UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA BIOLOGICKÝCH A LÉKAŘSKÝCH VĚD
DIPLOMOVÁ PRÁCE C-reaktivní protein, kardiovaskulární onemocnění a dysfunkce endotelu
Vedoucí diplomové práce: RNDr. Ivana Němečková, Ph.D.
Hradec Králové, 2015
KRISTÝNA BARTOŇKOVÁ
Poděkování Moje poděkování patří mé vedoucí práce RNDr. Ivaně Němečkové, Ph.D., za odborné vedení a pomoc, trpělivost a rady, které mi poskytla při vypracování této diplomové práce. Dále děkuji své rodině, své tetě Růžence a přátelům za pomoc a podporu při vypracování diplomové práce.
2
Prohlášení „Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorských dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci jsou řádně citovány. Práce nebyla použita k získání jiného nebo stejného titulu.“ V Hradci Králové dne
3
Obsah 1. Abstrakt .................................................................................................................................. 6 2. Abstract................................................................................................................................... 7 3. Úvod........................................................................................................................................ 8 4. Zadání diplomové práce-cíl práce .......................................................................................... 9 5. Teoretická část ...................................................................................................................... 10 5.1 Cévní endotel .................................................................................................................. 10 5.1.1 Vazodilatační látky ................................................................................................... 10 5.1.2 Endotelová dysfunkce .............................................................................................. 12 5.2 Metabolický syndrom ..................................................................................................... 16 5.2.1 Definice a kritéria pro MS ........................................................................................ 17 5.2.2 Epidemiologie a prevalence MS ............................................................................... 18 5.3 C-reaktivní protein .......................................................................................................... 18 5.3.1 CRP a endotelová dysfunkce .................................................................................... 20 5.3.2 CRP, kardiovaskulární onemocnění a metabolický syndrom ................................... 21 5.4 Endotelová NO syntáza ................................................................................................... 22 5.5 Superoxid-dismutáza ...................................................................................................... 24 5.6 Cyklooxygenáza 2 ............................................................................................................ 27 5.7 Nukleární faktor κB ......................................................................................................... 31 5.8. Forkhead box P3 ............................................................................................................ 33 6. Experimentální část .............................................................................................................. 34 6.1 Materiál ........................................................................................................................... 34 6.1.1 Zvířata ....................................................................................................................... 34 6.2 Pracovní postup .............................................................................................................. 34 6.2.1 Homogenizace tkáně ................................................................................................ 34 6.2.2 Příprava gelu pro elektroforézu ............................................................................... 35 6.2.3 Příprava vzorku a jeho aplikace na gel ..................................................................... 36 6.2.4 Western blot............................................................................................................. 37 4
6.2.5 Imunodetekce .......................................................................................................... 37 6.2.6 Chemiluminiscenční detekce ................................................................................... 38 6.3. Vyhodnocení, statistické vyhodnocení .......................................................................... 39 7. Výsledky ................................................................................................................................ 40 8. Diskuze .................................................................................................................................. 44 9. Závěr ..................................................................................................................................... 47 10. Seznam zkratek ................................................................................................................... 48 11. Seznam tabulek .................................................................................................................. 50 12. Seznam obrázků.................................................................................................................. 50 13. Seznam grafů ...................................................................................................................... 50 14. Použitá literatura ................................................................................................................ 51
5
1. Abstrakt C-reaktivní protein, kardiovaskulární onemocnění a dysfunkce endotelu Diplomová práce Autor: Kristýna Bartoňková Studijní obor: Farmacie Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Cíl práce: Endotel významně ovlivňuje cévní homeostázu, která je porušena při jeho dysfunkci. Dysfunkce endotelu je spojena s mnohými kardiovaskulárními onemocněními. Společně s chronickým zánětem je také podkladem pro metabolický syndrom a některé jeho součásti. Cílem práce bylo detekovat endotelovou dysfunkci u nového transgenního modelu metabolického syndromu pomocí vybraného spektra markerů. Metody: V práci byly sledovány následující faktory: endotelová syntáza oxidu dusnatého, fosforylovaná endotelová syntáza oxidu dusnatého, superoxid-dismutáza 3, cyklooxygenáza 2, nukleární faktor κB a forkhead box P3. Hodnocení jejich exprese v homogenátu aorty bylo provedeno pomocí metody Western blot. Kontrolní skupinu tvořily spontánně hypertenzní samci potkanů, hodnocenou skupinou byli samci transgenních spontánně hypertenzních potkanů exprimujících lidský C-reaktivní protein. Chemiluminiscenční metodou byla následně provedena detekce proteinů na rentgenové filmy. Data byla vyhodnocena denzitometrickou metodou. Výsledky a závěry: Naše výsledky ukazují, že nedošlo k signifikantním změnám v expresi sledovaných markerů. Jediný rozdíl jsme zaznamenali u superoxid-dismutázy 3, kde došlo k více než dvojnásobnému snížení exprese (40,92 %). Snížená exprese superoxiddismutázy 3 naznačuje, že u transgenních potkanů s expresí lidského C-reaktivního proteinu je přítomen oxidační stres, nicméně výraznou endotelovou dysfunkci jsme nepotvrdili. Klíčová slova: C-reaktivní protein, dysfunkce endotelu, metabolický syndrom, SHRpotkani, oxid dusnatý, cyklooxygenáza 2, superoxid-dismutáza 3, nukleární faktor κB, FOXP3, Western blot.
6
2. Abstract C-reactive protein, cardiovascular diseases and endothelial dysfunction Diploma thesis Author: Kristýna Bartoňková Study program: Pharmacy Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Background: Healthy endothelium significantly affects the vascular homeostasis which is damaged during the endothelial dysfunction. This dysfunction is linked to number of cardiovascular diseases. Endothelial dysfunction, together with the chronic inflammation, represents also basis of the metabolic syndrome. The aim of the thesis was to detect selected markers of endothelial dysfunction in recently published transgenic rat model of metabolic syndrome. Methods: In this thesis, following factors were evaluated: endothelial nitric oxide synthase, phosphorylated endothelial nitric oxide synthase, superoxide dismutase 3, cyclooxygenase 2, nuclear factor κB and forkhead box P3. Evaluation of their expression in the aorta homogenates was performed by method Western blot. The control group was composed of spontaneously hypertensive male rats, the evaluated group was made from transgenic spontaneously hypertensive male rats expressing human C-reactive protein. Then the detection of proteins was performed by chemiluminiscent method on X-ray films. All the data were evaluated by densitometry method. Results and conclusions: Our results show no significant changes in the expression of evaluated markers. The only one difference occured in superoxide dismutase 3 levels, there was more than double reduction of expression (40,92%). Decreased expression of superoxide dismutase 3 can indicate oxidative stress in transgenic rats expressing Creactive protein, however, marked endothelial dysfunction wasn´t detected in this study. Key words: C-reactive protein, endothelial dysfunction, metabolic syndrome, SHR-rats, nitric oxide, cyclooxygenase 2, superoxide dismutase 3, nuclear factor κB, FOXP3, Western blot.
7
3. Úvod Cévní endotel významnou měrou ovlivňuje vazodilataci a průtok krve cévním řečištěm. To je zajištěno především produkcí vazodilatačních látek endotelovými buňkami. Mezi ně patří i oxid dusnatý. Endotel na druhou stranu produkuje i látky vazokonstrikční, důležitá je proto rovnováha mezi oběma produkcemi. Dysfunkce endotelu je tedy způsobena jak nerovnováhou v produkci specifických látek, tak může být také důsledkem poruchy jeho celkové funkce. Může vyústit v mnohá kardiovaskulární onemocnění. Mezi ně lze zařadit hypertenzi, ischemickou chorobu srdeční, městnavé srdeční selhání a chronické renální selhání, v neposlední řadě také, metabolický syndrom. Ten je sdružením několika rizikových faktorů, které jsou klíčové pro rozvoj aterosklerózy, dalších kardiovaskulárních onemocnění a diabetes mellitus. V této práci se zaměřuji na vliv C-reaktivního proteinu na cévní endotel a na kardiovaskulární onemocnění. C-reaktivní protein je plasmatickým proteinem, který se podílí na systémové zánětlivé reakci. Podle četných studií má vliv jak na funkci cévního endotelu, tak na kardiovaskulární onemocnění a metabolický syndrom, při kterých se vyskytuje mírný chronický zánět. Měřením exprese vybraných faktorů souvisejících s hladinou C-reaktivního proteinu nebo ovlivněním produkce vazodilatačního oxidu dusnatého sledujeme vliv C-reaktivního proteinu na funkci endotelu. Faktory měřenými v práci jsou endotelová syntáza oxidu dusnatého a její fosforylovaná forma, superoxiddismutáza 3, která zmírňuje oxidační stres. Dále enzym cyklooxygenáza 2 katalyzující vznik prozánětlivých prostaglandinů, transkripční nukleární faktor κB a transkripční faktor FOXP3 (forkhead box P3), jakožto markery zánětlivé reakce.
8
4. Zadání diplomové práce-cíl práce V této práci byla pozorována souvislost exprese vybraných látek s hladinou C-reaktivního proteinu a endotelovou dysfukncí. Cílem práce bylo detekovat endotelovou dysfunkci u nového transgenního modelu metabolického syndromu pomocí vybraného spektra markerů.
9
5. Teoretická část 5.1 Cévní endotel Endotel tvoří výstelku cévního systému v podobě jedné vrstvy endotelových buněk, které jsou nepravidelného podlouhlého tvaru. V ontogenetickém vývoji tvoří první součást cévního sytému. Vlastnosti endotelu závisí na druhu cévy, ve které je umístěn, ale také jsou odvislé od typu jednotlivých orgánů. Luminální povrch endotelu představuje asi 5001000 m2, díky tomu je endotel považován za největší orgán v lidském těle. Tato obrovská plocha je dobrým místem pro kontakt a zprostředkování informací mezi cirkulujícími buňkami a stěnou cév (Hulín, 1998). Působí jako selektivní bariéra kontrolující propustnost a transport rozpuštěných látek - solutů a makromolekul. Pomáhá metabolizovat mnoho faktorů cirkulujících v krvi nebo generovaných na místě. Napomáhá též kontrolovat proliferaci podkladové vaskulární hladké svaloviny a regulovat adhezi a extravazaci neutrofilů, monocytů a leukocytů (Vanhoutte, 1997). Dlouhou dobu se předpokládalo, že tyto buňky jsou pouhou fyzikální bariérou mezi stěnou cév a krví. Ty však plní kromě role mechanické výstelky cév mnoho dalších biologických funkcí (Hartge a další, 2007). Dnes je endotel vnímán jako dynamický heterogenní orgán, který má zásadní sekreční, syntetické, metabolické a imunologické funkce (Cines a další, 1998). Buňky endotelu detekují signály z lumen cév a mění je na chemické posly pro hladkou svalovinu ve stěně cév nebo pro cirkulující buňky. Za fyziologických podmínek mají endotelové buňky více metabolických a sekrečních systémů, kterými mohou ovlivňovat tonus cév, průtok krve cévami a krevní tlak. Endotel může též podle okolností zprostředkovat vazodilataci nebo vazokonstrikci. Endotelové buňky vylučují renin a mají na povrchu velké množství enzymů. Tyto enzymy může endotel přeměňovat z inaktivních prekurzorů na aktivní formy, anebo je naopak inaktivovat. Buňky endotelu dále vylučují endoteliny (účinné vazokonstrikční peptidy), uvolňují vazokonstrikční, ale i vazodilatační faktory a mohou vychytávat a inaktivovat histamin, noradrenalin, serotonin, a tím interferovat s aktivací trombocytů (Hulín, 1998). 5.1.1 Vazodilatační látky Jednou z klíčových funkcí endotelu je zajistit adekvátní průtok krve. Ten je regulován sekrecí různých látek. Endotelové buňky uvolňují vazodilatační látky, které se nazývají EDRF – endotelem derivované relaxační faktory (endothelium-derived relaxing factors) (Vanhoutte, 2009). EDRF byly popsány Furchghottem a Zawadzkim (Furchgott a Zawadzki, 1980). Jejich uvolňování prostřednictvím mediátorů je popsáno v obrázku 1. Aktivují guanylát-cyklázu v hladké svalovině cév. Tímto EDRF je například oxid dusnatý (Vanhoutte, 2009). Oxid dusnatý (NO) patří tedy spolu s prostaglandinem I2 (PGI2) mezi hlavní vazodilatátory endotelu. U obou dvou těchto látek se ukázalo, že se účastní i na inhibici agregace krevních destiček (Hartge a další, 2007). Jejich hlavní biologické účinky 10
jsou regulovány lokalizací specifických receptorů na membránách cév nebo na úrovni genové transkripce. Vylučování NO je konstitutivní, prostřednictvím endotelových buněk. Jeho produkce může být však regulována mnoha exogenními chemickými látkami nebo fyzikálními podněty. Na druhou stranu - jako odpověď na změny vnějšího prostředí - je PGI2 syntetizován primárně z arachidonové kyseliny pomocí enzymu prostaglandinsyntázy (viz obrázek 10) (Cines a další, 1998). NO je jednoduchý plyn, který se enzymaticky syntetizuje z L-argininu NO syntázou. Tento enzym se může nacházet ve třech izomorfních formách - inducibilní NO syntáza (iNOS), neuronální NO syntáza (nNOS) a endotelová NO syntáza (eNOS). Endotelové buňky ovšem kromě eNOS obsahují i iNOS, která může produkovat až tisícinásobně vyšší koncentrace NO než endotelová forma. Poločas účinku NO je pouze několik sekund. Po svém vzniku difunduje NO z endotelových buněk do hladké svaloviny pod endotelem a aktivuje zde enzym guanylát-cyklázu navázáním na jeho hemovou složku. Tímto mechanismem vzniká cyklický guanosin-monofosfát (cGMP), který relaxuje hladkou svalovinu. NO se také kromě toho dostává na luminální povrch endotelu, kde inhibuje aktivaci trombocytů (Hulín, 1998). PGI2 se přímo neúčastní ovlivnění adhese trombocytů, ale synergicky s NO inhibuje další kroky v aktivační kaskádě krevních destiček. NO také inhibuje expresi Pselektinu v trombocytech. Navíc zřejmě podporuje disagregaci destiček narušením aktivity fosfoinosin-3-kinázy. Ke všem těmto efektům na cévách NO inhibuje adhezi leukocytů k endotelu a inhibuje migraci buněk hladkého svalstva (Cines a další, 1998). Lidské arteriální řečiště je nepřetržitě dilatované účinkem NO. Inhibice jeho syntézy je příčinou vazokonstrikce a jednou z možných příčin hypertenze. Stimulaci vzniku NO následkem zvýšení aktivity NOS způsobují trombin, adenosin-5-difosfát, bradykinin, substance P a muskarinoví agonisté. Uvedené regulační vlivy se týkají konstitutivních forem enzymu nNOS a eNOS. Obě dvě syntázy produkují radikálovou formu oxidu dusnatého. Mezi stimuly, které také zvyšují produkci NO, patří i smykové napětí (shear stress, hemodynamické namáhání) v endotelu a mediátory uvolňované z trombocytů (ADP-adenosin difosfát, ATP-adenosin trifosfát, serotonin). Při náhlém protažení endotelu (při roztažení cévy zvýšeným objemem krve) se zvýší také produkce NO v endotelových buňkách. Tím se zabezpečí potřebná dilatace cévy při zvýšeném průtoku krve cévou (Hulín, 1998).
11
Obrázek 1: Neurohumorální mediátory, které způsobují uvolnění EDRF důsledkem aktivace specifických endotelových receptorů. Převzato a upraveno z Vanhoutte, 2009. AA - arachidonová kyselina, ACh - acetylcholin, ADP - adenosin difosfát, α, β - adrenergní receptor, AVP arginin vazopresin, B - kininový receptor, E - epinefrin, EDRF - endotelem derivované relaxační faktory, ET endotelin, endotelinový receptor, H - histaminergní receptor, 5-HT - serotonin, serotoninergní receptor, M muskarinový receptor, NE -norepinefrin, P - purinový receptor, VEGF - vaskulární endotelový růstový faktor, VP -vazopresinový receptor.
Endotel, jak již bylo uvedeno, také kromě vazodilatačních působků uvolňuje i ty vazokonstrikční. Mezi ně patří endoteliny, tromboxan A2, nestabilní endoperoxidy PGG2 (prostagalndin G2) a PGH2 (prostaglandin H2) a složky renin-angiotenzinového systému (Hulín, 1998). Pokud endotel funguje normálně, jsou všechny jeho funkce a regulační mechanismy v rovnováze, zatímco u endotelové dysfunkce se procesy nacházejí ve velké dysbalanci (Hartge a další, 2007). 5.1.2 Endotelová dysfunkce Endotelová dysfunkce (ED) je systémový patologický stav, který je široce definován jako nerovnováha mezi vazodilatačními a vazokonstrikčními látkami produkovanými endotelem nebo porucha celkové funkce endotelu. Konkrétně je spojena se sníženou produkcí oxidu dusnatého, snížením antikoagulačního působení endotelu a v důsledku toho zvýšením agregace krevních destiček. Dále se objevuje zvýšená exprese adhezních molekul, zvýšená exprese chemokínů a cytokínů a zvýšení produkce reaktivních kyslíkových sloučenin endotelem (Kolluru a další, 2012). Dysfunkce byla dříve chápána pouze jako poškození vazodilatace v důsledku špatné odpovědi na specifické stimuly, acetylcholin a bradykinin. Širší chápání pojmu zahrnuje i další poruchy endotelových funkcí, které byly zmíněny (protrombotický a prozánětlivý stav) (Endemann, Schiffrin, 2004). U dysfunkce se tedy vyskytuje i interakce mnoha zánětlivých procesů a snížená 12
vazodilatace. Mnoho onemocnění a stavů, zahrnujících hypertenzi, ischemickou chorobu srdeční, městnavé srdeční selhání a chronické renální selhání, je zahájeno nebo spojeno se stavem endotelové dysfunkce. Tento vztah je také patrný u diabetu obou typů a byl prokázán i u metabolického syndromu, dyslipidemie, inzulínové rezistence, obezity, hyperhomocysteinémie, sedavého životního stylu a u lidí, kteří kouří. V souhrnu lze říci, že ED je komplexní stav, zahrnující více mechanismů (Hartge a další, 2007). Poprvé byla dysfunkce popsána a potvrzena klinickými studiemi v roce 1990 u pacienta s hypertenzí u cév v předloktí (Panza a další, 1990). Některé z patologických mechanismů dysfunkce endotelu se zdají být společné, jako nedostatek NO a oxidační stres. Snížená hladina NO byla velmi často zjištěna v souvislosti s poruchou funkce endotelu. Může to být výsledkem snížené aktivity endotelové NO syntázy, a to například kvůli jejím endogenním nebo exogenním inhibitorům, nebo snížením dostupnosti substrátu L-argininu, čímž dochází ke snížení biologické dostupnosti NO (Endemann, Schiffrin, 2004). Enzymy v endotelových buňkách mohou produkovat superoxid, ze kterého vznikají další kyslíkové radikály. ROS - reaktivní formy kyslíku potlačují aktivitu NO a přeměňují jej na peroxynitritový anion, který je cytotoxickým oxidačním činidlem. Enzymy, které mohou produkovat superoxid, jsou NADPH (nikotinadenin-dinukleotid-fosfát)-oxidáza, xantin-oxidáza a cyklooxygenáza. Tuto funkci může však mít i eNOS, pokud není spojena se substrátem (L-argininem), nebo pokud nejsou přítomné nezbytné kofaktory, jako tetrahydrobiopterin (BH4) (Vanhoutte, 2009). Peroxynitrit přispívá k degradaci tohoto kofaktoru eNOS na BH2 (dihydrobiopterin). Pokud je hladina BH2 zvýšena, dojde k „uncouplingu“ eNOS. Omezí se tvorba aktivního dimeru eNOS s její normální aktivitou, a tudíž dojde i ke snížení produkce NO. Při tomto stavu eNOS aktivuje více ROS a dojde k jejich zvýšené produkci. Peroxynitrit je také důležitým mediátorem oxidace LDL (lipoproteiny s nízkou hustotou) částic, ukazuje se tedy jeho pro-aterogenní role (Endemann, Schiffrin, 2004). Přenosy signálů v pozměněné endotelové buňce jsou znázorněny v obrázku 2.
13
Obrázek 2: Postulovaný přenos signálu v dysfunkční endotelové buňce. Převzato a upraveno z Vanhoutte, 1997. Vyskytuje se snížení hodnot proteinů v závislosti na signalizaci Gi2 s následným poklesem produkce EDRF oxidu dusnatého. Kromě toho výsledné zvýšení cAMP aktivuje transkripční faktor NFκB, což indukuje proaterogení aktivitu v endotelových buňkách. ROS - reaktivní formy kyslíku, R - membránový receptor, α,β - adrenoreceptor, 5-HT -serotonin, ETB - receptor pro endotelin, B - bradykininový receptor, G - G protein, LDL -lipoproteiny s nízkou hustotou, P - purinový receptor.
Další kritickou roli v udržování fyziologické funkce endotelu hraje inzulín. Jeho schopností je stimulovat uvolňování NO přes kaskády, které zahrnují aktivaci dráhy PI3K/Akt (fosfatidylinositol-3-kináza/protein-kináza-B) a navazující fosforylaci eNOS. Při inzulínové rezistenci je charakteristické, že se snižuje signální dráha PI3K (fosfatidyinositol-3-kinázy), zvyšuje se aktivita protein kinázy a sekrece endotelinu-1, což vše napomáhá endotelové dysfunkci (Kolluru a další, 2012). Mechanismy vedoucí k endotelové dysfunkci u diabetu a při změněné glykemii shrnuje obrázek 3.
14
Obrázek 3: Signální mechanismy vedoucí k endotelové dysfunkci u hyperglykemických pacientů. Převzato a upraveno z Kolluru a další, 2012. pARP - poly ADP-ribóza polymeráza, AGE - advence glycation end products, konečné produkty glykace , DAG - diacylglycerol, NFκB - nukleární faktor kappa B, PKC - proteinkináza C, iNOS -inducibilní NO syntáza, NADPH - nikontinamid-adenin-dinukleotid-fosfát, RAGE - receptor pro konečné glykované produkty, ONOO peroxynitrit, PI3K - fosfatidylinositol-3-kináza, AKT -protein kináza B, eNOS - endotelová NO syntáza, NO • oxid dusnatý, GTPCH - GTP cyklohydroláza, BH4 - tetrahydrobiopterin, BH2 - dihydrobiopterin, O2 superoxidový anion.
ED se ukázala jako důležitý surogát (pozn. zástupný, náhradní faktor) pro kardiovaskulární příhody. Při zahájení kaskády dějů vedoucích k ateroskleróze a aterotrombóze může mít roli časného indikátora onemocnění. Díky němu tak mohou být efektivně ovlivněny rizikové faktory nebo může být zavedena farmakologická intervence ještě dříve, než dojde k plnému rozvoji aterosklerózy (Styres, Miller, 2014). Neinvazivní testování endotelové funkce předpovědělo kardiovaskulární příhody u pacientů s ischemickou chorobou srdeční, onemocněním periferních tepen, hypertenzních pacientů a u takových, kteří podstoupili operaci cév (Endemann, Schiffrin, 2004).
15
5.2 Metabolický syndrom Metabolickým syndromem (MS), také nazývaným syndrom inzulínové rezistence nebo syndrom X (McCance, Huether, 2010), se označuje souběžný výskyt různých patofyziologických abnormalit, respektive klinických jednotek, které jsou v konečném důsledku spojené se zvýšeným rizikem vzniku a rozvoje aterosklerózy a jejích komplikací (Hulín, 1998). Je definován jako souhrn klíčových kardiovaskulárních rizikových faktorů (Eckel a další, 2005). Konkrétně jde o diabetes mellitus 2. typu (včetně poruchy tolerance glukózy), dyslipoproteinémii, centrální (abdominální) obezitu, esenciální hypertenzi, hyperurikémii a poruchy fibrinolýzy, přičemž v etiopatogenezi syndromu se klíčový význam připisuje inzulinorezistenci v oblasti metabolismu glukózy a hyperinzulinismu (Hulín, 1998). MS je stav mírného chronického zánětu, který je důsledkem složité souhry genetických a environmentálních faktorů (Kaur, 2014). Náčrt etiopatogenetických vztahů v rámci syndromu inzulínové rezistence podává obrázek 4.
Obrázek 4: Souhrn etiopatogenetických mechanismů a příčin MS. Převzato a upraveno z Kaur, 2014. 1 -↑ leptinu, ↑ angiotenzinu II, ↑ aldosteronu; 2 - ↑ faktoru VII, ↑ faktoru V. MK - mastné kyseliny, MS - metabolický syndrom, RAAS - renin angiotenzin aldosteronový systém, SNS sympatický nervový systém, VMK - volné mastné kyseliny.
16
5.2.1 Definice a kritéria pro MS V průběhu let bylo navrženo několik klasifikací pro metabolický syndrom s důrazem na inzulínovou rezistenci nebo viscerální obezitu. Nicméně máme tři hlavní klasifikace: definice The World Health Organization (WHO, Světová zdravotnická organizace), The Europian Group for the Study of Insuline Resistance (EGIR, Evropské uskupení pro studium inzulínové rezistence), The Adult Treatment Panel III (ATP III) report a The Internatiol Diabetes Federation (IDF, Mezinárodní diabetická federace) (Duvnjak, 2009). Dle definice WHO z roku 1999 je syndrom přítomen u osoby s diabetem, poruchou hladiny glykemie na lačno, poruchou glukózové tolerance nebo inzulínové rezistence mající alespoň dvě z následujících kritérií: poměr obvodu pasu a boků > 0,9 cm u mužů a > 0,85 cm u žen, triglyceridy v séru ≥ 150 mg/dl nebo HDL (lipoproteiny s vysokou hustotou, high density lipoprotein)-cholesterol < 35 mg/dl u mužů a < 39 mg/dl u žen, mikroalbuminurie (rychlost urinární exkrece albuminu) > 20 mcg/min a krevní tlak ≥ 140/90 mmHg (WHO definition, 1999). V roce 2001 organizace The National Cholesterol Educational Program-Adult Treatment Panel III (NCEP-ATP III) definovala metabolický syndrom u osob, které mají alespoň tři z následujících abnormalit: obvod pasu > 102 cm mužů a > 88 cm u žen, zvýšené sérové triglyceridy ≥ 150 mg/dl, HDL-cholesterol < 40 mg/dl u mužů a < 50 mg/dl u žen, krevní tlak ≥ 130/85 mmHg a hladina glykemie ≥ 110 mg/dl (National Cholesterol Education Program JAMA, 2001). EGIR v roce 1999 stanovila tato kritéria pro MS: obvod pasu u mužů ≥ 94 cm a ≥ 80 cm u žen, TAG (triacylglyceroly) ≥ 150 mg/dl a/nebo HDL cholesterol < 39 mg/dl u mužů nebo u žen, krevní tlak ≥ 140/90 mmHg nebo léčená hypertenze, porucha glykemie na lačno či porušená glukózová tolerance, hyperinzulinémie. Základním kritériem je právě hyperinzulinémie a ještě alespoň další 2 kritéria (Kaur, 2014). V roce 2005 The International Diabetes Federation (IDF) navrhla novou definici, založenou na klinických kritériích, která jsou určena pro globální aplikaci v klinické praxi. Tato definice reprezentuje modifikaci definicí WHO a ATP III a klade větší důraz na viscerální obezitu jako základní kritérium syndromu. Viscerální obezita, měřená jako obvod pasu, je nezbytným předpokladem pro diagnózu metabolického syndromu, zatímco ostatním proměnným kritériím, použitým u ATP III definice, je dáván menší důraz. IDF definovala viscerální obezitu, založenou na měření obvodu pasu, rovněž pro různé etnické populace; vycházela při tom z jejich epidemiologických dat (Alberti a další, 2005). Dle definice IDF je tedy pro diagnostikování metabolického syndromu nutná přítomnost centrální obezity a dalších dvou nebo více faktorů z následujících: zvýšená hladina TAG (> 150 mg/dl nebo 1,7 mmol/l), snížení HDL-cholesterolu (< 40 mg/dl nebo 1,03 mmol/l u mužů, < 50 mg/dl / 1,29 mmol/l u žen), zvýšený krevní tlak (≤ 135/85 mmHg), zvýšení 17
glukózy v krvi ≥ 100 mg /dl (5,6 mmol/l) nebo předchozí léčba u všech definovaných faktorů (IDF definition, 2005). 5.2.2 Epidemiologie a prevalence MS Metabolický syndrom je hlavním zdravotním problémem v populaci po celém světě (Girvalki a další, 2014). Světová prevalence MS se pohybuje v rozmezí od < 10 % až k 84 %. Hodnota prevalence záleží na regionu, městském nebo venkovském prostředí, složení populace (pohlaví, věk, rasa a etnická příslušnost) a definici, podle které MS hodnotíme. Dle definice IDF se odhaduje, že jedna čtvrtina světové dospělé populace má MS. Spolu s MS byl většinou přítomen i sedavý způsob života, vysoký index tělesné hmotnosti BMI (body mass index) a vyšší socioekonomický status. Dále se prevalence zvyšuje s věkem (10 % u osob ve věku 20-29 let, 20 % ve skupině 40-49 let a 45 % u 60-69letých). Je rozdíl i mezi pohlavími, dle kritérií NCEP-ATP III se u mužů pohybuje prevalence v rozmezí 8-43 % a u žen 7-56 % (Kaur, 2014). MS je přítomný u 38,5 % dospělé populace v US (Ford, 2010), u 21,1 % francouzské populace (Verany a další, 2013) a 27,8 % španělské populace (Corbatón-Anchuelo a další, 2013). Z jednotlivých kritérií syndromu byl nejčastěji přítomen (dle definice ATP III) zvýšený krevní tlak (u 85,4 % testovaných pacientů s MS), následován zvýšenými triacylglyceroly v plasmě (75,0 %) a zvýšenou hladinou glykemie na lačno (70,4 %) (Saely a další, 2006). Zdá se samozřejmé, že stav charakterizovaný mnoha rizikovými faktory ponese větší riziko klinických důsledků než pouze jeden rizikový faktor. Jedinci s metabolickým syndromem mají, jak již bylo předesláno, zvýšené riziko výskytu kardiovaskulárních onemocnění. Dle Framinghamské studie samotný výskyt MS předpověděl ≈25 % vzniku nových kardiovaskulárních onemocnění. V nepřítomnosti diabetes a při diagnostikovaném MS u hodnocených pacientů nepřevýšilo riziko vzniku ischemické choroby srdeční do příštích deseti let života hodnotu 20 %. Riziko kardiovaskulárních příhod do následujících deseti let života je u mužů s MS obvykle v rozmezí od 10 do 20 %, u většiny že se hodnota pohybuje do 10 % (Grundy a další, 2004).
5.3 C-reaktivní protein C-reaktivní protein (CRP) je fylogeneticky vysoce konzervativní plasmatický protein, který se podílí na systémové zánětlivé reakci (Black a další, 2014). CRP patří do rodiny pentraxinů spolu s dalšími proteiny; jedním z nich je například také sérový amyloid P. CRP je kalcium-dependentní vazebný plasmatický protein. Molekula lidského CRP se skládá z pěti identických neglykosylovaných polypeptidových podjednotek, z nichž každá obsahuje 206 aminokyselin. Výslednou strukturu tvoří cyklický symetrický pentamer (Pepys, Hirschfield, 2003). Byl pojmenován podle schopnosti precipitovat somatické C-polysacharidy Streptococcus pneumoniae a byl mezi prvními popsán jako protein akutní fáze. Ta zahrnuje 18
nespecifickou fyziologickou a biochemickou odpověď endotermních zvířat na většinu forem poškození tkáně, zánět, infekci a maligní neoplazii. Je zvýšena syntéza řady proteinů, zejména v hepatocytech. Tato syntéza je regulována cytokíny pocházejícími z místa patologie. CRP je tedy citlivým systémovým markerem zánětu a poškození tkáně (Pepys, Hirschfield, 2003). Normální koncentrace CRP v plasmě činí pouze několik μg/ml. Hladina tohoto proteinu ovšem rychle a výrazně narůstá v průběhu zánětu. Syntéza CRP v hepatocytech se v průběhu 24-48 hodin od začátku zánětu zvyšuje až tisíckrát a zhruba stejně rychle se vrací k velmi nízkým normálním koncentracím (Krejsek, Kopecký, 2004). Plasmatický poločas CRP se pohybuje okolo 19 hodin a je konstantní za všech podmínek. Jediným faktorem cirkulující koncentrace CRP v plasmě je tedy rychlost jeho syntézy, která tak odráží intenzitu patologického procesu (Pepys, Hirschfield, 2003). Indukce CRP v hepatocytech je regulovaná hlavně na transkripční úrovni, a to cytokíny interleukinem-6 (IL) a interleukinem-1 (oba kontrolují expresi mnoha proteinů akutní fáze). CRP se váže na specifické molekulární konfigurace, které jsou typicky přítomné v průběhu buněčné smrti, nebo se nacházejí na povrchu patogenů. Jeho rychlá syntéza po poranění tkáně nebo po započetí infekce naznačuje, že se účastní na obraně hostitele a je součástí vrozené imunitní odpovědi (Black a další, 2014). Lidský CRP se váže s vysokou afinitou na fosfocholinové zbytky patogenů i vlastních buněk, ale také na řadu dalších autologních a vnějších ligandů. Molekulární struktury, nesoucí tyto ligandy, agreguje a precipituje. Mezi autologní ligandy, se kterými CRP reaguje, patří nativní a modifikované plasmatické lipoproteiny, poškozené buněčné membrány, různé fosfolipidy a apoptotické buňky. Mezi vnější ligandy CRP patří glykany, fosfolipidy a další složky mikroorganismů, složky bakterií, plísní, parazitů, ale také rostlinných produktů. Při agregaci struktur nebo navázání makromolekulárního ligandu je lidské CRP rozpoznáno C1q podjednotkou komplementu. Tím dojde k aktivaci klasické cesty komplementu a zničení patogenu (Pepys, Hirschfield, 2003). Pokud se fosfocholinové skupiny objeví na cizích patogenech, je tímto mechanismem zprostředkována obranná funkce organismu, což vede k jejich usmrcení. Na druhé straně funkce CRP vázat fosfocholinové skupiny je škodlivá, pokud se tyto skupiny vyskytují na zraněných vlastních buňkách, protože způsobuje jejich ještě větší poškození a poškození celé tkáně prostřednictvím aktivace komplementu. Tento případ se vyskytuje například u akutního infarktu myokardu, kde CRP celou situaci zhoršuje (Agrawal a další, 2014). V posledních letech prokázalo velké množství studií souvislost mezi mírně zvýšenou hladinou CRP v plasmě (hodnoty mezi 3 a 10 μg/ml) a rizikem vzniku kardiovaskulárních onemocnění, metabolického syndromu a rakoviny tlustého střeva. Menší zvýšení hladiny CRP je také spojováno s množstvím zdravotních problémů, které se zdají být spojené se zánětem, jakož i s genetickými polymorfismy CRP a dalšími geny, etnickým původem, různými typy diety a obezitou (Black a další, 2014).
19
5.3.1 CRP a endotelová dysfunkce C-reaktivní protein má četné účinky na endotelové buňky; tyto účinky mohou podporovat zánětlivý a trombotický stav (Jialal a další, 2006). CRP zvyšuje expresi buněčných adhezních molekul, chemotaktického proteinu 1, a naopak snižuje uvolňování prostacyklinu. CRP také podporuje expresi tkáňového faktoru v monocytech a indukuje uvolňování chemokínů v endotelových buňkách. Kromě toho způsobuje i snížení syntézy NO snížením aktivity eNOS. V poslední době bylo také prokázáno, že zvyšuje hladinu endotelinu-1, produkovaného cévním endotelem (Singh a další, 2007; Venugopal a další, 2002). Vliv CRP na endotelovou buňku je shrnut v obrázku 5. Dále bylo zjištěno, že se CRP váže na fosfocholin oxidovaného LDL a zvyšuje vychytávání LDL částic makrofágy (Black a další, 2004).
Obrázek 5: Vliv CRP na cévní endotel. Převzato a upraveno z Jialal a další, 2006. CAMS - buněčné adhezní molekuly, eNOS - endotelová syntáza oxidu dusnatého, FCγ -fragment protilátky s C-terminálními částmi řetězce imunoglobulinu, IL - interleukin, NFκB -nukleární faktor κB, TNF - tumor nekrotizující faktor, tPA - tkáňový aktivátor plazminogenu.
Jak již bylo předesláno, CRP ovlivňuje hladinu a syntézu NO v endotelu. Děje se tak v důsledku stimulace NADPH oxidázy, která následně způsobí pokles tetrahydrobiopterinu a zvýšení reaktivních kyslíkových sloučenin. To vše vede k uncouplingu eNOS a následně snížené syntéze NO (vše již bylo podrobněji popsáno v kapitole 5.1.2). CRP dále také 20
inhibuje guanosin trifosfát (GTP) cyklohydrolázu (Jialal a další, 2008). GTP cyklohydroláza je enzym limitující rychlost syntézy BH4, je tedy zásadní pro jeho syntézu. Při jeho inhibici tedy dochází ke snížení BH4, a tak i k dalšímu snížení aktivity eNOS (Bendall a další, 2005). 5.3.2 CRP, kardiovaskulární onemocnění a metabolický syndrom Mírný chronický zánět je spojen s kardiovaskulárním onemocněním, diabetem, inzulínovou rezistencí, znaky metabolického syndromu a samotným MS. IL-6 jako prozánětlivý cytokín je produkován tukovými buňkami, endotelovými buňkami, makrofágy a lymfocyty. CRP je poté do značné míry syntetizován v odpovědi na IL-6 (Laaksonen a další, 2004). Interleukin-6 může interferovat s inzulínovou signalizací prostřednictvím indukce proteinů, které se váží na inzulínový receptor. Tímto mechanismem může dojít ke zvýšení inzulínové rezistence a dalších projevů metabolického syndromu. IL-6 také inhibuje aktivitu lipoproteinové lipázy a přispívá k dyslipidémii a inzulínové rezistenci. Prozánětlivé cytokíny a případně samotný CRP mohou také přímo podporovat aterosklerózu a trombózu indukcí jaderného faktoru κB (Laaskonen a další, 2004). Cirkulující hodnoty CRP úzce korelují s dalšími markery zánětu, z nichž některé vykazují podobný, i když obecně menší prediktivní význam u kardiovaskulárních onemocnění. Pozornost, která je zaměřena na CRP, je také částečně důsledkem skutečnosti, že se jedná o mimořádně stabilní analyt v séru nebo v plasmě a že imunologické testy jsou pro něj dobře standardizované, snadno reprodukovatelné a dostupné (Pepys, Hirschfield, 2003). Průřezové analýzy opakovaně zjistily, že zvýšená hladina CRP je pozitivně spojena se zvýšením krevního tlaku, hladiny LDL částic a celkového cholesterolu, hladiny glykemie na lačno a s hladinou triglyceridů. Naopak je negativně propojena s hladinou HDLcholesterolu (Young, Woodside, 2013). Několik studií prokázalo signifikantní spojení mezi vysoce citlivým C-reaktivním proteinem (hsCRP, high sensitivity C-reactive protein) a složkami MS. hsCRP byl navržen pro použití jakožto marker u primární prevence kardiovaskulárních onemocnění (Sigdel, 2014). Existuje stále otázka, zda zvýšená exprese CRP přispívá k patogenezi onemocnění, nebo je to jen výsledek sekundární odpovědi na zánětlivé onemocnění. Je tedy otázkou, zda je CRP pouze markerem, nebo je aktivním mediátorem těchto zánětlivých metabolických nebo kardiovaskulárních poruch (Pravenec a další, 2013).
21
5.4 Endotelová NO syntáza Endotelová NO syntáza je enzym, který se podílí na vzniku NO v endotelu (viz kapitola 5.1). nNOS a eNOS izoformy jsou aktivovány kalciem a kalmodulinem. Jejich enzymatická aktivita závisí na intracelulární hladině Ca2+. Všechny formy NOS nesou na N-konci oxygenázovou doménu a na C-konci reduktázovou doménu. C-konec také obsahuje domény vážící kofaktory FAD (flavin-adenin-dinukleotid), FMN (flavin-mono-nukleotid) a NADPH. N-konec obsahuje oblasti vážící hemové jednotky, tetrahydrobiopterin a kalmodulin. Aby byla eNOS enzymaticky funkční, musí vázat své kofaktory a dimerizovat. Dimerizace a vazba kofaktorů je znázorněna na obrázku 6 a vlastnosti jednotlivých izoforem enzymu jsou shrnuty v tabulce 1. Tabulka 1: Vlastnosti izoforem NO syntázy. Převzato a upraveno z Huang, 2003.
Obecný název Typické buňky Další místa exprese
Typ exprese Míra produkce Funkce
Typ I NOS nNOS Neurony Hladké svalstvo Kosterní svalstvo Plicní epitel Macula densa Konstitutivní (ale i inducibilní) Střední (nM až μM) Signalizace
Typ II NOS iNOS Makrofágy Endotel Hladké svalstvo Játra Chondrocyty Inducibilní Vysoká (μM) Toxin
Typ III NOS eNOS Endotelové buňky Endotel Hladké svalstvo Krevní destičky Hipokampální neurony Konstitutivní (ale i inducibilní) Nízká (pM až nM) Signalizace
NOS - syntáza oxidu dusnatého, nNOS - neuronální NO syntáza, iNOS - inducibilní NO syntáza, eNOS endotelová NO syntáza, NO - oxid dusnatý
22
Obrázek 6: Základní stuktura eNOS a schéma katalýzy eNOS. Převzato a upraveno z Förstermann, Münzel, 2006. A-
B-
C-
Všechny NOS enzymy jsou syntetizovány jako monomery. Každá podjednotka je složena z reduktázové a oxygenázové domény. Monomer, ale i izolovaná reduktázová doména jsou schopné přenést elektrony z NADPH na FAD (flavinadenin) a FMN (flavin-mono-nukleotid). Monomery a izolované reduktázové domény mohou vázat kalmodulin (CaM), který stimuluje elektronový transfer uvnitř reduktázové domény. Přítomnost hemových skupin umožní dimerizaci NOS. Hem je také důležitý pro interakci mezi reduktázovými a oxygenázovými doménami a pro interdoménový elektronový transport z flavinů do hemu opačného monomeru. Pokud je přítomen dostatek substrátu L-argininu a kofaktoru BH4, dojde k syntéze NO. Jako vedlejší produkt vzniká L-citrulin, meziproduktem reakce je Nω-hydroxy-L-arginin.
23
5.5 Superoxid-dismutáza Aerobní organismy obsahují antioxidační obranné systémy, které interagují s ROS. ROS jsou produkovány v důsledku aerobního dýchání a oxidace substrátu (Fukai a další 2002). Jejich hlavní formy a cesty detoxikace jsou na obrázku 7. Nízké hladiny ROS jsou nezbytné v mnoha biochemických procesech včetně nitrobuněčné signalizace, obrany proti mikroorganismům a buněčné funkce. Naproti tomu vysoké hladiny a/nebo nedostatečné odstraňování ROS, zvláště superoxidového aniontu, má za následek oxidační stres. Tento jev se podílí na patogenezi mnoha onemocnění včetně hypercholesterolémie, aterosklerózy, hypertenze, diabetu a srdečního selhání (Fukai a další 2002). Také se podílí na patologii endotelové dysfunkce, jak již bylo zmíněno v kapitole 1.2.
Obrázek 7: Hlavní reaktivní formy kyslíku, jejich potenciální původ a detoxikační cesty. Převzato a upraveno z Burton a Jauniaux, 2011. NADPH - nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfát.
Superoxid-dismutáza (SOD) je endogenní enzym, který odstraňuje superoxidový radikál katalytickou reakcí. Touto reakcí vzniká molekula kyslíku a peroxid vodíku (ten je následně rozkládán katalázou na vodu a kyslík). Patří mezi antioxidační enzymy (Batinić-Haberle, 2010). •O2− + •O2− + 2H+ → H2O2 + O2 V lidských tkáních se vyskytují tři formy SOD, každá z nich má specifickou distribuci v tkáních. 1) Cu-Zn (měď-zinek) SOD, také označovaná jako SOD-1, se nachází v cytoplasmě a organelách prakticky všech savčích buněk. Má molekulovou hmotnost přibližně
24
32 kDa a obsahuje dvě proteinové podjednotky. Každá podjednotka obsahuje katalyticky aktivní atom mědi a zinku. 2) Mn (mangan) SOD, SOD-2, je umístěna v mitochondriích téměř všech buněk a její molekulová hmotnost je okolo 40 kDa. Sestává ze 4 proteinových podjednotek, každá z nich pravděpodobně obsahuje atom manganu. Sekvence aminokyselin Mn SOD je zcela odlišná od Cu-Zn SOD. Tato forma není inhibována kyanidem, což umožňuje odlišit aktivitu Mn SOD od Cu-Zn SOD ve směsi obou těchto enzymů (Young, Woodside, 2001). 3) Třetí formou je extracelulární superoxid-dismutáza (ecSOD), také SOD-3. Je to tetrametrický protein, který se primárně nachází v extracelulární matrix a v menším rozsahu také v extracelulární tekutině. Obsahuje aktivní doménu, která váže měď a zinek. U C-terminálního konce je obsažena oblast vázající heparansulfát. Je syntetizována pouze v některých typech buněk (Young, Woodside, 2001; Petersen, 2004). Převládající místo produkce je v hladkosvalových buňkách zdravých cév. Navzdory tomu, že ec SOD převážně vzniká spíše působením hladkého svalstva než endotelových buněk cév, váže se na heparan-sulfát, který je na povrchu endotelových buněk. Takto může být enzym internalizován endotelem. Tento mechanismus způsobuje, že antioxidační enzym, produkovaný hladkým svalstvem cév, končí uvnitř sousedních endotelových buněk. Aktivita ecSOD je zhruba 10x vyšší ve stěně cév než v jiných tkáních. Vzhledem ke svému umístění může ecSOD fungovat jako jeden z hlavních regulátorů endotelem produkovaného NO. V ostatních tkáních jsou zastoupeny především druhé dva typy SOD (Fukai a další 2002). EDRF (NO nebo úzce související sloučeniny) jsou neutralizovány plasmatickým superoxidem (Young, Woodside, 2001). Důležité je, že oxid dusnatý reaguje se superoxidovým aniontem extrémně rychle. Proto je rovnováha mezi vnější hladinou superoxidového aniontu a buněčnou kapacitou antioxidantů, zejména SOD, důležitá v regulaci bioaktivity NO. Několik patofyziologických faktorů je spojeno se zvýšením vaskulární produkce kyslíkových radikálů. Tato zvýšená produkce O2• ovlivňuje biologickou aktivitu NO. Vzhledem k tomu, že O2•- i NO• jsou oba radikály a obsahují nepárové elektrony, vstupují spolu do reakce. Výsledkem je vznik dusitanů a dusičnanů a peroxynitritového aniontu. Tato reakce probíhá rychlostí 6,7x10 9 Ms-1 (viz obrázek 8) a je zhruba 3x rychlejší než reakce O2•- se superoxid-dismutázou a 10 000x rychlejší než reakce s jinými antioxidanty, například vitaminem A, E nebo C (Fukai, 2002).
25
Obrázek 8: Rovnováha mezi O2•- a NO• a role SOD. Převzato a upraveno z Fukai a další, 2002. •-
•
-
O2 - superoxidový anion, H2O2 - peroxid vodíku, SOD - superoxid-dismutáza, NO - oxid dusnatý, ONOO + peroxynitritový anion, H - proton.
Za těchto reakčních podmínek je vysoce pravděpodobné, že některý superoxidový anion bude vždy reagovat s radikálem NO. Ovšem za fyziologických podmínek tuto interakci minimalizují endogenní antioxidační mechanismy a udržují tak rovnováhu mezi O 2•- a NO•. Tato křehká rovnováha je porušena při patologických stavech (Cai, Harrison, 2000). Na ecSOD bylo odhaleno několik potenciálních regulačních transkripčních míst. ecSOD může být také regulována mnoha dalšími stimuly, mezi ně patří i cytokíny. Například tumor nekrotizující faktor je jeden ze supresivních faktorů, které potlačují expresi ecSOD v cévních buňkách. Četné faktory (ateroskleróza, kouření, diabetes a další) také vedou ke snížení produkce a/nebo biologické aktivity NO. Za těchto podmínek může snížení NO vést také k poklesu exprese ecSOD. Je tedy zjevné, že exprese ecSOD je regulována více podněty a tyto podněty mohou výrazně změnit antioxidační stav ve stěnách cév (Fukai a další, 2002; Adachi a další, 2004). Při nedostatečné expresi ecSOD a nedostatku dalších antioxidantů tedy v organismu převažuje oxidační stres. Za těchto podmínek vzniká z NO převážně peroxynitrit, který je cytotoxický. Důsledky jeho působení na endotelovou dysfunkci a další již byly shrnuty v kapitole 1.2. Jeho důsledky a důsledky celého oxidačního stresu jsou také v obrázku 9.
26
Obrázek 9: Mechanismus vzniku oxidačního stresu, jeho důsledků na endotel a kardiovaskulární onemocnění. Převzato a upraveno z Cai, Harrison, 2000. •
NADH - nikotin-adenin-dinukleotid, NADPH - nikotin-adenin-dinukleotid-fosfát, NO - oxid dusnatý, ROS reaktivní kyslíkové formy, H2O2 - peroxid vodíku, OONO - peroxynitrit, eNOS -endotelová NO syntáza, SOD •• superoxid-dismutáza, O2 - superoxidový anion, BH4 -tetrahydrobiopterin, OH - hydroxylový radikál.
5.6 Cyklooxygenáza 2 Cyklooxygenáza (COX) je integrální membránový glykoprotein; je také známá jako prostaglandin H syntáza. Katalyzuje první krok syntézy prostaglandinů (Minghetti, 2004). Je klíčovým enzymem v přeměně arachidonové kyseliny na prostaglandiny (Dubois a další, 1998). Enzymatická přeměna arachidonové kyseliny je uvedena na obrázku 10. V lidských buňkách se vyskytují alespoň dvě odlišné formy tohoto izoenzymu, označené jako cyklooxygenáza 1 (COX-1) a cyklooxygenáza 2 (COX-2), a také nedávno identifikovaná třetí izoforma COX-3, která se pravděpodobně nachází v centrálním nervovém systému. Základní katalytická aktivita těchto izoenzymů je vesměs podobná. COX-1 a COX-2 jsou produkovány dvěma odlišnými geny, které jsou lokalizovány na chromozomu 9 a 1. Sekvence aminokyselin obou forem jsou okolo 60 % identické. Hlavní rozdíl je, že protein COX-1 obsahuje sekvenci 17 aminokyselin blízko aminového konce, který není přítomen u COX-2. A naopak druhá izoforma obsahuje sekvenci 18 AMK blízko karboxylového konce, jež je nepřítomná u COX-1 (Clária, 2003). COX-1 je široce distribuována v podstatě ve všech typech buněk a předpokládá se, že zprostředkovává fyziologické reakce. Je exprimována v gastrointestinálním traktu, v hladké svalovině cév, v ledvinách a v krevních destičkách. Mezi její funkce patří produkce prostaglandinů, které mají cytoprotektivní účinek na žaludeční sliznici. Dále je 27
mezi funkce zahrnuta integrita krevních destiček při hemostáze a udržování renální perfuze. Naopak COX-2 je inducibilní izoformou enzymu. Za normálních podmínek jsou ve většině tkání hladiny nedekovatelné. Exprese iducibilní formy může být vyvolána různými podněty spojenými se zánětlivou reakcí, cytokíny a růstovými faktory. COX-2 izoforma je tedy zodpovědná za syntézu prostaglandinů zapojených do zánětlivé reakce (Minghetti, 2004; Clária, 2003). Promotor genu pro COX-2 obsahuje vazebná místa pro několik transkripčních faktorů, které tak mohou ovlivnit expresi. Mezi ně patří také nukleární faktor κB a nukleární faktor pro IL-6. Exprese COX-2 je regulována širokým spektrem mediátorů, zapojených do zánětlivé reakce. Indukci COX-2 mohou vyvolat lipopolysacharidy, prozánětlivé cytokíny (TNF-tumor nekrotizující faktor) a naopak protizánětlivý cytokín IL-10 inhibuje expresi tohoto enzymu. COX-2 lze také inhibovat pomocí farmak, a to nesteroidních antiflogistik (Hinz, Brune, 2002).
28
Obrázek 10: Enzymatická cesta prostaglandinu (PG) přeměnou z arachidonové kyseliny. Převzato a upraveno z Clária, 2003. Arachidonová kyselina se působením cyklooxygenázy (COX-1,2,3) oxiduje na prostaglandin G2 (PGG2), který se dále redukuje na prostaglandin H2 (PGH2). PGH2 je nestabilní endoperoxid, který je rychle konvertován specifickými syntázami na prostaglandiny řady E2, F2, D2 a také prostacyklin (PGI2) a tromboxan A2 (TXA2), díky tromboxan-syntáze. Jak TXA2, tak PGI2 mají velmi krátký poločas a jsou rychle hydrolyzovány na inaktivní složky 6-keto-prostaglandin F1α (6-Keto-PGF1α) a tromboxan B2 (TXB2).
Jeden z prostaglandinů, produkovaný enzymatickou přeměnou, je i prostaglandin I2 (PGI2). Jeho role je především protektivní bez ohledu na to, zda je produkován izoformou 1 nebo 2. PGI2 relaxuje většinu cév v důsledku aktivace adenylátcyklázy a zvýšení hladiny cAMP (cyklický adenosin monofosfát). Indukcí COX-2 může být syntetizován PGI2, a to jako akutní odpověď na nějakou změnu nebo poranění, a tak podporovat cévní ochranu. 29
Avšak ve změněném prostředí u chronických zánětlivých lézí je COX-2 exprimována ve vysokých koncentracích. Ty mohou vést k velmi zvýšené syntéze PGE2 (prostaglandinu E2) a alternativních prostanoidů (viz obrázek 11) (Bishop-Bailey a další, 2006).
Obrázek 11:Potenciální role izoenzymů COX při vaskulárním onemocnění. Převzato a upraveno z Bishop-Bailey a další, 2002. Vrchní panel - ve zdravých cévách je zpravidla endotelem exprimována COX-1 izoforma, za produkce protektivního prostaglandinu I2 (PGI2). PGI syntáza (PGIS) je exprimována v cévním endotelu i v hladké svalovině cév. Střední panel - akutní reakce na stres nebo poranění, COX-1 i COX-2 jsou indukovány v endotelu i v sousedním hladkém svalstvu. Produkují protektivní PGI2 přes konstituvně exprimovanou PGIS. Spodní panel - chronické zánětlivé léze v cévách. COX-2 spolu s prostglandin-E syntázou jsou indukovány v makrofázích. V hladkém cévním svalstvu vzniká velké množství PGE2, který má nyní poškozující funkci. To indukuje tkáň destruktivní metaloproteinázy (MMPs) a následně buněčnou smrt.
Také produkce endotelem derivovaných kontrakčních faktorů (EDCF) je závislá na COX-2. Mezi EDCF patří i některé prostanoidy, které vznikají enzymatickou přeměnou arachidonové kyseliny. Jejich tvorba může vést k endotelové dysfunkci. Cyklooxygenáza aktivně přispívá i ke snížení biodostupnosti oxidu dusnatého a spolu s dalšími enzymy (NADPH oxidáza, xantin-oxidáza), jak již bylo poznamenáno dříve, indukuje produkci ROS (Virdis a další, 2013).
30
COX-2 nacházíme vysoce exprimovanou v aterosklerotických lézích. Její hladina je zvýšena v aktivovaných monocytech/makrofázích, které hrají klíčovou roli v patogenezi aterosklerózy. Její exprese je také zvýšena při porušení endotelové bariéry mezi cirkulující krví a tkání, a dále při nekontrolované proliferaci buněk hladkého svalstva cév, které mohou být podkladem tvorby aterosklerotických plaků. Zvláště v nestabilních aterosklerotických plátech nacházíme prostaglandin-E syntázu produkující PGE2. Dále její vysokou koncentraci můžeme detekovat při poškození cév a také u aortálních výdutí (Bishop-Bailey a další, 2002; Massy, Swan, 2001).
5.7 Nukleární faktor κB Nukleární faktor κB (NFκB) je hlavní transkripční faktor, který hraje roli v mnoha aspektech lidského zdraví; zahrnuje rozvoj vrozené a získané imunity. Dysregulace faktoru je spojena s mnoha onemocněními, jako jsou například AIDS, ateroskleróza, astma, artritida, rakovina, diabetes, svalová dystrofie, zánětlivé onemocnění střev a virové infekce (Kumar a další, 2004). Nukleární faktor κB je společný pro mnoho typů buněk, včetně endotelových. Složení NFκB, vázané v různých nukleárních frakcích, může být z různých kombinací homo- nebo heterodimerů p50 a p65 proteinových podjednotek. Složení závisí na typu buňky, živočišném druhu a podmínkách. Obecně se předpokládá, že p50 podjednotka je nezbytná pro jadernou translokaci, zatímco p65 podjednotka přispívá k transkripci (Piper, Riaz-ul-Haq, 1997). Ve většině typů buněk jsou neaktivní NFκB komplexy odděleny v cytoplasmě prostřednictvím nekovalentní interakce s inhibitory proteinů. Tyto inhibitory se označují IκB. V odpovědi na různé stimuly, zahrnující cytokíny, virové a bakteriální patogeny a stresové faktory, latentní cytoplasmatický komplex NFκB/IκBα nebo IκBβ je aktivován fosforylací serinových zbytků na N-koncové části IκB. Tato reakce vede k degradaci inhibitorové podjednotky IκB (Piper, Riaz-ul-Haq, 1997). Nedávné výsledky ukazují, že tato fosforylace může být uskutečněna působením specifické IκB kinázy, závislé na ubiquitinu (Blackwell, Christman, 1997). Výsledkem je aktivace NFκB, který je translokován do jádra. V jádru se váže na DNA vazebná místa v promotoru nebo na enhancery specifických genů. Nukleární faktor se může vázat na místa v DNA, která obsahují sekvenci 5´-GGGRNWYYCC3´, kde R představuje purin, N nukleotid, W adenin nebo thymidin a Y pyrimidin (Kumar a další, 2004). Aktivace NFκB hraje významnou roli v přechodné expresi několika genů, které reagují na fyziologické a patologické stimuly (Piper, Riaz-ul-Haq, 1997). Schématické znázornění aktivace NFκB s jejími důsledky je uvedeno na obrázku 12.
31
Obrázek 12: Schéma aktivace transkripce nukleárního faktoru κB. Převzato a upraveno z Valen a další, 2001. COX-2 - cyklooxygenáza 2, ICAM-2 - intracelulární adhezní molekula 2,IL - interleukin, iNOS -inducibilní NO syntáza, LPS - lipopolysacharidy, MHC - hlavní histokompatibilní komplex, TNF - tumor nekrotizující faktor, VCAM-1 - vaskulární adhezní buněčná molekula-1.
NFκB může být aktivován reaktivními kyslíkovými produkty, hypoxií, hyperoxií, cytokíny, aktivátory proteinkinázy C, bakteriálními nebo virovými produkty, jako jsou například lipopolysacharidy, nebo UV zářením (Valen a další, 2001). Jedním z nejúčinnějších podnětů pro aktivaci NFκB je oxidační stres. Ten vyvolává například hyperglykemie u pacientů s diabetem, ale i další onemocnění, mimo jiné kardiovaskulární. Oxidační stres vede následně k vaskulární dysfunkci (Piper, Riaz-ul-Haq, 1997). Existuje pozitivní zpětná vazba, která může působit přes extracelulární mechanismy. Slouží tak k zesílení zánětlivého signálu. Aktivace NFκB zvyšuje transkripci TNF-α a IL-1β. Oba tyto cytokíny ovšem také aktivují NFκB (Blackwell, Christman, 1997). Aktivace nukleárního faktoru je přísně regulována negativní zpětnovazebnou smyčkou. Řídí trvání aktivace NFκB a nukleární lokalizace v reakci na určitý podnět. Dynamika NFκB je důležitá kvůli ovlivnění velikosti a specifičnosti exprese cílového genu (Van Der Heiden a další, 2010). Toto zpětnovazebné řízení je složité. Je jak intracelulární, tak extracelulární. Intracelulární mechanismy omezují aktivaci NFκB, vyvolanou daným stimulem. Extracelulární mechanismy stimulují potlačení aktivace. Některé cytokíny mohou, na rozdíl od ostatních, naopak potlačovat produkci jiných prozánětlivých cytokínů, tudíž i aktivaci NFκB. Takto se chová například i IL-10. Funkce NFκB je regulována také NO a příbuznými molekulami. NO primárně inhibuje aktivaci NFκB. Na druhou stranu NO může aktivovat NFκB v lymfocytech a neuronálních buňkách. NO tedy může regulovat nukleární faktor jak negativně, tak pozitivně, v závislosti na typu buněk, typu podnětu a koncentraci NO (Marshall, Stamler, 1999).
32
NFκB reguluje mnoho buněčných procesů včetně buněčného zrání, přežívání a proliferace, a systémových procesů, jako je zánět (Kumar a další, 2013). NFκB také aktivuje celou řadu cytokínů. Obecně platí, že cytokíny nejsou uloženy intracelulárně a jejich sekrece je závislá na nové syntéze proteinu. Transkripční faktory, včetně NFκB, tak mohou hrát klíčovou roli v zánětu regulovaném cytokíny (Blackwell, Christman, 1997). Aktivace nukleárního faktoru je obvykle přechodná kvůli negativní zpětnovazebné regulaci. Krátkodobá aktivace bývá prospěšná, zatímco dlouhotrvající aktivace mohou být pro organismus škodlivé. Podporují totiž chronický zánět. Několik studií prokázalo signalizační roli NFκB v patologických stavech srdce. U modelu se zvýšenou aktivitou NFκB v srdci myší se vyvinul oxidační stres a srdeční hypertrofie. Podobně u spontánně hypertenzních potkanů srdeční exprese IL-6 a IL-1β zvýšily expresi a aktivitu podjednotky p65 NFκB (Kumar a další, 2013). Přesná úloha NFκB v kardiovaskulárním systému zůstává zdrojem diskuze. Byla u něj popsána jak role adaptivní, tak ale i maladaptivní. Při chronické aktivaci tohoto faktoru může být indukována exprese zánětlivých cytokínů. Jejich působení může vyústit ve škodlivé následky, mezi které můžeme zařadit i smrt srdeční buňky. NFκB má tedy jak cytoprotektivní, tak i cytotoxickou úlohu (Gordon a další, 2011).
5.8. Forkhead box P3 Forkead box P3 - FOXP3 je transkripční faktor. Byl identifikován jako klíčový faktor v regulaci Treg (regulačních T buněk) a hraje rozhodující úlohu při jejich supresivní aktivitě. Vrozená i adaptivní imunita přispívá k aterogenezi. Chronický zánět vyskytující se u aterosklerózy vede také mimo jiné k tvorbě imunitních buněk, pozměněných makrofágů a T lymfocytů. LDL také podporují zánět a spouští tak aktivaci T buněk a produkci dalších protilátek. Dále T buňky rozpoznávající antigen detekují LDL v intimě a vyvolávají další zánětlivé stimuly, tím prohlubují a zhoršují rozvoj tohoto onemocnění. Treg potlačují navozenou imunitní odpověď a zmírňují tak aterosklerotický proces. Několik studií ukazuje, že regulace T buněk pomocí FOXP3 má pozitivní vliv na inhibici aterosklerózy, ovšem základní mechanismus tohoto procesu se zdá být ještě ne zcela vysvětlen (Klingenerg a další, 2013; Joly a další, 2013).
33
6. Experimentální část Pomocí metody Western blot jsme zkoumali vliv CRP na endotel v aortě u potkanů. Vzorky tkání byly zhomogenizovány v pufru společně s inhibitory fosfatáz a proteáz. Následně byl připraven elektroforetický gel, na který byly aplikovány naředěné vzorky. Pomocí metody SDS-PAGE (SDS-polyakrylamidová gelová elektroforéza) došlo k rozdělení proteinů - dle jejich molekulové hmotnosti. Proteiny z gelu byly transferovány na PVDF (polyvinylidenfluoridovou) membránu. Imunodetekce byla provedena pomocí inkubace s primárními a sekundárními protilátkami a následně proběhla vizualizace na RTG (rentgenový) film principem chemiluminiscence.
6.1 Materiál 6.1.1 Zvířata Byli použiti samci inbredního kmene SHR (spontánně hypertenzních) potkanů ve stáří 8 měsíců. Dále byli použiti samci transgenních potkanů SHR exprimujících lidský CRP ve věku 8 měsíců. Transgenní kmen byl získán mikroinjekcemi obsahujícími cDNA pro lidský CRP pod kontrolou apolipoproteinu E, který měl za úkol řídit expresi CRP v játrech. Mikroinjekce byly aplikovány do zygot potkanů. Zvířata byla rozdělena do dvou skupin: Kontrolní skupina SHR potkanů, počet zvířat = 5, SHR1-SHR5 Skupina transgenních potkanů SHR exprimujících lidský CRP, počet zvířat = 5, SHR+CRP1 – SHR+CRP5 Zvířata byla chována v klimatizovaném prostoru, v režimu 12 hodin světlo a 12 hodin tma, s volným přístupem ke standardní potravě a tekutinám. Všechny experimenty a veškerá manipulace se zvířaty byly prováděny v souladu s ochranou zvířat právního řádu České republiky (zákon č. 246/1992 Sb., vyhláška č. 311/1997 Ministerstva zemědělství o chovu a využití pokusných zvířat) a byly schváleny etickou komisí Fyziologického ústavu Akademie věd České republiky.
6.2 Pracovní postup 6.2.1 Homogenizace tkáně Byly použity aorty potkanů, které byly zhomogenizovány v RIPA pufru (radio immuno precipitation assay buffer; Sigma-Aldrich, USA) spolu s inhibitory fosfatáz (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) a inhibitory proteáz (aprotinin, benzamidin, leupeptidin; SERVA Electrophoresis, Německo).
34
Tkáň byla mechanicky rozstříhána v mikrozkumavkách typu Eppendorf. Poté zpracována také pomocí elektrického homogenizátoru. Vzorky byly umístěny do chlazené centrifugy po dobu 10 minut, následně byl odebrán supernatant (peleta zůstává ve zkumavce). Koncentrace proteinů ve vzorcích byla stanovena pomocí BCA Assay Kit (Thermo Fischer Scientific Inc., USA). 6.2.2 Příprava gelu pro elektroforézu Polyakrylamidový gel Nejdříve se sestaví aparatura pro elektroforézu. Skla se umístí do stojanu tak, aby bylo možno předpokládat, že soustava bude těsnit a gel nebude odtékat ven. Akrylamid/bis roztok se smíchá se separačním pufrem, SDS (dodecylsíran sodný) a destilovanou vodou. Poté se přidá TEMED (tetramethylethylendiamin) a APS (peroxodisíran amonný), které zahájí polymerizaci, a lehkým vířením se vše smíchá, aby se minimalizovalo riziko vniknutí vzduchu do výsledného roztoku. Byly použity separační gely o koncentraci 10% a 12% (složení uvedeno v tabulce 3). Připraveným separačním gelem se naplní prostor mezi skly aparatury. Pipetuje se po straně komory zhruba do výšky 1,5 cm pod hranou kratšího skla. Gel se překryje asi centimetrovou vrstvou isobutanolu (hladina kopíruje okraj skel) tak, aby se zamezilo přístupu vzduchu. V isobutanolové vrstvě by neměly být žádné vzduchové bubliny. Poté se gel nechá asi 40-60 minut polymerizovat. Polymerizaci gelu můžeme kontrolovat díky zbylému separačnímu gelu v kádince. Po ztuhnutí gelu se isobutanol vylije, gel se opláchne destilovanou vodou, (zbytky vody se odstraní buničitou vatou) a překryje se 5% zaostřovacím gelem, který se namíchal v průběhu polymerizace separačního gelu. Složení gelu je stejné pro všechny koncentrace separačního gelu a je popsané v tabulce 3. Zaostřovací gel se opět pipetuje po straně komory až k horní hraně skel. Pracujeme opatrně, aby nevznikly vzduchové bubliny. Mezi skla se vloží hřeben a po stranách se pipetou doplní zaostřovací gel. Ten se doplňuje i v průběhu polymerizace gelu. Gel se nechá stát 30-60 minut.
35
Tabulka 2: Složení gelů pro elektroforézu; pozn. uvedené množství složek je pro přípravu dvou gelů. Druh gelu
Separační gel
Zaostřovací gel
Složky gelu
Milli-Q-voda Separating gel buffer, 4x Acrylamide-Bis solution 10% (W/v) SDS 10% APS TEMED
Koncentrace gelu a odpovídající množství složek |ml| 10% 12% 9,8 8,8 5 5 5 6 0,2 0,2 0,06 0,06 0,03 0,03 5% 6,15 2,5 1,25 0,1 0,03 0,15
Milli-Q-voda Stacking gel buffer, 4x Acrylamide-Bis-Solution 10% (W/v) SDS 10% APS TEMED
5% 6,15 2,5 1,25 0,1 0,03 0,15
6.2.3 Příprava vzorku a jeho aplikace na gel Vzorek se naředí do mikrozkumavek s destilovanou vodou. Potom se přidá Laemmliho pufr v poměru 1:1 (vzorek vs. pufr). Nanáška vzorku na gel je 10 μl (20 μg vzorku). Po napipetování se vzorky promísí na třepačce a krátce stočí na minicentrifuze. V termostatu se vzorky na 5 minut zahřejí na teplotu 95° C. Poté se vzorky před nanáškou nechají vychladnout. Z gelů se opatrně vytáhne hřeben tak, aby se jamky na vzorky nepoškodily. Jamky se poté propláchnou SDS-elektroforetickým pufrem. Skla s gely se vyndají ze stojanů a vloží se do tanku, kratší sklo je umístěno směrem k těsnění. Tank se poté naplní SDS elektroforetickým pufrem, jamky na vzorky jsou pod hladinou. Do první jamky se nanese, jako standard hmotnostní marker (Precision Plus protein Standards, Bio-Rad, USA) v objemu 5 μl. Poté se do jamek pod hladinou mezi skly pipetou nanesou vzorky ve stejném objemu 10 μl. Jamky se plní zleva doprava (SHR1- SHR+CRP5). Podle potřeby se dle počtu umístěných gelů dolije SDS pufr tak, aby dosahoval po rysku. Aparatura se uzavře a připojí se ke zdroji. Zdroj produkuje elektrický proud, který se v průběhu elektroforézy mění. Jeho maximální hodnota je 0,24 A/gel , napětí 200 V; to musí být po celý průběh konstantní. Stěny aparatury se během elektroforézy chladí destičkami z hlubokomrazícího boxu. Když čelo, které je značené bromfenolovou modří, dorazí na konec, odpojí se zdroj od aparatury a SDS pufr se z tanku vylije.
36
6.2.4 Western blot Ekvilibrace Skla se z elektroforetické aparatury vyjmou a opatrně se od sebe oddělí, aby gel nebyl porušen. Po odříznutí zaostřovacího gelu, oříznutí okrajů pro oddělení od skla a oříznutí rohu pro orientaci, se gel přenese do transferového pufru. Příprava PVDF membrány PVDF membrána (Milipore, USA) se vyřízne na velikosti gelů + asi o 3 mm na každém okraji větší. Je nutné pracovat v rukavicích, aby se na membránu nepřenesly nějaké jiné proteiny, např. z rukou. Membrána se aktivuje pomalým ponořením do metanolu na 15 sekund, následně na 2 minuty do destilované vody a poté na 15 minut do transferového pufru (TB). Složení sandwiche Před složením je nutné zvlhčit filtrační papíry v transferovém pufru. Na jednu membránu a gel byly použity vždy 2 filtry. Do kazety transferového zařízení (Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell, Bio-Rad, USA) se na anodu vloží filtrační papíry, na ně se opatrně položí membrány tak, aby nevznikly vzduchové bubliny. Na membránu se položí gel, s nímž by se dále nemělo manipulovat, protože se již po prvním kontaktu mohly na membránu přenést nějaké proteiny. Vše se překryje ještě jednou vrstvou filtračního papíru. Pak se opatrně, aby se nepohnulo s membránou nebo gelem, zkumavkou vytlačí vzduchové bubliny. Kazeta se přiklopí katodou, vrchním víkem, zajistí se a zapojí se do zdroje. Transfer proteinu Přístrojem prochází konstantní napětí a elektrický proud. Pro 4 gely je napětí 25 V a proud 200 mA. Blotování probíhá po dobu 75 minut. Po uplynutí předepsané doby se přístroj rozebere, membrány se promyjí v destilované vodě a následně se vysuší mezi filtračními papíry. Membrány, které ihned nepoužíváme k imunodetekci, jsou uchovávány při teplotě 2-8° C. 6.2.5 Imunodetekce Membrány se nejdříve zaktivují ponořením do metanolu po dobu 1 minuty a potom na 10 minut do TBS (tris buffered saline, tris-pufr hydrochlorid) a umístí se na třepačku. Připraví se roztok ze sušeného netučného mléka (5 g na 100 ml) a TBS-T (TBS s 0,1% Tweenem 20) v objemu podle počtu membrán. Nespecifická vazebná místa se blokují ponořením do roztoku TBS-T-5% mléko. Membrány se blokují v roztoku na kývačce po dobu 1 hodiny.
37
Během blokace se použité primární protilátky v TBS-T-5% mléce naředily. Primární protilátky se při teplotě 4°C inkubují s membránami po dobu 16 hodin. Tabulka 3: Použité protilátky pro imunodetekci a jejich ředění. Primární protilátka
Sekundární protilátka ředění
ředění Rabbit anti-rat eNOS (SantaCruz Biotechnology, Inc., USA)
1/200
Goat atni-rabbit (Abcam, UK)
1/1000
1/100
Goat anti rabbit (Abcam, UK)
1/2000
Rabbit anti-rat COX2 (ProteinTech, UK)
1/500
Goat anti-rabbit (Abcam, UK)
1/1000
Mouse anti-rat SOD3 (Abcam, UK)
1/1000
Goat anti-mouse (Sigma-Aldrich, USA)
1/2000
Mouse anti-rat GAPDH (Sigma-Aldrich, USA)
1/10000
Goat anti-mouse (Sigma-Aldrich, USA)
1/20000
1/200
Goat anti-rabbit (Abcam, UK)
1/1000
1/2000
Goat anti-mouse (Sigma-Aldrich, USA)
1/4000
Rabbit anti-rat p-eNOS (Ser 1177) (SantaCruz Biotechnology, Inc., USA)
Rabbit anti-rat p-NFkB (Ser 276) (SantaCruz Biotechnology, Inc., USA) Mouse anti-rat FOXP3 (Abcam, UK)
Po inkubaci primárních protilátek se membrány promyjí v 0,1% TBS-T po dobu 8x5 na elektrické kývačce. Sekundární protilátky se naředí v daném poměru s roztokem TBS-T-5 % mlékem. Membrány se potom 1 hodinu inkubují na kývačce se sekundární protilátkou při laboratorní teplotě. Inkubované membrány se opět promyjí v 0,1% TBS-T po 8x9 minut a po 5 minut v TBS. Při promývání jsou membrány umístěné na kývačce. 6.2.6 Chemiluminiscenční detekce Proteiny přenesené na membrány detekujeme pomocí chemiluminiscenční detekce na fotografický film. Jako detekční činidla používáme detekční kit, roztoky piko a femto (Thermo Fisher Scientific Inc., USA). V tmavé lékovce se smíchá detekční roztok 1 a 2 v poměru 1:1. Z parafilmu si vytvoříme vaničky na membrány. Do nich napipetujeme smíchaný detekční roztok, do něhož vložíme 38
membrány proteiny dolů (zabrání se tak osvětlení membrán). Po inkubaci odsajeme přebytečné detekční agens a membránu s proteiny směrem nahoru zabalíme do průhledné folie tak, aby nebyly přítomné bubliny vzduchu. Folie s membránou je umístěna v kazetě na film. Je nutno pracovat rychle, aby se minimalizoval čas mezi aktivací luminolu a přiložením filmu. V temné komoře se na membrány v kazetě přiloží fotografický film (Foma, ČR) a nechá se exponovat. Po expozici je film vložen do roztoku vývojky, následně opláchnut ve vodě a vložen do roztoku ustalovače. Film opláchneme vodou a necháme oschnout a následně je možné jej vyhodnotit.
6.3. Vyhodnocení, statistické vyhodnocení Vyvolané filmy se naskenují a semikvantivně vyhodnotí pomocí programu NIS-Elements software, version 4.0 (Laboratory Imaging, ČR) denzitometrickou metodou. Statistické vyhodnocení se provede v systému GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, Inc., CA, USA). Výsledky jsou zobrazeny jako průměr procentuálních hodnot exprese jednotlivých vzorků hodnocené skupiny v porovnání s kontrolní skupinou, se zohledněním směrodatné odchylky (standard deviation, SD). Pro statistické hodnocení jsme použili Mann-Whitney test. Hladina statistické významnosti byla stanovena p ≤ 0,05.
39
7. Výsledky Sledované faktory byly statisticky vyhodnoceny a porovnány v rámci kontrolní a hodnocené skupiny vzorků potkaní aorty. Ve výsledcích z měření jsme nezaznamenali statisticky významné změny v expresi endotelové NO syntázy (100 % vs. 129 %; viz Graf 1), fosforylované formy eNOS (100 % vs. 80,06 %; viz Graf 2), cyklooxygenázy 2 (100 % vs. 96,6 %; viz Graf 4), nukleárního faktoru κB (100 % vs. 72,79 %; viz Graf 5), FOXP3 (100 % vs. 115,8 %; viz Graf 6). Hodnocení exprese SOD-3 nám ukázalo signifikantní snížení u hodnocené skupiny SHR+CRP (100 % vs. 40,92 %; viz Graf 3). Jako kontrola nanášky proteinů byla použita detekce GADPH (glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza), viz obrázek 13.
SHR+CRP
SHR
Obrázek 13: Kontrola nanášky pomocí GAPDH
Graf 1: Exprese eNOS Grafické zobrazení exprese proteinu v porovnání s kontrolní skupinou SHR. Ve spodní části je reprezentativní obrázek exprese eNOS.
40
Graf 2: Exprese p-eNOS Grafické zobrazení exprese proteinu v porovnání s kontrolní skupinou SHR. Ve spodní části je reprezentativní obrázek exprese p-eNOS.
Graf 3: Exprese SOD3 Grafické zobrazení exprese proteinu v porovnání s kontrolní skupinou SHR. Ve spodní části je reprezentativní obrázek exprese SOD3.
41
Graf 4: Exprese COX2 Grafické zobrazení exprese proteinu v porovnání s kontrolní skupinou SHR. reprezentativní obrázek exprese COX2.
Ve spodní části je
Graf 5: Exprese NFkB p_65 Grafické zobrazení exprese proteinu v porovnání s kontrolní skupinou SHR. Ve spodní části je reprezentativní obrázek exprese NFκB.
42
Graf 6: Exprese FOXP3 Grafické zobrazení exprese proteinu v porovnání s kontrolní skupinou SHR. Ve spodní části je reprezentativní obrázek exprese FOXP3.
43
8. Diskuze Endotel hraje klíčovou roli ve fyziologické regulaci tonu cév, cévní adheze a odolnosti vůči trombóze. Endotelová dysfunkce poukazuje na neplnění těchto fyziologických funkcí, často jako odpověď na patologické stimuly (Steyers, Miller, 2014). Dysfunkce endotelu je charakterizována snížením vazodilatace, dále prozánětlivým a protrombotickým stavem. Její výskyt je spojen s mnohými formami kardiovaskulárních onemocnění (například hypertenze, chronické srdeční selhání, ischemická choroba srdeční) a také s diabetem (Endemann, Schiffrin, 2004). Dále se objevuje u metabolického syndromu. MS je seskupení kardiovaskulárních rizikových faktorů, které zahrnují inzulínovou rezistenci, viscerální obezitu, dyslipidemii a hypertenzi. Inzulínová rezistence a obezita se zdají být nejvýznamnějšími patogenetickými faktory, se kterými se spojuje i přítomný chronický zánět (Kaur, 2014; Duvnjak a Duvnjak, 2009). C-reaktivní protein je markerem zánětu. Bylo prokázáno, že je nezávislým prediktorem kardiovaskulárních příhod. Exprese a bioaktivita endotelové NO syntázy je snížena při zvýšení hladiny CRP v organismu, a to zejména při jeho vyšších koncentracích (Venugopal a další, 2002). Ovlivnění hladiny NO se děje v důsledku stimulace NADPH oxidázy (působí pokles BH4, důležitého kofaktoru eNOS) a také inhibice GTP cyklohydrolázy (jak již bylo popsáno výše), která je důležitá pro tvorbu BH4 (Jialal a další, 2008; Bendall a další, 2005). Studiemi bylo prokázáno, že antagonismus CRP na expresi eNOS se nevyskytuje pouze in vitro, ale také in vivo (Schwartz a další, 2007). Při měření bylo pozorováno naopak zvýšení exprese eNOS. Může se jednat o kompenzační mechanismus v důsledku probíhajícího oxidačního stresu. Fosforylace eNOS je kritickým regulačním mechanismem kontrolujícím aktivitu eNOS. K fosforylaci eNOS dochází působením fosfatáz a protein-kináz na pěti fosforylačních místech enzymu (Boo, Jo, 2003). Jednou z nich je i PI3K/Akt. Její aktivací, která je stimulována také inzulínem, dochází k uvolňování NO (Kolluru a další, 2012). Zvýšení fosforylace eNOS prostřednictvím inzulínu je ovlivněno a omezeno CRP (Mineo a další, 2005). U myší s exprimovaným CRP byla zjištěna snížená exprese fosforylovaného proteinu eNOS a také snížení uvolňování NO (Devaraj a další, 2008; Xu a další, 2007). Tento mechanismus byl tedy prokázán i in vivo (Tanigaki a další, 2009). V této studii bylo zaznamenáno mírné snížení exprese fosforylované formy eNOS, která ovšem není nijak statisticky významná. Superoxid-dismutáza je enzymem, který vychytává ROS a ochraňuje tak NO před jeho degradací na peroxynitrit. Byla nalezena korelace mezi koncentrací CRP a aktivitou superoxidových enzymů u srdečního selhání. Tato skutečnost naznačuje existenci souvislosti mezi volnými radikálovými sloučeninami a zánětem (Wojciechowska a další, 2014). Fukai a další předložili koncept, kde NO produkovaný díky eNOS v cévní stěně zvyšuje expresi ecSOD (SOD-3) a naopak, snížená dostupnost NO poté snižuje také aktivitu 44
ecSOD a dále se tak prohlubuje ED (Fukai a další, 2002). V této práci pozorujeme více než dvojnásobné snížení exprese ecSOD (SOD 3) oproti kontrolní skupině. Je tedy zřejmé, že byl u testovaných zvířat přítomen oxidační stres, který může být zapříčiněn také vlivem CRP. Zdá se, že zvýšená hladina oxidačního stresu má vliv na metabolismus glukózy a riziko výskytu diabetes mellitus a také na patogenezi hypertenze a dalších kardiovaskulárních onemocnění. CRP, jak již bylo uvedeno, zřejmě zvyšuje oxidační stres, a tak zvyšuje riziko pro vznik těchto onemocnění (Pravenec a další, 2013). Cyklooxygenáza 2 je enzym katalyzující vznik prostaglandinů (Minghetti, 2004). Její exprese je zvýšena v pozměněných makrofázích (pěnových buňkách) aterosklerotického plaku a může stimulovat jeho růst. COX-2 také přispívá ke zvýšení oxidačního stresu produkcí ROS a k snížení produkce NO ovlivněním NADPH oxidázy, tím podporuje ED (Bogaty, 2004; Virdis a další, 2013). Současné výsledky ukazují, že cyklooxygenáza přispívá k ED především u starších potkanů (Heymes a další, 2000). Moje měření nezaznamenala výrazný rozdíl v expresi COX-2 v porovnání s kontrolní skupinou. Bylo pozorováno pouze zanedbatelné snížení tohoto enzymu. COX-2 obsahuje vazebná místa pro transkripční faktory, mezi něž patří i NFκB, který tak může ovlivnit expresi enzymu (Hinz, Brune, 2002). Jelikož nebyla objevena výrazná změna ani u NFκB, je možné pozorovat spojitost mezi expresí obou faktorů. Nukleární faktor κB je stěžejní transkripční faktor většiny prozánětlivých cytokínů a chemokínů. Výsledky studií naznačují, že aktivace NFκB se může účastnit endogenní indukce CRP (Agrawal a další, 2003). Indukce CRP je regulována především IL-6 a IL-1, které jsou ovlivněny právě NFκB (Black a další, 2004). Vztah mezi CRP a NFκB se zdá být však obousměrný. CRP se také podílí na indukci aktivace NFκB (Jialal, Devaraj, 2007). NFκB může být také aktivován dalšími různými podněty, například ROS (Valen a další, 2001). V měřeních byl pozorován spíše trend ve snížení exprese NFκB. Dle těchto výsledků by se tedy dalo usuzovat, že nukleární faktor není ovlivněn ani přítomným oxidačním stresem, ani zvýšenou hladinou CRP. FOXP3 je také transkripčním faktorem. Ovlivňuje aktivaci a regulaci Treg (Klingenerg a další, 2013). Dle studií se ukazuje, že Treg mohou mít protektivní funkci při probíhající hypertenzi. Kvakan a další při své studii objevili, že Treg mají efekt na poškození srdce způsobené angiotenzinem II, který má na hypertenzi vliv (Kvakan a další, 2009). Kassan a další zaznamenali, že nerovnováha Treg může být jedním z hlavních faktorů v ED cév. Treg hrají důležitou roli v regulace relaxaci arterií závislé na endotelu (Kassan a další, 2013). Několik studií také ukazuje, že regulace T buněk pomocí FOXP3 má pozitivní vliv na inhibici aterosklerózy (Klingenberg a další, 2013). V této práci jsme však nezaznamenali změny v expresi FOXP3 v aortě. ED je podkladem pro MS a také pro některé jeho jednotlivé složky. Jak u obezity, tak u inzulínové rezistence je jejich výskyt spojen s ED (Xu a další, 2007). ED se vyskytuje také u dalších složek MS, jako je dyslipidémie, hypertenze a hyperhomocysteinémie (Hartge 45
a další, 2007). Analýzy také zjistily, že zvýšená hladina CRP je spojena se složkami MS (Young, Woodside, 2001), avšak v této práci nebyly pozorovány (s výjimkou SOD3) výraznější změny faktorů dávaných do souvislosti s ED a hladinou CRP. Jako nejvýznamnější zjištění bylo zaznamenáno pouze velké snížení exprese SOD 3. U ostatních měřených faktorů nebyla překvapivě změna nijak výrazná a signifikantní. Je možné, že tato skutečnost je způsobena z důvodu nízkého věku a samozřejmě počtu zvířat. Důsledky endotelové dysfunkce a působení CRP by se možná prohloubily a více projevily až v pozdnějším věku. Je také možné, že je třeba vyšších hladin CRP pro větší ovlivnění exprese daných faktorů.
46
9. Závěr V této práci byly hodnoceny vybrané faktory, které jsou dávány do souvislosti s endotelovou dysfunkcí, hladinou C-reaktivního proteinu a ovlivněním syntézy oxidu dusnatého v organismu. Výsledná exprese sledovaných faktorů u hodnocené skupiny zvířat v porovnání s kontrolní skupinou byla následující: endotelová NO syntáza 129 %, fosforylovaná endotelová NO syntáza 80,06 %, superoxid-dismutáza 3 40,92 %, cyklooxygenáza 2 96,60 %, nukleární faktor κB 72,79 % a forkhead box P3 115,80 %. Zvýšená exprese C-reaktivního proteinu u tohoto experimentálního modelu tedy nemá vliv na rozvoj endotelové dysfunkce v tomto schématu a uspořádání.
47
10. Seznam zkratek ADP - adneosin difosfát APS - peroxodisíran amonný, amoniumpersulfate ATP - adenosintrifosfát ATP III - The Adult Treatment Panel III BH2 - dihydrobiopterin, BH4 - tetrahydrobiopterin BMI - index tělesné hmotnosti, body mass index cAMP - cyklický adenosin monofosfát cGMP - cyklický guanosin monofosfát CRP - C-reaktivní protein COX - cyklooxygenáza ecSOD - extracelulární superoxid-dismutáza ED - endotelová dysfunkce EDCF - endotelem derivované kontrakční faktory, endothelium-derived contracting factors EDRF - endotelem derivované relaxační faktory, endothelium-derived relaxing factors EGIR - Evropské uskupení pro studium inzulínové rezistence, Europian Group for the Study of Insuline Resistance eNOS - endotelová syntáza oxidu dusnatého FAD - flavinadenindinukleotid FMN - flavinmononukleotid FOXP3 - forkhead box P3 GAPDH - glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza GTP - guanosin trifosfát HDL - lipoproteiny s vysokou hustotou, high density lipoprotein hsCRP - vysoce citlivý C-reaktivní protein, high sensitivity C-reactive protein
48
IDF - Mezinárodní diabetická federace, The International Diabetes Federation IκB - inhibitor κB IL - interleukin iNOS - inducibilní syntáza oxidu dusnatého LDL - lipoproteiny o nízké hustotě, low density lipoprotein MS - metabolický syndrom NADPH - nikotinadenindinukleotid fosfát NCEP - The National Cholesterol Educational Program NFκB - nukleární faktor κB NO - oxid dusnatý, nitric oxide nNOS - neuronální syntáza oxidu dusnatého PGI2, PGG2, PGH2, PGE2 - prostaglandin I2 / G2 / H2 / E2 PI3K/Akt - fosfoinositol-3-kináza-proteinkináza B PVDF - polyvinilidendifluorid RIPA - radio immuno precipitation assay ROS - reaktivní formy kyslíku, reactive oxygen species RTG - rentgenový SDS - dodecylsíran sodný SDS-PAGE - SDS-polyakrylamidová gelové elektroforéza SHR - spontáně hypertenzní potkani, spontaneously hypertensive rats SOD - superoxid-dismutáza TAG - triacylglyceroly TBS - tris buffered saline, tris-pufr hydrochlorid TBS-T - tris buffered saline tween TEMED - tetramethylethylendiamin WHO - Světová zdravotnická oragnizace, The World Helath Organization 49
11. Seznam tabulek Tabulka 1: Vlastnosti izoforem NO syntázy. ............................................................................. 22 Tabulka 2: Složení gelů pro elektroforézu. ............................................................................... 36 Tabulka 3: Použité protilátky pro imunodetekci a jejich ředění. .............................................. 38
12. Seznam obrázků Obrázek 1: Neurohumorální mediátory, které způsobují uvolnění EDRF důsledkem aktivace specifických endotelových receptorů. ....................................................................................... 12 Obrázek 2: Postulovaný přenos signálu v dysfunkční endotelové buňce. ................................ 14 Obrázek 3: Signální mechanismy vedoucí k endotelové dysfunkci u hyperglykemických pacientů. ................................................................................................................................... 15 Obrázek 4: Souhrn etiopatogenetických mechanismů a příčin MS. ......................................... 16 Obrázek 5: Vliv CRP na vaskulární endotel. .............................................................................. 20 Obrázek 6: Základní stuktura eNOS a schéma katalýzy eNOS. ................................................ 23 Obrázek 7: Hlavní reaktivní formy kyslíku, jejich potenciální původ a detoxikační cesty. ........ 24 Obrázek 8: Rovnováha mezi O2•- a NO• a role SOD. ................................................................ 26 Obrázek 9: Mechanismus vzniku oxidačního stresu, jeho důsledků na endotel a kardiovaskulární onemocnění................................................................................................... 27 Obrázek 10: Enzymatická cesta prostaglandinu (PG) přeměnou z arachidonové kyseliny. ..... 29 Obrázek 11:Potenciální role izoenzymů COX při vaskulárním onemocnění. ............................ 30 Obrázek 12: Schéma aktivace transkripce nukleárního faktoru κB. ......................................... 32 Obrázek 13: Kontrola nanášky pomocí GAPDH ........................................................................ 40
13. Seznam grafů Graf 1: Exprese eNOS ................................................................................................................ 40 Graf 2: Exprese p-eNOS ............................................................................................................ 41 Graf 3: Exprese SOD3 ................................................................................................................ 41 Graf 4: Exprese COX2 ................................................................................................................ 42 Graf 5: Exprese NFkB p_65 ....................................................................................................... 42 Graf 6: Exprese FOXP3 .............................................................................................................. 43
50
14. Použitá literatura 1. 2.
3.
4.
5.
6.
7.
8. 9.
10.
11.
12.
Alberti, G. K. MM., Zimmet, P., Shaw, J. (2005). The Metabolic Syndrome-a New Worldwide Definition. The Lancet. 366 (9491), strany 1059-1062. Adachi, T., Inoue, M., Hara, H., Maehata, E., Suzuki, S. (2004) Relationship of Plasma Extracellular-Superoxide Dismutase Level with Insulin Resistance in Type 2 Diabetic Patients. Journal of Endocrinology. 181 (3), strany 413-417. Agrawal, A., Cha-Molstad, H., Samols, D., Kushner, I. (2003). Overexpressed Nuclear Factor-KappaB Can Participate in Endogenous C-reactive Protein Induction, and Enhances the Effects of C/EBPbeta and Signal Transducer and Activator of Transcription-3. Immunology. 108 (4), strany 539-547. Agrawal, A., Gang, T. B., Rusiñol, A. E. (2014). Recognition Functions of Pentameric C-Reactive Protein in Cardiovascular Disease. Mediators of Inflammation. 2014, strany 1-6. Batinić-Haberle, I., Rebouças, J. S., Spasojević, I. (2010). Superoxide Dismutase Mimics: Chemistry, Pharmacology, and Therapeutic Potential. Antioxidants. 13 (6), strany 877-918. Bendall, J. K., Alp, N. J., Warrick, N., Cai, S., Adlam, D., Rockett, K., Yokoyama, M., Kawashima, S., Channon, K. M. (2005). Stoichiometric Relationships between Endothelial Tetrahydrobiopterin, Endothelial NO Synthase (eNOS) Activity, and eNOS Coupling in Vivo: Insights from Transgenic Mice with Endothelial-Targeted GTP Cyclohydrolase 1 and eNOS Overexpression. Circulation Research. 97 (9), strany 864-871. Bishop-Bailey, D., Mitchell, J. A., Warner, T. D. (2006). COX-2 in Cardiovascular Disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (5), strany 956958. Black, S., Kushner, I., Samols, D. (2004). C-Reactive Protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), strany 48487-48490. Blackwell, T. S., Christman, J. W. (1997). The Role of Nuclear Factor- κB in Cytokine Gene Regulation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 17 (1), strany 3-9. Bogaty, P., Brophy, J. M., Noel, M., Boyer, L., Simard, S., Bertrand, F., Dagenais, G. R. (2004). Impact of Prolonged Cyclooxygenase-2 Inhibition on Inflammatory Markers and Endothelial Function in Patients With Ischemic Heart Disease and Raised C-Reactive Protein: A Randomized PlaceboControlled Study. Circulation. 110 (8), strany 934-939. Boo, Y. C., Jo, H. (2003). Flow-Dependent Regulation of Endothelial Nitric Oxide Synthase: Role of Protein Kinases. AJP: Cell Physiology. 285 (3), strany 499-508. DOI: 10.1152/ajpcell.00122.2003. Burton, G. J., Jauniaux, E. (2011). Oxidative Stress. Best Practice. 25 (3), strany 287-299. 51
13.
14.
15. 16.
17.
18.
19. 20. 21. 22.
23.
24.
25.
Cai, H., Harrison, D. G. (2000). Endothelial Dysfunction in Cardiovascular Diseases: The Role of Oxidant Stress. Circulation Research. 87 (10), strany 840844. Cines, D. B., Pollak, E. S., Buck, C. A., Loscalzo, J., Zimmerman, G. A., McEver, R. P., Pober, J. S., Wick, T. M., Konkle, B. A., Schwartz, B. S., Barnathan, E. S., McCrae, K. R., Hug, B. A., Schmidt, A. M., Stern, D. M. (1998). Endothelial Cells in Physiology and in the Pathophysiology of Vascular Disorders. Blood. 91(10), strany 3527-61. Clária, J. (2003). Cyclooxygenase-2 Biology. Current Pharmaceutical Design. 9, strany 2177-2190. Corbatón-Anchuelo, A., Martínez-Larrad, M. T., Fernández-Pérez, C., et al. (2013). Metabolic Syndrome, Adiponectin, and Cardiovascular Risk in Spain (the Segovia study). Impact of Consensus Societies Criteria. Metab Syndr Relat Disord. 11(5), strany 309–318. Devaraj, S., Sinhg, U., Jialal, I. (2008). The Evolving Role of C-Reactive Protein in Atherothrombosis. Clinical Chemistry. 55 (2), strany 229-238. DOI: 10.1373/clinchem.2008.108886 Dubois, R. N., Abramson, S. B., Crofford, L., Gupta, R. A., Simon, L. S., Van De Putte, L. B. A., Lipsky, P. E. (1998). Cyclooxygenase in biology and disease. The Journal of Federation of American Societies for Experimental Biology. 12 (12), strany 1063-1073. Duvnjak, L., Duvnjak, M. (2009). The Metabolic Syndrom-an Ongoing Story. Journal of Physiology and Pharmacology. 60 (7), strany 19-24. Eckel, R. H., Alberti, K. G. M. M., Grundy, S. M., Zimmet, P. Z. (2005). The Metabolic Syndrome. The Lancet. 365 (9468), strany 1415-1428. Enedmann, D. H., Schiffrin, E. L. (2004). Endothelial Dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (8), strany 1983-1992. Executive Summary of the Third Report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Pannel III). JAMA 2001; 285, strany 2468-2497. Ford, E. S., Li, C., Zhao, G. (2010). Prevalence and Correlates of Metabolic Syndrome Based on a Harmonious Definition among Adults in the US. J Diabetes. 2, strany 180–193. Förstermann, U., Münzel, T. (2006). Endothelial Nitric Oxide Synthase in Vascular Disease: From Marvel to Menace. Circulation. 113 (13), strany 17081714. Fukai, T., Folz, R. J., Landmesser, U., Harrison, D. G. (2002). Extracellular Superoxide Dismutase and Cardiovascular Disease. Cardiovascular Research. 55 (2), strany 239-249.
52
26.
27.
28.
29.
30. 31.
32. 33.
34. 35. 36.
37.
38.
Furchgott, R. F., Zawadzki, J. W. (1980). The Obligatory Role of Endothelial Cells in the Relaxation of Arterial Smooth Muscle by Acetylcholine. Nature. 288 (5789), strany 373-376. Girvalaki, Ch., Vardavas, C., Papandreou, Ch., Christaki, G., Vergetaki, A., Tsiligianni,I. G., Hatzis, Ch., Kafatos, A. (2014). Trends in Metabolic Syndrome Risk Factors among Adolescents in Rural Crete between 1989 and 2011. Hormones. 13(2), strany 259-267. Gordon, J. W., Shaw, J. A., Kirshenbaum, L. A. (2011). Multiple Facets of NF-B in the Heart: To Be or Not to NF-B. Circulation Research. 108 (9), strany 11221132. Grundy, S. M., Cleeman, J. I., Daniels, S. R., Donato, K. A., Eckel, R. H., Franklin, B. A., Gordon, D. J., Krauss, R. M., Savage, P. J., Smith, S. C., Spertus, J. A., Costa, F. (2004). Definition of Metabolic Syndrome: Report of the National Heart, Lung, and Blood Institute/American Heart Association Conference on Scientific Issues Related to Definition. Circulation. 109 (3), strany 433-438. Hartge, M., Unger, T. M., Kintscher, U. (2007). The Endothelium and Vascular Inflammation in Diabetes. Diabetes. 4 (2), strany 84-88. Heymes, Ch., Habib, A., Yang, D., Mathieu, E., Marotte, F., Samuel, J., Boulanger, Ch. M. (2000). Cyclooxygenase-1 and −2 Contribution to Endothelial Dysfunction in Ageing. British Journal of Pharmacology. 131 (4), strany 804-810. Hinz, B., Brune, K. (2002). Cyclooxygenase-2---10 Years Later. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 300 (2), strany 367-375. Huang, P. L. (2003). Endothelial Nitric Oxide Synthase and Endothelial Dysfunction. Current Hypertension Reports. 5 (6), strany 473-480. DOI: 10.1007/s11906-003-0055-4. Hulín, I. (1998). Patofyziológia. 5. aktualiz. vyd. Bratislava: SAP, 1140 s. ISBN 8088908078, strany 920, 921; 513-516. International Diabetes Federation: The IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome, 2005. Jialal, I., Devaraj, S., Singh, U. (2006). C-Reactive Protein and the Vascular Endothelium. Journal of the American College of Cardiology. 47 (7), strany 1379-1381. Jialal, I., Devaraj, S. (2007). The Role of C-Reactive Protein Activation of Nuclear Factor Kappa-B in the Pathogenesis of Unstable Angina. Journal of the American College of Cardiology. 49 (2), strany 195-197. Jialal, I., Verma, S., Devaraj,S. (2008). Inhibition of Endothelial Nitric Oxide Synthase by C-Reactive Protein: Clinical Relevance. Clinical Chemistry. 55 (2), strany 206-208.
53
39.
Joly, A. L., Liu, S., Mailer, R., Andersson, J. (2013). FOXP3 Isoform Expression in Atherosclerosis: Correlations with Plaque Inflammation and Disease Outcome. (P4140). The Journal of Immunology. 190 (191.16).
40.
Kassan, M., Wecker, A., Kadowitz, P., Ttrebak, M., Matrougui, K. (2013). CD4 CD25 Foxp3 Regulatory T cells and Vascular Dysfunction in Hypertension. Journal of Hypertension. 31 (10), strany 1939-1943. Kaur, J. (2014). A Comprehensive Review on Metabolic Syndrome. Cardiology Research and Practice. 2014, strany 1-21. Klingenberg, R., Gerdes, N., Badeau, R. M., Gistera, A., Strodthoff, D., Keteluth, D. F. J., Lundeberg, A. M., Rudling, M., Nilsson, S. K., Olivercona, G., Zoller, S., Lohmann, Ch., Lüscher, T. F., Jauhiainen, M., Sparwasser, T., Hannson, G. K. (2013). Depletion of FOXP3 Regulatory T Cells Promotes Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), strany 13231334. Kolluru, G. K., Bir, S. C., Kevil, C. G. (2012) Endothelial Dysfunction and Diabetes: Effects on Angiogenesis, Vascular Remodeling, and Wound Healing. International Journal of Vascular Medicine. 2012 (E), strany 1-30. Krejsek, J., Kopecký, O. (2004). Klinická imunologie. 1. vyd. Hradec Králové: NUCLEUS HK, 2004. ISBN 808622550x., strany 392-393. Kumar, A., Takada, Y., Boriek, A. M., Aggarwal, B. B. (2004). Nuclear Factor-κB: Its Role in Health and Disease. Journal of Molecular Medicine. 82 (7), strany 434-435. Kumar, R., Yong, Q. C., Thomas, C. M. (2013). Do Multiple Nuclear Factor Kappa B Activation Mechanisms Explain Its Varied Effects in the Heart? The Ochsner Journal. 13 (1), strany 157-165. Kvakan, H., Kleinewietfeld, M., Qadri, F., Park, J. - K., Fischer, R., Schwarz, I., Rahn, H. - P., Plehm, R., Wellner, M., Elitok, S., Gratze, P., Deched, R., Luft, F. C., Muller, D. N. (2009). Regulatory T Cells Ameliorate Angiotensin II-Induced Cardiac Damage. Circulation. 119 (22), strany 2904-2912. Laaskonen, D. E., Niskanen, L., Nyyssönen, K., Punnonen, K., Tuomainen, T. - P., Valkonen, V. - P., Salonen, R., Salonen, J. T. (2004). C-Reactive Protein and the Development of the Metabolic Syndrome and Diabetes in Middle-Aged Men. Diabetologia. 47 (8), strany 1403-1410. Massy, Z. A., Swan, S. K. (2001). Cyclooxygenase-2 and Atherosclerosis: Friend or Foe?. Nephrology Dialysis Transplantation. 16 (12), strany 2286-2289. Marshall, H. E., Stamler, J. S. (1999). Exhaled Nitric Oxide (NO), NO Synthase Activity, and Regulation of Nuclear Factor (NF)- κ B. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 21 (3), strany 296-297. McCance, K. L., Huether, S. E. (2010). Pathophysiology: the Biologic Basis for Disease in Adults and Children. 6th ed. Maryland Heights, Mo.: Mosby Elsevier, 1838 p. ISBN 9780323065849, strana 750.
41. 42.
43.
44. 45.
46.
47.
48.
49. 50.
51.
54
52.
53.
54.
55. 56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
Mineo, C., Gormley, A. K., Yuhanna, I. S., Osborne-Lawrence, S., Gibson, L. L., Hahner, L., Shonet, R. V., Black, S., Salmon, J. E., Samols, D., Karp, D. R., Thomas, G. D., Shaul, P. W. (2005). Fc RIIB Mediates C-Reactive Protein Inhibition of Endothelial NO Synthase. Circulation Research. 97 (11), strany 1124-1131. Minghetti, L. (2004). Cyclooxygenase-2 (COX-2) in Inflammatory and Degenerative Brain Diseases. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 63 (9), strany 901-910. Panza, J. A., Quyyumi, A. A., Brush, J. E., Epstein, S. E. (1990). Abnormal Endothelium-Dependent Vascular Relaxation in Patients with Essential Hypertension. New England Journal of Medicine. 323 (1), strany 22-27. Pepys, M. B., Hirschfield, G. M. (2003). C-Reactive Protein: A Critical Update. Journal of Clinical Investigation. 111 (12), strany 1805-1812. Petersen, S. V. Oury, T. D., Ostergaard, L., Valnickova, Z., Wegrzyn, J., Thøgersen, I. B., Jacobsen, C., Bowler, R. P., Fattman, C. L., Crapol, J. D., Enghild, J. J. (2004). Extracellular Superoxide Dismutase (EC-SOD) Binds to Type I Collagen and Protects Against Oxidative Fragmentation. Journal of Biological Chemistry. 279 (14), strany 13705-13710. Pieper, G. M., Riaz-ul-Haq (1997). Activation of Nuclear Factor-κB in Cultured Endothelial Cells by Increased Glucose Concentration: Prevention by Calphostin C. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 30 (4), strany 528-532. Pravenec, M., Kajiya, T., Zidek, V., Landa, V., Mlejnek, P., Simankova, M., Silhavy, J., Malinska, H., Oliyarnyk, O., Kazdova, L., Fan, J., Wang, J., Kurtz, T. W. (2011). Effects of Human C-Reactive Protein on Pathogenesis of Features of the Metabolic Syndrome. Hypertension. 57 (4), strany 731-737. Saely, CH., Koch, L., Schmid, F., Marte, T., Aczel, S., Langer, P., et al. (2006). Adult Treatment Panel III 2001 but not International Diabetes Federation 2005 Criteria of the Metabolic Syndrome Predict Clinical Cardiovascular Events in Subjects Who Underwent Coronary Angiography. Diabetes Care. 29, strany 901–907. Schwartz, R., Osborne-Lawrence, S., Hahner, L., Gibson, L. L., Gormley, A. K., Vongpatanasin, W., Zhu, W., Word, R. A., Seetharam, D., Black, S., Samols, D., Mimeo, C., Shaul, P. W.(2007). C-Reactive Protein Downregulates Endothelial NO Synthase and Attenuates Reendothelialization In Vivo in Mice. Circulation Research. 100 (10), strany 1452-1459. Singh, U., Devaraj, S., Vasquez-Vivar, J., Jialal, I. (2007). C-Reactive Protein Decreases Endothelial Nitric Oxide Synthase Activity Via Uncoupling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43 (6), strany 780-791. Steyers, C., Miller, F. (2014). Endothelial Dysfunction in Chronic Inflammatory Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 15 (7), strany 1132411349. 55
63.
64.
65.
66. 67. 68.
69.
70.
71.
72. 73.
74.
Tanigaki, K., Mineo, C., Yuhanna, I. S., Chambliss, K. L., Quon, M. J., Bonvini, E., Shaul, P. W. (2009). C-Reactive Protein Inhibits Insulin Activation of Endothelial Nitric Oxide Synthase via the Immunoreceptor Tyrosine-Based Inhibition Motif of Fc RIIB and SHIP-1. Circulation Research. 104, (11), strany 1275-1282. Valen, G., Yan, Z., Hanson, G., Hansson K. (2001). Nuclear Factor Kappa-B and the Heart. Journal of the American College of Cardiology. 38 (2), strany 307311. Van Der Heiden, K., Cuhlmann, S., Luong, L. A., Zakkar, M., Evans, P. C. (2010). Role of Nuclear Factor κB in Cardiovascular Health and Disease. Clinical Science. 118 (10), strany 593-605. Vanhoutte, P. M. (1997). Endothelial dysfunction and atherosclerosis. European Heart Journal. 18 (E), strany 19-29. Vanhoutte, P. M. (2009). Endothelial Dysfunction, the First Step Toward Coronary Arteriosclerosis. Circulation Journal. 73 (4), strany 595-601. Venugopal, S. K., Devaraj, S., Yuhanna, I., Shaul, P., Jialal, I. (2002). Demonstration That C-Reactive Protein Decreases eNOS Expression and Bioactivity in Human Aortic Endothelial Cells. Circulation. 106 (12), strany 1439-1441. Vernay, M., Salanave, B., de Peretti, C., Druet, C., Malon, A., Deschamps, V., Hercberg, S., Castetbon, K. (2013). Metabolic Syndrome and Socioeconomic Status in France. The French Nutrition and Health Survey (ENNS, 2006– 2007) International Journal of Public Health. 58, strany 855–864. Virdis, A., Bacca, A., Colucci, R., Duranti, E., Fornai, M., Materazzi, G., Ippolito, C., Bernardini, N., Blandizzi, C., Bernini, G., Taddei, S. (2013). Endothelial Dysfunction in Small Arteries of Essential Hypertensive Patients: Role of Cyclooxygenase-2 in Oxidative Stress Generation. Hypertension. 62 (2), strany 337-344. Wojciechowska, C., Romuk, E., Tomasik, A., Skrzep-Poloczek B., NowalanyKozielska, E., Birkner, E., Jacheć, W. (2014). Oxidative Stress Markers and CReactive Protein Are Related to Severity of Heart Failure in Patients with Dilated Cardiomyopathy. Mediators of Inflammation. 2014, strany 1-10. World Health Organization. Definition, Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus and its Complications. Geneva, WHO, 1999. Xu, J. W., Morita, I., Ikeda, K., Miki, T, Yamori, Y.(2007). C-Reactive Protein Suppresses Insulin Signaling in Endothelial Cells: Role of Spleen Tyrosine Kinase. Molecular Endocrinology. 21 (2), strany 564-573. Young, I. S., Woodside, J. V. (2001). Antioxidants in Health and Disease. Journal of Clinical Pathology. 54 (3), strany 176-186.
56
