Biotechnologická syntéza antibiotik

3.12.2014

Biotechnologická syntéza antibiotik

Úvod Růst biomasy ve vsádkovém systému Přenos hmoty v bioreaktoru Měření a regulace základních veličin biotechnologického procesu 5. Separace biomasy 1. 2. 3. 4.

Růst biomasy ve vsádkovém systému • Fáze růstu: I: lag-fáze II: exponenciální III: stacionární IV: odumírání

• Rychlost tvorby biomasy: přírůstek počtu jedinců populace, nebo přírůstek jejich koncentrace v časovém intervalu, nebo přírůstek hmotnosti biomasy v časovém intervalu dn d



dm d



dc d

n … počet jedinců populace m …hmotnost biomasy c … koncentrace biomasy

1

3.12.2014

Růst biomasy ve vsádkovém systému • Vliv podmínek na růst biomasy – Teplota: závislost specifické růstové rychlosti na teplotě 

 max  a1 exp   

Ea   RT 

1  E  1  K o exp   d   RT 

Ea … aktivační energie růstu biomasy Ed … aktiv. energie denaturace biomasy

– pH (vliv pH není jednoznačně objasněn) závislost specifické růstové rychlosti na pH  max *

 max  1

cH K1



K2

cH … koncentrace vodíkových iontů

cH

Přenos hmoty v bioreaktorech • Bioreaktor = vícefázový reaktor (biomasa, g a l fáze) • Přestup kyslíku z plynné do kapalné fáze

Schéma přestupu kyslíku do kapalné fáze v bioreaktoru

Přenos hmoty v bioreaktorech – Rychlost přestupu kyslíku: dc 1 dt



*

 k 1 a c1  c1



cl … konc. kyslíku v l fázi cl* … rovnovážná konc. kyslíku v l fázi kl … koeficient přestupu kyslíku a … měrný povrch mezifáz. rozhraní l-g

(rychlost procesu je limitována odporem přestupu kyslíku v kapalné fázi)

– Veličiny ovlivňující rychlost transportu kyslíku: • Kla - hodnota je podmíněna velikostí bublin plynu a charakterem kapalinového filmu • (cl*-cl) - hnací síla

2

3.12.2014

Přenos hmoty v bioreaktorech – Velikost bublin: • Průměry bublin bývají někdy velmi malé (0,1-1 mm), za velké jsou považovány bubliny s průměrem > 6 mm • Rozměr bublin závisí na jejich tvorbě v distributoru plynu

Závislost koeficientu přestupu hmoty na průměru bubliny pro systém voda- kyslík

Přenos hmoty v bioreaktorech – Rozpustnost kyslíku ve vodě: • (cl*-cl) - hnací síla transportu kyslíku cl*-rovnovážná koncentrace rozpuštěného kyslíku (viz Henryho zákon)

• Rozpustnost kyslíku ve vodě klesá s teplotou Typická rovnovážná rozpustnost kyslíku ve fermentačním médiu je přibližně 0,25 mmol/l (při 20°C)

• Rozpustnost kyslíku výrazně závisí i na složení fermentačního média • Clk … kritická koncentrace rozpuštěného kyslíku (tj. minimální koncentrace kyslíku, pod kterou je růst mikroorganismů přímo závislý na koncentraci rozpuštěného kyslíku)

Přenos hmoty v bioreaktorech • Určení objemového koeficientu přestupu kyslíku – Určení kla - experimentálně - pomocí korelačních vztahů – Přestup kyslíku z bubliny vzduchu do prostředí s vlastnostmi blízkými vodě:

• Sherwoodovo číslo • Laminární režim (Re 1) Sh = 0,39Gr1/3Sc1/3

• Turbulentní podmínky (Re 1) Sh = 2,0 +0,6Re1/2Sc1/3

Grashof

Reynolds

Schmidt

3

3.12.2014

Přenos hmoty v bioreaktorech V probublávaném reaktoru je charakteristickým geometrickým rozměrem průměr bublin plynu a rychlost pohybu bubliny. V reálných bioreaktorech je však situace mnohem složitější, protože se zde vytvářejí shluky bublin různých průměrů. př. vztahu pro výrobu antibiotik ve vsádkovém bioreaktoru s turbínovým míchadlem:

k l a  4 . 10

N    V 

3

0 , 65

 v g . 10     V    3

0 , 45

 ms    H /D

0 , 65

N … výkon míchadla V … objem reakční směsi vg … rychlost průtoku plynu D … průměr reaktoru H … výška kapalné směsi mS … počet sekcí míchadel

Přenos hmoty a tepla v bioreaktorech • Určení mezifázové plochy – Určení měrného povrchu pro kulovité bubliny plynu: 6Z

a 

Z … zádrž plynu

db

• Přestup tepla – Všechny aerobní fermentační pochody jsou spojené s produkcí tepla. – Výměna tepla mezi obsahem vsádkového bioreaktoru a chladící nebo vyhřívací soustavou je obvykle neustálený děj X izotermní děj (odvádí se pouze generované teplo)

Přenos tepla v bioreaktorech Nusseltovo číslo promíchávané kapaliny (nucená konvekce): Nu  f  Re, Pr 

Nu 

D .

 d m n 2

Re

m





Reynolds

Pr 

cp

   b c  Nu   m Re m Pr    w 

e

 m … empirická konstanta

D … vnitřní průměr nádoby α … součinitel přestupu tepla λ … tepelná vodivost dm … průměr míchadla n … otáčky μ … viskozita cp … specifické teplo



Prandtl

4

3.12.2014

Přenos tepla v bioreaktorech – Stanovení hodnoty koeficientu přestupu tepla na straně temperačního média (proudění v trubkách) • turbulentní proudění • pro Re 2300

Nu  0 , 027 Re

Nu  1,86 Gz

1/ 3

        w

0 ,8

Pr

1/ 3

        w

0 ,14

0 ,14

Graetzovo krit.

– Pro probublávané reaktory přestup tepla ze suspenze biomasy na stěnu zařízení závisí na mimovrstvové rychlosti plynu a prakticky nezávisí na geometrických parametrech systému. empirická rovnice

  9391 v

0 , 25

 w      

0 , 35

Přenos hmoty v bioreaktorech • Hydrodynamické podmínky Předpoklad: limitující složka je do systému trvale dodávána, její přenos k vnějšímu povrchu buněk je v rovnováze s úbytkem způsobeným biosyntézou. k 2 (c  c s ) 

n max c s k s  cs

k2 … koeficient sdílení hmoty jednotkovou plochou fázového rozhraní

bezrozměrné veličiny:

1 x

x

 koncentrace: x = cs / c Da  x parametr:  = ks / c Damköhlerovo číslo: Da=max / k2c (charakterizuje míru vlivu difuze na rychlost procesu)

Přenos hmoty v bioreaktorech Faktor účinnosti hydrodynamiky: ( = skutečná rychlost procesu / rychlost bez vlivu odporu proti přestupu hmoty) x

 

 x 1



x (   1)

 x

1

 1

Pokud převládá vliv difuze na rychlosti procesu, pak  

1  Da

(o rychlosti procesu rozhoduje přenos hmoty a rychlost procesu nezávisí na parametrech kinetické rovnice a rovněž vliv teploty a pH je nevýrazný).

5

3.12.2014

Měření a regulace základních veličin • Veličiny fyzikální povahy Teplota, tlak, hmotnost, výška hladiny, výška pěny, otáčky a příkon míchadla, vizkozita, průtok vzduchu, průtok kapaliny, … • Veličiny chemické povahy pH, redox potenciál, koncentrace rozpuštěného kyslíku, parciální tlak kyslíku a CO2 ve výdechových plynech, koncentrace některých iontů, ethanolu, methanolu, glukosy, …

Měření a regulace základních veličin • Veličiny biologické povahy celkové množství a koncentrace biomasy, primární a sekundární metabolity, nukleotidy, DNA/RNA, aminokyseliny, celkové množství proteinů, ATP/ADP, lipidy,… • Odvozené veličiny Objemový koeficient přestupu kyslíku k La, rychlost spotřeby kyslíku, rychlost vývoje CO2, specifická rychlost růstu biomasy, …

Měření a regulace základních veličin

6

3.12.2014

Měření a regulace základních veličin • Měření fyzikálních parametrů – Teplota - termistor, platinový odporový teploměr, termočlánek; – Tlak - membránový snímač s převodem na elektrický signál, tenzometry; – Hmotnost - tenzometrické snímače, vážení; (hmotnost vsádky lze určit z diference údajů membránových manometrů)

– Výška hladiny - kontaktní čidla - vodivostní či kapacitní sonda; – Výška pěny - kontaktní čidla - vodivostní či kapacitní sonda, snímač hydrostatického tlaku zabudovaný do stěny nádrže;

Měření a regulace základních veličin – Otáčky míchadla - indukčně citlivé prvky (tachodynamo), pulsní čítače, dynamometr; – Příkon míchadla - torzní dynamometr, tenzometr zabudovaný na hřídel míchadla; – Průtok vzduchu - rotametr s převodníkem, který poskytuje elektrický signál (optický, indukční, nebo odporový snímač), clonka s vysílačem tlakové diference; – Průtok kapalin - podobné snímače jako při měření průtoků plynů;

Měření a regulace základních veličin • Měření chemických parametrů – pH - skleněné elektrody; – Redox potenciál - platinová elektroda v kombinaci s referentní elektrodou; – Obsah rozpuštěného kyslíku - galvanické (potenciometrické) a polarografické (ampérometrické) elektrody; – Rozpuštěný CO2 - iontově selektivní elektrody opatřené membránou propustnou pro plyny, tepelně sterilované elektrody se zakrytou membránou;

7

3.12.2014

Měření a regulace základních veličin – Anorganické ionty - iontově selektivní elektrody; – Analýza plynů - paramagnetická rezonance, IČ spektrometrie, měření tepelné vodivosti, hmotové spektrometry;

Měření a regulace základních veličin • Měření fyziologických veličin – Nejdůležitější údaje o stavu a vývoji procesu z hlediska optimálního řízení. – Většina veličin není průběžně měřitelná (koncentrace biomasy, produktu, substrátu; specifické a absolutní rychlosti růstu biomasy, tvorby produktu).

Měření a regulace základních veličin • Měření fyziologických veličin – Metody založené na nových principech měření: optoelektronika a užití optických vláken (měření světelné absorpce, fluorescence, reflexe, barvy, turbidity, luminiscence) – Polovodičové křemíkové senzory - iontově selektivní senzory na bázi iontově selektivních FET (Field Effect Transistors) – Enzymové elektrody - stanovení některých organických sloučenin (glukosa, laktosa, maltosa, aminokyseliny, ethanol, methanol, acetaldehyd, penicilin, …)

8

3.12.2014

Měření a regulace základních veličin • Řízení biotechnologického procesu Řídící systémy: – systémy řízení pro stabilizaci podmínek kultivace, nebo s postupnou změnou kultivačních podmínek podle zadané trajektorie • regulační smyčky teploty, pH, tlaku, míchání, aerace, rozpuštěného kyslíku a odpěňování;

– systémy řízení s aplikací tzv. pokročilých algoritmů řízení • algoritmy již vyžadují znalost dalších stavových veličin jako je koncentrace biomasy, produktu, substrátu a umožňují konkrétní proces optimalizovat;

Měření a regulace základních veličin • Regulace základních kultivačních podmínek – Regulace teploty • Regulace přes duplikátor s teplosměným médiem cirkulujícím v uzavřeném temperačním okruhu. Chlazení se zajišťuje zaváděním chladící cody z rozvodu do temperačního okruhu, ohřev pak průtočným elektrickým topidlem nebo přiváděním páry do okruhu.

– Regulace pH • Regulace se provádí přídavkem kyseliny, nebo zásady ze zásobníku. Problémem je značná nelinearita mezi elektrickým signálem pH elektrody a regulačním zásahem.

Měření a regulace základních veličin – Obsah rozpuštěného kyslíku (regulace je možná 4 způsoby) • změna kLa (objemový koeficient přestupu hmoty v systému) - změny ve frekvenci otáčení míchadla • změna průtoku kyslíku - mění se buď poměr kyslíku k inertnímu plynu dodávanému do fermentoru, nebo průtok vzduchu • změna přívodu substrátu • změna tlaku - zvyšováním pracovního tlaku dojde ke zvýšení rozpustnosti kyslíku ve fermentačním médiu

9

3.12.2014

Měření a regulace základních veličin – Odpěňování • Tvorba pěny je nežádoucí (z tenkých kapalinových filmů je kyslík rychle buňkami vyčerpán a neúčinná pěna zaujímá značný prostor v reaktoru). Pěna strhávaná výstupním vzduchem zanáší sterilizační filtry a zvyšuje možnost zarůstání mikroorganismů v potrubí, nebo dokonce jejich nežádoucí únik do okolí. • Metody odpěňování: – Mechanické - rozbití pěny rotačním pohybem speciálně tvarovaného kotouče, odpěňování ultrazvukovými vlnami, zrychlený průtok pěny zúženým otvorem; – Chemické - odpěňovací prostředky vytěsňují povrchově aktivní látky způsobující pěnění;

Separace biomasy • Mikroorganismy tvoří s kultivačním prostředím v bioreaktoru suzpenze • Používané chemicko-inženýrské operace: – Filtrace – Sedimentace – Odstřeďování – Ultrafiltrace

10