Chromatografické metody Irina Nikolova, Mgr. Oddělení ochrany čistoty ovzduší Český hydrometeorologický ústav, pobočka Ústí nad Labem Kočkovská 18, 400 11 Ústí nad Labem tel: +420 472706050 fax: +420 472706024 mail to:
[email protected] , http://www.chmi.cz
1
Chromatografické metody V současné době jsou nejvýznamějšími separačními metodami, které jsou zároveň i metodami kvantitativně analytickými. Zakladatelem je ruský chemik a botanik Cvět (1872 – 1919), který ve skleněné koloně naplněné uhličitanem vápenatým rozdělil listová barviva. Chromatografie (z řečtiny χρώμα – barva, γραφειν – psát) je souhrnné označení pro skupinu fyzikálněchemických separačních metod.
Výsledek chromatografie chlorofylu 2
Terminologie a obecný princip Analyty – složky vzorku/směsi, které mají být chromatograficky rozděleny Mobilní fáze – neboli eluent, je fáze pohybující se chromatografickým systémem. Tato fáze přivádí vzorek do stacionární fáze, kde dochází k jeho separaci Stacionární fáze je v chromatografickém systému ta fáze, která je nepohyblivá. Stacionární fází může být pevná látka nebo film kapaliny zakotvený na pevné látce.
- k separaci analytu dochází na základě distribuce mezi 2 fáze: mobilní (pohyblivou) a stacionární (nepohyblivou) - složky směsi se liší svojí afinitou k oběma fázím - dělení je založeno na rozdílné distribuci složek směsi mezi mobilní a stacionární fázi a liší se vzájemně dobou setrvání v jednotlivých fázích - po určité době se ustaví dynamická rovnováha – poměr látkových množství každé látky ve fázi stacionární a mobilní je konstantní – základní princip chromatografického procesu 3
směr pohybu mob. fáze
B
Start
A B
mobilní fáze
B
A
stacionární fáze
I.
A
III.
II. t1
fázové rozhraní
t2
Kolona nebo plošné uspořádání
- směs je na kolonu nebo papír vnesena v intervalu I. - po dosažení dynamické rovnováhy (interval II.) platí pro každou látku, že její látkové množství v jednotlivých fázích je konstantní, takže:
n(A)SF/n(A)MF = k’A
n(B)SF/n(B)MF = k’B
k’ - kapacitní poměr Látka A je více zadržována stacionární fází a látka B mobilní fází. Výsledkem je separace obou látek 4
Rozdělení chromatografických metod Rozdělení chromatografie podle uspořádání • chromatografie v plošném (planárním) uspořádání - papírová chromatografie (PC, paper chromatography) - tenkovrstvá chromatografie (TLC, thin layer chromatography) • chromatografie v kolonovém (sloupcovém) uspořádání Základní rozdělení podle separačního principu (mechanismu) • adsorpční chromatografie • rozdělovací (partiční) chromatografie • iontová výměna Rozdělení chromatografie podle skupenství fází • kapalinová chromatografie (LC, liquid chromatography): mobilní fáze je kapalina • plynová chromatografie (GC, gas chromatography): mobilní fáze je plyn 5
Rozdělení chromatografických metod hlavní typ chromatografie plynová chr. (GC – gass chromatography)
mobilní fáze
stacionární fáze
kapalina plyn pevná látka
kapalina kapalinová chr. (LC – liquid chromatography)
kapalina
pevná látka
název
zkratka
anglický název
GLC
gass-liquid chr.
GSC
gass-solid chr.
kapalinová rozdělovací chromatografie
LLC
liquid-liquid chr.
gelová permeační chromatografie
GPC
gel-permeation chr.
papírová chromatografie
PC
paper chr.
tenkovrstvá chromatografie
TLC*
thin layer chr.
kapalinová adsorpční chromatografie
LSC
liquid-solid chr.
IEC
ion exchange chr.
TLC*
thin layer chr.
plynová rozdělovací chromatografie plynová adsorpční chromatografie
iontově výměnná chromatografie tenkovrstvá chromatografie
* TLC chromatografie existuje jako rozdělovací (stacionární fází je kapalina zakotvená na pevné látce) i jako adsorpční (stacionární fází je přímo tuhá látka) chromatografie
6
CHROMATOGRAFIE V PLOŠNÉM USPOŘÁDÁNÍ Papírová chromatografie (Paper Chromatography, PC)
rozdělovací - stacionární fáze je kapalina zachycená v papíře a mobilní fáze je též kapalná - starší a jednodušší metoda Tenkovrstvá chromatografie (Thin Layer Chromatography, TLC)
rozdělovací - stacionární fáze je kapalina zachycená na tenké vrstvě a mobilní fáze je také kapalná adsorpční - stacionární fáze je tuhý adsorbent, který je součástí tenké vrstvy, a mobilní fáze je kapalná - jednoduchá, levná metoda, vyžaduje minimální instrumentaci Vysokoúčinná tenkovrstvá chromatografie (High Performance Thin Layer
Chromatography, HPTLC) - využívá účinné stacionární fáze o malé a jednotné velikosti částic, instrumentaci pro automatické dávkování, vyvíjení (čerpadlo) a detekci => srovnatelná metoda s GC či HPLC
7
Princip dělení analytů při PC a TLC Vzorek se nanese ve formě malé kulaté skvrnky na papír nebo tenkou vrstvu a poté se mobilní fáze nechá vzlínat póry papíru nebo tenké vrstvy. Mobilní fáze unáší dělené látky ze vzorku, které se více či méně zpožďují interakcí (rozpouštěním nebo adsorpcí) se stacionární fází, a tím se vzájemně dělí. Poměr vzdálenosti středu koncentračního maxima každé zóny od startu ke vzdálenosti čela mobilní fáze od startu se označuje jako retardační faktor (RF).
Chromatogram se vyvíjí v uzavřené chromatografické komoře, která je dobře nasycena parami mobilní fáze. 8
Vyvíjení Rozdělení podle uspořádání : •Vzestupné vyvíjení •Sestupné vyvíjení •Kruhové (radiální) vyvíjení •Opakovatelné vyvíjení (eluent o jiné polaritě) •Dvojrozměrné vyvíjení
9
Detekční metody při PC a TLC Vyvíjení se ukončí vyjmutím chromatogramu z vyvíjecí komory, když čelo mobilní fáze dosáhne téměř protilehlého okraje papíru či tenké vrstvy. Chromatogram se vysuší a skvrny nebarevných analytů je třeba před vyhodnocováním chromatogramu detegovat použitím vhodné detekční metody.
Detekční metody 1) ponoření nebo postřik chromatogramu vhodným činidlem konc. H2SO4 (pouze TLC), KMnO4, I2 (organické látky); dithizon (ionty kovů); ninhydrin (aminy, AMK, aminocukry), fluorescamin (aminy, peptidy, sulfonamidy); acidobazické indikátory (kyseliny nebo zásady) 2) fluorescence luminoforů v UV záření (excitace při 254 nm) 3) zhášení fluorescence tenkovrstvé desky nadopované fluorescenčním indikátorem (např. hořčíkem aktivovaný křemičitan zinečnatý) 10
Kvalitativní vyhodnocení chromatogramu Jednotlivé separované analyty se charakterizují tzv. Retardačním faktorem RF.
RF ,i
ui d 1 i um d m 1 k
ui - rychlost skvrny i-tého analytu um - rychlost (čela) mobilní fáze di - vzdálenost středu skvrny i-tého analytu od startu dm - vzdálenost čela mobilní fáze od startu RF <0, 1> RF =0 látka nemigruje, zůstává na startu RF =1 látka se nezadržuje, migruje s čelem rozpouštědla 11
Identifikace analytů Protože existuje značné množství faktorů (např. teplota, malé odchylky ve složení chromatografické soustavy, vlhkost), které do jisté míry ovlivňují polohu zóny, a tedy hodnotu RF, vyvíjíme obvykle na chromatogramu zároveň vzorek standardu (autentické látky). Dosáhne-li standard a látka oddělená z neznámého vzorku stejné hodnoty RF (a to nejméně ve třech různých chromatografických soustavách), je pravděpodobné, že se jedná o látky chemicky totožné.
RF ,rel ,i
RF ,i RF ,std
RF,rel,i je relativní retardační faktor tj. retardační faktor chromatografované látky vztažený k retardačnímu faktoru standardu
12
Kvantitativní vyhodnocení
Množství látky v zóně lze odhadnout podle její plochy, kvantitativně stanovit fotodozimetrem, či po vymytí látky ze zóny vhodným rozpouštědlem a stanoví se vhodnou metodou v roztoku. 13
TENKOVRSTVÁ CHROMATOGRAFIE (TLC) jednoduchá, rychlá a často používaná chromatografická
metoda, se kterou se dají realizovat všechny metody kapalinové chromatografie. Tenkovrstvou chromatografii lze charakterizovat jako chromatografii v otevřené koloně. Na tenké vrstvě je podstatně méně stacionární fáze a tudíž analýza na tenké vrstvě může být velmi rychlá v porovnání s kolonou. Všechny nanesené látky se musí objevit mezi startem a čelem rozpouštědla; nic nemůže zůstat v koloně.
14
Chromatografie v kolonovém (sloupcovém) uspořádání Vzorek
Mobilná fáze
A+B+C
tRo – čas nástřiku tR, A – retenční čas latky A tR, B – retenční čas latky B tR, C – retenční čas latky C
C B C Kol B
C
C A
Det
B
retenční čas: kvalitativní
C
charakteristika (závisí na druhu látky) plocha píku: kvantitativní údaj (závisí na množství látky)
chromatogram A B
tRo
tR, A
C
tR, B
tR, C 15
Chromatografie v kolonovém (sloupcovém) uspořádání
16
RETENČNÍ DATA Retenční čas a retenční objem
Měření retence v eluční chromatografii může být vyjádřeno retenčním časem (tR), přímo definovaným polohou vrcholu píku na chromatogramu. Z retenčního času může být vypočítán retenční objem (VR) podle vztahu: VR = tRFm , v němž značí: tR - retenční čas nebo vzdálenost podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího dané složce, Fm – objemový průtok mobilní fáze .
17
Hmotnostní distribuční poměr Hmotnostní distribuční poměr známý jako kapacitní faktor k´ nebo retenční
faktor je definován jako:
k'A
n( A) s n( A) m
c( A) s Vs Vs kc kD c( A) m Vm Vm
v němž značí: k´A - kapacitní poměr pro látku A, n(A)s - množství rozpuštěné látky A ve stacionární fázi, n(A)m - množství rozpuštěné látky A v mobilní fázi, kD - rovnovážný distribuční koeficient (známý jako distribuční konstanta), VS - objem stacionární fáze, VM - objem mobilní fáze , β je fázový poměr, β = Vm/Vs. 18
Hmotnostní distribuční poměr kapacitní faktor k´ složky může být určen z chromatogramu s
použitím výrazu:
t R - t M t' R k'A tM tM v němž značí: tR - retenční čas nebo vzdálenost (nebo objem) podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího dané složce , tM - mrtvý čas nebo vzdálenost (nebo objem) podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího nezadržované složce, t´R – redukovaný retenční čas, t´R = tR – tM . 19
Klasická teorie chromatografických pater (ideální chromatografie) Chromatografická kolona je tvořena velkým či menším množstvím tzv. teoretických pater. Složky vzorku unášené tokem mobilní fáze vstupují do 1. patra kolony nerozdělené. Zde se ustavuje rovnováha mezi stacionární fází 1.patra a mobilní fází. Po ustavení rovnováhy se změní koncentrace složek v mobilní fázi a roztok dělených látek v mobilní fázi vstupuje do 2.patra, kde se opět ustavuje rovnováha mezi fázemi. Celý proces se mnohonásobně opakuje. Na počtu pater kolony je závislá účinnost separace.
Zjednodušující předpoklady: • rovnováha mezi fázemi se ustavuje okamžitě • podélná difuse látky je zanedbatelná • sorpční izoterma je zcela lineární • pístový tok mobilní fáze 20
Počet teoretických pater N Počet teoretických pater N – bezrozměrná veličina pro vyjádření účinnosti chromatografické kolony. Vypočítá se z šířky píku v chromatogramu
N = 16 . (tR/w)2 nebo
N = 5,54 . (tR/b1/2)2 v němž značí: w – šířka píku u základní linie b1/2 – šířka píku v polovině výšky Výškový ekvivalent teoretického patra H – délka kolony připadající na jedno teoretické patro
L H N 21
Počet teoretických pater N Počet teoretických pater N – bezrozměrná veličina pro vyjádření účinnosti chromatografické kolony. Vypočítá se z šířky píku v chromatogramu.
N = 16 . (tR/w)2 nebo
N = 5,54 . (tR/b1/2)2 v němž značí: w – šířka píku u základní linie b1/2 – šířka píku v polovině výšky Výškový ekvivalent teoretického patra H – délka kolony připadající na jedno teoretické patro
L H N 22
Van Deemterova rovnice
23
Van Deemterova rovnice
24
Van Deemterova rovnice
25
Van Deemterova rovnice
http://www.chromedia.org/chromedia?waxtrapp=yqegzCsHqnOxmOlI EcCbC&subNav=wnjedDsHqnOxmOlIEcCbCmF 26
Van Deemterova rovnice
27
Rozlišení Rozlišení RS je parametr charakterizující míru oddělení dvou píků (složek 1 a 2) RS = 2 (tR2-tR1)/(w1+w2) =
2Δt/(w1+w2) w – šířka píku u základní linie Dosažení požadovaného rozlišení W1
W2
RS = 1 dostatečné RS = 1,5 téměř dokonalé RS > 2 nadbytečné 28
Rozlišení
29
Rozlišení N 1 k '2 RS 4 1 k '2 účinnost
selektivita
retence
Faktory ovlivňující rozlišení • selektivita vyjadřovaná separačním (selektivitním) faktorem α α = k´2/k´1 = t′R2/t′R1 (t′R2 > t′R1) Když α=1 => R=0 • retence později eluované složky vyjádřená jejím kapacitním poměrem • účinnost vyjádřená odmocninou z počtu teoretických pater Ovlivnění selektivity a retence Volba mobilní fáze, volba stacionární fáze, teplota. Ovlivnění účinnosti Délka kolony, velikost částic, průtok.
30
Rozlišení N 1 k '2 RS 4 1 k '2 α - Největší vliv na rozlišení – zvýšení lze dosáhnout optimalizací stacionární i mobilní fáze. N - Má význam, ale rozlišení roste “jen” s druhou odmocninou N. k’ - pro vyšší retenční časy se poslední člen blíží k 1 a nemá tedy smysl dále retenci zvyšovat. 31
Rozlišení
http://www.chromedia.org/chromedia?waxtrapp=yqegzCsHqnOxmOlIEcCbC& subNav=ywjedDsHqnOxmOlIEcCbCqE 32
Rozlišení Efektivní počet pater Nef = N . [k2/(1+k2) ]2
RS
N ef 1 4
Počet teoretických pater N je proporcionální k délce kolony L. To znamená že i rozlišení R je proporcionální odmocninou délky kolony L. Dvounásoubná délka kolony zvyšuje R jenom 1,41 krát.
33
Potřebný počet efektivních pater k dosažení hodnoty rozlišení 1 a 1,5 Separační faktor α
RS =1
RS =1,5 Nef
1,005
650 000
1 450 000
1,01
163 000
367 000
1,02
42 000
94 000
1,05
7 100
16 000
1,1
1 900
4 400
1,15
940
2 100
1,25
400
900
1,5
140
320 34
CHROMATOGRAFICKÁ DATA Pík může být definován plochou píku (A) nebo výškou píku (h) a šířkou píku v poloviční výšce (b1/2) nebo výškou píku (h) a šířkou píku mezi body inflexe (w). Pro gaussovské píky platí vztah: w1/2 =1,18w
35
ASYMETRIE PÍKU Asymetrie píku souvisí s účinností kolony a má negativní vliv na integraci píku. Existují dvě metody vyjádření asymetrie píku a to jako faktor asymetrie AS, který je vyjádřen jako poměr šířky píku vzestupné (t) k sestupné části píku (f) nejčastěji v 5 nebo 10 % výšky píku: AS
t0.05 f 0.05
a dále faktor chvostování píku (tailing faktor) Tf, který je vyjádřen jako šířka píku k dvojnásobku šířky píku vzestupné části f v 5 % výšky píku:
Tf
t0.05 f 0.05 2 f 0.05 36
ASYMETRIE PÍKU Hodnota faktoru 1,0 značí úplnou (ideální) symetrii píku. Tf > 1 pro píky asymetrické v sestupné časti („tailing“ píky) Tf < 1 pro píky asymetrické v vzestupné časti („fronting“ píky)
37
Plynová chromatografie - GLS Schématický nákres plynového chromatografu:
Plynová rozdělovací chromatografie (GLC) používá jako mobilní fázi plyn a jako stacionární fázi kapalinu zakotvenou na povrchu pevné látky
Metoda GLC je instrumentální metoda (tzn. používá se přístroj vyrobený přímo pro provádění GLC analýz). Přístroj používaný pro plynovou chromatografii se nazývá plynový chromatograf. Podmínka pro použití GC: látka musí být těkavá a termicky stabilní, látky netěkavé je třeba derivatizovat.
plynový chromatograf firmy Agilent38
Nosný plyn Nosný plyn slouží v GLC chromatografii jako transportní médium pro plynnou směs, která je analyzována. Nosný plyn neinteraguje se stacionární fází ani se složkami analyzované směsi na rozdíl od kapalinové chromatografie, kde dochází k významné interakci mezi mobilní fází a analyzovanou směsí. Jako nosný plyn se používají plyny He, Ar, N2, H2, CO2. Regulátor průtoku slouží pro udržení konstantní průtokové rychlosti (nebo konstantního tlaku) nosného plynu v separační koloně během analýzy. výhody
nevýhody
H2
•levný •dává nejlepší časově efektivní separace •efektivní separace i při vysokých průtokových rychlostech nosného plynu ( ~60 cm/sec)
•může tvořit výbušné směsi se vzduchem •je to redukční plyn
He
•velmi inertní, nereaguje s analyty •dává velmi časově efektivní separace •nehořlavý
•drahý
N2
•levný •velmi inertní, nereaguje s analyty •nehořlavý
•velmi pomalé rychlosti k dosažení dobré účinnosti 39
Nosný plyn
40
Nástřikový port Nástřikový port je místo, které slouží pro vpravení vzorku do plynového chromatografu a do separační kolony. Nástřik se provádí ručně nebo automaticky speciální injekční stříkačkou (typický objem 1 ul). Nastřikovaný vzorek může být kapalný nebo plynný. V případě kapalných vzorků musí mít nástřikový port dostatečně vysokou teplotu aby došlo k okamžitému převedení vzorku do plynného stavu. Plynný vzorek je z nástřikového portu zaveden do proudu nosného plynu, který ho pak transportuje přes kolonu, přičemž dochází k separaci složek analyzované směsi. Pokud je původní vzorek jen velmi málo těkavý a byl by problém s jeho odpařením, pak se provede jeho derivatizace. Typickým příkladem derivatizace je například převedení málo těkavých mastných kyselin chemickou reakcí na methylestery mastných kyselin, které jsou již dobře analyzovatelné plynovým chromatografem.
41
Nástřikový port Nástřiky plynné fáze mohou být prováděny pomocí statických nebo dynamických head-space dávkovacích systémů. Dynamické head-space (Purge and Trap system) dávkovací systémy pro adsorpci a desorpci obsahují probublávací zařízení, pomocí kterého jsou těkavé látky uvolňovány z roztoku a vyplavovány do adsorpční kolonky udržované na nízké teplotě. Zadržené látky jsou pak desorbovány do mobilní fáze rychlým ohřátím adsorpční kolonky. Statické head-space dávkovací systémy obsahují termostatovanou komůrku, do které se vkládají uzavřené nádobky, obsahující pevné nebo kapalné vzorky na předem stanovenou dobu, potřebnou k ustavení rovnováhy těkavých složek vzorku mezi pevnou nebo kapalnou fází a plynnou fází. Po dosažení této rovnováhy je předem určené množství plynné fáze z lahvičky dávkováno do plynového chromatografu. 42
Požadavky: • rychlá odezva • vysoká citlivost • selektivita • linearita odezvy • stabilita
Detektory
Detektory • tepelně vodivostní detektor, katarometr (TCD, thermal conductivity detector) • plamenový ionizační detektor (FID, flame ionization detector) • termoionizační detektor, plamenový ionizační detektor se solí alkalického kovu, dusíkofosforový detektor (TID, thermionic detector, AFID alkali flame ionization detector, NPD) • detektor elektronového záchytu (ECD, electron capture detector) • plamenový fotometrický detektor (FPD, flame photometric detector) • atomový emisní detektor (AED, atomic emission detector) • hmotnostně spektrometrický detektor (MSD, mass spectrometric detector) • další detektory • heliový nebo argonový ionizační detektor • infračervený (FTIR) detektor • fotoionizační detektor (PID) • chemiluminiscenční detektor 43
Detektory Vlastnosti detektorů
44
Stacionární fáze Stacionární fáze jsou umístěny v kolonách, které mohou být: - kapilární kolony (capillary column) (křemenné, skleněné), na jejichž stěnách jsou naneseny stacionární fáze • WCOT(wall coated open tubular) • SCOT (support coated open tubular) • PLOT (porous layer open tubular)
45
Stacionární fáze Stacionární fáze jsou umístěny v kolonách, které mohou být: - kapilární kolony (capillary column) (křemenné, skleněné), na jejichž stěnách jsou naneseny stacionární fáze • WCOT(wall coated open tubular) • SCOT (support coated open tubular) • PLOT (porous layer open tubular)
- náplňové kolony (packed column) (kovové, skleněné) - kolony naplněné inertními částicemi impregnovanými stacionární fází (GLC), - kolony naplněné pevnou stacionární fází (GSC). Parametr kolony
Náplňové
WCOT
SCOT
délka, m
1-5
5-60
5-60
vnitřní průměr, mm
2-4
0,1-0,75
0,5
Počet pater, m-1
500-1000
1000-4000
600-1200
Množství vzorku, μg
0,01-1000
0,01-1
0,01-1
velký
malý
malý
Tlak
46
Stacionární fáze Výběr stacionární fáze/kolony • polarita • selektivita Nepolární analyty mají vysokou retenci na nepolárních stacionárních fázích a naopak. Nepolární sloučeniny a sloučeniny o střední polaritě je vhodné dělit na nepolární nebo středně polární stacionární fázi. Pro dělení polárních sloučenin se hodí polární a středně polární fáze.
47
Teplotní program Chromatografická kolona je uložená v termostatu. Teplotní program může být: - isotermický - s programovanou teplotou (teplotním gradientem)
Příklad – optimizace teplotního programu na koloně: 2.3 m MXT-5 Silicosteel column with a 180 μm I.D. and a 0.4 μm 5% phenyl/95% dimethyl polysiloxane film
Látky v směsi: n-Hexane n-Octane n-Nonane n-Decane n-Undecane n-Dodecane n-Tridecane
48
Optimizace metody • výběr mobilní fáze (nosného plynu) • výběr stacionární fáze: - typ kolony (polarity) - délka kolony (prakticky 5-60 m) - průměr kolony (prakticky 0,1-0,53 mm) - tloušťka filmu (bývá typicky 0,1-0,25µm) • optimizace průtoku • optimizace teploty, teplotního programu • výběr detectoru
http://www.chromedia.org/chromedia?waxtrapp=ilqdcDsHq nOxmOlIEcCpBkF&subNav=acdseDsHqnOxmOlIEcCpBkFdF 49
Optimizace metody • výběr mobilní fáze (nosného plynu) • výběr stacionární fáze: - typ kolony (polarity) - délka kolony (prakticky 5-60 m) - průměr kolony (prakticky 0,1-0,53 mm) - tloušťka filmu (bývá typicky 0,1-0,25µm) • optimizace průtoku • optimizace teploty, teplotního programu • výběr detectoru
http://www.chromedia.org/chromedia?waxtrapp=ilqdcDsHq nOxmOlIEcCpBkF&subNav=acdseDsHqnOxmOlIEcCpBkFdF 50
Optimizace metody
51
Vzorek se vpraví do kolony spec. injekční stříkačkou přes gumové septum. Objem závisí na použité koloně a charakteru vzorku. Plynné vzorky od 0,5 - 20 ml. Kapalné vzorky 1 – 10 l. Vyhodnocení chromatografických křivek - pro identifikaci látky je rozhodující eluční (retenční) čas - pro kvantitativní analýzu je rozhodující výška nebo plocha píkem ohraničená. - nutná kalibrace pomocí standardních látek
52
Naše chromatografická laboratoř
53
Kapalinová chromatografie - HPLC Schématický nákres kapalinového chromatografu:
Mezi metodami kapalinové chromatografie zaujímá významné místo technika HPLC. Zkratka je odvozena od dvou používaných názvů této techniky a to „high performance liquid chromatography“ (vysokoúčinná kapalinová chromatografie) nebo „high pressure liquid chromatography“ (vysokotlaká kapalinová chromatografie). Mobilní fází je kapalina. Stacionární fází je film příslušné látky zakotvený na povrchu nosiče nebo pevný adsorbent. Přístroj, na kterém se provádí HPLC analýzy se nazývá kapalinový chromatograf.
kapalinový chromatograf firmy Agilent
54
Kapalinová chromatografie - HPLC Metoda HPLC existuje jako tzv. „normální“ a „reversní“. • Normální HPLC Při normální HPLC je stacionární fáze polárnější než fáze mobilní. • Reversní HPLC Při reversní HPLC je naopak stacionární fáze méně polární než fáze mobilní. Reversní HPLC bývá též označovaná jako RP HPLC (reverse phase HPLC). RP HPLC technika je již řadu let používána mnohem častěji než normální HPLC.
Dále se budeme věnovat technice RP HPLC.
55
Mobilní fáze Mobilní fází v RP HPLC může být např. voda, methanol, acetonitril a jejich směsi v různých vzájemných poměrech a další. Zásobníky jsou skleněné láhve, kterých může být několik s navzájem různými mobilními fázemi, které je možné spolu automaticky mísit v předem zvoleném poměru. Na rozdíl od GLC zde mobilní fáze vstupuje do interakce se složkami analyzované směsi a konkrétní složení mobilní fáze může významným způsobem ovlivňovat celou analýzu (kvalitu separace).
Izokratická eluce: Složení mobilní fáze (její eluční síla) se během analýzy nemění. Gradientová eluce: Eluční síla mobilní fáze vzrůstá během analýzy. Výhody gradientové eluce: •Vhodnější pro komplexní vzorky s velkým počtem analytů •Lepší rozlišení pro píky na začátku a konci chromatogramu •Vyšší citivost pro píky na konci chromatogramu •Větší kapacita píků (víc se jich vejde do chromatogramu) Nevýhody gradientové eluce: •Náročnější instrumentace (čerpadla) •Náročnější vývoj metody •Delší doby analýzy vyplývající z nutnosti ekvilibrace kolon
56
Stacionární fáze Stacionární fáze je tvořena mikročásticemi silikagelu (2-10 um) na kterých je navázána vlastní stacionární fáze. Vlastní stacionární fáze může být tvořena například nepolárními uhlovodíky (C8 – oktan, C18 – oktadekan), nebo polárnějšími uhlovodíky s funkční skupinou ( např. -CN a pod).
Účinnost separace roste se snižující se velkostí částic náplně. Minimum křivky udává průtokové rychlosti, při kterých kolona vykazuje největší účinnost. Minimum je pro malé částice ploché, tj. je možno pracovat v širším rozsahu průtoků bez ztráty účinnosti. 57
Výhody silikagelových částic s pevným jádrem
58
Výhody silikagelových částic s pevným jádrem
59
Výhody silikagelových částic s pevným jádrem Rozlišení
60
Výhody silikagelových částic s pevným jádrem
61
Jednotlivé části kapalinového chromatografu a jejich funkce Zásobník mobilní fáze • zpravidla skleněné láhve s přívodní kapilárou z PTFE a filtrační fritou Vysokotlaké čerpadlo Čerpadla: •isokratická (pro isokratickou eluci) •gradientová (pro gradientovou eluci, eluci s programovaným složením mobilní fáze: binární, ternární, kvarternární) Požadavky na kvalitní čerpadlo • stálý průtok (0,01-10 ml/min), minimální tlakové pulsy • chemická inertnost materiálů (ocel, PEEK) • tlak běžně do 15 MPa • automatické vypnutí při překročení nastaveného tlakového limitu • přesná tvorba gradientu 62
Jednotlivé části kapalinového chromatografu a jejich funkce Nástřikové zařízení (injektor) obvykle šesticestný dávkovací ventil se smyčkou definovaného objemu Nastřikovaný objem (řídí se rozměry kolony) • 5-50 μl (většina analytických aplikací) • 200 μl – 2 ml (semipreparativní a preparativní účely)
Předkolona - má ochrannou funkci, chrání kolonu před látkami s velmi silnou retencí; může a nemusí být instalována Analytická kolona (může být uložena v termostatované skříni) Rozměry : • obvykle délka 10-25 cm, vnitřní průměr 2-8 mm (nejčastěji 250x4,6 mm) • větší průměry a délky u preparativních kolon Materiály: • nerezavějící ocel, titanová ocel • sklo, ocelový plášť • PEEK (polyetheretherketon) 63
Jednotlivé části kapalinového chromatografu a jejich funkce Detektory Na rozdíl od GLC zde však není k dispozici tak univerzální detektor, jakým je v GLC detektor FID. Metoda HPLC využívá tyto typy detektorů: •spektrofotometrický detektor (UV-VIS), •fluorescenční detektor (FLD), •hmotnostní spektrometr (MS), •refraktometrický detektor (RID) a další. Volba detektoru opět závisí na konkrétní aplikaci. Často používaným detektorem je detektor spektrofotometrický (UV-VIS) a fluorescenční. Podmínkou použití těchto detektorů je, aby daný analyt absorboval záření určité vlnové délky (UVVIS detekce) anebo aby emitoval flourescenční záření (fluorescenční detekce).
64
Literatura http://web.natur.cuni.cz/~suchan/PC_TLC.pdf http://www.lekopis.cz/Kap_2_2_46.htm http://www.hplc.cz/Tip/asymm_factor.htm
http://www.chromedia.org/chromedia?waxtrapp=yqegzCsHqn
OxmOlIEcCbC&subNav=wnjedDsHqnOxmOlIEcCbCmF http://web.natur.cuni.cz/~analchem/bosakova/hplc1.pdf http://www.xumuk.ru/encyklopedia/2/5089.html
65
Děkují za pozornost!
66
Iontově výměnná chromatografie - využívá rozdílné afinity jednotlivých iontů k výměnným skupinám -
a) b)
používaných ionexů stacionární fázi je obvykle ionex s kyselou nebo bazickou funkční skupinou na makromolekulárním nosiči každá aktivní skupina je pevně vázaný iont kladného nebo záporného náboje, který na sebe váže protiiont opačného náboje podle charakteru aktivní skupiny rozlišujeme: KATEXY jejichž kyselá funkční skupina (sulfo- nebo karboxylová kyselina) nese záporný náboj. Jsou určeny pro dělení kationtů. ANEXY nesou bazickou funkční skupinu (aminoskupina, kvarterní amoniová báze) s kladným nábojem a slouží k dělení aniontů.
Afinitní chromatografie - základem jsou specifické reakce funkčních skupin zabudovaných pro zcela
konkrétní případy do syntetických molekul matrice, obdobných gelům, se separovanými látkami - jde o interakce charakteristické pro některé biologické a biochemické 67 procesy
Adsorpční chromatografie Vykazují-li složky rozdílnou adsorpční afinitu dochází k jejich distribuci mezi pevnou stacionární a kapalnou nebo plynnou mobilní fázi. příčinou je ADSORPCE MOLEKUL na povrchu vhodného sorbentu. Tento proces je definován ADSORPČNÍ IZOTERMOU. Langmuirova izoterma:
cS
k .z.cm 1 k .cm
k je adsorpční koeficient z je počet volných aktivních center na povrchu sorbentu cS a cm jsou koncentrace sorbované látky, resp. látky v mobilní fázi 68
I
II
III
cs K.cm >>1 K.cm<<1 cm
Pouze v úseku I platí lineární závislost adsorbované látky na koncentraci této látky v mobilní fázi. Lineární závislost existuje jen při nízkých koncentracích látky v roztoku. Langmuirova izoterma se pak zjednoduší na obecný tvar cs = K.z.cm V úseku III už není koncentrace v sorbentu ovlivněna koncentrací v roztoku v důsledku nasycení aktivních center.
Pro chromatografii je žádoucí splnění podmínky pro lineární závislost – úsek I. Pro větší koncentrace – úsek II platí Langmuirova izoterma v plném rozsahu.
69
Eluční data, tvorba elučních křivek - dvě různé látky lišící se svými distribučními konstantami, utvoří dvě zóny, které se během migrace rozšiřují - aby bylo možno dvě látky bezpečně rozlišit musí mít dostatečně rozdílné distribuční konstanty - za chromatografickou kolonou získáme tzv. píky, které jsou závislostí odezvy detektoru na retenčních (elučních) veličinách a mají tvar podobná Gaussově křivce Retenční (eluční) čas tR – čas, který látka potřebuje od okamžiku vnesení do kolony do doby kdy detektor zaznamená maximum píku. Retenční objem VR = tR . FM (FM – objemová rychlost mobilní fáze v cm3/s) Mrtvý objem VM – objem mobilní fáze v koloně od nástřiku po detektor Redukovaný retenční objem VR = VR – VM Redukovaný retenční čas tR = tR - tM 70
