Az örökítő anyag (DNS) károsodásai kettős szerepben: hiba vagy jel?
BME Vegyészés Biomérnöki Kar MTA Enzimológiai Intézet
Genom Metabolizmus és Javítás Laboratórium
Hogyan tegyünk fel kérdéseket a mai molekuláris biológiában? Kísérlet-vezérelt kutatás Adatbázisok / rendszerbiológia
Hipotézis-vezérelt kutatás Esettanulmányok, specifikus problémák Ellenőrzés/Igazolás/ÉRTELMEZÉS!!! mindazon adatokra, melyeket a rendszerszemlélet begyűjtött
Választott megközelítés Hipotézis-vezérelt kutatás Esettanulmányok, specifikus problémák
Ellenőrzés/Igazolás/ÉRTELMEZÉS!!!
Módszerek és problémák Szerkezeti biológia Mechanizmusok vizsgálata Fajspecificitás Folding
Élettani szerep vizsgálata
Fejlődésbiológia, sejtciklus szabályozás DNS javítás / sejthalál Timinmentes sejthalál Enzimkinetika mechanizmusa Konformációk – Kifejeződési mintázatok spektroszkópiák (CD, fluoreszc.) Sejten belüli lokalizáció EPR-ENDOR Proteomika: kölcsönhatási Multidimenzionális NMR hálózatok Röntgenkrisztallográfia Transzgén élőlények SAXS Knock-out / RNS interferencia Magi és citoplazmás Objektumok: Uracil-DNS metabolizmus fehérjéi transzport
A mi esetünk: Paradoxon: stabil infotárolás reaktív makromolekulákban?? DNS és sejtbeli környezet: reaktív!! Spontán kémiai módosítások normál élettani körülmények mellett
Hogyan lehet feloldani a paradoxont? DNS javító mechanizmusok Genom stabilitás biztosítása Uracil
Timin
Uracil – a leggyakoribb hiba Uracil – talán nem csak hiba? Jelátvitel!
DNS szerkezet : alkotó elemek
Oés foszfátcsoport:
-O
P O
O-
Nukleinsav szerkezet
A nukleinsavak típusai
RNS
DNS
A nukleinsavak elsődleges szerkezete • A polinukleotid lánc direkcionális ( 5’ACGT3’ )
• A polinukleotid lánc individualitását a nukleotid szekvencia adja. • Minden egyed nukleotiszekvenciája más.
DNS: Watson-Crick. DE inkább: FranklinWilkinson Nature 2 April 1953 MOLECULAR STRUCTURE OF NUCLEIC ACIDS A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid
Kísérletes eredmény: Rosalind Franklin
Merész hipotézis: Watson és Crick We wish to suggest a structure for the salt of deoxyribose nucleic acid (D.N.A.). This structure has novel features which are of considerable biological interest. .... It has not escaped our attention that the specific pairing we postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material (cf Meselsohn and Stahl, 1958)
A kettős hélix
Valós szerkezet
Séma
DNS szerkezet : negatív töltés pKa = 1
Nukleotid egységenként egy negatív töltés Láncvégeken + egy negatív töltés
DNS szerkezet: kovalens kötések Cukorgyûrû – Bázisgyûrû Cukor és bázis szubsztituens csoportok Foszfátészter N-glikozidos: a legkevésbé stabil
DNS szerkezet: nem-kovalens kölcsönhatások H-hidak: bázispárosodás Van der Waals (hidrofób kölcsönhatás): átlapolás (aromás gyûrûk – pí-elektronok)
Hipokromaticitás: az átlapolás miatt a kettõsszálú DNS-beli bázisok elnyelése csökken Felhasználás: olvadási hõmérséklet
Miért fontos a DNS hibajavítás? Hogyan fordulnak elõ a hibák?
Paradoxon: Stabil info tárolás Instabil memória
DNS inherens kémiai reaktivitása (v.ö. ősi RNS világ) főleg a bázisok, ill. az N-glükozidos kötés Tárolás hibái
Spontán károsodási folyamatok Öregedés – Tumorok - Sejthalál
DNS polimerázok hibái Másolás hibái helytelen bázis beépítés (misincorporation) (jó/rossz pár : csak 10 kJ) - azonnali visszaolvasó javítás (proofreading) - SSB fehérjék 1 hiba/10,000,000 - replikáció utáni hamis pár javítás: 1/1010 - nukleotid szintek helyes aránya: nukleotid metabolizmus
A mi esetünk: Paradoxon: stabil infotárolás reaktív makromolekulákban?? DNS és sejtbeli környezet: reaktív!! Spontán kémiai módosítások normál élettani körülmények mellett
Hogyan lehet feloldani a paradoxont? DNS javító mechanizmusok Genom stabilitás biztosítása Uracil
Timin
Uracil – a leggyakoribb hiba Uracil – talán nem csak hiba? Jelátvitel!
Uracil in DNA? Two pathways
How to get rid of uracil in DNA? Two pathways - two enzyme families
Cytosine deamination 500/day/genome MUTAGENIC needs repair system: baseexcision repair (BER)
Prevent thymine-replacement
Thymine-replacing
incorporation under high dUTP/dTTP ratios INNOCENT does not need to be repaired, but BER acts on it transforms BER into hyperactive futile cycle
keep dUTP/dTTP low factor responsible: dUTPase dUTP dUMP + PPi dUTPase guards against U at T sites ONLY for innocent uracils
Remove uracil
cut by cleaving the 5’R glycosidic bond O O NH P=O O O N O
UDG
3
O BOTH for mutagenic ’R
and innocent uracils
N.B.
What happens in lack of dUTPase? dUMP dUMP dUMP
dTTP dTTP dTTP
dUTPáz dUTPase dUTPase
A dUMP-nek, a provides provides dTTP dTTP dTTP prekurzorának precursor precursor termelése A dUTP szint decreases decreasesdUTP dUTP csökkentése
dUTP dUTP
level level
high dUTP/dTTP DNA polymerase DNA polymerase UU UU
UU
UU U CU
UU
Lack of dUTPase Lack of dUTPase
Uracil(U) (U)substituted substituted Uracil DNA DNA BER C C
DNA double strand breaks Chromosome fragmentation
CELL DEATH
Thymine-less cell death (lethal) Mustafi et al, 2003 PNAS Barabás et al 2003 JBC Kovári et al 2004 JBC Barabás et al 2004, JBC Békési et al 2004, JBC Németh et al 2007 NAR Kovári et al 2008 Proteins Tóth et al 2007 JBC Varga et al 2007 FEBS Lett Vértessy 2009 Acc. Chem. Res. Békési et al, 2010 FEBS J Pukáncsik et al 2010 FEBS J Pécsi et al, 2010 NAR Horváth, Vértessy, 2010 NAR Pécsi et al, 2011 PNAS Muha et al 2012 PLoS Genetics
Mire jó mindez? - TBC elleni küzdelem - Uracil-DNS jelátvivő szerepének vizsgálata - Sejten belüli transzport vizsgálatok (Muha et al, 2009, Merényi et al, 2010, Róna et al 2011) - DNS károsodás mérése (Horváth és Vértessy, 2010, Nucl. Acids Res.) - Rákellenes terápiák és diagnosztika fejlesztése (Vértessy és Tóth, 2009, Acc Chem Res)
dUTPáz szerkezet Szimmetrikus homotrimer B
A
B C
A
N
C
1
2
3
4
5
C
Három aktív centrum Mindhárom monomer résztvesz
b E-S
S c Approach Intermediate, (E-AI)
E a d
*
TS mimic intermediate (E-S/E-piP mix)
e Post-attack Intermediate (E-piP)
f
P E-P
Intermediate structures observed along the reaction coordinate of the dUTP hydrolysis: sixteen structures E-I int, mix density Near-attack conformer
2.5 A
Note: Wcat and aP densities separate.
Intermediate model shown in dark red. Mixture model shown in two shades of green. Light green: the product dUMP, dark green: the substrate a,b-imino-dUTP
dUTPáz mechanizmus: atomok mozija AspI
GlnIV
AspIII
ArgII SerII
TyrIII
Fluoreszcencia és gyorskinetika
Phe158 Arg85
3.4 Å
f
Tyr105
Wcat
Asp102
Trp címke
Elemi lépések kvantitatív leírása
Tuberkulózis és malária: közös tulajdonságok Mycobacterium tuberculosis és Plasmodium falciparum: Egyaránt limitált enzimkészlet: dCMP dezamináz és timidin kináz nélkül
dUTPáz az egyedüli útvonal dTMP felé
M. tuberculosis dUTPáz inhibitor tervezés HTP in silico screen
Fajspecificikus szegmensek Varga et al 2008 PDB ID: 2PY4
Munkafolyamat 1. HTS In silico screening 2 millió vegyületre 2. In vitro enzimtesztek 100-200 vegyületre 3. MTB gátlás 350 vegyületre 4. Humán sejt vizsgálatok 50 vegyületre 5. Állatkísérletek 5 vegyületre 6. Szabadalmaztatás 3 vegyületcsaládra
What happens in lack of dUTPase? dUMP dUMP dUMP
dTTP dTTP dTTP
dUTPáz dUTPase dUTPase
A dUMP-nek, a provides provides dTTP dTTP dTTP prekurzorának precursor precursor termelése A dUTP szint decreases decreasesdUTP dUTP csökkentése
dUTP dUTP
level level
high dUTP/dTTP DNA polymerase DNA polymerase UU UU
UU
UU U CU
UU
Lack of dUTPase Lack of dUTPase
Uracil(U) (U)substituted substituted Uracil DNA DNA BER C C
DNA double strand breaks Chromosome fragmentation
CELL DEATH
Thymine-less cell death (lethal) Mustafi et al, 2003 PNAS Barabás et al 2003 JBC Kovári et al 2004 JBC Barabás et al 2004, JBC Békési et al 2004, JBC Németh et al 2007 NAR Kovári et al 2008 Proteins Tóth et al 2007 JBC Varga et al 2007 FEBS Lett Vértessy 2009 Acc. Chem. Res. Békési et al, 2010 FEBS J Pukáncsik et al 2010 FEBS J Pécsi et al, 2010 NAR Horváth, Vértessy, 2010 NAR Pécsi et al, 2011 PNAS Muha et al 2012 PLoS Genetics
Paradigm shift Non-conventional roles for uracil-DNA 5-Me-cytosine demethylation Me-C: key epigenetic signal DNA-methyltransferases do not demethylate ???? Diverse hypotheses in the literature TDG identified as major factor Mechanism: 5-Me-C:G T:G repair via TDG C:G Nature Jiricny, 2011, Cell, Bellacosa, 2011
Paradigm shift Non-conventional roles for uracil-DNA What happens in lack of both dUTPase and UDG? Accumulation of uracil-DNA (viable) e.g double mutant (dut-ung-) E. coli Bacillus subtilis PBS2 phage Is there any multicellular complex organism with such characteristics? Case of holometabolic insects (metamorphosis): - no UDG (major form) in the genome
Lack of dUTPase in Drosophila larvae Western
S2
E
1L
2L
3L
P
Confocal dUTPase
DNA
merge
Larvae have two types of tissues - larval - imaginal disks
dUTPase only in imaginal disks Exclusively nuclear Békési et al, 2004, JBC Correlation between survival/death and presence/lack of dUTPase
Base Excision Repair and uracil-DNA glycosylases
B
U P
B P
P
UDG B
Four UDG families:
B P
P
UNG *MAJOR UDG
P
AP endonuclease
High turn over independently from the context of uracil *Localisation at the replication foci
B
B OH
P
P
P
pol β
SMUG1
*Single strand selective!? *Much lower turn over
+dNTP B
B
B
+ P
P
OH
P
TDG MBD4
*Mismatch specific!!! *Much lower turn over
Ligase III B
B P
B P
P
P
OH
Base Excision Repair and uracil-DNA glycosylases
B
U P
B P
In Drosophila
P
UDG B
B P
P
P
Two Four UDG families: AP endonuclease
UNG *MAJOR UDG High turn over independently from the context of uracil *Localisation at the replication foci
SMUG1
*Single strand selective!? *Much lower turn over (10-4)
TDG MBD4
B
B OH
P
P
pol β +dNTP B
B
B
+ P
P
OH
P
Ligase III B
*Mismatch specific!!! *Much lower turn over (10-4)
P
B P
B P
P
P
OH
Uracil-DNA in the fruit fly: signalling for cell death during metamorphosis?
U-DNA ? U-DNA nuclease ?
Uracil-DNA in physiological samples: effect of uracil-DNA glycosylase and dUTPase Application on physyological samples
Drosophila melanogaster
0,75 0,50 0,25
P
0,8 0,6 0,4 0,2 0,0
disc sal.gl. 3 larval tissues rd
Uracil / million bases
1000 800 600 400 200 0
P
L3
L2
L1
Developmental stages
dUTPase silencing by transposon mediated RNA interference
7.62x
2000
2000
1500 1000 500 0
E
Uracil / million bases
Developmental stages
1,0
rd
disc
sal. gl.
3 larval tissues
Uracil / million bases
L3
L1
L2
0,00
Relative dUTPase mRNA level
1,00
E
Relative dUTPase mRNA level
dUTPase developmental and tissue specific downregulation
Imaginal primordium (eg. discs) - express dUTPase Larval tissues (eg. salivary gland)- no dUTPase expression Békési et al, 2004, J. Biol. Chem.
1.14x
1500
1000
500
0
c gl. isc i dis sal. RNA RNAi
ol d
tr con
rd
3 larval tissues
Uracil-DNA in physiological samples: effect of uracil-DNA glycosylase and dUTPase Application on physyological samples
Drosophila melanogaster
0,50 0,25
P
L3
L1
L2
0,00
0,8 0,6 0,4 0,2 0,0
disc sal.gl. 3 larval tissues rd
Uracil / million bases
1000 800 600 400 200 0
P
L3
L2
L1
Developmental stages
dUTPase silencing Strong lethality at pupal stage
7.62x
2000 1500 1000 500 0
E
Uracil / million bases
Developmental stages
1,0
rd
disc
sal. gl.
3 larval tissues
Uracil / million bases
0,75
Relative dUTPase mRNA level
1,00
E
Relative dUTPase mRNA level
dUTPase developmental and tissue specific downregulation
Imaginal primordium (eg. discs) - express dUTPase Larval tissues (eg. salivary gland)- no dUTPase expression Békési et al, 2004, J. Biol. Chem.
dUTPase silencingimplications by transposon -Uracil-DNA mediated RNA interference in development 2000 - Temporary uracil-DNA 1.14x 1500 intolerance factor 1000
500
0
c gl. isc i dis sal. RNA RNAi
ol d
tr con
rd
3 larval tissues
Evolutionary distribution of dut, ung, ude Insects N
Holometabola
Genom Metabolizmus és Javítás laboratórium BME VBK ABÉT és MTA Enzimológiai Intézet
Csoport
Támogatás
