BIOSENZORY. Prof. Ing. Miroslav Husák, CSc. Katedra mikroelektroniky ČVUT FEL Praha tel.:

BIOSENZORY Prof. Ing. Miroslav Husák, CSc. Katedra mikroelektroniky ČVUT FEL Praha [email protected], tel.: 2-2435 2267

2

3

4

5

Chemie

Fyzika

Mechanika

Optika Elektronika

6

1. Biosenzor •Biosenzory patří do skupiny chemických senzorů •Využívají vysoké citlivosti a selektivity aktivních biologických látek •Komunikace mezi biologickými organismy je založena na přenosu chemických signálů •Velké množství „bio – rozpoznávacích“ procesů Bvelké množství biosenzorů, např.: Senzory biologicko-chemické Anorganické Buněčné Tkáňové obsahující organismy Historie: První moderní biosenzor byl popsán v práci Clarka a Lyonse. Ti vytvořili první elektrodu s enzymy glukózy a elektrochemicky vázaným kyslíkem. Další biosenzory na principech: chemicky citlivých polovodičů, optických vláken, termistorů, SAW, piezoelektrických jevech a dalších.

7

Obecné schéma biosenzoru A

-

Princip : Chemický +

Biodetekce

Optický

Výstupní signál

Tepelný

A

atd.

+

-

A

A + Biodetekční

Převodník

membrána

2 základní části biosenzoru: Biologicky citlivá „membrána“ - obsahuje biologicky citlivé částice, které rozpoznají analyzovanou molekulu na základě vzájemné reakce, specifické adsorbce nebo na základě dalších chemických či fyzikálních procesů. Převodník na elektrický signál – převádí signál z membrány (chemický - změna koncentrace, fyzikální, optický či tepelný - teplo8 uvolněné při reakci) na výstupní signál většinou elektrický.

Bio-rozpoznávací procesy Rozpoznávání molekul na základě jejich tvaru tzv. tvarověspecifické-slučování. Podstatou této metody je fakt, že vazbu tvoří molekuly, které mají komplementární tvar, tj. chceme-li v prostředí detekovat (analyzovat ) určitou molekulu , použijeme ve snímací membráně molekuly tvarově komplementární. 2 základní bio-rozpoznávací procesy: Slučovací – reakcí bioaktivní a analyzované molekuly se vytvoří velmi silná vazba. Převodník vyhodnocuje přítomnost a množství párů tvořených receptorovou a analyzovanou molekulou. Metabolické - reakcí bioaktivní a analyzované molekuly vznikne jiná molekula. Převodník vyhodnocuje přítomnost těchto molekul, vedlejších produktů nebo teplo vzniklé při reakci. 9

2. Biologická část biosenzoru Látky detekovatelné pomocí biosenzorů Biosenzory lze využít k detekci téměř všech typů látek a reakcí probíhajících v biologických systémech.

Tab. 1 Příklady analyzovaných látek biosenzory

Analyzovaná látka Metabolické látky Enzymy Ligands Antigeny a protilátky Nukleové kyseliny

Příklad Kyslík, metan, etanol a další Glukóza, penicilin, močovina Hormony, feromony, toxiny Lidské Ig. DNA, RNA

10

Detekční látky užívané v biosenzorech Detekční látky – velmi široký rozsah (od jednotlivých molekul až po celé organismy). Tab. 2 Základních typů biologicky citlivých látek, převodních principů a příklady převodníků

Biologické látky Organismus Tkáň Buňka Organická membrána Enzym

Typ převodu Elektrochemický: - potenciometrický - proudový - impedanční Optický

Receptor

Kalorimetrický (termální) Akustický (hmotový)

Protilátky Nukleové kyseliny

Příklad převodníku ISFET nebo mikroelektrody Luminiscence + optická vlákny Termistor Povrchová nebo objemová akustická vlna 11

Detekční látky užívané v biosenzorech Poznámka k Tab. 2: •Látky uvedené v tab. 2 mají prostorově větší strukturu než detekované molekuly. •Obsahují kromě vlastních bio-detekčních molekul ještě látky vhodné k jejich prostorové fixaci (imobilizaci ) v oblasti snímací membrány. •Vytvářejí se tak buněčné a vícebuněčné struktury, které tvoří biologickou část biosenzoru. •V těchto strukturách probíhají chemické reakce s detekovanými molekulami. •Produkty těchto reakcí jsou vstupním signálem pro převodník.

12

2.3 Základní chemické reakce probíhající v biosystémech Biosenzory využívají chemických reakcí k detekci určitých molekul v analyzovaných látkách. Detekovaná molekula reaguje s detekční, biologicky aktivní molekulou biosenzoru 2 základní typy reakcí : a) reakce antigen-protilátka b) katalytická reakce enzym-substrát

13

adt a) Reakce antigen-protilátka Antigeny jsou vysokomolekulární látky bílkovinné povahy, které po podávání vyvolávají v organismu tvorbu specifických protilátek (očkování). Nejdůležitější vlastností je schopnost reagovat pouze s těmi protilátkami, které vznikají po jejich podání. Z toho také plyne vysoká selektivita biosenzoru při detekci těchto látek. Této reakce lze využít jak pro detekci protilátek, kdy detekčními molekulami v biosenzoru jsou antigeny, tak pro detekci antigenů přičemž biosenzor obsahuje protilátky. Základní reakční rovnice: ka Ab + Ag ↔ Ab.Ag Ka = ka = [ Ab . Ag ] kd kd [Ab].[Ag] Ab, Ag látky do reakce vstupující tj. protilátky resp. Antigeny, ka slučovací reakční poměr, kb.rozštěpovací reakční poměr, ka.rovnovážná konstanta, [Ab], [Ag] koncentrace protilátek resp. Antigenů, [Ab.Ag].koncentrace komplexu protilátka- 14 antigen

Vazba antigen-protilátka Princip určení koncentrace detekovaných molekul: [Ab]TOT = [Ag]eq + [Ab.Ag]eq Index TOT označuje celkové množství molekul (v tomto případě protilátek), EQ označuje rovnovážnou koncentraci molekul

Poznámka: Pro určení koncentrace detekovaných molekul (např. protilátek ) je tedy nutné zachovat konstantní koncentraci detekčních molekul (zde antigenů). Toho lze dosáhnout fixací molekul antigenů v oblasti membrány. Převodník pak detekuje množství komplexu antigen-protilátka. Vztah mezi koncentrací detekčních molekul v detekční membráně (zde antigenů) a koncentrací komplexu protilátka antigen: [Ab.Ag]eq =

[Ag]eq _ . [Ab]TOT (1/Ka) + [Ag]eq

15

adt b) Katalytická reakce enzym-substrát Enzymy - jsou jednoduché nebo složené bílkoviny, které v organismu katalyzují a usměrňují metabolické reakce. Substrát - je označení pro druhou látku vstupující do reakce s enzymem. Katalytická reakce – je základní chemická reakce enzymu se substrátem a lze ji zapsat: S+E

k1 ↔ k-1

E.S

k2 → P+E

S značí substrát, E enzym, E.S komplex enzym-substrát, P produkt reakce, k1, k-1, k2 reakční konstanty.

Enzym podílí na přeměně substrátu, přičemž na konci procesu je sám nezměněn a může se zapojit do dalších reakcí – viz rovnice. Poznámka: U živých organismů dochází k opotřebování enzymů a je nutné je doplňovat. 16

2.4 Detekční buněčná membrána umělá biocitlivá struktura Detekční buněčná membrána – uměle vytvořená struktura biologických materiálů k napodobení procesů vznikajících v buněčné membráně. Jeden z nejsložitějších systémů v biosenzoru. Iontové kanály - receptorové detekční molekuly v buňce dokáží rozpoznat jiné molekuly, přitom dojde ke změně permeability membrány. Vzniká iontový kanál, který může být ovládán buď přímo receptory, nebo nepřímo s využitím proteinů. Buněčná membrána je tvořena bílkovinami umístěnými v dvojvrstvě fosfidických molekul (BLM – bilayer lipid membranes – viz. obr). Příčná vodivost je pro ionty velmi malá, bílkoviny mohou i nemusí přemostit tuto dvojvrstvu fosficidů. Princip detekce - jeden z používaných je, že reakcí molekul bílkovin s detekovanými molekulami dojde ke vzniku a přerozdělení iontů, což má za následek vznik potenciálu napříč membránou. Hodnota tohoto potenciálu se obvykle pohybuje v rozmezí 40 - 90 mV. Chemický zesilovač signálu - mnoho biochemických procesů se chová jako „chemický zesilovač signálu“ se ziskem i více než tisíc. 17

Detekční buněčná membrána

18

2.5 Fixace biologicky citlivých elementů, tj. detekčních molekul Fixace tj. udržení biologicky citlivých detekčních molekul na povrchu převodníku je klíčovým faktorem, ovlivňujícím citlivost a životnost biosenzoru. Požadavky kladené na fixaci: •Připoutat biologicky aktivní materiál (detekční molekuly) na povrchu převodníku a zabránit jejich pronikání ven mimo oblast detekční membrány po celou dobu života biosenzoru •Umožnit kontakt analyzovaného roztoku s detekčními molekulami. •Umožnit i zpětnou difúzi molekul analyzovaného roztoku ven z biosenzoru • Nesmí denaturovat biologicky aktivní materiál (detekční molekuly) – materiál je většinou tvořen či obsahuje bílkoviny, které jsou velice citlivé na změnou pH, mechanické poničení, teplo, chlad, chemické látky). Poznámka: Denaturace je změna struktury bílkovin, bílkoviny tak ztrácejí své původní biologické vlastnosti 19

Základní typy fixačních technik Fixace fyzickým držením - spočívá v separaci biologicky aktivní detekční látky od analyzovaného roztoku separační vrstvou na povrchu biosenzoru. Vrstva je propustná pro analyzovaný roztok oběma směry, pro biologicky aktivní detekční látku se ale chová jako nepropustná stěna. Používané typy: a) membránové zachycení (pomocí polopropustné membrány) b) maticové zachycení Fixace chemickou vazbou - jedná se buď o přímé připojení biologicky aktivních detekčních molekul k povrchu převodníku nebo o chemické navázání spodní vrstvy detekční membrány a povrchu převodníku. Nejpoužívanější typy: c) adsorbce d) kovalentní vazba 20

Základní typy fixace Polopropustná membrána (selektivně propustná)

membrána

Převodník

Převodník

Převodník

Převodník

Obr.3 Základní fixace bioaktivních elementů a) zachycení membránou, b) zachycení v membránových maticových pastích, c) adsorpcí do materiálu membrány, d) kovalentní vazbou B označuje bioaktivní molekuly 21

adt a) Fixace polopropustnou membránou Princip - použití selektivně propustné membrány, umístěné kolem biologicky aktivního materiálu obsahujícího detekční molekuly. Membrána umožní difúzi analyzované látky k detekčním molekulám a zároveň dovolí výstup analyzované látky zpět ven z biosenzoru. Současně membrána nedovolí detekčním molekulám jejich difúzi ven z biosenzoru. Materiál membrány - porézní materiál s dostatečně velkými póry aby jimi prošly částice zkoumaného roztoku (detekovaná molekula) dovnitř, a zároveň malými pro biologicky aktivní materiál (detekční molekuly), aby se nedostaly ven. Obvykle se selektivní membrány vyrábějí z polymerů, polyamidů nebo polyester sulfonů. Selektivně propustná membrána B

B

B

B

B B

B

B

Převodník

22

adt b) Zachycení v membránových maticových pastích Princip - použití porézního objemového materiálu na povrchu převodníku biosenzoru. V materiálu jsou rovnoměrně maticově rozmístěny a drženy biologicky aktivní detekční molekuly (což mohou být enzymy, antigeny nebo celé buňky) Materiál - Pro velikosti pórů tohoto materiálu platí stejná pravidla jako u selektivní membrány v předchozím případě. Materiál musí umožňovat difůzi zplodin, vznikajících při reakcích. Materiálem je obvykle porézní gel, přírodní materiály popř. netoxické syntetické materiály. Materiál nesmí být toxický vůči bioaktivní detekční látce, ani produkovat škodliviny při polymerizaci. B

B

B

B

B

B

B

B

Převodník

23

adt c) Fixace adsorpcí Adsorbce – označuje proces hromadění molekul jedné látky na povrchu druhé. Realizace - povrch převodníku biosenzoru je po určitou dobu ponořen v roztoku s bioaktivní látkou. Po vyjmutí a omytí od zbytků roztoku je biosenzor realizovaný. Mechanismy fixace - Biologicky aktivní detekční molekuly jsou na povrchu převodníku drženy kombinací Van der Wallsových sil, hydroponických sil a iontové vazby. Bioaktivní detekční molekuly B

B

B

B

B

B

B

B

B

Membrána

Převodník

24

Fixace adsorpcí Fixační vazby s různými silami Nejednotnost v mechanizmech vazby je dána strukturou biologicky aktivních detekčních molekul. Detekční molekula je často tvořena velkým komplexem rozdílných částic jako např. bílkovin, karbohydrátů apod.. To je důvodem, proč je každá část detekční molekuly vázána k převodníku jinou silou. Výhoda jednoduchost i fakt, že síly, které vážou detekční molekuly k povrchu převodníku jsou relativně mírné. Díky tomu nedochází ke změně tvaru molekul, což by mohlo mít za následek ztrátu jejich bioaktivní detekční funkce. Nevýhody síla vazby je silně závislá na teplotě, koncentraci analyzované látky , pH apod. Je obtížné při výrobě určit jaké množství bioaktivních detekčních molekul se skutečně na povrchu převodníku zachytí.

25

adt d) Fixace kovalentní vazbou Kovalentní vazba - je silnější vazbou než adsorbce, umožňuje trvalejší vazbu mezi detekčními molekulami a povrchem převodníku. Povrch převodníku musí v tomto případě obsahovat molekuly schopné vytvořit kovalentní vazbu s detekčními molekulami.

Bioaktivní detekční molekuly

Kovalentní vazby B

B

B

B

B

B

B

B

B

Převodník

26

Fixace kovalentní vazbou Výhody •Detekční molekuly bioaktivního materiálu jsou přímo na povrchu převodníku a tím se zkracuje časová odezva biosenzoru, neboť zde odpadá difuze analyzované látky do fixační struktury, jak je tomu u metod fyzického držení. •Vazba je silnější a díky tomu je i delší životnost biosenzoru. Hlavní nevýhoda Vazba je mnohdy natolik silná, že mění její prostorové uspořádání, tím se molekule mění i její chemické vlastnosti a může dojít částečné nebo úplné ztrátě schopnosti detekovat.

27

2.6 Transport látek v biosenzorech Biosenzor je vlastně bioreaktor spojený s převodníkem. Transport látek v biosenzorech ovlivňuje funkci biosenzoru. Typy transportu v biosenzorech: • transport analyzované látky k membráně • transport produktů reakce k převodníku • transport analyzované látky a vedlejších produktů ven z biosenzoru Základních fyzikální principy transportu : • Difúze • Proudění • Migrace Poznámka: Migrace částic se většinou zanedbává, její přínos k celkovémui proudění látky je zanedbatelný. Proudění analyzované látky je zajišťováno jinými způsoby než samotným biosenzorem.

28

Difúze Difúze - nejdůležitější princip transportu látek v biosenzorech. Uplatňuje se při prostupu analyzované látky snímací membránou oběma směry (tok částic z jednoho prostředí do druhého). Je popsána Fickovým difuzním zákonem j(x , t) = - D . d c( x , t ) dx j(x,t) - tok částic plochou, c(x,t) – koncentrace, D - konstanta úměrnosti, označovaná jako difuzní koeficient. Difuze je přímo úměrná gradientu koncentrace analyzovaných molekul, který je největší v místě styku analyzované látky a biologicky aktivního materiálu na povrchu biosenzoru. Velikost zpoždění resp. časové odezvy biosenzoru je právě závislá na rychlosti difúze analyzované látky do detekční membrány. Zmenšení doby časové odezvy - tenčí membrány (doba difuze je přímo úměrná tloušťce membrány). Citlivé biosenzory - je nutná tlustá detekční membrána, protože 29 tloušťka membrány je dána počtem detekčních molekul.

3. Principy snímání reakcí na bioaktivních elementech - převodníky Převodní principy biologické detekční reakce na měřitelný signál V biosenzorech se používá mnoho metod pro převod signálu z biologické snímací membrány na zpracovatelný signál Neexistuje ideální metoda snímání, která by byla ideální pro všechny způsoby biorozpoznávacích procesů. Základní používané typy převodu: •Elektrochemický a) Potenciometrický (potenciálový, napěťový) b) Amperometrický (proudový) c) Impedometrický (impedanční) •Optický •Tepelný •Rezonanční Příklad ISFET potenciometrický senzor je vhodný jako převodník pro enzym-substrát reakci, naproti tomu nevhodný pro antibody-antigen 30 absorpční rozpoznávání.

3.2 Elektrochemický převod signálu •Elektrochemický princip převodu biochemické detekční reakce na elektrickou veličinu •Signály získané měřením pomocí tohoto principu z biologicky rozpoznávací reakce mohou být přímo zpracovávány a použity k vyhodnocení biologického systému •„elektrikářské“ metody

31

3.2.1 Potenciometrický princip převodu Princip převodu - je založen na měření napětí napříč buňkou, která obsahuje biologicky aktivní detekční molekuly (bezproudové měření rozdílového potenciálu mezi měřicí a referenční elektrodou, jejíž potenciál na styku s roztokem elektrolytu je nezávislý na koncentraci iontů) Definice měřeného napětí - je definováno jako potenciální rozdíl pracovní elektrody s biologicky aktivními detekčními molekulami proti referenční elektrodě Referenční elektroda - má konstantní potenciál Ideální případ - buňkou neteče žádný proud a elektrody jsou v termodynamické rovnováze. Oxidačně redukční reakce – tvoří základ potenciometrického principu převodu i principů dalších: Ox + n.e ↔ Re Ox - částice v oxidované formě, Re - částice v redukované formě, e - náboj elektronu, n - počet elektronů v reakci 32

Potenciometrický princip převodu Nerstův vztah určuje napětí napříč buňkou V = V0 + R.T . ln ( aOx) n .F aRe V0 - příčné napětí na buňce bez přiložení analyzované látky, R - plynová konstanta, T - termodynamická teplota, F - Faradayova konstanta, Ox,Re - aktivity oxidované resp. redukované formy (za normálního stavu aOx = aRe). Nevýhoda – vysoká citlivost na šum. Detekční buňkou neprotéká téměř žádný el. proud, systém má vysokou vnitřní impedanci. Zesilovač příčného napětí na buňce bude muset mít proto vysokou vstupní impedanci - vysoká citlivost na šum. (nutné používat speciální elektrody, stíněné kabely...)

33

Potenciometrický princip převodu Typická potenciální senzorová elektroda ISE (iontová selektivní elektroda) ISFET (ion-selektive field-effect transistor). Výhodou ISFETu je impedanční přizpůsobení přímo na čipu (převod do proudového režimu), takže výstupní signál je méně náchylný šumu. ESFET (enzyme field-effect transistor). Je nutná konstantní teplota, pH a iontová koncentrace během měření. Fixace detekčních molekul pro roztoky - používají se všechny dříve uvedené techniky Fixace detekčních molekul pro plyny - nejčastěji se používá fixace pomocí selektivní membrány. Měřicí rozsah - obecně 0.00001 až 0.1 mol / l. Stabilita - řádově týdny až měsíce. Příklady – potenciometrické biosenzory jsou vyráběny pro detekci sledovaných molekul jak v roztocích tak též v plynech (např. čpavek, moč, glukóza, aminokyseliny). 34

Potenciometrický princip převodu Příklad - potenciometrický biosenzor pro detekci v plynech

Iontová selektivní elektroda

Vrstva enzymů

Dialyzační membrána

35

Příklady polovodičových biosenzorů Polovodičové senzory •Rychlý rozvoj (nízká cena, a relativní přesnost) •Technologie unipolárních tranzistorů MOSFET •Modifikované struktury MOS A) MOSFET tranzistor (Metal Oxid Semiconductor Field Effect Transistor) Struktura kov-izolant-kov (SiO2, TiO2 nebo ZnO) Příčným elektrickým polem řídí vodivost kanálu v substrátu mezi elektrodami (kolektorem a emitorem) Elektrické pole je dáno potenciálním rozdílem mezi hradlem a substrátem.

36

CHEMFET senzory CHEMFET (Chemically Sensitive Field Effect Tranzistor) Řízení hradla - elektrickou dvojvrstvou na rozhraní kov-polovodič v závislosti na absorpci některých plynů. Absorpční kov hradla - nejčastěji Pb (citlivé na vodík a na plyny, z nichž je možné vodík odštěpit (H2, H2S, NH3 aj). Princip činnosti - molekuly H2 se na povrchu hradla rozkládají, disociované atomy se absorbují a dále difundují až na rozhraní kov-oxid. Zde se vytváří dipólová vrstva, která ovlivní vodivosti kanálu FET struktury. Chemické katalytické reakce na Pb vrstvě jsou ovlivňované i oxidačními plyny, proto lze senzory používat i pro detekci O2, Cl2 nebo při vyšší teplotě i pro redukční CO ve směsích s H2. Příklad – měření množství H2 (2 typy senzorů) a) MOS kondenzátor - k vyhodnocení používá C resp. U při konstantním napětí resp. kapacitě. b) CHEMFET - vyhodnocuje se posuv charakteristiky Ic = f (UGE) při UCE = konst. 37

Příkl. - senzory pro vyhodnocování H2

MOS kondenzátor

CHEMFET

38

ISFET senzory (The Ion Sensitive FET) Hradlová oblast – je vytvořená na přechodu elektrolyt - iontově citlivá vrstva (ve vrstvě dochází k elektrochemické reakci měřených iontů) Referenční elektroda - vložena spolu se senzorem do elektrolytu Citlivá vrstva hradla – volbou lze dosáhnout selektivity na určitý iont nebo molekulu. Selektivitu lze dále zlepšovat nanesením selektivně propustné membrány, která propouští k vrstvě oxidů pouze vybraný druh iontů (Na+, Ca2+, K+, Cl-, NH4+, NO3-). Nejčastější aplikací ISFET senzorů je senzor pH s iontově citlivou vrstvou z SiO2, nebo Ta2O5. 39

Struktura senzoru ISFET

40

REFET senzory (The Reference FET) Modifikovaný senzor ISFET Oxid na povrchu hradlové oblasti je upraven tak, aby byla maximálně potlačena citlivost na pH. Docíleno pomocí iontové implantace do oxidu nebo přidáním krycí vrstvy (např. Parylen). Použití - například jako referenční ISFET v diferenciálních měřicích obvodech.

41

IMFET senzory (The immuno FET) ISFET s přizpůsobeným povrchem hradlové oblasti pro sledování množství protilátek a antigenů v měřené látce. Protilátky a antigeny jsou absorbovány nebo kovalentně vázány na povrch IMFETu. Posuv prahového napětí tranzistoru - je způsobeno reakcí s antigeny nebo protilátkami

42

BIOFET senzory Chemický konvertor nahrazen biochemickým nebo tzv. bioreaktorem. Ten obsahuje různé druhy biologicky aktivních látek, včetně bakterií, celých buněk a živých tkání. Biologický reaktor si lze představit jako biologický receptor, který může velice selektivně monitorovat chemické nebo biochemické látky. U tohoto typu senzoru se předpokládá veliký rozvoj

43

3.2.2 Amperometrický princip převodu Princip - amperometrické biosenzory měří el. proud procházející snímací elektrodou, která je pokryta biologicky aktivní detekční látkou. Velikost procházejícího proudu je závislá na koncentraci detekovaných molekul. Princip je založen na oxidaci a redukci biologicky aktivních materiálů (většinou enzym) na povrchu elektrody. Nosiče náboje vzniklé touto reakcí jsou snímací elektrodě předány buď přímo nebo nepřímo pomocí další látky tzv. prostředníku. Fixace - využívá všech čtyř typů fixace detekčních molekul. Navíc se většinou používá ochranná membrána kolem bioaktivní vrstvy, která zabraňuje nežádoucím bílkovinám z analyzovaného prostředí ve vstupu do aktivní vrstvy (zabraňuje možnost interferencí detekčních bílkovinných molekul s cizími bílkovinami a tím zhoršení vlastností biosenzoru). Elektrochemická snímací elektroda je obvykle vyrobena z Pt, Au nebo různých forem C. V současnosti se provádějí pokusy s vodivými organickými solemi, coby snímací elektrodou, které mají lepší mechanizmy přesunu elektronů z enzymu do elektrody. 44

První „generace“s ampérometr. převodem 1.Generace – využívá se převodu biologických reakcí na oxidaci a redukci u povrchu elektrochemické elektrody. Základem je enzymaticky katalyzační reakce. Biologicky aktivní materiál (enzym) převede analyzovanou molekulu přímo na produkt, který může v oxidačně-redukční reakci odevzdat do biologicky aktivní elektrody el. náboj. Nevýhoda – existuje málo materiálů, jejichž produkty mohou přímo redukovat (např. kyslík, hydrogen a hydrogen peroxid) Příklad - Clarkova kyslíková elektroda která měří množství spotřebovaného kyslíku při reakci s glukózou. CR red

S

Analyzovaný roztok

P

CR ox

P

CR ox

Membrána CR red

S

E

CR red

CR ox

CR red

CR ox

Elektroda

2e-

CRred, CRox - redukovaná resp. oxidovaná forma koreaktantu S, P - analyzovaná molekula resp. její produkt E - enzym ve funkci bioaktivní detekční látky 45

Druhá „generace“s ampérometr. převodem 2.Generace - používá pomocnou látku, tzv. prostředníka pro přenos elektronů z enzymu. Princip - enzym reaguje s analyzovanou molekulou (substrátem) a převede ji na produkt. Přitom sám přejde z oxidační formy do redukční. Při reakci z prostředníkem pak enzym přejde zpět do výchozí formy a je schopen opět reagovat se substrátem. Prostředník při této reakci naopak přejde z oxidační formy do redukční. Při návratu prostředníku do oxidační formy dochází k uvolňování elektronů, které přejdou do Analyzovaný roztok S P snímací elektrolytické elektrody. Ered, Eox - enzym v redukované Membrána resp. oxidované formě S P S - substrát (analyzovaná E red E ox molekula) M red M ox P - produkt Mred, Mox - prostředník v redukované resp. oxidované Elektroda 2e46 formě

Třetí „generace“s ampérometr. převodem 3.Generace - má modifikovanou elektrochemickou snímací elektrodu. Do jejího povrchu jsou přidány molekuly, které dovolují přímou oxidaci resp. redukci enzymu u elektrody. Jednodušší - výroba elektrody je jednodušší, není potřeba prostředníku (zprostředkovatelských molekul). Materiály modifikující snímací elektrodu – nejčastěji vodivé Analyzovaný roztok organické soli. S P Membrána S

P

E red

Modifikovaná Elektroda

E ox

2e47

Tři „generace“s ampérometr. převodem Závěr: Detekční enzymy - používá se mnoho typů Detekovatelné látky - např. glukóza, moč, cholesterol, fruktóza a ethanol Citlivost - v rozsahu až mol/l, tj. spodní detekovatelná mez Lineární odezva - rozsahu až mol/l má amperometrický biosenzor lineární odezvu v závislosti na koncentraci.

48

Amperometrický princip - prakticky Měření proudu procházejícího mezi dvěma elektrodami ponořenými do roztoku elektrolytu Napájení obvykle stejnosměrným napětím Polarizována elektroda - označována jako pracovní, měřicí, nebo jako katoda, např. Pt, Au Nepolarizovatelná elektroda - označovaná jako vztažná nebo jako anoda, např. Pb, Ag/ AgCl, Zn aj. Depolarisér (energetická bariéra) – se vytváří na rozhraní mezi roztokem a měřicí elektrodou chemickou reakcí v roztoku do kterého jsou elektrody ponořeny. Způsobuje nevodivost roztoku při malém vstupním napětí. Při zvyšujícím napětí se zde uplatňuje difúzní proud, takže proud stoupá prakticky lineárně s napětím. Až při určité hodnotě napětí je proud konstantní – označuje se jako proud difúzní ID

nFDiS ID = ci d

N - počet elektronů v chemické reakci, Di difúzní koef. (teplotně závislý), S - plocha měřicí 49 elektrody, d - tloušťka difúzní vrstvy

Amperometrický princip - prakticky

Ampérometrický měřicí řetězec ME - měřicí elektroda, SE - referenční elektroda 50

Příklad - senzor O2 Pevný elektrolyt - Zr O2. Princip - O2 vniká do elektrolytu difúzním procesem. Na měřicí elektrodě se katalyticky transformuje do iontové formy. Ionty procházejí elektrolytem a na druhé elektrodě se chemickou reakcí opět uvolňuje O2. Senzor se zde chová jako ”kyslíková pumpa”.

51

3.2.3 Impedometrický princip Impedometrická detekce - měří frekvenční odezvu malé signálové impedance elektrochemické snímací elektrody a biologicky aktivního materiálu. Metoda vykazuje vysoké hodnoty poměru signál/šum a proto je vhodná pro měření velmi malých signálů (tj. velmi malých koncentrací analyzovaných molekul). Použití - není používaná v komerčních aplikacích biosenzorů, protože výsledky lze obtížně získávat (složitá analýza dat). Využívá se zatím jen laboratorně pro určování struktur a procesů probíhajících v elektrochemické elektrodě a jejím okolí. 52

Impedometrický princip Modelování struktury - pomocí pasivních prvků (ekvivalence fyzikálních procesů probíhajících na elektrodě – obr. vlevo Rozhraní s kovovou elektrodou - náboj na rozhraní elektrody s roztokem je ve dvou vrstvách. Na povrchu elektrody jsou absorbované anionty, tvořící vrstvu IHP (inner Helmholtz plane). Druhou vrstvou OHP (outer Helmholtz plane), jsou neabsorbované ionty, které jsou drženy elektrostat. silami k elektrodě – obr.vpravo Cd

Rct

Rw

Cw

Rsol

Ekvivalentní obvod elektrochemické elektrody - Rct – odpor přechodové vrstvy z elektrody do roztoku, Cd – kapacita vznikající mezi kovem a roztokem, Rw, Cw – prvky reprezentující impedanci vlivem transportu hmoty, Rsol – odpor roztoku. 53

3.3 Optický převod signálu Optická detekce - zahrnuje měření změn optické absorbce nebo optické emise způsobených přítomností analyzovaných molekul. Uvedené změny se projeví jen v určitých oblastech spektra. Nejběžnější oblasti jsou : infračervená (IR) a ultrafialová viditelná (UV - VIS), které se používají jak při optické absorbci tak při optické emisi. Dvě metody: a) přímá optická detekce b) nepřímá optická detekce

54

adt a) přímá optická detekce Princip - analyzované molekuly v biosenzoru reagují s biologicky aktivními částicemi tzv. receptory, dochází ke sloučení analyzované molekuly a receptoru: A + R ⇔ A.R Kr = [ A.R ] [A][R] A,[A] - analyzovaná molekula resp. její koncentrace, R,[R] - volný receptor, resp. jeho koncentrace (celkové množství R v biosenzoru je konstantní) [R]celk = [R]eq + [A.R]eq eq značí rovnovážnou koncentraci. Optický tok - je přímo závislý buď na rovnovážné koncentraci vzniklé sloučeniny A.R: [A]eq _ . [R]celk [A.R]eq = _ (1/Kr)+[A]eq nebo na koncentraci volných receptorů : [R]eq = _ 1 _ . [R]celk (1/Kr)+[A]eq 55

adt b) nepřímá optická detekce Princip metody - využívá principu tzv. konkurenční chemické vazby. Jedná se o to, že v bioaktivní části biosenzoru jsou jak molekuly receptorů, tak tzv. analog molekuly. Tyto fluorescenční molekuly mají podobnou strukturu jako molekuly analyzované a taktéž vytvářejí vazbu s receptory.Rozdíl je v tom, že vazba analog-receptor je slabší. Optické vlákno Analyzovaná molekula Fixovaná detekční molekula

L L A

A

L A L

L

A

Fluorescenční analog. molekula

L L

L Optická cesta

56

nepřímá optická detekce Princip činnosti - za nepřítomnosti analyzovaných molekul jsou všechny analog molekuly vázány s receptory a optický tok procházející optickou komorou biosenzoru není ovlivňován. Jakmile proniknou analyzované molekuly do optické komory, tak začínají nahrazovat ve vazbách analog molekuly. Fluorescenční analog molekuly jsou vytlačovány do prostoru optického paprsku a začínají jej zesilovat. Procházející optický signál je tedy přímo úměrný počtu analyzovaných molekul a jeho změny se měří optoelektronickými detektory Příklad - biosenzor s nepřímou optickou detekcí - senzor na určování glukózy v dialyzační trubici.Jako receptor je použit konkavanalin-A, který je fixován přímo na stěně dialyzační trubice. Funkci analog molekuly plní fluorescenčně obarvený cukr FTIC dextrin. Jakmile glukóza difunduje do trubice, nahradí ve vazbě dextrin. Ten pak začne v optické komoře zesilovat procházející optický signál.

57

3.3.3 Vlastnosti optických biosenzorů Výhody optických biosenzorů v porovnání s elektrochemickými : •Referenční elektroda - není potřeba. Využívá se referenční intenzity optického záření pro minimalizování vlivů okolního prostředí. •Imunní vůči elektrickému šumu •Multidetekce - nezávislé detekování více typů analyzovaných molekul. Jako analog molekuly se použijí látky různých barev a měření procházejícího optického signálu se provádí na různých vlnových délkách. Základní typy optických biosenzorů : a) Optické vláknové biosenzory – optody (dnes nejpoužívanějsí) - měření velikosti zpětného optického signálu - měření útlumu vlákna (Měření evanescentní vlnou) b) Na bázi fluorophoru a chromophoru c) Bioluminiscenční a chemiluminiscenční 58

Optické vláknové biosenzory s měřením velikosti zpětného optického signálu Princip - na konci optického vlákna je bioaktivní barvivo nebo fluorophor. Selektivně propustná membrána je vytvořena okolo bioaktivního materiálu. Měření – velikost optického signálu procházejícího zpětně do Druhé části vlákna určuje množství analyzovaných molekul.

ØOUT

Optické vlákno

Bioaktivní materiál

ØIN Membrána 59

Optické vláknové biosenzory s měřením útlumu vlákna Princip - optické vlákno je na určité délce zbaveno pláště a pokryto bioaktivním materiálem Množství analyzovaných molekul mění velikost útlumu vlákna Vlnové délky - optické vlastnosti jsou omezeny použitelnou vlnovou délkou optického vlákna. Tím je limitována možnost použití některých bioaktivních detekčních barviv. plastová - 450nm Plášť Membrána Optické vlákno skleněná - 380nm

Jádro

Bioaktivní materiál

Vázané receptory

Zdroje záření - LED, laser Detektory záření - fotodiody a fototranzistory Výhody - relativně levné, výrobně nenáročné, malý odběr

60

3.3.5 Optické biosenzory na bázi fluorophoru a chromophoru Princip - změna optické fluorescence resp. absorbce, způsobené změnou koncentrace analyzovaných molekul. Bioaktivní detekční materiál - jsou molekuly fluorophoru resp. chromophoru, jejichž fluorescence resp. absorbce se na určitých vlnových délkách mění když tyto molekuly oxidují. Použití – např. zjišťování pH, určování přítomnosti čpavku či kyslíku.

61

3.3.6 Optické biosenzory na principu bioluminiscence a chemiluminiscence Princip - použití bioluminiscenčních a chemiluminiscenčních molekul v biosenzorech Nejnovější metoda Největší dosud známá citlivost (řádově pikomoly) Vznik světla v biologicky aktivním materiálu: O2 Luciferin + Luciferase ↔ Oxyluciferin* H2O Oxyluciferin* → Oxyluciferin + světlo Luciferin - molekula, která emituje světlo Luciferase - enzym, který oxiduje luciferin do excitovaného stavu62

Příklad - Fluorescenční senzor Například senzor typu ENFET (Enzym FET). Fixační vrstvička enzymu na membráně zajištuje potřebnou selektivitu B je citlivý pouze na určité typy iontů. Příklad - fluorescenční princip využívaný pro analýzu žijící biomasy v enzymu. Zářivý tok z ultrafialového zdroje záření UV (360 nm) je optickým vláknem veden do chemické reaktivní komory s biomasou. UV záření reaguje se specifickými molekulami biomasy - interakcí záření s hmotou dochází k fluorescenci. Vyhodnocování - fluorescenční tok se z důvodu potlačení teplotních chyb vyhodnocuje poměrově při dvou různých vlnových délkách.

63

Příklad - Fluorescenční senzor Chemická reaktivní komora s biomasou

64

3.4 Tepelný převod signálu Tepelná detekce měří entalpii detekované reakce. Teplotní senzor – používají se termistory, umístěné v tepelně izolovaných kalorimetrech. Bioaktivní detekční látka – (jedná se obvykle o enzymy) je fixována na skleněných korálkách uvnitř kalorimetrické trubice. Princip činnosti - analyzovaný roztok teče nejprve přes tepelný výměník, kde získá počáteční teplotu a teprve pak postupuje do kalorimetrické trubice. Teplotní senzor měří teplotu roztoku vytékajícího z trubice. Měřený elektrický parametr termistoru je přímo úměrný a lineární k množství analyzovaných molekul. Rozlišovací schopnost termistoru - 0.01°C.

65

Tepelný převod signálu Celkové teplo uvolněné v chemické reakci enzymu a analyzované molekuly je přímo úměrné molární entalpii : Q = - n . ∆H n - počet molů výsledného produktu chemické reakce, ∆H - změna molární entalpie. Výsledná změna teploty systému : ∆T = Q = -n.∆H Cs Cs Cs - tepelná kapacita systému Enzymatické reakce uvolňují velké množství tepla a proto jsou pro tepelnou detekci vhodné. Citlivost tepelných biosenzorů - v rozsahu až mol/l pro enzymatické katalytické reakce. Nevýhody: •Větší rozměry než ostatní typy biosenzorů •Složité udržování konstantní teploty analyzovaného roztoku •Interference chemických reakcí a procesů v kalorimetru, které snižují množství uvolněného tepla. 66 Výhoda - velký rozsah lineární odezvy a velká ampl. výstup. signálu

3.5 Rezonanční převod signálu Rezonanční metoda – převod biochemických detekčních reakcí na elektrickou veličinu je založen na změně rezonanční frekvence mechanického rezonátoru. Změna rezonanční frekvence – je způsobena adsorbcí analyzovaných molekul na povrchu biologicky aktivní membrány převodníku. Dva základní typy rezonátorů : a) Oscilátor s objemovou vlnou (BAW) b) Oscilátor s povrchovou akustickou vlnou (SAW)

67

adt a) Oscilátor s objemovou vlnou (BAW) Piezoelektrický krystal - základ převodníku U krystalu lze velmi přesně změřit změnu rezonanční frekvence: ∆f/f < 10-5 až 10-6 Rezonanční kmitočet krystalového oscilátoru : fo = N = N.ρ.A d m N - frekvenční konstanta 0.167 MHz.cm-1, ρ - hustota krystalu, A plocha krystalu, d - tloušťka krystalu, m - hmotnost krystalu. Při detekování analyzovaných molekul dochází ke vzniku vazby mezi analyzovanými molekulami a bioaktivní látkou umístěnou na povrchu krystalu. Tím dochází k adsorbci analyzovaných molekul na povrchu krystalu a tím vlastně ke zvětšování jeho hmotnosti o ∆m. Pro změnu rezonanční frekvence v důsledku uvedené adsorbce, za předpokladu ∆m<< m, platí : ∆f = - fo ∆m = -2,3*10-6 * fo2 ∆m m A 68 m, ∆m [g], fo,∆f [Hz], A [-]

adt b) Oscilátor s povrchovou akustickou vlnou (SAW) Oscilátor s povrchovou akustickou vlnou - 2 hřebenové elektrody. Konstantního zpoždění signálu při přechodu z jedné elektrody na druhou. Velikost zpoždění - zvětšování zpoždění při přechodu signálu mezi elektrodami a díky tomu ke změně rezonanční frekvence v důsledku adsorbce analyzovaných molekul. Změna rezonanční frekvence : ∆f = (k1 + k2). ∆m A k1, k2 - materiálové konstanty SAW substrátu. Použití BAW a SAW - hlavně pro detekci plynů (anorganických a organických). Okrajově pro detekci v roztocích problémy (dochází k velkému rozptylu energie z oscilátoru do roztoku a to často dokonce znemožní vznik oscilací). 69

Pouzdření biosenzorů Pouzdro má zajistit: 1) Ochrana systému biosenzoru před vlivy prostředí •elektrická izolace, ochrana před vlhkem •mechanická ochrana pro zachování vnitřní struktury a objemové stability •optická a tepelná ochrana před ovlivňováním signálu •chemická izolace 2) Ochrana prostředí před účinky materiálu biosenzoru •pouzdro a funkce senzoru takové, aby nevznikali toxické produkty •použitý materiál je inertní k prostředí •možnost sterilizace senzoru 70

Příklady pouzdření biosenzorů a) Struktura ISFET. Cesty od D a S jsou vytvořeny difůzí pod SiO2. Kontaktní plochy jsou pasivovány silikonovou gumou nebo epoxidem. Povrch může být ošetřen polymerem zamezujícím pronikání vlhkosti do struktury. b) boční pohled na uspořádání kontaktů ISFETu. Přední strana je pokryta SiO2. Kontakty jsou vedeny skrze substrát. c) „ Skryté “ přívody k elektronickým obvodům vyhodnocujícím signál senzoru d) Vícevrstvové pouzdro s kontakty chráněnými pod křemíkovou vrstvou a aktivní oblast senzoru. Použitím různých membrán lze vyrobit více senzorů pro detekci různých látek na jednom substrátu. e) Mikrokomůrka sloužící k ochraně bioaktivní části senzoru před nárazovými vlnami měřeného roztoku a množstvím proteinů. 71 f) Vícevrstvá ochranu biosenzoru

Aplikace BIOSENZORŮ Měření pH Hodnota pH se používá k analýze kyselosti nebo zásaditosti roztoků. Pohybuje se v rozsahu od hodnoty 0 do 14. Destilovaná voda pH = 7, roztoky s pH > 7 jsou zásadité, s pH < 7 jsou kyselé. Základní princip měření pH: dvě elektrody ponořené do elektrolytu. Měřicí a referenční elektroda vytvářejí při ponoření do elektrolytu elektrický článek Napětí článku je dáno rozdílem potenciálů na obou elektrodách

72

Měření pH Proudové zatížení článku - I < 10-12 A, odpovídá vnitřnímu odporu zesilovače Ri > 1012 Ω. V současné době se obě elektrody vyrábějí v jediném pouzdru. Vzhledem k teplotní závislosti potenciálu na teplotě je nutné měřící řetězec doplnit senzorem teploty. 1 - měřicí skleněná elektroda 2 - srovnávací kalomelová elektroda 3,4 - vnitřní elektrody 5 - pH citlivá membrána z křemičitého skla 6 - roztok (pufer) s pevně definovanou hodnotou pH 7 - nasycený roztok 8 - diafragma (nekovové a iontově propustné spojení s analyzovaným roztokem elektrolytu)

73

Senzory pro měření glukózy v krvi Klasický způsob měření pomocí dvou elektrod (první elektroda z Pt a druhá z Ag, nebo AgCu. membrána umístěná před těmito elektrodami .

Konstrukce - senzory glukózy mohou být konstruovány například jako jádro jehly. .Takže pouhým vpichem mužeme analyzovat stav glukózy v krvi

74

Senzory pro měření glukózy v krvi Senzory ISFET (BIOFET) V oblasti hradla se nachází speciální enzymová membrána, která selektivnì reaguje na množství glukózy v měřeném rostoku.

Senzor glukózy

Biosonda glukózy - Sonda na měření glukózy je vyrobena na tenké destičce plošného spoje. 75

Katetrizační technika Katetr - se skládá z pružné tenké trubičky, která lze vsunout do některé z větších žil člověka. Pomocí katetru dokážeme diagnostikovat aktuální stav krevního řečiště v určitém místě, popřípadě i určitého orgánu (např. části srdce). Na konci katetru může být umístěna sonda na zjišťování O2, CO2, pH, teploty, nebo tlaku. Princip těchto senzorů je prakticky totožný s těmi, které byly vysvětleny v předešlé části textu.

76

Biosenzor umístěný v katetru

První oválné okénko zajišťuje kontakt senzoru s měřenou látkou (krví). Druhým okénkem lze do daného místa přivádět například infusi.

77

Biosenzor umístěný v katetru

78

SMART Biosenzory pro implantáty Implantáty biosenzorů - jsou operativně umístěny na příslušné místo lidského těla (nejčastěji biosenzory O2 a glukózy) Přenos signálu - je zde řešen elektromagneticky. Implantovaný blok - pod kůži označený GTS1c slouží pouze k předspracování signálu. Vyhodnocení signálu a uložení výsledků do paměti řeší vnější zařízení. Toto oddělení obou částí má výhodu jak minimalizování velikosti implantovaného zařízení, tak v snadnější stabilizaci a teplotní kompenzaci funkce vnějšího zařízení (především mikroprocesoru). Pomocné zařízení v kardiostimulátorech - senzory se začínají používat například jako pomocné zařízení v kardiostimulátorech pro sledování správné funkce organismu 79

Telemetrický systém pro měření množství glukózy v krvi

Blok GTSc je implantován pod kůži

80

Telemetr. systém pro měření množství glukózy v krvi - hybridní blok ”GTS1c”

81

The Problem of Diabetes 14 million people affected in the US 4.6% of the US population 15% of the healthcare costs very important healthcare issue Kidney failure Blindness Heart disease Limb amputation

82

Type I and Type II Type I – insulin dependent Loss of production of insulin

Type II – non-insulin dependent Loss of sensitivity to insulin from the cells Æ high blood sugars

Solutions : Type I Æ insulin shots Type II Æ exercise and weight control (and drugs) 83

Type I Constraint Constant monitoring of blood glucose levels Î to monitor the doses of insulin required

Solution Insulin Pump Therapy

84

Type I Insulin Pump = open-loop technology The person must determine the rates of insulin infusion by interfacing directly with the wearable insulin pump

Closing the loop ? Issues of exercise and diet that directly affect insulin needs can be incorporated into the system A closed loop system would include a monitoring system and an insulin administering system to provide continuous control of blood glucose levels

Source: InsuLink

85

Nedostaky biosenzorů Základem biosenzoru je živá organická struktura, a proto je biosenzor velmi citlivý na pracovní podmínky, je nutné chránit zejména před: - mrazem - vysokými teplotami - vysokými tlaky - mechanickým poškozením - toxickými látkami - před nevhodnými organickými látkami - atd. Nestabilita biosenzorů - největší problém, je způsobena: •degradací biomembrány (únik, denaturace aktivního materiálu) •ovlivňováním aktivní vrstvy zanášením bílůkovin nebo mechanickým poničením •nestabilitou převodníku •degradací pouzdra (vznik koroze, puklin... ) 86

Závěry Problematika biosenzorů - je velmi rozsáhlá, pokrývá mnoho vědních oborů. Pole biosenzorů je stále v ranném stádiu vývoje. Obsahuje obecné problémy, které vyžadují další výzkum v oblasti materiálů, biochemie, senzorové techniky a v základních principech funkce biosenzorů. Použitelnost senzorů závisí na jejich citlivosti a selektivitě. Citlivost je určena rozpoznávací úrovní kterou je ještě možno odlišit od šumu. Vyšší citlivosti se dosáhne použitím převodní ku s větší účinností a potlačením šumu. Pro potlačení šumu se používá metoda integrace více senzorů na jednom substrátu a rozpoznávání vzorů včetně využití neuronových sítí

87

Další vývoj a uplatnění Oblast medicíny - používají se biosenzory pro snímání množství cukru v krvi protékající dialyzačním přístrojem. Implantace do pacientova těla - v budoucnu se počítá s aplikací biosenzorů ve speciálních mikrosystémech, které po implantaci do pacientova těla budou kontrolovat a korigovat špatné funkce důležitých orgánů (např. neustálé sledování hladiny cukru v krvi a pomocí mikropump dávkování insulinu. Požadavky •vysoká spolehlivost senzoru i pouzdra •dlouhá životnost •zabudované samotestování a samokalibraci. 88

DESIGN OF LOW-NOISE pHISFET MICROSENSORS Bohuslav PALAN 3 April 2002 Supervisor: Prof. M.Husak Prof. B.Courtois

TIMA 46, Av. Félix Viallet 38031 Grenoble Cedex France

Dept. of Microelectronics K334 Fac. of Electrical Engineering Czech Technical University in Prague Technická 2, 166 27 Prague 6 Czech Republic 89

Background

T

interface

P

interface

pH

interface

micro motor

interface

micro valve

interface

Communication unit

MUX A/D Control unit DEMUX

µ-ACTUATORS

µ-SENSORS

Microsystem = system in a miniature scale

D/A

Advantage for biomedical applications

Power unit

90

Background – Biomedical Microsystems on CMOS Advantages to use a microsystem for biomedical appl. * very small size * micro-volume measurements * micro-surgery possible * in-vivo monitoring (blood, stomach liquid) * real-time information Easy to develop: * almost all electronic circuitry thanks to VLSI integration in submicron CMOS technologies Difficult to integrate on one chip together with electronics: * biomedical sensors (pH-ISFETs) * RF communication unit (with high-Q inductors) * electropotential isolation (high-Q µ-transformers)

91

Contents

ISFETs for Biomedical Microsystems pH-ISFET Microsensor – Overview Design of ISFETs in Submicron CMOS Technology Low Frequency Noise in ISFETs Design of Two ISFET Sensor Interfaces Conclusions and Future Work on ISFETs

92

pH-ISFET Microsensor - Overview What is pH? Sörensen 1909: pH=-log[c(H+)] Acid

Neutral

Base

pH<7

pH=7

pH>7

pure water 2H2O ↔ H3O+ + 0Hc(H+)=10-7moles/l, pH=7

Applications of pH Measurements: * Medicine:clinical analysis of blood pH (±0.001), urine, stomach * Food Industry: milk control, freshness of meat *

Industry: acidity of rain, neutrality of wastes

pH electrode 10x1cm

pH Measurement Methods: * ISFET microsensor

advantages Small size

* Glass Electrodes (sens. -59mV/pH)

Rapid response

*

Optical/Chemical methods

ISFET 1x2mm

Good S/N ratio Low output impedance 93

pH-ISFET Microsensor – Overview (cont.) Bergveld (1970), Ion-Sensitive Field Effect Transistor (ISFET) discovered

* Essentially a MOSFET device, Vth=Vth(MOS) +Vth*(pH) * pH sensitivity explained by Yates (1974) by site-binding theory * Sensitive layers:

SiO2

Si3N4

Al2O3

Ta2O5

25-46mV/pH

46-56mV/pH

53-55mV/pH

55-57mV/pH

Ids/Vgs pH 4,7,10 Vds=50mV

Ids [µA]

* Necessity of reference electrode (Ag/AgCl)

Vgs [V]

ISFET structure

Transfer curves 94

pH-ISFET Microsensor – Overview (cont.) Fabrication: * on Si (modified CMOS technology CNM25 Spain, 4more tech.steps) Implantations of S/D regions, Vth(ISFET) set Deposit nitride ISFET, wet etch of sensitive gate

* on organic substrates P3HT (IMEC, OFET 2000) ISFET Behaviour Modelization: SPICE, HDL-A, TCAD Nonidealities:

* temperature dependency * light sensitivity * drift, aging, limited lifetime

Packaging: *difficult, mostly manual procedure * epoxy resins and silicones * special shapes (needle) * back-side contact ISFETs, SOI ISFETs are today commercially available (SENTRON), however do not allow monolithic integration with interfacing circuits. 95

Contents


96

Design of ISFETs in Submicron CMOS Technology ISFET is CMOS compatible S and D regions, gate open with insulating pH-sens. layer (SiO2, Si3N4, SiOxNy)

Modified CMOS process for ISFETs

Bousse 1988, CNM 2.5µm Spain 1995, Yeow et al. 1997 (1.2µm CMOS)

Unmodified CMOS process PolySi gate must be left for S/D area definitions, OK if on top is insulating layer Inter-metal oxides and passivation layer used as pH-sensitive membranes

0.6µm CMOS (AMS) 2polySi, 3metal layers, Vth(NMOS)=0.85V Vth(PMOS)=-0.85V Advanced and stable analogue technology Already characterized for microsystems (TIMA) Never used before for ISFETs

Process mask flow

97

Design of ISFETs in Submicron CMOS Technology 2 multi-sensor chips designed DESIGN1 (A-D structures) * to verify sensitivity of passivation layer DESIGN2 (E-K devices) * to verify sensitivity of inter-metal oxides * extended gate structures All ISFET gate sizes W/L=250/30µm

DESIGN 1

A

B Passivation Si3N4

Passivation Si3N4

P substrate

P substrate

C

D Passivation Si3N4

Passivation Si3N4

P substrate

P substrate

PolySi

Metal 2

Metal 1

Metal 3 98

Design of ISFETs in Submicron CMOS Technology DESIGN 2 F

E

SiO2

SiO2 P substrate

P substrate

H

G SiO2

SiO2

P substrate

P substrate

I

J SiO2

SiO2

P substrate

PolySi

K

Passivation Si3N4

Metal 1 Metal 2 Metal 3

P substrate

99

Design of ISFETs in Submicron CMOS Technology DESIGN1 chip 3x2.5mm

DESIGN2 chip 3x0.8mm

100

Design of ISFETs in Submicron CMOS Technology Encapsulation materials: * Excellent adhesion to Si, glass, ceramic, and pcb * 14 materials characterized (epoxy, silicone, polyurethane) * Finally HYSOL and EPOTEKH54 chosen

Packaging:

* on pcb cards 5x5cm

Leakage Current Tests: * only good packaged chips used

Technological Problems: * micro-ruptures in passivation layer

101

Design of ISFETs in Submicron CMOS Technology Measurement results: examples of G and H devices

Ids [µA]

G device, chip Z, Vds=50mV, pH 4,7,10

SEM gate photo

30.7mV/pH

Vgs [V] SEM gate photo

Ids [µA]

H device, chip Z, Vds=50mV, pH 4,7,10

34.1mV/pH

Vgs [V]

102

Contents


103

Low Frequency Noise in ISFETs Why to study ISFET noise? * Maximum ISFET accuracy determined by noise * Noise research very limited (Janata 1983, Haemmerli 1982, Jakobson 1999) Noise sources: 1. Intrinsic noise id12 (MOS noise: 1/f, thermal noise) 2. Extrinsic electro-chemical noise id22 (ion-membrane interactions) 3. Extrinsic noise id32 from biasing elements (neglected) All sources independent

ind2= id12 + id22

Current noise spectral density Sid(f) for ISFETs (SPICE) Sid(f)=

id12 ∆f

=

8 3

k.T.gm+

KF.IdsAF Cox

L2.fEF

+

Minimization of ISFET Noise * Technological level (↑ Cox , ↓ KF, ↓ AF) * Design level (↑ L, ↓ Ids, ↓ gm )

4kT Rs

+

4kT Rd

[A2/Hz]

Svg(f)=

Sid(f) gm2

Noise of AMS CMOS ISFETs is lower than of commercial ISFETs.

104

Low Frequency Noise in ISFETs Low Frequency Noise Measurements * 3 commercial ISFETs (SENTRON, NL)

W/L=600/20µm

* 5 AMS CMOS experimental ISFETs (D, G, H, I, J) W/L=250/30µm W.L(sentron)=1.6xW/L(AMS)

Focus on quantitative noise comparison Frequency range 2Hz – 100kHz

Ids range 10µA – 1µA – 100nA

Vds saturation (2V), linear region (50mV)

3 pH buffer solutions (pH4,7,10)

Noise Measurement Setup

LPCS, Grenoble

105

Low Frequency Noise in ISFETs pH7 10µA/1µA/100nA Vds=2V

pH7 10µA/1µA/100nA Vds=50mV

10µA 100nA

1µA

10µA 100nA

1µA

Noise of Commercial ISFETs Sensor 1 10µA pH4/pH10 Vds=50mV

Sensor 2 10µA pH4/pH10 Vds=50mV

pH4 pH10

Noise variation with pH

pH4 pH10

106

Low Frequency Noise in ISFETs Noise of AMS CMOS ISFET (J)

J 10µA/1µA/100nA Vds=50mV pH4

J 10µA Vds=50mV pH4,7

32.5mV/pH 10µA

Vth(pH7)=1.17V

1µA 100nA

pH4

Extended gate

pH7

Results and Comparisons: * ISFET noise is dominated by 1/f noise at low f (MOSFET noise) * Small pH dependency of Sid(f) found (sensor1) Sensor aging Parasitic leakage current * AMS ISFETs (H,I,J) presented comparable or less noise than SENTRONs W.L(sentron)=1.6xW/L(AMS)

Lower noise properties of AMS ISFETs demonstrated.

107

Contents


108

Design of Two ISFET Sensor Interfaces 1. Differential configuration with two ISFETs, monolithically integrated * 2.5µm CMOS technology (4 additional process steps) * Part of a biomedical microsystem with A/D converter (current input Σ-∆) Vout= -Vth -

Is2 βIs1Rset

-

Is1Rset 2

chip photo Si3N4 58mV/pH

Iout/Vin SiO2

5.5µA/0.1V

39mV/pH

109

Design of Two ISFET Sensor Interfaces 1.

Iout current [µA]

VoutA voltage [V]

Circuit Characterization

simulation measured

pH

Discussion and Conclusion: * Technological Error ISFET2 off state * But proper circuit functionality verified

Iout

VoutA – VoutB [V]

VoutB zero

* Vds and Ids of ISFET can be programmed The interface is proposed for biomedical microsystems * performance can be optimized for each pH-microsensor * CMOS, low-power and low Si area, monolithically integrated with sensors. 110

Design of Two ISFET Sensor Interfaces 2. Low-noise, low-power, low-cost analogue interface for plastic ISFETs * Designed for IMEC, Leuven, Belgium * Accuracy better than 0.1pH, battery powered, voltage output signal

Vout/Iin -3mV/1nA -90mV/pH

P-type OFET Si3N4 sens. layer Vgs=-2V, Vds=-9V 30nA/pH sens.

Ids=IDC+ipH Required measurement specifications were achieved. Circuit is now used for characterization of ISFETs based on org. substrates. 111

Contents


112

Conclusions on ISFET part * Design and evaluation of fabricating pH-ISFET sensors in standard unmodified 0.6µm CMOS technology (AMS) Monolithic ISFET integration with ICs is possible. * ISFET Noise measurements of commercial and our designed ISFETs Our designed ISFETs have lower noise than commercial devices. * Two ISFET sensor interfaces designed Differential configuration proposed for biomedical microsystems.

113

Future Work on ISFETs AMS CMOS ISFETs: * Yield improvements (pinholes in passivation) * Sensitivity improvements (low temperature CVD) * Design of P-type CMOS compatible ISFETs * Light insensitive and ESD protected sensors * Modelization of achieved ISFET parameters in SPICE, TCAD ISFET Sensor Interface Design: * Find a compromise between noise and performance parameters * To obtain highly sensitive, low noise, and low power interface for biomedical microsystems

114

BIOSENZORY. Prof. Ing. Miroslav Husák, CSc. Katedra mikroelektroniky ČVUT FEL Praha tel.:

Recommend Documents