Centrum buněčné terapie a tkáňových náhrad

Centrum buněčné terapie a tkáňových náhrad Editoři prof. MUDr. Eva Syková, DrSc. Ústav neurověd UK 2.LF V Úvalu 84 150 00 Praha 5

Doc. MUDr. Miroslav Ryska, CSc. Klinika transplantační chirurgie Vídeňská 1958/9 140 00 Praha4

Redakční rada RNDr. Alexandr Chvátal, CSc. Oddělení neurověd, Ústav experimentální medicíny AVČR Vídeňská 1083, 140 00 Praha 4 Ing. Petr Dvořák, CSc. Laboratoř molekulární embryologie MZLU v Brně a ÚŽFG AV ČR Zemědělská 1, 613 00 Brno Ing. Milan Hájek, DrSc. Institut klinické a experimentální medicíny Vídeňská 1958/9, 140 00 Praha4 Ing. Josef Fulka, DrSc., Jr. Výzkumný ústav živočišné výroby Přátelství 815, POB 1, 104 01 Praha 10 Prof. MVDr. Jan Motlík, DrSc. Ústav živočišné fyziologie a genetiky AVČR Rumburská 89, 277 21 Liběchov RNDr. František Rypáček, CSc. Ústav makromolekulární chemie AVČR Heyrovského nám. 2, 140 00 Praha 4

OBSAH 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Předmluva Pokroky v transplantacích a výzkumu kmenových buněk Buněčná terapie na úrovni samičích a samčích pohlavních buněk Embryonální kmenové buňky a buněčná terapie Neurální prekurzory - kam na ně ? Embryonální kmenové buňky ve vývojové biologii Molekulární biologie a buněčná terapie Nové přístupy v imunoterapii - nástup dendritických buněk

9.

Membránové vlastnosti neuronů, gliových a kmenových buněk v centrálním nervovém systému

Předmluva Založení centra buněčné terapie a tkáňových náhrad V loňském roce vláda uvolnila 700 milionů Kč ročně na Program center výzkumu a vývoje. Ministerstvo školství a Rada vlády pro výzkum a vývoj proto vypsaly soutěž na založení těchto center ve všech vědních oblastech. Na základě hodnocení podaných návrhů pak bylo schváleno financování 33 projektů výzkumných center. Jedním z nových center je Centrum buněčné terapie a tkáňových náhrad. Proč vzniklo právě toto centrum? V České republice existuje dobře rozvinutá platforma výzkumu v oblasti vývojové biologie, v oblasti syntézy biokompatibilních polymerů, v oblasti neurověd a transplantační chirurgie. Snaha o vytvoření Centra pro buněčnou terapii a tkáňové náhrady byla logickým vyústěním předchozích vědeckých kontaktů mezi těmito obory. Hlavním cílem Centra je soustředit vybrané směry základního výzkumu v těchto disciplínách do vzájemně provázaného celku, poskytujícího základnu pro výzkum v oblasti buněčné terapie a tkáňových náhrad na kvalitativně nové úrovni, srovnatelné s úrovní dosahovanou ve vyspělých zemích EU a USA. Vedle základního výzkumu je cílem také výzkum nových léčebných postupů, preparátů a jejich kvalifikovaného a včasného preklinického testování. Cílem Centra je výraznější uplatnění naší vědecké komunity v mezinárodním měřítku. K praktickým výstupům Centra je reálné se dopracovat přes vytvoření buněčné banky a přes vývoj nových medicinálních polymerů, které budou vykazovat optimální interakci s buňkami cíleně diferencovanými in vitro, za současného vývoje postupů poskytujících vhodné buněčné linie. Centrum si tedy klade nejen vědecké cíle, ale současně se chce stát koordinačním střediskem výzkumu a vývoje nových terapeutických přístupů, základnou pro systematickou postgraduální výchovu a místem intenzivní domácí a mezinárodní spolupráce. Centrum má dnes více než 50 pracovníků. Z nich ti starší mají v Centru pouze částečný uvazek, zatímco ti mladší, kterých je více než polovina, mají v centru plný pracovní úvazek. Základní organizační jádro Centra, konzultační středisko a místo setkávání všech řešitelů, studentů a klinických pracovníků tvoří Ústav neurověd Univerzity Karlovy, 2. lékařské fakulty. Unikátní nové prostory ve Fakultní nemocnici v Motole (FNM) jsou vhodné pro Centrum svým uspořádáním a umístěním. Lokalizace jádra Centra v prostorách FNM umožňuje operativní kooperaci s klinickými jednotkami. Dalšími institucemi, které se mimo pracovišť FNM, 1. a 2. lékařské fakulty účastní na plnění projektů centra, jsou některá oddělení Ústavu experimentální medicíny AVČR, Ústavu makromolekulární chemie AVČR, Ústavu živočišné fyziologie a genetiky AVČR, Institutu klinické a experimentální medicíny (IKEM), Laboratoř molekulární embryologie MZLU v Brně a Výzkumný ústav živočišné výroby v Uhříněvsi. Koncentrací lidského a materiálního potenciálu pracovišť, která se dosud uvedenou problematikou zabývala v dílčích otázkách, se podařilo vytvořit podmínky pro rozvoj

Centra patří tyto záměry: 1. Vytvořit experimentální podmínky pro získávání a kontrolovanou diferenciaci kmenových buněk zvířat (embryonálních a orgánových) s cílem získat buněčné typy s požadovanými vlastnostmi pro transplantační pokusy na zvířatech. Důraz je kladen na definování podmínek, které vedou k diferenciaci kmenových buněk do neurálních linií a analýzu jejich osudu in vivo. 2. Vyvinout nové biokompatibilní polymerní materiály, jak inertní tak i biologicky aktivní, vhodné pro studium buněčné diferenciace in vitro, jako náhrada extracellulární matrix pro transplantaci buněk nebo pro přímou implantaci in vitro kultivované tkáňové struktury do organizmu. 3. Zavést vhodné experimentální modely patologických stavů u zvířat pro transplantační pokusy a ověření přínosu buněčné terapie a tkáňových náhrad pro léčbu onemocnění. 4. Studovat morfologické a membránové vlastnosti prekurzorových a diferencovaných buněk (zvl. nervových) včetně vlastností tkání které budou těmito buňkami osídleny. 5. Vyvinout nové léčebné technologie, využívající kmenových buněk a biologicky aktivních polymerních implantátů pro použití a léčbu neurodegenerativních onemocnění (Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, roztroušená skleróza míšní), ischemických lézí mozku, úrazů mozku a míchy, mozkových nádorů, popáleninových traumat, trofických vředů, diabetu, onemocnění jater a dalších onemocnění. 6. Využít naše a zahraniční vědecké poznatky pro rozvoj dalších oborů, pro včasné a klinické využití u našich pacientů ve spolupráci s klinickými pracovišti a farmaceutickými firmami. Centrum bude dbát, aby jedinečné postupy vypracované v Centru byly odpovídajícím způsobem patentově chráněny a tak zajištěny pro další ekonomické zhodnocení. Cílem Bulletinu je průběžně informovat lékařskou i laickou veřejnost o výsledcích nejen na našem pracovišti, ale i na předních světových pracovištích. K informaci je možné využít i naše internetové stránky: http://www.medicon.cz/cbt/ Prof. MUDr. Eva Syková DrSc. Vedoucí Centra buněčné terapie a tkáňových náhrad Vedoucí Ústavu neurověd UK 2. LF

Pokroky v transplantacích a výzkumu kmenových buněk Syková, E. Centrum buněčné terapie a tkáňových náhrad a Ústav neurověd UK 2. LF Oddělení neurověd Ústav experimentální medicíny AVČR Kmenové buňky se na samém konci minulého tisíciletí staly středem pozornosti, a je

Proč může být jejich význam tak obrovský? Především proto, že jsou to buňky, které se mohou měnit na všechny typy buněk, ze kterých se skládá živý organizmus, a vzbuzují tím naději, že by se mohly měnit podle přání lékařů a sloužit pro tzv. buněčnou terapii. Tyto buňky se totiž nevyskytují pouze ve vyvíjejícím se zárodku, ale na mnoha místech existují i u dospělých jedinců, včetně lidí. Důsledky pro medicínu by mohly být nesmírně významné, ale jejich využití ještě bude předcházet velmi intenzivní výzkum. Využití kmenových buněk stojí v cestě nejen řada praktických, ale i etických překážek. Jsou naše naděje, které vkládáme do této technologie, oprávněné? Stojí za to překonat některé etické překážky, abychom zachránili lidské životy a zlepšili jejich kvalitu? Úlohou vědců je nejen přinést nové poznatky a objevy, často ještě v době, kdy na ně není lidstvo připraveno, ale také vypracovat a navrhnout postupy jak využít tyto poznatky v praxi pro blaho lidstva. Není lepšího údělu než přispět k narození zdravého potomstva, zmírnění fyzického i duševního utrpení nemocných dětí i dospělých, přispět k odstranění vrozených vad, nádorů a dalších smrtelných nemocí, vrátit do života jedince těžce postižené selháním některého důležitého orgánu nebo jedince postižené těžkými úrazy a neštěstími. Jedinečnost každého člověka je tím imperativem, pro který je třeba učinit vše, co je v našich silách.

Kmenové buňky Všechny buňky pochází z jiných buněk; co tedy znamená "kmenová" buňka? Kmenové buňky jsou nediferencované buňky (buňky bez specializace), které se mohou samy neustále obnovovat (Morrison a spol., 1997) a kromě toho dávají vzniknout i jednomu nebo více druhům vysoce diferencovaných (specializovaných) buněk, které mají v těle charakteristické funkce. V medicíně se takové buňky objevují velmi často, například nádory začínají mnohdy jako jediná buňka a u řady tumorů se objevuje několik typů buněk odvozených z jedné nádorové "kmenové" buňky. Krajním případem jsou nádory varlat zvané teratomy nebo teratokarcinomy. U myší mohou být tyto nádory uměle vytvořeny prostým přenesením obyčejných buněk varlat na jiné místo v těle. Objev, že jediná nádorová buňka může vytvářet mnoho odlišných druhů buněk, měl dramatické důsledky. To je však situace patologická a věnujme se nyní fyziologickým funkcím kmenových buněk. Kmenové buňky jsou určeny svým vývojovým potenciálem. Pojem kmenové buňky má význam v souvislosti se zárodečnou linií: vajíčka a spermie, které po splynutí vytvoří celý organizmus, jsou produktem zárodečných linií. Oplozené vajíčko (zygota) je totipotentní (z latinského totus = úplný) kmenová buňka vytvářející všechny buňky organizmu, včetně například buněk placenty, které nejsou součástí embrya. Během vývoje jsou buňky směrovány k jednotlivým vývojovým drahám a jejich vývojový potenciál se mění, ale je stále ještě široký. Tyto multipotentní kmenové buňky již mohou vytvářet jen omezený počet druhů buněk; například kmenové buňky v mozku dávají na konci své vývojové dráhy vzniknout různým druhům nervových a podpůrných buněk v centrálním nervovém systému. Kmenové buňky, často multipotentní ale i unipotentní, se však vyskytují také v dospělých tkáních. Například dospělé svalové kmenové buňky se účastní přestavby svalu a hematopoetické kmenové buňky mohou vytvořit všechny druhy buněk, vyskytujících se v krvi. Transplantace kostní dřeně, kde se vyskytují tzv. hematopoetické kmenové buňky, se s obrovským úspěchem již řadu let používá např. pro léčbu leukemie. Poté, když Henry Becquerel a Marie Curie objevili radioaktivní záření, se postupně odhalilo, že toto záření poškozuje rychle se dělící buňky. Nejdříve působí onemocnění buněk bílé a červené krevní

řady (hematopoetický systém). Tato pozorování vedla k objevu hematopoetické kmenové buňky. Teoreticky i prakticky může jediná hematopoetická kmenová buňka zcela obnovit krevní systém myši (Osawa a spol., 1996). Skutečnost, že u dospělých existují kmenové buňky, je zajímavá; mnohem zajímavější je však to, že možnosti kmenových buněk nejsou omezeny zdrojem, ze kterého byly získány. Řada překvapujících pozorování ukázala například, že svaly a krev mohou být získány z kmenových buněk nalezených v jiných tkáních (Jackson a spol., 1999, Gussoni a spol., 1999). Se všemi genetickými znaky a protokoly pro rozpoznávání hematopoetických kmenových buněk bude možné v krátké době potvrdit nebo vyvrátit tvrzení, že přesně ty samé kmenové buňky mohou u člověka vytvořit celý krevní systém stejně tak jako příčně pruhované svaly nebo dokonce buňky nervové. Nedávné pokusy na myších nasvědčují tomu, že hematopoetické kmenové buňky mohou vytvářet elementy centrální nervové soustavy (Mezey a spol., 2000). Zdá se, že kmenové buňky dospělých mohou mít stejné možnosti vývoje jako embryonální kmenové buňky, dostanou-li správný pokyn. Víme však jen málo o tom, jak mohou kmenové buňky při svém vývoji překonávat hranice a jakým způsobem je můžeme nasměrovat vybraným směrem.

Embryonální kmenové buňky Inspirováni výzkumem teratomů vědci brzy zjistili, že v průběhu raného vývoje myší se objevuje období, ve kterém mají určité buňky embrya nápadnou schopnost zakládat velmi rozsáhlou skupinu různých buněčných druhů. Tyto rané embryonální kmenové buňky mohou být z embrya odebrány a pomnoženy v laboratorních podmínkách; vrátíme-li je do vyvíjejícího se embrya zpět, tak se účastní vzniku všech tkání myši, včetně zárodečné linie (Brook and Gardner, 1997). Tyto buňky se označují jako pluripotentní (z latinského plures = několik). Rozdíl mezi pluripotentní ranou embryonální kmenovou buňkou a totipotentní zygotou je ten, že raná embryonální kmenová buňka může dávat vzniknout pouze buňkám, které jsou součástí samotného embrya. Jiným typem pluripotentní buňky jsou embryonální zárodečné buňky, které pocházejí z pozdějšího období vývoje, ve kterém se oddělí buňky zárodečné linie. Embryonální kmenové a embryonální zárodečné buňky se vyskytují i u člověka a posledních několik let je možné i jejich pěstování v laboratorních podmínkách (Thompson a spol., 1998, Reubinoff a spol., 2000). Embryonální kmenové buňky myší je možné rozpoznat podle jejich schopnosti přispívat k vývoji všech tkání embrya. Na celém světě je však zakázáno pokoušet se vytvářet lidi z lidských embryonálních kmenových buněk, proto musí být tyto buňky definovány jinak. Lidské embryonální kmenové buňky bývají získávány z nadbytečných embryí, která jsou produkována na klinikách umělého oplodnění. Ve velmi časné fázi vývoje, ve které je embryo tvořeno zhruba tisícem buněk, mohou být odděleny a růst ve tkáňových kulturách. Mohou in vitro vytvářet mnoho odlišných druhů buněk a tak jsou také definovány - jako pluripotentní buňky ve tkáňových kulturách. Výzkum a kultivace myších embryonálních kmenových buněk a jejich vracení zpět do vyvíjejících se embryí může přinést poznatky o základních zákonitostech pro budoucí buněčnou terapii. Jaká je však motivace pro práci s lidskými embryonálními kmenovými buňkami? Obecně jsou pro to dva hlavní důvody. Prvním důvodem je možnost tyto buňky využít k výzkumu vlastností specifických pro časné fáze vývoje člověka. Druhým důvodem je, že embryonální kmenové buňky vytvářejí somatické buňky: pestrou škálu

buněk, které se nemohou obnovovat a ze kterých se skládá lidské tělo. Studiem embryonálních kmenových buněk můžeme získat hlubší porozumění průběhu obnovy buněk lidského těla. Možnost využít tyto znalosti při léčbě je veliká a sahá od produkce nových neuronů pro léčbu pacientů s Parkinsonovou chorobou až po poznání procesů na molekulární úrovni, které řídí vývoj nádorů.

Nervové kmenové buňky Co se vlastně v posledních několika letech minulého tisícíletí ale stalo? Padlo staré dogma, že neurogeneze v CNS savců je výhradně uskutečňována během embryonálního vývoje a v časném postnatálním období. Sice již Altman a Das publikovali v r. 1965 práci, ve které nalezli DNA syntézu (inkorporaci značeného thymidinu) v nervových buňkách dospělých potkanů, ale nedostatek specifických protilátek pro značení a diferencování buněk zpochybňoval jejich závěr, že se skutečně jedná o neurony. V následující části tohoto přehledu se soustředíme na nervové kmenové buňky a jejich využití pro buněčnou terapii. Teprve studie, které prokázaly neurogenezi (vytváření nových neuronů) u primátů a nakonec i v lidském mozku (Eriksson a spol., 1998), vedly k definitivní změně v našem názoru o postnatálním ukončení neurogeneze a o možnostech obnovy či náhrady nervové tkáně (Gage, 2000). Dalším převratným zjištěním byl průkaz nervových kmenových buněk v dospělém mozku. Již Reynolds a Weiss (1992) ukázali, že z dospělého savčího mozku, lze vykultivovat populaci buněk, které mají vlastnosti buněk kmenových, totiž jsou multipotentní a schopné se samy neustále obnovovat a jestliže je indukována diferenciace, vyvinou se všechny tři hlavní druhy nervových buněk - neurony, astrocyty a oligodendrocyty (Reynolds a Weiss, 1996). Takové kmenové buňky byly nedávno izolovány i z dospělého lidského mozku (Johansson a spol., 1999). Myšlenka vývoje vhodné strategie jak stimulovat neurogenezi v případě např. neurodegenerativních onemocnění nebo poranění mozku a míchy (Gage, 1998, Dunnett a Bjorklund, 1999, Svendsen a Smith, 1999) se proto okamžitě stala zajímavou nejen pro vědecké pracovníky, ale i pro lékaře a průmyslovou sféru.

Kde jsou kmenové buňky? Jakmile byly kmenové buňky prokázány v dospělém savčím mozku, byl zahájen výzkum, kde jsou tyto buňky a mohou-li za určitých podmínek putovat do dalších oblastí mozku, kde je jich třeba. Kmenové buňky se v mozku nacházejí ve stěnách komor, kde se vyskytuje jedna vrstva tzv. ependymálních buněk. Blízko této vrstvy ependymálních buněk se nachází tzv. subventrikulární zóna, která již obsahuje tři rozdílné buněčné populace, nezralé neurony, astrocyty a další rychle proliferující typ buněk (Doetsch a spol., 1997, Bruni, 1998, Chaisson a spol., 1999, Doetsch a spol., 1999). Serie experimentů v laboratoři Friséna a spol. (Johanson a spol., 1999) ukazují, že jsou to ependymální buňky dospělého mozku i míchy, které jsou multipotentní, samy se obnovují in vitro a z nichž se generují neurony olfaktorického bulbu in vivo. Po poranění vznikají ze spinálních ependymálních buňek astrocyty, které přispívají k vytváření buněčné jizvy. Všeobecně se dnes uzavírá, že jsou to jak ependymální buňky, tak subventrikulární astrocyty, které mají vlastnosti kmenových buněk. Není jasné, zda jsou to dvě nezávislé populace kmenových buňek, nebo zda mají společný původ v ependymálních buňkách.

Neurony vznikají v tzv. subventrikulární zóně (SVZ) mezi vrstvou ependymových buněk (E) vystýlajících vnitřní stěnu mozkových komor (V) a striatem (S). Buňky migrují podél tzv. rostrálního migračního proudu do čichového bulbu (viz šipka). V SVZ vznikají z rychle se dělící populace buněk (oválné buňky) nezralé migrující neurony (neuroblasty, tmavé buňky v horní části nákresu SVZ. Astrocyty, hvězdicovité buňky v dolní části nákresu SVZ, slouží buď jako nezávislé kmenové buňky, nebo jako přechodná populace mezi ependymovými buňkami a progenitory. (Obr. 1)

Obr. 1 - Model tvorby neuronů z ependymových kmenových buněk laboratorního potkana.

Možnosti a nástrahy klinického použití Významným důvodem pro výzkum kmenových buněk je možnost jejich použití pro terapii buněčnými náhradami. Jak již bylo řečeno, manipulace s hematopoetickými kmenovými buňkami je důležitým nástrojem klinické medicíny a lidské hematopoetické kmenové buňky jsou významnou součástí transplantátů kostní dřeně používaných k léčbě nemocných leukemií. V tomto čísle časopisu vydávaného Centrem buněčné terapie a tkáňových náhrad se zabýváme možnostmi buněčné terapie na úrovni pohlavních buněk. Přestože stále ještě neumíme rozpoznat příslušnou kmenovou buňku, umíme in vitro pěstovat buňky tvořící kůži a tím zachraňovat životy obětem popálenin prostřednictvím transplantace kůže. Cukrovka může být léčitelná, pokud vypěstujeme z kmenových buněk buňky vytvářející inzulin a transplantujeme je do slinivky břišní diabetiků. Jaterní insuficienci pravděpodobně budeme moci léčit pomocí kultivovaných hepatocytů. Léčba onemocnění mozku je také možná, ale k tomu, aby bylo možné léčit buněčnými náhradami, ještě povede delší cesta. Dnes je sice zřejmé, že transplantujeme-li kmenové buňky CNS do vyvíjejícího se nebo dospělého myšího mozku, mohou se diferencovat na neurony i glie, zůstává však otázka jak nejlépe docílit, aby se správně a funkčně včlenily do tkáně (mozku nebo míchy) hostitele. Takto transplantované buňky mohou být schopny napravit onemocnění mozku způsobená ztrátou neuronů. Tato myšlenka je nejlépe propracována pro Parkinsonovu chorobu, kdy byly již buňky embryonální úspěšně využity u několika stovek pacientů. Povzbudivé experimenty totiž ukazují, že kmenové buňky fetálního mozku mohou být použity k náhradě některých mozkových funkcí u nemocných s Parkinsonovou chorobou (Olanow a spol., 1996). Chceme-li používat buněčné transplantace v praxi, potřebujeme mít přístup a zdroje vhodných buňek. Například neurony pro léčbu Parkinsonovy choroby je možné získat z mozku plodů, ale praktické i etické překážky nám brání tento zdroj buněk používat. Umíme nyní vytvářet vhodné neurony - produkující dopamin - z myších kmenových buněk centrálního nervového systému (Studer a spol., 1998). Kmenové buňky CNS však rychle ztrácejí schopnost diferencovat se na dopamin produkující neurony. Nejen u těchto, ale i u jiných typů buněk

se může stát, že nebude možné vypěstovat kmenové buňky v dostatečném počtu pro transplantaci. Je též otázkou výzkumu jak zajistit nejvyšší produkci dopaminu z transplantátu, který může v mozku v důsledku operace vyvolat obrannou reakci, která způsobí kolem transplantátu vytvoření nepropustné bariéry složené z gliových buněk. Naše pokusy na modelu Parkinsonovy choroby u potkana ukázaly, že nejvhodnějším přístupem bude mikrotransplantace v několika bodech, ať už se bude jednat o buňky fetální nebo kultivované buňky kmenové (Reum a spol, 2000). Pluripotentní embryonální kmenové buňky mají oproti tělovým kmenovým buňkám důležitou výhodu: mohou být bez omezení pěstovány ve tkáňové kultuře. Může se ukázat jednodušší získat některé potřebné buňky (třeba dopamin tvořící neurony pro léčbu Parkinsonovy nemoci) kultivací embryonálních kmenových buněk a podnícením jejich diferenciace na žádané druhy buněk. Zatím víme jen málo o lidských embryonálních kmenových buňkách, ale ze tkáňových kultur myších embryonálních kmenových buněk je možné získat mnoho odlišných typů buněk. Použijeme-li správnou kombinaci podnětů, jako jsou například růstové faktory, mohou se myší embryonální kmenové buňky in vitro diferencovat na oligodendrocyty (Brustle a spol., 1999) - buňky, které chybí u nemocných s roztroušenou sklerózou - i na buňky, které odumírají při Parkinsonově chorobě (Lee a spol., 2000). Oligodendrocyty mohou být u lidí získány i z méně eticky sporných zdrojů, než jakými jsou lidské embryonální kmenové buňky. Možná, že existují i jiné cesty jak získat dostatek dospělých kmenových buněk pro lékařské účely. Při studiu nádorů byla objevena řadu genů, které mohou ovlivnit růst buněk. Je možné připravit "nesmrtelné buňky", které se neomezeně množí v kultuře a přitom po injekci zvířeti u něj nevytvářejí nádory. Mnoho druhů kmenových buněk může být učiněno nesmrtelnými, vložíme-li do nich geny podporující jejich růst; takové buňky si stále ponechávají schopnost diferenciace a mohou se po transplantaci začlenit do hostitelových tkání. S používáním nesmrtelných buněk je však spojeno určité riziko - nelze totiž zatím vyloučit, že se z nich vyvinou buňky nádorové. Zmíněné riziko je možné obejít například tím, že do buněk při přenosu genů, které je mají učinit nesmrtelnými, vpravíme i gen pro "buněčnou sebevraždu", který může být aktivován podáním nějaké látky pokusným zvířatům. Podobné strategie dovolují ovlivnit počet transplantovaných nesmrtelných buněk a tato technologie se stává užitečnou i pro klinické použití. Genetická manipulace není omezena jen na embryonální kmenové buňky. V nedávno uveřejněné studii (McCreath a spol., 2000) byly geny ovčích fibroblastů pozměněny rekombinací a jejich jádra byla přenesena do vajíček, jejichž jádra byla předtím odstraněna. Těmto vajíčkům bylo umožněno vyvinout se a daly tak vzniknout ovcím, jejichž genetická výbava obsahovala požadovanou změnu. Výhody genetické modifikace hospodářských zvířat mohou zahrnovat vytvoření druhu dobytka, který nebude vytvářet protein, který je základem bovinní spongiformní encefalopatie (BSE). Náhrada buněk se dostává do centra pozornosti současné medicíny a některé výsledky zde popsané jsou pouhým začátkem. Využití těchto buněk nemusí být pouze buněčné opravy a náhrady. Kmenové buňky se například mohou volně pohybovat tkáněmi a mohou být využity ke sledování a zabíjení nádorových buněk (Benedetti a spol., 2000). Dalším z výsledků výzkumu kmenových buněk může být objev mechanizmu umožňujícího nasměrovat vývoj kmenových buněk přítomných v našem těle požadovaným směrem, bez nutnosti je izolovat a pomnožit. Zmíněná manipulace kmenovými buňkami může být po klinické i etické stránce lepší než postupy, při kterých jsou hostiteli transplantovány buňky, které byly pomnoženy v laboratoři. Tak např. nové neurony stále vznikají v oblastech

hipokampu a bulbus olfactorius, i když ve velmi malém množství. Hipokampus je důležitý pro formování paměti a je často poškozen např. během stárnutí. Mohou být vyvinuty proto metody jak regulovat a zvýšit tvorbu nových neuronů v hipokampu (Cameron a McKay, 1999) nebo jak zajistit jejich migraci ze subventrikulární zóny do jiných oblastí mozku. V budoucnosti může být tento přístup použit i pro propagaci kmenových buněk z hipokampu nebo z míchy (Palmer a spol., 1999), např. pomocí fibroblastového růstového faktoru-2. Tak může dojít k řešení řady neurologických problémů; náhrada neuronů v mozku pomocí diferenciace kmenových buněk centrální nervové soustavy může být kruciálním faktorem při léčbě po poranění mozku a míchy. Nejsou to však pouze různé růstové faktory, ale i jednoduché extracelulární signály, které působí na proteiny buněčné membrány a mohou nasměrovat krevní i mozkové kmenové buňky k určitým osudům (Anderson, 1997, McKay, 1997, Cory, 1999). Návrat funkce po míšním poranění - konec údělu žít pouze na dýchacím přístroji nebo na vozíčku? Tato provokativní otázka dnes trápí vědce a rodiny pacientů na celém světě. Proto bychom se chtěli blíže zmínit o možnosti užít buněčnou terapii a tkáňové náhrady pro terapii míšního poranění. Na tomto tak palčivém onemocnění, které vede k trvalé invaliditě, často dětí a mladých osob, a pro něž dnes často nemáme prakticky žádnou úspěšnou léčbu, si ukážeme příklad, kam spěje výzkum. Je však zřejmé, že bychom měli uvážit a zkusit všechny možné cesty jak těmto pacientům pomoci a že se budeme musit možná oprostit od některých předsudků. Po poranění míchy dnes stojíme u čtyř nesmírně závažných problémů, které budeme muset řešit současně s případnou transplantací buněk. Je to: 1. zabránit okamžité reakci tkáně na poranění, tj. buněčné smrti a vytvoření gliální jizvy, 2. potlačit inhibiční vlastnosti mikroprostředí CNS, které normálně brání regeneraci v CNS a naopak podpořit růstový potenciál axonů a poškozených neuronů, 3. porozumět tomu jak správně nasměrovat rostoucí axony, aby bylo obnoveno funkční propojení, 4. vytvořit optimální podmínky pro přežívající tkáň. Všechny tyto otázky jsou dnes intenzivně zkoumány. Tak např. byly nalezeny inhibiční molekuly, které mají vztah k oligodendrocytům a jejich myelinovým pochvám, dokonce byl právě identifikován s myelinem spojený gen zvaný Nogo, který u potkanů i u člověka blokuje axonální vrůstání do poškozené tkáně (Chen a spol., 2000, GradPre a spol., 2000, Prinjha a spol., 2000). Bylo provedeno i mnoho pokusů, které užívaly metodu implantace periferních nervů, nebo různých jiných vodičů a lepidel pro usnadnění míšní regenerace. V neposlední řadě jsou to i pokusy strukturálně nahradit a simulovat mikroprostředí nervové tkáně, které by jednak usnadnilo vrůstání a propojování buněk a axonů, a dále by zabraňovalo vytvoření astrogliotické jizvy. Takový je i přístup, na kterém nyní dále pracujeme v Centru buněčné terapie a tkáňových náhrad, kdy využíváme na modelu poranění míchy u potkana vhodné implantované hydrogely a provádíme se zvířaty intenzivní rehabilitaci (Woorly a spol., 1999). Zdá se, že transplantované nervové kmenové buňky mohou potenciálně nahradit ztrátu buněk po poranění míchy, rekonstituovat neuronální okruhy a tak propojit dráhy pod a nad míšní lézí. Jinou možností je intraspinální transplantace geneticky modifikovaných kmenových buněk, které produkují faktory, které zabraňují buněčné smrti a podporují regeneraci. Takové pokusy byly provedeny na potkanech s míšním poraněním a ukázaly, že transplantované buňky v poraněné míše přežívají, migrují do hostitelské tkáně a vedou k regeneraci axonů a k návratu motorických funkcí (Kalyani a spol., 1998, Liu a spol., 1999). Snad kombinace výše uvedených přístupů povede ke klinickému využití.

Etika a zákony Pochybnosti vzrůstají zejména ze skutečnosti, že mnoho užitečných kmenových buněk je odvozeno z embryí nebo plodů. Přestože ve většině případů by byla tato embrya jinak vyřazena, zůstává otázka, zda je odebírání kmenových buněk z embryí ospravedlnitelné. Na druhou stranu slibuje tato technologie veliké úspěchy při léčbě různých nemocí. Existují různé alternativy, například svalové kmenové buňky dospělých myší mohou zakládat různé linie buněk. Jejich vývojový potenciál může však být menší než u embryonálních kmenových buněk a je obtížné je izolovat a kultivovat. Legislativa v současném světě odráží toto dilema: · V Německu zakazují zákony o reprodukční medicíně extrakci kmenových buněk z lidského embrya. · Ve Spojených Státech nesmí být použity federální fondy k financování výzkumů, které používají lidské pluripotentní kmenové buňky získané z tkání lidských plodů nebo embryí. Hlavní federální agentura (National Institute of Health) v současnosti přezkoumává své směrnice týkající se této záležitosti. Návrh zákona, který je v současnosti probírán komisí Senátu, navrhuje legislativu, která by povolila výzkumníkům financovat získávání lidských embryonálních kmenových buněk z federálních fondů. V čase psaní tohoto článku nebylo o tomto návrhu zákona ještě hlasováno. Výzkum lidských embryonálních kmenových buněk podporovaný ze soukromých zdrojů není ve Spojených Státech zakázán. · Parlament ve Velké Británii právě schválil návrh vlády, aby bylo povoleno klonování lidských embryonálních buněk za účelem rozvinutí nových léčebných procesů. Současně však vláda navrhla, aby proces klonování probíhal pouze při splnění mnoha přísných podmínek. Předpokládá se nutnost získání licence pro výzkum embryonálních kmenových buněk a souhlas dárce vajíčka a spermatu. Návrh zahrnuje četné zákazy, např. spojení lidské a dospělé somatické buňky s vajíčkem jakéhokoliv zvířecího druhu či tzv. reprodukční klonování (implantace embrya vytvořeného technikou přenosu buněčného jádra do dělohy ženy). · Francouzské zákony o bioetice nedovolují výzkum prováděný na lidských embryích, ale poslední zápis, který byl odhlasován generálním shromážděním Conseil d'Etat, doporučuje, aby byl pro účely zkoumání kmenových buněk povolen výzkum na embryích. Tato otázka bude projednávána později tento rok.

Literatura 1. Altman, J. & Das, G.D. (1965) Autoradiographic and histological evidence of postnatal neurogenesis in rats. J. Comp. Neurol., 124: 319-335 2. Anderson, D.J. (1997) Cellular and molecular biology of neural crest cell lineage determination. Trends Genet., 13: 276-280 3. Benedetti, S., Pirola, B., Pollo, B., Magrassi, L., Bruzzone, M.G., Rigamonti, D., Galli, R., Selleri, S., Di Meco, F., De Fraja, C., Vescovi, A., Cattaneo, E. & Finocchiaro, G. (2000) Gene therapy of experimental brain tumors using neural progenitor cells. Nature Med., 6: 447-450 4. Brook, F.A. & Gardner, R.L. (1997) The origin and efficient derivation of

embryonic stem cells in the mouse. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 94: 5709-5712 5. Bruni, J.E. (1998) Ependymal development, proliferation, and functions: a review. Microsc. Res. Tech., 41: 2-13 6. Brustle, O., Jones, K., Learish, R., Karram, K., Choudhary, K., Wiestler, O.D., Duncan, I.D. & McKay, R.D. (1999) Embryonic stem cell-derived glial precursors: a source of myelinated transplants. Science, 285: 754-756 7. Cameron, H.A. & McKay, R.D. (1999) Restoring production of hippocampal neurons in old age. Nature Neurosci., 2: 894-897. 8. Chen, M.S., Huber, A.B., van der Haar, M.E., Frank, M., Schnell, L., Spillman, A.A., Christ, F. & Schwab, M.E. (2000) Nogo-A is a myelin-associated neurite outgrowth inhibitor and an antigen for monoclonal antibody IN-1. Nature, 403: 434-439 9. Chiasson, B.J., Tropepe, V., Morshead, C.M. & van der Kooy, D. (1999) Adult mammalian forebrain ependymal and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but only subependymal cells have neural stem cell characteristics. J. Neurosci., 19: 4462-4471 10. Cory, S. (1999) Immunology: wavering on commitment. Nature, 401: 538-539. Doetsch, F., Caille, I., Lim, D.A., Garcia-Verdugo, J.M. & Alvarez-Buylla, A. (1999) Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell, 97: 703-716 11. Doetsch, F., Garcia-Verdugo, J.M. & Alvarez-Buylla, A. (1997) Cellular composition and three-dimensional organization of the subventricular germinal zone in the adult mammalian brain. J. Neurosci., 17: 5046-5061 12. Dunnett, S.B. & Björklund, A. (1999) Prospects for new restorative and neuroprotective treatments in Parkinson's disease. Nature, 399(suppl): A32-A39 13. Eriksson, P.S., Perfilieva, E., Björk-Eriksson, T., Alborn, A.M., Nordborg, C., Peterson, D.A. & Gage, F.H. (1998) Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nat. Med., 4: 1313-1317 14. Gage, F.H. (1998) Cell therapy. Nature, 392(suppl): 18-24 15. Gage, F.H. (2000) Mammalian neural stem cells. Science, 287: 1433-1438 16. GradPre, T., Nakamura, F., Vartanian, T. & Strittmatter, S. (2000) Identification of the Nogo inhibitor of axon regeneration as a Reticulon protein. Nature, 403: 439444 17. Gussoni, E., Soneoka, Y., Strickland, C., Buzney, E., Khan, M., Flint, A.F., Kunkel. L.M. & Mulligan, R.C. (1999) Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation. Nature, 401: 390-394 18. Jackson, K.A., Mi, T. & Goodell, M.A. (1999) Hematopoietic potential of stem cells isolated from murine skeletal muscle. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 96: 1448214486 19. Johansson, C.B., Momma, S., Clarke, D.L., Risling, M., Lendahl, U. & Frisén, J. (1999) Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell, 96: 25-34 20. Johansson, C.B., Svensson, M., Wallstedt, L., Jansom, A.M. & Frisén, J. (1999) Neural stem cells in the adult human brain. Exp. Cell Res., 253: 733-736 21. Kalyani, A.J., Piper, D., Mujtaba, T., Lucero, M.T. & Rao, M.S. (1998) Spinal cord neuronal precursors generate multiple neuronal phenotypes in culture. J. Neurosci., 18: 7856-7868

22. Lee, S.-H., Lumelsky, N., Studer, L., Auerbach, J.M. & McKay, R.D. (2000) Efficient generation of midbrain and hindbrain neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Biotechnol., 18: 675-679 23. Liu, Y., Kim, D., Himes, B.T., Chow, S.Y., Schallert, T., Murray, M., Tessler, A. & Fischer, I. (1999) Transplants of fibroblasts genetically modified to express BDNF promote regeneration of adult rat rubrospinal axons and recovery of forelimb function. J. Neurosci., 19: 4370-4387 24. McCreath, K.J., Howcroft, J., Campbell, K.H., Colman, A., Schnieke, A.E. & Kind, A.J. (2000) Production of gene-targeted sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells. (2000) Nature, 405: 1066-1069 25. McKay, R. (1997) Stem cells in the central nervous system. Science, 276: 66-71. Mezey, E., Chandross, K.J., Harta, G., Maki, R.A. & McKercher, S.R. (2000) Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow. Science, 290: 1779-1782 26. Morrison, S.J., Shah, N.M. & Anderson, D.J. (1997) Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell, 88: 287-298 27. Olanow, C.W., Kordower, J.H. & Freeman, T.B. (1996) Fetal nigral transplantation as a therapy for Parkinson's disease. Trends Neurosci., 19: 102-109 28. Olshausen,F., Reum, T., Mazel, T., Voříšek, I., Morgenstern, R. & Syková E. (2000) Extracellular diffusion in the striatum of 6-OHDA-lesioned and grafted rats. Soc. for Neurosci. Abstracts, 26: 870 29. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H. & Nakauchi, H. (1996) Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science, 273: 242-245 30. Palmer, T.D., Markakis, E.A., Willhoite, A.R., Safar, F. & Gage, F.H. (1999) Fibroblast growth factor-2 activates a latent neurogenic program in neural stem cells from diverse regions of the adult CNS. J. Neurosci., 19: 8487-8497 Adresa ke korespondenci: Prof. MUDr. E. Syková, DrSc. Ústav neurověd UK 2.LF V úvalu 94 150 00 Praha 5

Buněčná terapie na úrovni samičích a samčích pohlavních buněk 1,2,3

Fulka, J. Jr., 1Syková, E., 2Mrázek, M., 2Teplá, O., 3 Krylov, V.,4Kopská, T., 4Fulková, H., 4Mrkvan, T., 1,3 Křen, R., 1,5Motlík, J. 1 2

Centrum buněčné terapie a tkáňových náhrad, 2LF UK, V Úvalu 84, 150 06 Praha 5 Centrum asistované reprodukce ISCARE IVF, Hloubětínská 3/13, 198 00 Praha 9

4 5

Přírodovědecká fakulta UK, Viničná 7, 128 44 Praha 2 Ústav fyziologie a genetiky zvířat ČAV, 277 21 Liběchov

Souhrn Mikromanipulační techniky nacházejí široké uplatnění při studiu časné embryogeneze savců, produkci identických jedinců dělením embryí nebo přenosem jader a v asistované reprodukci u lidí. Náš článek je stručným přehledem a úvahou o možnosti využití těchto technik pro buněčné terapie u lidí.

Summary The applications of cell therapies in mammalian germ cells. Fulka, J., Jr., Syková, E., Mrázek, M., Teplá, O., Krylov, V., Kopská, T., Fulková, H., Mrkvan, T., Křen, R., Motlík, J. Micromanipulation techniques are widely used in early embryonic studies, for the production of identical twins by embryo splitting or by nuclear transfer and/or in human assisted reproduction. Our contribution discusses their potential use for cell therapies in humans. Narození ovce Dolly v roce 1996 (Wilmut a spol., 1997) po přenosu jádra somatické buňky do enukleovaného oocytu, produkce klonovaných jedinců skotu (Kato a spol., 1998), myší (Wakayama a spol., 1998), koz (Baguisi a spol., 1999) a prasat (Poleajeva a spol., 2000) vyvolalo četné diskuze o využití těchto technik u lidí. K tomu jistě přispěla i zpráva o narození opice Tetry po separaci blastomer časného embrya (Chan a spol., 2000), ustavení linií embryonálních kmenových buněk z lidských embryí (Thompson a spol., 1998, Shamblott a spol., 1998) a v neposlední řadě i překvapivé výsledky týkající se tkáňově specifických kmenových buněk. Je však nezbytné poznamenat, že i přes povzbudivé výsledky není řada postupů spolehlivě zvládnuta, a tím je dána i nezbytnost dalšího intenzivního výzkumu, než budou možné aplikace u lidí. Problémem jsou často i otázky etické, především v souvislosti s využitím nadbytečných embryí získaných po oplození in vitro pro ustavení linií lidských embryonálních kmenových buněk, ale i s případnými terapeutickými přenosy jader. Přes naději, kterou nové přístupy přinášejí pro léčení některých chorob u lidí, je zřejmé, že tyto postupy musí být natolik spolehlivě zvládnuty, aby se vyloučila veškerá možná rizika, která je mohou doprovázet (Fulka, Jr. a spol., 2000).

Vznik embrya a časný embryonální vývoj Embryo schopné normálního vývoje vznikne za přirozených podmínek pouze po penetraci spermie do oocytu. Předtím však musí obě gamety projít řadou pochodů, jejichž hlavním cílem je haploidizace genomu meiotickým zráním. Cytoplazma embrya pochází v podstatě výhradně z oocytu. Proto jsou pro úspěšný vývoj embrya velmi důležité i cytoplazmatické pochody, kterými prochází oocyt těsně před penetrací spermie. Finální část přípravy oocytu pro oplození probíhá in vivo po vzestupu hladin LH, nebo in vitro po izolaci oocytů

z folikulů a jejich kultivaci za vhodných podmínek. U oocytů proběhne rozpad jádra (GVzárodečný váček) a chromozomy zkondenzují. Po jejich uspořádání v metafázi I následují anafáze a telofáze I, kdy však k pólům vřeténka putují bivalenty. Polovina bivalentů je vydělena mimo oocyt jako první pólové tělísko, druhá část je uspořádána do metafáze II. K vlastní redukci na haploidní počet dojde až po oplození, kdy v anafázi II dochází k separaci chromatid a vyloučení jejich poloviny mimo oocyt ve formě druhého pólového tělíska. Po oplození jak chromozomy spermie, tak i oocytu dekondenzují, utvoří se samčí a samičí prvojádro a po proběhnutí S-fáze (replikace DNA) jsou chromozomy uspořádány do první mitotické metafáze, po které následuje rozdělení embrya do dvou stejně velkých blastomer. Následující dělení představují stádia 4 a 8 blastomer. V obou stádiích jsou blastomery jednotlivých embryí stejně velké a předpokládá se, že u nich dosud nedochází k determinaci toho, jaké linie budou následně tvořit. K tomu dojde až při kompakci embrya, kdy mizí mezibuněčné prostory, některé blastomery jsou uloženy uvnitř embrya, zatímco další je obklopují. Zcela evidentní je diferenciace ve stádiu blastocysty, kdy jsou patrné dvě odlišné populace buněk - embryoblast (ICM - inner cell mass), který se jako shluk buněk nachází uvnitř dutiny embrya (blastocoel), a trofektoderm, buňky ohraničující tuto dutinu. Z embryoblastu vzniká vlastní embryo, z trofektodermu pak plodové obaly. Jak bude uvedeno dále, stádia od GV do blastocysty představují velmi vhodné objekty pro buněčné terapie.

Produkce identických jedinců separací buněk časného embrya Pokusy, při kterých byla např. zničena jedna z blastomer dvoubuněčných embryí, dokázaly, že zbývající blastomera se dále vyvíjí až do stádia blastocysty a po implantaci do narození nového jedince. Ostatně i identická dvojčata u lidí vznikají pravděpodobně tím, že se od dvoublastomerního embrya každá z blastomer vyvíjí nezávisle. Na tomto základě se uvažovalo o tom, že by se separací blastomer časného embrya mohla produkovat identická dvojčata, čtyřčata atd. Tuto představu dovedl do praktického využití v podstatě až Willadsen (1979), který separoval blastomery dvoubuněčného embrya, přenesl je do hostitelských zón pellucid a následně v agarových blocích do vejcovodů přechodných příjemců. Za 4 - 5 dnů po přenosu byly bloky z vejcovodů vypláchnuty a embrya ve stádiu blastocysty přenesena definitivním příjemcům. Narození několika párů identických dvojčat dokázalo vysokou efektivitu postupu. Tento postup byl pak následně aplikován i na další druhy, identická dvojčata skotu produkovala i naše laboratoř. Cílem těchto pokusů byla především zvýšená produkce zvířat kvalitního genotypu. Další pokusy vedly k zjednodušení metody, navíc se pak ukázalo, že i rozdělení embrya v pozdějších stádiích na dvě poloviny přináší uspokojivé výsledky. S počtem dalších dělení - na čtvrtiny atd. efektivnost metody drasticky klesala a celý postup přestal být později prakticky používán. Nový zájem vyvolala publikace o narození opice Tetry (Chan a spol., 2000), která vznikla ze dvou blastomer izolovaných z osmibuněčného embrya. Cílem těchto pokusů není produkce identických dvojčat (čtyřčat). Předpokládá se ale, že by se jedna polovina embrya nechala vyvíjet až do narození, zatímco druhá část by byla využita k ustavení linií embryonálních kmenových buněk. Ty by pak mohly být po diferenciaci přeneseny již narozenému jedinci s určitou chorobou nebo defektem. Vzhledem k tomu, že by kmenové buňky byly geneticky totožné, nedošlo by k jejich odmítnutí hostitelským organizmem. Z tohoto pohledu se jeví celý postup jako velmi perspektivní pro modelové pokusy. Úvahy o tom, že by i u lidí mohla být jedna polovina embrya použita jako potenciální zdroj

embryonálních kmenových buněk pro budoucnost, jsou lákavé, ale byly z důvodů etických zásadně odmítnuty.

Přenosy jader Genom jedince je ustaven po oplození v první mitotické metafázi, kdy dochází ke sloučení chromozomů jak od matky, tak i od otce. Další dělení (až na linie zárodečných buněk) probíhají mitoticky - tím je původní informace kopírována do dceřiné buňky. V průběhu vývoje však dochází u buněk k další diferenciaci podle toho, jakou přebírají funkci. Klonování mělo původně zodpovědět otázku, zda a za jakých podmínek můžeme jádro dediferencovat tak, aby po přenosu znovu zabezpečilo vývoj až po narození nového jedince, který bude v podstatě kopií dárce jádra. Počáteční pokusy využívaly pro přenos jádra blastomery časného embrya, které byly fúzovány s enukleovanými oocyty (zygotami). Jako model byla výhradně používána myš. Tyto pokusy byly natolik neúspěšné, že výsledky vedly k závěru, že je klonování savců biologicky nemožné. V roce 1986 však Willadsen publikoval sdělení, že se mu podařilo naklonovat ovce přenosem jader blastomer 8-16 buněčných embryí do enukleovaných oocytů metafáze II. Jeho výsledky byly potvrzeny narozením klonovaných telat a následně i mláďat dalších druhů. V dalších letech byla pro přenos používána jádra z pozdějších vývojových stádií a nakonec i jádra již narozených jedinců (Wilmut a spol., 1997).

Metody produkce klonů K vyprodukování klonu potřebujeme dvě buňky - oocyt v metafázi II a danou buňku, jejíž jádro chceme přenášet. Z oocytu však nejdříve musíme odstranit vlastní genetický jaderný materiál (chromozomy). Tento krok nazýváme enukleace, enukleovaný oocyt se nazývá cytoplast (Obr. 1a,b).

Obr. 1a, b - Enukleace savčího oocytu. Fixační pipeta (prázdná šipka) udržuje oocyt ve stabilní pozici. Enukleační pipetou (plná šipka) odsáváme chromozomy, které se nacházejí pod prvním pólovým tělískem (tenká šipka). Jádra přenášíme do cytoplastu buď jejich přímou injekcí, nebo fúzí buňky s cytoplastem. V druhém případě označujeme celou buňku s jádrem jako "karyoplast". Přenos jádra je delikátní záležitost. Především jde o objekty velmi malé (oocyt ?100µm), které jsou navíc

značně náchylné k poškození. Přenosy jader však nemusí vždy znamenat to, že bude vytvořena kopie již narozeného jedince. V podstatě lze použít k přenosu jádra: a/ velmi časného embrya, nebo kultivovaných buněk embryoblastu (ICM - inner cell mass) Tento postup se používal především v počátcích, např. osmiblastomerní embryo bylo rozděleno na jednotlivé buňky (8), jejichž jádra byla přenesena do enukleovaných oocytů. Pokud zrekonstruovaná embrya (blastomery) nebyla opět použita jako zdroj karyoplastů, byl počet jedinců, kteří se teoreticky mohli narodit, dán počtem blastomer časného embrya (8). Později byla pro přenos použita i jádra z buněk kultivovaných embryoblastů (ICM), avšak s nepoměrně nižším úspěchem. Využití této techniky se předpokládalo především pro multiplikaci embryí od vynikajících jedinců. Úspěšnost tohoto postupu byla velmi vysoká (Loi a spol., 1998). b/ fetální fibroblasty izolované z plodů ve stáří 2-3 měsíců Úspěšné použití embryonálních fibroblastů jako karyoplastů bylo publikováno současně se zprávou o narození ovce Dolly. Výhodou je, že počet fibroblastů není v podstatě omezen: lze je snadno kultivovat a geneticky modifikovat. Využití se předpokládá pro tvorbu transgenních klonovaných jedinců. c/ buňky již narozeného jedince Pro přenos je použito jádro buňky již narozeného jedince, a proto v podstatě víme, jak bude klonovaný jedinec vypadat. Původní předpoklad počítal především s tvorbou kopií vynikajících jedinců zvířat, záchranou ohrožených druhů zvířat a množením transgenních jedinců. Stejný výčet variant bychom mohli poskytnout ohledně cytoplastů, nicméně je obecně akceptováno, že nejoptimálnější jsou především cytoplasty vzniklé enukleací oocytů v metafázi II (Fulka, Jr. a spol., 1996, 1998, 2001). Nízká efektivnost klonování, zejména při využití somatických buněk jako karyoplastů, jasně dokazuje, že řada aspektů souvisejících s úspěchem při přenosech jader zůstává velmi nejasná. Výše uvedený přehled také dokazuje, že klonování nepředstavuje pouze produkci kopií již narozených jedinců. Metody přenosů jader a tím i jejich účel závisí na zdroji jader a především na tom, k čemu má postup sloužit. V zásadě však klonování dělíme na: a/ reprodukční - které vede k narození nového jedince b/ terapeutické - které by mělo sloužit především pro tvorbu embryonálních kmenových buněk. V další části se budeme detailněji problematikou embryonálních kmenových buněk zabývat, zejména pak v souvislosti s terapeutickým klonováním. Jak jsme již uvedli, evidentní diferenciace buněk embrya je patrná ve stádiu blastocysty, kdy jsou zřejmé dvě populace buněk - trofektoderm a embryoblast. Z embryoblastu vzniká vlastní embryo (mezoderm, ektoderm, endoderm). Počet buněk embryoblastu je však omezen a dlouho se nedařilo je kultivovat tak, aby neztratily svoje "univerzální" vlastnosti - pluripotenci. Až v roce 1981 publikovaly dvě skupiny vědeckých pracovníků zprávy, že se jim buňky daří kultivovat in vitro tak, že množením neztrácejí své původní charakteristiky. To lze ověřit především tím, že se tyto buňky (ES, angl. embryonic stem cells) přenášejí do hostitelských embryí a u narozených zvířat se analyzuje jejich participace na tvorbě tkání (důležité je zastoupení v gonádách). Snahy o ustavení linií ES buněk u hospodářských zvířat nelze dosud označit za úspěšné. O to překvapivější byly zprávy z roků 1998 a 2000, které uvádějí, že se třem skupinám na světě podařilo ustavit linie lidských embryonálních (zárodečných) kmenových buněk. Pro ověření pluripotence nelze pochopitelně přenášet tyto buňky do lidských zárodků, nicméně charakteristiky a

možnost diferenciace na různé tkáně in vitro svědčí o tom, se příliš neliší od ES buněk myši. I když proces cílené diferenciace ES buněk není dosud spolehlivě zvládnut, předpokládá se na základě jejich značné spontánní diferenciační verzatility jejich využití v humánní medicíně. Linie ES buněk je možné získat z nadbytečných embryí z klinik asistované reprodukce, není však zcela jasné, zda by tyto buňky byly imunologicky kompatibilní s příjemcem. Z tohoto důvodu se uvažuje o tzv. klonování terapeutickém, které by v žádném případě nevedlo k narození nového jedince, ale "pouze" k tvorbě embryí, z nichž by byl izolován embryoblast, který by byl použit následně k ustavení linií ES buněk. Celý postup by pak vypadal následovně: Pacient s určitou nemocí by daroval svoje buňky, jejichž jádro by bylo přeneseno do oocytu. Rekonstruovaná embrya by se nechala vyvíjet až do stádia blastocysty, ze kterých by byl izolován embryoblast pro tvorbu linií ES buněk. Po jejich namnožení na dostatečný počet by se u nich indukovala diferenciace na požadovaný typ tkáně, která by byla následně dárci jádra přenesena. Výše uvedený postup je však jen jednou z uvažovaných variant. Zdá se, že pro tvorbu ES buněk by mohla být využita jakákoliv embrya, neboť u nich dosud nedochází k expresi povrchových antigenů, a tak by tělo příjemce nemuselo poznat, že jde o cizí buňky. Teoreticky by mohly být využity i linie partenogenetických ES buněk. U myší bylo dokázáno, že se tyto buňky prioritně podílejí na tvorbě jen určitých tkání. Otevřena je i otázka využití somatických kmenových buněk (tkáňově specifických), které rovněž vykazují určitou verzatilitu. V současné době je velmi těžké rozhodnout, která z cest bude nejperspektivnější.

Buněčná terapie na úrovni samčích a samičích pohlavních buněk V závěrečné části našeho příspěvku bychom se chtěli zaměřit na buněčné terapie v asistované reprodukci. Cílem není přehled o technikách, které jsou v současné době používány - IVF, ICSI, ROSI atd. Tyto postupy svým způsobem buněčné terapie nepředstavují a jde u nich zpravidla o získání samčí zárodečné buňky, která je následně injikována do oocytu. Náš přehled se bude týkat postupů, při kterých je defektní samičí buňka "opravena" - např. nahrazena defektní cytoplazma, nebo transformována na plnohodnotnou buňka samčí tak, aby po injekci do oocytu byl zabezpečen plnohodnotný vývoj. Konečným produktem meiotického zrání samičích a samčích buněk by měly být gamety, jejichž spojením vznikne embryo, jehož vývoj plnohodnotně probíhá až do narození nového jedince. Tato kritéria splňují pohlavní buňky většiny druhů savců, u lidí však situace začíná být kritická. Nelze předpokládat, že se tento stav v budoucnosti zlepší - spíše naopak. V současné době se problémy spojené s fertilitou týkají až 20% dvojic, většinu z nich lze řešit oplozením in vitro, intracytoplazmatickými injekcemi spermií (ICSI) nebo dokonce náročnějšími postupy. I přes dosažené úspěchy zůstává řada případů, které uvedené techniky vyřešit nedokáží. V této souvislosti se uvažuje o využití dalších postupů - buněčných terapií, které by měly pomoci ve většině zbývajících případů a navíc vést např. k eliminaci nemocí zapříčiněných vlivem mitochondriálního genomu. Současně by ale měly tyto postupy umožnit snadnější, z hlediska etického přijatelnější, produkci embryí s následným využitím při ustavení embryonálních kmenových buněk, které by byly využity pro buněčné terapie.

Samčí pohlavní buňky K defektům spermatogeneze může v podstatě dojít v jakékoliv fázi vývoje spermií. Výsledkem je buď minimální počet spermií v ejakulátu, nebo jejich totální absence. Určitým řešením může být jejich získávání z nadvarlete nebo po testikulární biopsii. V některých případech jsou i tyto přístupy neúspěšné, nicméně z varlete jsou získány jiné buňky - prekurzory spermií. Jejich inkubace s testosteronem a FSH po 48 hodin vede k jejich transformaci na spermatidy ve stádiích Sb1 až Sd, které již mají haploidní počet chromozomů. Po jejich injekci do oocytů v metafázi II dochází k dekondenzaci chromatinu, tvorbě samčího prvojádra a normálnímu vývoji embrya až do narození zdravého potomstva. Není dosud známo, zda po ošetření dochází pouze k transformaci již haploidních buněk, nebo je akcelerována meióza z diploidních stádií. V naší laboratoři jsme ověřovali výše uvedený postup a můžeme jen potvrdit jeho účinnost. Transformované spermatidy však u nás dosud do oocytů injikovány nebyly. Další terapie, která je uvažována jako teoretické řešení pro absolutní absenci samčích zárodečných buněk (např. Sertoli cells only syndrome), je produkce gamet haploidizací somatických buněk. Vlastní haploidizaci lze zatím dosáhnout pouze transplantací somatické buňky do nezralého enukleovaného oocytu, který následně projde prvním a druhým meiotickým zráním. Přenášená jádra musí být ve stadiu G2. Druhou alternativou je přenos jádra ve stádiu G2 do enukleovaného oocytu metafáze II a následná aktivace. V obou případech se počet chromozomů sníží na polovinu, není však dosud známo, zda je rozdělení ekvivalentní. Po aktivaci by se u prvojader zablokovala replikace DNA a prvojádro by se přeneslo do partenogeneticky aktivovaného oocytu. Výše uvedené údaje jsou však zatím velmi předběžné.

Samičí pohlavní buňky Stejně jako spermatogenezi provází i oogenezi řada defektů, jejichž výsledkem je nedostatečná produkce oplození schopných oocytů, oocytů morfologicky abnormálních nebo oocytů s určitými defekty (mtDNA). K narůstání výskytu různých komplikací přispívá i to, že se rozhodnutí mít potomstvo odkládá do stále pozdějšího věku ženy. Je jasně dokázáno, že tím se snižuje kvalita oocytů, což se projevuje např i odlišnou morfologií meiotického vřeténka v průběhu zrání a následně pak vyšším výskytem chromozomálních abnormalit. Karyotyp některé z blastomer časného embrya není spolehlivým ukazatelem, neboť je známo, že časná humánní embrya jsou často mozaikou různých karyotypů a i omezený počet normálních blastomer zabezpečí kompletní vývoj. Stejně jako u samčího pohlaví se při totální absenci oocytů uvažuje o haploidizaci somatických buněk přenosem do enukleovaných oocytů dárce. Výsledkem by měl být "haploidní" oocyt, který by byl následně oplozen spermií partnera. Problémem by mohla být mitochondriální DNA, která by výhradně pocházela z cytoplazmy dárce oocytu. V tomto případě by byla vyžadována přísná kontrola, zda tato mtDNA nemůže následně zapříčinit určité choroby. Z etického hlediska by daný postup neměl představovat vážný problém. V řadě zemí je dárcovství oocytů povoleno. Injekce cytoplazmy do embryí (zygot) s určitým vývojovým defektem jsou již v současné době používány v případech, kdy se embrya po předchozích ošetřeních opakovaně z

neznámých důvodů nevyvíjela. Do těchto embryí je injikována cytoplazma z dárcovských oocytů. V řadě případů došlo k výraznému zvýšení vývojového potenciálu takto ošetřených zygot - včetně narození zcela normálních dětí. Ekvivalentním řešením by mohl být přenos zárodečných váčků z defektních oocytů do enukleovaných normálních oocytů nezralých (Obr. 2).

Obr. 2 - Přenos zárodečných váčků do enukleovaných nezralých savčích oocytů. Plná šipka - enukleovaný oocyt (cytoplast), prázdná šipka - karyoplast (zárodečný váček), který je následně přenesen do cytoplastu elektrickými pulzy. Stejně tak by mohly být přenášeny chromozomy metafáze II. Jak bylo uvedeno výše, defekty mtDNA mohou být příčinou vážných nemocí. Řešením by mohl být přenos prvojader z defektních embryí do enukleovaných aktivovaných oocytů (v podstatě dárcovství cytoplazmy). Ve výčtu dalších alternativ bychom mohli pokračovat, buněčné terapie v této oblasti mají značný rozsah (využití při záchraně samičích pohlavních buněk např. před chemoterapií či lokálním ozářením vaječníku, záchrana normálních blastomer z abnormálně se vyvíjejících embryí atd.). Jisté je, že využití výše uvedených technik a postupů může velmi rychle vést k řešení některých problémů infertility, navíc pak s ohledem na další buněčné terapie jistě tyto postupy mohou přispět k snadnější a snad i eticky akceptovatelnější produkci linií humánních embryonálních kmenových buněk. Pochopitelně jako u dalších buněčných terapií existuje i zde řada dosud nedořešených a nezodpovězených otázek.

Závěr Buněčné terapie představují velmi perspektivní přístup k léčení řady chorob a defektů v humánní medicíně v rozsahu, který můžeme v současné době jen velmi těžko odhadnout. Včetně určitých rizik, které s sebou nové postupy mohou nést, je nezbytné vzít v potaz i otázky etické. Námi uvedený přehled není výčtem všech možností, ale jen náznakem toho, kde by mohly být terapie aplikovány. Diskuze nad riziky a etickými otázkami by si navíc vyžádala další samostatný článek. Podporováno z programu výzkumu a vývoje "Výzkumná centra" č. projektu LN00A065.

Literatura

1. Baguisi, A., Behboodi, E., Melican, D.T., Pollock, J.S., Destrempes, M.M., Cammuso, C., Williams, J.L., Nims, S.D., Porter, C.A., Midura, P., Palacios, M.J., Ayres, S., Denniston, R.S., Hayes, M.L., Ziomek, C.A., Meade, H.M., Godke, R.A., Gavin, M.G., Overstrom, E.W. & Echelard, Y. (1999) Production of goats by somatic cell nuclear transfer. Nature Biotechnol., 17, 456-461 2. Chan, A.W.S., Dominko, T., Luetjens, C.M., Neuber, E., Martinowich, C., Hewitson, L., Simerly, C. & Schatten, G.P. (2000) Clonal propagation of primate offspring by embryo splitting. Science, 287, 317-319 3. Fulka, Jr., J., First, N.L. & Moor, R.M. (1996) Nuclear transplantation in mammals: remodelling of transplanted nuclei under the influence of maturation promoting factor. BioEssays, 18, 835-840 4. Fulka, Jr., J., First, N.L., Loi, P. & Moor, R.M. (1998) Cloning by somatic cell nuclear transfer. BioEssays, 20, 847-851 5. Fulka, Jr., J., Syková, E., Fulková, H. & Motlík, J. (2000) Klonování reprodukční a terapeutické. Vesmír, 79, 127-129 6. Fulka, Jr., J., Loi, P., Ledda, S., Moor, R.M. & Fulka, J. (2001) Nucleus transfer in mammals: how the oocyte cytoplasm modifies the transferred nucleus. Theriogenology, v tisku 7. Kato, Y., Tani, T. Sotomaru, Y., Kurokawa, K., Kato, J., Doguchi, H., Yasue, H. & Tsunoda, Y. (1998) Eight calves cloned from somatic cells of a single adult. Science, 282, 2095-2098 8. Loi, P., Ledda, S., Fulka, Jr., J., Cappai, P. & Moor, R.M. (1998) Development of parthenogenetic and cloned ovine embryos: effect of activation protocol. Biol. Reprod., 58, 1177-1187 9. Polejaeva, I.A., Chen, S.H., Vaught, T.D., Page, R.L., Mullins, J., Ball, S., Dai, Y., Boone, J., Walker, S., Ayares, D., Colman, A. & Cambell, K.H.S. (2000) Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature, 407, 86-90 10. Shamblott, M.J., Axelman, J., Wang, S., Bugg, E.M., Littlefield, J.W., Donovan, P.J., Blumental, P.D., Huggins, G.R. & Gearhart, J.D. (1998) Derivation of pluripotent stem cells from culture human primordial germ cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 95, 13726-13731 11. Thomson, J.A., Itskowitz-Eldor, J., Shapiro, S.S., Waknitz, M.A., Swiergel, J.J., Marshall, V.S. & Jones, J.M. (1998) Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science, 1145-1147 12. Wakayama, T., Perry, A.F.C., Zuccotti, M., Johnson, K.R., & Yanagimachi, R. (1998) Full term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature, 394, 369-374 13. Willadsen, S.M. (1979) A method for culture of micromanipulated sheep embryos and its use to produce monozygotic twins. Nature, 277, 298-300 14. Willadsen, S.M. (1986) Nuclear transplantation in sheep embryos. Nature, 320, 6365 15. Wilmut, I., Schnieke, A.E., McWhir, J., Kind, A.J. & Campbell, K.H.S. (1997) Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature, 385, 810813. Adresa pro korespondenci:

J. Fulka, Jr. Výzkumný ústav živočišné výroby Přátelství 815, POB 1, 104 01 Praha 10 E-mail: [email protected] Fax: (2) 677710659 Tel: (2) 67710659

Embryonální kmenové buňky a buněčná terapie Dvořák, P., Hampl, A. Centrum buněčné terapie a tkáňových náhrad Univerzita Karlova v Praze, V Úvalu 94, 150 06 Praha 5 Laboratoř molekulární embryologie Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a Ústavu živočišné fyziologie a genetiky AV ČR, Zemědělská 1, 613 00 Brno

Souhrn Organogeneze je složitý proces odehrávající se u převážné většiny savců krátce po uchycení časného embrya, blastocysty, na stěnu dělohy. Během několika dnů organogeneze jsou ze tří základních zárodečných linií embryonálních buněk, ektodermu, mezodermu a endodermu, formovány tkáně a orgány budoucího dospělého jedince s odpovídajícími populacemi funkčně specializovaných buněk. Před organogenezí, ve vývojovém stádiu blastocysty, stojí malá skupina buněk takzvaná vnitřní buněčná masa (epiblast, embryoblast), tvořená primitivním ektodermem a primitivním endodermem. S možností buňky primitivního ektodermu, ex vivo označované jako embryonální kmenové buňky, snadno izolovat a množit, cíleně diferencovat a geneticky modifikovat se naskýtá příležitost využít tyto pro buněčné terapie. Následující přehled se v obecné rovině zabývá a) vymezením kategorie embryonálních kmenových buněk ve vyvíjejícím se embryu a jejich srovnáním s kmenovými buňkami, které jsou přítomné v jednotlivých orgánech a tkáních dospělého organizmu, b) manipulacemi s embryonálními kmenovými buňkami in vitro, a c) možnostmi a úskalími jejich "praktického" použití pro buněčné terapie.

Summary Embryonic stem cells and cell therapy Dvořák, P., Hampl, A. In mammals, an intricate process of forming organs (organogenesis) begins upon the implantation of blastocyst into uterine wall. Since that developmental step, three basic embryonal cell lineages give rise to all tissues and organs typical for the adult. Organogenesis itself is preceded by the existence of inner cell mass of blastocyst (epiblast) represented by a small group of two types of cells, primitive ectoderm and primitive endoderm. The technologies have been developed that allow researchers to isolate, in vitro propagate, intentionally differentiate, and genetically modify the cells of primitive ectoderm, ex vivo called embryonic stem cells. This review aims to present in general

terms a) a biology of embryonic stem cells including the comparison with organ stem cells of adult, b) the principles of manipulating embryonic stem cells in vitro, and c) the potentials and drawbacks of their exploitation for cell therapies.

Kmenové buňky dospělých jedinců versus embryonální kmenové buňky Většina orgánů obsahuje kromě heterogenní populace specializovaných, vlastní funkci orgánu nebo tkáně zajišťujících buněk ještě početně omezenou buněčnou populaci zajišťující náhradu "opotřebovaných" buněk v konečných stádiích diferenciace a tím trvalou regeneraci celých funkčních jednotek. Dlouhou dobu se myslelo, že buňky tohoto typu, často označované jako orgánové kmenové buňky, jsou hojné pouze ve vyvíjejících se zárodcích, v nedávné době však byla jejich existence prokázána i u dospělých jedinců. Kmenové buňky u dospělců jsou nyní poměrně dobře definovatelnou buněčnou populací například v hematopoetickém systému a v kůži, kde umožňují kontinuální náhradu přirozeně nebo následkem poškození odumírajících buněk. Překvapivě však byly objeveny i v tak "stabilních" strukturách těla, jakými jsou například mozek a kosti. Společnou vlastností všech kmenových buněk je jejich schopnost dávat vznik přinejmenším jedné specializované populaci buněk a vytvářet své vlastní kopie. V nedávné době byla u kmenových buněk dospělých objevena ještě jedna vlastnost, která je velmi významná zejména pro jejich potenciální terapeutické použití. Přinejmenším některé z nich se mohou přizpůsobovat prostředí, do kterého jsou vloženy a zásadně měnit svůj původní směr vývoje. Tato jejich neočekávaná vlastnost byla poprvé odhalena experimenty s nervovými kmenovými buňkami, které se po vnesení do krve vlivem okolního prostředí zcela změnily a staly se krevními buňkami (Bjornson a spol., 1999). V mnoha ohledech podobné vlastnosti mají také embryonální kmenové buňky (Obr. 1).

Obr. 1 - Dobře ohraničené, kompaktní kolonie nediferencovaných myších embryonálních kmenových buněk kultivovaných na vrstvě primárních embryonálních fibroblastů. Ty navíc, díky svému původu z vnitřní buněčné masy blastocyst, mají pravděpodobně podstatně širší možnosti vyvinout se v různé více či méně specializované buněčné typy. Výjimečná univerzálnost embryonálních kmenových buněk byla elegantním způsobem opakovaně potvrzena na živých modelových zvířatech - myších. Po jejich označení "molekulární značkou" a přenesení do vyvíjejících se blastocyst, byly při pozdější analýze nalezeny označené buňky odvozené z původních embryonálních kmenových buněk ve všech orgánech dospělých jedinců, včetně pohlavních žláz, kde daly vznik pohlavním

buňkám.

Izolace a kultivace embryonálních kmenových buněk Poprvé se podařilo získat embryonální kmenové buňky z vnitřní buněčné masy myších blastocyst současně dvěma nezávislými skupinami vědců v roce 1981 (Martin, 1981; Evans a Kaufman, 1981). K jejich izolaci z heterogenní populace buněk vnitřní buněčné masy byla použita jednoduchá technika opakovaných mikrodisekcí a pasáží buněk primitivního ektodermu, selektovaných na základě jejich typické morfologie. Tuto techniku s mírnými obměnami používáme i v naší laboratoři (Obr. 2).

Obr. 2 - Základní přístup k izolaci myších embryonálních kmenových buněk. V zásadě identickou technikou byly získány i lidské embryonální kmenové buňky Pro neomezené množení embryonálních kmenových buněk bez ztráty jejich základní vlastnosti, totipotence, je zcela zásadní přítomnost cytokinu, Leukemického Inhibičního Faktoru (LIF), bílkoviny, která stimuluje specifické receptory na buněčné membráně. Signál z nich je přenášen do jádra buňky, kde řídí aktivitu transkripčních faktorů, regulačních molekul zodpovědných za udržení stavu totipotence (Smith a spol., 1988; Williams a spol., 1988). LIF může být kmenovým buňkám, bezprostředně po jejich vyjmutí z blastocyst a přenesení do podmínek in vitro, dodáván ve dvou formách. První z nich je LIF produkovaný primárními fibroblasty izolovanými z 11 až 13 ti denních myších zárodků, které se používají jako kultivační podložka buněk vnitřní buněčné masy. Fetální fibroblasty zároveň usnadňují adherenci a stimulují růst buněk vnitřní buněčné masy. Doplňujícím zdrojem je uměle, molekulárně-biologickými technikami připravený LIF, přidávaný ve vysokých koncentracích do kultivačního média. Nejvýznamnější vlastnost embryonálních kmenových buněk, totipotence, je velmi přesvědčivě prokázána schopností embryonálních kmenových buněk dát vznik pohlavním buňkám v "hostitelském" organizmu. Právě tato schopnost, která zajistí přenos genetické informace nesené embryonálními kmenovými buňkami na potomstvo, udělala z embryonálních kmenových buněk jeden z nejefektivnějších nástrojů cílených zásahů do myšího genomu (Dvořák a Hampl, 1999). Možnosti využít embryonální kmenové buňky pro manipulace s genomem vyvolaly vlnu pokusů získat obdobné buňky také z embryí hospodářských zvířat s cílem ovlivnit užitkové vlastnosti nebo odolnost proti chorobám.

Ve většině případů skončily tyto pokusy neúspěšně nebo nebyly opakovatelné. Doposud byly embryonální kmenové buňky úspěšně izolovány, množeny v podmínkách in vitro bez ztráty totipotence a přesvědčivě charakterizovány pouze u laboratorní myši (Martin, 1981; Evans a Kaufman, 1981), opice (Thomson a spol., 1995) a člověka (Shamblott a spol., 1998; Thomson a spol., 1998).

Diferenciace embryonálních kmenových buněk Embryonální kmenové buňky, ať již vyňaté z embrya nebo jako jeho součást, nemají tak jasně předurčen svůj osud jako je tomu u kmenových buněk dospělých v jejich původním prostředí. Oba buněčné typy mohou volit mezi třemi základními alternativami. První z nich je vlastní reprodukce v původním, totipotentním, stavu. Druhá alternativa, kvalitativně odlišující totipotentní embryonální kmenové buňky od "pouze" pluripotentních kmenových buněk dospělých, je diferenciace. Poslední možností je buněčná smrt - apoptóza. Jak je uvedeno v předešlém odstavci, reprodukce totipotentních kmenových buněk nepředstavuje z technického hlediska závažnější problém. Proto je pro budoucí použití embryonálních kmenových buněk v buněčných terapiích limitující především dostatečné poznání mechanizmů diferenciace a vývoj metodických postupů jak proces diferenciace ovlivnit. Příkladem bouřlivého pokroku v poznávání diferenciačního potenciálu embryonálních kmenových buněk směřujícího k buněčným terapiím může být získání homogenních populací nervových (Hancock a spol., 2000; Lee a spol., 2000), hematopoetických (Era a spol., 2000) nebo svalových buněk (Doevendans a spol., 2000; Prelle a spol., 2000) v podmínkách kultivace in vitro. Pokroky v terapeutickém použití embryonálních kmenových buněk Odvážnými a především úspěšnými pokusy skupiny Johna Gearharta z John Hopkins Hospital a Jamese Thomsona z University of Wisconsin, kteří téměř současně získali linie lidských embryonálních zárodečných a kmenových buněk (Shamblott a spol., 1998; Thomson a spol., 1998), dostal dosud teoretický výzkum mechanizmů diferenciace embryonálních kmenových buněk nový rozměr. Nejvýznamnější otázkou se stalo chování embryonálních kmenových buněk po implantaci do orgánu příjemce. Příkladem pokusů částečně odpovědět na tuto zásadní otázku mohou být následující transplantační experimenty s myšími buňkami. Totipotentní embryonální kmenové buňky byly bez jakéhokoli předešlého zásahu transplantovány do mozku dospělé myši. Přežití transplantovaných buněk bylo téměř stoprocentní a navíc bylo zjištěno, že část štěpu vytvořila buňky podobné neuronům, schopné integrovat se do mozku příjemce (Deacon a spol., 1998). Obdobný transplantační experiment, tentokrát využívající buňky diferencované in vitro, ukázal, že embryonální kmenové buňky mohou vytvářet v mozku příjemce nejenom neurony, ale i gliové buňky (Benninger a spol., 2000). Další významná studie naznačila, že oligodendrocyty, jeden z typů gliových buněk, vytvořené v podmínkách in vitro mohou nahradit chybějící myelin v poškozené míše dospělých jedinců (Liu a spol., 2000). Myší embryonální kmenové buňky mohou v podmínkách in vitro diferencovat do všech hematopoetických linií. Tato schopnost nejen činí z embryonálních kmenových buněk velmi užitečný model ke studiu mechanizmů, které regulují hematopoézu, ale také otevírá možnost použití těchto buněk k buněčné terapii poruch krvetvorby. Například Hole a kolektiv (1996) použili embryonální kmenové buňky v časném stádiu diferenciace pro transplantaci do krevního oběhu myší ozářených smrtelnou dávkou radiace. Tímto způsobem prodloužili jejich život o více než 3 týdny. Příkladem transplantační strategie

pro nahrazení nefunkčních či odumírajících srdečních buněk (kardiomyocytů) štěpem embryonálních kmenových buněk, navíc kombinované s obohacením kardiomyocytů in vitro pomocí transfekce totipotentních buněk fúzním genem obsahujícím promotor těžkého řetězce srdečního a-myosinu, může být práce Kluga a spolupracovníků (1996).

Jak přelstít imunitní systém Téměř nepřekonatelnou bariérou pro úspěšné osídlení poškozeného orgánu nebo tkáně embryonálními kmenovými buňkami nebo z nich diferencovanými buňkami je imunitní systém příjemce. Tuto bariéru je možné, alespoň částečně, obejít několika způsoby. První z nich je velmi dobře známý, fungující a ověřený, ale nákladný a v mnoha případech poškozující příjemce. Podstatou je dlouhodobé potlačování imunitního systému podáváním velkých dávek léčiv, takzvaných imunosupresiv. Druhý představitelný způsob, nijak nezasahující do organizmu příjemce, avšak podobně jako předešlý ne zcela dokonalý, je zakládání rozsáhlých bank linií embryonálních kmenových buněk s předem definovanými systémy transplantačních antigenů (MHC, Major Histocompatibility Complex). Vzhledem k vysokému stupni polymorfizmu MHC (pravděpodobnost identity mezi sourozenci je pouze 25%) však bude velmi náročné a nákladné takové banky vytvořit a udržovat, a situace bude nadále komplikovaná přítomností takzvaných minor histocompatibility antigenů, které jsou důležité pro rejekce štěpů a imunitní reakci štěpu vůči hostiteli (GvH). Třetí možností, jak usnadnit embryonálním kmenovým buňkám osídlit cílovou tkáň nebo orgán, jsou cílené inaktivace genů kódujících membránové antigeny MHC metodou homologní rekombinace. Příkladem použitelnosti této strategie může být prodloužené "přežívání" transplantovaných orgánů získaných z geneticky "upravených" myší s chybějícími MHC antigeny třídy I a II (Pollak a Blanchard, 2000). Přesto, podobně jako v případě bank linií embryonálních kmenových buněk, je téměř nemožné vyhnout se imunitní reakci která je zprostředkována "minor histocompatibility" antigeny. Další způsob, který by mohl být pro terapeutické použití embryonálních kmenových buněk výhodný, je transplantace in utero. Technologie transplantací kmenových nebo progenitorových buněk do vyvíjejícího se plodu in utero s cílem navodit imunologickou toleranci byly dlouhodobě vyvíjeny pro léčbu vrozených vad. I když současné výsledky za použití hematopoetických progenitorových buněk neodpovídají původním představám (Carrier a spol., 2000), použití nediferencovaných embryonálních kmenových buněk vzhledem k nepřítomnosti "klasických" MHC antigenů třídy I a II (Tian a spol., 1997) může být úspěšnější. Obdobnou strategii navození imunologické tolerance vůči buňkám získaným cílenou diferenciací libovolné linie embryonálních kmenových buněk představuje navození takzvaného chimérizmu. Podstatou metody je transplantace snadněji získatelných alogenních buněk kostní dřeně s MHC haplotypem embryonálních kmenových buněk, která předchází vlastní "terapeutické" transplantaci. Uvedená strategie, významně potlačující imunitní reakci zprostředkovanou T lymfocyty, je již ověřena zejména v transplantacích orgánů (Sachs, 2000; Exner a spol., 1999), ale s výhodami může sloužit i pro zamýšlené transplantace embryonálních kmenových buněk. Posledním a nejdiskutovanějším návrhem řešení problému imunitní reakce vůči embryonálním kmenovým buňkám je takzvané terapeutické klonování. Principem a výhodami terapeutického klonování se okrajově zabývá navazující příspěvek pracovníků

Laboratoře molekulární embryologie a podrobně jeden z dalších přehledných článků. Přesto je již nyní zřejmé, že etické překážky nedovolí v dohledné době použití strategie terapeutického klonování. Výše uvedená alternativní řešení však nabízejí dostatečný prostor pro rychlý rozvoj buněčných terapií založených na embryonálních kmenových buňkách. Poděkování Publikace vznikla za finanční podpory Programu podpory výzkumu a vývoje "Výzkumná centra" č. LN00A065 a Výzkumného záměru AF MZLU v Brně č. MSM 432100001.

Literatura 1. Benninger, Y., Marino, S., Hardegger, R., Weissmann, C., Aguzzi, A. & Brandner, S. (2000) Differentiation and histological analysis of embryonic stem cell-derived neural transplants in mice. Brain Pathol., 10:330-341 2. Bjornson, C.R., Rietze, R.L., Reynolds, B.A., Magli, M.C. & Vescovi, A.L. (1999) Turning brain into blood: a hematopoietic fate adopted by neural stem cells in vivo. Science, 283:534-537 3. Carrier, E., Gilpin, E., Lee, T.H., Busch, M.P. & Zanetti, M. (2000) Microchimerism does not induce tolerance after in utero transplantation and may lead to the development of alloreactivity. J.Lab.Clin.Med., 136:224-235 4. Deacon, T., Dinsmore, J., Costantini, L.C., Ratliff, J. & Isacson, O. (1998) Blastula-stage stem cells can differentiate into dopaminergic and serotonergic neurons after transplantation. Exp.Neurol., 149:28-41 5. Doevendans, P.A., Kubalak, S.W., An, R.H., Becker, D.K., Chien, K.R. & Kass, R.S. (2000) Differentiation of cardiomyocytes in floating embryoid bodies is comparable to fetal cardiomyocytes. J.Mol.Cell Cardiol., 32:839-851 6. Dvořák, P. & Hampl,A. (1999) The ins and outs of embryonic stem cells. Acta Univ.Agric.et Silvic. Mendel. Brun., 47:67-75 7. Era, T., Takagi, T., Takahashi, T., Bories, J.C. & Nakano, T. (2000) Characterization of hematopoietic lineage-specific gene expression by ES cell in vitro differentiation induction system. Blood, 95:870-878 8. Evans, M.J. & Kaufman, M.H. (1981) Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature, 292:154-156 9. Exner, B.G., Acholonu, I.N., Bergheim, M., Mueller, Y.M. & Ildstad S.T. (1999) Mixed allogeneic chimerism to induce tolerance to solid organ and cellular grafts. Acta Haematol., 101:78-81 10. Hancock, C.R., Wetherington, J.P., Lambert, N.A. & Condie, B.G. (2000) Neuronal differentiation of cryopreserved neural progenitor cells derived from mouse embryonic stem cells. Biochem.Biophys.Res.Commun., 271:418-421 11. Hole, N., Graham, G.J., Menzel, U. & Ansell, J.D. (1996) A limited temporal window for the derivation of multilineage repopulating hematopoietic progenitors during embryonal stem cell differentiation in vitro. Blood, 88:1266-1276 12. Klug, M.G., Soonpaa, M.H., Koh, G.Y. & Field, L.J. (1996) Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embryonic stem cells form stable intracardiac grafts. J.Clin.Invest., 98:216-224 13. Lee, S.H., Lumelsky, N., Studer, L., Auerbach, J.M. & McKay, R.D. (2000)

Efficient generation of midbrain and hindbrain neurons from mouse embryonic stem cells. Nat.Biotechnol., 18:675-679 14. Liu, S., Qu, Y., Stewart, T.J., Howard, M.J., Chakrabortty, S., Holekamp, T.F. & McDonald, J.W. (2000) Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 97:6126-6131 15. Martin, G.R. (1981) Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 78:7634-7636 16. Pollak, R. & Blanchard, J.M. (2000) Organ donor or graft pretreatment to prolong allograft survival: lessons learned in the murine model. Transplantation, 69:24322439 17. Shamblott, M.J., Axelman, J., Wang, S., Bugg, E.M., Littlefield, J.W., Donovan, P.J., Blumenthal, P.D., Huggins, G.R. & Gearhart, J.D. (1998) Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells. Proc.natl.Acad.Sci. USA, 95:13726-13731 18. Smith, A.G., Heath, J.K., Donaldson, D.D., Wong, G.G., Moreau, J., Stahl, M. & Rogers, D. (1988) Inhibition of pluripotential embryonic stem cells differentiation by purified polypeptides. Nature, 336:688-690 19. Prelle, K., Wobus, A.M., Krebs, O., Blum, W.F. & Wolf, E. (2000) Overexpression of insulin-like growth factor-II in mouse embryonic stem cells promotes myogenic differentiation. Biochem.Biophys.Res.Commun., 277:631-638 20. Sachs, D.H. (2000) Mixed chimerism as an approach to transplantation tolerance. Clin.Immunol., 95:63-68 21. Thomson, J.A., Kalishman, J., Golos, T.G., Durning, M., Harris, C.P., Becker, R.A. & Hearn, J.P. (1995) Isolation of a primate embryonic stem cell line. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 92:7844-7848 22. Thomson, J.A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S.S., Waknitz, M.A., Swiergiel, J.J., Marshall, V.S. & Jones, J.M. (1998) Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science, 282:1145-1147 23. Tian, L., Catt, J.W., O'Neill, C. & King, N.J. (1997) Expression of immunoglobulin superfamily cell adhesion molecules on murine embryonic stem cells. Biol.Reprod., 57:561-568 24. Williams, R.L., Hilton, D.J., Pease, S., Willson, T.A., Steward, C.L., Gearing, D.P., Wagner, E.F., Metcalf, D., Nicola, N.A., Gough, N.M. (1988) Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potentials of embryonic stem cells. Nature, 336:684-687. Autor pro korespondenci: Petr Dvořák Laboratoř molekulární embryologie MZLU v Brně a ÚŽFG AV ČR Zemědělská 1, 613 00 Brno Tel./Fax: 05-45 13 32 98 E mail: [email protected]

Neurální prekurzory - kam na ně ? Pacherník, J. Centrum buněčných terapií a tkáňových náhrad, Karlova univerzita V Úvalu 84, 150 18 Praha 5 Laboratoř molekulární embryologie, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně a Ústav živočišné fyziologie a genetiky AV ČR, Zemědělská 1, 613 00 Brno

Souhrn Schopnost připravit lidské neurální buňky in vitro by přinesla nové možnosti využít tento typ buněk jako nástroj pro buněčné a genové terapie při poškození nervového systému. V současnosti je již dobře známa schopnost totipotentních embryonálních kmenových buněk růst v kultuře a diferencovat do širokého spektra buněčných typů, zahrnujících také buňky nervové a gliové. Podařilo se již také izolovat nervové kmenové buňky jak z vyvíjejícího se, tak i z dospělého lidského mozku. Současné práce navíc dokumentují, že kmenové buňky z dospělého jedince izolované z mozku, svalů a krve mohou dát vznik buněčným typům jiným, než by odpovídalo orgánu, z nějž byly izolovány. Následující článek shrnuje možnosti využití těchto buněčných typů pro buněčné terapie.

Summary Neural precursors - where to get them ? Pacherník, J. It would be of an enormous benefit if human neural cell types could be generated in vitro as these might serve as a tool for cell and gene therapies of nervous system disorders. It is now well established that totipotent embryonic stem cells (ES cells) can be propagated in culture and differentiated into a wide range of cell types, including neuronal and glial cells. Also, more-restricted neural stem cells have been isolated from both developing and adult human brain. Morever, a collection of recent studies have suggested that adult stem cells taken from brain, muscle and blood can be converted into multiple mammalian cell types. This article reviews the possibilities of using these sources in cell therapies. Klíčový význam plně funkční nervové tkáně pro živý organizmus versus malá regenerační schopnost nervových buněk evokuje důležité otázky, jakým způsobem by bylo možno zmíněnou regeneraci urychlit, případně čím chybějící buňky nahradit. Experimentální práce z posledních deseti let ukázaly, že přijatelným zdrojem mohou být v některých případech nervové buňky vyvíjejícího se plodu. U pacientů s Parkinsonovou chorobou přináší transplantace těchto buněk výrazné zlepšení funkce mozku. I u prvních pacientů, kteří se podrobili tomuto typu transplantace (před deseti lety), jsou transplantované buňky stále funkční a zlepšují symptomy onemocnění zhruba o 50 %. Tento přístup však není ideální ani z etického, ani z praktického hlediska. Pro jednu transplantaci je potřeba materiál ze šesti lidských plodů, protože transplantované buňky vykazují až 95% úmrtnost

alternativních zdrojů transplantovatelných buněk. Současné znalosti nám nabízejí v zásadě tři možnosti získání neurálních prekurzorů, neuronů nebo oligodendrocytů in vitro. Tyto jsou s určitým zjednodušením postupně charakterizovány v následujícím textu. Za historicky první lze považovat cíleně diferencované embryonální kmenové buňky (embryonic stem cells - ES) (charakterizovány ve Dvořák a Hampl v tomto čísle). První práce popisující podmínky cílené diferenciace myších ES buněk do neurálních buněčných typů se objevily v roce 1995 (Bain a spol., 1995; Fraichard a spol., 1995). Z hlediska potenciálního použití ES buněk pro buněčnou terapii neurologických postižení člověka se stal klíčovým rok 1998, kdy byla popsána izolace lidských embryonálních kmenových buněk (Thomson a spol., 1998). Kultivační postupy používané k získání neurálních progenitorů z ES buněk in vitro jsou detailněji popsány v příspěvku Mgr. Ešnera v tomto čísle. Dostatečné počty správně specializovaných ES buněk lze získat nejen vhodnými podmínkami kultivace těchto buněk, ale také efektivněji jejich genetickou úpravou. Obecně lze využít exprese bílkoviny typické pro konkrétní požadovaný typ buněk ve spojení s rezistencí na nějakou toxickou látku, například antibiotikum (Li a spol., 1998). Buňky které, takovou bílkovinu produkují, jsou tak současně rezistentní k toxickému působení antibiotika. Vystavení heterogenní kultury buněk vlivu daného antibiotika pak umožní přežít pouze buňkám požadovaného typu. Detailněji se tomuto přístupu věnuje příspěvek Mgr. Bryji v tomto čísle. Embryonální kmenové buňky mají z hlediska jejich potenciálního využítí jako výchozího zdroje transplantovatelných buněk několik nesporných výhod. Jsou jimi zejména a) dlouhodobé zkušenosti s jejich izolací, kultivací a diferenciací u myšího modelu b) jejich totipotence, tedy schopnost dávat vznik všem buněčným typům in vivo i in vitro c) schopnost rychlého a dlouhodobého množení v nediferencovaném stavu in vitro a z toho plynoucí přístupnost ke genetickým analýzám a manipulacím. Nezanedbatelná není ani částečná tolerance imunitního systému příjemce jak k embryonálním kmenovým buňkám samotným, tak k buňkám z nich odvozených cílenou diferenciací. Tuto toleranci lze navíc dále zlepšit výběrem klonů, které jsou nejvíce tolerovány imunitním systémem potenciálního příjemce. Alespoň teoreticky si lze pomoci také genetickou úpravou klíčových molekul určujících specifické rozpoznání transplantovaných buněk imunitním systémem, tedy molekul MHC (Major Histocompatibility Complex - hlavní histokompatibilitní komplex). Bohužel, tolerance imunitního systému vůči ES buňkám není stoprocentní a je značně závislá na lokalizaci štěpu (shrnuto v Kaufman a spol., 2000). Navíc výše naznačená genetická úprava MHC molekul není z technického hlediska snadná a buňky s modifikovanými MHC molekulami mohou být přesto stále organizmem rozpoznány a odstraněny jako cizí. Největším nedostatkem embryonálních kmenových buněk je však stále jejich schopnost v některých případech tvořit v těle příjemce novotvary - teratomy (Gottlieb a Huettner, 1999). Možnosti jak omezit toto nebezpečí jsou naznačeny v příspěvku Mgr. Bryji v tomto čísle. Jedním z teoreticky možných způsobů jak zcela vyloučit nebezpečí imunitní reakce vůči transplantovaným buňkám je vyjít z embryonálních kmenových buněk izolovaných z embrya získaného klonováním, jinými slovy z embrya, které se vyvinulo z vajíčka, jehož buněčné jádro bylo nahrazeno jádrem somatické buňky budoucího příjemce. U savců schůdnost této cesty ukázal experiment, který skončil narozením známé ovce Dolly. V případě ovce Dolly byla zdrojem buněčného jádra ne zcela charakterizovaná buňka izolovaná z vemene. Vyvíjející se klonované embryo bylo přeneseno do dělohy matky,

ovce, kde proběhl normální embryonální vývoj až do narození (Wilmut a spol., 1997). V poslední době byl tento postup zopakován několika dalšími skupinami také u myši, skotu, kozy (shrnuto v Pennisi a Vogel, 2000) a prasete (shrnuto v Pennisi a Normile, 2000). Lze tedy předpokládat, že získat klonované embryo a použít je k izolaci embryonálních kmenových buněk je u člověka technicky možné. Touto cestou získané embryonální kmenové buňky by měly mít všechny pozitivní vlastnosti ES buněk uvedené výše a navíc by měly být příjemcem plně tolerovány vzhledem ke zcela shodné genetické a tím také antigenní výbavě. I tento postup však přináší jednu velkou nevýhodu. Tou je nemožnost řešit tímto postupem potřebu nahradit buňky, které jsou nefunkční v důsledku dědičného genetického defektu vzhledem k tomu, že genetickým defektem jsou poškozeny všechny buňky jedince, které jsou potenciálním zdrojem jádra nutného k přenosu do vajíčka. Tuto překážku však snad bude možné odstranit genetickou modifikací ustavených ES buněk metodami molekulární genetiky. Přes tento svůj nedostatek představují ES buňky izolované z klonovaných embryí vysoce potenciální zdroj buněk použitelných pro buněčné terapie. Zkušenosti s těmito buňka jsou však zatím sporadické a u člověka zatím nepublikované. Důvodem je, že žádná ze zemí stojící na špici takto směrovaného výzkumu (USA, Velká Británie, Francie, Švédsko) zejména z etických důvodů dosud nepovolila experimentovat s lidskými klonovanými embryi (shrnuto ve Vogel, 2000a). Posledním, třetím zdrojem buněk, jevících se jako v budoucnu vhodné k náhradě buněk nervové tkáně, jsou kmenové buňky dospělých jedinců (charakterizovány v Dvořák a Hampl v tomto čísle). Předpokládá se, že každý orgán obsahuje populaci buněk, které mohou dávat vznik různým buněčným typům tohoto orgánu a tak přispívat k jeho regeneraci. Prvními popsanými kmenovými buňkami dospělých byly začátkem sedmdesátých let kmenové buňky kostní dřeně. Ani téměř čtyři dekády intenzivního výzkumu však dosud nepřinesly identifikaci a jednoznačnou charakterizaci prvotní kmenové buňky kostní dřeně (shrnuto ve Weissman, 2000). Obdobně je tomu také u ostatních orgánů, včetně mozku. Tento fakt však nebrání vědcům v izolaci a práci s populacemi buněk, které kmenové buňky obsahují a z nichž je možno požadované kmenové buňky cílenou selekcí získat. Neurální kmenové buňky se již podařilo z mozku dospělého jedince nejen izolovat, ale také je in vitro namnožit a diferencovat. Tyto buňky pak byly experimentálně úspěšně transplantovány myši. Přesto, že jejich získání z pacienta je technicky velmi náročné, je možné a bylo již v praxi ověřeno (Pagano a spol, 2000). Experimenty s neurálními kmenovými buňkami navíc odhalily ještě jednu velmi významnou skutečnost. Pokud jsou tyto buňky injikovány do vyvíjejícího se embrya, jsou schopny diferencovat nejen do neurálních buněčných typů, ale dávají vznik také mnoha jiným buněčným typům na různých místech organizmu. Tato skutečnost naznačuje, že vývojový potenciál kmenových buněk dospělých jedinců není příliš odlišný od tohoto u buněk embryonálních kmenových (Clarke a spol, 2000). Práce z poslední doby navíc ukazují, že schopnost vyvinout se v buňky jiného orgánu, než ze kterého byly izolovány, není omezena jen na neurální kmenové buňky. Speciálně tato skutečnost dává zcela nové perspektivy využití kmenových buněk dospělých. Velký potenciál z hlediska buněčných terapií mají právě výše zmíněné kmenové buňky kostní dřeně. Tyto buňky není tak obtížné získat z těla pacienta, jako je tomu u neurálních kmenových buněk. Již v roce 1997 bylo poprvé na myším modelu popsáno, že kmenové buňky kostní dřeně injikované do ocasní žíly daly vznik neurálním buňkám in vivo (Eglitis a Mezey, 1997). V roce 2000 se podařilo přeměnit buňky kostní dřeně na buňky neurální také in vitro (Woodbury a spol., 2000). Bez zajímavosti jistě není ani fakt, že kmenové buňky kostní dřeně mohou dát vznik také

buňkám jaterním a svalovým (shrnuto ve Vogel, 2000b), zatím bohužel pouze in vivo, tedy po jejich injekci do živého jedince. Velmi slibným zdrojem kmenových buněk je také kůže, přesněji epidermis (shrnuto v Slack, 2000). Zde je naše poznání teprve na začátku, ale potenciálně snadná dostupnost epidermálních kmenových buněk je velkým příslibem pro jejich budoucí využití. Nejvýznamnějšími výhodami použití vlastních orgánových kmenových buněk pacienta je jejich relativně snadná dostupnost a zejména absence restrikcí plynoucích z etických hledisek. Nevýhodami jsou naopak skutečnost, že, podobně jako ES buňky získané z klonovaných embryí, nesou genetické poškození pacienta a že poznávání jejich biologie, a zejména způsobů kultivace a cílené diferenciace in vitro je teprve na úplném začátku. Přes všechny naznačené komplikace, díky závratně rychle se hromadícím poznatkům o všech uvedených typech buněk, není daleko doba, kdy se "buněčná terapie a tkáňové inženýrství" stanou významnou součástí metod používaných k léčbě neurologických onemocnění. Navíc nemá poznání regulačních kroků řídících diferenciaci význam jen v přípravě konkrétních buněčných linií vhodných pro transplantaci, ale má velký význam i v dalších oblastech biomedicíny. Zde stojí v popředí zejména pochopení mechanizmů stojících za vznikem vývojových vad a nádorů. Poděkování Publikace vznikla za finanční podpory Programu podpory výzkumu a vývoje "Výzkumná centra" č. LN00A065 a Výzkumného záměru AF MZLU v Brně č. MSM 432100001.

Literatura 1. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J.E. & Gottlieb, D.I. (1995) Embryonic Stem Cells Express Neuronal Properties in Vitro. Dev. Biol., 168: 342-357 2. Barinaga, M. (2000) Fetal Neuron Grafts Pave the Way for Stem Cell Therapies. Science, 287: 1421-1427 3. Clarke, D.L., Johansson, C.B., Wilbertz, J., Veress, B., Nilsson, E., Karlstrom, H., Lendahl, U. & Frisen, J. (2000) Generalized Potential of Adult Neural Stem Cells. Science, 288: 1660-1663 4. Eglitis, M.A. & Mezey, E. (1997) Hematopoietic cells differentiated into both microglia and macroglia in the brains of adult mice. PNAS, 94: 4080-4085 5. Fraichard, A., Chassande, O., Bilbaut, G., Dehay, C., Savatier, P. & Samarut, J. (1995) In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Science, 108: 3181-3188 6. Gottlieb, D.I. & Huettner, J.E. (1999) An in vitro Pathway from Embryonic Stem Cells to Neurons and Glia. Cells Tissues Organs, 165: 165-172 7. Kaufman, D.S., Odorico, J.S. and Thomson, J.A. (2000) Transplantation Therapies from Human Embryonic Stem Cells - Circumventing Immune Rejection. e-biomed, 1: 11-15 8. Li, M., Pevny, L., Lovell-Badge, R. & Smith, A. (1998) Generation of purified neural precursors from embryonic stem cells by lineage selection. Current Biology, 8: 971-974 9. Pagano, S.F., Impagnatiello, F., Girelli, M., Cova, L., Grioni, E., Onofri, M., Cavallaro, M., Etteri, S., Vitello, F., Giombini, S., Solero, C.L. & Parati, E.A. (2000) Isolation and characterization of neural stem cells from the adult human

olfactory bulb. Stem Cells,18: 295-300 10. Pennisi, E. & Vogel, G. (2000) Clones: A Hard Act to Follow. Science, 288: 17221727 11. Pennisi, E. & Normile, D. (2000) Biotechnology. Perseverance leads to cloned pig in Japan. Science 289: 1118-1199 12. Slack, J.M.W. (2000) Stem Cells in Epithelial Tissues. Science, 287: 1431-1433 13. Thomson, J.A., Itskovitzeldor, J., Shapiro, S.S., Waknitz, M.A., Swiergiel, J.J., Marshall, V.S. & Jones, J.M. (1998) Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science, 282: 1145-1147 14. Vogel, G. (2000a) Researchers Get Green Light For Work on Stem Cells. Science, 289: 1442-1443 15. Vogel, G. (2000b) Stem Cells: New Excitement, Persistent Questions. Science, 290: 1672-1775 16. Weissman, I.L. (2000) Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution. Cell, 100: 157-168 17. Wilmut, I., Schnieke, A.E., McWhir, J., Kind, A.J. & Campbell, K.H. (1997) Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature, 385: 810813. Adresa pro korespondenci: Pacherník J. Laboratoř molekulární embryologie MZLU v Brně a ÚŽFG AV ČR Zemědělská 1 613 00 Brno Tel: 05 - 45 13 32 97 Fax: 05 - 45 13 32 98 e-mail: [email protected]

Embryonální kmenové buňky ve vývojové biologii Ešner, M. Centrum buněčné terapie a tkáňových náhrad Karlova univerzita v Praze, V Úvalu 84, 150 18 Praha 5 Laboratoř molekulární embryologie, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně a Ústav živočišné fyziologie a genetiky AV ČR, Zemědělská 1, 613 00 Brno

Souhrn Embryonální kmenové buňky jsou buněčné linie derivované z vnitřní buněčné masy preimplantačních blastocyst. Při kultivaci na vrstvě primárních embryonálních fibroblastů a s přídavkem leukemického inhibičního faktoru (LIF) si udržují svou totipotenci a schopnost neomezeně se množit. Po odstranění LIF a vrstvy embryonálních fibroblastů

diferencují embryonální kmenové buňky do různých buněčných typů v závislosti na kultivačních podmínkách, zejména na přítomných růstových faktorech. Díky těmto vlastnostem představují embryonální kmenové buňky vynikající model pro studium mechanizmů, které řídí diferenciační procesy během vývoje časného embrya. Jeden ze způsobů jak efektivně simulovat diferenciační procesy využívá schopnosti embryonálních kmenových buněk formovat in vitro trojrozměrné mnohobuněčné struktury - embryoidní tělíska. Tato strategie a s ní související postupy jsou obsahem tohoto článku.

Summary Embryonic stem cells in developmental biology Ešner, M. Embryonic stem cells are cell lineages derived from inner cell mass of preimplantation blastocyst. When cultured on a layer of primary embryonic fibroblasts and with the addition of leukemia inhibitory factor (LIF) they are able to maintain their totipotency and the ability to proliferate indefinitely. Upon removal of both LIF and embryonic fibroblasts embryonic stem cells differentiate into a variety of cell types according to culture conditions, most importantly according to the activity of growth factors that are present in culture media. Thanks to their features, embryonic stem cells represent a valuable model for studying the mechanisms that drive differentiation processes taking place during embryogenesis. One of the key strategies employed to effectively simulate differentiation processes is based on the ability of embryonic stem cells to in vitro form three dimensional multicellular structures - embryoid bodies. The description of this strategy and of the selected approaches that are related to it create the content of this article. Odstranění leukemického inhibičního faktoru (LIF) a vrstvy primárních embryonálních fibroblastů z in vitro kultury embryonálních kmenových (Embryonic Stem - ES) buněk vede vždy k jejich spontánní diferenciaci. Embryonální kmenové buňky přitom mohou diferencovat v závislosti na kultivačních podmínkách do většiny specializovaných buněčných typů, včetně buněk hematopoetických, svalových a nervových. Tato skutečnost činí z ES buněk vynikající model pro studium regulačních mechanizmů uplatňujících se v časných fázích vývoje embrya. Stejně jako u všech ostatních in vitro systémů, také v experimentech s ES buňkami je však velmi důležité navodit podmínky, které se budou co nejvíce blížit situaci in vivo. Jedním ze způsobů jak toho dosáhnout je přinutit ES buňky vytvořit mnohobuněčné trojrozměrné struktury podobné časným vývojovým stádiím živého embrya. Tyto útvary, tvořené vrstvami ektodermu, mezodermu a vnějšího endodermu, v sobě uzavírají dutinu podobnou žloutkovému váčku (Obr. 1A) a jsou označovány jako embryoidní tělíska (Embryoid Body - EB).

Obr. 1A - Model diferenciace ES buněk. Nediferencované ES buňky jsou kultivované na vrstvě primárních embryonálních fibroblastů (PEF) a s přídavkem leukemického inhibičního faktoru (LIF). Po odstranění vrstvy fibroblastů a faktoru LIF se ES buňky kultivují na miskách s neadhezivním povrchem (např. bakteriologické Petriho misky) nebo formou tzv. visících kapek, kdy se ES buňky kultivují v kapkách na víčku kultivační misky. Vzniklá embryoidní tělíska (EB) se dále kultivují na miskách s adhezivním povrchem. Pro jejich tvorbu je klíčové zabránit ES buňkám kultivovaným již bez LIF a embryonálních fibroblastů adherovat na kultivační povrch (dno kultivační misky). Toho lze docílit použitím kultivačních misek s výrazně omezenou adhezivitou pro ES buňky nebo metodou takzvaných visících kapek (Obr.1B).

Obr. 1B - Embryoidní tělíska po osmi dnech kultivace na neadhezivním povrchu. Mikroskopický snímek v procházejícím světle. Takto vzniklá embryoidní tělíska je pro další specifikaci a diferenciaci buněk nutno převést zpět na adhezivní povrch. V těchto podmínkách začnou z EB do periferie vyrůstat buňky, které pak dále postupně diferencují a migrují do okolí (Obr. 2).

Obr. 2 - Po 30 minutách začínají z embryoidního tělíska adherovaného na misku potaženou fibronektinem vyrůstat migrující buňky, které jsou základem pro diferenciaci dalších buněčných typů. Mikroskopický snímek v procházejícím světle. Pokud budou buňky stejně jako dosud kultivovány nadále v médiu s vysokým obsahem krevního séra, které obsahuje mimo jiné také velké množství růstových faktorů a hormonů, bude výsledná populace buněk velice heterogenní a bude zahrnovat široké spektrum buněk odvozených ze všech tří zárodečných listů, ektodermu, mezodermu i endodermu (shrnuto ve Wiles, 1995). Chceme-li však získat homogenní populaci buněk určitého typu, je nutno podmínky kultivace vždy vhodným způsobem modifikovat. Tyto modifikace zahrnují zejména: a) přidání nebo naopak odebrání specifických růstových faktorů a b) úpravu kultivačního povrchu specifickými bílkovinnými substráty, z nichž nejčastější jsou fibronektin nebo laminin. Velmi často studovanou je v současné době in vitro diferenciace ES buněk do neurálních buněčných typů. Nediferencované ES jsou svým původem buňky primitivního ektodermu, ze kterého se in vivo během gastrulace vytváří další zárodečné obaly, mezoderm a endoderm. Indukce mezodermu z buněk primitivního ektodermu probíhá pod vlivem specifických růstových faktorů. Pokud tyto faktory nejsou přítomny, pak se mezoderm a endoderm nevytváří. Podobnou situaci lze simulovat v podmínkách tkáňové kultury, kdy kultivací buněk v bezsérovém médiu a na specifickém substrátu, např. laminin, přežívají a dále rostou pouze buňky ektodermu, dávající vznik populaci neuroektodermových buněk (Okabe a spol., 1996; Mujtaba a spol., 1999). Obdobný způsob diferenciace založený na kultivaci v bezsérovém médiu a specifických substrátech používáme také v Laboratoři molekulární embryologie. Embryoidní tělíska adherovaná na kultivační misky jsou základem pro vznik populace rychle se dělících buněk, pro které je charakteristický obsah bílkoviny nestinu (Obr. 3).

Obr. 3 - Neuroepiteliální kmenové buňky jsou charakteristické přítomností nestinu zbarveny zeleně. Snímek pořízen pomocí laserové konfokální mikroskopie. Nestin (NEuroepithelial STem cell proteIN, Lendahl a spol., 1990) je bílkovina, která tvoří intermediární filamenta charakteristická pro neuroepiteliální kmenové buňky. Tyto buňky jsou základem pro vývoj dalších derivátů neuroektodermu nejen během diferenciace in vitro, ale zejména během diferenciace buněk nervové soustavy in vivo. Vzniklé neuroepiteliální buňky jsou v dalším kroku převedeny na kultivační misky, které mají na svém povrchu navázaný laminin. Tato bílkovina je jednou ze složek mezibuněčné hmoty a svou pozicí určuje správný růst axonů nervových buněk ve vyvíjejícím se zárodku (Letourneau a spol., 1988). Jeho přítomnost podporuje růst výběžků nervových buněk také in vitro. Za přítomnosti fibroblastového růstového faktoru (FGF-2), signální bílkoviny, která významně stimuluje dělení právě neuroepiteliálních kmenových buněk, dochází hned v prvních dnech kultivace na lamininu k výrazné expanzi buněk obsahujících nestin. Odebrání tohoto růstového faktoru pak vede ke spontánní diferenciaci expandovaných neuroepiteliálních prekurzorů do terminálních buněčných typů jak neuronální, tak i gliové linie (Obr. 4).

Obr. 4 - Snímek pořízen mikroskopií ve viditelném světle. A) Neurony a gliové buňky diferencované z neuroepiteliálních kmenových buněk po odebrání růstového faktoru FGF-2. Mikroskopický snímek v procházejícím světle. B) Astrocyt (zeleně) barvený protilátkou proti GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein). C, D) Nervové buňky barvené protilátkou proti nervovému tubulinu TU-20 (zeleně). Snímky pořízeny pomocí laserové konfokální mikroskopie. Terminálně diferencované typy lze dále charakterizovat podle obsahu produktů specifických genů, a to jak na úrovni mRNA, tak i proteinů (Tab. 1). Tab. 1 - Vybrané specifické markery, podle kterých lze charakterizovat některé populace neurálních buněk. Buněčný typ

Název rozpoznávaného proteinu

Rozpoznávaná struktura

Astrocyty

GFAP (glial fibrillary acidic protein)

intermediární filamentum

Oligodendrocyty

O4

povrchový antigen

Dendritické výběžky

MAP-2

tubulární protein

Neuroepiteliální buňky

Nestin

intermediární filamentum

Neuronální buněčné typy

Neurofilament 200 TU-20

intermediární filamentum tubulin

Dopaminergní neurony

TH (tyrosine hydroxylase)

Enzym metabolizmu L-DOPA

Velmi významné je, že takto diferencované buňky jsou schopny se po transplantaci integrovat do nervové soustavy a případně dokonce funkčně nahradit poškozené buňky příjemce. Tato schopnost byla demonstrována na modelu myší neschopných vytvářet myelin, bílkovinu, která je významnou složkou mezibuněčné hmoty typickou pro nervovou soustavu (Brüstle a spol., 1999; Liu a spol., 2000). Jak je řečeno v úvodu, buňky derivované z EB jsou díky své extrémní podobnosti s

různých důvodů provést na živém organizmu. Typickým příkladem je řešení potřeby odhalit, jaké funkce v pozdějším vývojovém období plní produkt genu, který je zcela esenciální pro časná stadia vývoje zárodku. Tyto "pozdní funkce" nelze studovat tradičním postupem inaktivace genu, protože zárodky nesoucí nefunkční formu tohoto genu umírají v časných fázích vývoje. Problém však lze vyřešit použitím embryonálních kmenových buněk, které jsou schopny v in vitro diferenciaci překlenout kritické období vývoje a dosáhnout stupně diferenciace odpovídajícího požadovanému pozdějšímu vývojovému stadiu. Tímto způsobem byla úspěšně studována například funkce ?1-integrinu (Rohwedel a spol., 1998). Dalším příkladem mohou být experimenty prováděné v naší laboratoři. Pro studium časné diferenciace mezodermu pracujeme s linií ES buněk, u kterých je inaktivován gen pro jeden ze čtyř receptorů pro FGF (Deng a spol. 1994). Vzhledem k tomu, že tato inaktivace způsobuje smrt zárodku v časném stádiu vývoje, experimenty s ES buňkami opět představují způsob jak toto omezení obejít. Současné poznatky předpokládají úzký vztah mezi indukcí diferenciace mezodermu a signálními drahami FGF receptorů. Naše výsledky tuto hypotézu potvrzují. Pomocí detekce transkripčního faktoru Brachyury, bílkoviny typické pro mezodermální buňky (Herrmann a spol, 1990), jsme prokázali, že nefunkční FGF receptor blokuje mezodermální diferenciaci (Obr. 5).

Obr. 5 - Analýza epxrese mRNA transkripčního faktoru Brachyury během diferenciace embryonálních kmenových buněk v porovnání s expresí mRNA pro HPRT použitého jako vnitřní standard. +/+ označuje kontrolní linii ES buněk, -/- ES buňky s mutovaným FGF receptorem. Na závěr nutno vzpomenout alespoň teoretickou možnost testování léčiv a ostatních chemických preparátů na různě diferencovaných ES buňkách, jako alternativu k použití zvířat nebo nádorových buněčných linií (Kuang a spol., 1998). Poděkování Publikace vznikla za finanční podpory programu podpory výzkumu a vývoje "Výzkumná centra" č. LN00A065, výzkumného záměru AF MZLU v Brně č. MSM 432100001 a Fondu rozvoje vysokých škol MŠMT.

Literatura 1. Brüstle, O., Jones, K.N., Learish, R.D., Karram, K., Choudhary, K., Wiestler, O.D., Duncan, I.D., McKay, R.D. (1999) Embryonic Stem Cell-Derived Glial Precursors: A Source of Myelinating Transplants. Science 285, 754-756

2. Deng, C.X., Wynshaw-Boris, A., Shen, M.M., Daugherty, C., Ornitz, D.M., Leder, P. (1994) Murine FGFR-1 is required for early postimplantation growth and axial organization. Genes & Dev. 8, 3045-3057 3. Herrmann, B.G., Labeit, S., Poustka, A., King, T.R., Lehrach, H. (1990) Cloning of the T gene required in mesoderm formation in the mouse. Nature 343, 617-622 4. Kuang, W., Xu, H., Vachon, P.H., Engvall, E. (1998) Disruption of the lama2 gene in embryonic stem cells: laminin alpha 2 is necessary for sustance of mature muscle cells. Exp. Cell. Res. 241, 117-125 5. Lendahl, U., Zimmermann, L.B., McKay, R.D.G. (1990) CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein. Cell 60, 585-595 6. Letourneau, P., Madsen, A.M., Palm, S.M., Furcht, L.T. (1988) Immunoreactivity for laminin in the developing ventral longitudinal pathway of the brain. Dev. Biol. 125, 135-144 7. Liu, S., Qu, Y., Stewart, T.J., Howard, M.J., Chakrabortty, S., Holekamp, T.F., McDonald, J.W. (2000) Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6126-6131 8. Okabe, S., Forsberg-Nilsson, K., Spiro, C. S., Segal, M., McKay R.D.G. (1996) Development of neuronal precursor cells and functional postmitotic neurons from embryonic stem cells in vitro. Mech. Dev. 59, 89-102 9. Mujtaba, T., Piper, D. R., Kalyani, A., Groves, A.K., Lucero, M.T., Rao, M.S. (1999) Lineage-Restricted Neural Precursors Can Be Isolated from Both the Mouse Neural Tube and Cultured ES Cells. Dev. Biol. 214, 113-127 10. Rohwedel, J., Guan, K., Zuschratter, W., Jin, S., Ahnert-Hilger, G., Furst, D., Fassler, R., Wobus, A. M. (1998) Loss of beta1 integrin function results in a retardation of myogenic, but an acceleration of neuronal, differentiation of embryonic stem cells in vitro. Dev. Biol. 201, 167-184 11. Wiles, M.V. (1995) Embryonic stem cell differentiation in vitro. Methods. Enzymol. 225, 900-918. Adresa pro korespondenci: Ešner Milan Laboratoř molekulární embryologie MZLU v Brně a ÚŽFG AV ČR, Zemědělská 1 613 00 Brno Tel: 05 - 45 13 32 97 Fax: 05 - 45 13 32 98 e-mail: [email protected]

Molekulární biologie a buněčná terapie Bryja V.

V Úvalu 84, 150 18 Praha 5 Laboratoř molekulární embryologie Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně a Ústav živočišné fyziologie a genetiky AV ČR, Zemědělská 1, 613 00 Brno

Souhrn Metody molekulární biologie a genetiky se v dnešní době neuplatňují pouze v oblasti základního výzkumu, ale významným způsobem zasahují i do experimentální a klinické medicíny. Očekává se, že genetická modifikace kmenových buněk umožní obejít mnohé biologické problémy bránící rozvoji buněčných terapií. Mezi nejvýznamnější z nich patří produkce definovaných buněčných typů metodou liniově specifické selekce. Velké možnosti také nabízí genetické úpravy, které blokují v transplantovaných buňkách signální dráhy vedoucí ke smrti buněk, modifikují povrchové antigeny nebo zajišťují produkci specifických enzymů a růstových faktorů. Při klinickém použití bude zřejmě nutné upravení transplantovaných buněk umožňující jejich likvidaci v případě nekontrolovaného množení.

Summary Molecular biology and cell therapies Bryja V. Methods of molecular biology and genetics are not being applied only in a basic research but they also find their use in experimental and clinical medicine. By employing the proper genetic modifications of stem cells we may overcome some obstacles preventing the introduction of stem cell therapies into clinical practice. The production of defined precursor cells using lineage specific selection seems to be one of the most promising strategies. However, some other genetic modifications, including insertions of genes that block apoptotic processes in cells, modifications of cell surface antigens, and production of specific enzymes and growth factors may also result in great improvements. Genetic modification enabling the elimination of transplanted cells during potential tumour promotion will probably also be necessary for safe clinical use of stem cell transplantations.

Může molekulární biologie pomoci při přípravě buněk pro transplantaci ? Buňky pro náhradu nervové tkáně lze potenciálně získat buď cílenou diferenciací embryonálních kmenových buněk, izolací a následnou propagací neurálních kmenových buněk nebo v poslední době i reprogramováním kmenových buněk jiných orgánů. Všechny tyto přístupy s sebou nesou jisté problémy, z nichž většina však může být řešena s použitím metod molekulární biologie. Současné vědecké poznatky ukazují, že pro úspěšnou transplantaci s následným obnovením funkce poškozené nervové tkáně bude třeba použít buňky ve zcela specifickém stupni diferenciace. V podstatě se pohybujeme mezi dvěma extrémy - úplně nediferencované kmenové buňky jsou schopny rychle se dělit a přispět k tvorbě tkání příjemce, ovšem pro svůj vysoký dělicí potenciál hrozí nebezpečí nádorového zvrhnutí a tvorby novotvarů - teratomů. Naopak u terminálně nebo téměř terminálně

diferencovaných buněk toto nebezpečí nehrozí, ovšem u buněk v tomto stadiu je již výrazně (z hlediska transplantací takřka fatálně) snížena schopnost začlenit se do tkání, tam se dělit a migrovat do okolních poškozených oblastí. Z výše uvedeného je zřejmé, že ideální pro transplantace by mohly být buňky někde v půli své cesty k úplné diferenciaci. Ovšem jak takové buňky získat ? Kromě tradičnějších postupů založených na vhodné kombinaci působení specifických růstových faktorů a definovaných vnějších (kultivačních) podmínek se zde může zásadním způsobem uplatnit modifikování kmenových buněk molekulárně-biologickými postupy. Jedním z nejelegantnějších přístupů pro získání čistých a definovaných neurálních progenitorů je metoda liniově specifické selekce, jejíž princip shrnuje obrázek 1 (Li a spol., 1998).

Obr. 1A - Průběh diferenciace nemodifikovaných ES buněk. V neurálních prekurzorech je aktivován gen sox-2. Obr. 1B - Průběh diferenciace ES buněk molekulárně-geneticky upravených pro liniově specifickou selekci. Za promotor genu sox-2 je začleněn gen neo umožňující přežití v přítomnosti antibiotika G418. Přepis z tohoto promotoru je aktivován pouze v neurálních prekurzorech, proto kultivace v přítomnosti G418 vede k získání čisté populace neurálních

prekurzorů. Za regulační část genu (promotor), který je normálně aktivován pouze v neurálních prekurzorech (takovým genem je např. transkripční faktor Sox-2) je genetickou manipulací kmenových buněk zařazen úsek DNA (např. gen neo, zajišťující rezistenci k antibiotiku G418), jehož aktivace je nutná k přežití buněk v umělém selekčním systému. Výsledkem je, že z velmi heterogenní populace buněk vznikající po indukci diferenciace kmenových buněk přežijí pouze ty buňky, které aktivují daný nový úsek DNA (v našem případě neurální prekurzory aktivující gen sox-2). Tyto buňky jsou pak použity k transplantaci. Nezanedbatelný význam mají molekulárně-genetické přístupy také v předklinických experimentech studujících chování transplantovaných buněk. Buňky určené k transplantaci lze například "označit" specifickými enzymy (např. beta-galaktozidáza) či fluorescenční značkou (např. zeleně fluoreskující protein - GFP), což při vyhodnocování výsledků experimentů umožňuje snadno odlišit buňky příjemce od buněk dárce.

Jak mohou genetické úpravy napomoci správné funkci buněk po transplantaci ? Transplantované buňky se ocitají pro přenesení do organizmu ve zcela jiném prostředí, než kterému byly vystaveny během kultivace in vitro. Působí na ně velmi rozmanitá směs biologicky aktivních látek často navozující u těchto buněk programovanou buněčnou smrt - apoptózu, buňky jsou zaměřovány imunitním systémem a ve velké míře jím i likvidovány a v neposlední řadě buňky mění svůj celkový charakter (fenotyp) a pak neplní funkci od nich očekávanou. Proto je obecnou snahou buňky určené k transplantaci geneticky modifikovat zejména takovým způsobem, který zvýší jejich šanci na přežití a na správné fungování v poškozené tkáni. Například při transplantaci buněk jater (hepatocytů) bylo úspěšně využito umělého zvýšení množství (overexprese) protiapoptické bílkoviny Bcl-2, které vedlo ke zvýšenému přežívání a zlepšení funkce transplantovaných buněk (Mignon a spol., 1998). U neurálních prekurzorů jsou však současné zkušenosti s využitím bílkoviny Bcl-2 spíše rozporuplné a jako nadějnější se zdá blokování proapoptické dráhy v jiném bodě (Kaminski-Schierle a spol., 2000; Sortwell a spol., 2000). Zajímavé pokusy byly uskutečněny již také s genetickými manipulacemi, které měly za cíl obejít imunitní reakci organizmu. Ukázalo se, že ani úplné vyřazení antigenů hlavního histokompatibilního komplexu I a II, které jsou především zodpovědné za odmítnutí transplantátu, nestačí k "ukrytí" ES buněk před imunitním systémem. Jako slibnější se jeví strategie založená na zvýšení produkce molekul blokujících imunitní reakce transplantovanými buňkami (shrnuto v Kaufman a spol., 2000). Jednou z nemocí, jejíž léčba může být v budoucnu úspěšná právě díky rozvoji buněčných terapií, je Parkinsonova choroba. Toto onemocnění je způsobeno chyběním dopaminergních neuronů v jedné části mozku. Úspěšnému použití buněčné terapie pro léčbu Parkinsonovy choroby však brání skutečnost, že právě postižené dopaminergní neurony patří k nejhůře regenerovatelným jednotkám mozku a transplantované buňky povětšinou hynou. V současné době bylo prokázáno, že genetická modifikace neurálních kmenových buněk s cílem uměle zvýšit v těchto buňkách produkci enzymu zodpovědného za tvorbu dopaminu (tyrozinhydroxylázy), vedla u krys k výraznému zlepšení funkce v porovnání s transplantací geneticky neupravených buněk (Kim a spol., 2000) . Při buněčné

terapii Parkinsonovy choroby je fakt, že pouhá produkce chybějícího enzymu transplantovanými prekurzory vede ke zlepšení klinického obrazu, obzvláště významný a zdá se, že genetická modifikace transplantovaných buněk bude jednou ne-li jedinou ze schůdných strategií. Předchozí text přinesl přehled možných přístupů, kterými snad bude možné zvýšit přežívání a zajistit správnou funkci transplantovaných buněk. Samozřejmě je žádoucí, aby buňky měly zachovánu schopnost buněčného dělení a jistý status "primitivní" buňky. Nicméně příliš velká dělící aktivita může vést až ke ztrátě kontroly organizmu nad vnesenými buňkami. Řešením je buňky určené k transplantaci geneticky modifikovat tak, aby je bylo možno zvnějšku kontrolovat a organizmu pomoci v případě, že se osud transplantovaných buněk neubírá žádoucím směrem. Jednou z cest je inducibilní exprese toxického transgenu. Toxickým transgenem rozumíme cizorodý gen, který je včleněn do genomu transplantovaných buněk a jehož aktivace v těchto buňkách vede k jejich smrti. Inducibilní exprese znamená, že buňkami nesený gen pro toxin je aktivován pouze po své indukci jinou látkou, takzvaným induktorem. V konkrétním případě lze jako induktor použít antibiotikum tetracyklin nebo jeho analog doxycyklin. Embryonální kmenové buňky lze cíleně geneticky upravit tak, že přidání jinak netoxického antibiotika do kultivačního média vede ke smrti těchto buněk. Podání těchto antibiotik pacientům po transplantaci tímto způsobem upravených buněk by vedlo k cílené smrti všech transplantovaných buněk. Samozřejmě, že při úspěšně probíhajícím začlenění transplantovaných buněk do tkáně je nutno navždy vyloučit aplikaci daného antibiotika vyléčenému jedinci. Poděkování Článek vznikl za finanční podpory Programu podpory výzkumu a vývoje "Výzkumná centra" č. LN00A065 a Výzkumného záměru AF MZLU v Brně č. MSM 432100001.

Literatura 1. Kaminski-Schierle, G.S., Keep, M.F.& Brundin, P. (2000) Death of dopaminergic neurons in nigral transplants is in part mediated via the CD95 receptor. Soc. Neurosci. Abstr. 26: 554 2. Kaufman, D.S., Odorico, J. S. & Thomson, J.A. (2000) Transplantation therapies from human embryonic stem cells - circumventing immune rejection. e-biomed 1: 11-15 3. Kim, E.Y., Lee, M.A., Ryu, J.K., Kim, J., Lee, H.S., Bang, J.H., Ryu, M.Y., Ahn, Y.H., Cho, K.G., Mook, I.H. & Kim, S.U. (2000) Genetically modified human neural stem cells produce behavioral recovery in animal model of Parkinson's disease. Soc. Neurosci. Abstr. 26: 862 4. Li, M., Pevny, L., Lovell-Badge, R. & Smith, A. (1998) Generation of purified neural precursors from embryonic stem cells by lineage selection. Curr. Biol. 8: 971-974 5. Mignon, A., Guidotti, J.E., Mitchell, C., Fabre, M., Wernet, A., De La Coste, A., Soubrane, O., Gilgenkrantz, H. & Kahn, A. (1998) Selective repopulation of normal mouse liver by Fas/CD95-resistant hepatocytes. Nat. Med. 10: 1185-1188 6. Sortwell, C.E., Pitzer, M.R., Camargo, M.D., Daley, B.F., McGuire, S.O., MaguireZeiss, K., Bowers, W.J., Federoff, H.J. & Collier, T.J. (2000) Increased mesencephalic dopamine neuron transduction using a helper-freee HSVTH9 Bcl-2

amplicon vector. Soc. Neurosci. Abstr. 26:872. Adresa pro korespondenci: Vítězslav Bryja Laboratoř molekulární embryologie MZLU v Brně a ÚŽFG AV ČR Zemědělská 1 613 00 Brno Tel: 05 - 45 13 32 97 Fax: 05 - 45 13 32 98 e-mail: [email protected]

Nové přístupy v imunoterapii - nástup dendritických buněk 1,3 2

Špíšek, R., 3Bretadeau, L., 1,2Hrušák, O., 2Poloučková, A., Pospíšilová, D., 1,2Bartůňková, J.

1

Centrum buněčné terapie a tkáňových náhrad, UK 2.LF, V Úvalu 84, Praha 5 Ústav imunologie UK 2.LF a FNM, V Úvalu 84, Praha 5 3 Institut de Biologie, INSERM U419, 9, quai Moncousu, 44035 Nantes Cedex, France 2

Souhrn Buňky prezentující antigen (APC) mají klíčovou úlohu v regulaci imunitní odpovědi. Nejdůležitějším typem APC jsou dendritické buňky (DC), které pohlcují antigen, ten následně zpracují a předkládají T lymfocytům a aktivují je. DC jsou heterogenní, jejich jednotlivé funkční subpopulace mohou podle okolností indukovat odpověď na antigeny infekční i nádorové, ale působí i v indukci tolerance. Využití DC k imunoterapii malignit umožnily laboratorní techniky, kterými lze získat prekurzory DC z periferní krve a přinutit je k diferenciaci in vitro. Jedním z možných mechanizmů vzniku nádoru je porucha v účinné prezentaci antigenů. Kultivace DC s nádorovými antigeny v prostředí in vitro se směsí cytokinů vede k účinnější antigenní prezentaci a může stimulovat vytvoření protinádorově specifických cytotoxických lymfocytů. Aplikace takto připravených DC, případně přímo cytotoxických T lymfocytů může navodit regresi nádorového onemocnění, jak je ukazují pokusy na zvířecích modelech i první klinické studie např. u pacientů s melanomem a karcinomem ovárií. V rámci Centra buněčné terapie a tkáňových náhrad se zabýváme přípravou DC z monocytární frakce periferní krve a testujeme je na modelech in vitro. Experimentálně ověřujeme možnost využití DC v terapii dětských akutních leukemií ve fázi minimální reziduální nemoci. Po zvládnutí metodiky přípravy DC je možné rozšířit využití i na terapii solidních nádorů.

Summary New approach in immunotherapy - the occur of dendritic cells Špíšek, R., Bretadeau, L., Hrušák, O., Poloučková, A., Pospíšilová, D., Bartůňková, J.

Antigen presenting cells (APC) play key role in the immune response regulation. Dendritic cells (DC) are the most potent APC. DC's main function is to capture, process and present antigens (Ag) to T lymphocytes and induce primary immune response. DC are heterogeneous, they can induce efficient anti-tumor or anti-infectious immune reaction but some subsets appear to facilitate or induce immune tolerance. Recent laboratory techniques generating sufficient numbers of DC in vitro from monocytes enabled use of DC in anticancer immunotherapy. Inefficient presentation of Ag contributes to inability of immune system to eliminate tumor cells. Coculturing of DC and tumor Ag (pulsing of DC) in vitro leads to more efficient Ag presentation and induction of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes. Injection of pulsed DC led to tumor regression and established long-term protective immune response against original tumor. Encouraging results were obtained in preliminary clinical trials in patients with malignant melanoma and renal cell carcinoma. In Center for Cell Therapy and Cell Repair we develop protocol that enables generation of large numbers of fully active DC. We test their possible use in the immunotherapy of minimal residual disease in pediatric leukemia. Immunotherapy using DC is a flexible system applicable to various malignancies.

Historie buněčné protinádorové imunoterapie Termín protinádorová imunoterapie byl zprvu používán pro označení přenosu efektorových buněk imunitního systému, jehož cílem bylo obnovit či zesílit protinádorovou imunitní odpověď. Tato tzv. adoptivní imunoterapie spočívala především v kultivaci periferních mononukleárních buněk (PMB) pacienta in vitro, za přítomnosti vysokých dávek interleukinu 2 (IL-2). Takto připravené buňky, nazývané LAK (lymphokine activated killer), vykazovaly značnou schopnost zabíjet in vitro nádorové linie a byly účinné v různých myších modelech (Mulle, 1985). Studie na malých souborech pacientů spočívající v reinjekci LAK a IL-2 prokázaly povzbudivé výsledky u některých typů pokročilých a refrakterních nádorů, především adenokarcinomu ledviny a maligního melanomu. Následné velké klinické studie však neprokázaly rozdíl mezi průměrným přežitím pacientů léčených podle klasických protokolů a těch, kteří obdrželi infuze LAK+IL-2 (Rosenberg, 1985). Cytotoxický účinek LAK navíc není závislý na přítomnosti molekul hlavního histokompatibilního systému (MHC), a nejde tedy o populaci buněk specifickou pro nádorovou tkáň. Úsilí se dále soustředilo na expanzi těch lymfocytárních populací, které infiltrují samotný nádor (TIL-tumor infiltrating lymphocytes), a je tedy možno předpokládat, že se mezi nimi vyskytují i lymfocyty specifické proti nádoru. Studie provedené in vitro ukázaly značný nárůst cytotoxické aktivity specifické proti původní nádorové tkáni. Klinický přínos infuzí TIL nebyl ovšem dosud zhodnocen ve velkých klinických studiích, především pro množství metodologických překážek, které představuje izolace TIL z nádorové tkáně a jejich dostatečné pomnožení in vitro (Aebersold, 1991). Nepřesvědčivé výsledky, spolu s vysokými náklady zapříčinily koncem 80. let odklon od tohoto způsobu léčby nádorových onemocnění.

Úloha buněk předkládajících antigen (APC) v imunitním systému Z výše uvedeného vyplývá, že imunoterapie se hlavně soustředila na lymfocyty jako na efektorovou složku imunitního systému. Pro indukci účinné imunitní reakce je ovšem

nutná přítomnost ještě další složky, kterou jsou buňky prezentující antigen (APC), jejichž nejúčinnějším představitelem jsou dendritické buňky (DC, nazývané tak pro jejich typickou morfologii s množstvím výběžků - obrázek 1).

Obr. 1 - Vzhled nezralých DC ve světelném mikroskopu. B lymfocyty, prekurzory buněk produkujících protilátky, jsou schopny rozpoznat antigen v nativní formě pomocí receptoru přítomného na jejich povrchu receptoru. Naproti tomu T lymfocyty vyžadují, aby antigen byl pohlcen APC, rozštěpen na menší části a vystaven na jejich povrchu navázán na molekuly MHC (hlavní histokompatibilní komplex - main histocompatibility complex). MHC molekuly jsou dvojího typu: MHC I. třídy, které stimulují cytotoxické T lymfocyty exprimující na svém povrchu znak CD8, a MHC II. třídy, které nabízejí antigen pomahačským Th lymfocytům, pro něž je typická přítomnost molekuly CD4 (Bartůňková a Hořejší, 1999). Zatímco MHC I. třídy jsou exprimovány na všech buňkách, přítomnost MHC molekul II. třídy je omezena pouze na APC. Interakce MHC molekuly s navázaným antigenem s antigen specifickým receptorem na povrchu T lymfocytů (1. signál) ovšem stále nestačí pro indukci účinné imunitní odpovědi. Pro aktivaci naivních T lymfocytů je dále nezbytně nutná přítomnost dalších molekul na povrchu buňky předkládající antigen v přítomnosti MHC. Jde o molekuly řazené obecně do skupin molekul kostimulačních a adhezivních. Hlavními zástupci kostimulačních molekul jsou molekuly CD80 a CD86, které se váží na molekuly CD28 přítomné na povrchu T lymfocytu. Propojení těchto molekul s jejich ligandy na povrchu naivních T lymfocytů dodá 2.signál, který umožní vývoj efektorových T lymfocytů schopných specificky rozpoznat a ničit struktury obsahující původní antigen (Janeway, 2000). Zahájení T-buněčné imunity je tedy značně náročný proces. Nádorové nebo infikované buňky lokalizované kdekoli v těle musí být nalezeny a rozpoznány specifickými T lymfocyty, jejichž prekurzory cirkulují v krevním řečišti ve velmi nízké frekvenci (1/100000 a méně). Množství komplexu MHC I. třídy spolu se specifickým antigenem na nádorových nebo infikovaných buňkách bývá velmi nízké (<100 na buňku) a navíc tyto buňky velmi často nemají na svém povrchu nezbytné kostimulační molekuly (Angevin, 2000). Jsou to právě APC a především dendritické buňky, které zajistí, že ve většině případů je antigen účinně prezentován specifickým naivním T lymfocytům a může dojít k jejich namnožení, účinné obranné reakci a vytvoření paměťových buněk. Výše uvedené poznatky o podmínkách, za kterých dochází k indukci specifické imunitní odpovědi proti

nádorové tkáni, vedou k úvahám o využití dendritických buněk, jako nejúčinnějšího představitele buněk předkládajících antigen, v imunoterapii nádorových onemocnění. V tomto článku budou stručně shrnuty poznatky o jejich životním cyklu v organizmu a diskutovány možnosti jejich praktického využití v aktivní imunoterapii nádorových onemocněni.

Fyziologie DC Dendritické buňky cirkulují v krvi ve velmi malém množství, což v minulosti ztěžovalo jejich výzkum a bránilo úvahám o jejich využití v imunoterapii. V polovině 90. let byly publikovány první protokoly (Romani a spol., 1996; Thurner a spol., 1999), popisující kultivaci DC z monocytů či kmenových hematopoetických buněk zdravých dárců za přítomnosti různých cytokinů, především GM-CSF (Granulocyte-Monocyte-Colony stimulating factor) a IL-4. Možnost získat dostatečné množství DC in vitro umožnila jejich intenzivní studium a během posledních 5 let byl učiněn značný pokrok ve znalostech o jejich přesné funkci v organizmu a jejich fyziologii. DC vznikají z kmenových buněk v kostní dřeni, odkud jsou již jako nedělící se buňky vyplavovány do krevního oběhu. Z krevního oběhu vstupují do tkání, kde se vyskytují především v takzvaném nezralém stavu. Nezralé DC exprimují na svém povrchu velké množství molekul umožňujících pohlcování nejrůznějších patogenů (viry, bakterie, infikované, nádorové či odumřelé buňky - obrázek 2).

Obr. 2 - Nezralé DC (označeny protilátkou proti MHC II.třídy-zeleně) účinně fagocytují buňky nádorové linie maligního melanomu M44 (označené barvivem PKH26-červeně). V tomto nezralém stavu mají na svém povrchu pouze málo MHC a kostimulačních molekul. Pro zahájení imunitní odpovědi je nezbytné, aby došlo k maturaci (dozrání) DC. Tento proces je charakterizován vymizením schopnosti fagocytovat antigeny. Dochází k výraznému zvýšení exprese MHC molekul I. a II. třídy, CD83 a kostimulačních molekul CD80, CD86, na jejich povrchu se objevuje molekula CCR7, která je receptorem pro

chemokin MIP-3b, který se vyskytuje v lymfatických uzlinách. Zralá DC migruje do lymfatické uzliny, kde účinně předkládá antigeny na svém povrchu T lymfocytům. Navíc syntetizuje celou radu cytokinů, které dále ovlivňují typ vyvíjejících se efektorových T lymfocytů, především IL-12 (Steinman a spol., 1997). Byla popsána celá řada látek, které způsobí maturaci DC. Většinou jde zcela logicky o produkty spojené s přítomností patogenů v organizmu (např. lipopolysacharid - součást stěny gramnegativních bakterií, bakteriální DNA, virová dvojvláknová RNA, zánětlivé cytokiny (TNFa, IL-1, IL6)) nebo o molekuly exprimované na povrchu aktivovaných T lymfocytů (CD40L) (Cella a spol., 1999; Salio a spol., 2000; Sallusto a spol., 1995; Verdijk a spol., 1999).

Imunoterapie pomocí DC Současné terapeutické protokoly používané v onkologii (chirurgie, chemoterapie, radioterapie) jsou relativně velmi účinné ve své schopnosti zredukovat množství nádorových buněk. U mnoha typů malignit ovšem zůstává problémem perzistence malého množství buněk rezistentních na použité léky. Tento stav se nazývá minimální reziduální nemoc (MRN) a zřejmě existuje závislost mezi hladinou MRN a prognózou pacienta. Přežívající buňky dají v dalším průběhu choroby vznik nové, terapeuticky již těžko ovlivnitelné nádorové populaci. Imunitní systém je schopen eliminovat nádorové buňky, jak ukazují ojediněle popisované spontánní remise např. u maligního melanomu a adenokarcinomu ledvin (Palucka a spol., 1998). Aktivace protinádorové odpovědi probíhá v několika krocích : 1) rozpoznání nádorových antigenů nezralými DC, 2) pohlcení, zpracování a prezentace nádorových antigenů DC, 3) aktivace a namnožení nádorově specifických T lymfocytů, 4) migrace efektorových T lymfocytů do místa nádorového bujení a specifická eliminace nádorových buněk. Na každém z těchto stupňů může nádor uniknout imunitnímu dohledu (Banchereau, 2000). Mechanizmů, které umožní nádoru uniknout z imunitního dohledu, bylo popsáno několik a pravděpodobně je jich ještě celá řada neobjasněna. Nicméně nádorové buňky exprimují antigeny, víceméně specifické, které se na jiných buněčných typech nevyskytují nebo se vyskytují v jiných kombinacích. Těchto tzv. nádorově specifických, resp. asociovaných antigenů (TSA - tumor specific antigens, resp. TAA- tumor associated antigens) je již popsáno velké množství (Boon, 1996) a pokusy in vitro prokázaly, ze jsou-li předkládány naivním T lymfocytům zralými dendritickými buňkami, dochází k indukci specifické imunitní odpovědi (Marchand, 1999; Topalian, 1996). Důvodem, proč nádorové buňky in vivo nevyvolají imunitní odpověď, která by vedla k eliminaci nemoci, je často právě jejich neschopnost plnit funkci antigen prezentující buňky, nebo stimulovat profesionální antigen prezentující buňky. Profesionální APC, jak již bylo řečeno, jsou schopny poskytnout T lymfocytům oba signály nezbytné pro vývoj efektorových buněk, schopných specificky ničit nádorovou tkáň. Naproti tomu nádorová buňka nenese na svém povrchu kostimulační molekuly, takže specifický T lymfocyt je místo aktivace utlumen a uveden do stavu tzv. anergie, t.j. neschopnosti reagovat na přítomnost nádorově změněné buňky proliferací a vývojem cytotoxické odpovědi (Schultze, 1996). V souladu s výše uvedenými údaji se tedy zdá, že imunoterapie pomocí dendritických buněk, které by obsahovaly nádorové antigeny, by mohla byt elegantním a účinným přístupem, který by mohl v kombinaci s ostatními terapeutickými modalitami přispět k eradikaci minimální reziduální nemoci.

Nedořešené problémy Dendritické buňky jsou nejúčinnější APC a jsou jedinečné ve své schopnosti stimulovat jak paměťové, tak naivní T lymfocyty (Banchereau, 2000). Jejich klíčová role při stimulaci nádorově specifické imunitní odpovědi je prokázaná in vitro a in vivo (Berard a spol., 2000; Jenne a spol., 2000). Myší dendritické buňky, které in vitro pohltily nádorové antigeny, vyvolaly po injekci zpět do organizmu regresi nádoru, a myši, které obdržely tuto infuzi, byly chráněny proti následnému vystavení původní nádorové linii (Henry, 1998). U lidí byly první klinické studie provedeny u pacientů s maligním melanomem ve stadiu orgánových metastáz. Z krve pacientů byly izolovány monocyty, z nichž byly následně in vitro v přítomnosti GM-CSF a IL-4 připraveny DC. Těmto DC byly dále nabídnuty ke zpracování TAA specifické pro maligní melanom (peptid označovaný jako MAGE-1). Procesu, kdy DC zpracovávají antigen a vystavují ho pak účinně na svém povrchu spolu s MHC I. a II. třídy a kostimulačními molekulami, říkáme pulzování. DC pulzované TAA byly následně injikovány do lymfatických uzlin pacientů. Objektivně prokazatelná klinická odpověď, byla prokazatelná u 5/16 pacientů zahrnutých ve studii (Nestle, 1998). Podobných studií bylo publikováno několik, téměř ve všech případech byla prokázána aktivace specifických T lymfocytů proti nádorovým antigenům in vitro, nicméně klinická data stále neumožňují s určitostí říci, zda jsou naděje vkládané do dendritických buněk oprávněné Dhodapkar, 1999; Hsu, 1996). Problémem je, že existuje velké množství proměnných, které mohou ovlivnit indukci protinádorové odpovědi: · Otázkou zůstává, jaké množství DC a v jakých časových intervalech by mělo být pacientům injikováno. Ze 100 ml periferní krve je možno připravit maximálně 10 miliónů nezralých DC. Tento počet se dále zredukuje poté,co jsou DC pulzovány TAA a maturovány pomoci cytokinů. Pro přípravu většího množství DC se jako optimální jeví odběr velkého množství PMB pomoci leukaferézy, příprava DC a jejich zmrazení pro pozdější použití. · Dalším problémem je forma TAA, která má být nabídnuta DC ke zpracování. Nabízí se celá řada možností: - Přímo TAA ve formě peptidu, proteinu, či mRNA - Lyzát nádorové tkáně -Apoptotické nádorové buňky. · Forma DC, která je injikována pacientům. Ve většině zatím proběhlých klinických studiích byly použity DC nezralé. Z pokusu in vitro je ovšem zřejmě, ze schopnost aktivovat naivní T lymfocyty mají pouze DC zralé (Larsson a spol., 2000). Bude tedy možná nezbytné maturovat pulzované DC in vitro pomocí některého z prokázaných maturačních agens a pacientům injikovat již DC zralé. · Konečně posledním problémem, který bude zmíněn, je otázka cesty, kterou by měly být pulzované DC vpraveny zpět do organizmu, tak aby byla zaručena jejich migrace do lymfatických uzlin a účinná stimulace T lymfocytů. Injekce přímo do lymfatické uzliny se jeví technicky přece jenom obtížnějším řešením a uvažuje se spíše o intravenózní, či subkutánní aplikaci.

Centrum buněčné terapie a terapeutický protokol

V rámci Centra buněčné terapie, které vzniklo při 2. lékařské fakultě Univerzity Karlovy, jsou připravovány nezralé dendritické buňky z monocytů izolovaných z periferní krve zdravých dárců a onkologicky nemocných pacientů. Takto získané DC jsou ve spolupráci s Institutem biologie a imunologie v Nantes (Francie) detailně studovány z hlediska morfologie a exprese specifických molekul. Je zhodnocena jejich schopnost pohlcovat nádorové buňky a aktivovat in vitro specifické T lymfocyty. Stejně tak je detailně studována schopnost různých agens indukovat zrání dendritických buněk a vliv tohoto procesu na životnost DC a jejich schopnost prezentovat účinné antigeny lymfocytům. Souběžně s tímto výzkumem probíhají studie mající za cíl zjistit, jaká forma nádorových buněk je nejvhodnější pro pulzaci DC, a jak zpracovat nádorové tkáně tak, aby bylo možno připravit skutečně účinnou směs nádorových antigenů. Cílem celého projektu je vytvoření a uvedení do praxe obecně aplikovatelného terapeutického protokolu, jehož schéma je na obrázku č. 4.

Obr. 4 - Schéma terapeutického protokolu. Na rozdíl od již publikovaných studií, do kterých byli zahrnuti pacienti s již velmi rozvinutým nádorovým onemocněním, bychom se chtěli zaměřit na pacienty ve stadiu MRN, u nichž byla značná část nádorové masy odstraněna buď chirurgickým výkonem nebo účinnou chemoterapeutickou léčbou. Pacient podstoupí leukaferézu, při které bude získáno dostatečné množství PMB pro přípravu dendritických buněk. Vzorek nádorové tkáně získaný při biopsii nebo při chirurgickém výkonu bude použit pro přípravu nádorových antigenů. Následně budou dendritické buňky ve dvou krocích pulzovány nádorovými antigeny a indukována jejich maturace. Takto pulzované zralé dendritické buňky budou vpraveny zpět do těla pacienta. V této souvislosti se hovoří o protinádorové vakcíně, protože pacient je vlastně "očkován" proti svému nádoru. Zralé dendritické buňky by měly migrovat do lymfatických uzlin a zde účinně předkládat nádorové antigeny specifické pro nádorovou tkáň každého jednotlivého pacienta naivním T lymfocytům. Výsledkem by tedy mělo být vyvolání specifické protinádorové odpovědi, dostatečně efektivní pro potlačení zbylé nádorové masy.

Závěr Naděje vkládané do protinádorové imunoterapie vždy pramenily z úspěšných pokusů in vitro a z úspěšných studií na zvířecích, především myších modelech. Jak již bylo uvedeno v úvodu článku, data takto získaná ještě neopravňují k přílišnému optimizmu ohledně stejné účinnosti při terapii lidských onemocnění. Přes velké naděje, které jsou do tohoto přístupu vkládány a první probíhající klinické studie, bude ještě třeba s hodnocením počkat na studie, kde budou jasně definovány všechny parametry tak, jak byly zmíněny v předešlých kapitolách, a do kterých budou zahrnuti pacienti s malým množstvím nádorové tkáně. Nezbytnou složkou všech klinických studií bude dokonalá spolupráce mezi laboratoří připravující protinádorovou vakcínu a klinickým pracovištěm, které bude muset velmi přesně hodnotit míru terapeutické odpovědi. Ta nemusí spočívat v úplné eradikaci nádorových buněk, může se spíše jednat o jakousi trvalou kontrolu dalšího růstu nádoru (Srivastava, 2000). Ustavení Centra buněčné terapie při 2. lékařské fakultě v Motole dává předpoklad k těsné spolupráci s klinickými pracovišti. Navrhovaný terapeuticky protokol je navíc velmi pružný a je možno jej aplikovat na celou řadu nádorových onemocnění. Poděkování Děkujeme Mgr. Radku Čmejlovi a MUDr. Tomáši Kalinovi za pomoc s redakční úpravou. Projekt je podporován Programem podpory výzkumu a vývoje « Výzkumná centra » č. LN00A065

Literatura 1. Aebersold, PM., Hyatt, C., Johnson, S. (1991) Lysis of autologous melanoma cells by tumor-infiltrating lymphocytes: association with clinical response. J Natl Cancer Inst, 83, 932-7. 2. Angevin, E., Andre, F., Zitvogel, L. (2000) Antitumor cellular immunotherapy: the breakthrough of dendritic cells, Bull Cancer, 87(1):107-15. French 3. Banchereau, J., Briere, F., Caux, C. (2000) Immunobiology of denditic cells. Annu Rev Immunology, 18, 767-811. 4. Berard, F., Blanco, P., Davoust, J., Neidhart-Berard, E.M., Nouri-Shirazi, M., Taquet, N., Rimoldi, D., Cerottini, J.C., Banchereau, J. and Palucka, A.K. (2000) Cross-Priming of Naive CD8 T Cells against Melanoma Antigens Using Dendritic Cells Loaded with Killed Allogeneic Melanoma Cells. J Exp Med, 192, 1535-1544. 5. Boon, T., van der Bruggen, P. Human tumor antigens recognized by T lymphocytes. J Exp Med, 183, 723-9. 6. Cella, M., Salio, M., Sakakibara, Y., Langen, H., Julkunen, I. and Lanzavecchia, A. (1999) Maturation, activation, and protection of dendritic cells induced by doublestranded RNA. J Exp Med, 189, 821-9. 7. Dhodapkar, MV., Steinman, R., Sapp, M. (1999) Rapid generation of T cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells. J Clin Invest, 104, 173-80. 8. Henry, F., Boisteau, O., Bretaudeau, L. (2000) Antigen-presenting cells that phagocytose apoptotic tumor-derived cells are potent tumor vaccines. Cancer Res,

59,3329-32. 9. Horejsi, V, Bartunkova, J, Základy imunologie. 10. Hsu, FJ., Benike, C., Fagnoni, F. (1996) Vaccination of patients with B-cell lymphoma using autologous antigen pulsed dendritic cells. Nature Med, 2, 52-8. 11. Janeway CA Jr, Travers P Eds, Immunobiology. 12. Jenne, L., Arrighi, J.F., Jonuleit, H., Saurat, J.H. and Hauser, C. (2000) Dendritic cells containing apoptotic melanoma cells prime human CD8+ T cells for efficient tumor cell lysis. Cancer Res, 60, 4446-52. 13. Larsson, M., Messmer, D., Somersan, S., Fonteneau, J.F., Donahoe, S.M., Lee, M., Dunbar, P.R., Cerundolo, V., Julkunen, I., Nixon, D.F. and Bhardwaj, N. (2000) Requirement of mature dendritic cells for efficient activation of influenza Aspecific memory CD8+ T cells. J Immunol, 165, 1182-90. 14. Marchand, M., van Baren, N., Weynants, P. (1999)Tumor regression observed in patients with metastatic renal cell carcinoma terated with peptide encoded by gene MAGE-3 and presented by HLA-A1. Int J Cancer, 80, 219-30. 15. Mulle, JJ, Shu S., Rosenberg, SA. (1985) The antitumor efficacy of lymphocyte activated tumo cells and recombinant IL-2 in vivo. J Immunol, 135, 646-52. 16. Nestle, FO, Alijagic, S., Gillier, M. (1998) Vaccination of melanoma patients with peptide or tumor lysate pulsed dendritic cells. Nat Med, 4, 328-32. 17. Palucka, K.A., Taquet, N., Sanchez-Chapuis, F. and Gluckman, J.C. (1998) Dendritic cells as the terminal stage of monocyte differentiation. J Immunol, 160, 4587-95. 18. Romani, N., Reider, D., Heuer, M., Ebner, S., Kampgen, E., Eibl, B., Niederwieser, D. and Schuler, G. (1996) Generation of mature dendritic cells from human blood. An improved method with special regard to clinical applicability. J Immunol Methods, 196, 137-51. 19. Rosenberg, SA., Lotze, MT., Muul, LM. (1985) Observation of systemic administration of autologous lymphokine activated killer cells and recombinant interleukin-2 to patients with metastatic cancer. N Engl J Med, 313, 1485-92. 20. Salio, M., Cerundolo, V. and Lanzavecchia, A. (2000) Dendritic cell maturation is induced by mycoplasma infection but not by necrotic cells. Eur J Immunol, 30, 705-8. 21. Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C. and Lanzavecchia, A. (1995) Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocompatibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products [see comments]. J Exp Med, 182, 389-400. 22. Schultze, J., Nadler, LM., Gribben, JG. (1996) B7-mediated costimulation and the immune response. Blood Rev, 10, 111-27. 23. Srivastava, PK. (2000) Immunotherapy of human cancer. Nature Immunol, 1, 3634. 24. Steinman, R.M., Pack, M. and Inaba, K. (1997) Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol, 417, 1-6. 25. Thurner, B., Roder, C., Dieckmann, D., Heuer, M., Kruse, M., Glaser, A., Keikavoussi, P., Kampgen, E., Bender, A. and Schuler, G. (1999) Generation of large numbers of fully mature and stable dendritic cells from leukapheresis products for clinical application [published erratum appears in J Immunol Methods 1999 Apr 22;224(1-2):211]. J Immunol Methods, 223, 1-15.

26. Topalian, SL., Gonzales, MI., Parkust, M. (1996) Melanoma specific CD4+ T cells recognize nonmutated HLA-DR restricted tyrosinase epitopes. J Exp Med, 183, 1965-74. 27. Verdijk, R.M., Mutis, T., Esendam, B., Kamp, J., Melief, C.J., Brand, A. and Goulmy, E. (1999) Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly(I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells. J Immunol, 163, 5761. Adresa pro korespondenci: Doc. MUDr. Jiřina Bartůňková, Csc. Ústav imunologie UK 2.LF a FNM V úvalu 84 150 00 Praha 5 Telefon: 02-2443 5960 Fax: 02-2443 5962 E-mail: [email protected]

Membránové vlastnosti neuronů, gliových a kmenových buněk v centrálním nervovém systému Chvátal, A., Syková, E. Oddělení neurověd, Ústav experimentální medicíny AVČR, Vídeňská 1083, 142 20 Praha 4 Ústav neurověd UK 2. LF, Praha a Centrum buněčné terapie a tkáňových náhrad UK, V Úvalu 94, 150 00 Praha 5

Souhrn Studium elektrofyziologických vlastností neuronů a gliových buněk, tj. astrocytů a oligodendrocytů, prokázalo, že i když se vyvíjejí ze stejných prekurzorových buněk, mají odlišné elektrofyziologické vlastnosti, které jsou určeny především přítomností různých typů iontových kanálů a přenašečů v buněčné membráně. U neuronů se iontové kanály výraznou měrou podílejí na tvorbě a propagaci akčních potenciálů, zatímco u gliových buněk se iontové kanály mohou uplatnit během celé řady pochodů, např. při udržování iontové homeostázy, při uvolňování hormonů a při komunikaci s okolními buňkami. V nedávné době začal výzkum elektrofyziologických vlastností kmenových buněk pro jejich případné využití k transplantacím. Bylo zjištěno, že neurony a gliové buňky, diferencované z embryonálních kmenových buněk a pěstované v kulturách, mají obdobné elektrofyziologické vlastnosti, jako zralé buňky v nervové tkáni. Proto bude další výzkum soustředěn na studium jejich elektrofyziologických vlastností po transplantaci do mozku a míchy pokusných zvířat, a jejich funkčního zapojení v nervové tkáni hostitele.

Summary Membrane features of neurons, glial and stem cells in the central nervous system Chvátal, A., Syková, E. The study of the electrophysiological properties of glial cells, i.e. astrocytes and oligodendrocytes, revealed that even though they develop from the same type of precursor cell, they have distinct electrophysiological properties, which are determined by the presence of different types of ionic channels and transporters in the cell membrane. In neurons, ionic channels play an important role in the initiation and propagation of action potentials, while in glial cells they are involved in the maintenance of ionic homeostasis, the regulation of metabolism or the release of hormones, and in communication with surrounding cells. Recently, the electrophysiological properties of stem cells have been studied for their possible use in transplantation. It was found that both neurons and glia, differentiated from embryonal stem cells and kept in cell cultures, have similar electrophysiological properties as mature cells in the nervous tissue. Therefore, the future studies will be concentrated on the electrophysiological properties of stem cells after transplantation into the brain or spinal cord of experimental animals and their functional incorporation into the host nervous tissue.

1. Vývoj neuronů a gliových buněk v průběhu ontogeneze. Neurony patří spolu s gliovými buňkami, tj. astrocyty, oligodendrocyty a jejich prekurzory, k hlavním buněčným elementům centrálního nervového systému (CNS). Bylo vypočteno, že na jeden neuron v CNS připadá asi 10 gliových buněk, přičemž neuroglie zabírá 50% z celkového objemu mozku (Kuffler, 1967; přehled viz Sontheimer, 1995). Řada proteinů a enzymů se nachází téměř výlučně v gliových buňkách, a proto se lze domnívat, že kromě neuronů, které se v CNS podílejí na přenosu signálů, gliové buňky zajišťují další specializované funkce. Nejlépe byl vývoj neuronů a gliových buněk v průběhu ontogeneze prostudován v kůře mozkové (přehledy viz Rakic, 1981; Cameron a Rakic, 1991; Obr. 1).

Obr. 1 - Vývojové vztahy v průběhu ontogeneze mezi neurony a gliovými buňkami v kůře mozkové. Diferenciace neuronů a gliových buněk probíhá ze společných prekurzorů. Podrobnější popis viz text. Neurony a gliové buňky se vyvíjejí z neuroektodermu neurální trubice. Další diferenciací buněk dojde ke vzniku tzv. multipotentních kmenových buněk a dále pak bipotentních (neuronálních a gliových) prekurzorových buněk, které jsou přítomny v mozku po celý život. Z těchto prekurzorových buněk se v dalších, již oddělených vývojových liniích diferencují neuronální a gliové prekurzorové buňky, které však ještě v určitých vývojových fázích mohou fenotypovou konverzí přecházet z jednoho typu do druhého. Z prekurzorů gliové linie dochází následnou diferenciací ke vzniku další skupiny prekurzorů, tzv. O-2A prekurzorů, 1A prekurzorů a prekurzorů radiální glie. Z O-2A prekurzorů se vyvíjejí jak oligodendrocyty, tak i astrocyty typu 2, z prekurzorů typu 1A se vyvíjejí astrocyty typu 1 a z prekurzorů radiální glie se vyvíjí řada gliových buněk: Bergmannovy gliové buňky v mozečku, Müllerovy gliové buňky v oční sítnici, ependymové gliové buňky a další typy glie (např. tanycyty).

2. Iontové kanály v gliových buňkách Elektrofyziologické vlastnosti neuronů a gliových buněk jsou určeny přítomností pasivních iontových kanálů (především pro K+), napěťově řízených iontových kanálů (např. pro K+, H+, Ca2+ a Cl-) a chemicky řízených iontových kanálů (např. GABA, glycin a glutamát). Iontové kanály jsou tvořeny proteiny, které se nacházejí v buněčné membráně, přičemž otevření póru je způsobeno konformační změnou proteinů. Aktivace napěťově řízeného iontového kanálu je vyvolána změnou membránového potenciálu, zatímco aktivace chemicky řízeného iontového kanálu nastane po navázání chemické látky na receptorovou část proteinu.

2.1. Napěťově řízené kanály Napěťově řízené kanály přítomné u neuronů a gliových buněk lze rozdělit podle aktivace a inaktivace do dvou základních skupin: inaktivující se a neinaktivující se iontové kanály (přehledy viz Barres a spol., 1990; Barres, 1991; Oh, 1997). Inaktivující se napěťově řízené kanály byly zjištěny u neuronů, kde zajišťují průběh akčního potenciálu, a u prekurzorů gliových buněk (Tab. 1).

Tab. 1 - Napěťově řízené kanály na membránách astrocytů, oligodendrocytů a neuronů. NaV - sodíkové kanály, CaT - nízkoprahové vápníkové kanály, CaL - vysokoprahové "dlouhé" vápníkové kanály, CaN - vysokoprahové vápníkové kanály neuronového typu, KD - draslíkové kanály, tzv. pozdní usměrňovače, KA - tzv. A-typ draslíkového kanálu, KCa - vápníkem aktivované draslíkové kanály, KIR - dovnitř usměrňující draslíkové kanály, ClV - chloridové kanály. Mezi nejdůležitější patří napěťově řízený Na kanál (NaV), dále pak A-typ K+ kanálu (KA) a K+ zpožděný usměrňovač (angl. delayed rectifier - KD). Proudy, které procházejí uvedenými kanály, lze pozorovat při postupné depolarizaci buňky z klidové hladiny -70 mV na +20 mV (Obr. 2; Chvátal a spol., 1995; přehled viz Chvátal a Syková, 2000). V průběhu hyperpolarizace buňky z -70 mV na -110 mV lze v některých případech pozorovat i dovnitř směřující K+ usměrňovače (angl. inward rectifier - KIR). Na rozdíl od gliových prekurzorových buněk, jsou neinaktivující se K+ proudy u zralých astrocytů a oligodendrocytů pasivní, a téměř věrně kopírují průběh depolarizačního nebo hyperpolarizačního pulzu (Obr. 2).

Obr. 2 - Membránové proudy neuronů, gliových prekurzorových buněk a zralých gliových buněk vyvolané depolarizací a hyperpolarizací v míšních řezech potkana. Buňky byly depolarizovány a hyperpolarizovány serií pulzů o délce 50 ms a o vzrůstající intenzitě od klidové hladiny -70 mV na +20 mV a na -160 mV. Získané záznamy jsou pro přehlednost superponovány. U neuronů lze v průběhu depolarizace pozorovat spontánní aktivitu. I když se u zralých oligodendrocytů proud v průběhu pulzů snižuje, nejedná se o inaktivaci, ale pravděpodobně o postupné hromadění K+ v těsné blízkosti membrán buněk a postupnému ustavení nové rovnováhy pro K+ (Chvátal a spol., 1997).

2.2. Chemicky řízené kanály. Chemicky řízené kanály se aktivují navázáním chemické látky (např. mediátoru) na receptorovou část iontového kanálu. Nejběžnější mediátory synaptického přenosu u neuronů jsou glutamát, který působí excitačně, GABA a glycin, které působí inhibičně. Rovněž na membránách gliových buněk v různých strukturách mozku a míchy byla zjištěna přítomnost celé řady chemicky řízených iontových kanálů, jejichž aktivace však většinou vyvolává opačný účinek než u neuronů (Tab. 2).

Tab. 2 - Účinek aktivace ionotropních kanálů na neuronech a gliových buňkách v míšních řezech potkana po aplikaci excitačně působících agonistů glutamátu (AMPA, kainát a NMDA) a inhibičních mediátorů (GABA a glycin).

3. Fyziologický význam iontových kanálů. Inaktivující se napěťově řízené kanály u neuronů se výraznou měrou podílejí na tvorbě a propagaci akčních potenciálů, avšak jejich úloha v prekurzorových gliových buňkách nebyla dostatečně objasněna. Neinaktivující se napěťově řízené kanály u gliových buněk se uplatňují při tzv. prostorovém pufrování K+, které se hromadí v důsledku neuronální aktivity v extracelulárním prostoru CNS (přehledy viz Syková, 1983; Syková, 1992). Aktivace chemicky řízených kanálů u neuronů a gliových buněk hraje důležitou úlohu během regulace neuronální excitability a přenosu signálů mezi neurony a gliovými buňkami, při regulaci velikosti extracelulárního prostoru prostřednictvím změn objemu astrocytů, při regulaci iontové homeostázy a metabolizmu gliových buněk, při uvolňování hormonů z neuronů a gliových buněk, v průběhu vývoje a během patologických stavů (Chvátal a Syková, 2000; Syková a Chvátal, 2000).

4. Membránové vlastnosti kmenových buněk. V poslední době probíhá intenzivní výzkum morfologických, imunohistochemických a elektrofyziologických vlastností nervových kmenových buněk pro jejich případné využití k transplantacím a náhradě poškozené nervové tkáně.

Výzkum elektrofyziologických vlastností embryonálních kmenových buněk (EKB) a z nich diferencovaných neuronů a gliových buněk byl doposud z velké části proveden na buňkách pěstovaných v kulturách. K výzkumu bylo použito EKB izolovaných z pokusných zvířat, např. z myši (Strubing a spol., 1995; Gottlieb a Huettner, 1999), z potkana (Ma a spol, 1998), ale i z lidských kmenových buněk (Cauley a spol., 1997; Gritti a spol., 2000). Růstovými faktory a dalšími látkami, např. kyselinou retinolovou, lze v podmínkách in vitro navodit diferenciaci EKB přes fázi prekurzorových buněk na zralé neurony nebo gliové buňky, identifikovatelné specifickými imunohistochemickými markery. Vlastnosti zralých neuronů, astrocytů a oligodendrocytů v nervové tkáni in vivo nebo in situ a stejných typů buněk vypěstované z EKB in vitro jsou i přes některé odlišnosti podobné. U nervových buněk diferencovaných z embryonálních kmenových buněk (Obr. 3) byla zjištěna přítomnost nejen napěťově závislých kanálů, např. pro K+, Na+ a Ca2+, ale i chemicky aktivovaných inhibičních a excitačních kanálů, např. pro GABA, glycin a glutamát (Strubing a spol, 1995; Bain a spol., 1995). U astrocytů diferencovaných z lidských EKB byla zjištěna přítomnost KA a KD, zatímco přítomnost KIR nebyla prokázána. Avšak nejzajímavějším nálezem byla přítomnost TTX-senzitivních NaV, jejichž aktivace vede ke vzniku akčních potenciálů (Obr. 3; Gritti a spol., 2000).

Obr. 3 - Příklady membránových vlastností astrocytů a neuronů vypěstovaných z lidských kmenových buněk v průběhu depolarizace buněčné membrány. A: Jednotlivé hroty zaznamenané v průběhu depolarizace membrány astrocytu a neuronu reprezentují akční potenciály. B: Proudová analýza prokázala u starocytů přítomnost napeťově závislých sodných (NaV) a draselných kanálů (KA) kanálů (podle Gritti a spol., 2000).

V další studii, provedené na lidských prekurzorových buňkách astrocytů, byla zjištěna přítomnost i AMPA/kainátového typu glutamátových receptorů (Cauley a spol., 1997). Je zřejmé, že neurony a gliové buňky, diferencované z embryonálních kmenových buněk a pěstované v kulturách, mají obdobné elektrofyziologické vlastnosti, jako zralé buňky v nervové tkáni. Proto bude výzkum diferencujících se nervových kmenových buněk v dalším období soustředěn na studium jejich elektrofyziologických vlastností po transplantaci do mozku a míchy pokusných zvířat, a jejich funkčního zapojení v nervové tkáni hostitele. Grantová podpora: MŠMT Program podpory výzkumu a vývoje "Výzkumná centra" č. LN00A065, GAČR č. 305/99/0655 a 309/99/0657.

Literatura 1. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J.E. & Gottlieb, D.I. (1995) Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol., 168:342-357. 2. Barres, B.A., (1991) New roles for glia. J. Neurosci., 11:3685-3694. Barres, B.A., Chun, L.L.Y. & Corey, D.P. (1990) Ion channels in vertebrate glia. Annu. Rev. Neurosci., 13:441-473. 3. Cameron, R.S. & Rakic, P. (1991) Glial cell lineage in the cerebral cortex: A review and synthesis. Glia, 4:124-137. 4. Cauley, K., Kukekov, V. & Young, D. (1997) Kainate/AMPA receptors expressed on human fetal astrocytes in long-term culture. J. Neurosci. Res., 47:311-321. 5. Chvátal, A. & Syková, E. (2000) Glial influence on neuronal signaling. Prog. Brain. Res., 125:199-216. 6. Chvátal, A., Berger, T., Voříšek, I., Orkand, R.K., Kettenmann, H. & Syková, E. (1997) Changes in glial K+ currents with decreased extracellular volume in developing rat white matter. J. Neurosci. Res., 49:98-106. 7. Chvátal, A., Pastor, A., Mauch, M., Syková, E. & Kettenmann, H. (1995) Distinct populations of identified glial cells in the developing rat spinal cord: Ion channel properties and cell morphology. Eur. J. Neurosci., 7:129-142. 8. Gottlieb, D.I. & a Huettner, J.E. (1999) An in vitro pathway from embryonic stem cells to neurons and glia. Cell. Tis. Org., 165:165-72. 9. Gritti, A., Rosati, B., Lecchi, M., Vescovi, A.L. & Wanke, E. (2000) Excitable properties in astrocytes derived from human embryonic CNS stem cells. Eur. J. Neurosci., 12:3549-3559. 10. Kuffler, S.W., Nicholls, J.G. & Orkand, R.K. (1966) Physiological properties of glial cells in the central nervous system of amphibia. J. Neurophysiol., 29:768-787. 11. Ma, W., Liu, Q.Y., Maric, D., Sathanoori, R., Chang, Y.H. & Barker, J.L. (1998) Basic FGF-responsive telencephalic precursor cells express functional GABA(A) receptor/Cl-channels in vitro. J. Neurobiol., 35:277-86. 12. Oh, Y. (1977) Ion channels in neuroglial cells. Kaohsiung J. Med. Sci., 13:1-9. 13. Rakic, P. (1981) Neuronal-glial interaction during brain development. Trends Neurosci., 4:184-187. 14. Sontheimer, H. (1995) Glial influences on neuronal signaling. Neuroscientist, 1:123-126. 15. Strubing, C., Ahnert-Hilger, G., Shan, J., Wiedenmann, B., Hescheler, J. & Wobus,

A.M. (1995) Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev., 53:275-87. 16. Syková, E. (1983) Extracellular K+ accumulation in the central nervous system. Prog. Biophys. Molec. Biol., 42:135-189. 17. Syková, E. (1992) Ionic and Volume Changes in the Microenvironment of Nerve and Receptor Cells. In: Ottoson, D. (ed.), Progress in Sensory Physiology. Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, New York, 1-167. 18. Syková, E. & Chvátal, A. (2000) Glial cells and volume transmission in the CNS. Neurochem. Int., 36:397-409. Adresa pro korespondenci: RNDr. Alexandr Chvátal, CSc. Oddělení neurověd Ústav experimentální medicíny AVČR Vídeňská 1083 142 20 Praha 4 E-mail: [email protected] Tel: 475 2670 Fax: 475 2783

HOME | hpb | autorům | kongresy | časopis | akce |