BIOTECHNOLÓGIÁK EGYÉB IPARÁGAKBAN Pókselyemfehérjék előállítása dohányban és burgonyában Tárgyszavak: selyemfehérje; transzgénikus növény; szintetikus pókselyem; selyemfehérjegén. A Nephila clavipes pók által előállított selyem húzószilárdsága azonos nagyságrendű a szintetikus Kevlar száléval, de a selyemszál rugalmassága a szintetikus szálhoz képest nagyobb. Az ilyen bioalapanyagok jól alkalmazhatók ipari és gyógyászati célokra. Miután azonban a selyemszálat a pókok nem képesek nagy mennyiségben előállítani, vizsgálták egyéb élő szervezetek segítségével való előállítási lehetőségüket. A pókok által szőtt selyemszálak fehérjéinek molekuláris szerkezete adja az alapját a szintetikus gének tervezésének és a selyemszálak előállításának egyéb élő szervezetek, pl. mikroorganizmusok segítségével. A pók által szőtt selyemszál fehérjéi (spidroinok) nagy mennyiségű glicint és alanint tartalmaznak, ezen aminosavakat kell nagy mennyiségben rendelkezésre bocsátani, ha spidroinokat akarnak előállítani gyorsan növekedő mikroorganizmusok (élesztők, baktériumok) segítségével. A baktériumok segítségével végzett selyemszál-előállítás azonban nehéz a rekombináció miatti genetikai instabilitás miatt, amelyet a spidroinokat kódoló ismétlődő gének okoznak. Transzgénikus burgonyát és dohányt állítottak elő, amelyek képesek jelentős mennyiségű rekombináns Nephila clavipes pókselyemfehérje előállítására. Az endoplazmatikus retikulumban (ER) való visszatartással megvalósították a funkcionális fehérjék tartós felhalmozódását. Ismertetik a szintetikus spidroinok transzgénikus dohány- és burgonyanövényekben a fentiekhez hasonló, retenciós megközelítéssel végzett, hatékony és stabil előállítását. A növények által termelt szintetikus pókselyemfehérjék a nagy hőstabilitásuk miatt felhasználhatók tisztítási eljárások kifejlesztésére. A kísérletek a következő lépcsőkből álltak: – a szintetikus pókselyemgének összeállítása – a kiméra pókselyemfehérje-gének előállítása és behelyezése dohányés a burgonyanövényekbe, – a szintetikus pókselyemfehérjék vizsgálata a transzgénikus dohány- és burgonyanövények leveleiben és erezetében, – a növények által előállított szintetikus pókselyemfehérjék tisztítása.
A kísérleti eredmények és értékelésük A stratégia Az alap szintetikus szekvenciákat alkalmazták a különböző molekulatömegű pókselyemfehérjéket kódoló génsorozatok megszerkesztésére. A szintetikus pókselyemgéneket a lehető legpontosabban összeillesztették az N. clavipes MaSp1 (spidroin1) komplementer DNS-ével (cDNS), majd különböző szintetikus fúziós géneket készítettek ezen megközelítés alkalmazásával. A szintetikus gének moduláris szerkezete kombinálható más szekvenciákkal, új tulajdonságokkal rendelkező, pókselyemszerű fehérjék előállítására. Különböző méretű, proteineket kódoló spidroingén-sorozatot alkalmaztak a növények pókselyemfehérjét termelő tulajdonságainak a vizsgálatára, a pókselyemfehérjéket felépítő folyamat optimálására és a tisztításra. 18 oligodezoxi-ribonukleotidot (1. ábra) szintetizáltak és 6 rövid génfragmensbe építettek össze. Az oligonukleotidokat – az 1, 2 és a 11 kivételével – a szintézis végén foszforilezték. A fragmensek felhasználásával szintetikus spidroin géneket állítottak elő, amelyek 90%-nál nagyobb mértékben megfeleltek a természetes spidroin szekvenciáinak. Az egységeket pUC-19-származék plazmidokba helyezték, és felhasználták az Escherichia coli klónozására. A fragmenseket endonukleázokkal feltárták, majd több ligálási lépésben létrehozták a szintetikus spidroin1 gén egyre nagyobb szegmenseit. A végső lépésben egy szintetikus 1,8 kilobázis homológ N. clavipes MaSp1 (spidroin1) cDNS-t állítottak elő, amelynek a 3’ helyen hiányzott a nem ismétlődő része. Az FA2 fúziós fehérjét kódoló gén előállítására használt fibroin fragmens szintetikus homológja a Bombyx mori selyemhernyólepke fibroin láncú génszegmensének. A fibroinnak, a B. mori legfontosabb selyemfehérjéjének kombinálása a pókselyem elemeivel lehetővé teszi az új tulajdonságokkal rendelkező selymek megtervezését és létrehozását. Az FA2-t 14 oligodezoxiribonukleotidból építették fel, a fentiekben ismertetett módon. A szintetikus pókselyem géneket egy expressziós vektorban klónozták, amely lehetővé tette a transzgénikus növényekben való kifejeződést a karfiol mozaikvírus 35S promoterének az ellenőrzése mellett. Egy jelölő peptid a pókselyemfehérje N végén, a C végen levő KDEL jellel együtt biztosítja a transzgénikus proteinek visszatartását a növényi sejtekben, az endoplazmatikus retikulumban. Egy c-myc toldalékot építettek be a selyemfehérje C végén, a transzgénikus termékek kimutatására western blot módszerrel. A pókselyemgéneket az alap modulokból (12,9–99,8 kDa) rakták össze. Az FA2 (19,5 kDa) N. clavipes selyem és B. mori fibroin szekvenciákból álló szintetikus hibrid proteint szintén vizsgálták. Az expressziós kazettákat azután klónozták a növény két transzformációs vektorába (pGSGLUC1 vagy pBIN19), az így kapott plazmidokat beépítették az Agrobacterium tumefaciens-be. A dohány és a burgonya levelébe való áthelyezés után 30–156 darab, kanamicin-rezisztens növényt kaptak, amelyeket elültettek és vizsgálták a transzgén kifejeződésére.
1. ábra A szintetikus pókselyem gének alapelemei. A: a szintetikus pókselyem gének kialakításakor felhasznált oligonukleotidok szekvenciái; B: a szintetikus oligodezoxiribonukleotidokból előállított génfragmensek vázlata
A szintetikus pókselyemfehérjék felhalmozódása a transzgénikus növényekben Az átalakított, kanamicin-rezisztens növények 31–69%-ában halmozódott fel rekombináns pókselyemfehérje. Az első és második generációs transzgénikus növényeknél normál növekedést és alakot tapasztaltak. A kapott eredmények tehát igazolták a fenti megközelítés általános alkalmazhatóságát. A fehérjék mennyiségét a c-myc toldalékkal jelölt rekombináns selyemfehérjét jelző festés segítségével határozták meg, amelyek meghatározott rend szerinti rekombináns antitest molekulákat hordoznak ugyanazon a végen. A pókselymet leghatékonyabban előállító növények az összes oldható fehérje 2%-ánál nagyobb mennyiségben halmozták fel a pókselymet. A transzgénikus selyemfehérje felhalmozódásának a mértéke nem függ a fehérje méretétől. A proteinek stabilak a növények levelében és az erezetében. Ugyanezeknek a rekombináns pókselyemfehérjéknek a termelődése az E. coli-ban jelentős mennyiségű c-myc-jelölt, kisebb peptideket adott a festés alapján. Az endoplazmatikus retikulum optimális lehetőséget ad a pókselyemfehérjék felhalmozódására a transzgénikus növényekben, amint azt már más transzgénikus fehérjék esetében is kimutatták. A kapott eredmények jelzik, hogy bizonyos növényfajták olcsó biológiai reaktorok lehetnek a pókselyemfehérjék ipari előállításában. A transzgénikus növények által termelt szintetikus pókselyem oldhatósága és hőstabilitása A bioalapanyagok előállításában és a gyógyászatban történő felhasználásuk során a rekombináns pókselyemfehérjéket egyszerű és reprodukálható módszerek segítségével kivonják és oldhatóvá teszik. A folyamatok léptéke növelhető. A transzgénikus növényeket 50 mM trisz, 100 mM NaCl, 10 mM MgSO4 pufferoldattal pH = 8 értéken (oldható extraktumok), illetve párhuzamosan Na-dodecilszulfát pufferral extrahálták. Mindkét pufferral közel azonos mennyiségű szintetikus pókselyemfehérjét nyertek ki. Az első pufferral nagy mennyiségű egyéb dohánylevél-fehérjét is kivontak. Az oldható extraktumokat 10 percen át 95 °C-on hevítették, majd centrifugálták. Meghatározták a folyadékfázis szintetikus pókselyem fehérje tartalmát. Különböző méretű pókselyemfehérje mutatható ki az oldható frakcióban a hevítés előtti extraktumokban levő fehérjékkel összemérhető mennyiségben. Más vizsgálatok eredményével megegyezően megállapították, hogy a rekombináns selyemfehérjék nehezen mutathatók ki a nyers extraktumokban proteinfestő eljárásokkal. A levélproteineknek csak kis mennyisége detektálható a hevítési folyamat után. A proteinek vizsgálati eredményei szerint az oldható levélproteinek több mint 90%-a denaturálódott, és csapadékként kivált a hőkezelés során. A rekombináns pókselyemfehérjék savas közegben oldódtak, a közeg további savanyítása még több fehérje kicsapódását okozta.
A pókselyemfehérjéket szakaszos ammónium-szulfátos csapadékképzéssel dúsították és tisztították. Amint az várható volt, a selyemproteinek csapadékként való leválasztásához szükséges ammónium-szulfát mennyisége a fehérjék méretétől függött. A nagyméretű SO1SO1 fehérjét (99,8 kDa) 20%-os telített ammónium-szulfát oldattal, a kisebb SD1 fehérjét (12,9 kDa) 50%-os telített ammónium-szulfát oldattal lehetett leválasztani. A hőkezelés, a savanyítás és a só formájában való csapadékképzés együttes alkalmazásával a pókselyemfehérjék jelentős mértékű feldúsulását érték el. A pókselyemfehérjék azonosítását és a jelölő peptid lehasadását az N-vég szekvenciáinak vizsgálatával igazolták. A tisztítás ezen lehetőségeinek a léptéke a jövőben növelhető. Következtetések A megújuló biológiai forrásokból előállított alapanyagok alternatívái lehetnek a szénalapú alapanyagoknak. Elterjedésük előfeltétele, hogy elegendő mennyiségben álljanak rendelkezésre, és legyenek megfelelő feldolgozási technológiák. A pókselyemfehérjék felhasználhatók nyersanyagként ipari folyamatokban és a gyógyászat terén használatos rugalmas és könnyű szálak, fóliák és lemezek előállítására. A megfelelő növények alkalmazásával biológiai reaktorként jelentős mértékben megnövelhető az előállított pókselyemfehérjék mennyisége. A növényi szervezet magasabb rendű a baktériumok szervezetéhez képest, és hatékony, ugyanakkor olcsó selyemfehérje-előállítási lehetőséget kínál (a növényi fermentorok költsége 10–50%-a a baktériumalapú fermentorok termelési költségének) és a léptéke könnyen növelhető. Egyszerű tisztítási eljárásokkal könnyen előállíthatók tisztított fehérjeoldatok. Az itt ismertetett vizsgálatok során rekombináns pókselyemfehérjéket sikeresen hoztak létre dohány- és burgonyalevélben és erezetben. A vizsgálatokat kiterjesztették más növényekre is. Ezen anyagok alkalmazhatóságát gátolja még a nyersanyagot intermedier termékekké átalakító technológiák hiánya. Az alkalmazhatóság további feltétele az elegendő mennyiségű, rekombináns pókselyemfehérje előállítása. Fonási kísérletekkel olyan mechanizmusok vizsgálhatók, amelyek alapul szolgálnak a tömény selyemfehérje-oldatok szilárd fázisba való átmenetéhez, így új területek nyílhatnak meg az alkalmazásukban. A pókselyemfehérjék ipari léptékű előállítása új lehetőségeket hoz ezen termékek felhasználásához a mindennapi életben. (Regősné Knoska Judit) Scheller, J.; Gührs, K.: Production of spider silk proteins in tobacco and potato. = Nature Biotechnology, 19. k. 6. sz. 2001. p. 573–577. Hinman, M. B.; Jones, J. A.; Lewis, R. V.: Synthetic spider silk: a modular fiber. = Trends in Biotechnology, 18. k. 4. sz. 2000. p. 374–379.
BUDAPESTI MŰSZAKI ÉS GAZDASÁGTUDOMÁNYI EGYETEM
M B E
ORSZÁGOS MŰSZAKI INFORMÁCIÓS KÖZPONT ÉS KÖNYVTÁR
2002-ben az OMIKK továbbra is megjelenteti a
KÖRNYEZETVÉDELMI FÜZETEK című gyűjteményes kiadványát. A kiadványhoz egyenként 2–4 szerzői ív – 40–70 oldal – terjedelmű szakirodalmi tanulmányok készülnek. A tanulmánycímeket a jegyzék ismerteti. (Felhívjuk szíves figyelmüket, hogy a tanulmányok sorrendje nem jelenti a megjelenés sorrendjét.) A füzetek megrendelhetők egyenként, tetszőleges válogatásban és teljes gyűjteményként is. Az egyes füzetek ára – terjedelemtől függően – 1500–2500 Ft + ÁFA. A teljes gyűjtemény ára a füzetszámból adódó teljes vételár 80%-a. Az elektronikus forma (MS Word dokumentum) ára az aktuális füzetár 90%-a.
A Környezetvédelmi Füzetek 2002. évi tanulmányai 2201 2202 2203 2204 2205 2206 2207 2208 2209
Az EU regionális és strukturális támogatásaiban érvényesülő környezeti szempontok A perspektivikus energiatakarékos technológiák és a kockázati tőke befektetései A vegyipar „responsible care” (felelős gondoskodás) programja Több közegben megjelenő szennyezők kockázatelemzése Környezetvédelem gépipari üzemekben A környezeti felelősség és privatizáció Közép- és Kelet-Európában Városi autóbuszok alternatív üzemanyagai Klímaváltozás és a vízkészletek kapcsolata Szennyvíziszap felhasználásának előnyei és veszélyei
2210 2211 2212 2213 2214 2215 2216 2217 2218
A MTBE (metil-tercier butil-éter) és a talajvíz A kommunális hulladékkezelés energia- és emissziómérlege Szelektív hulladékkezelés és a gazdaságosság Mosószerek, ill. alkotóik a környezetben Szelén a környezetben Arzén a környezetben A faj-, ill. tájdiverzitás fenntartásának támogatása Kadmium a környezetben Gyógyszermaradék a kommunális hulladékban, a megelőzés lehetőségei
Bővebb információ, megrendelés: BME–OMIKK – Műszaki–Gazdasági Kiadványok Osztálya 1011 Budapest, Gyorskocsi u. 5–7. tel.: 457-5322 tel./fax: 457-5323 e-mail:
[email protected] –– – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – –
MEGRENDELÉS Alulírott megrendelem a Környezetvédelmi Füzetek teljes sorozatát (2002) vagy ……………………………………………………………………………………….………….…számait. Megrendelő neve: ……………………………………………………… Tel./Fax: .……………………… Címe: ………………….…………………………………………………………………………………… A megrendelés száma: ………………………………………………….. Ügyintézője: …………..……… A megrendelő pénzforgalmi jelzőszáma: …………………………………………………………..……… Kelt: ..………………………………………………………………………………………………………. (cégszerű aláírás, bélyegző) Szállítási feltételek: legkésőbb a tárgyévet követő év vége.
