2.12.2015
ANTIBIOTIKA ANTIBIOTIKA:
Biotechnologická syntéza antibiotik
produkty různých organizmů, zejména mikroorganizmů hubí patogenní mikroorganizmy baktericidní, fungicidní
zastavují růst patogenních mikroorganizmů bakteriostatická, fungistatická
ANTIBIOTIKA
přírodní (penicilin, tetracyklin) polosyntetická (ampicilin, oxacilin) syntetická (chloramfenikol)
ANTIBIOTIKA
s úzkým spektrem
Vývoj antibiotik
Vývoj antibiotik • Selman Abraham Waksman
Alexander Fleming
– v jeho laboratoři objeveno přes 20 antibiotik
• 1929 Objev penicilinu • Technologie průmyslové výroby penicilinu o 10 let později
• Streptomycin (proti tuberkulóze)
• 1950 Antracyklinová antibiotika • 1963 Cytostatikum – léčba leukémie • do dnešní doby objeveno přes 10 000 různých antibiotik, malý počet nalezl klinické využití
– S.A. Waksman (USA) a G. Brotz (IT)
• 1943 Zahájení průmyslové výroby penicilinu (USA)
VÝROBA ANTIBIOTIK
PŘEDVÝROBNÍ ETAPA
ETAPA PŘEDVÝROBNÍ
ETAPA VÝROBNÍ
sporulace
výběr kmene
šlechtění a úprava
Cíl: namnožit spóry
konzervace
Cíl: najít vhodný kmen produkčního mikroorganizmu
fermentace
Cíl:
produkovat co nejvíce antibiotika
se širokým spektrem
ETAPA IZOLACE
chlazení filtrace izolace
ČIŠTĚNÍ ÚPRAVA
syntéza krystalizace jiné metody
Cíl: Cíl: získat získat čisté antibiotikum antibiotikum v surovém zlepšit jeho stavu vlastnosti
- nežádoucí snížit účinky
Výběr kmene najít v přírodě
Šlechtění a úprava hledání nových mutací
produkční kmen
kritéria:
antibiotická účinnost (produkce AB) stálost (nemění vlastnosti po několik generací)
ozařování účinek jedů selekce mutací
výběr podle stejných kritérii adatace
snést co nejvyšší koncentraci antibiotika, které sám tvoří
Konzervace kapalný dusík lyofilizace
KONZERVA
1
2.12.2015
SPORULACE
KONZERVA
1. sporulační generace
zkumavky, šikmý agar
1. vegetativní generace
očkování
Petriho misky
2. sporulační generace očkování
3. sporulační generace
několik hodin
- SPORULAČNÍ INOKULUM očkovací konev, baňka
ŽIVNÉ PŮDY – složení voda zdroj energie zdroj dusíku ionty speciální přísady
ŽIVNÉ PŮDY kapalné tuhé
suš ení
TUHÁ FÁZE mycelium zbytky živin někdy AB
(usnadňují tvorbu antibiotika) jen do fermentačního tanku!
PŘÍKRMY - doplněk živin - do fermentačního tanku během fermentace
IZOLACE AB z kapalné fáze a) existuje organické rozpouštědlo, které se nemísí s vodou a v němž je AB lépe rozpustné než ve vodě
extrakce b) existuje činidlo, s nímž AB selektivně reaguje za vzniku ve vodě nerozpustné sraženiny
srážení
EXTRAKT
c) AB se selektivně váže na měnič iontů či jiný sorbent
zahu štění krysta lizace
adsorpce
filtr ace suš ení
KAPALNÁ FÁZE zbytky živin produkty metabolizmu někdy AB
ANTIBIOTIKUM surové
KAPALNÁ FÁZE ROZPOUŠTĚDLO
filtr ace suš ení
- prekurzory
roze mletí extr akce
zahu štění
(tlumí tvorbu spór, stimulují růst mycelia)
2. vegetativní generace
desítky hodin
TUHÁ FÁZE
filtr ace
krysta lizace
očkovací tank
3. vegetativní generace
IZOLACE AB z tuhé fáze
ochlazení 5 °C (zastavení metabolických procesů)
EXTRAKT
několik hodin
IZOLACE
fermentační tank
extr akce odděle ní fází
ŽIVNÉ PŮDY– složení - voda - zdroj energie - zdroj dusíku - ionty - speciální přísady
předočkovací tank
fermentační tank
- agar - želatina
(tlumí růst mycelia, stimulují tvorbu spór)
FERMENTACE
SPORULAČNÍ INOKULUM
očkování
ČIŠTĚNÍ A ÚPRAVA AB
srá žení
adso rpce
SRAŽENINA
adso rpce SRAŽENINA
(sloučenina AB)
(AB + sorbent)
roz klad rozpuš tění
extr akce
ROZTOK AB zahu krysta filtr suš
ANTIBIOTIKUM
SORBENT
SRÁŽEDLO
štění lizace ace ení
ANTIBIOTIKUM surové
štění lizace ace ení
ANTIBIOTIKUM polosyntetické
ANTIBIOTIKUM čisté
EXTRAKT zahu krysta filtr suš
metody chemické syntézy
krystalizace filtrace, srážení aj.
HODNOCENÍ AB
Analytické metody fyzikální fyzikálně chemické chemické
biologické metody stanovení účinnosti mezinárodní jednotky
2
2.12.2015
Průmyslová výroba antibiotik • velké fermentory – nárůst biomasy a metabolitů
FERMENTOR únik plynu kyseliny hydroxidy
míchadlo
kontrola pěny kontrola hladiny výstup vody
přívod vody
• využití produkčních mikroorganismů
kontrola pH kontrola teploty
• aerobní proces (přítomnost kyslíku) • vodný roztok živin • amonné ionty • síranové ionty • fosforečnanové ionty • uhlíkaté složky (sacharidy, oligosacharidy)
plnění odpěňovač průzor
duplikace průlez vzduch odběr vzorků výpusť
Šlechtění produkčních kmenů • produkční kmeny : mikroorganismy produkující antibiotika • působení mutagenů na produkční kmeny pro zvýšení jejich aktivity • UV záření • Rentgenové záření • Chemické látky: • kyselina dusitá • nitrosometylmočovina • nitrosometylquanidin
Mikrobiální kinetika • vícefázový systém (kapalná, plynná, pevná fáze) • na celkovou rychlost má vliv rychlost přenosu hmoty přes buněčnou stěnu Využití živin na růst a dělení buňky (tvorba biomasy)
Cytoplazmantická membrána
Mikrobiální kinetika • reakční směs = kultivační roztok – substráty (živiny, kyslík) – metabolické produkty – mikroorganismy suspendované ve vodě
• rychlost závisí na koncentraci složek v reakční směsi, teplotě, (tlaku) • vlastní bioreakce - uvnitř buňky
Mikrobiální kinetika • Zjednodušení: – populace mikroorganismů = kontinuum • koncentrace biomasy (hmotnost mikroorganismů v jednotce objemu kultivačního roztoku)
– biomasa = chemické individuum Bioreakce přenos živin přes membránu do buňky
• nezabýváme se změnou složení biomasy
přenos produktů metabolismu z buňky
kultivační roztok
3
2.12.2015
Růst biomasy – růstová křivka (vsádkový reaktor)
Modely rychlosti růstu n = počet jedinců populace m = hmotnost biomasy c = koncentrace biomasy (hmotnostní)
• Adaptační (Lag fáze) – buňky se nerozmnožují, zvětšují svůj objem, dochází k aktivaci enzymového systému
• Exponenciální (logaritmická fáze)
Exponenciální fáze:
– vlastní množení buněk – rychlost tvorby se s časem zvětšuje (autokatalytický charakter)
• pouze exponenciální růst, bez inhibice
– rovnováha mezi dělením a odumíráním buněk (nedostatek živin)
• Fáze postupného odumírání
k = specifická rychlost růstu
– buňky se již nerozmnožují, pouze odumírají vlivem toxických produktů metabolismu
Modely rychlosti růstu k = konstanta růstu β = konstanta tvorby toxinu
• Ricatiho model • faktor inhibice β
– řešení
poč. podmínky τ = 0 n = n0
βn asymptota βn = 1 poč.exponenciální f. začíná působit faktor inhibice
adaptační fáze
τ1/2
0
PŘECHOD NA STACIONÁRNÍ FÁZÍ (nezahrnuje odumírání)
Modely rychlosti růstu • Volterův model
– Numerické řešení
τ
• Monodova rovnice tvorby biomasy (empirická) • nejpoužívanější rovnice v mikrobiální kinetice
rmax
rmax = maximální rychlost bioreakce
cS = koncentrace substrátu KS = koncentrace substrátu pro
rychlost = ½ max. rychlosti
Paměťový člen Inhibiční člen (Inhibiční vliv toxinu) (Ricati)
Parametr řešení:
λ = k0 = 0 k0 > 0 k0 < 0
Kinetické modely růstu biomasy
kS
n = n0
• Malthusův model
• Stacionární fáze
1
τ=0
růst kultury není ani inhibován ani promotován přítomnost promotoru ihibice toxinem (odumírání buněk)
Kinetické modely růstu biomasy • Monodova rovnice • analogie k heterogenně katalytizovaným reakcím (Langmuir – Hinshelwood) – proměnná hodnota zdánlivého reakčního řádu – pro cS >> kS ...... nultý řád – pro cS << kS ...... první řád
• neplatí pro podmínky velmi rychlého růstu
4
2.12.2015
Vliv vnějšího prostředí na růst mikroorganismů • úzký rozsah podmínek, za kterých mikrobiální procesy probíhají
• Teplota – urychluje řadu metabolických reakcí (Arrheniovská závislost) – ale při vyšších teplotách – rychlejší denaturace bílkovin a dezaktivace enzymů (využití při sterilizaci) – optimum obvykle 10 - 40°C μ = specifická růstová rychlost EA = aktivační energie růstu biomasy ED = aktivační energie denaturace biomasy
Separace biomasy • Biomasa tvoří dominantně suspenze
Vliv vnějšího prostředí na růst mikroorganismů • pH – růst mikroorganismů velmi citlivý na hodnotu pH (enzymová aktivita závisí na pH) • většina mikroorganismu pH 4-8 • Pepsin pH 3 • Argináza pH 10 • s hodnotou pH souvisí i odolnost vůči vyšším teplotám – čím vyšší odchylka od ideálního pH, tím nižší odolnost vůči vysokým teplotám
RIZIKA LÉČBY ANTIBIOTIKY vznik rezistentních MO
nepravidelné dávkování, neúplné vyléčení zkřížená rezistence
– Cílem oddělit biomasu a produkt
• Využívané metody separace: – – – –
filtrace sedimentace odstřeďování (centrifugace) ultrafiltrace (membrány 1-100 μm)
• Separace produktu → čištění produktu → úprava produktu • Recyklace biomasy (omezená stárnutím biomasy)
JINÉ PRODUKTY BIOTECHNOLOGiÍ
změna složení střevní flóry průjmy, zažívací potíže superinfekce v důsledku změny střevní flóry se rozmnoží patogenní MO, rezistentní k použitému AB
ze sacharózy účinkem Leuconostoc mesenteroides
zejména esenciální – výživa hospodářských zvířat L-lysin, L-threonin, L-tryptopfan, L-methionin aj.
VITAMÍNY
C, kys. askorbová – pouze jeden stupeň biotechnologicky další vitamíny: A, D 2, B 6, H
VAKCÍNY rekombinantní vakcíny
biotechnologicky získané peptidy na povrchu stejná struktura jako na bílkovinách na povrchu virů či bakterií
B 2, riboflavin – buď biotechnologicky nebo synteticky B 12, kyanokobalamin – výhradně biotechnologicky
ENZYMY růstové faktory erythropoetin, neutropoetin a trombocytopoetin
AMINOKYSELINY
rozvine se jiná choroba, než která je léčena alergie zejména penicilinová AB
amylázy a proteázy, produkty Aspergillus oryzae
DEXTRAN polysacharid, náhrada krevní plazmy
MO rezistentní na jedno AB je rezistentní i na příbuzná AB dysmikrobie
PROTILÁTKY monoklonální protilátky
produkty jednoho klonu hybridomů AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE účinná dělicí metoda izolace cenných látek, např. monoklonálních protilátek
5
2.12.2015
LIDSKÝ INZULÍN
ALKALOIDY námelové alkaloidy
peptidický hormon, 51 molekul aminokyselin, 2 řetězce
efedrin
Rozdíl:
kvašení sacharózy za přítomnosti benzaldehydu
HORMONY
lidskému
Ala 1 aminokyselina
Thr je nejpodobnější vepřový na konci 2. řetězce
steroidní (kortizon, hydrokortizon, prednizolon, dexametazon,
spironolakton, pohlavní hormony)
plíseň Rhizopus nigricans, některé baktererie
Výroba lidského inzulínu fermentací
lidský inzulín
U lidského inzulínu se zastavíme – pokračování příště (další snímek)1
gen pro tvorbu inzulínu
Escherichia coli
upravená Eschericha coli
lidský růstový hormon somatostatin a jiné liberiny (releaisng faktory hypotalamu) živočišné hormony
lidský inzulín izolace
fermentace
6
