišní laboratorního potkana (primokultura) jako následek působení exogenně podaného PDGFbeta Materiál ISCOVE modifikované Dulbecco medium ( IMDM ) a další podpůrné substance pro buněčnou kultivaci obdržené od Biochrom (Berlín, Něměcko) , 5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU) značení a detekce enzyme-linked immunosorbent essay sada (Roche Diagnostics ). Izolace a kultivace hvězdicovitých buněk pankreatu Hvězdicovité buňky byly izolovány z pankreatu LEW.1W inbredního laboratorního potkana ( samec), podle postupu Apteho a kol. ( citace 4) . Následně byl pankreas vystaven digesci směsí kolagenázy P (0,05%), proteázy IX (0,02%) a deoxyribonukleazy (0,1%) v Hankś buffered salt solution ( HBSS). Hvězdicovité buňky pankreatu byly odděleny od acinů a dalších buněk centrifugací (12 % Nycodenz; centrifugace v 1400 g po 20 minut). Hvězdicovité buňky byly odebrány z povrchu vzniklého gradientu buněčných komponent ve zkumavce; omyty a resuspendovány v IMDM doplněném 10 % FCS, 1 % neesenciálních aminokyselin , 100 U/ml Penicilin a 100 ug/ml Streptomycin, a kultivovány na 6 kultivačních miskách při 37 st. C a 5 % CO2 zvlhčovaném prostředí. Po změnách media ( za 24 a 48 hodin) byla odstraněna většina kontaminujících buněk, a tím jsme získali téměř ( více jak 95 %) čisté PSC kultury ( ověřeno světlenou fázově kontrastní fluorescenční a elektronovou mikroskopií). Buněčná kultura Primokultury izolovaných pancreatic stellate cells laboratorního potkana byly i nadále udržovány v IMDM doplněné 10 % fetal calf serum ( FCS ), neesenciálními aminokyselinami, 100U/ml Penicilin a 100ug/ml Streptomycin , při teplotě 37 st C a 5% CO2 vlhčeném prostředí. Postup Hvězdicovité buňky pankreatu ( první pasáž) byly trypsinizací uvolněny z primární kultivační misky, posbírány a znovu kultivovány ve stejných množstvích,za základních kultivačních podmínek v 96 komůrkové kultivační misce. Po 24 hodinách byly stimulovány pomocí definovaných koncentrací PDGFbeta cytokinu( ve chvíli, kdy nejrychleji rostoucí kultury byly v jednotlivých kultivačních komůrkách difuzně, téměř bez přerušení, rozprostřené). Pro možnost kvantitativního ohodnocení buněčné proliferace byl přidán 5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU), který se inkorporoval do nově syntezované DNA. Po 24 hodinách byl pak měřen pomocí BrdU labelling and enzyme-linked immunosorbent essay kit (Roche Diagnostics), podle instrukcí výrobce sady. Aplikované koncentrace PDGF ( ng/ml) :0,03 0,1 0,3 1 3 10 30 100 Výsledky Obrazová domunetace :experiment 10.4. str. 64 100 % buněčné proliferace odpovídá hvězdicovitým buňkám, které byly kultivovány bez PDGF (tedy kontrola pouze s IMDM mediem + 10 % FCS).

62

Hodnoty jsou vyjádřeny jako střední ( průměry) ( +-SEM) šesti nezávislých experimentů. P méně 0,05 vs. DMSO ( základní medium IMDM + 10 % FCS ) Statistická významnost byla ohodnocena za použití Wilcoxonova „rank sum test“. P ‹ 0,05 byla shledána jako statisticky významná. Závěr PDGF signifikantně stimuloval DNA syntézu a tedy proliferaci hvězdicovitých buněk pankreatu v koncentračním rozmezí 100 – 3 ng/ml.

63

64

10.5. Intracelulární přenos aktivačních signálů Výzkum zaměřený na intracelulární signalizaci v hvězdicovitých buňkách pankreatu je zaměřen na dva hlavní aspekty: roli enzymů mitogen-aktivated protein kinazové ( MAPK) rodiny transkripční kontrolu PSC aktivace : ligandy nukleárního receptoru PPARgamma (peroxisome proliferator- activated receptor gamma) ). 10.5.1. MAPK (mitogen activated protein kinases) MAPK jsou rodinou serin/threonin specifických protein kináz s širokou škálou biologických funkcí v rámci regulace základních buněčných procesů (zahrnujících genovou expresi, proliferaci a buněčné přežívání / apoptotickou buněčnou smrt (Chang L, 2001), (Pearson G, 2001) (Lewis TS, 1998) ). V savčích buňkách jsou rozpoznány 3 podrodiny MAPK, všechny regulují aktivaci těchto buněk (Pearson G, 2001) : a) extracellular signal-regulated kinases- ERKs (ERK1 a ERK2)…..obsahují četné intracytoplazmatické proteiny a také malý G-protein Ras a serin/threonin- specifickou kinasu Raf-1.(Pearson G, 2001) U kultivovaných PSC je ERK1/2 aktivace klasickým projevem při transformaci buňky v myofibroblast-liek fenotyp. (Jaster R, 2002) Cestou navýšení exprese ERK1/2 působí silný PSC mitogen PDGF beta (Jaster R, 2002), (Jaster R, 2003), (Masamune A, 2003c ), (Yuantai W, 2005), (Wan Y,2005), (Masamune A, 2003b ); její inhibici zpostředkovává PD98059. (Yuantai W, 2005), (Wan Y,2005) Expozice hvězdicovitých buněk pankreatu ethanolu a acetladehydu je doprovázena rychlou (Masamune A, 2002b ) a dlouhodobou (McCarroll JA, 2003) ERK 1/2 aktivací. Galektin (beta-galactosid- vážící endogenní lektin) také působí aktivaci PSc cestou aktivace ERK1/2 a navýšenou DNA vážící AP-1 trasnkripční faktory. (Fitzner B, 2005), (Masamune A, 2005d ) b) cJun N –terminal kinase (JNK) c) p38 obě tyto kaskády jsou přenosnými cestami pro signály indukované proinflamatorními cytokiny a buněčnými stresory (např. oxidativní stres, UV záření) (Tibbles LA, 1999), reagují svojí aktivací na ethanol / acetaldehydovou expozici. (Masamune A, 2002b ), (McCarroll JA, 2003) .Inhibicí p38 enzymatické aktivity dochází k ovlivnění ethanolem- indukované myofibroblastové trasndiferenciace PSC. (McCarroll JA, 2003) P38 signální cesta je zřejmě zapojena do zprostředkování mitogenního efektu PDGF na PSC a jejich aktivace v dlouhodobě udržovaných kulturách. (Masamune A, 2003d ) JNK vede k proliferaci čerstvě izolovaných PSC, JNK inhibitor SP600125 ji potlačuje (Masamune A, 2004), (Kikuta K, 2004) Efekt Angiotenzinu II je v hvězdicovitých buňkách pankreatu také přenášen pomocí MAP kinasové cesty. (Hama K, 2004),(Reinehr R, 2004) Další intracelulární cesty přenášející signál v hvězdicovitých buňkách pankreatu 10.5.2. Phosphatidylinositol 3 (PI 3)-kináza

65

Pomocí této cesty je zajištěna PDGF- stimulovaná migrace PSC, ne však jejich proliferace. (Masamune A, 2003b), (Masamune A, 2003c ), (McCarroll JA, 2004) 10.5.3. Rho-Rho kináza (ROCK) Rho-Rho kináza (ROCK) je cesta, která zapojena do aktivace PSC ( in vitro průkaz) a sice regulací aktinového cytoskeletu. (Masamune A, 2003e )

10.5.4. Transkripční faktory Transkripční faktory, jejichž aktivita je v rámci aktivace pancreatic stellate cells ( v kultuře) cílově regulována, jsou: a ) activator protein (AP)-1 ….velmi důležitý článek v procesu aktivace PSC. (Karin M, 1997) , (Shaulian E, 2001), (Jaster R, 2002) b) signal transducer and activator of transcription (STAT)3…signální přenašeč a aktivátor transkripce. (Ihle JN, 2001) PDGFbeta cesta : ERK- JAK2-STAT3 (Masamune A, 2005c ) c) nukleární faktor kappaB (NF-kappaB) (Baud V, 2001), (Karin M, 2000) AP-1 a NF-kappaB vykazují brzkou maximální DNA vazebnou aktivitu v porovnání s STAT 3. (Fitzner B, 2004) d) Smad transkripční faktory hrají centrální roli v přenosu TGF-beta receptor –signálů do buněčného jádra. (ten Dijke P, 2000), (Derynck R, 1998) Smad2-, Smad3- a ERK-dependentní cesty však sehrávají odlišné role při přenosu TGFbeta1 signálu v PSC. (Ohnishi H, 2004) U HSC je dnes prokázáno (Dooley S, 2003), že Smad7, je negativním regulátorem TGF- beta signalizace, a mohl by působit jako transkripční inhibitor PSC aktivace. e) peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) nukleární hormonální receptor - sehrává roli v inhibici aktivace stellate cells jater (Galli A, 2002), (Miyahara T, 2000), (Galli A, 2000) a pankreatu (Galli A, 2000), (Jaster R, 2002), (Jaster R, 2004), (Jaster R, 2005), (Masamune A, 2002) - PPARgamma ligandy : 15-deoxy-delta12,14- prostaglandin J2 a troglitazone ( antidiabetikum thiazolidindionové skupiny) působí jako antagonisté PSC aktivace a proliferace in vitro. (Masamune A, 2002), (van Westerloo DJ, 2005),(Masamune A, 2002) U Wistar Bonn/Kobori laboratorních potkanů, troglitazone tlumí pankreatický zánět a fibrozu (brání jejich rozvoji).(Shimizu K, 2002), (Patel M, 2005), (Hisada S, 2005) Při aktivaci PPARgamma pomocí trolitazonu dochází i k navýšení CD36 exprese v PSC a tím i navýšení jejich fagocytové aktivity. Protože fagocytoza je esenciální pro limitaci rozsahu zánětu, zvýšení fagocytové aktivity může poskytnout významný přístup k léčbě pankreatických nemocí. (Shimizu K, 2005), (Lobo MV, 2001) Role CD 36 a peroxisom-proliferator- activated receptor gamma při fagocytoze: CD36 slouží společně se scavanger receptory třídy A typu I a II(SRA)., jako transportni transmembránový receptor pro internalizaci LDL, jeho lokalizace byla u člověka přešetřena jak v ramci GIT (epitel duoden,a jejuna, žaludku, kde fyziologicky napomáhá vstřebávání tuků ze stravy; ) tak také v epiteliích koronárních arterií, jako spolupodílející se činitel na progresi aterosklerotických změn těchto arterií (Nakagawa Y, 1999), (Nakagawa-Toyama Y, 2001) Byl identifikován na povrchu velký, pěnovitých makrofágu v GIT a aorty, koronárních arterií postižených významnou progresí aterosklerozy, zatimco v oblastech s difuznim ztluštěním intimy např. v oblasti koronárních arterií byly vice exprimovány scavenger receptory, (a CD36 téměř vůbec nebyl exprimován). PSC představují (působí jako) rezidentní fagocytující buňky, CD36 podporuje troglitazoneindukovanou fagocytovou aktivitu cestou peroxisome proliferator-activated receptor gamma

66

transaktivaci. Protože fagocytoza je esenciální pro limitaci rozsahu zánětu, zvýšení fagocytové aktivity může poskytnout významný přístup k léčbě pankreatických nemocí. (Shimizu K, 2005), (Lobo MV, 2001) Diabetes mellitus (Inzulínová insuficience), jeho různá tíže, má vliv na expresi těchto CD36 povrchových buněčných transporterů a tukového transportu, specificky v různých tkáních (Luiken JJ, 2002)

10.6. Hvězdicovité buňky pankreatu - další charakteristiky 10.6.1. Produkce matrix- degradujících enzymů z matrix metalloproteinázové rodiny (MMP, matrix metalloprotinases) a jejich inhibitorů (tissue inhibitors of matrix metalloproteinases,TIMP). MMP a TIMP jsou produkovány klidovými i aktivovanými PSC.Významně participují na regulaci aktuálního „obratu“ fibrilárních komponent extracelulární matrix ve zdravém i poškozeném pankreatu . V současnosti lze fibrozu pankreatu považovat za výsledek změn v rovnováze mezi syntezou a degradací proteinů extracelulární matrix. (Phillips PA, 2003b) Matrix metalloproteinazy (MMP): rodina více než 20 zinek - dependentních enzymů (poslední údaj 23), které jsou produkovány v neaktivní formě. Jsou aktivovány pomocí proteaz ( plazmin ,trypsin ). MMP2 a MMP9 degradují kolagen IV bazální membrány, jsou asociovány s remodelací hmoty extracelulární matrix při hojení ran, zánětu, fibroze, angiogenezi, nádorové invazi. Degradace kolagenu bazální membrány (typ IV) zřejmě usnadňuje deposici patologického fibrily - formujícího kolagenu, čímž potencuje fibrozu. Klasifikujeme je na základě jejich substrátové specificity a strukturálních rysů, dělíme je do 5 základních skupin: gelatinasy ( MMP2, MMP9), stromelysiny ( MMP3, MMP10, MMP11), elastazy ( MMP12,MMP7), kolagenazy (MMP1, MMP8,MMP13, MMP18) matrix metallopoteinazy membránového typu (MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP, MT4MMP). Tkáňové inhibitory metalloproteinaz (TIMP): rodina působků odlišujících se neselektivním či vysoce specifickým inhibičním účinkem vůči jednotlivým MMP. „Ve zdraví“ slouží k udržování normální parenchymové architektury, během orgánového poškození PSC vylučují zvýšené množství specifických MMPs . Obecně: TIMPs inhibují MMPs aktivitu vazbou na jejich aktivní stranu v poměru 1:1., formou reverzibilních, nekovalentních vazeb. TIMPs ale také hrají roli v přeměně latentních MMPs v aktivní formy. Výsledný efekt TIMP na příslušný MMP, se kterým reaguje, je závislý na koncentraci přítomného TIMP ( př. nízká koncentrace TIMP2 usnadňuje aktivaci mMMP2, vysoká koncentrace brání aktivaci MMP2). Rozlišujeme celkem 4 podtypy. PSCs syntezují především tyto MMP a TIMP: MMP-2,: jeho produkce navýšena TGFbeta, IL6, alkoholem, acetaldehydem; způsobuje degradaci kolagenu bazální membrány, což umožní invazi fibrogeneze ( a tedy ukládání patologického - fibrilárního kolagenu) ale i např. nádoru do okolí. (Phillips PA, 2003b) (TNFalfa a IL6 jsou nalézány ve vysokých tkáňových a serových koncentracích v průběhu akutní pankreatitidy. Serové hladiny korelují s těžkostí probíhající akutní pankreatitidy. U

67

chronické pankreatitidy u člověka je nalézáno navýšení TGFbeta. In vitro TGFbeta1 i IL6 signifikantně navyšují produkci MMP2 v PSC. MMP-2 je důležitá v malignitách , jak její aktivace koreluje s nádorovým šířením a špatnou prognozou MMP-9 : také degraduje kolagen typu IV (bazální membrány) MMP-13 degraduje fibrilární kolagen TIMP-1 …množství vzrůstá stimulací alkoholem a acetaldehydem TIMP-2 …množství vzrůstá stimulací alkoholem a acetaldehydem vše (Phillips PA, 2003b). Produkce a činnost matrix metalloproteináz in vivo je přesně regulována. V intaktních tkáních a parenchymech je jejich bazální produkce minimální, ke skladování těchto působků nedochází. Matrix metalloproteinázy jsou syntezovány především stromálními buňkami, hlavně buňkami hvězdicovitými. Při EMT změnách ( epitelial to mesenchym transformation ) epiteliální buňka ztrácí své původní buněčné charakteristiky a získává znaky buněk stromálních. (Gilles CH, 2005) Jedním z průvodních znaků je nově nabytá schopnost syntetizovat matrix metalloproteinazy. Díky nim pak mohou epitelie degradovat proteiny bazální membrány a migrovat. EMT proces je spjat s fyziologickými i patologickými ději, pro které je nezbytná migrace epiteliálních buněk a invaze. Matrix metalloproteinázy mohou v některých buněčných systémech sloužit dokonce jako iniciátor EMT změn. Pankreatické hvězdicovité buňky se produkcí MMP a TIMP podílejí na vzniku EMT změn, čímž umožňují neoplasticky alterovaným epiteliím samostatně produkovat metalloproteinázy a jejich inhibitory, a tedy nezávisle na součinnosti s okolními faktory si otevírat cestu v lokální invazi i vzdáleném metastazování.Matrix metalloproteinázy jsou obecně zapojeny tedy do mnoha kroků maligní transformace, včetně růstu primárního nádoru, angiogeneze, invaze přes bazální membránu a do stromatu; a metastatické progrese. Současná pozorování tvrdí, že MMP hrají roli nejen v šíření nádorových buněk, ale i v jejich přežívání. (Reunanen N,2005) TIMPs v nádorovém růstu a invazi Navýšená exprese TIMPs karcinomovými něbo hostitelovými buňkami redukuje invazivní a metastatickou kapacitu nádorových buněk. Jednotlivé TIMPs mají odlišné vlivy na přežívání okolních buněk. Mohou totiž z buněčného povrchu modulovat hladiny smrtících proteinů. ( např. odštěpení fas ligandu z buněčného povrchu je indukováno MMP a inhibováno syntetickými inhibitory MMP ). (Reunanen N,2005) Inhibice MMP aktivity - TIMPs, 4 poddruhy:TIMPs-1,-2,-3 a –4 jsou důležité endogenní regulátory MMP aktivity v tkáních . Všechny TIMPs jsou rozpustné ve vodě, pouze TIMP3 není, a váže se k proteinům extracelulární matrix. Vysoká hodnota exprese TIMP-2 na rozhraní mezi maligními a stromálními buňkami je odrazem výrazné hostitelovy reakce proti přítomným aktivním, vysoce invazivním buňkám, tedy koreluje se špatnou prognozou. - SERPIN proteinázovými inhibiory ( SERPINy) :Serpiny jsou glykoproteiny 50-100 kDa, hojně zastoupené ve všech tkáních lidského organismu. Jsou zapojeny do kontroly obecně proteolytické aktivity v mnoha tkáních. Patří k nim např. alfa1-antitrypsin (alfa1-proteinázový inhibitor), plazminogen aktivátor inhibitor (PAI)1 a PAI2. - nespecifickými serovými proteinázovými inhibitory : např. alfa2-makroglobulin, který je důležitý pro blokování MMP v synoviální tekutině, séru a dalších tělesných tekutinách 10.6.2.Další matrixcelulární proteiny produkované PSC

68

Mezi další matrixcelulární proteiny produkované PSC patří trombospondin-1 (TSP-1) a TSP2 .(Neuschwander-Tetri BA, 2005)

10.7. Vztah PSC k ostatním buněčným komponentám pankreatického parenchymu Základní přehled transformací jednotlivých komponent pankreatického parenchymu byl uveden v rámci popisu patologických změn při chronické pankreatitidě. PSC a acinární buňky, PSC a buňky Langerhansových ostrůvků Při onemocnění pankreatu ( např. chronické pankreatitidě) hvězdicovité buňky pankreatu indukují apoptozu acinárních buněk, za pomoci TRAIL (TNF-related apoptosis –inducing ligand) substancí (mechanismem cross linking dvou TRAIL receptorů). (Hasel C, 2003), (Bateman AC, 2002) Při chronické pankreatitidě je signifikantně navýšen apoptotický a proliferační index acinárních buněk v porovnání se stejným buněčným kompartmentem v normálním pankreatu. Rozdílné indexy apoptozy ( ale i proliferační indexy) v epiteliích acinů a pankreatických ostrůvků mohou hrát důležitou roli v určení histologické a klinické progrese nemoci. Exprese Fas ligandu buňkami Langerhansových ostrůvků pravděpodobně ovlivňuje relativní distribuci T lymfocytů uvnitř acinů a ostrůvků ve prospěch přežívání buněk ostrůvků. Langerhansovy ostrůvky si také pomocí aktivace nukleárním faktorem-kappaB ( NF-kappaB)indukovaných anti-apoptotických faktorů udržují imunoprotektivní status, čímž umožňují vlastní přežití. (Bhanot UK, 2006) Navýšená exprese retinoblastoma proteinu (Rb) je zřejmě dalším mechanismem indukce apoptozy v buňkách acinů ( při chronické pankreatitidě ). Vztahy PSC a pankreatických nádorových buněk Desmoplastická reakce je charakteristickou známkou karcinomu pankreatu. (Pinzani M,1999), (Jesnowski R, 2005), (Bachem MG, 2005) Aktivace hvězdicovitých buněk pankreatu nejen že doprovází nádorovou progresi, ale sehrává v ní významnou aktivní roli. Růst a rozvoj pankreatického karcinomu je násoben pomocí komplexu interakcí mezi buňkami karcinomu a hvězdicovitými buňkami pankreatu. (Bachem MG, 2003a) Buňky pankreatického karcinomu si v hostitelově organismu vytváří obranné mechanismy, pomocí nichž různým způsobem předcházejí možnosti vlastní destrukce. (Löhr, 2005) Např. výrazně navyšují expresi vlastních povrchových buněčných receptorů a adekvátních cytokinů v okolí s výsledným antiapotpotickým efektem. K produkci těchto cytokinů si parakrinně modifikují např. činnost okolních pancreatic stellate cells. Charakteristika maligního růstu I. Autonomní růstová regulace

Karcinom pankreatu např. Zvýšená exprese EGF,FGF,PDGF,IGF ˇ

a jejich receptorů např. zvýšená exprese TGFbeta cytokinové rodiny a jejich receptorů, Smad 4 mutace, navýšení exprese Smad6+7 III. Rezistence vůči apoptotickým stimulům např. navýšená exprese VEGF,FGF-2 a jejich receptorů IV.invaze a metastazování např. navýšená exprese HGF, TGFbeta rodiny cytokinů, NGF a jejich receptorů II. rezistence k růstové inhibici

69

(HGF...hepatocyte growth factor, EGF epidermal growth factor, FGF fibroblast growth factor, VEGF vascular endothelial growth factor) IGF I a II jsou somatomediny, polypeptidy tvořené v játrech (pod vlivem růstových hormonů). Vykazují cca 70 ti % vzájemnou homologii a vůči Inzulínu 50 %. Navýšené ukládání fibrilární složky vaziva v pankreatickém karcinomu je výsledkem parakrinní stimulace PSCs karcinomovými buňkami (Bachem MG, 2003b), (Apte MV, 2004c ) Tenascin C (TNC) byl doposud znám jako je složka přechodné extracelulární matrix charakterizující solidní nádory. Buněčný povrch annexin II je vysoce afinitní receptor pro různé tenascinové variety. Nyní bylo zjištěno, že tenascin se vyskytuje též ve slinivkovém parenchymu poškozovaném chronickou pankreatitidou, v intaktním pankreatu nebyl prokázán. Tenascin je produkován hvězdicovitými buňkami pankreatu, jeho produkce je indukována TNFalpha, TGF-beta1 , stejně tak supernatanty karcinomových buněk obsahujících TGFbeta1. Exprese tenascinu C v parenchymu a annexinu II na povrchu nádorové buňky zvyšuje progresi z „low-grade PanIN“ lezí do pankreatického karcinomu. (Esposito I, 2006) Dalším mechanismem, pomocí něhož desmoplastická reakce v okolí pankreatického karcinomu formuje a posiluje maligní fenotyp buněk, je navýšená produkce kolagenu typu I. (Armstrong T, 2004) Kolagen typu I podporuje fenotypovou malignizaci buněk pankreatu cestou alpha2beta1 integrinu (na povrchu anaplasticky se transformujících acinárních buněk).(Grzesiak JJ, 2006) TGFbeta 1 je znám jako hlavní cytokin navozující aktivaci hvězdicovitých buněk pankreatu, je tedy i klíčovým efektorem při rozvoji tumor-asociované pankreatické fibrozy. (Bachem MG, 1998), (Apte MV, 1999), (Luttenberger T., 2000), (Schneider E, 2001) Nově je věnována velká pozornost mapování intracelulárních procesů probíhajících v buňkách karcinomu pankreatu ve vztahu např. i k aktivitám pancreatic stellate cells. (Müeller Ch, 2006)

70

11. EXPERIMENT Insulin - like growth factor II receptor (IGF II) R /mannosa 6fosfátem modifikovaný receptor pro lidský albumin (M6P(28)HSA) R na povrchu hvězdicovitých buněk pankreatu (PSC) Nový cíl antifibrotické terapie ? 11.1. Cíl experimentu Cílem tohoto experimentu bylo identifikovat na povrchu pankreatických hvězdicovitých buněk laboratorního potkana receptor pro lidský albumin modifikovaný 28 mannosa 6fosfátovými zbytky (M6P(28)-HSA) a definovat jeho základní vlastnosti. Tento receptor je identický s Insulin-like growth factor receptorem typu II (IGF II) ( v dalším textu IGF II R). S ohledem na výsledky výzkumu tohoto receptoru u hvězdicovitých buněk jater ( Beljaars et al., 1999, 2001, 2006 a 2006 *) se IGF II receptor jeví jako potenciální cílový receptor pro zprostředkování selektivní antifibrotické terapie. Ta by měla regulovat činnost hvězdicovitých buněk pankreatu ( cíleně aktivovaných ) k zamezení či redukci produkce kolagenu. * Beljaars et al.: (M6P(28)-HSA) / IGFII receptor a hvězdicovité buňky jater 1) (M6P(28)-HSA) selektivně je vychytáván hvězdicovitými buňkami – in vivo (laboratorní potkan s fibrozou jater). Pacienti s cirhozou jater - (M6P(28)-BSA) je predominantně nakupený v játrech. 70% nitrojaterního signálu- v hepatic stellate cells. (Beljaars L, 1999) 2) Průkaz specifické vazby modifikovaného albuminu na IGFII R. Výrazná selektivní vazba albuminu k aktivovaným, ne klidovým hvězdicovitým buňkám .M6P(28)-HSA internalizován hvězdicovitými buňkami endocytozou. (Beljaars L, 2001) 3) Doxorubicin ( v porovnání s cisplatinou, chlorambucilem) - největší antiproliferativní efekt na kultivované hvězdicovité buňky jater laboratorního potkana (indukovaná chronická pankreatitida). DOX navázán na (M6P(28)-HSA).In vitro i in vivo ověřena selektivní vazba M6PHSA-DOX na aktivované hvězdicovité buňky jater, jejichž aktivace a míra proliferace byly významně potlačeny. (Greupink R, 2006) 4) Glitoxin má vysoký apoptozu – indukující potenciál ( imunohistochemická a mRNA verifikace v hepatálních vzrocích). Apoptoza byla v jaterních hvězdicovitých buňkách takto jednoznačně navozena. Poškozeny byly ale také Kuppferovy buňky a jaterní endotelie. K předcházení takovýchto nežádoucích vedlejších efektů je třeba vyvinout specifickou léčbu s vysoce selektivním účinkem pouze na hvězdicovité buňky jater. (Hagens WI, 2006)

11.2. Materiál ,metody 11.2.1. Reagencie Kolagenáza P, deoxyribonukleáza, polynukleotid kináza, poly- (dIdC) a Pefabloc ( Roche Diagnostics, Mannheim, Německo), Proteáza IX a α- SMA protilátka od Sigma – Aldrich (St.Louis, Missouri, USA), nitrocelulosa, peroxidasa značené protilátky, Nycodenz od Nycomed (Oslo, Norsko), protilátky ze Santa Cruz Biotechnologie (např.anti IGF II R) (Santa Cruz, California, USA). Hank´s buffered salt solution (HBSS), media a doplňky pro buněčnou kulturu byly získány od Life Technologies (Eggenstein, Něměcko) a Iscove modifikované Dulbecco medium (IMDM) a další podpůrné substance pro buněčnou kultivaci.

71

Housekeeping gen hypoxanthine phosphoribosyl transferasu (HPRT) a sekvence pro real time PCR byly získány od Biochrom (Berlín, Něměcko), horseradish peroxidase labelled antirabbit nebo antimouse Ig protilátky (použit Enhance Chemiluminiscence Plus Kit,Amersham Pharmacia Bitech). 11.2.2.Izolace a kultivace hvězdicovitých buněk pankreatu Hvězdicovité buňky byly izolovány z pankreatu LEW.1W inbredního laboratorního potkana (samec), podle postupu Apteho a kol. (citace 4). Následně byl pankreas vystaven digesci směsí kolagenázy P (0,05%), proteázy IX (0,02%) a deoxyribonukleazy (0,1%) v Hank´s buffered salt solution (HBSS). Hvězdicovité buňky pankreatu byly odděleny od acinů a dalších buněk centrifugací (12 % Nycodenz; centrifugace v 1400 g po 20 minut). Hvězdicovité buňky byly odebrány z povrchu vzniklého gradientu buněčných komponent ve zkumavce; omyty a resuspendovány v IMDM doplněném 10 % FCS, 1 % neesenciálních aminokyselin, 100 U/ml Penicilin a 100 ug/ml Streptomycin, a kultivovány na 6 komorových kultivačních miskách při 37 st. C a 5 % CO2 zvlhčovaném prostředí. Po změnách media (za 24 a 48 hodin) byla odstraněna většina kontaminujících buněk, a tím jsme získali téměř ( více než 95 %) čisté PSC kultury (ověřeno světlenou fázově kontrastní fluorescenční a elektronovou mikroskopií). Jakmile proliferující buňky kontinuálně obsáhly celý povrch kultivační komůrky, byly „sklizeny„ pomocí trypsinizace a znovu kultivovány ve shodných počátečních hustotách (koncentracích). Pro experimenty byly použity buněčné kultury maximálně první pasáže. Buněčné kultury izolovaných pancreatic stellate cells laboratorního potkana byly i nadále udržovány v IMDM obohacené o 10 % fetal calf serum (FCS), neesenciálními aminokyselinami, 100U/ml Penicilin a 100ug/ml Streptomycin, při teplotě 37 stupně Celsia a 5% CO2 vlhčeném prostředí. Metodika experimentů Imunofluorescenční mikroskopie Pro přípravu vzorků byly použity hvězdicovité buňky pankreatu laboratorního potkana, nepasážované. Odběr buněk k analýze probíhal dle schematu (rav. 3. a 6. den primokultury). Imunohistocheická analýza exprese alfaSMA a IGFIIR byla porovnána s kontrolním značením vzorku sekundární protilátkou. Western blotting Jednotlivé primokultury hvězdicovitých buněk pankreatu byly dle schematu experimentu postupně zpracovávány pro analýzu přítomnosti proteinu pro IGF 2 R v buňkách ( fixace vzorků směsí probenpuffer 50 %, H20 45%, Mercaptoethanol 5% + varem 3 minuty 100 °C), následné skladování vzorků při – 20 °C. 25 µg jednotlivých vzorků bylo separováno pomocí SDS- polyacrylamid gelové elektroforezy a přeneseno na nitrocelulozový filtr ( papír). Následně byly membrány promývány, fixovány s 1% bovine serum albumine ( BSA) a inkubovány s protein- specifickými protilátkami při teplotě + 4 ºC nebo po 2 hodiny při teplotě v místnosti. Po dalším omytí vzorku a jeho inkubaci s horseradish peroxidase labelled antirabbit nebo antimouse Ig protilátkou , byly bloty vyvolány ( použit Enhance Chemiluminiscence Plus Kit,Amersham Pharmacia Bitech). Při využití téhož vzorku k označení s dalšími protilátkami byly bloty očištěny pomocí inkubace v čistícím pufru (

72

62,5 mM Tris HCl,pH 6,7, 2% SDS, 100mM 2-mercaptoethanolu) při 50 ºC po dobu 30 minut. Výsledky zde prezentované jsou výsledkem nejméně tří nezávisle realizovaných experimentů. TaqMan analýza RT- PCR Celková RNA byla izolována z buněk za použití RNeasy kit podle pokynů výrobce.1 µg celkové RNA byl reverzně transkribován do cDNA (jak bylo popsáno v textu Sparmannové et al.) za použití oligo (dT)12-18 primeru a superscript II reverzní transkriptázu. Kvantifikace mRNA exprese byla zrealizována použití kompetitivní PCR pro housekeeping gen hypoxanthine phosphoribosyl transferasu (HPRT). Příslušné vzorky cDNA byly spolunavýšeny (navýšeny) s definovanou koncentrací syntetických DNA fragmentů jako vnitřní standart obsahující HPRT specifické primer sekvence. Molekulární hmotnost standardní a cDNA amplifikátů byly rozdílné, dovolující elektroforetickou separaci v 1,8 % gelu obsahujícím 0,3 µg/ml ethidium bromidu. Podle intenzity ethidium bromide fluorescence, která reflektuje HPRT expresi, byly různé cDNA vzorky poupraveny na stejné vstupní koncentrace. Hodnoty cílové cDNA byly měřeny pomocí quantitative real-time PCR za použití TaqManTM Universal PCR Master Mix a následující Assay-on-DeamndTM MGB probes v ABI Prism 7OOO sequence detekčním systému (Applied Biosystems). Hladiny exprese housekeeping genu byly kvantifikovány pomocí TaqManTM Rodent housekeeping gene Kontrol Reagens.Podmínky při PCR: 95°C po 10minut, 50 cyklů 15 sekund v 95º C / 1 minutu v 60ºC, PCR reakce byly realizovány minimálně třikrát opakovány s nezávislými vzorky. Statistická významnost byla ohodnocena za použití Wilcoxonova „rank sum test“. P ‹ 0,05 byla shledána jako statisticky významná. Každý experiment je reprezentován skupinou alespoň 3 nezávislých vzorků a výsledků.

11.3. Výsledky 11.3.1. Obrazová dokumentace -popis I Strana 75: imunofluorescence IGF II receptor A 3. den, B 3. den, C 6. den, D6. den kultivace ( D detail), primokultura PSC II strana 76 : Western blotting: porovnání exprese alfaSMA a IGF II R proteinu u aktivovaných hvězdicovitých buněk pankreatu v primokultuře III a, III b strana 77, 78: TaqMan real time PCR analýza exprese mRNA pro α SMA a IGF II R při aktivaci hvězdicovitých buněk pankreatu v primokultuře IVa, IVb, IVc strana 79, 80, 81: TaqMan real time PCR analýza exprese mRNA pro IGF IIR v odpovědi na cytokiny se známým biologickým efektem na hvězdicovité buňky pankreatu. V strana 82 : TaqMan real time PCR analýza exprese mRNA pro IGF IIR v odpovědi na cytokiny se známým biologickým efektem na hvězdicovité buňky pankreatu. Signifikantní inhibiční efekt IFNγ na expresi IGF II R mRNA. 11.3.2. Komentář Exprese IGF II receptoru na buněčném povrchu (imunofluorescence ) se signifikantně navýšila už v 6. dni v primární buněčné kultuře. Zvýšené množství přítomného proteinu pro IGF II R korelovalo s nárustem alfa aktinu hladké svaloviny (alfa smooth muscle actin, alfa

73

SMA) i při Western blotting analýze. Porovnáním množství messenger RNA pro IGF II R a alfa SMA (TaqMan analýza) byla potvrzena navýšená proteosyntéza obou, pro alfa SMA s maximem v 8. dnu a IGF II R již 6 .dnu primokultury. Po stimulaci vůdčími cytokiny se známým biologickým účinkem (IFNgamma interferon gamma, PDGF platelet derived growth factor, TGFbeta transforming growth factor beta) docházelo ke změnám množství messenger RNA pro IGF II R. (TaqMAn analýza). V rámci odpovědi na IFN gamma (ale ne pro PDGF a TGFbeta) došlo k snížení exprese mRNA pro IGF II R.

11.4. Závěr IGF II R je přítomen na povrchu hvězdicovitých buněk pankreatu laboratorního potkana. Aktivace hvězdicovitých buněk je asociována s časným nárůstem exprese IGF II receptoru Navýšení exprese tohoto receptoru časově mírně předchází aktivaci hvězdicovitých buněk (definována mírou exprese alfa SMA ). IGF IIR je tedy prokazatelně navýšeně exprimován u aktivovaných pancreatic stellate cells. Další studie s cílem objasnit jeho využití pro zamezení aktivace a fibroprodukce těchto buněk, jsou nezbytné.

11.5. Diskuze Retinoidy a manose 6- phosphate/ insulin-like growth factor –II receptor (M6P/IGF2R) jsou obecně známé svými důležitými pozicemi v kontrole buněčného růstu během embryonálního rozvoje a onkogeneze. In vitro experimentem bylo prokázáno zprostředkování retinoidem indukované apoptozy cestou M6P/IGF2 receptoru (specificky modifikované buňky myši IGFIIR +/-).(Kang JX, 1999) Spolu s dalším údajem specifikujícím intracelulární přenos IGFII receptorové stimulace cestou G proteinů (BALB/c 3T3 fibroblastech) (Nishimoto I.,1993) se nabízí otázka vztahu intracelulárního přenosu signálu IGFII stimulovaného receptoru a signálu indukovaného ATRA povrchovou stimulací ve hvězdicovitých buňkách pankreatu. IGFII/ M6P receptor je bohatě exprimován v gastrointestinálním traktu (in situ průkaz – laboratorní potkan), sehrává zde tedy pravděpodobně významnou roli. (Heinz-Erian P, 1991) Stejně jako IGFI receptor je hojně exprimován v oblasti ilea a kolon, společná je také obecná lokalizace v kryptách než epiteliálních buňkách klků. Jejich rozložení v rámci mukosy vykazuje odlišnosti, tedy jejich funkce nebude totožná. Nicméně jejich společné predominantní zastoupení v epiteliích krypt jim uděluje velmi pravděpodobnou úlohu v regulaci mitotické a růstové buněčné aktivity. ……..tímto lze také podpořit, že exprese IGF II receptoru bude navýšena u buněk aktivovaných (byť jen mitoticky), a skutečně by tedy mohl představovat jeden z významných znaků pro odlišení, identifikaci a terapeutické „zacílení„ aktivovaných hvězdicovitých buněk pankreatu (stejně tak jater).

74

75

76

77

78

79

80

81

82

12. ZÁVĚR 12.1. Souhrn výsledků experimentů prezentovaných v disertační práci Při zpracování tématiky hvězdicovitých buněk a hvězdicovitých buněk pankreatu ve vztahu ke chronické pankreatitidě bylo mým cílem: - podat ucelený a systematický přehled současných znalostí o tomto buněčném typu - objasnit vazbu mezi činností těchto buněk a rozvojem některých druhů pankreatopathií ( včetně chronické pankreatitidy), a prokázat tak jejich význam jako potenciální cíl pro zamýšlenou podskupinu antifibrotik - prokázat přítomnost hvězdicovitých buněk pankreatu v parenchymu pankreatu člověka ( v zoně fibrozy- desmoplastické reakce v okolí neoplastického procesu pankreatu) ( výsledek pokusu 10.2.1.) - ověřit stimulační vliv některých cytokinů na funkci izolovaných hvězdicovitých buněk pankreatu laboratorního potkana: PDGFβ stimuluje proliferaci PSC. ( výsledek pokusu 10.2.2.) - objasnit přítomnost specifického receptoru ( IGFIIR) na povrchu těchto buněk, jehož míra exprese se mění v závislosti na míře aktivace hvězdicovitých buněk pankreatu ( kultivované buňky pakreatu laboratorního potkana). ( část výsledku experimentu 11) - ověřit změnu exprese IGF II receptoru na povrchu izolovaných hvězdicovitých buněk pankreatu laboratorního potkana, v rámci odpovědi na stimulaci PSc cytokiny se známými biologickými účinky ( jednoznačný efekt např.IFNγ, ověření působení dalších cytokinů vyžaduje realizaci dalších serií pokusů) ( část výsledku experimentu 11) - -shromáždit doposud popsané významné vlastnosti hvězdicovitých buněk pankreatu, které jsou současnou experimentální pankreatologií považovány za možná místa terapeutických intervencí. Závěr: IGF II receptor je prokazatelně navýšeně exprimován na povrchu aktivovaných hvězdicovitých buněk pankreatu, je tedy adekvátním potenciálním cílem pro navázání nosiče ( mannosovými zbytky modifikovaný albumin) s účinným antifibrotikem, při zaměření takovéto léčby selektivně na aktivovanou formu těchto buněk.

12.2. Hvězdicovité buňky pankreatu ve vztahu k pankreatopatiím – současné trendy Aktivované hvězdicovité buňky vykonávají více funkcí v parenchymu pankreatu a až překvapivě bohatě komunikují s dalšími buněčnými typy přítomnými v pankreatu ( buňky rezidentní, vcestované; fyziologicky utvářené či neoplasticky se transformující) a ovlivňují tak vzájemně svoje aktivity. Hvězdicovité buňky pankreatu jsou především hlavními efektorovými buňkami fibroproduktivních procesů v rámci pankreatopatií. Proto jsou i hlavním cílem při hledání antifibrotické léčby. Vzhledem k existenci společných mechanismů v rozvoji hepatální a pankreatické fibrozy byly potenciální léky hledány a testovány do nedávné minulosti hlavně na modelech jaterní fibrozy. (Schuppan D, 2000) Do současnosti byla jako možná místa pro terapeutickou intervenci v buněčných aktivitách hvězdicovitých buněk pankreatu nalezena tato klíčová místa:

83

1/ aktivace hvězdicovitých buněk pankreatu a) Zabránění aktivace hvězdicovitých buněk nebo návrat zpět z myofibroblastového do klidového fenotypu PSC * Terapie zaměřená na ethanol a jeho metabolity, cytokiny jako PDGF a TGF-beta jako na klíčové aktivátory hvězdicovitých buněk pankreatu. * Derivát vitamínu A all-trans retinoic acid (ATRA) působí na hvězdicovité buňky komplexně, z několika úhlů a za pomocí různých signálních kaskád. Velmi důležitý je objev, že ATRA působí přinejmenším částečně jako antagonista aktivačního procesu. (Jaster R, 2003b) ATRA inhibuje PSC proliferaci a syntezu kolagenu, neblokuje ale buněčné fenotypové změny směrem k myofibroblastům. Velmi pravděpodobná součást přenosu biologických efektů ATRA na PSC je pomocí inhibice AP-1 signalizace. (Jaster R, 2003b ) Z těchto experimentů (a exaktního popisu zapojených intracelulárních, intranukleárních efektorů tohoto děje) vzešla hypotéza, že tyto deriváty vitamínu A jsou, přes jejich vazbu na nukleární receptory a regulaci genové exprese, zavzaty do udržování klidového fenotypu hvězdicovitých buněk pankreatu. Také výsledky nedávno realizovaných pokusů australské skupiny autorů s touto tematikou přinesly slibné závěry. (McCarroll JA, 2005) Retinol a jeho metabolity all-trans retinoic acid (ATRA) a 9-cis retinoic kyseliny (9-RA) totiž indukovaly klidový fenotyp v kultivovaných aktivovaných PSC, což je spojeno se signifikantním poklesem v aktivaci všech 3 tříd MAPK v PSC. Závěr z celého pokusu vzešlý, a sice že ethanolem indukované aktivaci hvězdicovitých buněk pankreatu PSC je možné úspěšně předejít retinolovou suplementací, staví vitamín A a jeho deriváty do pozice vážného kandidáta účinné antifibrotické terapie. Dalším příznivým efektem vitamínu A je, že navyšuje expresi scavenger receptoru CD36, který napomáhá fagocytoze a může aktivovat substance (peroxisome proliferators-activated receptor), které inhibují procesy probíhající v rámci zánětu. (Caulfield LE, 2004) * Hypolipidemika (konkrétně statiny) představují ve světovém trhu hlavní podíl finančních toků, čímž předběhla i léky onkologické (výsledky rok.r. 2005). Jak vyplývá z výsledků současných in vitro studií vlivu statinů na PSC, čeká je v budoucnosti nové terapeutické uplatnění- při léčbě fibroproduktivních onemocnění s cílem ovlivnit aktivitu hvězdicovitých buněk. Serií pokusů, publikovaných v r. 2003, byl prokázán in vitro inhibiční efekt lovastatinu na PSC. Lovastatin potlačil aktivaci Ras- ERK1/2 aktivaci i PDGF indukovanou translokaci RhoA. Lovastatin jasně interferoval s aktivací hvězdicovitých buněk pankreatu potlačením Ras signálu. (Jaster R, 2003), (DiMagno MJ, 2003), (Talukdar R, 2006) * Další inhibitory PSC aktivátorů a mitogenů V tomto ohledu, efektivita substancí interferujících s aktivitou stellate cells mitogenů (e.g.,PDGF), nebo cytokinů stimulujících ECM syntezu (zvláště TGF-beta), by mělo být testováno na zvířecích modelech pankreatické fibrozy. * Endothelinnoví antagonisté: Endothelin 1 působí na činnost hvězdicovitých buněk pankreatu cestou endothelinových receptorů A a B (ET(A), ET(B)), s odlišným výsledným efektem. Antagonista ET(A) receptoru blokuje endothelinem navozenou buněčnou kontrakci PSC, antagonista ET(B) receptoru blokuje endothelinem navozenou migraci PSC. Pro obě intracelulární kaskády je společná Rho kináza, jejímž blokováním byla blokována kontrakce i migrace PSC.

84

(Masamune A, 2005b) V současnosti je věnována pozornost přesnému mapování sítě endothelinem stimulovaných intracelulárních kaskád v PSC (in vitro,laboratorní potkan) * inhibiční efekty inhibitoru angiotenzin-konvertujícího enzymu (ACEI) (Kuno A, 2003) * stejně jako angiotensin II (ATII) receptorových antagonistů (Nakazawa T, 2003), na pankreatickou fibrozu je potřeba dále vyhodnotit * Zajímaví kandidáti jsou též cytokiny,které vykazují inhibiční efekty na hepatic stellate cellaktivaci, jako jsou interferony. (terapeutické výhledy u PSC uvedeny u popisu extracelulárně působících signálů) * Studie zabývající se regulacemi PSC aktivace na intracelulární úrovni identifikovaly klíčové mediátory stimulačních a inhibičních signálů. Cílové molekuly jako: - PPARgamma (PPARgamma ligandy indukují klidový fenotyp PSC (Troglitazone) ( viz výše, popis intracelulárních kaskád PSC) (Talukdar R, 2006), ( Jaster R, 2005) - MAP kinazy: MAP kinázy jsou hlavními signálními kaskádami, které jsou zapojené do přenosu aktivačních signálů…..terapie zaměřená na jejich regulaci, inhibici - PI 3-kinaza - Smad proteiny * Antioxidanty, inhibitory indukce intracelulárního oxidativního stresu Dalším cílovým procesem jako potenciálním bodem pro regulaci činnosti hvězdicovitých buněk je tedy mechanismus vzniku a šíření intracelulárního oxidativního stresu. (Yoo BM, 2005b ) Látky s prokázaným inhibičním účinkem na činnost hvězdicovitých buněk: -Ellagilová kyselina (přirozeně se vyskytující rostlinný derivovaný polyfenol obsažený v olivovém oleji, ovoci, oříšcích) in vitro inhibuje klíčové buněčné funkce a aktivaci PSCs. (Masamune A, 2005e). Efekt olivového oleje na zotavení jaterního parenchymu ze steatotického fenotypu , cestou ovlivnění aktivity hvězdicovitých buněk jater, je ozřejmen v textu(HernandezR,2005). - Curcumin, žlutý pigment obsažený v kari, Další polyfenolová sloučenina s antioxidančími a protifibrotickými schopnostmi. Curcumin inhiboval PDGF-indukovanou rpoliferaci, alfaSMA genovou expresi, IL-1beta a TNFalpha- indukovanou MCP-1 produkci, aktivaci aktivátor proteinu –1 (AP-1) a MAP kináz ( ERK, c-Jun N-terminal kinazy (JNK) a p38MAP kinazy), ale ne nukleárního faktoru kappaB , produkci kolagneu typu I, exresi genů pro kolagen typu I a III.Curcumin tedy inhiboval transformaci čertsvě izolovancýh buněk do myofibroblast-like fenotypu. (Masamune A,2005f) U hepatic stellate cells byl prověřen antioxidační efekt přirozeně se vyskytujících složek zedoary (Curcuma aromatica oil, Curcumol, beta-elemence, Curcumin) s vlivem na aktivitu hepatic stellate cells.(Jiang Y, 2005)Efekt Dahuang Zhechong Pill (DZP). (Pan ZH, 2005) - Inhibitory xantin- oxidázy: Xantin-oxidazou vytvořené volné radikály totiž mohou přímo aktivovat PSC. 2006 Mar;. Japan. (Tanioka H, 2006) - Blokátory : tvorby jednotlivých typů reaktivního kyslíku, ( reactive oxygen species, např.H2O2 ). H2O2 aktivuje aktivátor protein-1 a mitogen-aktivované protein kinázy v PSC. (Kikuta K, 2006) - Extrakt zeleného čaje epigallocatechin-3-galat (EGCG), hlavní komponenta extraktů zeleného čaje, který je znám jako silný polyfenolový antioxidant. EGCG inhiboval transformaci čerstvě indukovaných PSC buněk na aktivované myofibroblast-like genotyp, jejich migraci a proliferaci (in vivo model pankreatické fibrozy u Wistar labor.potkana). 85

(Masamune A, 2005a) (EGCG) inhiboval tyrosinovou fosforylaci PDGF beta-receptoru - ERK - phosphatidylinositol 3-kinazovou aktivační cestu. Další antioxidanty, s prověřeným inhibičním efektem na činnost hvězdicovitých buněk jater: - Salidrosid – zřejmě cestou inhibice lipidové peroxidace. (Zhang Y, 2005) - Adipose differentiation-related protein (ADRP) vstřebává mastné kyseliny s dlouhým řetězcem a formuje tukové kapénky v tuky-skladujících buňkách. Navýšení exprese na HSC labor. potkana indukovala formaci intracytoplazmatických tukových kapének v aktivovaných HSC, ale nevedla už ke konverzi dalších charakteristik tak, aby se aktivované hvězdicovité buňky transformovaly do klidové fenotypové formy. (Fukushima M, 2005) - proteásomové inhibitory: Bay11-7082 blokuje aktivaci NF-kappaB a navozuje apoptozu hvězdicovitých buněk jater. (Anan A, 2006) * COX2 inhibitory Role COX2 u chronické pankreatitidy: COX2 byla exprimována v kultuře aktivovaných PSC ale ne u izolovaných PSc ( PSC laboratorního potkana).Smad2/3- dependentní cesta hraje centrální roli v COX2 indukci od TGFbeta, IL-1beta a IL-6. IL-1beta a IL-6 podporují PSC aktivaci pomocí navýšení COX-2 exprese nepřímo Smad2/3- dependentní cestu cestou navýšeníTGF-beta 1 sekrece z PSC. Vzhledem k tomu, že COX2 je nezbytná k zpostředkování odpovědi aktivovaných hvězdicovitých buněk na prozánětlivé cytokiny, je pravděpodobné, že inhibitory COX2 aplikované PSC povedou k omezení reakce hvězdicovitých buněk na cytokiny a tím k redukci fibroprodukce PSC. (Aoki H, 2006) Role COX2 při rozvoji karcinomu pankreatu Cyklooxygenasa –2 ( COX-2) je klíčová modulační molekula u zánětu a neoplazie. COX2 je často přítomna v pankreatickém parenchymu při chronické pankreatitidě. Vysoká hladina COX-2 epxrese v PanIn lezích (pankreatické intraepiteliální neoplazii) předpokládá, že enzym by mohl být terapeutickým cílem v neinvazivním stadiu pankreatické kancerogenezy a použitelný pro chemoprevenci u chronické pankreatitidy. (Albazaz R, 2005) Pro karcinomem stimulovanou proliferaci hvězdicovitých buněk je nezbytná COX2 aktivace. (Yoshida S, 2005) b) Eliminace aktivovaných hvězdicovitých buněk – cíleným, vysoce specifickým navozením apoptozy takovýchto PSC Cílená eliminace aktivovaných PSC apoptozou by mohla být důležitá v ukončování reparativní odpovědi jako následku pankreatického poškození. (Klonowski- Stumpe H, 2002) Proto je tedy nutné najít specifický znak (např. povrchový buněčný receptor, jenž by byl významně navýšen na povrchu pouze aktivovaných hvězdicovitých buněk pankreatu, a byl by tak vhodným cílem pro vysoce selektivní doručení antifibrotického léku právě PSC). V průběhu aktivace hvězdicovitých buněk pankreatu jsme prokázali navýšení exprese IGF II receptoru, pro takovéto účely zůstává tedy mezi vhodnými kandidáty. 2/ terapie zaměřená ne regulaci proteosyntetické aktivity MMP, TIMP regulace 3/ transgenní terapie- modifikace imunitní reakce v pankreatu - Pomocí transgenně modifikované imunitní reakce (genový transfer interleukinu 4 adenovirem do pankreatu laboratorního potkana) se úspěšně podařilo inhibovat zánětlivou reakci u navozené chronické pankreatitidy laboratorního potkana. (Brock P,2005) - Camostat mesilat ( CM), perorální proteázový inhibitor. V Japonsku byl léta úspěšně používán k inhibici rozvoje a redukci tíže chronické pankreatitidy , nyní (2006) byl 86

retrospektivně prověřen mechanismus jeho účinku. Experiment realizován na in vivo modelu Wistar laboratornímupotkanovi indukované DBTC ( dibutylin dichlorid) chronické pankreatiitdy a in vitro kultivovaných PSC tohoto potkana. Tlumivý efekt Camostat mesilatu na potlačení rozvoje indukované fibrozy je zprostředkován cestou inhibice aktivit monocytů a hvězdicovitých buněk pankreatu. Exprese prokolagen alfa1 v PSC nebyla tímto lékem ovlivněna. (Emori Y, 2005), (Gibo J, 2005)

12.3. Závěr disertační práce Objev hvězdicovitých buněk pankreatu vložil do vědeckých záměrů popsat a léčit různá onemocnění slinivky břišní významného činitele, neboť tyto buňky ovlivňují činnost a podmínky pro existenci prakticky všech ostatních struktur pankreatu. Se získanými odpověďmi na položené otázky se otevírají nové pohledy na dynamiku dějů odehrávajících se při takovýchto onemocněních. V rámci obecnějších výzkumů pankreatopatií dosud nepodařilo nalézt kauzální, dostatečně účinnou a klinicky aplikovatelnou terapii pro tyto nemoci. Je velmi pravděpodobné, že syntézou výsledků dosavadních experimentů ( z různých oborů medicíny, přírodních věd , informatiky a rozvíjející se bioinformatiky) bude takovýto lék (léky), v časových horizontech odpovídajících současné efektivitě a rychlosti postupu výzkumů, definován. Myslím si, že v první linii výsledků těchto objevů budou látky s léčivým účinkem navozeným cestou regulace hvězdicovitých buněk pankreatu.

87

13. PODĚKOVÁNÍ Mé srdečné poděkování patří těm, kteří mně pomohli s realizací této práce formou odborných rad a konzultací, otevřené kritiky průběžných výsledků; spolupráce při uskutečnění jednotlivých experimentů; opravdové a dlouhodobé podpory a zájmu o mé vědecké aktivity. Jmenovitě pak: panu Prof.Dr. Petru Dítě, DrSc., přednostovi Interní hepatogastroenterologické kliniky FNB a mému PhD školiteli Prof. Dr. Robertu Jasterovi, PhD., vedoucímu laboratoře základního výzkumu při Gastroenterologické klinice Univerzitní nemocnice v Rostocku, Německo Dr. Brit Fitznerové, výzkumné pracovnici v laboratoři prof. Jastera paní Helze Schulzeové a slečně Katje Bergmannové, laborantkám laboratoře prof. Jastera doc. MUDr. Markétě Hermanové, PhD., lékařce Patologicko- anatomického ústavu Fakultní nemocnice Brno, Brno – Bohunice; a paní Haně Richetské, laborantce téhož ústavu paní Martě Lněničkové a Jiřině Menšíkové, laborantkám Anatomického ústavu Lékařské fakulty Masarykovy Univerzity v Brně paní Stanislavě Bártové , výtvarnici Anatomického ústavu Lékařské fakulty Masarykovy Univerzity v Brně, za pomoc s přípravami prezentací dílčích výsledků této práce na kongresech a mé rodině.

88

14. LITERATURA Akiyoshi H, Terada T.:Mast cell, myofibroblast and nerve terminal complexes in carbon tetrachloride-induced cirrhotic rat livers.J Hepatol. 1998 Jul;29(1):112-9. Albazaz R, Verbeke CS, Rahman SH, McMahon MJ.Cyclooxygenase-2 expression associated with severity of PanIN lesions: a possible link between chronic pancreatitis and pancreatic cancer. Pancreatology. 2005;5(4-5):361-9. Epub 2005 Jun 23. Anan A, Baskin-Bey ES, Bronk SF, Werneburg NW, Shah VH, Gores GJ.Proteasome inhibition induces hepatic stellate cell apoptosis. Hepatology 2006 Feb;43(2):335-44. Aoki H, Ohnishi H, Hama K, Ishijima T, Satoh Y, Hanatsuka K, Ohashi A, Wada S, Miyata T, Kita H, Yamamoto H, Osawa H, Sato K, Tamada K, Yasuda H, Mashima H, Sugano K.:Autocrine Loop between Transforming Growth Factor-{beta} 1and Interleukin-1{beta} through Smad3- and ERK-dependent Pathways in Rat Pancreatic Stellate Cells. Am J Physiol Cell Physiol 2005 Dec 21; [Epub ahead of print] Aoki H, Ohnishi H, Hama K, Shinozaki S, Kita H, Osawa H, Yamamoto H, Sato K, Tamada K, Sugano K. Cyclooxygenase-2 is required for activated pancreatic stellate cells to respond to pro-inflammatory cytokines. Am J Physiol Cell Physiol. 2006 Jul 12 Apte MV, Haber PS, Applegate TL et al. Periacinar stellate shaped cells in rat pancreas : identification, isolation, and culture. Gut: 1998; 43:128-33. Apte MV, Haber PS, Darby SJ, Rodgers SC, McCaughan GW, Korsten MA, Pirola RC, Wilson JS: Pancreatic stellate cells are activated by proinflammatory cytokines: implications for pancreatic fibrogenesis. Gut 1999, 44:534-541 Apte MV, Phillips PA, Fahmy RG, Darby SJ, Rodgers SC, McCaughan GW, Korsten MA, Pirola RC, Naidoo D, Wilson JS: Does alcohol directly stimulate pancreatic fibrogenesis ? Studies with rat pancreatic stellate cells. Gastroenterology 2000, 118:780-794 Apte M, Keating J, Phillips P, Wu MJ, Friess H, Buchler M, Korsten M, Wilson j: Endogenous expression of proinflamamtory cytokines and nerve growth factor by pancreati stellate cells- implications for fibrosis and neural changes in chronic pancreatitic ( abstract). Pancreas 2001, 23:428. Apte MV, Wislon JS: Stellate cells activation in alcoholic pancreatitis. Pancreas 2003, 27:311-315 Apte MV, Wilson JS.: Mechanisms of pancreatic fibrosis. Dig Dis 2004;22(3):273-9. Apte M, Wilson J:Johnson, Imrie: Pancreatic stellate cells,Pancreatic disease 2004, 2004b Apte MV, Park S, Phillips PA, Santucci N, Goldstein D, Kumar RK, Ramm GA, Buchler M, Friess H, McCarroll JA, Keogh G, Merrett N, Pirola R, Wilson JS.: Desmoplastic reaction in pancreatic cancer: role of pancreatic stellate cells. Pancreas. 2004 Oct;29(3):179-87. 2004c Armstrong T, Packham G, Murphy LB, Bateman AC, Conti JA, Fine DR, Johnson CD, Benyon RC, Iredale JP, Type I collagen promotes the malignant phenotype of pancreatic ductal adenocarcinoma., Clin Cancer Res. 2004 Nov 1;10(21):7427-37 Bachem MG, Meyer D, Melchior R, Sell KM, and Gressner AM :Activation of rat liver perisinusoidal lipocytes by transforming growth factors derived from myofibroblastlike cells. A potential mechanism of self perpetuation in liver fibrogenesis.J Clin Invest 1992 Jan; 89(1):19-27 Bachem MG, Schneider E, Gross H, et al. Identification, culture, and characterization of pancreatic stellate cells in rats and humans. Gastroenterology 1998; 115: 421-32 Bachem MG, Gundel M, Zhou S, Diaz F, Buchholz M, Sieh M, Schneiderhan W, Adler G: Functional interactions between carcinoma cells and stellate cells accelerate pancreas cancer progression ( abstract). Pancreas 2003, 27:370 , 2003a

89

Bachem MG, Schünemann M, Zhou S, Schneiderhan W, Buck A, Sieh M, Beger H, Gress T, Buchholz M, Adler G: Fibrosis associated with pancreatic cancer is the result of paracrine stimulation of stellate cells by carcinoma cells ( abstract). Pancreas 2003, 27:370, 2003b Bachem MG, Schunemann M, Ramadani M, Siech M, Beger H, Buck A, Zhou S, SchmidKotsas A, Adler G.: Pancreatic carcinoma cells induce fibrosis by stimulating proliferation and matrix synthesis of stellate cells. Gastroenterology 2005 Apr;128(4):907-21. Barry-Lane PA, Wilson SE, Cavanagh HD, Petroll WM, Jester JV.: Characterization of SV40-transfected cell strains from rabbit keratocytes. Cornea 1997 Jan;16(1):72-8 Bateman AC,Turner SM, Thomas KSA, McCrudden PR, Fine DR, Johnson PA, Johnson CD and Iredale JP, Apoptosis and proliferation of acinar and islet cells in chronic pancreatitis: evidence for differential cell loss mediating preservation of islet function. Gut. 2002 Apr Battaler R, Brenner DA: Liver fibrosis.J Clin Invest. 2005 February 1; 115(2): 209–218. Baud V, Karin M: Signal transduction by tumor necrosis factor and its relatives. Trends Ceel biol 2001, 11:372-377 Baumert J-T, Sparmann G, Emmrich J, Liebe S, Jaster R: Inhibitory effects of interferons on pancreatic stellate cell activation.World J Gastroenterol 2006 February 14; 12(6):896-901 Bednář: Patologie, učebnice pro LF, Avicenum 1982 Beljaars L, Molema G, Weert B, Bonnema H, Olinga P, Groothuis GM, Meijer DK, Poelstra K.:Albumin modified with mannose 6-phosphate: A potential carrier for selective delivery of antifibrotic drugs to rat and human hepatic stellate cells. Hepatology 1999 May;29(5):148693. Beljaars L, Olinga P, Molema G, de Bleser P, Geerts A, Groothuis GM, Meijer DK, Poelstra K.:Characteristics of the hepatic stellate cell-selective carrier mannose 6-phosphate modified albumin (M6P(28)-HSA). Liver 2001 Oct;21(5):320-8. Bhanot UK, Moller P, Hasel C:Dichotomy of fates of pancreatic epithelia in chronic pancreatitis: apoptosis versus survival. 2006 Jul 4. Trends Mol Med. 2006 Aug; 12(8): 351-7. Epub 2006 Jul 7 Bray F, Sankila R, Ferlay J, Oarkin DM. Estimates of cancer incidence and mortality in Europe in 1995 . Eur J Cancer 2002 Jan; 38 (1) 19 :99-166. Breitkopf K, Godoy P, Ciuclan L, Singer MV, Dooley S.: TGF-beta/Smad Signaling in the Injured Liver. Gastroenterol. 2006 Jan;44(1):57-66. Brock P, Sparmann G, Ritter T, Jaster R, Liebe S, Emmrich J: Interleukin-4 gene transfer into rat pancreas by recombinant adenovirus.Scand J Gastroenterol. 2005 Sep; 40(9):1109-17 Buchholz M, Kestler HA, Holzmann K, Ellenrieder V, Schneiderhan W, Siech M, Adler G, Bachem MG, Gress TM.: Transcriptome analysis of human hepatic and pancreatic stellate cells: organ-specific variations of a common transcriptional phenotype. J Mol Med. 2005 Oct;83(10):795-805. Epub 2005 Jun 23. Buniatian GH, Hartmann HJ, Traub P, Wiesinger H, Albinus M, Nagel W, Shoeman R, Mecke D, Weser U: Glial fibrilary acidic protein-positive cells of the kidney are capable of raising a protective biochemical barrier similar to asrocytes:expression of metallothionein in podocytes.Anat Rec 2002Aug 267:296-306 Caulfield LE, Richard SA, Black RE : Undernutrition as an Underlying Cause of Malaria Morbidity and Mortality in Children Less Than Five Years Old. The Malaria Burden: Clinical and Epidemiological Impact, Am J Trop Med Hyg 2004 Aug; 71 ( 2 suppl): 55-63. Review Csemy L, Nespor K., European action plan on alcohol in teh Czech Republic –no substantional progress, Cas Lek Cesk 2004; 143(5):339-41 Cunha JE, de Lima MS, Jukemura J, Penteado S, Jureidini R, Patzina RA, Siqueira SA. Unusual clinical presentation of annular pancreas in the adult. Pancreatology, 2005; 5(1):815.Epub 2005 Mar 16

90

Derynck R, Zhang Y, Feng XH: Smads: transcriptional activators of TGF-beta responses. Cell 1998, 95:737-740 Desi Pan, Xiaoning Zhe, Sandhya Jakkaraju, Gregory A. Taylor, and Lucia Schuger: P311 induces a TGF-ß1-independent, nonfibrogenic myofibroblast phenotype. J Clin Invest. 2002 November 1; 110(9): 1349-1358. Diep QN, El Mabrouk M, Cohn JS, Endemann D, Amiri F, Virdis A, Neves MF, Schiffrin EL.: Structure, endothelial function, cell growth, and inflammation in blood vessels of angiotensin II-infused rats: role of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma. Cirucaliton 2002 May 14;105(19):2296-302. DiMagno MJ, DiMagno EP.:Chronic pancreatitis. Curr Opin Gastroenterol 2003 Sep;19(5):451-7. Dítě P, Chronická pankreatitida – definice, Sborník přednášek, Aktuální gastroenterologie X, IV/02, Nemocnice Na Homolce), 2002a Dítě P. et al., Chronická pankreatitida, 2002b, Galén, ISBN 80 7262 1483, první vydání 2002 Dítě P.,Chronická kalcifikující pankaretitida a exokrinní pankreatická funkce, Vybrané kazuistiky z oblasti gastroenterologie, 1/2002, Berlin-Chemie Menarini Group, 2002c Dooley S, Hamzavi J, Breitkopf K, Wiercinska E, Said HM, Lorenzen J, Ten Dijke P, Gressner AM: Smad7 prevents activation of hepatic stellate cells and liver fibrosis in rats. Gastroenterology 2003, 125:178-191 Emori Y, Mizushima T, Matsumura N, Ochi K, Tanioka H, Shirahige A, Ichimura M, Shinji T, Koide N, Tanimoto M.Camostat, an oral trypsin inhibitor, reduces pancreatic fibrosis induced by repeated administration of a superoxide dismutase inhibitor in rats. J Gastroenterol Hepatol 2005 Jun;20(6):895-9. Esposito I, Penzel R, Chaib-Harrireche M, Barcena U, Bergmann F, Riedl S, Kayed H, Giese N, Kleeff J, Friess H, Schirmacher P.: Tenascin C and annexin II expression in the process of pancreatic carcinogenesis. J Pathol 2006 Jan 31; [Epub ahead of print] Etemad B, Whitcomb DC: Chronic pancreatitis:diagnosis, classification and new genetic developments. Gastroenterology 2001, 120:682-707 Fan J, Shen H, Sun Y, Li P, Burczynski F, Namaka M, Gong Y:Bone morphogenetic protein 4 mediates bile duct ligation induced liver fibrosis through activation of Smad1 and ERK1/2 in rat hepatic stellate cells. J Cell Physiol 2006 Jan 30; [Epub ahead of print] Fine, Shek:Johnson, Imrie: Pancreatic disease, 2004 Fitzner B, Sparmann G, Emmrich J, liebe S, jaster R: Involvement of AP-1 proteins in pancreatic stellate cell activation in vitro. Int J Colorectal Dis 2004, 19:414-420 Fitzner B, Walzel H, Sparmann G, Emmrich J, Liebe S, Jaster R.: Galectin-1 is an inductor of pancreatic stellate cell activation. Cell Signal 2005 Oct;17(10):1240-7. Epub 2005 Jan 21. Friedman SL: The cellular basis of hepatic fibrosis. Mechanisms and treatment strategies. N Engl J Med 1993, 328:1828-1835 Frossard JL, Past CM: Experimental acute pancreatitis:new insight into the pathophysiology. Front Biosci 2002, Jan 7:d275-87 Fuja TJ, Probst-Fuja MN, Titze IR. Transdifferentiation of vocal-fold stellate cells and alltrans retinol-induced deactivation. Cell Tissue Res 2005 Dec;322(3):417-24. Epub 2005 Jul 27. Fukushige H, Doi Y, Kudo H, Kayashima K, Kiyonaga H, Nagata T, Itoh H, Fujimoto S.:Synthesis and receptor sites of endothelin-1 in the rat liver vasculature. Anat Rec. 2000 Aug 1;259(4):437-45. Fukushima M, Enjoji M, Kohjima M, Sugimoto R, Ohta S, Kotoh K, Kuniyoshi M, Kobayashi K, Imamura M, Inoguchi T, Nakamuta M, Nawata H.Adipose differentiation related protein induces lipid accumulation and lipid droplet formation in hepatic stellate cells. In Vitro Dev Biol Anim. 2005 Nov-Dec;41(10):321-4.

91

Galli A, Crabb D, Price D, Ceni E, Salzano R, Surrenti C, Casini A: Peroxisome proliferatoractivated receptor γ transcriptional regulation is involved in plateet-derived growth factorinduced proliferation of human hepatic stellate cells. Hepatology 2000, 31:101-108 Galli A, Crabb DW, Ceni E, Salzano R, Mello T, Svegliati-Baroni G, Ridolfi F, Trozzi L, Surrenti C, Casini A: Antidiabetic thiazolidinediones inhibit collagen synthesis and hepatic stellate cells activation in vivo and in vitro, Gastroenterology 2002, 122:1924-1940 Gao R, Brigstock DR.: A novel integrin {alpha}5{beta}1: binding domain in module 4 of connective tissue growth factor promotes adhesion and migration of activated pancreatic stellate cells. Gut 2005 Dec 16; [Epub ahead of print] 2005a Gao R, Brigstock DR.: Connective tissue growth factor (CCN2) in rat pancreatic stellate cell function: integrin alpha5beta1 as a novel CCN2 receptor. Gastroenterology 2005 Sep;129(3):1019-30. 2005b Gibo J, Ito T, Kawabe K, Hisano T, Inoue M, Fujimori N, Oono T, Arita Y, Nawata H. Camostat mesilate attenuates pancreatic fibrosis via inhibition of monocytes and pancreatic stellate cells activity.Lab Invest. 2005 Jan;85(1):75-89. Gilles CH, Newgreen DF, Sato H, Thompson EW:Matrix metalloproteases and epithelial-tomesenchymal transition: implication for carcinoma metastasis. Landes bioscience : web zdroj www.eurekah.com. 2005 Go VL, Gukovskaya A, Pandol SJ. Alcohol and pancreatic cancer.Alcohol 2005 Apr; 35(3):205-11 Gonzalez – Abraldes J, Albillos A, Banares , et al. Randomized comparison of long- term losartan versus propranolol in lowering portal pressure in cirrhosis. Gastroenterology 2001;121:382-8. Gressner AM, Bachem MG: Molecular mechanisms of liver fibrogenesis – a homage to the role of activated fat- storing cells. Digestion 1995,56:335-346 Greupink R, Bakker HI, Bouma W, Reker-Smit C, Meijer DK, Beljaars L, Poelstra K.:The antiproliferative drug doxorubicin inhibits liver fibrosis in bile duct-ligated rats and can be selectively delivered to hepatic stellate cells in vivo.J Pharmacol Exp Ther. 2006 May, 317(2): 514-21. Epub 2006 Jan 26 Grzesiak JJ, Bouvet M., The alpha2beta1 integrin mediates the malignant phenotype on type I collagen in pancreatic cancer cell lines., Br J Cancer. 2006 May 8;94(9):1311-9 Gukovskaya AS, Gukovsky I, Zaninovic V, Song M, Sandoval D, Gukovsky S, Pandol SJ: Pancreatic acinar cells produce, release, and respond to tumor nacrosis factor-alpha. Role in regulating cell death and pancreatitis. J. Clin Invest 1997,100:1853-1862. Hagens WI, Olinga P, Meijer DK, Groothuis GM, Beljaars L, Poelstra K.:Gliotoxin nonselectively induces apoptosis in fibrotic and normal livers. Liver Int, 2006 Mar;26(2):232-9. Hama K, Ohnishi H, Yasuda H, Ueda N, Masima H, Satoh Y, Hanatsuka K, Kita H, Onashi A, Tamada K, Sugano K? Angiotensin II stimulates DNA synthesis of rat pancreatic cells by activating ERK through EGF receptor transactivation. Biochem Biophys Res Commun 2004, 315:905-911 Hama K, Ohnishi H, Aoki H, Kita H, Yamamoto H, Osawa H, Sato K, Tamada K, Mashima H, Yasuda H, Sugano K.:Angiotensin II promotes the proliferation of activated pancreatic stellate cells by Smad7 induction through a protein kinase C pathway. Biochem Biophys Res Commun.2006 Feb 17;340(3):742-50. Epub 2005 Dec 20. Hasel C, Durr S,Rau B, Stra“ter J, Schmid RM, Walzak ,Bachem MG, Mo“ller P: In chronic pancreatitis, widespread emergence of TRAIL receptors in epithelia coincides with neoexpression of TRAIL by pancreatic stellate cells of early firbotic areas. Lab Invest 2003 Jun 83:825-36 Heinz-Erian P, Kessler U, Funk B, Gais P, Kiess W.:Identification and in situ localization of the insulin-like growth factor-II/mannose-6-phosphate (IGF-II/M6P) receptor in the rat

92

gastrointestinal tract: comparison with the IGF-I receptor. Endocrinology. 1991 Oct;129(4):1769-78. Hernandez R, Martinez-Lara E, Canuelo A, del Moral ML, Blanco S, Siles E, Jimenez A, Pedrosa JA, Peinado MA.:Steatosis recovery after treatment with a balanced sunflower or olive oil-based diet: involvement of perisinusoidal stellate cells. World J Gastroenterol 2005 Dec 21;11(47):7480-5 Hisada S, Shimizu K, Shiratori K, Kobayashi M.: Peroxisome proliferator-activated receptor gamma ligand prevents the development of chronic pancreatitis through modulating NFkappaB-dependent proinflammatory cytokine production and pancreatic stellate cell activation. Rocz Akad Med Bialymst. 2005;50:142-7. Horký D, Čech S, Trávník P:Obecná histologie, LF MU, Brno 1995, str, 55- 73, ISBN 80210-1254-4 Horký D, Dítě P et al., Chronická pankreatitida, Galén, ISBN 80 7262 1483, první vydání 2002 Chang L,Karin M: Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature 2001, 410:37-40 Chappell MC, Millsted A, Diz DI, Brosnihan KB, Ferrario CM: Evidence for an intrinsic angiotensin system in the canine pancreas. J Hypertens 1991,9:751-759 Ihle JN: The Stat family in cytokine signaling. Curr Opin Cell Biol 2001, 13:211-217 Ikejima K, Takei Y, Honda H, Hirose M, Yoshikawa M, Zhang YJ, Lang T, Fukuda T, Yamashina S, Kitamura T, Sato N.:Leptin receptor-mediated signaling regulates hepatic fibrogenesis and remodeling of extracellular matrix in the rat. Gastroenterology.2002 May;122(5):1399-410. Inoue M, Yanagiasawa M, Kimura S, et al.. the human endothelin family: three structurally and pharmacologically distinct isopeptides predicted by three separate genes. Porc Natl Aca Sci USA 1989;86:2863-7 Jaster R, Sparmann G, Emmrich J, Liebe S: Extracellular signal regulated kinases are key mediators of mitogenic signals in rat pancreatic stellate cells.Gut 2002;51:579-584 Jaster R, Brock P, Sparmann G, Emmrich J, Liebe S.:Inhibition of pancreatic stellate cell activation by the hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor lovastatin. Biochem Pharmacol. 2003 Apr 15;65(8):1295-303. Jaster R, Hilgendorf I, Fitzner B, Brock P, Sparmann G, Emmrich J, Liebe S.: Regulation of pancreatic stellate cell function in vitro: biological and molecular effects of all-trans retinoic acid. Biochem Pharmacol. 2003 Aug 15;66(4):633-41. 2003b Jaster R, Molecular regulation of pancraetic stellate cell function, Review.Molecular Cancer 2004 Oct 6;3:26. Jaster R, Lichte P, Fitzner B, Brock P, Glass A, Karopka T, Gierl L, Koczan D, Thiesen HJ, Sparmann G, Emmrich J, Liebe S.:Peroxisome proliferator-activated receptor gamma overexpression inhibits pro-fibrogenic activities of immortalised rat pancreatic stellate cells. J Cell Mol Med. 2005 Jul-Sep;9(3):670-82. Jesnowski R, Furst D, Ringel J, Chen Y, Schrodel A, Kleeff J, Kolb A, Schareck WD, Lohr M.: Immortalization of pancreatic stellate cells as an in vitro model of pancreatic fibrosis: deactivation is induced by matrigel and N-acetylcysteine. Lab Invest. 2005 Oct;85(10):127691. Jiang Y, Li ZS, Jiang FS, Deng X, Yao CS, Nie G. Effects of different ingredients of zedoary on gene expression of HSC-T6 cells.World J Gastroenterol 2005 Nov 21;11(43):6780-6. Johnson CD and Imrie CW:Pancreatic disease. Basic Science and Clinical Management.© Springer- Verlag Londn Limited 2004, ISBN 1-85233-711-7 Johnson SJ, Burr AW,Toole K,Dack CL, Mathew J, Burt AD :Macrophage and hepatic stellate cell responses during experimental hepatocarcinogenesis, J Gastroenterol Hepatol 1998 , Feb, 13(2): 145-51

93

Kang JX, Bell J, Beard RL, Chandraratna RA.:Mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor mediates the growth-inhibitory effects of retinoids. Cell Growth Differ. 1999 Aug;10(8):591-600. Karin M, Liu Z, Zandi E: AP-1 function and regulation. Curr Opin Cell Biol 1997,9:240-246 Karin M, Delhase M: The I kappa B kinase (IKK) and NF-kappa B: key elements of proinflammatory signalling . Semin Immunol 2000, 12:85-98 Kato R, Ishikawa T, Kamiya S, Oguma F, Ueki M, Goto S, Nakamura H, Katayama T, Fukai F., A new type of antimetastatic peptide derived from fibronectin., Clin Cancer Res 2002 Jul;8(7):2455-62. Keith RG, Definition and classification of chronic pankreatitis,World J Surg. 2003 Nov;27(11):1172-4. Epub 2003 Oct 13. Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR: Apoptosis: a basic biological phenomenon with wideranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer.1972 Aug, 26(4):239-57 Kikuta K , Masamune A, Satoh M, Suzuki N, Satoh K, Shimosegawa T.:c-Jun N kinase inhbition activates rat pancreatic stellate cells. PancreasWeb 24/09/04 Kikuta K, Masamune A, Satoh M, Suzuki N, Satoh K, Shimosegawa THydrogen peroxide activates activator protein-1 and mitogen-activated protein kinases in pancreatic stellate cells. Mol Cell Biochem. 2006 Apr 22; Kim CD, Pancreatitis--etiology and pathogenesis, Korean J Gastroenterol 2005, Nov;46(5):321-32. Klonowski- Stumpe H, Fisher R, Reinehr R, Lütchen R, Hässinger D: Apoptosis in activated rat pancreatic stellate cells. Am. J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2002, 283:G819-826 Knittel T, Kobold D, Saile B, Grundmann A, Neubauer K, Piscaglia F, Ramadori G.: Rat liver myofibroblasts and hepatic stellate cells: different cell populations of the fibroblast lineage with fibrogenic potential. Gastroenterology. 1999 Nov;117(5):1205-21. Ko SH, Hong OK, Kim JW, Ahn YB, Song KH, Cha BY, Son HY, Kim MJ, Jeong IK, Yoon KH.: High glucose increases extracellular matrix production in pancreatic stellate cells by activating the renin-angiotensin system. J Cell Biochem 2006 Jan 11; [Epub ahead of print] Korc M, Chandarsekar B, Yamanaka Y, Friess H, Buchier M, Beger H.G. Overexpression of the epidermal growth factor receptor in human pancreatic cancer is associated with concomitant increases of levels of epidermal growth factor alpha. J Clin Invest,90:135260,1992 Kordes C, Brookmann S, Haussinger D, Klonowski-Stumpe H.: Differential and synergistic effects of platelet-derived growth factor-BB and transforming growth factor-beta1 on activated pancreatic stellate cells. Pancreas 2005 Aug;31(2):156-67. Krause ML, Hildebrand PB, Timke C, Folsch UR, Schmidt WE: TGFβ1 autocrine growth control in isolated pancreatic fibroblastoid cells/ stellate cells in vitro. Regulatory peptides 2000, 90:47-52 Kruse C, Birth M, Rohwedel J, Assmuth K, Goepel A, Wedel T: Pluripotency of adult stem cells derived from human and rat pancreas. Appl Phys A 2004, 79:1617-1624 Křivohlavý J., Psychologie nemoci Kuno A, Yamada T, Masuda K, Ogawa K, Sogawa M, Nakamura S, Nakazawa T, Ohara H, Nomura T, Joh T, Shirai T, Itoh M: Angiotenzin-converting enzyme inhibitor attenuates pancreatic inflammation and fibrosis in male Wistar Bonn/Kobori rats. Gastroenterology 2003, 124:1010-1019 Lalazae A, Wong L, Yamasaki G, Friedman SL: Early genes induced in hepatic stellate cells during wound healing.Gene 1997 Aug 195:235-43 Leung PS, Chan HC, Fu LX, Wong PY. Localization of angiotenzin II receptor subtypes AT1 and AT2 in the pancreas of rodents. J Endocrinol 1997 ,153:269-274

94

Lewis TS, Shapiro PS, Ahn NG: Signal transduction through MAP kinase cascades. Adv Cancer Res 1998, 74:49-139 Li CH, Piao DM, Xu WX, Yin ZR, Jin JS, Shen ZS.:Morphological and serum hyaluronic acid, laminin and type IV collagen changes in dimethylnitrosamine-induced hepatic fibrosis of rats. World J Gatsroenterol 2005 Dec 28;11(48):7620-4. Liu X, Hu H, Yin JQ.: Therapeutic strategies against TGF-beta signaling pathway in hepatic fibrosis. Liver Int 2006 Feb;26(1):8-22. Liu WB, Wang XP, Wu K, Zhang RL.:Effects of angiotensin II receptor antagonist, Losartan on the apoptosis, proliferation and migration of the human pancreatic stellate cells. World J Gastroenterol 2005 Nov 7;11(41):6489-94. Lobo MV, Huerta L, Ruiz-Velasco N, Teixeiro E, de la Cueva P, Celdran A, Martin-Hidalgo A, Vega MA, Bragado R.: Localization of the lipid receptors CD36 and CLA-1/SR-BI in the human gastrointestinal tract: towards the identification of receptors mediating the intestinal absorption of dietary lipids. J Histochem Cytochem. 2001 Oct;49(10):1253-60. Longnecker DS: Pathology and pathogenesis of diseases of the pancreas. Am J Pathol 1982, 107:103-121 Löhr M.-J., Heinemann V., Friess H., Pancreatic cancer,str. 24, UNI-MED Verlag AG, D28323 Bremen, ISBN 3-89599-870-2, 2005 Lu G, Shimizu I, Cui X, Itonaga M, Tamaki K, Fukuno H, Inoue H, Honda H, Ito S: Interferon- alpha enhances biological defense activities against oxidative stress in cultured rat hepatocytes and hepatic stellate cells. J. med Invest 2002, 49:172-181 Lu L, Zeng M, Li J,Hua J,Mao Y, Fan Z,Qiu D ,Effects of lipid on low- denisty and highdensity receptors in hepatic stellate cell from rat liver.Zhongua Gan Zang Bing Za Zhi 2000 Jun 8:164-6 Lu SC,Tsukamoto H, Mato JM,Role of abnormal methionine metabolism in alcoholic liver injury,Alcohol 2002 Jul;27(3):155-62 Luiken JJ, Arumugam Y, Bell RC, Calles-Escandon J, Tandon NN, Glatz JF, Bonen A.: Changes in fatty acid transport and transporters are related to the severity of insulin deficiency. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2002 Sep;283(3):E612-21. Lurje A: The topography of the extrahepatic biliary pasages with the reference to dangers of surgical technic, Annals of Surgery,vol. 105, Feb. 1937, No2 Luttenberger T.,Schmid-Kotsas A., Menke A., Siech M., Beger H., Adler G, Grünert A, Bachem MG: Platelet-derived growth factors stimulace proliferation and extracellular matrix synthesi of pancreatic stellate cells: implications of pathogenesis of pankreas fibrosis.Lab Invest 2000,80:47-55 Lüllmann H, Mohr K, Ziegler A, Bieger D: Barevný atlas farmakologie.© Georg Thieme Verlag, 2000 Transaltion © Grada Publishing spol. sr.o. 2001,ISBN 80-7169-973-X Mallat A, Préaux AM, Serradeil-Le Gal C, Raufaste D, Gallois C, Brenner DA, Bradham C, Maclouf J, Iourgenko V, Fouassier L, Dhumeaux D, Mavier P, and Lotersztajn S:Growth inhibitory properties of endothelin-1 in activated human hepatic stellate cells: a cyclic adenosine monophosphate-mediated pathway. Inhibition of both extracellular signal-regulated kinase and c-Jun kinase and upregulation of endothelin B receptors. Clin Invest. 1996 December 15; 98(12): 2771-2778. Marti A, Berraondo B, Martinez JA.:Leptin: physiological actions. J physiol Biochem.1999 Mar;55(1):43-9. Masamune A, Kikuta K, Satoh M,Sakai Y,Satoh A,Shimosegawa T: Ligands of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma block activation of pancreatic stellate cells.J Biol Chem 2002 Jan 277:141-7

95

Masamune A, Kikuta K,Satoh M, Satoh A, Shimosegawa T:Alcohol activates activator protein-1 and mitogen-activated protein kinases in rat pancreatic stellate cells. J Pharmacol Exp Ther 2002,302:36-42 2002b Masamune A, Satoh M, Kikuta K, Suzuki N, Shimosegawa T: Establishment and characterization of a rat pancreatic stellate cell line by spontaneous immortalization. World J Gastroenterol 2003, 9:2751-2758 Masamune A, Kikuta K, Satoh M, Kume K, Shimosegawa T.:Differential roles of signaling pathways for proliferation and migration of rat pancreatic stellate cells. Tohoku J Exp Med. 2003 Feb;199(2):69-84. 2003b Masamune A, Kikuta K, Satoh M, Satoh A, Shimosegawa T: Differential roles of signalling pathways for proliferation and migration of rat pancraetic stellate cells. Tohoku J Exp Med 2003, 199:69-84, 2003c Masamune A, Satoh M, Kikuta K, Sakai Y, Satoh A, Shimosegawa T: Inhibiton of p38 mitogen-activated protein kinase blocks activation of rat pancreatic stellate cells. J Pharmacol Exp Ther 2003, 304:8-14 , 2003d Masamune A, Kikuta K, satoh M, Satoh K, Shimosegawa T: Rho kinase inhibitors block activation of pancreatic stellate cells. Br J Phramacol 2003, 140:1292-1302, 2003e Masamune A, Kikuta K, Satoh K, Shimosegawa T: A c-Jun NH2-terminal kinase inhibitor SP600125 (Anthra1,9-cd] pyrazole-6 (2H)-one) blocks activation of pancreatic stellate cells. J Pharmacol Exp Ther 2004, 310: 520-7 Masamune A, Kikuta K, Satoh M, Suzuki N, Shimosegawa T.:Green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate blocks PDGF-induced proliferation and migration of rat pancreatic stellate cells. World J Gastroenterol 2005 Jun 14;11(22):3368-74. 2005a Masamune A, Satoh M, Kikuta K, Suzuki N, Shimosegawa T.Endothelin-1 stimulates contraction and migration of rat pancreatic stellate cells. World J Gastroenterol 2005 Oct 21;11(39):6144-51.2005b Masamune A, Satoh M, Kikuta K, Suzuki N, Shimosegawa T.:Activation of JAK-STAT pathway is required for platelet-derived growth factor-induced proliferation of pancreatic stellate cells. World J Gastroenterol 2005 Jun 14;11(22):3385-91. 2005c Masamune A, Satoh M, Hirabayashi J, Kasai K, Satoh K, Shimosegawa T.: Galectin-1 induces chemokine production and proliferation in pancreatic stellate cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2005 Dec 22; [Epub ahead of print] 2005d Masamune A, Satoh M, Kikuta K, Suzuki N, Satoh K, Shimosegawa T.Ellagic acid blocks activation of pancreatic stellate cells. Biochem Pharmacol 2005 Sep 15;70(6):869-78. 2005e Masamune A, Suzuki N, Kikuta K, Satoh M, Satoh K, Shimosegawa T.Curcumin blocks activation of pancreatic stellate cells. J Cell Biochem 2005 Nov 17; [Epub ahead of print] (2005f) Mayor S: Alcohol and drug misuse sweeping the world, says WHO.BMJ 2001, February 24; 322(7284):449 McCarroll JA, Phillips PA, Park S, Doherty E, Pirola RC, Wilson JS, Apte MV.:Pancreatic stellate cell activation by ethanol and acetaldehyde: is it mediated by the mitogen-activated protein kinase signaling pathway? Pancreas 2003 Aug;27(2):150-60. McCarroll JA, Phillips PA, Kumar RK, Park S, Pirola RC, Wilson JS, Apte MV: Pancreatic stellate cells migration: role of the phosphaidylinositol 3-kinase (PI3-kinase) pathway. Biochem Phramacol 2004, 67:1215-25 McCarroll JA, Phillips PA, Santucci N, Pirola RC, Wilson JS, Apte MV. :Vitamin A inhibits pancreatic stellate cell activation: implications for treatment of pancreatic fibrosis. Gut 2006 Jan;55(1):79-89. Epub 2005 Jul 25. Comment in: Gut. 2006 Jan;55(1):12-4.

96

Meurer SK, Tihaa L, Lahme B, Gressner AM, Weiskirchen R.:Identification of endoglin in rat hepatic stellate cells: new insights into transforming growth factor beta receptor signaling. J Biol Chem 2005 Jan 28;280(4):3078-87. Epub 2004 Nov 10. Mews P, phillips P, Fahmy R, Pirola R, Wilson J, Apte M: Pancreatic stellate cells respond to inflammatory cytokines:potential role in chronic pancreatitis.Gut 2002 Apr 50:535-41 Michaud DS, Epidemiology of pancreatic cancer, Minerva Chir. 2004, Apr;59(2):99-111, Miyahara T, Schrum L Rippe R, Xiong S, Yee HF Jr, Motomura K, Anania FA, Willson TM, Tsukamoto H: Peroxisome proliferator-activated receptors and hepatic stellate cell activation. J biol Chem 2000, 275:35715-35722 Müeller Ch, Emmrcih J, Jaster R, Braun D, Liebe S, Sparmann G: Cis- hydroxyprolineinduced inhibition of pancreatic cancer cell growth is mediated by endoplasmic reticulum stress. World J Gastroenterol 2006 March 14; 12(10):1569-1576 Nagashio Y, Asaumi H, Watanabe S, Nomiyama Y, Taguchi M, Tashiro M, Sugaya T, Otsuki M: Angiotensin II type I receptor interaction is an important regulator for the development of pancreatic fibrosis in mice. Am. J physiol Gastrointest Liver Physiol 2004, 287:G170-177 Nakagawa Y, Nishida M, Nozaki S, Miyagawa J, Nakagawa T, Tamura R, Matsumoto K, Kameda-Takemura K, Yamashita S, Matsuzawa Y.: CD36, a novel receptor for oxidized lowdensity lipoproteins, is highly expressed on lipid-laden macrophages in human atherosclerotic aorta.Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1999 May;19(5):1333-9. Nakagawa-Toyama Y, Yamashita S, Miyagawa J, Nishida M, Nozaki S, Nagaretani H, Sakai N, Hiraoka H, Yamamori K, Yamane T, Hirano K, Matsuzawa Y.: Localization of CD36 and scavenger receptor class A in human coronary arteries--a possible difference in the contribution of both receptors to plaque formation.Atherosclerosis. 2001 Jun;156(2):297-305. Nakata K, Leong GF, Brauer RW. Direct measurements of blood pressures in minute vessels of the liver. Am J Physiol 1960;199:1181-8 Nakazawa T, Ohara H, Nomura T, Joh T, Itoh M: Candesartan, an angiotensin II receptor antagonist, suppresses pancreatic inflammation and fibrosis in rats. J Pharmacol Exp Ther 2003, 307:17-23 Navarro S, Valderrama R, Lopez JM, Gimenez A, Caballeria J, Pares A, Fernandez-Cruz L:Serum amino-terminal propeptide of type III procollagen levels in chronic pancreatitis. Pancreas 1996 Mar;12(2):153-8. Neuschwander – Tetri BA, Burton FR, Presti ME, Britoon MS, Janney CG, Garvin PR, Brunt EM, Galvin N, Poulos JE: Repetitive self-limited acute pancreatitis induces pancreatic fibrogenesis in the mouse. Dig Dis Sci 2000a, 45:665-674 Neuschwander-Tetri BA, Bridle KR, Wells LD, Marcu M, Ramm GA: Repetitive acute pancreatic injury in the mouse induces procollagen α1(I) expression colocalized to pancreatic stellate cells, Lab Invest 2000b, 80:143-150 Neuschwander-Tetri BA, Talkad V, Otis Stephen F.: Induced thrombospondin expression in the mouse pancreas during pancreatic injury. Int J Biochem Cell Biol 2006 Jan;38(1):102-9. Epub 2005 Sep 12. News P, Phillips P, Fahmy R, Korsten M, Pirola R, Wilson J, Apte M: Pancreatic stellate cells respond to inflammatory cytokines: potential role in chronic pancreatitis. Gut 2002, 50:535541 Niki T, Rombouts K, De Bleser P, De Smet K, Rogiers V, Schuppan D, Yoshida M, Gabbiani G, Geerts A.:A histone deacetylase inhibitor, trichostatin A, suppresses myofibroblastic differentiation of rat hepatic stellate cells in primary culture.Hepatology. 1999 Mar;29(3):85867. Nishimoto I.: The IGF-II receptor system: a G protein-linked mechanism. Mol Reprod Dev. 1993 Aug;35(4):398-406; discussion 406-7

97

Nollevaux MC, Guiot Y, Horsmans Y, Leclercq I, Rahier J, Geubel AP, Sempoux C.:Hypervitaminosis A-induced liver fibrosis: stellate cell activation and daily dose consumption. Liver Int 2006 Mar;26(2):182-6. Novo E, Marra F, Zamara E, Valfre di Bonzo L, Monitillo L, Cannito S, Petrai I, Mazzocca A, Bonacchi A, Defranco R, Colombatto S, Autelli R, Pinzani M, Parola M.: Overexpression of bcl-2 by activated human hepatic stellate cells: resistance to apoptosis as a mechanism of progressive hepatic fibrogenesis in humans. Gut 2006 Jan 19; [Epub ahead of print] Ohnishi N, Miyata T, Ohnishi H, Yasuda H, Tamada K, Ueda N, Mashima H, Sugano K: Activin A is an autocrine activator of rat apncreatic stellate cells: potential role of follistatin for pancreatic fibrois. Gut 2003 Oct,52(10):1487-1493 Ohnishi H, Miyata T, Yasuda H, Satoh Y, Hanatsuka K, Kita H, Ohashi A, Tamada K, Makita N, Iiri T, Ueda N, Mashima H, Sugano K: Disticn roles of Smad2-, Smad3-, and ERK-dependent pathways in transforming growth factor-beta 1 regulation of pancreatic stellate cellular functions. J biol Chem 2004, 279:8873-8878 Ooi LP, Crawford DH, Gotley DC, Clouston AD, Strong RW: Evidence that Myofibroblast – like cells are the cellular source of capsular collagen in hepatocellular carcinoma, J Hepatol 1997 Apr: 26(4): 798-807 Ozaki S, Sato Y, Yasoshima M, Harada K, Nakanuma Y:Diffuse expression of heparan sulfate proteoglycan and connective tissue growth factor in fibrous septa with many mast cells relate to unresolving hepatic fibrosis of congenital hepatic fibrosis.Liver Int. 2005 Aug;25(4):817-28. Páč L, Dokládal M:Anatomie člověka II, Splanchnologie a cévní systém, Brno 2000, ISBN 80-210-2413-5 , str. 31-32 Páč L., Anatomie pankreatu, Dítě P et al., Chronická pankreatitida, 2002, Galén, ISBN 80 7262 1483, první vydání 2002 Pan ZH, Xie Y, He HW. [Effects of dahuang zhechong pill on expression and activity of matrix metalloproteinase in rats' hepatic stellate cells] Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2005,Dec;25(12):1100-3. Patel M, Fine DR.:Fibrogenesis in the pancreas after acinar cell injury. Scand J Surg 2005;94(2):108-11. Pearson G, Robinson F, Beers Gibson T, Xu BE, Karandikar M, Berman K, Cobb MH: Mitogen-activated protein ( Map) kinase pathways: regulation and physiological functions. Endocr Rev 2001, 22:153-183 Phillips PA, Wu MJ, Kumar RK, Doherty E, McCaroll JA, Park S, Pirola RC, Wilson JS, Apte MV: Cel migration : a novel aspect of pancreatic stellate cell biology. Gut 2003,52:677682. 2003a Phillips PA, McCarroll JA, Park S, Wu M-J, Pirola R, Korsten M, Wilson JS and Apte MV: Rat pancreatic stellate cells secrete matrix metalloproteinases: implications for extracellular matrix turnover. Gut 2003;52:275-282. 2003b Pinzani M: New kids on the block: pancreatic stellate cells enter the fiborgenesis world, Gut 1999; 44:451-2 Popescu LM, Hinescu ME, Ionescu N, Ciontea SM, Cretoiu D, Ardelean C., Interstitial cells of Cajal in pancreas., J Cell Mol Med 2005 Jan-Mar;9(1):169-90. Puig-Divi, Molero X, Salas A, Guarner F, Guarner L, Malagelada JR: Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas 1996, 13:417-424 Ramm GA, Ruddell RG.: Hepatotoxicity of iron overload: mechanisms of iron-induced hepatic fibrogenesis. Semin Liver Dis 2005 Nov;25(4):433-49. Reeves HL, Burt AD, Wood S, Day CP, Hepatic stellate cell activation occurs in the absence

98

of hepatitis in alcoholic liver disease and correlates with the severity of steatosis, J Hepatol 1996 Nov 26:677-83 Reinehr R, Zoller S, Klonowski- Stumpe H, Kordes C, Häussinger D: Effects of Angiotensin II on rat pancreatic stellate cells. Pancreas 2004, 28:129-137 Reunanen N: Matrix Metalloproteinases in Cancer Cell Invasion,2005 Landes Bioscience: Eurekah.com Reynaert H, Thompson MG, Thomas T and Geerts A, Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension,GUT 2002;50:571-581 Rockey DC, Weisiger RA: Endothelin induced contarctility of stellate cdells from normal and cirhotic rat liver:implications for regulation odf portal pressure and resistance. Hepatology 1996 Jul 24:233-40 Saad RS, Liu YL, Nathan G, Celebrezze J, Medich D, Silverman JF.:Endoglin (CD105) and vascular endothelial growth factor as prognostic markers in colorectal cancer. Mod Pathol 2004 Feb;17(2):197-203. Saile B, Eisenbach C, El-Armouche H, Neubauer K, Ramadori G: Antiapoptotic effect of interferon- alpha on hepatic stellate cells ( HSC): a novel úathway of IFN-alpha signal transduction via Janus kinase 2 ( JAK2) and caspase-8. Eur J Cell Biol 2003, 82:31-41 Sarem M, Znaidak R, Macias M, Rey R.:Hepatic stellate cells: it's role in normal and pathological conditions.Gastroenterol Hepatol 2006 Feb;29(2):93-101. Sarles H, Bernard JP, Gullo L. Pathogenesis of chronic pancreatitis. Gut 1990;31:629–32 Saxena NK, Ikeda K,Rockey DC, Friedman SL, Anania FA.:Leptin in hepatic fibrosis: evidence for increased collagen production in stellate cells and lean littermates of ob/ob mice. Hepatology 2002 Apr;35(4):762-71. Seaberg RM, Smukler SR, Kieffer TJ, Enikolopov G, Asghar Z, Wheeler MB,Korbutt G, Van Der Kooy D: Clonal idenitification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol 2004, 22: 1115-1124 SEER Program : Biometry Branch, Division of Cancer Prevention and Control, National Cancer Institute. Cancer Incidence and Mortality in the United States 1973-81. NIH Publication No. 85-1837.1985) Senoo H, Imai K, Matano Y, Sato M.:Molecular mechanisms in the reversible regulation of morphology, proliferation and collagen metabolism in hepatic stellate cells by the threedimensional structure of the extracellular matrix. J Gastroenterol Hepatol.1998 Sep;13 Suppl:S19-32. Shaulian E, Karin M: AP-1 in cell proliferation and survival. Oncogene 2001, 3:85-98 Shek FW, Benyon RC, Walker FM, McCrudden PR, Pender SL, Williams EJ, Johnson PA, Johnson CD, Bateman AC, Fine DR, Iredale JP. Expression of transforming growth factzorbeta I by pancreatic stellate cells and its implications for matrix secretion turnover in chronic pancreatitis. Am J Pathol 2002, 160:1787-1798 Shen H, Zhang M, Minuk GY, Gong Y: Different effects of rat interferon alpha, beta and gamma on rat hepatic stellate cells proliferation and activation. BMC Cel Biol 2002, 3:9. Shimizu I, Curr: Antifibrotic therapies in chronic HCV infection, Drug Targets Infect Disord.2001 Aug; 1(2):227-40, Shimizu K, Shiratori K, Habayashi M, Fujiwara T, Horikoshi H: Thiazolidinedione derivates as novel therapeutic agents prevent the development of chronic pancreatitis. Pancreas 2002, 24:184-190 Shimizu K, Kobayashi M, Tahara J, Shiratori K.: Cytokines and peroxisome proliferatoractivated receptor gamma ligand regulate phagocytosis by pancreatic stellate cells. Gastroenterology 2005 Jun;128(7):2105-18.

99

Shrikhande SV, Friess H, di Mola FF, Tempia-Caliera A, Conejo Garcia JR, Zhu Z, Zimmermann A, Buchler MW.NK-1 receptor gene expression is related to pain in chronic pancreatitis.Pain. 2001 Apr;91(3):209-17. Schmid-Kotsas A, Gross HJ, Menke MG: Lipopolysacharide-activated macrophages stimulate the synthesis of collagen type I and c-fibronectin in cultured pancreatic stellate cells. Am J Pathol 1999,155:1749-1759 Schneider E, Schmid-Kotsas A, Menke A, Siech M, Beger H, Adler G, Grünert A., Bachem MG: Identification of mediators stimulating proliferation and matrix synthesis of rat pancreatic stellate cells. Am J Physiol Cell Physiol 2001, 281:C532-543 Schuppan D, Koda M, Bauer M,Hahn EG: Fibrosis of liver, pancreas and intestine: common mechanisms and clear targets ? Acta Gastroenterol Belg 2000, 63:366-370 Schuppan D, Krebs A, Bauer M, Hahn EG Hepatitis C and liver fibrosis,Cell Death Differ.2003 Jan;10 Usppl 1S59-67 Siegmund SV, Seki E, Osawa Y, Uchinami H, Cravatt BF, Schwabe RF.:Fatty acid amide hydrolase determines anandamide-induced cell death in the liver. J Biol Chem 2006 Jan 17; [Epub ahead of print] Silbernagel S., Lang F., Atlas patofyziologie člověka, 2001, str. 160, ISBN 80-7169-968-3 Skandalakis JE, Skandalakis PN, Skandalakis LJ: Surgical anatomy and technique,A pocket manual. 1995 Springer- Verlag New York Inc., ISBN 0-387-94081-2 Song MH, Kim MH, Jang SJ, Lee SK, Lee SS, Han J, Seo DW, Min YI, Song DE, Yu E., Comparison of histology and extracellular matrix between autoimmune and alcoholic chronic pancreatitis. Pancreas. 2005 Apr;30(3):272-8. Song SH, Leng XS, Li T, Qin ZZ, Peng JR, Zhao L, Wei YH, Yu X.:Expression of subtypes of somatostatin receptors in hepatic stellate cells. World J Gastroenterol. 2004 Jun 1;10(11):1663-5. Sparmann G, Hohenadl CH, Tornoe J, Jaster R, Fitzner B, Koczan D, Thiesen H-J, Glass Ä, Winder D, Liebe S, Emmrich J: Generation and characterization of immortalized rat pancreatic stellate cells. Am J Physiol Gastrointest Liver physiol 287:G211-G219, 2004 Sparmann G, Merkord J, Jaschke A, Nizze H, Jonas L Lohr M, Liebe S, Emmrich J: Pancreatic fibrosis in experimenatl pancreatitis induced by dibutylin dichloride. Gastroenterology 1997, 112:1664-1672 Stites DP, Terr AI: Základní a klinikcá Imunologie, Copyright© 1991 ba Appleton &Lange, A publishing Division of Prentice Hall, ISBN 80-85605-37-6, Victoria Publishing a.s., 1994 Ševčíková A., Od chronické nehereditární pankreatitidy k pankreatickému karcinomu, Sborník přednášek Aktuální gastroenterologie XVII, X/05, ISBN 80-85977-55-9 Špičák J., Akutní pankreatitida z pohledu internisty, Sborník přednášek Aktuální gastroenterologie XVII, X/05, ISBN 80-85977-55-9 Takemura S, Kawada N, Hirohashi K, Kinoshita H, Inoue M.Nucleotide receptors in hepatic stellate cells of the rat .FEBS Lett.,1994 Oct 31;354(1):53-6. Talukdar R, Saikia N, Singal DK, Tandon R: Chronic Pancreatitis: Evolving Paradigms. Pancreatology. 2006 Jul 13;6(5):440-449 Tang M, Potter JJ, Mezey E.:Leptin enhances the effect of transforming growth factor beta in increasing type I collagen formation. Biochem Biophys Res Commun. 2002 Oct 4;297(4):906-11. Tanioka H, Mizushima T, Shirahige A, Matsushita K, Ochi K, Ichimura M, Matsumura N, Shinji T, Tanimoto M, Koide N. Xanthine oxidase-derived free radicals directly activate rat pancreatic stellate cells J Gastroenterol Hepatol. 2006 Mar;21(3):537-44. Taylor a Aspinwall, 1993 ten Dijke P, Miyazono K, heldin CH: Signalling inputs converge on nuclear effectors in TGF-β signaling. TIBS 2000, 25:64-70

100

Thomas DB, Karagas MR, Cancer in first and second generation Americans. Cancer Res 1987 , 47:5771-5776. Tibbles LA, Woodgett JR: The stress- activated protein protein kinase pathways. Cell Mol LIfe Sci 1999, 55:1230-1254 Tsukamoto H.: Fat paradox in liver disease. Keio J Med 2005 Dec;54(4):190-192. Ushiki T.:Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint. Arch Histol Cytol 2002 Jun;65(2):109-26. van Westerloo DJ, Florquin S, de Boer AM, Daalhuisen J, de Vos AF, Bruno MJ, van der Poll T.:Therapeutic effects of troglitazone in experimental chronic pancreatitis in mice. Am J Pathol 2005 Mar;166(3):721-8. Veerle L.,Van Marck, Marck E. Bracke, Cancer development, 2000-2002 Landes Bioscience,Epithelial-mesenchymal transition ( EMT). Vogelmann R, Ruf D, Wagner M, Adler G, Menke A: Effects of fibrogenic mediators on the development of pancreatic fibrosis in a TGF –beta 1 transgenic mouse model. Am J Physiol Gastroent LIver Physiol 2001, 280:G164-172 Wan Y, Wang T, Zhao Q.: PD98059 inhibited the activation of pancreatic stellate cells mediated by platelet-derived growth factor BB in rats.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2005; 25(3): 297-9,306 Wang XD,Chronic alcohol intake interferes with retinoid metabolism and signaling, Nutr Rev 1999 Feb 57:51-9 Whiting PH, Tisocki K,Hawksworth GM: Human renal medullary interstictal cells and analgesic nefropathy.Ren Fall1999May-Jul 21:387-92 Widgren S, Jlidi R, Cox JN.:Collagenous colitis: histologic, morphometric, immunohistochemical and ultrastructural studies. Report of 21 cases. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 1988;413(4):287-96. Yang ZF, Poon RT, To J, Ho DW, Fan ST: The potential role of hypoxia inducible factor 1alpha in tumour progression after hypoxia and chemotherapy in hepatocellular carcinoma ,Cancer Res.2004 Aug 1;5496-503 Yoo BM, Yeo M, Oh TY, Choi JH, Kim WW, Kim JH, Cho SW, Kim SJ, Hahm KB. Amelioration of pancreatic fibrosis in mice with defective TGF-beta signaling. Pancreas. 2005 Apr.; 30(3):e71-9 Yoo BM, Oh TY, Kim YB, Yeo M, Lee JS, Surh YJ, Ahn BO, Kim WH, Sohn S, Kim JH, Hahm KB. Novel antioxidant ameliorates the fibrosis and inflammation of cerulein-induced chronic pancreatitis in a mouse model.Pancreatology. 2005;5(2-3):165-76. Epub 2005 Apr 21. 2005b Yoshida S, Ujiki M, Ding XZ, Pelham C, Talamonti MS, Bell RH Jr, Denham W, Adrian TE.Pancreatic stellate cells (PSCs) express cyclooxygenase-2 (COX-2) and pancreatic cancer stimulates COX-2 in PSCs. Mol Cancer 2005 Aug 5;4:27. Yu JH, Lim JW, NAmkung W, Kim H, Kim KH: Supression of cerulein-induced cytokine expression by antioxidants in pancreatic acinar cells. Lab Invest 2002, 82:1359-1368 Yuantai W, Tiancai W, Qiu Z.:PD98059 inhibits expression of pERK1 protein and collagen alpha1(I) mRNA in rat pancreatic stellate cells activated by platelet-derived growth factor. Indian J Gastroenterol 2005 May-Jun;24(3):100-3. Zavoral M., Karcinom pankreatu, Jubilejní X. sympozium Aktuální gastroenterologie, Sborník přednášek, str.16-19, IV/02 Zimmermann A, Gloor B, Kappeler A, Uhl W, Friess H, Büchler MW: Pancreatic stellate cells contribute to regeneration early after acute necrotising pancreatitis in humans. Gut 2002, 51:574-578 Zhang Y, Liu Y. [Study on effects of salidroside on lipid peroxidation on oxidative stress in rat hepatic stellate cells] Zhong Yao Cai 2005 Sep;28(9):794-6.

101