Bioscience Imaging Centre (Středisko mikroskopie)
• zajišťujeme moderní mikroskopické zařízení a softwary pro analýzu obrazu • poradíme s plánováním experimentů (histologie, detekce proteinů a mRNA) • pomůžeme s analýzou obrazu Umístění: přízemí Entomologického ústavu, Biologické Centrum AV ČR, Branišovská 31
Kontakt: Mgr. Hana Sehadová, Ph.D. Entomologický ústav, Biologické Centrum AV ČR Branišovská 31 370 05 telefon: +38 777 5273, 5218 místnost: Entomologický ústav, druhé patro, laboratoř 224
Zaměření: • zobrazení v procházejícím světle - zvýraznění obrazu pomocí diferenciálního interferenčního kontrastu (DIC) zobrazení v temném poli zobrazení fluorescence zobrazení bioluminescence • 2D/3D/4D zobrazení • zobrazení více barev spektra (spectral multi-colour imaging) • zobrazení více pozic (multi-position imaging) • zobrazení živého materiálu (live cell imaging) • moderní fluorescenční techniky (FRAP, FRET)
Světelný a fluorescenční mikroskop - Zeiss Axioplane 2
Využítí: zobrazení v prochazejícím světle + DIC zobrazení v temném poli zobrazení fluorescence
Žábronožka solná, Artemia salina. Sladkovodní mechovka bochnatka americká, Pectinatella magnifica. Statoblast - chráněný shluk buněk sloužící k nepohlavnímu rozmnožování.
Souběžná imunodetekce dvou proteinů v optickém laloku švába amerického, Periplaneta americana.
Konfokální mikroskop - Olympus FluoView™ FV1000 Využítí: • zobrazení více barev spektra (jednotlivé optické řezy či 3D rekonstrukce) - spektrální detekční systém umožňuje vysokou citlivost a kombinovatelnost až 4 barev fluorescenčních markerů
Průřez sítnicí složeného oka octomilky, vzniklý složením několika optických řezů. Rhodopsin 5 (zeleně) a rhodopsin 6 (červeně). Rýhující se myší embryo. (A) čtyřbuněčné stadium (2 dny po oplodnění), (B) šestnáctibuněčné stadium (3 dny po oplodnění). 3D obraz vznikl složením série optických řezů. Aktin (bíle), jádra (různobarevně), malá pólová buňka (žlutě).
Neurony sluchového receptoru na tykadlech octomilky. Neurony byly zviditelněny pomocí zeleného (cytoplazma) a červeného (jádra) fluorescenčního proteinu. 3D rekonstrukce obrazu vznikla složením série optických řezů.
• časosběrné snímání (jednotlivé optické řezy či 3D rekonstrukce) • časosběrné snímání více pozic Mitotické dělení buněk během časného embryonálního vývoje octomilky celkový pohled na embryo
detailní záznam
Buněčná dělení probíhají lavinovitě směrem od vegetativního k apikálnímu póĺu embrya. Červeným fluorescenčním proteinem (RFP) je značen histon 2A, který je součástí bílkovinných komplexů, okolo nichž se obtáčí DNA eukaryot. Zeleným fluorescenčním proteinem (GFP) je značen protein Jupiter vážící se na mikrotubuly.
• spekrální dekonvoluce • fotovybělovací/foto-aktivační experimenty Fluorescenční metoda FRAP („návrat fluorescence po fotovybělení“)
Časosběrná série snímků fluorescence fykobilizomů ruduchy Porphyridium cruentum získaná pomocí FRAP. (Fykobilizomy jsou pigmentované proteinové komplexy sloužící k zachytávání světla.) Vlivem krátkodobého zvýšení intenzity laseru (červená obdelníková oblast v čase t = 8 s) poklesne fluorescence fotovybělených proteinů ve vybrané oblasti. V průběhu času dochází k postupnému návratu fluorescence v oblasti fotovybělení vlivem difúze proteinů z okolí. Návrat fluorescence odráží mobilitu fykobilizómů a jejich mobilní frakci.
Bioluminiscenční mikroskop - LuminoView LV200 Využítí: vizualizace a kvantitativní analýza bioluminiscenčního signálu na buněčné úrovni dlouhodobé monitorování světelně senzitivního živého materiálu (vysoký rozdíl signál/šum bez fotovybělování/fototoxicity) zobrazení vzorků s vysokou autofluorescencí (embrya, rostliné buňky, bakterie, parazité) studie genové exprese a funkce promotorů zejména časosběrné monitorování luminiscence reportérového genu (rychlá tvorba a krátký poločas rozpadu luciferázy, kvantitativní měření) vizualizace Ca2+ (netoxické značení, přímé měření, vysoký rozdíl signál/šum) měření ATP a procesů s ATP spojených s vysokou rozlišovací schopností na úrovni buněčné i v mimobuněčné hmotě (vizualizace metabolismu a procesů spojených s receptory spraženými s G-proteiny)
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------• vhodné v případě, že fofotoxický efekt a silná autofluorescence znemožují použití excitačního světla • světlo produkované pouze chemickou reakcí --- vysoký rozdíl signál/pozadí umožňuje detekci i velmi slabého signálu • chemická reakce vyžaduje funkční metabolismus --- pouze živé buňky produkují bioluminiscenci
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Bioluminiscence snímaná pomocí Luminoview LV200
Příklad studia genové exprese u transgenní drozofily obsahující luciferázový gen za promotorem genu cirkadiánních hodin
+1 -4200 bp
1
2
3
4
5
67 8
+9124 bp
period gene
CLKCYC
EcoRI
luciferase
NciI
BamHI
BamHI
plo
= reports per RNA expression
BG-luc
luciferase
XLG-luc
luciferase
translated exons non-coding exons genomic DNA
report PER protein expression
Isolované části těla v kultivačním médiu Luminoview + CCD kamera s velkým rozlišením
exprese Per-Luc ve křídle
Systém umožňuje: • kontrolu teploty • kontrolu vlhkosti • kontrolu CO2 • kombinaci fluorescenčního, luminiscenčního obrazu a obrazu v procházejícím světle
Prostorová a časová exprese Per-Luc ve křídle
14000
ROI 1
12000
ROI 2
Intensity
ROI 3 10000
ROI 4
8000
ROI 5
6000 4000 2000
Wings were imaged in 1 hr intervals (once per hour). Exposure time 15 min, gain 255.
0 1
3
5
7
9
11
13
Time (hours)
15
17
19
21
Těšíme se na vaši návštěvu
