CELLULÁRIS SZÍVELEKTROFIZIOLÓGIAI MÉRÉSI TECHNIKÁK Dr. Virág László
Intracelluláris mikroelektród technika Voltage clamp technika Patch clamp technika
Membrane potentials and excitation of impaled single muscle fibers. J. Graham, R. W. Gerard. J Cell Physiol. 1946 Aug;28(1):99-117.
J Cell Physiol. 1949 Dec;34(3):383-96.
J. Physiol. (I95I) 115, 74-94.
Coraboeuf, E. & Weidmann, S. (1949a). C.R. Soc. Biol., Paris, 143, 1329. Coraboeuf, E. & Weidmann, S. (1949b). C.R. Soc. Biol., Paris, 143, 1360.
Intracelluláris mikroelektród technika
Ag/AgCl 3 M KCl Re ~ 10 - 40 MOhm
0.1 - 0.2 µm
erősítő
számítógép
ingerlő
P
e
A/D r
szervfürdő d: ingerlő elektróda e: mikroelektróda r: referens elektróda P: preparátum
Detektált jel
0mV
50 mV
d
100 ms
0 mV
20 mV
50%
APA
100 ms Vmax 90% RP APD50 APD90 előinkubáció 60 perc
anyag
kimosás
20-60 perc
60 perc
Voltage clamp technika
Cole KS (1949) Dynamic Electrical Characteristics of the Squid Axon Membrane. Arch. Sci. Physiol. 3:253–258
Két mikroelektródás voltage clamp teszt potenciál
parancsjel (voltage command)
holding potenciál
“makroszkópikus” nátrium-áram
Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete
Hamill OP, Marty A, Neher E, Sakmann B, Sigworth FJ (1981) Improved Patch-Clamp Techniques for High-Resolution Current Recording from Cells and Cell-Free Membrane Patches. Pflügers Arch. 391: 85–100.
Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete (1) Szívjunk be egy kis membrán darabot a mikropipetta hegyének belsejébe (átmérő ~ 1 µm)
Sejt
Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete (2) “Gigaohm-seal”
R > 1 GOhm
Sejt
M. Sokabe and E Sachs, The Journal of Cell Biology, Volume 111, 599-606, 1990.
Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete (3) Kapcsoljuk a kívánt potenciálra az elektróda belsejét és tartsuk konstans értéken a voltage clamp módszert használva.
Sejt
Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete (3) Kapcsoljuk a kívánt potenciálra az elektróda belsejét és tartsuk konstans értéken a voltage clamp módszert használva.
zárt nyitott
+
+ Sejt
Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete
zárt
(3) Kapcsoljuk a kívánt potenciálra az elektróda belsejét és tartsuk konstans értéken a voltage clamp módszert használva.
zárt
nyitott
Sejt
Nátrium csatornák tulajdonságai parancsjel (voltage command)
10 msec
Két mikroelektródás voltage clamp teszt potenciál
parancsjel (voltage command)
holding potenciál
“makroszkópikus” nátrium-áram
Nátrium csatornák tulajdonságai 1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak
Nátrium csatornák tulajdonságai 1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak 2. A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus nátrium áramhoz viszonyítva.
“makroszkópikus” nátrium áram
Nátrium csatornák tulajdonságai 1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak 2. A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus nátrium áramhoz viszonyítva. 3. A csatornanyitások időtartama és latenciája nagyon változó és előfordul, hogy a csatorna ki se nyílik
“makroszkópikus” nátrium áram
Nátrium csatornák tulajdonságai 1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak 2. A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus nátrium áramhoz viszonyítva. 3. A csatornanyitások időtartama és latenciája nagyon változó és előfordul, hogy a csatorna ki se nyílik 4. A csatornák nyitási valószínűsége hasonló a makroszkópikus áramhoz
300 felvétel szummája
“makroszkópikus” nátrium áram
Nátrium csatornák tulajdonságai 1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak 2. A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus nátrium áramhoz viszonyítva. 3. A csatornanyitások időtartama és latenciája nagyon változó és előfordul, hogy a csatorna ki se nyílik 4. A csatornák nyitási valószínűsége hasonló a makroszkópikus áramhoz 5. A csatornák inaktivációja miatt a másodszori nyitás nagyon ritka
300 felvétel szummája
“makroszkópikus” nátrium áram
1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak. 2. A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus áramhoz viszonyítva. 3. A csatornanyitások időtartama és latenciája nagyon változó és előfordul, hogy a csatorna ki se nyílik 4. A csatornák nyitási valószínűsége hasonló a makroszkópikus áramhoz 5. A csatornák többször is kinyílhatnak, ha nincs inaktiváció
Slowly inactivating K current channel (Ram & Dagan, 1987)
Patch clamp technika konfigurációi
OnCell
Cell-Attached
Patch clamp technika konfigurációi
OnCell
Insideout patch
Patch clamp technika konfigurációi
OnCell
Whole Cell
Patch clamp technika konfigurációi
Whole Cell
Patch clamp technika konfigurációi
Whole Cell
outsideout patch
Whole cell konfiguráció
Whole cell konfiguráció
Whole cell konfiguráció
Rs
Rc
Cm
≈ CmRs
A „whole cell” konfiguráció Intracelluláris oldat
Mikropipetta
+
Extracelluláris oldat
-20 mV ... +50 mV -40 mV
Patch-clamp erősítő
_ _ _ + +
_ _ + + + _ _ + + _ + _ _ +
Sejt
10 ms ... 5000 ms
IBM PC
Run-down jelenség ATP-függő kálium áram
Run-down jelenség L típusú kalcium áram
Patch clamp technika konfigurációi
Whole Cell
Whole Cell, perforated patch - amphotericin-B - nystatin
Run-down jelenség L típusú kalcium áram
Sejtizoláció
- Ca2+ - mentes perfúzió - emésztés (kollagenáz...) - mechanikai agitáció
L típusú kalcium áram 400 ms -40 mV
200 pA 100 ms
0 mV
-40 mV
-35 mV
ICa amplítúdó (pA)
L típusú kalcium áram 0
-400
-800
-1200 -40
-20
0
20
Potenciál (mV)
40
60
-40 mV
-30 mV
ICa amplítúdó (pA)
L típusú kalcium áram 0
-400
-800
-1200 -40
-20
0
20
Potenciál (mV)
40
60
-40 mV
-25 mV
ICa amplítúdó (pA)
L típusú kalcium áram 0
-400
-800
-1200 -40
-20
0
20
Potenciál (mV)
40
60
-40 mV
-20 mV
ICa amplítúdó (pA)
L típusú kalcium áram 0
-400
-800
-1200 -40
-20
0
20
Potenciál (mV)
40
60
-40 mV
-15 mV
ICa amplítúdó (pA)
L típusú kalcium áram 0
-400
-800
-1200 -40
-20
0
20
Potenciál (mV)
40
60
-10 mV -40 mV
ICa amplítúdó (pA)
L típusú kalcium áram 0
-400
-800
-1200 -40
-20
0
20
Potenciál (mV)
40
60
55 mV
-40 mV
ICa amplítúdó (pA)
L típusú kalcium áram Áram-feszültség (I-V) karakterisztika 0
-400
-800
-1200 -40
-20
0
20
40
Potenciál (mV)
előinkubáció 5-10 perc
anyag
kimosás
5-10 perc
10-15 perc
60
