Biomedicínské aplikace diamantových vrstev

92

Referáty

Biomedicínské aplikace diamantových vrstev Bohuslav Rezek1*, Egor Ukraintsev1, Marie Krátká1, Alexander Kromka1, Antonín Brož2, Marie Kalbáčová2 1

2

Fyzikální ústav Akademie věd České republiky, Cukrovarnická 10, 162 00 Praha 6 Ústav dědičných metabolických poruch, 1. lékařská fakulta Univerzity Karlovy a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze, Ke Karlovu 2, 128 52 Praha 2

Pro řadu biomedicínských aplikací je zásadní interakce mezi biologickým prostředím a povrchem pevné látky. Diamant jako materiál sdružuje v tomto ohledu výborné polovodičové, mechanické, chemické i biologické vlastnosti a lze ho připravovat synteticky i na velké plochy. Zde ukazujeme, jaký vliv má atomární zakončení povrchu diamantu na uspořádání proteinů a buněk a jak toto biologické rozhraní naopak ovlivňuje jeho elektronické vlastnosti. Dosažené poznatky jsou přínosné pro využití unikátních vlastností diamantu v medicíně a dalších oborech.

Úvod Pro biomedicínské aplikace, jako jsou biosenzory, bioelektronika, tkáňové inženýrství a  optimalizace materiálů pro implantáty, je zásadní interakce mezi biologickým prostředím (tkáně, buňky, proteiny, elektrolyty apod.) a povrchem pevné látky. Buňky, jako základní prvek živé tkáně, rozpoznávají své okolí a  následně ho modifikují vytvářením extracelulární matrix (ECM), která tvoří základnu pro jejich adhezi, pohyb, růst a diferenciaci [1]. Interakce buněk s materiálem je komplexní a flexibilní proces, který silně závisí na  podmínkách buněčné kultivace včetně použité podložky. Významnou roli přitom hrají drsnost podložky [2, 3], její pórozita [4] i její smáčivost, která ovlivňuje konformaci proteinů [5, 6] i adhezi a životaschopnost buněk [7, 8].1 Běžně používanými povrchy v  biologii jsou polystyren a sklo, které jsou upraveny speciálně pro tkáňové kultury. Diamant jako nový materiál může v tomto směru poskytnout poměrně unikátní kombinaci výborných polovodičových, mechanických, chemických i  biologických vlastností [9]. Splňuje také základní předpoklady pro široké průmyslové využití, neboť ho lze připravovat synteticky s různými požadovanými parametry. Syntéza diamantu může probíhat v objemu za  vysokého tlaku a  teploty nebo v  tenkých vrstvách depozicí z chemických par metanu a vodíku na různé podložky včetně skla a kovu [10, 11]. Pomocí selektivní nukleace je možné, aby na skleněných podložkách přímo rostly vodivé diamantové struktury, které pak fungují např. jako tranzistory nebo senzory pH [12]. V současné době je již možná depozice i na velké plochy (600 cm2 i více) pomocí lineárních antén [13, 14]. Zásadním pro využití v medicíně je výborná kompatibilita diamantu s  biologickými materiály a  prostředím [15, *1 tel.: 420-220 318 525; fax: 420-220 318 468; e-mail: [email protected]; www.fzu.cz/~rezek

http://cscasfyz.fzu.cz

7, 16, 8]. To je zejména dáno tím, že diamant je uhlík, který je navíc v této své krystalické formě mechanicky, chemicky i  fyzikálně velmi stabilní. Přesto může být jeho povrch zakončen různými atomy [17] a organickými molekulami [18], které dávají diamantu další nové vlastnosti a otevírají pole pro mnoho nových aplikací. Například elektrická vodivost a elektronová afinita diamantu jsou významně ovlivněny zakončením povrchu vodíkovými nebo kyslíkovými atomy [19, 20, 21, 17, 22]. Rozdíly jsou hlavně způsobeny dipóly C-H a C-O vazeb na povrchu. Kyslíkem zakončený diamant je nevodivý, zatímco vodíkem zakončený po(a) roztok UDD

držák

vzorek

(b) UDD nukleační vrstva Si nebo SiO2 podložka

voda

(c) NCD vrstva

MW-CVD

Si nebo SiO2 podložka ultrazvuková lázeň (d)

(e)

Obr. 1 Schematický postup přípravy tenkých vrstev diamantu na podložce ze skla nebo křemíku: (a) nukleace podložek v ultrazvukové lázni s ultradispergovaným diamantovým práškem (UDD), (b) výsledná nukleační vrstva a (c) vrstva nanokrystalického diamantu po depozici v mikrovlnném výboji. (d) Aparatura pro růst diamantu na velké plochy (lineární plazma) a (e) pro růst vysokou rychlostí (fokusovaná plazma).

č. 2

Příprava vrstev nanokrystalického diamantu Růst tenkých vrstev nanokrystalického diamantu (NCD) byl realizován na  křemíkových nebo skleněných substrátech pomocí chemické depozice z  par v  mikrovlnném výboji (MW-CVD) [10, 11]. Velikost substrátů byla 10 × 10 mm2 s drsností <1 nm. Před CVD růstem byly substráty vyčištěny izopropanolem a deionizovanou vodou v ultrazvuku, a poté byly po dobu 40 minut ponořeny do  ultrazvukové lázně obsahující diamantový prášek (ultradispergovaný diamant – UDD) o velikosti částic 5 nm. Tento proces vede k vytvoření 5 až 25  nm tenké vrstvy nanodiamantového prášku. Po procesu nukleace následuje samotný proces růstu MW-CVD. Podmínky depozice byly následující: teplota substrátů 600–800 °C, 1% CH4 v H2, výkon 1,4–2,5 kW, tlak plynu 30–50 mbar, doba depozice cca 4 hodiny. Tloušťka NCD vrstev je tak 100–500 nm. V některých případech jsou nukleace a růst opakovány i z druhé strany podložky, což vede k hermetickému zapouzdření substrátu NCD vrstvou [30, 31]. Postup přípravy diamantové vrstvy je schematicky znázorněn na obr. 1. Tento obrázek také ukazuje fotografie aparatur pro růst diamantu na velké plochy (lineární plazma) a s vysokou rychlostí růstu (fokusovaná plazma). NCD vrstvy byly chemicky vyčištěny v kyselinách (97,5% H2SO4 + 99% prášek KNO v  poměru 4:1) při 200 °C po dobu 30 minut. Poté byl povrch vystaven čisté vodíkové plazmě za teploty 600–800 °C po dobu 10 minut. Díky tomuto procesu je vodíkem zakončený povrch velmi kvalitní (povrchová vodivost v řádu10-7 S/sq) [32].

(a)

93

(b)

intenzita [a.u.]

vrch umožňuje vznik dvoudimenzionální p-typové povrchové vodivosti na jinak nevodivém diamantu. Tyto vlastnosti lze použít pro vytvoření planárního polního tranzistoru (FET), jehož hradlo je tvořeno pouze atomy vodíku bez dalších izolačních vrstev a který je citlivý na pH roztoku [23, 24, 25]. Vodíkem zakončený povrch je také ideálním počátečním bodem pro kovalentní navázání dalších biomolekul, jako jsou DNA nebo proteiny [26, 27, 18]. Na druhé straně je vodíkem zakončený povrch diamantu obecně méně příznivý pro adhezi a rozprostření buněk než povrch oxidovaný [7]. Je to dáno tím, že kyslíkem zakončený povrch (O-diamant) je hydrofilní, zatímco vodíkem zakončený povrch (H-diamant) je hydrofobní. Kombinace zakončení vodíkem a kyslíkem na povrchu diamantu je tedy velmi zajímavá pro bioelektroniku [28, 29] ale i pro tkáňové inženýrství [30, 31]. V této práci ukazujeme, jaký vliv má mikroskopické strukturování atomárního zakončení povrchu diamantu kyslíkem a vodíkem na uspořádání a funkci buněk. Prozkoumáváme vliv klíčových parametrů, jako koncentrace buněk, typ použitých buněk, délka kultivace buněk, koncentrace fetálního hovězího séra (FBS) v kultivačním médiu, rozměry mikrostruktur a drsnost povrchu. Uvidíme, že zásadní vliv má právě adsorpce proteinů z  FBS. Pomocí mikroskopie atomárních sil (AFM) v roztoku a na vzduchu proto charakterizujeme morfologii FBS vrstev adsorbovaných na diamantu s různým atomárním zakončením povrchu. Pomocí polního tranzistoru vytvořeného na vodíkem zakončeném diamantu, jehož hradlo je vystaveno roztoku (SG-FET), studujeme vliv proteinů a buněk na elektronické vlastnosti diamantu. Tyto výsledky diskutujeme jak z fundamentálního pohledu fyziky a biologie, tak vzhledem k možným aplikacím v medicíně.

Čs. čas. fyz. 61 (2011)

450

900

1350

1800

Ramanův posuv [1/cm]

200 nm

Obr. 2 Základní charakteristiky typické NCD vrstvy používané v této práci: (a) morfologie v elektronovém mikroskopu a (b) spektrum Ramanova rozptylu.

Povrchová morfologie a chemická kvalita NCD vrstev byly charakterizovány pomocí AFM, rastrovací elektronové mikroskopie (SEM) a Ramanovy spektroskopie. Drsnost určená v poklepovém režimu („tapping“) AFM je 15–30 nm rms (na ploše 1 × 1 μm2). Velikost zrn určená z rastrovacího elektronového mikroskopu (SEM) je 50–150 nm (viz obr. 2a). Mírnou úpravou depozičních podmínek mohou narůst zrna o velikosti i několika set nanometrů. Na zrnech jsou zřetelně vidět fazety odpovídající krystalkům diamantu. Ramanova spektroskopie (excitační vlnová délka 325 nm) potvrdila diamantový charakter vrstev (viz obr. 2b).

Růst buněk na diamantu s mikroskopickými atomárními vzory Pro experimenty s uspořádáváním buněk byly na NCD vrstvách vytvořeny pomocí fotolitografie mikroskopické vzory o šířce 30 až 200 μm. Byl použit pozitivní fotorezist ma-P1215 (micro resist technology GmbH, Německo). Poté byly NCD vrstvy s  fotolitografickou maskou ošetřeny ve vysokofrekvenční kyslíkové plazmě (výkon 300 W, doba 3 minuty), což má za následek oxidaci povrchu, a  tedy vytvoření hydrofilních vzo-

84°

15° hydrofilní

hydrofobní

200 μm

O

H

O

H

O

H

O

H

O

Obr. 3 Obrázek z elektronového mikroskopu SEM na vrstvě nanokrystalického diamantu s 200 μm širokými proužky zakončenými střídavě vodíkem a kyslíkem. Světlé proužky odpovídají vodíkovému povrchu díky jeho nízké elektronové afinitě. Křížek v horní části obrázku je tvořen tenkou vrstvou zlata a slouží jako značka pro rozlišení uspořádání proužků. Nad obrázkem SEM jsou typická měření a hodnoty smáčivého úhlu na vodíkem a kyslíkem zakončeném povrchu diamantu.

http://cscasfyz.fzu.cz

94

Referáty rů zakončených kyslíkovými chemickými skupinami (v případě oxidace v plazmě převážně C-O-C a C=O, obecně i C-OH a COOH). Smáčivý úhel vody na kyslíkem zakončeném diamantu byl <20°, oproti tomu na plazmou oxidovaném diamantu byl ≈80°. Morfologie povrchu se při tomto procesu nemění. Obr. 3 ukazuje, jak takto připravené proužky vypadají v elektronovém mikroskopu. Proužky vodíku a  kyslíku mají v SEM odlišný kontrast díky různé elektronové afinitě. Před nasazením buněk byly NCD vrstvy sterilizovány UV zářením nebo v  70% ethanolu po  dobu 10 minut. Pro většinu experimentů byla použita buněčná linie lidských kostních buněk (osteoblasty – buňky SAOS-2; DSMZ GmbH). Buňky byly nasazeny na diamant v koncentracích od 2 500 buněk/cm2 (subkonfluentní pokrytí) do 10 000 buněk/cm2 (konfluentní pokrytí, kdy jsou buňky v přímém kontaktu mezi sebou) a zality médiem McCoy´s 5A (BioConcept), které obsahuje FBS (Biowest) o různých koncentracích (0–15 %), penicilín (20 U/ml) a  streptomycin (20 μg/ml). Poté byly buňky kultivovány v inkubátoru při teplotě 37 °C v 5% CO2 po dobu dvou dnů. Použili jsme osteoblasty, protože SAOS-2 je standardní buněčná linie, u které jsou zachovány stejné vlastnosti během dlouhé časové periody. Proto mohou být výsledky srovnávány mezi různými experimenty, stejně tak jako s výsledky v literatuře. Pro srovnání byly použity také jiné typy buněk: lidské periodontální vazivové fibroblasty (HPdLF; Lonza) a buňky lidského cervikálního karcinomu (HeLaG; DSMZ GmbH). Adheze a morfologie buněk byly charakterizovány pomocí fluorescenčního barvení aktinových vláken (zeleně) a  buněčných jader (modře) podle protokolu v Ref. [33]. Barvení bylo zobrazeno pomocí epifluorescenčního mikroskopu E-400 (Nikon); digitální

(a)

(b)

Obr. 5 Fluorescenční obrázek (a) fibroblastů (HPdLF) a (b) buněk cervikálního karcinomu (HeLaG), které byly kultivovány 2 dny na 30μm proužcích H/O-diamantu. Počáteční koncentrace 2 500 buněk/cm2. Médium s 15% FBS. Fluorescence ukazuje aktinová vlákna (zeleně) a buněčná jádra (modře). (b) (a)

Obr. 6 Fluorescenční obrázek osteoblastických buněk, které byly kultivovány 2 dny na  100 μm proužcích H/O-diamantu s použitím různé počáteční koncentrace buněk: (a) 2 500 buněk/cm2, (b) 10 000 buněk/cm2. Fluorescence ukazuje aktinová vlákna (zeleně) a buněčná jádra (modře).

http://cscasfyz.fzu.cz

60 μm buňka

zakončení povrchu

O

H

O

H

O

H O

diamantová vrstva křemíková podložka

Obr. 4 Obrázek z fluorescenčního mikroskopu ilustruje preferenční uspořádání osteoblastických buněk (SAOS-2) po dvou dnech kultivace v McCoy’s 5A medium s 15% FBS na H/O proužcích diamantu o šířce 60 μm. Počáteční koncentrace buněk byla 2 500 buněk/cm2. Fluorescence ukazuje aktinová vlákna (zeleně) a buněčná jádra (modře). Schéma pod obrázkem situaci názorně dokresluje.

snímky byly pořízeny barevným digitálním fotoaparátem DS-5M-U1 (Nikon). Po nasazení a růstu buněk na H/O-zakončených mikroskopických vzorech bylo zjištěno, že se osteoblastické buňky preferenčně uspořádaly na  kyslíkem zakončeném povrchu diamantu. Obr. 4 z fluorescenčního mikroskopu ilustruje tento případ na proužcích o šířce 60 μm. Schéma pod obrázkem toto názorně dokresluje. Preferenční chování buněk bylo nezávislé na šířce proužků v rozsahu 30–200 μm [31]. Ani drsnost povrchu v rozsahu 20–500 nm rms selektivitu buněk neovlivnila [34]. Nicméně bylo pozorováno, že tvar buněk na drsnosti povrchu [2, 3] a na šířce struktur [30, 31] závisí. Buňky na úzkých O-proužcích (30 μm – srovnatelné s velikostí buňky) jsou protáhlé a tvoří řetízky. Na širších proužcích (60, 100 a 200 μm – větší než velikost buňky) se buňky více rozprostřou a vyplní celou šířku proužku. Na rozhraní H/O-diamantu tvoří buňky ostré hranice. Obr. 5 potvrzuje, že i  jiné typy buněk jsou schopny se selektivně uspořádat na O-terminované proužky na diamantu. Lidské fibroblasty (HPdLF) a buňky cervikálního karcinomu (HeLaG) byly nasazeny na NCD vzorky s  30 μm širokými proužky a  byly kultivovány po  dobu 2 dní. Buňky vykazují odlišnou morfologii, přesto stejnou preferenci k oxidovaným vzorům. Selektivní růst buněk na  H/O-diamantu je ovlivněn jejich počáteční koncentrací, jak ukazuje obr. 6. Při nízké počáteční koncentraci buněk (2 500 buněk/cm2) rostou buňky převážně na povrchu zakončeném kyslíkem, kde je dostatek místa pro expanzi buněk uvnitř hydrofilní oblasti (obr. 6a). Naopak buňky nasazené při vysoké hustotě (10 000 buněk/cm2) přerůstají také povrch zakončený vodíkem (obr. 6b). Selektivní růst buněk je také ovlivněn přítomností fetálního hovězího séra (FBS). Obr. 7 ukazuje vliv různých počátečních koncentrací FBS v  kultivačním médiu na rozmístění buněk na H- a O-zakonče-

č. 2 ných proužcích diamantu. Rozsah koncentrací od 5 % do 15 % výrazně neovlivňuje buněčnou adhezi (ukázán je obrázek pro 15% FBS). Oproti tomu buňky nasazené v médiu bez FBS obsazují povrch nezávisle na typu zakončení povrchu. Preference buněk k jednomu typu povrchu je tedy zřejmě určena proteiny z FBS a nikoliv přímým působením povrchových dipólů diamantu na buňky. Proto jsme dále zkoumali vlastnosti FBS vrstev adsorbovaných na různé povrchy diamantu.

Morfologie proteinových vrstev na diamantu

0% FBS

Adsorpce, adheze a  konformace vrstev FBS na  diamantu byly studovány pomocí AFM (Ntegra, NTMDT). Měření AFM byla prováděna na vzduchu a v roz(a)

(b)

200 nm Z škála = 3 nm RMS = 0,6 nm, Lx = 12 nm

200 nm

(c)

(d)

,

,

Z škála = 3 nm RMS = 1,7nm, Lx = 18nm ,

,

Z škála = 10° 200 nm Z škála = 10° 200 nm RMS = 1,0°, Lx = 22 nm RMS = 1,4°, Lx = 10 nm (e ) (e) 0,47

0,00

-0,47 0

(a)

100

200

((f) f)

AFM protein protein H-diamant

O-diamant

hydrofobní

hydrofilní

Obr. 8 Měření mikroskopie atomárních sil (AFM) v roztoku FBS/ McCoy’s na vodíkem a kyslíkem zakončeném povrchu diamantu s adsorbovanou vrstvou FBS: topografie a fáze na (a–b) FBS/H-diamantu, (c–d) FBS/O-diamantu. Pod obrázky jsou uvedeny hodnoty standardní odchylky (RMS) výškového a fázového signálu a charakteristická laterální velikost útvarů (Lx) zjištěná pomocí autokorelační funkce. (e) Charakteristické křivky spektroskopie atomárních sil pro FBS vrstvu na vodíkem a kyslíkem zakončeném povrchu diamantu. (f) Model morfologie proteinů na vodíkem a kyslíkem zakončeném povrchu. Zeleně je vyznačeno hydrofobní jádro proteinu, černé kuličky jsou polární skupiny obklopující jádro ve vodném prostředí. Červená linie naznačuje výšku proteinu, jak je detekována AFM v roztoku.

Čs. čas. fyz. 61 (2011)

95

(b)

15% FBS

Obr. 7 Fluorescenční obrázek osteoblastických buněk, které byly kultivovány 2 dny na 100μm proužcích H/O-diamantu s použitím různé počáteční koncentrace fetálního hovězího séra (FBS): (a) 0 %, (b) 15 %. Fluorescence ukazuje aktinová vlákna (zeleně) a buněčná jádra (modře). V případě 0 % FBS byly buňky nasazeny bez séra, nicméně po 2 hodinách bylo sérum dodáno, aby byla umožněna kultivace po následující 2 dny.

toku v  kontaktním i  poklepovém tapping režimu. Pro měření byly použity dopované křemíkové hroty (BSMulti75Al) s  typickou tuhostí 3 N/m, rezonanční frekvencí 75 kHz na vzduchu (30 kHz v roztoku), a nominálním poloměrem hrotu <10 nm. Aby byl minimalizován vliv morfologie povrchu na měření, byl použit jako substrát leštěný monokrystalický diamant (připravený podobně jako NCD synteticky pomocí CVD). Atomární zakončení jeho povrchu kyslíkem nebo vodíkem byla připravena stejně jako v případě NCD vrstev. Tloušťka proteinové vrstvy byla určena pomocí metody „nanoshaving“, kdy se hrotem AFM v  kontaktním režimu nejprve seškrábne část vrstvy proteinů, a následně se v poklepovém režimu změří výškový schod [35, 18, 6]. Monokrystalický diamant je pro tuto metodu ideální substrát, neboť je rovný a tvrdý. Proteiny byly adsorbovány na  povrch diamantu z 15% roztoku FBS (Biowest) v McCoy`s 5A médiu (BioConcept). Adsorpce byla provedena buď nakápnutím roztoku pipetou, ponecháním 10 min ve vlhké komůrce a následným opláchnutím vodou, nebo přímo ve fluidní cele mikroskopu AFM s následným měřením in-situ. Obě metody poskytly srovnatelné výsledky. Monovrstva proteinů se na  diamantu vytvoří během několika sekund po aplikaci [6]. Pomocí AFM jsme zjistili, že tloušťka vrstvy adsorbovaných proteinů v  roztoku je 4 ± 2 nm na  O-diamantu a 1,5 ± 2 nm na H-diamantu [6]. Vrstva FBS je tedy přítomná na obou typech diamantových povrchů. Podívali jsme se proto podrobněji na morfologii těchto proteinových vrstev. Obr. 8 ukazuje detailní topografii a  fázový signál změřené v mikroskopu AFM. Pod obrázky jsou uvedeny hodnoty standardní odchyl ky (RMS) výškového a fázového signálu a také charakteristická laterální velikost útvarů (Lx) zjištěná pomocí autokorelační funkce. V případě výškového signálu tato hodnota charakterizuje drsnost povrchu. Drsnost vrstvy FBS na H-diamantu (0,6 nm) je přibližně 3× menší ve  srovnání s vrstvou na O-diamantu (1,7 nm). Také útvary na povrchu vypadají odlišně a mají různou velikost (12 nm, resp. 18 nm). Ještě výraznější rozdíl je vidět ve fázovém signálu. V  případě H-diamantu je fázový obraz na  FBS vrstvě pokryt tmavými body, které korelují s výstupky v topografii. Na O-diamantu jsou naopak výrazně větší světlé oblasti, které opět korelují s oblými strukturami v topografii. Při měření na vzduchu nebyly tyto rozdíly v topografii a fázi pozorovány [6].

http://cscasfyz.fzu.cz

Referáty (a)

UG

hradlo

IG

buňka proteiny

D

H H H H H H H H H H

I DS

S

vodivý kanál

UDS

diamant (b)

kontakt

oxidovaný povrch vodivý kanál

izolace (d)

(c) -1,2

-0,8

Ug= -0.2V

Ug= -0.1V

-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,0

Ug= 0V Ug= 0.1V

Uds= -0.6V v McCoy's 5A

-2,0

proud kanálem Ids [nA]

-1,0

proud kanálem Ids [nA]

96

na počátku po FBS adsorpci po růstu buněk

-1,5

-1,0 - 45 mV

-0,5

Ug= 0.2V -0,2 -0,4 -0,6 napětí kanálu Uds [V]

0,0 0,2

-123 mV

0,0 -0,2 -0,4 napětí hradla Ug [V]

Obr. 9 (a) Schematický nákres polního tranzistoru s hradlem v roztoku (SG-FET) vytvořeného s využitím povrchové vodivosti diamantu. Hradlo je izolováno pouze vodíkovými atomy na povrchu diamantu. Proteiny a buňky jsou tak interagují přímo s povrchem diamantu. (b) Schematický obrázek tranzistoru shora, kde je vodíkem vodivý mikroskopický kanál ohraničen po stranách nevodivým oxidovaným povrchem a aktivní oblast je vymezena otvorem v izolační vrstvě. Na čipu je několik těchto mikroskopických oblastí, jak ukazuje návaznost na optický obrázek celého čipu o rozměrech 10 × 10 mm s 5 tranzistory, který je umístěn vpravo. (c) Výstupní charakteristika SG-FET tranzistoru z nanokrystalického diamantu v roztoku McCoy’s 5A při potenciálu na hradle od –0,2 V do 0,2 V. (d) Převodní charakteristika tranzistoru v roztoku McCoy’s 5A na počátku (modrá), po adsorpci proteinů z FBS (červená) a po dvoudenním růstu buněk (zelená).

To je dáno tím, že FBS vrstvy nejsou ve svém přirozeném prostředí (v roztoku). Spektroskopie atomárních sil ukázala, že na obou typech povrchů lze detekovat charakteristické zubovité interakce mezi hrotem a  povrchem o  síle 500 ± 100 pN v adhezní části křivky (záporné síly) [31]. Typické křivky jsou ukázány na obr. 8e. Podobné síly a interakce na  silové křivce byly změřeny na  proteinech adsorbovaných na skle a odpovídají natahování proteinů hrotem AFM [36]. Charakter silových křivek je proto důkazem, že na obou typech povrchů se vyskytují proteiny z FBS. Na základě AFM měření jsme navrhli model morfologie proteinů na vodíkem a kyslíkem zakončeném povrchu diamantu [6]. Schematicky je tento model znázorněn na obr. 8f. Na hydrofobních površích proteiny denaturují (tj. konformačně se negativně pozmění), protože se jejich hydrofobní jádro přilepí k vodíkem zakončenému povrchu povrchu. Na hydrofilních površích zůstávají proteiny ve své přirozené globulární formě. AFM proto detekuje jiný tvar, výšku a disi-

http://cscasfyz.fzu.cz

paci energie (fázi) na útvarech na povrchu. Podobné chování proteinů bylo pozorováno i na jiných materiálech [5].

Elektronické efekty na rozhraní diamant-protein-buňka Vodíkem zakončené proužky obklopené plochami zakončenými kyslíkem byly dále použity jako vodivé kanály polních tranzistorů SG-FET typu p [24], které sloužily pro charakterizaci efektu adsorpce proteinů a růstu buněk na elektronické vlastnosti diamantu [28]. Schémata tranzistoru SGFET v průřezu a v pohledu shora jsou ukázána na obr. 9a a 9b. Elektrické kontakty byly připraveny napařením kovové vrstvy (10 nm Ti a 50 nm Au) přes fotolitografickou masku a následným užitím lift-off techniky. Tranzistor byl izolován od  elektrolytu pomocí vrstvy fotorezistu (ma-P1215 o  tloušťce 1,5 μm nebo SU8-3050 o  tloušťce 5 μm). Pouze v aktivní oblasti tranzistoru byly v této izolační vrstvě vytvořeny otvory 60 × 60 μm2, které odhalily povrch vodivého kanálu (20 μm široký) a částečně i okolní oxidovaný povrch (20 μm z každé strany) [28]. Hradlo tranzistoru bylo vytvořeno ponořením této aktivní oblasti do roztoku (elektrolyt), který je v kontaktu s Ag/AgCl referenční elektrodou. Výstupní a  převodní charakteristiky tranzistorů SG-FET byly měřeny pomocí dvou zařízení Keithley K327 v zapojení dle obr. 9a. Charakteristiky byly měřeny v následujících roztocích: a) McCoy´s 5A médium, b) McCoy´s 5A médium doplněné o 15% FBS, c) Britton-Robinsonův pufr o pH = 7. Pro získání stabilizovaných dat byla všechna měření prováděna třikrát. Výstupní charakteristika na  obr. 9c potvrzuje, že tranzistory na  bázi nanokrystalického diamantu byly v roztoku plně funkční a reagovaly na napětí na hradle v souladu s očekáváním pro p-typový vodivý kanál. Této funkčnosti jsme dosáhli i u NCD vrstev tenkých pouze 100 nm a s průměrnou velikostí zrn 80 ± 50 nm. Efekt adsorpce proteinů a růstu buněk na elektronické vlastnosti diamantu je zřejmý z obr. 9c, který ukazuje převodní charakteristiky čistého tranzistoru v počátečním stavu (modrá), tranzistoru po adsorpci FBS (červená) a  po  kultivaci buněk SAOS-2 (zelená). Vše bylo měřeno v McCoy´s 5A médiu. Napětí source-drain bylo ponecháno konstantní během všech měření (–0,6  V). Toto nastavení odpovídá zesilovacímu režimu tranzistoru. U  všech převodních charakteristik je pozo-

Nastavování procesu pro růst diamantu.

č. 2

Čs. čas. fyz. 61 (2011)

rována mírná hystereze. Proud protékající tranzistorem SG-FET se snížil po  aplikaci FBS, což ukazuje posun převodních charakteristik tranzistoru přibližně o –45 mV pro Ids = –0,6 nA. Další posun přibližně o –78 mV byl pozorován po kultivaci buněk. Tedy celkový posun od počátečního stavu je okolo –123 mV. Kromě posunu charakteristiky došlo i ke snížení strmosti (transkonduktance), definované jako gm = δI ds/δUg, z 9,5 na 8,3 nS pro Ids = –0,6 nA. Charakteristiky zůstaly podobné po opláchnutí vzorku pomocí McCoy´s média [28]. Svodové proudy tranzistorů byly typicky na úrovni 10 pA. Po adsorpci proteinů se svodové proudy obvykle snížily. V  některých případech však bylo pozorováno zvýšení až na úroveň 40 pA [28].

Diskuse Jak jsme ukázali, v  případě mikroskopických vzorů zakončených vodíkem a  kyslíkem se buňky uspořádávají selektivně na  kyslíkem zakončeném povrchu diamantu. Přerůstání buněk na  vodíkem zakončený povrch, zejména při vyšších koncentracích buněk, je zřejmě umožněno jejich napojením k buňkám na O-diamantu, protože osamocené buňky na H-diamantu vykazují zhoršenou adhezi a redukovanou metabolickou aktivitu [7, 30]. Buňky pravděpodobně komunikují mezi sebou, vyměňují si růstové faktory a různé impulzy a postupně vytvářejí novou ECM. Tímto způsobem modifikují povrch s proteiny a proteoglykany pod nimi, aby překonaly nepříznivé vlastnosti subtrátu. To umožňuje zarůst elektricky vodivý H-diamant, pokud je obklopen plochami O-diamantu. Tohoto efektu jsme využili při inkubaci buněk na polních tranzistorech. Obr. 7 jasně ukázal, že na selektivní růst buněk mají rozhodující vliv proteiny z  FBS adsorbované na  diamant. Protože je adsorpce proteinů mnohem rychlejší než transport buněk k povrchu, očekává se, že interakce buňky s materiálem je určena povahou této adsorbované proteinové vrstvy. Měření AFM odhalila, že proteiny adsorbují na oba typy diamantových povrchů. To je v souladu s předchozími výsledky na jiných materiálech, kde albumin adsorbuje jak na hydrofilní, tak na hydrofobní povrchy [5]. Buněčná selektivita není tedy určena tím, že by vrstva FBS adsorbovala jen na jeden typ povrchu. Pro vysvětlení selektivní adsorpce musí být vzaty do úvahy další faktory, jako např. denaturace proteinů na hydrofobních površích. Studie detailní povrchové morfologie pomocí AFM ukázala zřejmé rozdíly v povrchové drsnosti, morfologii i fázovém kontrastu mezi vrstvou proteinů na H- a O-diamantu. Když se proteiny z FBS dostanou na H-diamant, pravděpodobně zaujmou konformaci, která způsobí skrytí epitopů (např. RGD sekvence peptidů), tudíž neposkytují optimální podmínky pro buněčnou adhezi. Podobný rozdíl v morfologii proteinů byl popsán na polystyrenových podložkách [5]. Proto se smáčivé vlastnosti povrchu jeví jako nejdůležitější faktor pro buněčný růst. Ostatní specifické vlastnosti diamantových vrstev nehrají takovou roli. Jak jsme ukázali, tento jev je obecný a platí i pro jiné typy buněk. Výše uvedená preference buněk ke  kyslíkem zakončenému povrchu na  H/O proužcích je detekovatelná již v prvních dvou hodinách adsorpce v médiu s 15% FBS [31]. Vzor nicméně není ještě plně vyrýsován jako po dvou dnech, protože buňky neměly dost času k rozprostření na povrchu. V kontrolním experimentu bez FBS nebylo opět detekováno žádné preferenční

Příprava mikroskopu atomárních sil pro měření proteinů.

uspořádání buněk. Tedy již samotné usazování buněk v počátečním stadiu je silně ovlivněno proteiny z FBS. Buňky jsou v tomto stadiu pohyblivé a aktivně prohledávají své okolí. Dalšími faktory, které mohou ovlivnit selektivní růst buněk, je odlišná adheze buněk a proteinů a případně odlišné složení proteinové vrstvy na  vodíkem a kyslíkem zakončeném povrchu. Byla pozorována až o  40 % nižší adheze buněk k  vodíkem zakončenému diamantu v případě přítomnosti FBS než ke kyslíkem zakončenému diamantu [37]. Dále bylo zjištěno, že fibronektin jako jedna ze složek FBS má nejvýznamnější vliv na selektivní růst buněk [37]. Specifické složení kompletní vrstvy FBS na diamantu se však z důvodu komplexnosti tohoto roztoku dosud nepodařilo identifikovat. V případě média bez FBS se nevytvoří žádná proteinová vrstva, kterou by buňky detekovaly během jejich nasazení. Buňky po krátké době (2 h) nejsou zcela rozprostřeny, ale mají již viditelné kontakty se substrátem [31]. Obecný mechanismus adheze není znám. Po další kultivaci (48 h) v médiu doplněném o FBS zaujmou svůj normální tvar a rostou řádně na místech, kde nasedly (viz obr. 7a), protože měly dost času k vytvoření vlastní ECM a  tím k  přizpůsobení substrátu pod sebou. Zakončení diamantu vodíkem nebo kyslíkem tak samo

Příprava aparatury pro růst diamantu na velké ploše.

http://cscasfyz.fzu.cz

97

Referáty

- - - -- - - - - - - - -- -- buňka

voda

protein

-

ionty

-

protein

- -

-

protein

elektrické pole Debyova délka 10 nm

í kultivační medium

O O O O H H H H H H H H H H H H H H H H H HH O O O O

+ + + +

+ + + +

p-typový povrchový vodivý kanál

intrinsický (nevodivý) diamant

hloubka kanálu 10 nm

98

Obr. 10 Schematický model rozhraní mezi povrchově vodivým kanálem SG-FET na diamantu a buněčným médiem obsahujícím proteiny a buňky. Rozložení elektrického pole a jeho dosah přes rozhraní je znázorněn po pravé straně. Ukazuje omezení vzájemné interakce na vzdálenost jen několika desítek nm.

o sobě (bez počátečního působení proteinů FBS) zřejmě není rozhodující pro buněčnou selektivitu. Z  hlediska elektronických vlastností systému diamant-protein-buňka vykazují diamantové tranzistory SG-FET posun převodních charakteristik směrem k záporným napětím na hradle po adsorpci proteinů z FBS a po kultivaci buněk. To odpovídá snížení vodivosti tranzistoru. Tento efekt nemůže být vysvětlen čistě elektrostatickým (polním) efektem. Hlavní rozpor je v tom, že nejvýznamnější proteiny z FBS (albumin, fibronectin, vitronectin) a také buněčné membrány mají ve  fyziologickém pH typicky záporný náboj. Tedy jejich přítomnost v  blízkosti hradla tranzistoru typu p by měla zvyšovat proud tranzistorem Ids, což se v tomto případě neděje. Jak již bylo ukázáno, proteiny na hydrofobním povrchu se stávají denaturovanými tím, že jejich jádro se přitiskne k  povrchu diamantu. Mohou tedy modifikovat původní rovnováhu systému povrchově vodivé vrstvy, která spočívá v rovnováze chemických potenciálů v diamantu a roztoku [38, 22]. Negativní posun tedy nastává pravděpodobně díky změně materiálových vlastností diamantu (vodivosti), což je v souladu se snížením strmosti převodové křivky (transkonduktance). Snížení svodových proudů po adsorpci FBS zle vysvětlit tím, že vrstva FBS vytváří

Manipulace se vzorkem diamantového tranzistoru.

http://cscasfyz.fzu.cz

dodatečnou izolační vrstvu na hradlu tranzistoru. Naopak pozorované zvýšení svodových proudů naznačuje, že proteiny z FBS mohou i snižovat elektronickou bariéru systému diamant-elektrolyt způsobenou povrchovými dipóly C-H [24] a usnadnit tak přenos náboje přes rozhraní s roztokem. Tento efekt je neočekávaný a proto tyto jevy dále podrobněji zkoumáme pomocí elektrických a AFM měření. Primární monovrstva FBS na povrchu přetrvává [6, 39] a nelze ji odstranit ani běžnými postupy oplachování, včetně použití detergentů a enzymů. To vysvětluje, proč je posun převodních charakteristik tranzistoru SG-FET trvalý. Další záporný posun převodních charakteristik byl pozorován po  kultivaci buněk. Tento posun nemůže být připisován samotným buňkám, neboť přetrvává i po odstranění buněk. Jedním z důvodů může být, že osteoblastické buňky drží na povrchu pouze v limitovaném počtu bodů (tzv. fokální adheze), které nemohou pokrýt celou plochu hradla, a zbytek buňky není v přímém kontaktu s povrchem substrátu [3]. Navíc buňky na H-diamantu nemají tendenci se rozprostřít a adherovat, spíše tvoří mosty k O-diamantu, pokud je nablízku [30]. Mezi buňkou a  povrchem diamantu je navíc ještě vrstva proteinů z  FBS. Proto je většina buněčné membrány pravděpodobně dále než Debyeova délka v médiu, která je <10 nm díky přítomnosti solí a dalších iontových sloučenin v kultivačním médiu. Proto usuzujeme, že posun po kultivaci buněk je díky změně adsorbované vrstvy proteinů, která zůstává na diamantu dokonce i po oplachování [6, 39]. V takových změnách mohou hrát buňky aktivní roli, protože osteoblasty neustále modifikují svoje prostředí a následně vytvářejí svoje ECM. Detailní vliv jednotlivých kroků kultivačního procesu je předmětem dalšího zkoumání. Nicméně na základě výše uvedených úvah a experimentálních poznatků jsme navrhli mikroskopický model rozhraní mezi kanálem diamantového SG-FET a buněčným médiem obsahujícím proteiny a buňky [28]. Tento model je schematicky znázorněn na obr. 10.

Závěrečné shrnutí V této studii o vlastnostech a využití diamantu pro biomedicínské aplikace jsme ukázali, že kombinace ploch zakončených vodíkem a  kyslíkem umožňuje řízené uspořádávání buněk do mikrostruktur. Buňky preferují plochy zakončené kyslíkem. Tento efekt je obecný a platí pro různé typy buněk. Nejlepší selektivity je dosaženo pro nízké počáteční koncentrace buněk (2 500 buněk/cm2) bez ohledu na geometrii povrchu a běžné koncentrace FBS (5% až 15%). Vyšší počáteční koncentrace buněk umožňují kolonizaci i méně vhodného vodíkem zakončeného povrchu, který je elektricky vodivý, a tudíž může být použit v elektronických zařízeních. Buňky nasazené v médiu bez FBS kolonizují povrch nezávisle na mikrostrukturách. Preferenční růst buněk je tedy řízen vlastnostmi proteinů na H- a O-zakončeném povrchu, a  nikoliv přímým působením povrchových dipólů diamantu na buňky. Mikroskopie atomárních sil (AFM) odhalila přítomnost tenké vrstvy (2–4 nm) proteinů na obou površích, nicméně v odlišné konformaci. Na  základě těchto měření byl vytvořen model uspořádání proteinů na diamantu, které je řízeno smáčivostí povrchu obdobně jako u jiných materiálů. Kromě konformace proteinů mohou k preferenčnímu růstu buněk ještě přispívat jejich různá adheze a složení FBS vrstvy na H- a O-diamantu.

č. 2 Elektronické efekty na rozhraní diamant-protein-buňka byly charakterizovány pomocí tranzistorů SG-FET založených na povrchové vodivosti nanokrystalického diamantu a na izolaci hradla pouze vodíkovými atomy. Ukázali jsme, že tyto tranzistory jsou plně funkční a  slouží jako převodník (a  částečně zesilovač) charakteristik biologických materiálů a  prostředí na elektrické signály. Adsorpce proteinů z kultivačního média obohaceného FBS a kultivace buněk vedla k posunu převodních charakteristik tranzistoru v rozsahu desítek až jednoho sta mV. To je způsobeno zejména vytvořením tenké vrstvy proteinů, jak bylo zjištěno pomocí AFM. Zásadní poznatek je, že tyto posuny nemohou být vysvětleny čistě elektrostatickým (polním) efektem, protože ten vede k posunu převodních charakteristik v  opačném směru. Navrhli jsme model, ve kterém proteiny nahrazují ionty v blízkém okolí povrchu diamantu. Negativní posun převodních charakteristik je pravděpodobně díky změně materiálové vlastnosti diamantu (vodivosti), což je v souladu se snížením sklonu křivek (transkonduktance). Svodové proudy naznačují, že vrstva FBS může podpořit přenos náboje přes rozhraní diamantu s roztokem. Další probíhající výzkum by měl zodpovědět dosud otevřené otázky ohledně složení adsorbovaných vrstev FBS na diamantu, vlivu jednotlivých kroků inkubačního procesu na proteinové vrstvy, vlivu proteinů a buněk na svodové proudy diamantových tranzistorů, a  zejména možnost přímé elektrické detekce buněčných funkcí pomocí rozhraní s  diamantem, jak bylo naznačeno v případě neuronů [29]. Výše uvedené poznatky a  závěry jsou zásadní pro využití unikátních vlastností diamantu v biosenzorech a biotechnologiích, které mohou najít uplatnění v medicíně i dalších oborech. Tento výzkum byl realizován za finanční podpory projektů KAN400100701 (AVČR), IAAX00100902 (GAAV), LC510 (MŠMT), LC06040 (MŠMT), MSM0021620806 (MŠMT), 202/09/H041 (GAČR), institucionálního záměru AV0Z10100521 a stipendií Fellowship J. E. Purkyně (BR, AK) a Fellowship 2010 L´Oreal-UNESCO for Women in Science (MK). Poděkování za technickou podporu při řešení této problematiky patří Zdence Poláčkové, Vlastimilu Jurkovi, Karlu Jurkovi a Lence Michalíkové. Softwarové knihovny TAFLAB pro vytvoření měřicího softwaru vyvinul a laskavě poskytl Dr. Antonín Fejfar.

Čs. čas. fyz. 61 (2011)

Nastavování zařízení pro osvit litografických masek.

Literatura [1] J. Shakenraad, H. Busscher: „Cell-polymer interactions:the influence of protein adsorption“, Colloid Surf. 42, 331 (1989). [2] A. Kromka, B. Rezek, M. Kalbacova, V. Baresova, J. Zemek, C. Konak, M. Vanecek: „Diamond seeding and growth of hierarchically structured films for tissue engineering“, Adv. Eng. Mater. 11, B71 (2009). [3] M. Kalbacova, B. Rezek, V. Baresova, C. Wolf-Brandstetter, A. Kromka: „Nano-scale topography of nanocrystalline diamonds promotes differentiation of osteoblasts“, Acta Biomaterialia 5, 3076 (2009). [4] M. Tanaka, A. Takayama, E. Ito, H. Sunami, S. Yamamoto, M. Shimomura: „Effect of pore size of self-organized honeycomb-patterned polymer films on spreading, focal adhesion, proliferation and function of endothelial cells“, J. Nanosci. Nanotechnol. 7, 763 (2007). [5] M. M. Browne, G. V. Lubarsky, M. R. Davidson, R. H. Bradley: „Protein adsorption onto polystyrene surfaces studied by XPS and AFM“, Surf. Sci. 553, 155 (2004). [6] B. Rezek, E. Ukraintsev, L. Michalikova, A. Kromka, J. Zemek, M. Kalbacova: „Adsorption of fetal bovine serum on H/O-terminated diamond studied by atomic force microscopy“, Diam. Relat. Mater. 18, 918 (2009). [7] M. Kalbacova, M. Kalbac, L. Dunsch, A. Kromka, M. Vanecek, B. Rezek, U. Hempel, S. Kmoch: „The effect of SWCNT and nano-diamond films on human osteoblast cells“, phys. stat. sol. (b) 244, 4356 (2007). [8] L. Grausova, L. Bacakova, A. Kromka, M. Vanecek, B. Rezek, V. Lisa: „Molecular markers of adhesion, maturation and immune activation of human osteoblast-like MG63 cells on nanocrystalline diamond films“, Diam. Relat. Mater. 18, 258 (2009). [9] C. E. Nebel, D. Shin, B. Rezek, N. Tokuda, H. Uetsuka, H. Watanabe: „Diamond and biology“, J. R. Soc. Interface 4, 439 (2007). [10] S. Potocky, A. Kromka, J. Potmesil, Z. Vorlicek, M. Vanecek, M. Michalka: „Investigation of nanocrystalline diamond films grown on silicon and glass at substrate temperature below 400 C“, Diamond Relat. Mater. 16, 744 (2007). [11] A. Kromka, B. Rezek, Z. Remes, M. Michalka, M. Ledinský, J. Zemek, J. Potmesil, M. Vanecek: „Formation of continuous nanocrystalline diamond layer on glass and silicon at low temperatures“, Chem. Vap. Deposition 14, 181 (2008).

Umístění vzorku pro optickou litografii.

[12] H. Kozak, A. Kromka, O. Babchenko, B. Rezek: „Directly grown nanocrystalline diamond field-effect transistor microstructures“, Sensor Lett. 8, 482 (2010).

http://cscasfyz.fzu.cz

99

100

Referáty müller, M. Stutzmann: Protein-modified nanocrystalline diamond thin films for biosensor applications, Nature Mat. 3, 736 (2004). [28] B. Rezek, M. Kratka, A. Kromka, M. Kalbacova: „Effects of protein inter-layers on cell-diamond fet characteristics“, Biosens. Bioelectron. 26, 1307 (2010). [29] M. Dankerl, S. Eick, B. Hofmann, M. Hauf, S. Ingebrandt, A. Offenhäusser, M. Stutzmann, J. A. Garrido: „Diamond transistor array for extracellular recording from electrogenic cells“, Adv. Funct. Mater. 19, 2915 (2009). [30] M. Kalbacova, L. Michalikova, V. Baresova, A. Kromka, B. Rezek, S. Kmoch: „Adhesion of osteoblasts on chemically patterned nanocrystalline diamonds“, phys. stat. sol. (b) 245, 2124 (2008). [31] B. Rezek, L. Michalikova, E. Ukraintsev, A. Kromka, M. Kalbacova: „Micro-pattern guided adhesion of osteoblasts on diamond surfaces“, Sensors 9, 3549 (2009).

Pracoviště pro měření elektrických charakteristik diamantových biotranzistorů.

[13] K. Tsugawa, M. Ishihara, J. Kim, Y. Koga, M. Hasegawa: „Nanocrystalline diamond film growth on plastic substrates at temperatures below 100 °C from low-temperature plasma“, Phys. Rev. B 82, 125460 (2010). [14] A. Kromka, O. Babchenko, T. Izak, K. Hruska, B. Rezek: „Linear antenna microwave plasma cvd deposition of diamond films over large areas“, Vacuum, podáno do redakce. [15] L. Tang, C. Tsai, W. Gerberich, L. Kruckeberg, D. Kania: „Biocompatibility of chemical-vapour-deposited diamond“, Biomaterials 16, 483 (1995). [16] P. Bajaj, D. Akin, A. Gupta, D. Sherman, B. Shi, O. Auciello, R. Bashir: „Ultrananocrystalline diamond film as an optimal cell interface for biomedical applications“, Biomed. Devices 9, 787 (2007). [17] B. Rezek, C. Sauerer, C. E. Nebel, M. Stutzmann, J. Ristein, L. Ley, E. Snidero, P. Bergonzo: „Fermi level on hydrogen terminated diamond surfaces“, Appl. Phys. Lett. 82, 2266 (2003). [18] B. Rezek, D. Shin, H. Uetsuka, C. E. Nebel: „Microscopic diagnostics of DNA molecules on mono-crystalline diamond“, phys. stat. sol. (a) 204, 2888 (2007). [19] S. G. Ri, T. Mizumasa, Y. Akiba, Y. Hirose, T. Kurosu, M.  Iida: „Formation mechanism of p-type surface conductive layer on deposited diamond films“, Jpn. J. Appl. Phys. 34, 5550 (1995). [20] H. Kawarada: „Hydrogen-terminated diamond surfaces and interfaces“, Surf. Sci. Rep. 26, 205 (1996).

[32] H. Kozak, A. Kromka, M. Ledinský, B. Rezek: „Enhancing nanocrystalline diamond surface conductivity by deposition temperature and chemical post-processing“, phys. stat. sol. (a) 206, 276 (2009). [33] M. Kalbacova, S. Roessler, U. Hempel, R. Tsaryk, K. Peters, D. Scharnweber, C. Kirkpatrick, P. Dieter: „The effect of electrochemically simulated titanium cathodic corrosion products on ros production and metabolic activity of osteoblasts and monocytes/macrophages“, Biomaterials 28, 3263 (2007). [34] L. Michalikova, B. Rezek, A. Kromka, M. Kalbacova: „CVD diamond films with hydrophilic micro-patterns for self-organisation of human osteoblasts“, Vacuum 84, 61 (2009). [35] B. Rezek, D. Shin, T. Nakamura, C. E. Nebel: „Geometric properties of covalently bonded DNA on single-crystalline diamond“, J. Am. Chem. Soc. 128, 3884 (2006). [36] C. Popov, W. Kulisch, J. Reithmaier, T. Dostalova, M. Jelinek, N. Anspach, C. Hammann: „Bioproperties of nanocrystalline diamond/amorphous carbon composite films“, Diamond Relat. Mater. 16, 735 (2007). [37] B. Rezek, E. Ukraintsev, A. Kromka, M. Ledinský, A. Broz, L. Noskova, H. Hartmannova, M. Kalbacova: „Assembly of osteoblastic cell micro-arrays on diamond guided by protein pre-adsorption“, Diam. Relat. Mater. 19, 153 (2010). [38] F. Maier, M. Riedel, B. Mantel, J. Ristein, L. Ley: „Origin of surface conductivity in diamond“, Phys. Rev. Lett. 85, 3472 (2000). [39] E. Ukraintsev, B. Rezek, A. Kromka, A. Broz, M. Kalbacova: „Long-term adsorption of fetal bovine serum on H/O-terminated diamond studied in-situ by atomic force microscopy“, phys. stat. sol. (b) 246, 2832 (2009).

[21] F. Maier, J. Ristein, L. Ley: „Electron affinity of plasma-hydrogenated and chemically oxidized diamond (100) surfaces“, Phys. Rev. B 64, 65411 (2001). [22] V. Chakrapani, J. C. Angus, A. B. Anderson, S. D. Wolter, B. R. Stoner, G. U. Sumanasekera: „Charge transfer equilibria between diamond and an aqueous oxygen electrochemical redox couple“, Science 318, 1424 (2007). [23] C. E. Nebel, B. Rezek, D. Shin, H. Watanabe, T. Yamamoto: „Electronic properties of h-terminated diamond in electrolyte solutions“, J. Appl. Phys. 99, 033711 (2006). [24] B. Rezek, D. Shin, H. Watanabe, C. E. Nebel: „Intrinsic hydrogen-terminated diamond as ion-sensitive field effect transistor“, Sens. Actuators B 122, 596 (2007). [25] M. Dankerl, A. Reitinger, M. Stutzmann, J. A. Garrido: „Resolving the controversy on the ph sensitivity of diamond surfaces“, phys. stat. sol. RRL 2, 31 (2007). [26] W. Yang, O. Auciello, J. E. Butler, W. Cai, J. A. Carlisle, J. E. Gerbi, D. M. Gruen, T. Knickerbocker, T. L. Lasseter, J. J. N. Russel, L. M. Smith, R. J. Hamers: „DNA-modified nanocrystalline diamond thin films as stable, biologically active substrates“, Nature Mat. 1, 253 (2002). [27] A. Härtl, E. Schmich, J. A. Garrido, J. Hernando, S. C. R. Catharino, S. Walter, P.  Feulner, A. Kromka, D.  Stein-

http://cscasfyz.fzu.cz

Držák pro měření tranzistorů v roztoku.