CADASIL
analýza mutací v genu NOTCH3
H. Vlášková, M. Boučková Hnízdová, A. Loužecká, M. Hřebíček, R. Matěj, M. Elleder Ústav dědičných metabolických poruch 1. LF UK a VFN Oddělení patologie a nár. ref. laboratoř TSE-CJN, FTN
http://udmp.lf1.cuni.cz/
CADASIL Cerebrální Autozomálně Dominantní Arteriopatie se Subkortikálními Infarkty a Leukoencefalopatií Patofyziologický podklad: postižení malých subkortikálních artérií v důsledku mutací v genu NOTCH3 Klinický obraz: subkortikální ischemické ikty (30 – 50 let) kognitivní poruchy, závratě, poruchy řeči, sluchu, zraku migrény (s nebo bez aury) psychiatrické potíže progredující vaskulární demence První příznaky: mezi 20 – 50 lety věku Incidence: neznámá v ČR, 2 : 100 000 dosp. ve Skotsku
CADASIL
Morfologické změny: Makroskopické Mozek - mnohočetné infarkty malých artérií (typický MRI obraz)
Mikroskopické Hladké svalstvo arterií (mozek, kůže) - přítomnost GOM na zevní ploše bazální laminy buněk hladkého svalstva arteriol (el. mikroskop)
18 000 x
MRI pacienti s mutací v genu NOTCH3 ve věku A, B : 20-30 let C: 40-50 let D: 50-60 let
van den Boom, R. et al. Radiology 2003;229:683-690
Copyright ©Radiological Society of North America, 2003
Notch 3 - protein o velikosti 2321 AA - rodina transmembránových receptorů (Notch1-4) - vazba s ligandy - odštěpení intracelulární části jako signálu Notch signální dráha: regulace růstu, apoptózy, buněčné diferenciace u živočichů
Diagnostika CADASIL – dřívější model - klinický obraz, pozitivní rodinná anamnéza - typický MRI obraz - kožní biopsie - ELMI (přítomnost GOM) - imunohistochemicky prokázané zvýšené množství materiálu reagujícího s protilátkou proti Notch3
- mutace v genu NOTCH3
Nový diagnostický postup - klinické podezření a MRI nález - sekvenování exonů 3 až 12 - negativní nález – hluboká kožní biopsie - pozitivní ELMI nebo imunohistochemie - sekvenování zbylých 13 exonů
Gen NOTCH3
HGMD databáze: 172 mutací 161 missence mutací 5 malých delecí, 2 sestřihové mutace, 2 malé inzerce, 1 indel mutace, 1 velká delece
Joutel et al, 1997
EGF-like doména - doména podobná motivu v epidermálním růstovém faktoru - v extracelulární doméně transmembránových proteinů nebo u sekretovaných proteinů - v genu NOTCH3 – 34 EGF-like domén - konzervovaný motiv 30 - 40 aminokyselin - šest 100% konzervovaných cysteinů tvoří 3 disulfidové můstky
Mutační analýza – výsledky v ÚDMP od r. 2005 vyšetřeno 48 probandů 13 nalezených mutací (12 „cysteinových”, 1 ne) 3 nové mutace (nepopsané v HGMD) Pacienti bez mutace
Pacienti s prokázanou patogenní mutací
Pacient s potenciálně patogenní mutací
Mutační analýza – výsledky – 1. část Rodina Pacient
Prokázané variace
Vliv na protein
Lokalizace
Proband (1) syn probanda (2) syn probanda (3) dcera probanda (4) bratr probanda (5) synovec probanda (6) sestra probanda (7)
c.866 G >T c.866 G >T -/c.866 G >T -/c.866 G >T c.866 G >T
p. G296C p. G296C
Exon 6
p. G296C p. G296C
5
probandka
c.1931 T >A
p. V644D
Exon 12
6
probandka
c.566 A >G
p. Y189C
Exon 4
2
p. G296C
Mutační analýza – výsledky – 2. část Rodina Pacient
Prokázané variace
Vliv na protein
Lokalizace
c. 994 C >T -/c.544 C >T c.544 C >T -/-
p. R332C
Exon 6
10
proband syn probanda probandka dcera, synovec neteř, synovec
p. R182C p. R182C
Exon 4
11
proband
c.1261 C >T
p. R421C
Exon 8
13
probandka
c.431 G >T
p. C144F
Exon 4
23
proband
c.1732 C >T
p. R578C
Exon 11
27
proband
c.3172 C >T
p. G1058C
Exon 20
28
proband
c.994 C >T
p. R332C
Exon 6
38
proband sestra
c.544 C >T c.544 C >T
p. R182C p. R182C
Exon 4
44
proband
c.994 C >T
p. R332C
Exon 6
47
probandka
c.544 C >T
p. R182C
Exon 4
7
Celkový záchyt činí 27% (13 z 48), s příbuznými ale 34% (23 z 67)
Korelace genotypu a fenotypu Mutace
Klinické příznaky
Familiární výskyt
Kožní biopsie
1
wt/wt
demence, ?
ne
neprokázáno
2
G296C/wt
kognitivní, CMP
ano
GOM/imunohisto
3
wt/wt
?
?
neprokázáno
4
wt/wt
?
ano
neprokázáno
5
V644D/wt
?
?
1 céva, negativní
6
Y189C/wt
migrény, TIA, MRI
ano
GOM/imunohisto
7
R332C/wt
CT, MRI, kognitivní
ano
GOM/imunohisto
11
R182C/wt
migrény, CT
ano
nevyšetřeno
12
R421C/wt
kognitivní, TIA
?
GOM
14
C144F/wt
migrény, TIA, MRI
ano
GOM/imunohisto
15
wt/wt
CMP
ano
nevyšetřeno
Fragmentační analýza - 15 negativních probandů - běžné polymorfismy v homozygotním stavu - přítomnost rozsáhlejší delece na druhé alele ? - vysoce polymorfní STR markery (D19S252, D19S923, D19S415) na chromozomu 19
Výsledek: neprokázali jsme přítomnost rozsáhlé delece u žádného z výše zmíněných probandů, ale zároveň ani nevyloučili možnost menší delece mezi použitými markery.
CADASIL
analýza mutací v genu Notch3
Závěr - shoda mutační a morfologické analýzy - upozornění na výskyt této choroby v ČR (incidence neznámá) - nezbytnost genetické porady v rodině (u presymptomatických konzultandů ve více fázích jako u M. Huntington)
MUDr. Martin Hřebíček, PhD. MUDr. Radoslav Matěj, PhD. Prof. MUDr. Milan Elleder, DrSc. RNDr. Lenka Dvořáková, CSc. Michaela Boučková Hnízdová Alena Loužecká Bc. Helena Myšková MUDr. Larisa Stolnaja Eva Richterová
[email protected]
MŠM ČR 0021620806 a MZ ČR 64165
