BIOLOGICKÁ AKTIVITA BOBULOVITÝCH PLODIN LONICERA CAERULEA L. A VACCINIUM MACROCARPON AIT

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI LÉKAŘSKÁ FAKULTA

BIOLOGICKÁ AKTIVITA BOBULOVITÝCH PLODIN LONICERA CAERULEA L. A VACCINIUM MACROCARPON AIT.

DISERTAČNÍ PRÁCE

Olomouc 2009

Irena Palíková

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI LÉKAŘSKÁ FAKULTA

Irena Palíková

BIOLOGICKÁ AKTIVITA BOBULOVITÝCH PLODIN LONICERA CAERULEA L. A VACCINIUM MACROCARPON AIT. DISERTAČNÍ PRÁCE

Školitelka: Ing. Kateřina Valentová, Ph.D. Obor: Lékařská chemie a biochemie

Disertační práce byla vypracována během prezenční formy doktorského studia na Ústavu lékařské chemie a biochemie Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci v období září 2006 – září 2009.

Prohlašuji, že jsem disertační práci vypracovala samostatně s použitím uvedené literatury, kterou cituji. Spoluautoři souhlasí s použitím publikovaných výsledků.

V Olomouci dne 25. 9. 2009

…..…………….. Ing. Irena Palíková

Děkuji pracovníkům Ústavu lékařské chemie a biochemie LF UP za vytvoření dobrého pracovního prostředí a pomoc při řešení odborných problémů. Zvláště děkuji své školitelce Ing. Kateřině Valentové, Ph.D. a panu prof. MUDr. RNDr. Vilímu Šimánkovi, DrSc. za odborné vedení, cenné připomínky, rady a předané zkušenosti během mého doktorského studia, při výzkumné části i při vlastním sepisování disertační práce. Doc. RNDr. Jitce Vostálové, Ph.D. děkuji za cennou spolupráci a rady nejen při pokusech na zvířatech. Ing. Adéle Zdařilové, Ph.D. a Ing. Aleně Svobodové, Ph.D. (Ústav lékařské chemie a biochemie, LF UP, Olomouc), doc. MUDr. Rostislavu Večeřovi, Ph.D. (Ústav farmakologie, LF UP, Olomouc), doc. MUDr. Davidu Stejskalovi, Ph.D. a ostatním pracovníkům z Oddělení laboratorní medicíny (Nemocnice Šternberk), doc. RNDr. Janu Hrbáčovi, Ph.D. (Katedra fyzikální chemie, PřF UP, Olomouc) a MUDr. Drahomíře Černochové, CSc. (Ústav histologie a embryologie, LF UP, Olomouc) za pomoc při provádění pokusů na potkanech a měření speciálních parametrů. Dále děkuji panu Miroslavu Chovancovi (Zahradnictví Chovanec, Lipník nad Bečvou) za poskytnutý rostlinný materiál, doc. RNDr. Petru Bednářovi, Ph.D. (Katedra analytické chemie, PřF UP, Olomouc) za předané zkušenosti z oblasti kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie, prof. Ing. Aleši Lebedovi, DrSc. (Katedra botaniky, PřF UP, Olomouc) za rady z oblasti botaniky. Také firmě Walmark a.s. (Oldřichovice 44, 739 61 Třinec) za spolupráci a poskytnutou finanční podporu. Ing. Ladislavu Cvakovi, Ph.D. (IVAX Pharmaceuticals s.r.o., Opava), prof. Ing. Vladimíru Křenovi, DrSc., Ing. Petru Marholovi (Mikrobiologický ústav AV ČR, Praha) a RNDr. Vítězslavu Maierovi, Ph.D. (Katedra analytické chemie, PřF UP, Olomouc) děkuji za spolupráci při analýzách obsahových látek. Děkuji i doc. MUDr. Ivaně Oborné, Ph.D. (Porodnicko-gynekologická klinika, LF UP, Olomouc) za odběry biologického materiálu pro izolaci lidských endotelových buněk.

Prof. RNDr. Jitce Ulrichové, CSc., přednostce Ústavu lékařské chemie a biochemie, LF UP, děkuji za cenné rady a připomínky předané v průběhu celého mého působení na jejím pracovišti. Práce

byla

vypracována

v rámci

řešení

projektů

MŠM

6198959216

a FT-TA3/024. Děkuji také mému muži Martinovi za pochopení, trpělivost a podporu při studiu.

SOUHRN

SOUHRN V předkládané disertační práci byly analyzovány obsahové látky plodů zimolezu modrého (Lonicera caerulea L.), studována jejich biologická aktivita a ověřena bezpečnost konzumace klikvy velkoplodé (Vaccinium macrocarpon Ait.) na potkanech kmene Wistar. Obě plodiny, u nás dříve jen málo známé, jsou po staletí využívány v lidovém léčitelství. Zimolez modrý je původním keřem severní polokoule, především území Ruska a Číny. V tamní tradiční medicíně se používají květy, pupeny či jiné nadzemní části při infekčních onemocněních pro své antibakteriální, antipyretické a protizánětlivé účinky. Plody L. caerulea L. obsahují, kromě mnoha dalších látek, vitamin C, anthokyaniny a fenolové kyseliny. Díky vysoké koncentraci látek s antimikrobiální aktivitou se jeví jako vhodný doplněk stravy pro prevenci a léčbu onemocnění dutiny ústní. Jejich konzumace působí příznivě i u osob vystavených vyšší zátěži a riziku vzniku některých chronických onemocnění. V Evropě je této plodině prozatím věnována malá pozornost. Při analýze nutričních složek, vitaminů, minerálů a kontaminantů v plodech zimolezu modrého pěstovaného v ČR byly nalezeny hodnoty srovnatelné s množstvím těchto látek v plodech L. caerulea L. pěstovaných na území Číny. Z fenolových kyselin převažovaly chlorogenová a gentisová kyselina v plodech a kávová a ferulová kyselina ve fenolové frakci. Z anthokyaninů byl v obou případech nejvíce zastoupený kyanidin-3glukosid.

Identifikovány

byly

i

peonidin-3,5-diglukosid,

delfinidin-3-glukosid

a -3-rutinosid a pelargonidin-3,5-diglukosid a -3-rutinosid. Připravená fenolová frakce vykazovala redukční kapacitu při měření Folin-Ciocalteauovým činidlem a reagovala s 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazylem i superoxidovým radikálem. Koncentračně závisle inhibovala radikálové poškození potkaních mikrosomálních membrán vyvolané terc-butylhydroperoxidem i oxidaci lidských lipoproteinů o nízké hustotě indukovanou inkubací s Cu2+. Při dlouhodobé inkubaci s primárními kulturami potkaních hepatocytů a lidských endotelových buněk nepůsobila cytotoxicky ani při nejvyšší testované koncentraci a době inkubace (1000 µg·ml-1, 48 hod.) a v nejvyšší koncentraci (1000 µg·ml-1) vykazovala mírný cytoprotektivní účinek na obě kultury buněk po intoxikaci terc-butylhydroperoxidem. Při poškození endotelových buněk oxidovanými lipoproteiny o nízké hustotě byl signifikantní protektivní účinek fenolové frakce zaznamenán při koncentraci 0,1 µg·ml-1.

SOUHRN

Klikva velkoplodá je mnoho let používána k prevenci infekčních onemocnění močových cest. Klikva obsahuje jednoduché organické kyseliny, anthokyaniny, fenolové kyseliny a proanthokyanidiny. Většina těchto látek se metabolizuje na hippurovou kyselinu, a tak je vylučována močí, kde působí jako antibakteriální agens. Biologicky aktivní látky klikvy svým působením zabraňují adhezi Escherichia coli na epitel močových cest. Díky těmto schopnostem je klikva vhodným doplňkem stravy rizikových skupin, např. žen a mužů trpících záněty dolních cest močových. U V. macrocarpon Ait. byla ověřena bezpečnost na potkanech kmene Wistar. Jednalo se o sušené šťávy (NUTRICRAN®90S, HI-PAC 4.0) a celý plod (PACRAN®, Decas Botanical Synergies, USA). Konzumace diety obsahující použité přípravky V. macrocapon Ait. (1500 ppm) nevykazovala vedlejší nežádoucí účinky a po dobu 100 dnů bylo její užívání bezpečné. U skupiny zvířat krmené dietou obsahující NUTRICRAN®90S došlo ke snížení hladiny alkalické fosfatasy v plazmě a u skupiny krmené dietou s přípravkem PACRAN® k poklesu glutathionreduktasy a glutathionu v játrech. Bylo prokázáno, že fenolové látky a jejich metabolity se v těle potkana neakumulují a jsou vylučovány močí ve formě hippurové kyseliny. Plody Lonicera caerulea L. i Vaccinium macrocarpon Ait. jsou perspektivním zdrojem zdraví prospěšných látek a jejich konzumace je vhodnou prevencí vážných chronických onemocnění. Díky možnosti jejich pěstování v podmínkách střední Evropy mohou být vyhledávanými funkčními potravinami obohacující naši dietu.

Klíčová slova: Lonicera caerulea L., Vaccinium macrocarpon Ait., fenolové látky, antioxidační aktivita, cytoprotektivní účinky, potkaní hepatocyty, lidské endotelové buňky, potkan, bezpečnost, hippurová kyselina.

SUMMARY The present thesis focuses on (a) the constituents and biological activity of the blue honeysuckle (Lonicera caerulea L.) and (b) a safety study of cranberry (Vaccinium macrocarpon Ait.) in rodents. Both plants have been used for centuries in folk medicine by the native inhabitants of Nothern countries, but to date are practically unknown in the Czech Republic. Blue honeysuckle is a shrub native to the Nothern hemisphere, especially Russia and China. In indigenous medicine, flowers, buds and other aerial parts of the plant are used for their anti-bacterial, anti-pyretic and anti-inflammatory activities. The berries contain a huge amount of ascorbic acid, anthocyanins and phenolic acids as health promoting phytochemicals. Due to the high content of anti-microbial compounds, the berries are promising beneficial functional food for the prevention and treatment of buccal cavity diseases. Their consumption is convenient for people exposed to high risk of chronic inflammation. Analysis of the nutritional components, vitamins, minerals and contaminants of blue honeysuckle fruits grown in the Czech Republic were comparable with the findings from plants grown in China. Among phenolic acids chlorogenic and gentisic predominated in fruits and caffeic and ferulic in the phenolic fraction. Among anthocyanins cyanidin-3glucoside

predominated.

Peonidin-3,5-diglucoside,

delphinidin-3-glucoside

and -3-rutinoside and pelargonidin-3,5-diglucoside and -3-rutinoside were identified. The phenolic fraction displayed Folin-Ciocalteu reagent reducing and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl and superoxide scavenging activity. The phenolic fraction inhibited rat liver microsome peroxidation induced by tert-butylhydroperoxide and low density lipoprotein oxidation induced by Cu2+ in a dose dependent manner. It was nontoxic to rat hepatocytes and human umbilical vein endothelial cells at all tested concentrations and time intervals. The protective effects against cell damage caused by tert-butylhydroperoxide was noted at 1000 µg·ml-1 and against damage caused by oxidatively modified low density lipoproteins at 0.1 µg·ml-1. Cranberry (Vaccinium macrocarpon Ait.) has been used for the prevention of urinary tract infections for many years. It contains huge amounts of organic acids, anthocyanins, phenolic acids and proanthocyanidins. These types of compounds are usually metabolized to hippuric acid and in this form are excreted in the urine where they

SUMMARY act as an anti-microbial agent. Biologically active compounds can inhibit Escherichia coli adhesion to the bladder mucosal surface. For these reasons, Vaccinium macrocarpon Ait. is a promising dietary supplement for risk groups of human populations, such as women with repetitive urinary tract infections and men with prostate related health problems including urinary tract infection. V. macrocarpon Ait. berries were used for a safety study in Wistar rats. The dried juice (NUTRICRAN®90S, HI-PAC 4.0) and whole berries (PACRAN®; Decas Botanical Synergies, USA) were used for the study. They were nontoxic and a 100-day consumption was safe at a concentration 1500 ppm. The level of plasma alkaline phosphatase was significantly decreased in the group fed NUTRICRAN®90S and glutathionereductase and glutathione levels were significantly decreased in the group fed by PACRAN® in comparison to the control which received no supplementation. Phenolic compounds were shown to be eliminated as hippuric acid. Neither phenolics nor their metabolites accumulated within the body.

Lonicera caerulea L. and Vaccinium macrocarpon Ait. berries are a prospective source of health promoting phytochemicals and their consumption is promising in the prevention of a number of chronic diseases, especially lifestyle conditions. The plants can be cultivated in the area of Central Europe and thus could be a valuable functional food of the diet of the Czech Republic.

Keywords: Lonicera caerulea L., Vaccinium macrocarpon Ait., phenolic compounds, antioxidant activity, cytoprotectivity, rat hepatocytes, human endotelial cells, rat, safety, hippuric acid.

OBSAH

1. ÚVOD ......................................................................................................... 1 2. PŘEHLED SOUČASNÉHO STAVU PROBLEMATIKY ................... 3 2.1 LONICERA CAERULEA L. (ZIMOLEZ MODRÝ) ..................................................3 2.1.1 Botanický popis, historie, rozšíření, pěstování .................................................. 3 2.1.2 Chemické složení a biologické účinky obsahových látek.................................. 6 2.1.3 Využití v dietě a tradičním léčitelství ............................................................... 10 2.2 VACCINIUM MACROCARPON AIT. (KLIKVA VELKOPLODÁ)........................10 2.2.1 Botanický popis, historie, rozšíření, pěstování ................................................ 10 2.2.2 Chemické složení a biologické účinky obsahových látek................................ 12 2.2.3 Využití v dietě a tradičním léčitelství ............................................................... 16 2.3 BOBULOVITÉ OVOCE JAKO ZDROJ BIOLOGICKY AKTIVNÍCH FENOLOVÝCH LÁTEK ...............................................................................................17 2.3.1 Fenolové kyseliny ............................................................................................. 19 2.3.2 Flavonoly a flavony .......................................................................................... 20 2.3.3 Anthokyaniny.................................................................................................... 21 2.3.4 Proanthokyanidiny ........................................................................................... 23

3. CÍLE DISERTAČNÍ PRÁCE ................................................................ 26 4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST.................................................................. 27 4.1 BIOLOGICKÝ MATERIÁL ....................................................................................27 4.1.1 Rostlinný materiál ............................................................................................ 27 4.1.2 Zvířata............................................................................................................... 27 4.1.3 Lidský biologický materiál ............................................................................... 27 4.2 CHEMIKÁLIE, ROZTOKY A PŘÍSTROJE ............................................................28 4.2.1 Chemikálie ........................................................................................................ 28 4.2.2 Roztoky.............................................................................................................. 30 4.2.3 Přístroje............................................................................................................. 34 4.2.4 Ostatní materiál ................................................................................................ 36 4.3 STATISTICKÉ ZHODNOCENÍ..............................................................................37 4.4 LONICERA CAERULEA L. ...................................................................................37 4.4.1 Zpracování plodů.............................................................................................. 37 4.4.2 Analýza obsahových látek ................................................................................ 38 4.4.3 Stanovení antioxidační aktivity fenolové frakce ............................................. 42 4.4.4 Stanovení inhibice lipoperoxidace................................................................... 43 4.4.5 Stanovení inhibice oxidace lidských LDL ....................................................... 44 4.4.6 Buněčné modely ............................................................................................... 45 4.5 VLIV VACCINIUM MACROCARPON AIT. NA VYBRANÉ FYZIOLOGICKÉ PARAMETRY A METABOLISMUS POTKANA...........................................................49 4.5.1 Průběh experimentu ......................................................................................... 49

OBSAH 4.5.2 Stanovení obsahu anthokyaninů a fenolových kyselin v dietě a biologických vzorcích ...................................................................................................................... 50 4.5.3 Stanovení parametrů klinické biochemie a hematologie................................ 52 4.5.4 Stanovení parametrů oxidačního stresu.......................................................... 52 4.5.5 Stanovení koncentrace cytochromu P450 ....................................................... 58 4.5.6 Histologická analýza ........................................................................................ 59 4.5.7 Stanovení poškození DNA (Comet assay)........................................................ 59 4.6 STANOVENÍ KONCENTRACE PROTEINŮ .........................................................61 4.6.1 Metoda kyseliny bicinchoninové...................................................................... 61 4.6.2 Metoda dle Lowryho......................................................................................... 62 4.6.3 Metoda dle Bradfordové................................................................................... 62

5. VÝSLEDKY............................................................................................. 63 5.1 OBSAHOVÉ LÁTKY A BIOLOGICKÁ AKTIVITA L. CAERULEA L....................63 5.1.1 Nutriční složky, minerály, vitaminy a kontaminanty ...................................... 63 5.1.2 Cukry................................................................................................................. 64 5.1.3 Lipidy ................................................................................................................ 64 5.1.4 Organické kyseliny ........................................................................................... 65 5.1.5 Fenolové látky................................................................................................... 66 5.2 ANTIOXIDAČNÍ AKTIVITA FENOLOVÉ FRAKCE L. CAERULEA L. ...............69 5.2.1 Stanovení redukční kapacity ............................................................................ 69 5.2.2 Zhášení DPPH radikálu................................................................................... 69 5.2.3 Interakce se superoxidovým radikálem ........................................................... 70 5.2.4 Inhibice lipoperoxidace.................................................................................... 70 5.2.5 Inhibice oxidace lidských LDL ........................................................................ 70 5.3 VLIV FENOLOVÉ FRAKCE L. CAERULEA L. NA BUNĚČNÉ KULTURY ........71 5.3.1 Primární kultury potkaních hepatocytů .......................................................... 71 5.3.2 Primární kultury endotelových buněk ............................................................. 73 5.4 VLIV VACCINIUM MACROCARPON AIT. NA VYBRANÉ FYZIOLOGICKÉ PARAMETRY A METABOLISMUS POTKANA...........................................................81 5.4.1 Spotřeba krmiva a tělesná hmotnost................................................................ 81 5.4.2 Stanovení fenolových kyselin a anthokyaninů v dietě, moči, trusu, játrech a plazmě ..................................................................................................................... 83 5.4.3 Biochemická analýza........................................................................................ 85 5.4.4 Hematologické vyšetření .................................................................................. 86 5.4.5 Parametry oxidačního stresu a obsah cytochromu P450................................ 86 5.4.6 Vliv experimentálních diet na poškození DNA ............................................... 88 5.4.7 Morfologická struktura ledvin, jater, srdce a střeva ....................................... 89

6. DISKUSE ................................................................................................. 90 6.1 LONICERA CAERULEA L. ...................................................................................90 6.2 VACCINIUM MACROCARPON AIT. ...................................................................97

7. ZÁVĚRY ................................................................................................ 101

OBSAH 8. SEZNAM PRACÍ VZTAHUJÍCÍCH SE K DISERTACI ................ 103 9. OSTATNÍ PRÁCE ................................................................................ 106 10. LITERATURA .................................................................................... 107

SEZNAM ZKRATEK

SEZNAM ZKRATEK AAS

atomová absorpční

DTT

D,L-dithiothreitol

spektrometrie

EBS

Earleův solný roztok

ACN

acetonitril

EDTA ethylendiamintetraoctová kyselina

ALP

alkalická fosfatasa

EGTA ethylenglykol-O,O-bis(2-

ALT

alaninaminotransferasa

aminoethyl)-N,N,N´,N´-tetraoctová

AOPP produkty pokročilé oxidace

kyselina

proteinů

ELISA imunoenzymatické stanovení

AST

aspartátaminotransferasa

FCS

fetální telecí sérum

BCA

bicinchoninová kyselina

FID

plamenový ionizační detektor

BHA

butylhydroxyanisol

FLD

fluorescenční detektor

BSA

hovězí sérový albumin

FPD

plamenový fotometrický detektor

GC

plynová chromatografie

GIT

trávicí ústrojí

CDNB 1-chloro-2,4-dinitrobenzen

GPx

glutathionperoxidasa

CH 27 buněčná linie odvozená od

GSH

redukovaný L-glutathion

Caco-2 buněčná linie odvozená od adenokarcinomu střeva

B buněk pankreatu CIOMS Mezinárodní etická komise pro

GSHred glutathionreduktasa GSSG oxidovaný L-glutathion

biomedicíncký výzkum

GST

cJNK

c-Jun-N-terminální kinasa

HEPES N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N´-

CYP

cytochrom P450

DAD

detektor diodového pole

ethansulfonová kyselina HepG2 buněčná linie odvozená z lidských

DMEM Eagleovo médium modifikované Dulbeccoem

hepatomových buněk HL-60 buněčná linie odvozená z lidských

DMEM/F12 DMEM s přídavkem Ham F-12

leukemických buněk HPLC

DMSO dimethylsulfoxid DPPH 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl

vysokoúčinná kapalinová chromatografie

HPTLC vysokoúčinná chromatografie na

DTNB 5,5´-dithio-bis-(2-nitrobenzoová) kyselina

glutathion-S-transferasa

tenké vrstvě HRP

křenová peroxidasa

SEZNAM ZKRATEK HT 29 buněčná linie odvozená od

PAGE elektroforéza v polyakrylamidovém

rakoviny konečníku HUVEC lidské endotelové buňky

gelu PBS

z pupeční žíly H460

fyziologický roztok upravený fosfátem na pH 7,4

buněčná linie odvozená od

PMS

fenazin methosulfát

rakoviny plic

PVDF polyvinyliden difluoridová membrána

CHE

cholinesterasa

IC50

koncentrace látky, při které je

RID

refraktometrický detektor

dosaženo 50% inhibice

SD

směrodatná odchylka

LC

kapalinová chromatografie

SDS

dodecylsulfát sodný

LDH

laktátdehydrogenasa

SOD

superoxiddismutasa

LDL

lipoproteiny o nízké hustotě

SPE

extrakce tuhou fází

MEM

minimální esenciální médium

subg.

podrod (bot.)

MS

hmotnostní spektrometrie

TAC

celková antioxidační kapacita

MTT

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

TBA

thiobarbiturová kyselina

difenyltetrazolium bromid

TBARS látky reagující s thiobarbiturovou

NADH redukovaný nikotinamidadenin-dinukleotid NADPH redukovaný nikotinamidadenin-dinukleotid fosfát NBT

NCS

tBH

terc-butylhydroperoxid

TBS

izotonický Tris pufr

TBS/T izotonický Tris pufr s přídavkem

2,2´-di-p-nitrofenyl-5,5´-difenyl-

0,05 % Tween-20

3,3´-[3,3´-dimethoxy-4,4´-

TCA

difenylen]ditetrazolium chlorid

TEMED tetramethylethylendiamin

(nitrotetrazoliová modř)

TFA

trifluoroctová kyselina

telecí sérum

TLC

chromatografie na tenké vrstvě

TNB

5-thio-2-nitrobenzoát

NF-κB jaderný faktor kappa B NR

kyselinou

neutrální červeň

oxLDL oxidované lipoproteiny o nízké hustotě

trichloroctová kyselina

TNF-α tumor nekrotizující faktor α Tris

tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

UV

ultrafialová oblast spektra

SEZNAM ZKRATEK VEGF vaskulární endotelový růstový faktor VIS

viditelná oblast spektra

VLDL lipoproteiny o velmi nízké hustotě WME

Williamsovo medium E

XOD

xanthinoxidasa

ÚVOD

1

1. ÚVOD Životní styl rozvinutých zemí klade nároky na funkci celého organismu v podobě zvýšené zátěže, nesprávných stravovacích návyků, nedostatku pohybu atd. Dochází k výraznému nárůstu množství lidí, u nichž v důsledku způsobu života vzrůstá počet civilizačních chorob, autoimunitních onemocnění, alergií, nemocí spojených s narušením metabolismu cholesterolu a s bakteriálními infekcemi. Optimálním složením diety lze předcházet nežádoucímu vlivu okolí na organismus i mnohým chronickým onemocněním, a snižovat tak náklady zdravotní péče. Nutraceutika, dělená na obohacené potraviny a doplňky stravy, mají prokazatelný fyziologický účinek, za něž je zodpovědná jedna či více jejich složek, obsahujících určitou skupinu látek (fytochemikálií). K nim patří zejména vitaminy, fenolové kyseliny, flavonoidy, anthokyaniny, proanthokyanidiny, fytosteroly, karotenoidy, polynenasycenné mastné kyseliny a další. Bobulovité ovoce je jedním z významných zdrojů fytoceutik, jejichž účinky mohou snižovat riziko vzniku nádorových, kardiovaskulárních a jiných chronických onemocnění. Mnoho

prací

prokázalo

jejich

antioxidační,

antibakteriální,

antimikrobiální,

protinádorové, protizánětlivé i antimutagenní vlastnosti. Plody jsou bohaté na vitamin C, vitaminy skupiny B a fenolové látky, především fenolové kyseliny, anthokyaniny a proanthokyanidiny. Jsou to právě anthokyaniny, které propůjčují ovoci typické zbarvení a mají příznivé účinky na lidský organismus. Obsah fenolových látek však závisí na době sklizně, stupni zralosti, genetických odlišnostech a podmínkách okolního prostředí. Bobuloviny se přirozeně vyskytují zejména v oblastech mírného pásu severní polokoule, je proto možné jejich pěstovaní v klimatických podmínkách České republiky. V tradiční medicíně Ruska, Číny a Severní Ameriky je využívána většina těchto rostlin, zatímco u nás byly až donedávna pěstovány především jako okrasné keře.

Ve své disertační práci jsem se věnovala studiu biologické aktivity dvou z bobulovitých rostlin, a to zimolezu modrého (Lonicera caerulea L.) a klikvy velkoplodé (Vaccinium macrocarpon Ait.). U zimolezu modrého jsem se zaměřila na získání základních dat jeho složení a biologické aktivity na subcelulárních i buněčných modelech in vitro s následným možným použitím in vivo. U klikvy, jejíž biologické účinky jsou

ÚVOD

2

dobře známy, jsem se zabývala ověřením bezpečnosti konzumace, vlivem na vybrané fyziologické parametry a detekcí metabolitů fenolových látek v plasmě, moči, trusu a játrech potkana.

PŘEHLED SOUČASNÉHO STAVU PROBLEMATIKY

3

2. PŘEHLED SOUČASNÉHO STAVU PROBLEMATIKY 2.1 Lonicera caerulea L. (zimolez modrý) 2.1.1 Botanický popis, historie, rozšíření, pěstování Lonicera caerulea L. (obr. 1, 2) patří do rodu Lonicera L. (zimolez) čeledi Caprifoliaceae (zimolezovité), do níž se dále řadí rody Weigela Thunb. (weigelie), Viburnum L. (kalina), Symphoricarpos Duh. (pámelník), Diervilla Mill. (zanice), Kolkwitzia Graebner (kolkwitzie) a Linnaea L. (zimozel; cit.1,2). Rod Lonicera, zahrnující okolo 180 druhů opadavých nebo stálezelených, keřovitých, popínavých nebo půdopokryvných dřevin, se přirozeně vyskytuje zejména na severní polokouli. Nejjižnější výskyt byl zaznamenán v Mexiku, severní Africe, na Jávě a Filipínách3. Názvosloví zimolezů je velice komplikované. Mnoho druhů je často klasifikováno jako variety a má více synonym. Rod Lonicera je rozsáhle geneticky variabilní. Například od L. involucrata (Richardson) Spreng. je odvozeno deset různých hybridů4. Mnohé z druhů zimolezu jsou pěstovány jen jako okrasné keře a popínavé rostliny (L. periclymenum L.; cit.2,5), zvláště pro své nádherné květy a ornamentální plody3. Některé zimolezy mají nejedlé, někdy i mírně jedovaté plody (L. xylosteum L.). Jiné jsou jedlé či slouží především jako potrava ptáků (L. tatarica L.). Jejich barva přechází od bílé či žluté přes oranžovou a červenou až po modrou nebo černou a je znakem zralosti plodů. Plody zimolezu dozrávají brzy na jaře a v létě. Rostliny z rodu Lonicera se vyznačují vysokou odolností vůči mrazu6. Některé druhy se využívají v tradiční indické, čínské a japonské medicíně jako antipyretické, diuretické a antidyzenterické agens5.

Obr. 1. Lonicera caerulea L. (zimolez modrý; cit.7).


4

Obr. 2. Plody Lonicera caerulea L.10 L. caerulea L. patří do sekce Isika Redh., podsekce Caeruleae Redh. (obr. 3). Rozsah podsekce je již mnoho let předmětem výzkumu a četných diskuzí. Různí autoři dokonce rozlišují v rámci podsekce až 11 druhů. U druhu L. caerulea L. dnes převládají tendence zařazovat dříve uváděné druhy L. altaica, L. caerulea, L. emphyllocalyx, L. kamtschatica, L. pallasii, L. stenantha, L. vebulosa jako poddruhy tohoto druhu8. L. caerulea L. se původně vyskytovala v Rusku (Kamčatka, Sibiř), v severovýchodní Asii a Japonsku9,10, kde je běžnou součástní denní diety. V Evropě je rozšířena převážně v oblasti Alp a Skandinávie11. L. caerulea L. byla poprvé botanicky popsána v roce 1894 a první pokusy o její pěstování proběhly v severním a východním Rusku v letech 1913-1915. Rozsáhlejší pěstitelské práce začaly v 50. letech minulého století. V polovině 80. let pokračovala v práci na šlechtění M. N. Plekhanová na oddělení ovocných plodin Vavilovova výzkumného institutu v Petrohradu12. Během posledních 25 let vzniklo v Rusku více než 68 kultivarů, z toho nejméně 60 je komerčně využíváno a mnoho z nich bylo rozšířeno i do Severní Ameriky11. L. caerulea L. je v anglicky mluvících zemích známa jako blue honeysuckle, honeyberry, edible honeysuckle nebo sweet berry honeysuckle9. V České republice se pěstuje již několik desítek let a nese název zimolez modrý či kamčatský nebo též obchodní značku kamčatská borůvka®. Keře zimolezu modrého původně dorůstaly výšky 0,8-3,0 m, dnes dosahují výšky 1,8 m a šířky asi 1,0 m (cit.12). Listy jsou vstřícné, celistvé, kopinaté až oválné a mohou být ochmýřené nebo holé. Květy jsou asi 2 cm velké, mají žlutou barvu a trubkovitý nebo trychtýřovitý tvar. Tvar plodů je oválný až podlouhlý a liší se podle jednotlivých genotypů13. Jejich barva přechází od purpurové po námořnickou modř. Mohou být dlouhé


5

Lonicera caerulea L.: Říše:

Plantae - Rostliny

Podříše:

Tracheobionta - Cévnaté

Nadoddělení: Oddělení: Třída: Podtřída: Řád: Čeleď: Rod: Druh:

Spermatophyta - Semenné Magnoliophyta - Krytosemenné Magnoliopsida - Nižší dvouděložné Asteridae - Asteridy Dipsacales - Štětkotvaré Caprifoliaceae - Zimolezovité Lonicera L. - Zimolez Lonicera caerulea L. - Zimolez modrý Obr. 3. Zařazení Lonicera caerulea L.2,14

více než 2 cm a vážit více než 1,5 g. Povrch je pokrytý voskovitou vrstvou10. Jejich chuť je rozdílná podle kultivaru. Někdy je přirovnávána k borůvkám či černému rybízu a pohybuje se od hořké (zvláště u brzy plodících odrůd), přes velmi kyselou a kysele neutrální po trpce sladkou. Semena jsou zanedbatelné velikosti. Zimolez modrý dozrává velmi brzy, zhruba dva týdny před dozráváním jahod, a tak patří mezi vůbec první ovoce u nás. Jedna rostlina má výnos až 500 g již jeden rok po vysazení, později je schopná plodit až 2 kg ovoce11. Není samosprašná a vyžaduje nejlépe další dvě rostliny pro zkřížené opylení. Jako opylovači se nejčastěji uplatňují čmeláci a včely13. Karyotyp zimolezu je tetraploidní (2n = 4x = 36; cit.15). Zimolez nevyžaduje speciální půdní typ, prospívá však především na vlhkých písčitých, hlinitých či jílovitých půdách s pH okolo 5 až 7 a vyšším organickým podílem5. Patří mezi vytrvalé rostliny a přežívá i 25 až 30 let. Rostliny jsou vysoce tolerantní vůči nízkým teplotám a mrazu. Jsou schopny bez poškození přežívat i teploty okolo -46 ºC (cit.16). Odolnost vůči mrazu se zvyšuje na podzim a v zimě, je známa jako chladová aklimatizace a pravděpodobně je spojena s množstvím a akumulací specifických typů cukrů a proteinů (viz dále; cit.16,17,18).


6

2.1.2 Chemické složení a biologické účinky obsahových látek Plody a šťáva zimolezu modrého obsahují jako hlavní složky cukry, tuky, bílkoviny, organické kyseliny a polyfenoly9, dále jsou zastoupeny vitamin C (200-1700 mg/kg), vitamin B, hořčík, fosfor, vápník a draslík19,20. Sušina tvoří 10-17 % váhy plodů. 2.1.2.1 Cukry a bílkoviny Plody L. caerulea L. obsahují okolo 5-10 % cukrů, mezi nimiž převládá glukosa (75 %), dále galaktosa, sacharosa a manosa. Obsah pektinu v čerstvých plodech je 0,4-0,8 % (cit.20). Ve vrcholových částech rostliny bylo identifikováno pět druhů cukrů16 s majoritním zastoupením sacharosy (50-90 %). Obsah fruktosy, glukosy, sacharosy, rafinosy a stachyosy se mění v závislosti na klimatických podmínkách a ročním období. Nejvyšší hladina byla naměřena v lednu, následně jejich množství klesá do května, od června se opět zvyšuje. Obsah stachyosy a rafinosy se během roku mění nejvíce. Od dubna do listopadu je jejich množství téměř zanedbatelné, kdežto v období prosinec až březen jejich zastoupení výrazně roste. Akumulace rafinosy a stachyosy má přímou souvislost s tolerancí zimolezu vůči chladu a vysychání. Fruktosa a glukosa zaujímají jen malou část z celkového množství cukrů a jejich obsah se v průběhu roku nemění16. K sezónním změnám dochází také ve složení bílkovin v jednotlivých částech rostlinného pletiva. V hojivém pletivu (kalusu) se během roku dramaticky mění koncentrace proteinu o velikosti 42 kDa (pI 5,4). Při nízkých teplotách se jeho množství významně zvyšuje, kdežto při vyšších, okolo 25 ºC, snižuje18. K nejvíce zastoupeným aminokyselinám patří asparagin, glutamin, leucin a alanin20. 2.1.2.2 Minoritní látky Obsah organických kyselin v plodu se pohybuje v rozmezí 1,5-4,5 %. Převládá citronová (90 %) a jablečná kyselina. V zimolezu se nacházejí také důležité minerální látky, a to jak makroelementy: draslík (300-500 mg/kg), fosfor, vápník, sodík, hořčík, železo a křemík, tak mikroelementy: měď, zinek, stroncium, barium a jód. Důležité jsou


7

také vitaminy, především vitamin C (200-1700 mg/kg), karoten (0,5-3,2 mg/kg), vitamin B1 (28-38 mg/kg), B2 (25-38 mg/kg), listová kyselina (70-100 mg/kg) a vitamin P (28000 mg/kg; cit.20). V nadzemních

částech

některých

druhů

zimolezů

byly

nalezeny

látky

s předpokládanými zdraví prospěšnými účinky. Mezi ně patří především saponiny21,22 a iridoidní glykosidy23,24. Z pupenů L. bournei (Hemsl.) byl izolován triterpenoidní saponin lonicerosid C, 3-O-β-D-glukopyranosylhederagenin-28-O-α-L-rhamnopyranosyl (1→2)-[β-D-xylopyranosyl(1→6)]-β-D-glukopyranosyl ester. Lonicerosid C (obr. 4) vykazuje protizánětlivé účinky při otoku uší vyvolaném krotonovým olejem u myší22. Směs triterpenoidních saponinů z L. fulvotomentosa (P.S.Hsu & S.C.Cheng) vykazuje u myší protektivní aktivitu vůči hepatotoxickým účinkům paracetamolu25 a kadmia26.

O O CH2OH

O

O CH2OH

OH

CH

HO

2

O

O

OH O

OH HO OH

OH HO

O

OH O

HO CH3

OH

OH

Obr. 4. Lonicerosid C (cit.22). Iridoidy jsou sekundární metabolity odvozené od cyklopentano[c]pyranových monoterpenoidů a biogeneticky a chemotaxonomicky tvoří strukturální vazbu mezi terpeny a alkaloidy. Obecně se u těchto látek předpokládá široké spektrum příznivých účinků

na

lidské

hypolipidemických,

zdraví,

především

protizánětlivých,

hepatoprotektivních,

hypoglykemických,

antivirových,

imunomodulačních,

antispasmodických, protinádorových a projímavých27. Listy zimolezu modrého obsahují


8

tři iridoidní glukosidy, pojmenované caerulosid A, B a C (obr. 5). Tyto sloučeniny jsou tvořené ze sekologaninu připojeného acetalovou vazbou na C-4´ a C-6´sacharidovou část loganinu nebo swerosidu. Caerulosidy A a B jsou první bis-iridoidy tvořené dvěma jednotkami iridoidů spojenými acetalovou vazbou19,28. O

O

COOCH3 A

B

C

HO

O

O O

O

O

O

O

OH

O

O OH

OH

OH

COOCH3

COOCH3

COOCH3

O

O

O

CH2

O

CH2

O

HO

HO

O

OH

OH

HO

HO OH

O

HO

O

O OH

OH

O

OH

OH O

CH2

CH2

O

O

HO OH

OH

Obr. 5. Caerulosid A, B a C (cit.19,28). 2.1.2.3 Fenolové látky Množství fenolových sloučenin bylo v plodech L. caerulea L. stanoveno na 21,3±0,9 g ekvivalentů katechinu/kg sušiny29. Tato hodnota však může být do značné míry ovlivněna mnoha faktory, včetně varietních a regionálních rozdílů, a především rozdílnými analytickými postupy extrakce či zpracování plodů. Fenolové kyseliny Koncentrace fenolových kyselin v plodech zimolezu modrého je srovnatelná s dalšími bobulovitými plody jako je borůvka (Vaccinium myrtillus L.), ostružina (Rubus plicatus Weihe et Nees.) či černý rybíz (Ribes nigrum L.). Celkový obsah fenolových kyselin v plodech L. caerulea L. je 5,4±0,23 g/kg sušiny29. Z volných kyselin převládá kávová, p-kumarová a ferulová kyselina. Až 70 % tvoří estery, z nichž u zimolezu dominují estery m-kumarové a salicylové kyseliny29. Zastoupení fenolových kyselin v plodech L. caerulea L. uvádí tabulka I (cit.29). Množství kyselin se mění i mezi


9

jednotlivými druhy, např. u L. japonica (Thunb. ex Murray) je nejhojněji zastoupená protokatechová a chlorogenová kyselina, vykazující hepatoprotektivní a protinádorové účinky30,31. Extrakt L. japonica (Thunb. ex Murray) vykazoval cytotoxický účinek na buňky HepG2 odvozené od hepatocelulárního karcinomu a aktivoval c-Jun-N-terminální kinasu (cJNK; cit.32). Tabulka I. Obsah fenolových kyselin (mg/kg sušiny) v plodech L. caerulea L. dle cit.29. Kyselina

Celkový obsah

Volné

Estery

Glykosidy

Gentisová

154 ± 11

1,5 ± 0,2

116,8 ± 15,8

35,2 ± 3,8

Galová

44 ± 3

0,1 ± 0,0

43,8 ± 3,0

0,4 ± 0,1

o-Pyrokatechová

29 ± 1

22,5 ± 1,1

6,1 ± 0,8

Protokatechová

144 ± 10

2,3 ± 0,3

105,2 ± 11,7

36,9 ± 4,0

Salicylová

1235 ± 140

9,0 ± 0,6

824,8 ± 78,0

401,1 ± 20,0

Vanilová

21 ± 3

10,2 ± 1,3

10,9 ± 2,0

Kávová

298 ± 36

22,4 ± 2,8

536,6 ± 35,7

39,2 ± 4,1

m-Kumarová

2015 ± 145

6,4 ± 0,4

1402,1 ± 20,6

606,0 ± 45,5

p-Kumarová

987 ± 100

23,5 ± 1,2

631,7 ± 67,9

331,9 ± 25,2

29,9 ± 2,0

14,3 ± 1,8

13,1 ± 1,6

3,1 ± 1,5

3,4-Dimethoxyskořicová

44 ± 5

Ferulová

37 ± 3

Hydroxykávová

52 ± 6

20,7 ± 2,1

46,5 ±4,2

p-Hydroxyfenyloctová

10 ± 0,1

0,9 ± 0,2

9,4 ± 0,6

p-Hydroxyfenylmléčná

48 ± 5

0,5 ± 0,1

29,2 ± 1,9

18,6 ± 1,4

Flavonoidy L. caerulea L. obsahuje 700 mg flavonoidů na kg plodů. Nejvíce zastoupený flavon je rutin v množství 480 mg/kg a luteolin 50-140 mg/kg, flavonol isokvercetin 50-120 mg/kg a kvercetin 20-100 mg/kg (cit.20). Anthokyaniny Hlavními anthokyaniny L. caerulea L. jsou glykosidy a rutinosidy kyanidinu, peonidinu a pelargoninu13,33,34. Koncentrace jednotlivých anthokyaninů se v závislosti na literárním zdroji liší. Všechny však potvrzují přítomnost kyanidin-3-glukosidu, jakožto hlavního

anthokyaninu,

dále

kyanidin-3,5-diglukosidu

a

kyanidin-3-rutinosidu.

V L. caerulea L. byl dále identifikován i kyanidin-3-gentiobiosid a malvidin-3glukosid33,34. Zastoupení anthokyaninů v plodech je uvedeno v tabulce II (cit.13).


10

Tabulka II. Zastoupení anthokyaninů v plodech L. caerulea L. dle cit.13. Anthokyanin

Obsah (rel. %)

Kyanidin-3,5-diglukosid

2,2-6,4

Kyanidin-3-glukosid

79,0-88,0

Kyanidin-3-rutinosid

1,0-11,0

Pelargonidin-3-glukosid

0,2-1,0

Peonidin-3-glukosid

2,8-4,5

Peonidin-3-rutinosid

0,3-1,3

2.1.3 Využití v dietě a tradičním léčitelství L. caerulea L. je původní rostlinou Ruska, Číny a Japonska, kde probíhá nejobsáhlejší výzkum s cílem komerční produkce jejích plodů. K nesporným výhodám jejího pěstování patří brzká doba sklizně, příjemná chuť a vůně, ale především množství příznivých účinků na lidské zdraví. V Rusku se již staletí používá k prevenci atherosklerosy, hypertense, chorob trávicího ústrojí (GIT) a bakteriálních infekcí. Odvary z listů a květů se používají jako diuretikum, desinfekce a antiseptikum. Biologická aktivita je přisuzována zejména vysokému obsahu vitaminu C a fenolových látek10,35,36. Extrakt z listů L. caerulea L. vykazuje schopnost chránit před působením oxidačního stresu a volných radikálů37.

2.2 Vaccinium macrocarpon Ait. (klikva velkoplodá) 2.2.1 Botanický popis, historie, rozšíření, pěstování Vaccinium macrocarpon (Aiton; klikva velkoplodá) patří do čeledi Vacciniaceae (brusnicovité), rodu Vaccinium L. (brusnice). Vaccinium je rodem zahrnujícím 450 různých stálezelených nebo opadavých druhů keřovitých rostlin, které se vyskytují převážně v chladnějších oblastech severní polokoule s největším rozšířením v Asii a Severní Americe. Výjimky tvoří tropické druhy rostoucí i na Madagaskaru a Havaji. Název vaccinium byl používán v klasické latině pro typ bobule. Rostliny tohoto rodu preferují louky, stejně jako řídké lesy38,39.


11

Vaccinium macrocarpon Ait.: Říše:

Plantae - Rostliny

Podříše:

Tracheobionta - Cévnaté

Nadoddělení:

Spermatophyta - Semenné

Oddělení:

Magnoliophyta - Krytosemenné Magnoliopsida - Nižší dvouděložné

Třída: Podtřída: Řád: Čeleď: Rod: Druh:

Dilleniidae Ericales - Vřesovcotvaré Vacciniaceae - Brusnicovité Vaccinium L. - Brusnice, subg. Oxycoccus (Hill) A. Gray - Klikva Vaccinium macrocarpon Ait. (Oxycoccus macrocarpos) - Klikva velkoplodá

Obr. 6. Zařazení Vaccinium macrocarpon Ait. (klikva velkoplodá; cit.2,40,41).

Taxonomie (obr. 6) tohoto rodu je komplexní a je stále předmětem výzkumu. Například mnoho asijských druhů je příbuzných spíše rodu Agapetes D. Don ex G. Don než Vaccinium L. Některé z keřů jsou pěstovány jako okrasné pouze pro své listy, jiné pro květy a některé pro velmi chutné plody38. V České republice je klikva často mylně označována jako „brusinka“ či „kanadská brusinka“, a to dokonce i v doplňcích stravy či potravinách. Na našem území roste běžně brusnice brusinka (brusinka pravá, brusnice pravá, Vaccinium vitis-ideae L.). Klikva velkoplodá (obr. 7) se v anglicky mluvících zemích označuje jako cranberry. Je to celoročně zelená rostlina s úzkými, houževnatými stonky, dorůstající až jednoho metru. Listy jsou krátce řapíkaté, kožovité, obvejčité, eliptické nebo okrouhlé 6-18 mm podlouhlé, na okraji celokrajné a mírně podvinuté, na spodní straně drobně tečkované. Malé pravidelné květy růžové až žluté barvy vyrůstají v létě v hroznech, koruna je zvonkovitá. Kulaté červené plody jsou jedlé, ale trpké. Sladší chuť získávají přejitím mrazem. Mohou být vysušeny, nebo se využívají k přípravě šťávy či džemu. Klikva pochází z chladnějších oblastí Severní Ameriky, kde roste na kyselých mírně zastíněných půdách39. První komerční kultivace začala v Americe okolo roku 1816 na písčitých


12

půdách, v mokřinách nebo na deštěm promáčených slaných loukách v Massachusetts, New Jersey42,43. V našich podmínkách ji lze úspěšně pěstovat na vlhkých rašelinných místech, v mírném polostínu. Vždy však vyžaduje kyselé půdy s pH 4,0-6,1, a to jak rašelinní,

Obr. 7. Plody Vaccinium macrocarpon Ait. (klikva velkoplodá; cit.44,45). písčité, tak kamenité, dále dostatek vlhka, a naopak nesnáší přímé působení slunečních paprsků a sucho. V České republice se vyskytuje pouze vzácně nebo zcela chybí. Největší výskyt je zaznamenán v podhorských až horských polohách. Dosahuje zde pouze 10 až 30 cm, kvete v květnu až červenci a dozrává v červenci až září. Roste převážně v oblastech světlých lesů, vřesovišť, rašelinišť, pastvin, písčin a horských skal39,46.

2.2.2 Chemické složení a biologické účinky obsahových látek Plody klikvy obsahují jako majoritní složky cukry (glukosa a fruktosa; 4,03 %), bílkoviny (0,19 %), vlákninu (1,99 %) a tuky (0,10 %). Z mikronutrientů převládá draslík hořčík, vápník a fosfor, z vitaminů vitamin C a A. Z organických kyselin (6028 mg/kg) převažují citronová (81 %) a jablečná kyselina (19 %; cit.47). U klikvy jsou důležité především dva typy sloučenin se schopností preventivně chránit před infekcemi močových cest. Jedná se o fruktosu (2.2.2.1) a proanthokyanidiny typu A (2.2.2.3). Z hlediska antioxidační ochrany jsou pak důležité především fenolové látky. Listy klikvy velkoplodé obsahují glykosid hydrochinonu arbutin (asi 5 %), flavonoidy, třísloviny, fenolové kyseliny (galovou), dále benzoovou a šťavelovou


13

kyselinu, hydrocholin, cholesterin, taniny, vaccin a vitamin C. Ze stopových prvků převládá hořčík47. 2.2.2.1 Cukry Koncentrace cukrů v čerstvém ovoci je 40 g/kg plodu46, z čehož je 42 % glukosy a 26 % fruktosy48. Dříve se předpokládalo, že za inhibici adheze E. coli na uroepiteliální buňky je zodpovědná fruktosa49. Tento účinek byl však dokázán pouze in vitro50. Adherence E. coli je usnadněna vazbou bakterií na buněčnou stěnu proteinovými vlákny. Fimbrie produkují adhesiny, které se vážou na specifický receptor uroepiteliálních buněk51. Fruktosa přítomná v mnoha druzích ovoce inhibuje adherenci fenotypů E. coli produkující adhesiny typu 1 (manosa sensitivní; cit.49). Specifický oligosacharidový receptor α-Gal(1→4)β-Gal inhibuje adherenci E. coli s adhesiny typu P (manosa resistentní; cit.51). Fruktosa je obsažena ale i v mnoha druzích ovoce, které antibakteriální účinky nevykazují. In vivo je metabolizována dříve než dosáhne močového ústrojí. Za hlavní účinek klikvy na bakteriální adherenci jsou tedy zodpovědné jiné látky48. 2.2.2.2 Minoritní látky Plody V. macrocarpon Ait. jsou bohatým zdrojem vitaminu C (133 mg/kg) a A (600 IU/kg), naproti tomu obsahují jen malé množství vitaminů skupiny B (B1 120 µg/kg, B2 200 µg/kg) a vitaminu E (12 mg/kg). Ze stopových prvků je přítomen vápník (80 mg/kg), hořčík (60 mg/kg) a draslík (850 mg/kg; cit.46). Z dalších látek obsažených v plodech V. macrocarpon Ait. je zajímavá především ursolová kyselina (obr. 8). Ta je přítomna v mnoha rostlinách a je složkou protizánětlivých herbálních přípravků52. Jako potencionální biologicky aktivní látce je ursolové kyselině věnována jen malá pozornost, pravděpodobně kvůli nedostatku informací o její dostupnosti po ústním podání. V literatuře je však popsáno její protinádorové působení in vitro53. Inhibuje proliferaci myší melanoidní buněčné linie B16 a buněk rakoviny prsu zastavením buněčného cyklu v G1 fázi54,55. Zvýšením intracelulární koncentrace vápenatých iontů přímo indukuje apoptosu u buněk leukémie HL-60 (cit.53). U buněk karcinomu prostaty DU-145 indukuje apotosu aktivací kaspas56. Kvantitativní analýzou LC/MS bylo zjištěno,


14

že obsah ursolové kyseliny se liší mezi jednotlivými kultivary V. macrocarpon Ait. a je srovnatelný s množstvím flavonoidů (600-1100 mg/kg plodu; cit.57). Sušením plodů se její obsah téměř nemění. CH3 H3C

CH3

CH3

H

COOH

H3C HO H3C

CH3

Obr. 8. Kyselina ursolová. Benzoová kyselina je v plodech klikvy obsažena ve velkém množství. V těle se metabolizuje na hippurovou kyselinu, která je následně vylučována močí58.

2.2.2.3 Fenolové látky Plody klikvy velkoplodé obsahují tři strukturní typy flavonoidů (flavonoly, anthokyaniny a proanthokyanidiny), hydroxyskořicovou a další fenolové kyseliny a triterpenoidy. Existují odlišnosti mezi složením sušené šťávy, celého plodu a extraktu z něj, ale i mezi výsledky různých pracovišť59. Množství polyfenolů dosahuje v sušené šťávě 3 % (cit.48). Fenolové kyseliny Koncentrace fenolových kyselin v sušené šťávě plodů klikvy velkoplodé je srovnatelná s množstvím těchto látek u zimolezu modrého. Kolísá mezi 1-10 %. Byly identifikovány salicylová, elagová, ferulová, kávová, p-kumarová, sinapová, vanilová a protokatechová kyselina. Vyskytují se buď volné nebo vázané jako estery a glykosidy48. Anthokyaniny a flavonoly Dobře charakterizovanými anthokyaniny klikvy velkoplodé jsou hlavně peonidin-3galaktosid, -3-arabinosid, kyanidin-3-galaktosid a -3-arabinosid. Profil složení se mírně odlišuje od složení klikvy bahenní (Vaccinium oxycoccus L.), u níž převládá peonidin-3-


15

glukosid a kyanidin-3-glukosid. Množství anthokyaninů v plodech se liší mezi druhy i kultivary a pohybuje se v rozmezí 250-650 mg/kg plodu. Kultivary tmavší barvy a brzké doby sklizně mají vyšší nejen obsah anthokyaninů, ale i proanthokyanidinů60. Z flavonolových

glykosidů

převažuje

kvercetin,

jeho

-3-galaktosid

(hyperin),

-3-arabinosid a -3-ramnosid (kvercitrin), dále myricetin-3-arabinosid a -3-digalaktosid (obr. 9). Koncentrace flavonolů se pohybuje mezi 200-300 mg/kg (cit.61). Ve šťávě bylo nalezeno 0,30 % kvercetinu a 0,44 % anthokyaninů. Z nich nejvíce zastoupenými byly peonidin-3-glukosid a -3,5-digalaktosid. Složení anthokyaninů v sušené šťávě udává tabulka III (cit.48). OH

OH OH

HO

O

OH

O

HO

OR O OH Kvercetin R = galaktosa, arabinosa, xylosa, ramnosa

OH OR

O OH Myricetin R = galaktosa, arabinosa

Obr. 9. Struktura kvercetinu a myricetinu. Anthokyaniny klikvy působí jako inhibitory oxidačního stresu. Extrakty inhibují indukci endoteliálních růstových faktorů a růst nádoru62. Tabulka III. Zastoupení anthokyaninů a anthokyanidinů ve šťávě V. macrocarpon Ait. dle cit.48. Anthokyanin/anthokyanidin

Obsah (%)

Peonidin-3-glukosid

30,7

Peonidin-3,5-digalaktosid

24,1

Peonidin-3-galaktosid

10,2

Peonidin-3-arabinosid

5,7

Kyanidin-3-galaktosid

7,1

Kyanidin-3-glukosid

12,3

Kyanidin-3-arabinosid

5,5

Kyanidin-3-pentosid

3,0

Delfinidin

1,8


16

Proanthokyanidiny Klikva

velkoplodá

obsahuje

především

proanthokyanidiny

A-1.

Proanthokyanidinovým trimerům typu A je připisována antiadherenční aktivita vůči uropatogenním kmenům E. coli (cit.63), které způsobují téměř 95 % infekcí močového ústrojí64. Konzumace plodů V. macrocarpon Ait. přispívá antiadherenční aktivitou a navíc pravděpodobně způsobuje zvýšení kyselosti moče, které je zapříčiněno přítomností hippurové

kyseliny,

jejímž

prekurzorem

v potravě

je

benzoová

kyselina58

a pravděpodobně jimi mohou být i fenolové kyseliny a flavonoidy. Šťáva z klikvy neenzymaticky tvoří oxidy dusíku redukční kapacitou svých složek, zejména vitaminu C (cit.65). Při zánětu močového ústrojí tvoří bakterie nitrity jako své odpadní produkty. Snižením pH jsou nitrity přeměňovány na různé oxidy dusíku, které jsou pro bakterie toxické66. Inhibiční vliv byl prokázán nejen na patogenní kmeny E. coli, ale i na druhy rodu Klebsiella, Enterobacter a Pseudomonas, běžné patogeny infekcí močového ústrojí67, na Helicobacter pylori, bakterii spojovanou s onemocněním žaludku68, či na patogeny způsobující zubní plak. Díky velkému obsahu různě biologicky aktivních látek ovlivňuje klikva tvorbu zubního plaku několika mechanismy. Jedná se především o inhibici adherence bakterií na povrchu dutiny ústní, snížení aktivity enzymů způsobujících tvorbu plaku a potlačení životaschopnosti patogenních mikroorganismů tvorbou kyselého prostředí46.

2.2.3 Využití v dietě a tradičním léčitelství Klikva velkoplodá roste divoce především na východě Spojených států amerických a v Kanadě, kde měla velký význam především pro původní obyvatele jakožto jediné ovoce dozrávající velmi pozdě na podzim, v září a v říjnu. Různé části rostliny byly využívány jako barvivo, potravina či léčivo. Sbírá se plod i list, a to buď na jaře, nebo koncem léta až na podzim. Suší se volně ve stínu nebo v sušárnách při teplotě do 40 ºC. Využívá se především pro své močopudné a antibakteriální účinky, působí i mírně protiprůjmově. Podává se nejčastěji ve formě macerátu, kdy se luhuje osm hodin a před použitím se nechá projít krátkým varem. Listy sloužily ve formě obkladů při zraněních či


17

otravě krve, plody na onemocnění močových cest, na průjem a při diabetu, odvary z větviček na zánět pohrudnice69. Již od čtyřicátých let 20. století je džus z klikvy běžně k dostání i v obchodech69. Tento nápoj je slazený a obsahuje 27 % klikvové šťávy. Jako doplněk stravy patří V. macrocarpon Ait. do první desítky nejběžnějších v USA46. Podle Státního ústavu pro kontrolu léčiv v USA jsou klikva i nápoje z ní bezpečné potraviny. Nebyly nalezeny žádné nebo jen minimální vedlejší účinky plynoucí z její konzumace. K nim patří zejména průjem a další gastrointestinální symptomy. Bezpečnost klikvových tablet a koncentrátů prozatím zkoumána nebyla. Je také omezené množství informací o interakcích doplňků stravy a džusů z V. macrocarpon Ait. s dalšími doplňky, potravinami, léčivy. Díky vysokému obsahu oxalátů může klikva způsobovat vznik ledvinových kamenů39,46. Jiné studie však dokazují pravý opak70. Pouze jedna studie popisuje intoxikaci a acidosu čtyřměsíčního kojence způsobené klikvou71. Existují i doklady o interferenci s warfarinem46. Dnes jsou přípravky z V. macrocarpon Ait. známé po celém světě. I v České republice se využívají především jako doplňky stravy pro prevenci infekcí močových cest, čímž snižují množství potřebných antibiotik a chemoterapeutik. Vzhledem ke schopnosti působit na patogenní bakterie dutiny ústní jsou extrakty klikvy přidávány i do ústních vod či žvýkaček.

2.3 Bobulovité ovoce jako zdroj biologicky aktivních fenolových látek Bobulovité ovoce představuje jeden z nejdůležitějších zdrojů fytoceutik prospěšných pro lidské zdraví. Koncentrace fenolových látek je závislá na stupni zralosti, genotypových odlišnostech, klimatických podmínkách před sklizní, skladovacích podmínkách a metodách zpracování72. Polyfenoly zahrnují široké spektrum různých sekundárních metabolitů rostlin, které mají schopnost působit jako antioxidanty přerušující řetězové radikálové reakce73. Polyfenoly vznikají jako odpověď rostlin na poškození patogeny a jsou nezbytné pro jejich metabolismus, růst a reprodukci. V nízkých koncentracích stabilizují potravu a příznivě působí i na trávicí enzymy a tkáně, které chrání před poškozením volnými radikály. Ve vyšších množstvích mohou buď samy


18

nebo jejich oxidační produkty reagovat s bílkovinami, cukry a minerály74,75. Zdraví prospěšný vliv polyfenolů na lidský organismus je dáván do souvislosti se dvěma účinky. S inhibicí některých enzymů, např. xanthinoxidasy (XOD) či aldosareduktasy, a s antioxidační aktivitou76. O biodostupnosti, absorpci a metabolismu polyfenolů u lidí je zatím známo jen málo. Jednotlivé skupiny flavonoidů mají pravděpodobně odlišné farmakokinetické vlastnosti77. Fenoly jsou mocné antioxidanty in vitro, jejich působení v lidském těle je doposud nedostatečně objasněné74. Vyšší dávky fenolů v dietě jsou po vstřebání ve střevě metabolizovány v játrech a jejich volné formy přecházejí do oběhu. Při nižším obsahu v dietě jsou rozštěpeny střevní mikroflórou, dochází k jejich konjugaci či dekonjugaci. Mohou být hydrolyzovány na své aglykony nebo podléhat methylaci, sulfataci, glukuronidaci atd. Další metabolismus splývá s metabolismem xenobiotik. Z organismu se vylučují převážně močí78. Dnes jsou polyfenoly považovány za bezpečné a netoxické látky ovlivňující zánětlivé reakce závislé na jaderném faktoru-κB (NF-κB; cit.79). Tímto způsobem a následnou

tvorbou

prozánětlivého

tumor

nekrotizujícího

faktoru-α

(TNF-α), prostaglandinu E2 a oxidů dusíku působí extrakt z plodů L. caerulea L. i proti uveitidě potkanů vyvolané endotoxinem79. Vliv fenolových látek bobulovitého ovoce na atherosklerosu spočívá v ochraně cév udržováním jejich permeability, snížením intenzity zánětlivé odpovědi a agregace krevních destiček. In vitro mají schopnost inhibovat oxidaci lipoproteinů, in vivo redukují atherosklerotické pláty60,80. Fenoly vykazují protinádorový účinek modulací enzymových systémů, které jsou zodpovědné za metabolizaci karcinogenů a prokarcinogenů na genotoxiny. Fenoly L. caerulea L. například blokují mutagenesi vyvolanou chemickými karcinogeny a endogenními mutageny a působí na proces nekontrolované buněčné proliferace a apoptosy in vitro81. Extrakty bobulovin působí proti angiogenesi, inhibují expresi vaskulárního endotelového růstového faktoru (VEGF) vyvolanou peroxidem vodíku nebo TNF-α in vitro i in vivo82. Vykazují účinky podobné působení insulinu snížením hladiny krevní glukosy po příjmu potravy. Tento efekt spočívá ve snížení absorpce glukosy z potravy snížením aktivity α-glukosidasy/maltasy83.


19

2.3.1 Fenolové kyseliny Fenolové kyseliny tvoří zhruba třetinu celkového příjmu fenolových látek v dietě. Denní příjem byl odhadnut na 25-1000 mg. V rostlinném materiálu jsou přítomny ve volné formě nebo vázané jako estery, ethery nebo acetyly. Volné kyseliny zaujímají z celkového

množství

jen

malou

část,

a

tak

neovlivňují

chuť

plodů.

V těle vznikají jednoduché kyseliny štěpením ostatních fenolů střevní mikroflórou84-86. Jednou z nejdůležitějších kyselin přítomných v bobulovitém ovoci je chlorogenová kyselina. Je to ester kávové a chininové kyseliny, který může být střevní mikroflórou rozložen zpět na své výchozí produkty87. Kávová kyselina je antioxidant působící in vitro i in vivo88. I když je známo, že kávová i chlorogenová kyselina jsou absorbovány ve střevě89, dostupnost kávové kyseliny je její esterifikací s chininovou kyselinou značně snížena. Kávová kyselina je uváděna v bezpečnostních listech jako potencionální karcinogen, potvrzený dvěma prvotními pokusy na myších a potkanech. Pozdější experimenty dokázaly, že bakterie ve střevech potkana mohou ovlivňovat tvorbu metabolitů kávové kyseliny. U člověka však podobným mechanismem přeměna neprobíhá90,91. Mnoho potravin obsahuje i dihydrokávovou kyselinu, oxidační produkt kávové kyseliny92. Ferulová kyselina, další hojně zastoupená kyselina v rostlinném materiálu, je absorbována přes buněčnou membránu pasivní difúzí či usnadněným transportem, který je saturován při koncentraci 50 µmol·l-1 (cit.93). Kumarová kyselina, hydroxyderivát skořicové kyseliny, existuje v rostlinném materiálu ve třech izomerech: o-kumarová, m-kumarová a p-kumarová, lišící se pozicí hydroxylové skupiny. Z nich nejrozšířenější v přírodě je p-kumarová forma, vykazující silné antioxidační vlastnosti, projevující se především snížením rizika vzniku rakoviny žaludku94,95. Elagová kyselina ovlivňuje karcinogenezi přímo na úrovni cytochromu P450 i metabolismus enzymů druhé fáze96. Rostliny produkují elagovou kyselinu a převádějí ji do formy taninu (elagotanin), což je glykosid, který se ve vodě hydrolyzuje za opětovného vzniku elagové kyseliny. Této kyselině jsou připisovány protinádorové a antioxidační účinky in vitro i in vivo97. Její vlastnosti jsou dány schopností inhibovat


20

vazbu karcinogenů na DNA a chemoprotektivními účinky před poškozením oxidačním stresem98,99.

2.3.2 Flavonoly a flavony Flavonoidy jsou rostlinné metabolity s fenylbenzopyronovým jádrem. Rozdíly mezi jednotlivými skupinami flavonoidů jsou dány množstvím a polohou hydroxylových skupin, jejich alkylací a glykosylací100. Flavonoly mají stejnou strukturu jako flavony s dvojnou vazbou mezi pozicí C-2 a C-3. Flavony postrádají hydroxylovou skupinu v pozici C-3. Flavan-3-oly nemají dvojnou vazbu na pozici C-2 (obr. 9).

O

O

O

OH

OH

O

O

flavonol

flavon

flavan-3-ol

Obr. 9. Struktura flavonolu, flavonu a flavan-3-olu. Kvercetin je jedním z nejvíce studovaných flavonolů s protikarcinogenními účinky101 a stejně jako jeho glukosidy je resistentní k hydrolýze kyselinou chlorovodíkovou v žaludku102. Jeho absorpce probíhá v tenkém střevě do enterocytů pravděpodobně

aktivním

transportem101,103.

Po

absorpci

bývá

methylován

na

isorhamnetin. Rutinosidy kvercetinu jsou absorbovány ze střeva po deglykosylaci101. Hlavní formou exkrece kvercetinu je oxid uhelnatý (23-81 %). Apigenin je netoxický flavon s protinádorovými a protizánětlivými vlastnostmi104. Katechin a epikatechin jsou vzájemné epimery. Předpokládá se, že epikatechin dokážet snížit riziko vzniku čtyř nejčastějších chorob dnešní doby: mrtvice, srdečního selhání, rakoviny a diabetu105. Luteolin vykazuje schopnost indukce apoptosy buněčné linie CH-27 odvozené od lidského

karcinomu

plic

aktivací

kaspasy-3,

apoptosu

vyvolávajícího

faktoru

a specifických enzymů, jako je superoxiddismutasa (SOD) a katalasa, jež jsou schopny


21

zabránit iniciační a prolongační fázi karcinogenese a jejichž hladiny jsou u mnoha nádorových onemocnění snížené106,107.

2.3.3 Anthokyaniny Anthokyaniny, zvané též anthokyany (bez cukerné složky anthokyanidiny, obr. 10), jsou další sekundární metabolity rostlin odvozené od 2-fenylbenzopyrylia, nacházející se především jako glykosidy. Představují důležitou skupinu ve vodě rozpustných pigmentů, poskytující rostlinným pletivům charakteristické modré, červené nebo černé zbarvení. Tyto vlastnosti jsou dány jejich schopností spojovat se do komplexů s vyšší absorpcí světelných vln, kopigmentací a vytvářením komplexů s kovy108. Anthokyaniny mají díky přítomnosti hydroxylové skupiny v pozici 3 kruhu C významné antioxidační účinky, které mohou být zvýšeny acylací zbytků sacharidů aromatickými kyselinami109. Tyto sloučeniny mají vyšší antioxidační aktivitu než vitamin C, E nebo β-karoten110.

R

1

R

O

HO A

2

B

+

R

3

C OH

OH

Anthokyanidin

R1

R2

R3

Kyanidin

OH

OH

H

Delfinidin

OH

OH

OH

H

OH

H

Peonidin

OCH3

OH

H

Petunidin

OCH3

OH

OH

Malvidin

OCH3

OH

OCH3

Pelargonidin

Obr. 10. Struktury základních anthokyanidinů. Ve vodných roztocích existují anthokyaniny v různých molekulárních formách, jejichž rovnováha závisí zejména na pH roztoku (obr. 11). Červený flavyliový kation převažuje při pH pod 2. Při zvyšování pH dochází k rychlé ztrátě protonu za vzniku modré chinoidní struktury a zároveň k mnohem pomalejší hydrataci na bezbarvou hemiketalovou

formu,

která

následně

tautomerizuje

do

formy

chalkonové111.

Anthokyaniny mají protizánětlivé, antimutagenní a hepatoprotektivní účinky se schopností regulovat permeabilitu kapilár. Pro tuto vlastnost jsou někdy označovány jako


22

vitamin P (cit.62,112). Jsou spojovány se zvyšením rezistence červených krvinek vůči oxidačnímu stresu i zlepšením symptomů neurologických onemocnění ve stáří113.

R

Flavyliový kation (červený) HO

OH O

+

R

O -H

O

+

Hemiketal (bezbarvý)

1

2

H2O,-H

O O +

OH O

R1

O

gly

+

R

gly

R O O

gly

2

O

gly

-

R2 O

O

R2 O

O O

O

+

R1

O

OH

HO

O O

OH

gly -H

1

-

-H2O

O

O -H

gly

gly

R2

gly

2

R1

R2 O

O

OH R

O O

O

gly

-H

1

OH

HO

+

gly

R1

HO

R

O

gly

gly

Chalkon (bezbarvý)

gly

gly

Chinoid (modrý)

Obr. 11. Formy anthokyaninů ve vodném roztoku v závislosti na pH (cit.111). gly… glykosid

Kyanidin je běžný anthokyanidin, hydroxylován v pozici 3´, 4´ na B kruhu, přítomný v 90 % ovoce114. Právě díky přítomnosti těchto dvou hydroxy skupin je kyanidin-3-glukosid účinnějším antioxidantem než glykosidy peonidinu a malvidinu115. Hlavním rozdílem oproti ostatním glykosidům je fakt, že po podání v dietě dochází k jeho, i když limitované, absorpci116. Naproti tomu kyanidin-3-rutinosid vykazuje schopnost inhibice cyklooxygenasy I a II (cit.117) a příznivě působí při diabetu, obezitě, hyperlipidemii118 a virové hepatitidě typu B a C (cit.119). Kyanidin a jeho -3-glukosid snižují poškození DNA lidských lymfocytů ex vivo a jeho rutinosid i glukosid potlačují metastázy buněk rakoviny plic A579 (cit.120). Delfinidin, malvidin i petunidin inhibují proliferaci buněk rakoviny prsu, střeva a pankreatu in vitro121,122. Delfinidin chrání integritu endotelu a buňky před apoptosou123. Pelargonidin-3-monoglukosid chrání aminokyselinu tyrosin před působením radikálu peroxynitrilu a inhibuje růst E. coli


23

a Staphylococcus aureus124. Diacylované formy anthokyaninů inhibují α-glukosidasu, čímž snižují hladinu glukosy v krvi, a tak příznivě ovlivňují diabetes mellitus typu II (cit.75,125). U diabetu podporují noční vidění zvýšením tvorby retinálního pigmentu, cirkulaci v kapilárách sítnice, a tak potlačují diabetickou retinopatii126.

2.3.4 Proanthokyanidiny Sekundární metabolity rostlin nazývané proanthokyanidiny (kondenzované taniny) jsou oligomery a polymery monomerních flavonoidů. Jsou to polyflavany, kondenzované molekuly těch flavonoidů, které mají saturovaný C kruh. Prozatím bylo identifikováno patnáct podtříd proanthokyanidinů127, ale pouze několik z nich se běžně vyskytuje v dietě či doplňcích stravy rostlinného původu. Názvy podtříd jsou založeny na konverzi původních monomerních jednotek na příslušný anthokyanidin během kysele katalyzované depolymerace. Existuje mnoho možností spojení jednotlivých monomerních jednotek, nečastější je spojení uhlíků typu 4→6 nebo 4→8 (typ B) nebo uhlíků 4→8 a etherové vazby 2→7 (typ A) (obr. 12). Další typy vazeb se vyskytují převážně v nejedlých rostlinách nebo jen minoritně v pochutinách, např. kakau127. Jejich přítomnost není potřebná pro základní metabolické pochody rostlin, ale významně se podílí na ochraně před vnějším poškozením mikroby, plísněmi atd.128. Svou polyhydroxyfenolovou strukturou a výslednou elektronovou konfigurací snadno uvolňují protony, a tak působí jako antioxidanty, vychytávající volné radikály, a to opět dokonce s vyšší účinností než vitamin C a E (cit.129). Potraviny obsahující proanthokyanidiny vykazují v ústech adstringentní pocit tím, že se ve slinách vážou na proteiny bohaté na prolin130. Absorpce proanthokyanidinových dimerů a trimetrů byla prokázána u buněčné linie Caco-2 odvozené z lidských střevních buněk, což naznačuje možnost jejich průchodu bez metabolických změn. Polymerní typy však často podléhají degradaci střevní mikroflórou131. Studie na lidech prokázaly stabilitu proanthokyanidinů při průchodu kyselým prostředím žaludku132, ale zároveň bylo pozorováno zvýšení vylučování fenolových kyselin močí131.


24

Vznikající kyseliny se vylučují močí a stolicí ve formě glukuronidů, sulfátů a O-methyl derivátů133. Jedním z největších problémů výzkumu proanthokyanidinů je praktická nemožnost separace jednotlivých oligomerů či polymerů z materiálu. Často jsou 5´ 4´

6´ 8

HO

A

C

6 4

5

OH 7 HO

8

D

2 3

1´

3´ 2´

F

5

4

OH

8

OH

O

OH

2

7

4

OH

E

1

3

O

OH OH

6

OH

2

OH

OH

O

O

HO

B

O1

7

OH

OH

OH OH

HO B-typ

OH

A-typ

Obr. 12. Struktura proanthokyanidinů typu B a A (cit.134). používány rostlinné extrakty, které kromě těchto látek obsahují množství dalších sloučenin ovlivňujících biologické účinky134. Působení proanthokyanidinů na rakovinu byl zkoumán na zvířecích a buněčných modelech. Bylo například prokázáno, že extrakt proanthokyanidinů z plodů Vitis vinifera inhibuje 12-O-peroxidaci lipidů indukovanou tetradekanoylforbol-13-acetátem a fragmentaci DNA v mozku a játrech myší135. Proanthokyanidiny inhibují růst buněčných linií odvozených od rakoviny prsu in vitro136 i in vivo u potkanů137. Frakce proanthokyanidinů klikvy velkoplodé selektivně inhibuje růst lidských buněčných linií odvozených od rakoviny plic H460, konečníku HT-29 a chronické myelogenní leukémie 8 (cit.138). Frakce zodpovědné za tento biologický účinek obsahují převážně oligomery se 4-7 jednotkami epikatechinu a s jednou nebo dvěma vazbami typu A (cit.). Proanthokyanidiny interagují s fosfolipidovou částí lipoproteinů, omezují přístup oxidačních činidel k jejich povrchu a přechod přes hydrofobní části membrány, a tak zabraňují jejich oxidaci, čímž pomáhají předejít vzniku atherosklerosy139. Proanthokyanidiny snižují oxidaci izolovaných LDL částic, vyvolanou chemickými oxidanty in vitro140, inhibují zánětlivou odpověď, snižují agregaci krevních destiček, vyvolávají vasokonstrikci atd. Je však těžké interpretovat výsledky


25

s polymerními typy proanthokyanidinů, neboť tyto látky jsou minimálně absorbovány lidským tělem134.

CÍLE DISERTAČNÍ PRÁCE

26

3. CÍLE DISERTAČNÍ PRÁCE Záměrem

předkládané

disertační

práce

bylo

doplnit

poznatky

v oblasti

fytochemické analýzy a biologické aktivity plodů Lonicera caerulea L. a potvrdit nebo vyvrátit bezpečnost Vaccinium macrocarpon Ait. Konkrétní cíle byly: 1. Studium biologické aktivity Lonicera caerulea L. - in vitro: Extrakce a analýza obsahových látek plodu. In vitro studie antiradikálové a antilipoperoxidační aktivity extraktu ve vztahu k některým známým obsahovým látkám. Studium cytoprotektivní aktivity extraktu na primárních kulturách potkaních hepatocytů a lidských endotelových buněk. 2. Studium bezpečnosti konzumace Vaccinium macrocarpon Ait. - in vivo: Vliv tří rozdílných produktů z Vaccinium macrocarpon Ait. na vybrané fyziologické parametry u potkana.

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

27

4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1 Biologický materiál 4.1.1 Rostlinný materiál Rostlinný materiál L. caerulea L., odrůda modrý triumf, byl poskytnut Zahradnictvím Chovanec (Lipník nad Bečvou, ČR). Ke studiu biologické aktivity V. macrocarpon Ait. in vivo byly používány komerční suroviny - dehydratované prášky NUTRICRAN®90S (lyofilizovaná koncentrovaná šťáva V. macrocarpon Ait. standardizovaná na 1,4 % proanthokyanidinů s minimálním obsahem 90 % pevného podílu klikvy velkoplodé), HI-PAC 4.0 (lyofilizovaná šťáva V. macrocarpon Ait. standardizovaná na 4,75 % proanthokyanidinů) a PACRAN® (sušený plod klikvy velkoplodé s obsahem proanthokyanidinů 1,5 %), získané od firmy Decas Botanical Synergies (USA).

4.1.2 Zvířata Laboratorní potkani kmene Wistar (dvouměsíční samci, tělesná hmotnost 210 ± 10 g) byli dodáni firmou Biotest s.r.o. (Konárovice, ČR). Zvířata měla neomezený přístup k potravě (standardní laboratorní dieta, krmivo Mohelsky). Veškerá práce se zvířaty byla prováděna s povolením Etické komise FNOL a LF UP v Olomouci v souladu s českou legislativou. Zvířata byla využita pro izolaci hepatocytů a mikrosomů z jater a pro „in vivo“ experimenty.

4.1.3 Lidský biologický materiál Krev pro izolaci lipoproteinových částic o nízké hustotě (LDL, low density lipoprotein) byla získána od dobrovolných dárců krve z Transfuzní stanice Fakultní nemocnice Olomouc. Vzorky pupečních šňůr pro izolaci lidských endotelových buněk HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) byly získány z Porodnicko-gynekologické kliniky


28

Fakultní nemocnice Olomouc. Odběr a zpracování tkání bylo prováděno s povolením Etické komise FNOL a LF UP v Olomouci v souladu s českou legislativou a s informovaným souhlasem dárkyň. Pupečníky byly odebrány pouze po přirozených porodech.

4.2 Chemikálie, roztoky a přístroje 4.2.1 Chemikálie Acetonitril (HPLC grade), agarosa typ I a VII, bicinchoninová dexamethason,

1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl

(DPPH),

kyselina

dimethylsulfoxid

(BCA), (DMSO),

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid (MTT), disodná sůl ethylendiamintetraoctové

(Na2EDTA),

kyseliny

disodná

sůl

redukovaného

β-nikotinamidadeninukleotidu (NADH), 5,5´-dithio-bis(benzoová) kyselina (DTNB), dodecylsulfát sodný (SDS), ethidium bromid, ethylen-diamintetraoctová kyselina (EDTA), ethylenglykol-O,O´-bis(2-aminoethyl)-N,N,N´,N´-tetraoctová kyselina (EGTA), fenazin methosulfát (PMS), fetální telecí sérum (FCS), L-glutamin, Histopak 1077, hovězí albumin - frakce V (BSA), hovězí želatina typ B (0,2% roztok), N-(2hydroxyethyl)piperazin-N´-2-ethansulfonová kyselina (HEPES), chloramin T, 1-chloro2,4-dinitrobenzen (CDNB), médium DMEM/F-12, methanol (HPLC grade), Na3VO4, neutrální červeň (NR), nitrotetrazoliová modř (NBT), PD-10 Sephadex (G-25M) gel, penicilin (stabilizovaný roztok, 10000 U·ml-1) se streptomycinem (10 mg·ml-1), Ponceau S,

superoxiddismutasa

terc-butylhydroperoxid

(SOD,

(tBH),

3920

U/mg),

tetrasodná

telecí sůl

sérum

(NCS),

redukovaného

β-nikotinamidadenindinukleotidfosfátu (NADPH), thiobarbiturová kyselina (TBA), trifluoroctová

kyselina

(TFA),

trichloroctová

kyselina

(TCA),

tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris), Triton X-100, 0,4% roztok trypanové modři, 0,25% roztok trypsin-EDTA, Williamsovo médium E (WME), Williamsovo médium E bez fenolové červeně, xanthin, xanthinoxidasa (XOD, 0,07 U/mg), dihydrokávová, elagová,

ferulová,

2-hydroxyfenyloctová,

gallová,

gentisová,

hippurová,


4-hydroxybenzoová, 4-hydroxyfenyloctová,

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3-(3-hydroxyfenyl)propionová,

29 3-(4-hydroxyfenyl)propionová,

3-hydroxyskořicová,

chlorogenová, kávová, p-kumarová, protokatechová, rozmarýnová, salicylová, syringová a vanilová kyselina, katechin hydrát, kvercetin dihydrát, kyanidin, rutin hydrát a SYBR®Green byly zakoupeny od firmy Sigma-Aldrich (USA). Eagleovo médium modifikované Dulbeccoem (DMEM) bylo koupeno od firmy GIBCO - Life Technologies (USA). Dále byly použity: primární kozí protilátka - proti aktinu, primární králičí protilátky proti: glutathionperoxidase (GPx), glutathionreduktase (GSHred) a superoxiddismutase (SOD1 a SOD2), sekundární kozí protilátka konjugovaná s křenovou peroxidasou (HRP), sekundární králičí protilátka konjugovaná s HRP, western blotting luminol činidlo A a B pro chemiluminiscenční detekci HRP od Santa Cruz Biotechnology (USA). Proteasový inhibitor CompleteTM od firmy Roche Diagnostic GmbH (Německo), bazální médium pro endotelové buňky (Endothelial Cell Basal Medium) s růstovými faktory od firmy Promocell

(SRN),

dithiotreitol

(DTT),

glycerol,

roztok

akrylamidu

s N,N´-

methylenbisakrylamidem (29:1, 40 %), sacharosa, standard molekulové hmotnosti Mid/Low

Range,

N,N,N´,N´-tetramethylethylendiamin

(TEMED),

2-thioethanol,

10x Tris-glycin pufr, 10x Tris-glycin-SDS pufr a Tween® 20, vše od firmy Bio Basic Inc. (Kanada). Folin-Ciocalteauovo fenolové činidlo od NYCOM (ČR), sušené mléko Laktino (1,3 % tuku) od firmy PML (ČR), ledová octová kyselina (HPLC gradient grades) společnosti Merck & Co Inc. (USA), BCATM kit pro stanovení proteinů od Pierce (USA), kolagenasa o aktivitě PZ 162 a 263 U/g od firmy Serva (Německo), fentanyl od firmy Janssen Pharm. (Belgie), medetomidin od firmy Orion-Farmos Pharm. (Finsko), diazepam od Krka, D. D. (Slovinsko), insulin (100 UI/ml) od Zentivy a.s. (ČR). Pro práci s buněčnými kulturami byly použity kyslík a oxid uhličitý a pro měření na LC/MS a přípravu odparků byl použit dusík od firmy Linde Technoplyn (ČR). Ostatní chemikálie stupně čistoty p.a. byly zakoupeny od firmy Pliva-Lachema (ČR).


30

4.2.2 Roztoky Zásobní roztok fosfátového pufru (PBS) 10× PBS: NaCl (0,137 mol·l-1), KCl (0,00268 mol·l-1), Na2HPO4 (0,00896 mol·l-1), KH2PO4 (0,00147 mol·l-1), pro experimenty byl zásobní roztok 10× zředěn.

Roztoky a rozpouštědla, používaná pro extrakci vzorků a v kapalinové chromatografii Voda, deionizovaná v aparatuře Ultrapur 10 super (Watrex, ČR), methanol p.a., ledová octová kyselina p.a., acetonitril p.a., trifluoroctová kyselina, 1% HCl v methanolu, 1% HCl ve vodě, 50 mmol·l-1 fosfátový pufr KH2PO4, pH 7.

Roztoky pro izolaci mikrosomální frakce potkaních hepatocytů Pufr 1: Tris/HCl (3 mmol·l-1), sacharosa (250 mmol·l-1) a EDTA (0,1 mmol·l-1), pH 7,4. Pufr 2: Tris/HCl (50 mmol·l-1) s KCl (100 mmol·l-1) a EDTA (1 mmol·l-1), pH 7,4. Pufr 3: Tris/HCl (50 mmol·l-1) s EDTA (0,1 mmol·l-1), pH 7,6.

Roztoky pro izolaci a oxidaci lidských LDL Pufr o hustotě 1,006 g·ml-1: NaCl (0,19 mol·l-1), EDTA (96 mmol·l-1). Pufr o hustotě 1,063 g·ml-1: KBr (71 mol·l-1), EDTA (96 mmol·l-1). Roztok modré skalice (CuSO4·5H2O; 5 µmol·l-1), 10× zředěný PBS.

Roztoky pro izolaci a kultivaci potkaních hepatocytů Centrifugační

roztok:

NaCl

(161

mmol·l-1),

Na2HPO4

(0,7 mmol·l-1),

CaCl2 (6,75 mmol·l-1), KCl (3,09 mmol·l-1), HEPES (32,7 mmol·l-1). Hanksův roztok I: NaCl (137 mmol·l-1), KCl (5,37 mmol·l-1), MgSO4 (0,81 mmol·l-1), Na2HPO4 (0,34 mmol·l-1), K2HPO4 (0,34 mmol·l-1), NaHCO3 (25 mmol·l-1), HEPES (12,6 mmol·l-1), EGTA (0,6 mmol·l-1), pH 7,4. Hanksův roztok II: NaCl (137 mmol·l-1), KCl (5,37 mmol·l-1), MgSO4 (0,81 mmol·l-1), Na2HPO4 (0,34 mmol·l-1), K2HPO4 (0,34 mmol·l-1), NaHCO3 (25 mmol·l-1), HEPES (12,6 mmol·l-1), pH 7,4, CaCl2 (4,5 mmol·l-1), kolagenasa (0,1052 U·ml-1). Kultivační médium: WME obohacené dexamethasonem (1 µmol·l-1), penicilinem (100 U·ml-1), -1

streptomycinem

(0,35 µmol·l ), NCS (10 %, v/v).

(50 mg·l-1),

L-glutaminem

(2 mmol·l-1),

insulinem


31

Bezsérové médium: WME s dexamethasonem (1 µmol·l-1), penicilinem (100 U·ml-1), streptomycinem (50 mg·l-1), L-glutaminem (2 mmol·l-1), insulinem (0,35 µmol·l-1). Bezbarvé médium: WME bez fenolové červeně s dexamethasonem (1 µmol·l-1), penicilinem (100 U·ml-1), streptomycinem (50 mg·l-1), L-glutaminem (2 mmol·l-1), insulinem (0,35 µmol·l-1).

Roztoky pro izolaci a kultivaci buněk HUVEC Roztok želatiny na potahování kultivačních lahví a desek: 2% sterilní roztok hovězí želatiny (typ B) byl 10× ředěn sterilní deionizovanou vodou. Earleův solný roztok (EBS): KCl (5,37 mmol·l-1), NaHCO3 (26 mmol·l-1), NaCl (116 mmol·l-1), NaH2PO4·H2O (1,02 mmol·l-1), glukosa (5,56 mmol·l-1). Hanksův roztok bez Ca2+ a Mg2+: KCl (5,37 mmol·l-1), KH2PO4 (0,44 mmol·l-1), NaHCO3 (4,2 mmol·l-1), NaCl (137 mmol·l-1), Na2HPO4 (0,34 mmol·l-1), glukosa (5,56 mmol·l-1). Kultivační médium: bazální médium pro endotelové buňky obsahující aditiva a růstové faktory (Promocell). Centrifugační médium: médium DMEM/F12, penicilin (100 U·ml-1), streptomycin (100 mg·l-1), L-glutamin (2 mmol·l-1), FCS (20 %, v/v). Stabilizační médium: médium DMEM/F12, penicilin (100 U·ml-1), streptomycin (100 mg·l-1), L-glutamin (2 mmol·l-1), FCS (5 %, v/v). Bezsérové médium: médium DMEM/F12, penicilin (100 U·ml-1), streptomycin (100 mg·l-1), L-glutamin (2 mmol·l-1).

Roztoky pro SDS-PAGE a western blot Lyzační pufr: Tris (20 mmol·l-1), EGTA (5 mmol·l-1), NaCl (150 mmol·l-1), glycerolfosfát (20 mmol·l-1), Na3VO4 (1 mmol·l-1), NaF (1 mmol·l-1), Triton X-100 (1%, v/v), Tween 20 (0,1%, v/v), inhibitor proteas CompleteTM (1 tableta v 50 ml), pH 7,5. Migrační pufr: Tris/HCl (1,5 mol·l-1), pH 8,8. Migrační gel: 10% SDS polyakrylamidový gel: 40% roztok akrylamidu/bisakrylamidu 29:1 (24,7 %), deionizovaná voda (48,5 %), migrační pufr (24,7 %), 10% dodecylsulfát sodný (1 %), 10% peroxodisíran amonný (1 %), tetramethylethylendiamin (0,1 %); a 15% SDS polyakrylamidový gel: 40% roztok akrylamidu/bisakrylamidu 29:1 (37,1 %), deionizovaná voda (36,1 %), migrační pufr (24,7 %), 10% dodecylsulfát sodný (1 %), 10% amonium persulfát (1 %), tetramethylethylendiamin (0,1 %).


32

Zaostřovací pufr: Tris (0,5 mmol·l-1), pH 6,8. Zaostřovací gel: 10% polyakrylamidový gel: 40% roztok akrylamidu/bisakrylamidu 29:1 (13,1 %), deionizovaná voda (60,6 %), zaostřovací pufr (24,7 %), 10% dodecylsulfát sodný (1 %), 10% peroxodisíran amonný (0,3 %), tetramethylethylendiamin (0,15 %). Přenosový pufr: Tris (25 mmol·l-1), glycin (0,192 mol·l-1), methanol (20%, v/v), SDS (0,1%, m/v), pH 8,3. TBS (izotonický Tris pufr): Tris (0,1 mol·l-1), NaCl (0,137 mol·l-1), pH 7,6. TBS/T: Tween 20 (0,05%, v/v) v TBS. TBS/T/mléko: Tween 20 (0,05%, v/v), sušené mléko (5%, m/v) v TBS. TBS/T/BSA: Tween 20 (0,05%, v/v), BSA (5%, m/v) v TBS. Vzorkový pufr: Tris (0,125 mol·l-1), pH 6,8; SDS (4%, m/v), glycerol (20%, v/v), DTT (0,2 mol·l-1), bromfenolová modř (0,02%, m/v). Barvící roztok: kyselina octová (5%, v/v); Ponceau S (0,1% m/v). „Stripping“ pufr: Tris (62,5 mmol·l-1), SDS (2%, v/v), 2-thioethanol (0,1 mol·l-1), pH 6,7.

Roztoky pro stanovení inkorporace neutrální červeně Promývací roztok: směs - formaldehyd (0,5%, v/v) a CaCl2 (1%, m/v) v poměru 1:1. Extrakční roztok: methanol (50%, v/v), CH3COOH (1%, v/v).

Roztoky pro stanovení aktivity LDH LDH pufr: Na2HPO4 (50 mmol·l-1), pH 7,5; pyruvát sodný (1,22 mmol·l-1). Pracovní roztok: NADH (0,4 mmol·l-1) v LDH pufru.

Roztoky pro izolaci mikrosomů z jater v experimentu na potkanech Homogenizační pufr: sacharosa (0,25 mol·l-1), EDTA (0,001 mol·l-1), Tris/HCl (0,001 mol·l-1), pH 7,4. Promývací pufr: KCl (0,1 mol·l-1), EDTA (1 mmol·l-1), Tris/HCl (50 mmol·l-1), pH 7,4.

Roztoky pro stanovení parametrů oxidačního stresu GSH pufr: Tris-HCl (0,8 mol·l-1), EDTA (20 mmol·l-1), pH 8,9. Roztok pro stanovení GSH: DTNB (3 mmol·l-1) v GSH pufru.


33

GSHred pufr: KH2PO4 (0,2 mol·l-1), EDTA (2 mmol· l-1), pH 7. Roztok pro stanovení GSHred: GSH oxidovaný (20 mmol·l-1) v deionizované vodě. Reakce se startuje přidáním NADPH (2 mmol·l-1) v Tris/HCl (10 mmol·l-1), pH 7. SOD pufr: KH2PO4 (50 mmol·l-1), EDTA (0,1 mmol· l-1), pH 7,4. Roztok pro stanovení SOD: NBT (62 µmol·l-1), NADH (98 µmol·l-1) v SOD pufru. Reakce se startuje přidáním PMS (33 µmol·l-1) v SOD pufru. GPx pufr: Tris (50 mmol·l-1), EDTA (0,1 mmol·l-1), pH 7,6. Roztok pro stanovení GPx: GSH (0,3875 mmol·l-1), NADPH (0,186 mmol·l-1), glutathionreduktasa (1,55

U·ml-1) v GPx

pufru.

Reakce se startuje přidáním

kumenhydroperoxidu (10 µl v 10 ml deionizované vody). GST pufr: NaH2PO4 (0,1 mol·l-1), pH 6,5. Pracovní roztok pro stanovení GST: GSH redukovaný (20 mmol·l-1) v deionizované vodě. Reakce se startuje přídavkem CDNB (20 mmol·l-1) v 95% ethanolu. Pufr na katalasu: KH2PO4 (0,05 mol·l-1); Na2HPO4 (0,05 mol·l-1), pH 7. Pracovní roztok pro stanovení katalasy: H2O2 (0,03 mol·l-1) v pufru na katalasu. Pufr na stanovení cytochromu P450: KH2PO4 (0,1 mol·l-1), pH 7 a KCl (0,15 mol·l-1), Tris (0,05 mol·l-1), pH 7,4. Další látky na stanovení cytochromu P450: CO, Na2S2O4. TAC pufr: KH2PO4 (0,3 mol·l-1), pH 7. Pracovní roztok pro stanovení AOPP: chloramin T (20 µmol·l-1) v PBS. Reakce se startuje přídavkem KI (1,16 mol·l-1) v PBS a kyseliny octové.

Roztoky pro stanovení poškození DNA (Comet assay) Lyzační roztok: NaCl (2,5 mol·l-1), EDTA (0,1 mol·l-1), Tris (10 mmol·l-1), pH 10. Neutralizační roztok: Tris/HCl (0,4 mol·l-1), pH 7,4. Roztok na elektroforézu: NaOH (0,3 mol·l-1), EDTA (1 mmol·l-1). Barvící roztok: SYBR®Green (20 µl; 10000× zředěno v DMSO).


34

Roztoky pro stanovení proteinů a hemoglobinu Pracovní roztok pro stanovení pomocí bicinchoninové kyseliny: kit BCATM - 10 ml činidla A a 200 µl činidla B. Pracovní roztok pro stanovení dle Lowryho: 25 ml 2% Na2CO3 v NaOH (0,1 mol·l-1), 0,25 ml 1% CuSO4·5H2O (m/v) a 0,25 ml 2% vinanu sodnodraselného (m/v). Pracovní roztok pro stanovení dle Bradfordové: 0,01 % (m/v) Coomassie Brilliantová modř v 50 ml 95% ethanolu a 100 ml 85% H3PO4 doplněno do 1000 ml vodou. Pracovní roztok pro stanovení hemoglobinu: NaHCO3 (0,012 mmol·l-1), KCN (0,77 mmol·l-1), K3[Fe(CN) 6] (7,4 µmol·l-1). Standardy hovězího sérového albuminu o koncentraci 0-2 g·l-1.

4.2.3 Přístroje Chlazená centrifuga Z 323 K (Hermle Labortechnik, Německo) Ultracentrifuga OptimaTM LE-80K (Beckman Instruments, USA) Chlazená centrifuga Mikro 22 a Rotina 38R (Hettrich Zentrifugen, Německo) Centrifuga Labofuge 400 (Heraeus, Německo) Centrifugy MiniSpin® (Eppendorf, Německo) Laminární box CLF (Schoeller Instruments, ČR) Fotometr pro měření absorbance v 96-jamkových deskách Sunrise Remote (Tecan, Švýcarsko) UV-VIS spektrofotometr UV-2401PC (Shimadzu, Japonsko) Hlubokomrazící box VX 380 (Jouan, Francie) Homogenizátor Ultra-Turax T 25 basic (Ika Werte, Německo) Ultrazvuková termostatová vodní lázeň PS 01000A (Notus-Powersonic, Slovensko) Termomixer Comfort (Eppendorf, Německo) Mikroskop CK40 (Olympus, Japonsko) Inkubátor Cellstar (Qeueue System, USA) Inverzní fluorescenční mikroskop Olympus IX 70 S8F (Olympus, Japan) s kamerou PCO VC 45-CG-23 (CCD Imaging, Germany)


35

pH-metr inoLab Level 1 (Schoeller Instruments, ČR) s elektrodou SenTix41 (WTW, Německo) Třepačka OLS 200 (Grant Instruments,Velká Británie) Třepačka Duomax 1030 a Reax top (Heidolph, Německo) Magnetická míchačka IKA RH basic KT/C (Slabo, ČR) Systém pro elektroforézu Mini-Protean® 3 Cell se zdrojem PowerPac 200, PowerPac 3000 nebo PowerPac universal (Bio-Rad Laboratories, USA) Váhy AX105 DeltaRange® (Mettler Toledo, Švýcarsko) Zařízení pro přípravu deionizované vody Ultrapur (Watrex, ČR) Ultrazvuková sonda UP200s (Dr. Hielscher, GmbH, Německo) Vakuové čerpadlo Vacci-space (Chromservis, Slovensko) Vakuová rotační odparka s vodní lázní Rotavapor R-3000 (Bőchi, Švýcarsko)

Systém pro cyklickou voltametrii Potenciostat/Galvanostat Model 273, (EG&G Princeton Apllied Research, USA) byl vybaven pracovní skleněnou uhlíkovou elektrodou MF2012 (Bioanalytical

Systems,

USA),

pomocnou

platinovou

elektrodou

a

referenční

kalomelovou elektrodou (Hg / Hg2Cl2 / nasycený roztok KCl).

Systém pro LC Shimadzu Class VP (Shimadzu Corporation, Japan) byl vybaven řídící jednotkou SCL-10AVP, odplyňovačem DGU-14A, ventilem kontroly průtoku FCV10AlVP, pumpou LC-10ADVP, autoinjektorem SIL-10ADVP, termostatem kolony CTO10AC, UV detektorem SPD-10AVP a hmotnostním detektorem LCQ Fleet, software Xcalibur®. Kolona Gemini C18, 5µm, 110 Å, 150 × 2 mm (Phenomenex, USA). Plynový chromatograf GC-HP 6890 (Hewlett Packard, USA), kapilára JW - DB5, délka 25 m, vnitřní průměr 0,250 nm, film 0,25 µm. Hmotnostní spektrometr Autospec Ultima (Waters Micromass, UK). Tenkovrstevný chromatograf Iatroscan®new MK-5 (Iatron laboratoriem, Japonsko) s FID a FPD detekcí a tyčinkami Chromarod®S III (Iatron laboratoriem, Japonsko). Kapilární elektroforéza HP 3D (Agilent, Německo).


36

Kapalinový chromatograf Spectra-Physics (Spectra-Physics, USA) v uspořádání pumpa SP 8800, autosampler SP 8800, kolona 250 × 4 mm, náplň Lichropher 100-5, NH2 (Watrex, ČR) a detektor Shodex RI SE-61, kolony pro předseparaci Amberlite® XAD-2 (9 × 5 cm), XAD-4 (16 × 6 cm, Rohm and Haas Deutschalnd GmbH, Německo) a Bio-Gel P2 (80 × 2,5 cm, Bio-Rad, USA). MALDI-TOF hmotnostní spektrometr Bruker BIFLEX II (Bruker-Frazen, Německo) vybavený dávkovačem vzorků SCOUT 26, zdrojem zpožděné extrakce iontů a dusíkovým laserem s vlnovou délkou 337 nm (Laser Science, UK).

4.2.4 Ostatní materiál Fotografický film Kodak X-Omat AR Film XAR5, fotografická vývojka a ustalovač Kodak GBX (Eastman Kodak, USA) PVDF membrána Immun-BlotTM (0,2 µm; Bio-Rad Laboratories, USA) Sterilizační filtry 0,22 µm Millex®-GS (Millipore, USA) Kultivační láhve NunclonTM, kultivační desky, filtry a centrifugační zkumavky (Nunc, Dánsko) Plastové injekční stříkačky (B. Braun, Německo) Plastové mikrozkumavky (Eppendorf, Německo) Filtrační papír Whatman (Whatman, USA) Chromatografické desky pro HPTLC (Merck, Německo) Sephadex G50 (Sigma-Aldrich, USA) Aerosil® Rumec Silica (Evonik Industrie, Německo) Neionomerní polystyren-divinylbenzenový sorbent Sepabeads SP 207 (Mitsubishi Chemical Corp., Japonsko) Teflonové membránové mikrofiltry PTFE 13 mm, 0,45 µm (Labikom s.r.o., ČR) SPE kolonka Strata-Screen-A, směsný sorbent, 200 mg/3 ml (Phenomenex, USA) SPE kolonka Strata SDB-L, styren-divinylbenzen, 200 mg/3 ml (Phenomenex, USA) Zkumavky Na2EDTA-NaN3 a heparin litný (Sarstedt, Německo)


37

4.3 Statistické zhodnocení Všechny experimenty in vitro byly provedeny v tripletech ve třech nezávislých opakováních, pokud není uvedeno jinak. Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ± SD. Statistické vyhodnocení dat bylo provedeno pomocí programu MS Excel 2000 (Microsoft, USA) s nástavbou Life Science Workbench (LSW) Data Analysis Toolbox (MDL Information Systems, Inc., USA) nebo Studentovým t-testem. Všechny hodnoty z experimentů na zvířatech byly zpracovány systémem ANOVA a vyjádřeny jako průměr ± SD (p < 0,05).

4.4 Lonicera caerulea L. 4.4.1 Zpracování plodů L. caerulea L. (odrůda modrý triumf) byla pěstována v Zahradnictví Chovanec (Lipník nad Bečvou, ČR). Plody byly ručně sesbírány a zpracovány do 24 hod. Část plodů byla uskladněna při -20 ºC a část lyofilizována. 4.4.1.1 Macerace mražených plodů 96% ethanolem 1) Plody (370 g) byly zality a rozmíchány ve 400 ml 96% ethanolu. Macerace probíhala po dobu 4 hod., z čehož bylo získáno 450 ml extraktu. Následovala extrakce 2× 200 ml ethanolu po dobu 2 hod. Extrakty byly společně zahuštěny na medovitý odparek (24 g), který byl rozpuštěn v methanolu. K roztoku bylo přidáno 2,4 g Aerosilu, suspenze byla zahuštěna a vysušena v sušárně při 60 ºC a vakuu 2 mbar po dobu 6 hod. Odparek byl stále lepivý. Jeho část byla i s Aerosilem rozemleta v třecí misce (frakce 10/1). 2) Ke zmraženým plodům po předchozí extrakci (bod 1) bylo přidáno 200 ml 96% ethanolu a ponecháno macerovat 2 dny, následně 2× 200 ml ethanolu po dobu 2 hod. a 200 ml ethanolu po dobu 24 hod. Z plodů byla vymačkána všechna přebytečná tekutina. Všechny extrakty byly spojeny a zahuštěny na odparek (11 g). Odparek byl rozpuštěn v methanolu a k roztoku přidáno 1,1 g Aerosilu a suspenze byla opět zahuštěna. Lepivý odparek byl rozetřen v třecí misce (frakce 10/2).


38

4.4.1.2 Macerace mražených slupek Slupky (90 g) získané po extrakci plodů 20% ethanolem byly zality 200 ml 96% ethanolu a macerovány 24 hod. Extrakt byl odfiltrován, slupky vymačkány a promyty 100 ml 96% ethanolu. Spojené extrakty byly odpařeny (2,8 g), odparek rozpuštěn v methanolu a k roztoku přidáno 0,3 g Aerosilu. Směs byla odpařena a usušena ve vakuové sušárně (60 ºC, 20 nPa, 2 hod.). Bylo získáno 2,6 g křehkého odparku (frakce 12/1). 4.4.1.3 Extrakce mražených plodů 0,1% kyselinou fosforečnou - příprava fenolové frakce Zmražené

plody

byly

extrahovány

0,1%

H3PO4

při

teplotě

50

ºC

v semikontinuálním extraktoru po dobu 14 hod. (cit.141). Získaný primární extrakt byl přečištěn na koloně naplněné neionomerním polystyren-divinylbenzenovým sorbentem Sepabeads SP 207. Kolona byla promyta deionizovanou vodou a extrakt odpařen na fenolovou frakci (20,3 g, frakce 8/1). Po eluci vodou byla kolona promyta ethanolem a eluát odpařen (8,5 g, frakce 8/2).

4.4.2 Analýza obsahových látek 4.4.2.1 Stanovení nutričních složek, minerálů a kontaminantů Analýza nutričních složek, vitaminů, vybraných minerálů a kontaminantů v plodech byla provedena na Odboru hygienických laboratoří v Karviné Zdravotního ústavu se sídlem v Ostravě. Jednotlivé metody jsou specifikovány v tabulce v sekci výsledky (tab. IV). Parametry byly určeny v plodech L. caerulea L. pěstovaných na území ČR a současně v plodech pocházejících z Číny. 4.4.2.2 Stanovení cukrů Zmražené plody byly 2× extrahovány vodou (100 ºC; 2 hod.) a 0,1% H3PO4 (pH 6) při pokojové teplotě. Extrakty byly lyofilizovány a analyzovány. Vzorky byly rozpuštěny ve vodě a předseparovány použitím kolon XAD-2, XAD-4 a Bio-Gel P2. Dělení cukrů


39

bylo provedeno na analytickém chromatografu Spectra Physics; mobilní fáze - voda, průtok 0,5 ml·min-1; teplota 80 ºC; UV a RI detekce. Detekční vlnová délka byla 210 nm, spektrum registrováno v rozmezí 200-360 nm. Hmotnostní spektra byla měřena na MALDI-TOF hmotnostním spektrometru Bruker BIFLEX II pracujícím v pozitivním lineárním módu; urychlovací napětí 19 kV. Maldi matrici tvořila 2,5-dihydroxybenzoová kyselina (10 mg·ml-1) ve vodném 50% ethanolu/0,1% trifluoroctové kyselině (TFA). Spektra byla registrována v rozmezí molekulových hmotností 0-6000 Da. 4.4.2.3 Stanovení lipidů, sterolů a mastných kyselin Lipidy byly analyzovány dle Folsche142 po extrakci ze zmražených plodů chloroformem/methanolem (2:1). Alikvotní část byla vysušena za podtlaku olejové vývěvy a zvážena. Takto získaný extrakt byl analyzován na přístroji Iatroscan®New MK-5. Extrakt (1 µl) byl nanesen na tyčinky Chromarod®S III do mobilní fáze chloroform/methanol/voda/25% amoniak (47:20:2,5:0,28) při pokojové teplotě. Po vysušení (110 ºC; 3 min.) byla jako druhá mobilní fáze použita směs hexan/diethylether (60:10), při 20 ºC. Tyčinky byly vysušeny a spáleny (H2 160 ml, vzduch 1,5 l) a produkty snímány při 526 nm rychlostí 50 s/tyčinka. Extrakt lipidů byl odpařen do sucha a zmýdelněn varem (2 hod., 50 ml 1 mol·l-1 NaOH v ethanolu). Nezmýdelnitelný podíl byl extrahován směsí diethylether/hexan (1:1) a analyzován GC/MS. Vodný roztok byl okyselen na pH 2 pomocí HCl a mastné kyseliny extrahovány chloroformem. Methylestery mastných kyselin byly připraveny reakcí s roztokem 14% BF3 v methanolu při 50 ºC, 10 min., přidána voda (5 ml), estery extrahovány hexanem (2× 5 ml), hexanová vrstva promyta vodou (4 ml) a vysušena. Roztok byl zfiltrován a analyzován GC/MS (cit.143). Steroly byly identifikovány na plynovém chromatografu HP 6890, kapilára SPB-1701, délka 5 m, vnitřní průměr 0,53 mm (Supelco, PA), teplotní program od 50 ºC, gradient 15 ºC/min, výsledná teplota 300 ºC. Nástřik split (1:50), byl udržován konstantní průtok 3,2 ml/min He jako nosného plynu. Methylestery mastných kyselin byly rozpuštěny v chloroformu a měřeny na stejném plynovém chromatografu HP 6890, kapilára SPB-35, délka 30 m, vnitřní průměr 0,25 mm


40

(Supelco, PA), teplotní program od 50 ºC, gradient 15 ºC/min, výsledná teplota 300 ºC. Nástřik - split (1:50), průtok He jako nosného plynu byl udržován konstantní (1,2 ml/min). Detekce byla provedena na hmotnostním spektrometru Autospec Ultima, magnetický scan 20-600 amu. 4.4.2.4 Stanovení organických kyselin Organické kyseliny byly stanoveny kapilární zónovou elektroforézou HP 3D (Agilent, USA) s UV/VIS detekcí s diodovým polem v oblasti 190 až 600 nm, křemíková kapilára pokrytá polyakrylamidem, délka 40 cm, 25 ºC, -20 kV, pufr: 10 mmol·l-1 salicylát/triethylamin, pH 3,5, hydrodynamická injekce 5000 Pa × 5/s. Detekční vlnová délka 238 nm. Vzorky byly před analýzou rozpuštěny v 1 ml destilované vody, 10 min. sonikovány, zfiltrovány a analyzovány za použití kalibrační křivky. 4.4.2.5 Stanovení fenolových látek Metoda LC/MS Vzorky (44 mg) byly rozpuštěny v 50 mmol·l-1 fosfátovém pufru (1,5 ml; pH 7) a roztok zfiltrován přes teflonový membránový mikrofiltr (0,45 µm porosita). Vzorek byl nanesen na kondiciovanou (methanol, fosfátový pufr) SPE kolonku (směsný sorbent reverzní fáze, Strata Screen A). Kolona byla promyta 3 ml deionizované vody a eluována 3 ml methanolu a 3 ml 1% HCl v methanolu. Methanolové frakce byly spojeny a odpařeny pod dusíkem při 40 ºC. Pevný podíl byl rozpuštěn v mobilní fázi A a analyzován LC/MS, mobilní fáze A: 10 mmol·l-1 octová kyselina, 5% acetonitril ve vodě (v/v); mobilní fáze B: acetonitril, gradient 0-5 min., 10 % B, 5-25 min., 10-90 % B, 40-45 min., 90-10 % B a 45-50 min., 10 % B. Měření byla provedena na systému pro LC Shimadzu Class VP (Shimadzu Corporation, Japan) s UV detektorem SPD-10AVP a hmotnostním detektorem LCQ Fleet, koloně Gemini C18 (Phenomenex, USA). Nastavení iontového zdroje a optiky bylo optimalizováno podle 4-hydroxybenzoové kyseliny. Směs standardů (protokatechová, gentisová, 4-hydroxybenzoová, elagová, salicylová,

rozmarýnová,

ferulová,

kávová,

dihydrokávová,

chlorogenová,

3-hydroxyskořicová, kumarová, vanilová a syringová kyselina) ve čtyřech různých


41

koncentracích (0,01-10 mg·l-1) byla použita pro získání kalibračních závislostí. Kalibrační závislosti byly lineární (R ≥ 0,990). Limit detekce byl 1,5 µg·l-1 a limit kvantifikace 10 µg·l-1. 4.4.2.6 Stanovení anthokyaninů Vysokoúčinná chromatografie na tenké vrstvě (HPTLC) Pro dělení látek byly použity skleněné desky potažené celulosou 50 HPTLC 20 × 10 cm (Merk, Německo). Všechny vzorky a standardy byly rozpuštěny v methanolu a nanášeny ručně pipetou v objemu 10 µl vzorku (4 mg·ml-1) a 5 µl standardu (0,4 mg·ml-1; peonidin-3-glukosid, pelargonidin-3-glukosid a kyanidin-3-glukosid). Desky byly vyvíjeny v horizontální poloze v mobilní fázi A (HCl:CH3COOH:H2O 3:15:82), následně vyjmuty, vysušeny fénem a opět vyvíjeny v mobilní fázi B (H2O:CH3COOH - 40:60). Po vysušení byly hodnoceny na základě retenčního faktoru. Metoda LC/MS Vzorky (44 mg) byly rozpuštěny v 1 ml 0,01% HCl. Roztok (0,5 ml) byl nanesen na kondiciovanou (methanol, 0,01% HCl) SPE kolonku (styren-divinylbenzen). Kolona byla promyta 3 ml 0,01% HCl a anthokyaniny eluovány 3 ml 0,01% HCl v methanolu. Frakce byla odpařena pod dusíkem při 40 ºC, pevný podíl rozpuštěn v mobilní fázi A a analyzován LC/MS, mobilní fáze A: 0,12% trifluoroctová kyselina, 5% acetonitril ve vodě (v/v); mobilní fáze B: 0,12% trifluoroctová kyselina v acetonitrilu, gradient 0-35 min., 10-90 % B, 35-40 min., 90 % B. Měření byla provedena na systému Shimadzu Class VP (Shimadzu Corporation, Japan) s UV detektorem SPD-10AVP a hmotnostním detektorem LCQ Fleet, koloně Gemini C18 (Phenomenex, USA). Ke kvantifikaci anthokyaninů byl použit standard malvidin-3-glukosidu v koncentračním rozmezí 5-100 mg·l-1. Kalibrační závislost byla lineární (R = 0,994). Faktory odezvy jednotlivých barviv byly zanedbány. Limit detekce byl 1,5 µg·l-1, limit kvantifikace 10 µg·l-1.


42

4.4.3 Stanovení antioxidační aktivity fenolové frakce 4.4.3.1 Stanovení redukční kapacity Redukční kapacita byla stanovena použitím Folin-Ciocalteauovy metody144. 5 µl vzorku nebo standardu (galová kyselina) bylo smícháno se 100 µl Folin-Ciocalteauova fenolového činidla (10× zředěno destilovanou vodou). Po 5 min. stání bylo přidáno 100 µl roztoku Na2CO3 (75 g·l-1) a směs inkubována 90 min. při pokojové teplotě. Paralelně byly inkubovány roztoky galové kyseliny v koncentraci 0,05-0,5 g·l-1 resp. pufr jako slepá zkouška. Po ukončení inkubace byla měřena absorbance při 725 nm (fotometr Sunrise Remote) a redukční aktivita v extraktech odečtena z kalibrační křivky kyseliny galové. 4.4.3.2 Stanovení zhášení DPPH radikálu Antiradikálová aktivita byla testována metodou zhášení radikálu 1,1-difenyl-2pikrylhydrazylu (viz schéma 1; cit.145,146).

Schéma 1. Zhášení DPPH radikálu. Do jamek mikrotitrační destičky bylo napipetováno 90 µl methanolového roztoku testovaného extraktu v koncentracích 0-100 µg·ml-1, následně přidáno 180 µl methanolového roztoku DPPH (20 µg·ml-1) a po 30 min. měřena absorbance při 517 nm. Hodnota IC50 byla zjištěna z kalibrační křivky.


43

4.4.3.3 Stanovení interakce se superoxidovým radikálem •−

Schopnost testovaných látek zhášet O 2 , generovaný neenzymatickou cestou β-nikotinamidadeninnukleotidu/fenazinmethosulfátu

(NADH/PMS),

byla

sledována

redukcí nitrotetrazoliové modři (NBT) superoxidem147. Pro stanovení bylo smícháno 50 µl roztoku testované látky v koncentračním rozmezí 0-360 µg·ml-1 se 40 µl NADH (996 µmol·l-1) a 60 µl NBT (250 µmol·l-1). Reakce byla zahájena přidáním 150 µl roztoku PMS (5,4 µmol·l-1), ve slepých zkouškách byl místo PMS použit PBS, který sloužil k rozpuštění všech složek reakční směsi. Tato směs byla inkubována 30 min. při teplotě 37 ºC a absorbance změřena při 560 nm. Schopnost testovaných látek zhášet superoxid byla vypočítána jako koncentrace inhibující oxidaci NADH z 50 %.

4.4.4 Stanovení inhibice lipoperoxidace Lipoperoxidace mikrosomálních membrán byla hodnocena stanovením produktů peroxidace lipidů reakcí s thiobarbiturovou kyselinou (TBA), spektrofotometricky při 535 nm (cit.148). Látky reagující s TBA se obecně označují jako TBARS (thiobarbituric

acid reactive substances). Izolace mikrosomální frakce potkaních jater Mikrosomální frakce byly izolovány z jater laboratorních potkanů149,150. Po usmrcení potkana v celkové anestezi, byla játra odebrána a uchovávána při -80 ºC. Jaterní tkáň byla rozmražena při 4 ºC a homogenizována v ledovém pufru 1. Získaný 20% (w/w) homogenát byl centrifugován (15 min/800×g/4 ºC), poté následovala centrifugace supernatantu (20 min/10000×g/4 ºC). Sediment obsahující mitochondriální frakci byl resuspendován v pufru 2, znovu centrifugován a resuspendován a naředěn pufrem 2. Supernatant po oddělení mitochondriální frakce byl ultracentrifugován (ultracentrifuga

OptimaTM, 60 min/35000×g/4 ºC). Sediment obsahující mikrosomální frakci byl resuspendován v pufru 2 a znovu centrifugován, resuspendován v 0,5 ml 1,15% KCl a naředěn pufrem 3. Množství proteinů bylo stanoveno metodou dle Lowryho151. Získané mikrosomy byly před dalším použitím uchovávány při -80 ºC.


44

Stanovení inhibice lipoperoxidace Směs mikrosomální suspenze (výsledná koncentrace 200 µg proteinu·ml-1) s testovanými látkami (1-250 µg·ml-1) v PBS byla inkubována 1 hod. při 37 ºC. Peroxidace membránových lipidů byla indukována terc-butylhydroperoxidem (tBH, 5× ředěné; cit.148). Celkový objem reakční směsi činil 0,5 ml. Slepá zkouška obsahovala vše kromě tBH. Po 1 hod. inkubace bylo k reakční směsi přidáno 0,7 ml směsi thiobarbiturové (TBA 26 mmol·l-1) a trichloroctové kyseliny (TCA 918 mmol·l-1) a vzorky zahřívány 15 min. při 90 ºC. Po ochlazení a centrifugaci (10 min., 9000×g) byla změřena absorbance při 535 nm a účinek látek vyjádřen jako IC50 ± SD.

4.4.5 Stanovení inhibice oxidace lidských LDL Izolace lidských lipoproteinů o nízké hustotě z krve Lipoproteiny o nízké hustotě (LDL) byly izolovány z plazmy několikastupňovou ultracentrifugací (OptimaTM). Nesrážlivá krev byla centrifugována 10 min. při 3500×g, při 15 ºC. Ke 2 ml získané plazmy bylo přidáno 0,5 ml roztoku o hustotě 1,006 g·ml-1 a směs ultracentrifugována 11 hod., při 45000×g a 10 ºC. Po oddělení vrstvy lipoproteinů o velmi nízké hustotě (VLDL) byl supernatant přemístěn do kalibrované zkumavky spolu s 0,5 ml roztoku o hustotě 1,063 g·ml-1 a přidán pevný KBr (výsledná koncentrace 82,74 mg·l-1). Směs byla ultracentrifugována 12 hod. při 45000×g a 10 ºC. Vrstva LDL byla odtažena do chlazené zkumavky a obsah proteinů stanoven metodou dle Bradfordové152. Oxidace lidských LDL LDL (výsledná koncentrace 100 µg·ml-1 v PBS) byly inkubovány v přítomnosti 0,5, 1,0 a 2,0 µg·ml-1 fenolové frakce (4.4.1.3). Jako slepá zkouška sloužil PBS, jako pozitivní kontrola roztok askorbové kyseliny (5 µmol·l-1) v PBS. Oxidace LDL byla indukována CuSO4 (10 µg·l-1; cit.153) a měřena při 234 nm (UV-2401PC) jako tvorba konjugovaných dienů hydroperoxidů lipidů při 37 ºC po dobu 320 min. Odolnost LDL vůči oxidaci byla vyjádřena prodloužením „lag“ fáze.


45

Příprava oxidovaných LDL pro použití na buňky Pro aplikaci na buněčné modely byly LDL zbaveny EDTA a rozpustných nízkohustotních sloučenin gelovou filtrací. Získané LDL byly naředěny na koncentraci 0, 1, 5, 10, 25, 100 a 200 µg·ml-1 v PBS a inkubovány s CuSO4 (10 µg·l-1) po dobu 2, 4, 8 a 24 hod. při 37 ºC. Oxidace byla ukončena přídavkem ethylendiamintetraoctové kyseliny (EDTA; 100 µg·l-1) a butylhydroxyanisolu (BHA; 200 µg·l-1) a tyto roztoky byly aplikovány na buňky.

4.4.6 Buněčné modely 4.4.6.1 Potkaní hepatocyty Izolace potkaních hepatocytů Hepatocyty byly izolovány modifikovanou dvoustupňovou kolagenasovou perfúzí potkaních jater154. Po intraperitoneální anestezi (xylazin - 30 mg·kg-1 hmotnosti a ketamin - 120 mg·kg-1 hmotnosti) a následné kanylaci portální vény, byla játra vyjmuta z břišní dutiny a promývána 4 minuty Hanksovým pufrem I s chelatačním činidlem (EGTA) pro odstranění Ca2+ a poté 6 min. Hanksovým pufrem II obsahujícím kolagenasu a Ca2+. Játra byla přenesena do sterilní nádoby s centrifugačním roztokem a opatrně roztřepána. Buněčná suspenze byla filtrována přes gázu, třikrát centrifugována (2 min/50×g), vždy promyta centrifugačním roztokem, a po poslední centrifugaci Krebs-Henseleitovým bikarbonátovým pufrem, resp. kultivačním médiem. Životnost a počet buněk byly stanoveny na základě barvení trypanovou modří, životnost byla vždy větší než 80 %. Primární kultury potkaních hepatocytů Hepatocyty byly naředěny ve sterilním kultivačním médiu a kultivovány na deskách pokrytých kolagenem typu I (cit.155) v inkubátoru nasyceném vodními parami při 37 ºC, v atmosféře s 5 % CO2 minimálně 4 hod. Výsledná koncentrace buněk byla 1·105 buněk/cm2. Po stabilizaci buněk bylo kultivační médium vyměněno za bezsérové médium. Inkubace pokračovala v inkubátoru přes noc a následující den byly provedeny experimenty.


46

Stanovení cytotoxicity fenolové frakce: Toxicita byla sledována po 4, 6, 24 a 48 hod. inkubaci buněk s fenolovou frakcí. Sledovanými parametry byly redukce MTT mitochondriálními dehydrogenasami metabolicky aktivních buněk na formazanové barvivo (MTT test156, viz níže) a uvolnění cytoplasmatické LDH do média (LDH test157). Cytoprotektivní aktivita fenolové frakce: Cytoprotektivní aktivita frakce byla studována na primárních kulturách potkaních hepatocytů, intoxikovaných tBH. Po stabilizaci buněčné monovrstvy byla kultura preinkubována s fenolovou frakcí (0-1000 µg·ml-1) po dobu 30 min. Po preinkubaci následovala intoxikace tBH (0,5 mmol·l-1) po dobu 1,5 hod. Negativní kontroly neobsahovaly sledované látky ani tBH, pozitivní obsahovaly pouze tBH. Životnost buněk byla sledována MTT testem a integrita buněčné membrány LDH testem. 4.4.6.2 Lidské endotelové buňky Izolace lidských endotelových buněk Endotelové buňky (HUVEC) byly izolovány z pupečních šňůr žen (18-35 let) po fyziologickém porodu na Porodnicko-gynekologické klinice Fakultní nemocnice Olomouc. Všechny dobrovolnice podepsaly informovaný souhlas s odběrem a splňovaly kritéria pro zařazení do studie. Studie byla schválena Etickou komisí Fakultní nemocnice a Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci (č.j. 39/05) a probíhala v souladu s principy Mezinárodní etické komise pro biomedicínský výzkum (CIOMS, Ženeva 1993). Po porodu byla pupeční šňůra ustřižena (minimálně 10 cm), propláchnuta EBS, vložena do sterilního EBS s antibiotiky a uchována při 4 ºC. Endotelové buňky byly izolovány kolagenasovou digescí maximálně do 20 hod. od porodu. Šňůra byla promyta EBS, naplněna roztokem kolagenasy v EBS (15 min., 37 ºC), promyta sterilním Hanksovým pufrem bez Ca2+ a Mg2+ a izolované buňky přemístěny do kultivačního média s růstovými faktory a antibiotiky. HUVEC byly kultivovány v kultivačních lahvích potažených 0,2% želatinou. Vzhledem k tomu, že po osmé pasáži dochází k nezvratné změně morfologie, byly v experimentech používány buňky mezi 2.-7. pasáží.


47

Primární kultury endotelových buněk Buňky byly uchovány v inkubátoru nasyceném vodními parami při 37 °C a v atmosféře 5% CO2, médium bylo měněno každých 48-72 hod. Po dosažení konfluence byly buňky opláchnuty sterilním PBS (5 ml), uvolněny inkubací s 0,25% roztokem trypsinu s EDTA (0,5 ml; 1-2 min.; 37 °C), centrifugovány s 5-10 ml centrifugačního média (10 min., 152×g, pokojová teplota), resuspendovány v 10 ml kultivačního média, a poté použity do experimentů. Kultivační desky byly potaženy 0,2% želatinou (100 µl·cm-2). Po zatuhnutí želatiny (30 min., 37 °C) byl sterilně odsát nadbytek roztoku. Buňky byly vysévány v koncentraci 3× 104 buněk/ml v růstovém médiu a uchovávány v inkubátoru nasyceném vodními parami při 37 °C. Po dosažení konfluence (3-4 dny) bylo 16 hod. před zahájením pokusu kultivační médium vyměněno za stabilizační a následující den přidávány testované látky. Stanovení cytotoxicity fenolové frakce: Toxicita fenolové frakce byla sledována po 4, 6, 24 a 48 hod. Sledovaným parametrem byla redukce MTT a uvolnění LDH do média. Cytoprotektivní aktivita fenolové frakce: Cytoprotektivní aktivita frakce byla stanovena stejně jako v případě potkaních hepatocytů (viz kapitola 4.4.6.1) poškozením tBH. Protektivní aktivita fenolové frakce vůči oxidovaným LDL: Pro stanovení vlivu oxidačně modifikovaných LDL (oxLDL) na HUVEC byly buňky inkubovány 2, 4, 8 a 24 hod. v přítomnosti fenolové frakce (0-1000 µg·ml-1) a nebo oxLDL (0-200 µg·ml-1). Účinek byl měřen MTT a LDH testy. Pro určení protektivního účinku byly HUVEC nejprve preinkubovány s fenolovou frakcí (0-1000 µg·ml-1) po dobu 2 hod. a následně s oxLDL (200 µg·ml-1) po dobu 24 hod. Potenciální protektivní účinek byl hodnocen MTT a LDH testem, inkorporací neutrální červeně (NR; cit.158) a stanovením produktů lipoperoxidace. 4.4.6.3 Stanovení parametrů buněčného poškození MTT test Tetrazoliová

sůl

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium

bromidu

(MTT) je redukována mitochondriálními dehydrogenasami metabolicky aktivních buněk


48

na formazanové barvivo, jehož koncentrace je po rozpuštění v organickém rozpouštědle stanovena spektrofotometricky při 540 nm (cit.156). Buňky byly opláchnuty sterilním roztokem PBS a do jamek bylo aplikováno 100 µl čerstvého bezsérového média a 10 µ l roztoku MTT (5 mg·ml-1; PBS). Po 3 hod. inkubaci (37 °C; 5 % CO2) bylo médium s MTT odsáto, do jamek aplikováno 200 µl DMSO s 1 % amoniaku a po 5 min. (rozpuštění krystalů) byla změřena absorbance při 540 nm. Životnost buněk byla počítána podle vztahu: Životnost (%) =

Av ⋅ 100 As

Av…absorbance vzorku, As…absorbance kontroly

Inkorporace neutrální červeně (NR) Nepoškozené buňky přijímají a ukládají NR do lysozomů. Koncentrace barviva je měřena po rozpuštění v organickém rozpouštědle spektrofotometricky při 540 nm (cit.158). Buňky byly opláchnuty sterilním PBS a do jamek přidáno 40 µl roztoku NR (0,03 %; PBS). Po 3 hod. inkubaci (37 °C; 5 % CO2) byl roztok s NR odstraněn, buňky opláchnuty promývacím roztokem (200 µl), lyzovány extrakčním roztokem (200 µl) a po 5 min. intenzivního třepání změřena absorbance při 540 nm.

LDH test Buňky s porušenou integritou membrány uvolňují laktátdehydrogenasu do média. V reakční směsi obsahující pyruvát dochází k přeměně NADH na NAD+, a tím k poklesu absorbance, měřené při 340 nm po dobu 4 min. (cit.157). Aktivita LDH v médiu byla stanovena v 50 µl vzorku po přidání 150 µl pracovního roztoku. Aktivita LDH byla vypočítána podle vztahu: ∆A min aktivita ( µkat ⋅ l -1 ) = ⋅ ředění ε ⋅L ∆Amin … změna absorbance (za minutu) při 340 nm; ε … molární absorpční koeficient (mol-1·l·cm-1); L … délka optické dráhy (cm). Životnost buněk byla počítána podle vztahu: aktivita s Životnost (%) = ⋅ 100 aktivita v aktivitav…aktivita vzorku, aktivitas…aktivita kontroly


49

Produkty peroxidace lipidů Vzorek média (500 µl) byl zahříván (30 min., 90 ºC) se 700 µl roztoku TBA (26 mmol·l-1) – TCA (918 mmol·l-1). Koncentrace TBARS byla stanovena po centrifugaci (10 min., 900×g) měřením absorbance supernatantu při 535 nm (cit.148). Koncentrace TBARS, hodnocených jako malondialdehyd, byla počítána podle vztahu: c ( µmol ⋅ l -1 ) =

A 535nm ⋅ ředění ε ⋅L

A535 … absorbance vzorku při 535 nm; ε … molární absorpční koeficient (mol-1·l·cm-1); L … délka optické dráhy (cm).

4.5 Vliv Vaccinium macrocarpon Ait. na vybrané fyziologické parametry a metabolismus potkana 4.5.1 Průběh experimentu Potkani kmene Wistar (samci, tělesná hmotnost 210 ± 10 g) byli chováni za standardních podmínek v boxech po dvou zvířatech s volným přístupem k potravě a vodě při pokojové teplotě 23 ± 2 °C s 12 hod. cyklem světlo/tma. Po týdenní aklimatizaci byli náhodně rozděleni do 4 skupin po 6 zvířatech. Příprava diety: Na 1 kg diety bylo použito 1,5 g surovin V. macrocarpon Ait. NUTRICRAN®90S, HI-PAC 4.0 a PACRAN® (výsledná koncentrace 1500 ppm), které byly smíchány se standardní dietou (800 g), mikrokrystalickou celulosou (190 g) a stearanem hořečnatým (10 g). Ze směsi byly připraveny granule uchovávané při pokojové teplotě. Skupina 1 (kontrolní) byla krmena standardní laboratorní dietou, skupina 2 dietou obsahující 1500 ppm NUTRICRAN®90S, skupina 3 dietou s 1500 ppm HI-PAC 4.0 a skupina 4 dietou obsahující 1500 ppm PACRAN®. V průběhu experimentu byla sledována spotřeba krmiva a hmotnost zvířat (2× týdně). Obsah anthokyaninů a fenolových kyselin v dietě byl kontrolován metodou LC/MS. Stý den experimentu byla v celkové anestesii [fentanyl (40 µg·kg-1 tělesné hmotnosti), medetomidin (200 µg·kg-1 tělesné hmotnosti), diazepam (5 mg·kg-1 tělesné


50

hmotnosti)] zvířata usmrcena a odebrána krev a orgány. Krev byla odebrána z aortálního rozvětvení do zkumavek s Na2EDTA-NaN3 a do zkumavek naplněných heparinem litným. Část krve ze zkumavek pokrytých Na2EDTA-NaN3 byla použita pro izolaci lymfocytů na stanovení poškození DNA a pro určení krevního obrazu. Zbytek byl centrifugován (10 min., 420×g, 4 °C). Získaná plazma byla rozdělena na alikvoty, uchovávané při -80 °C. Plazma byla použita pro stanovení obsahu anthokyaninů a fenolových kyselin, celkové antioxidační kapacity (TAC), hladiny celkových SH-skupin, produktů pokročilé oxidace proteinů (AOPP) a produktů lipoperoxidačního poškození (TBARS). Erytrocyty byly promyty PBS, rozděleny na alikvoty a zamraženy (-80 °C). Dále byly použity pro stanovení glutathionu (GSH), TBARS, enzymové aktivity glutathionperoxidasy (GPx), glutathiontransferasy (GST), superoxiddismutasy (SOD) a katalasy. Plazma oddělená centrifugací (10 min., 420×g, 4 °C) ze zkumavek plněných heparinem

litným

byla

použita

pro

měření

parametrů

klinické

biochemie

(asparátaminotransferasa - AST, alaninaminotransferasa - ALT, alkalická fosfatasa ALP, cholinesterasa - CHE, sodík, draslík, chloridy, bilirubin, cholesterol, močovina, kreatinin, cholinesterasa, celkové bílkoviny, prealbumin). Játra byla opláchnuta vychlazeným PBS, zvážena a použita pro histologické vyšetření, stanovení TAC, TBARS, SOD, GSH, GPx, GST, GSHred a katalasy, obsahu cytochromů P450 a pro stanovení koncentrace anthokyaninů a fenolových kyselin. Rovněž byly odebrány vzorky tkání (jater, ledviny, střeva a srdce) pro histologickou analýzu. Množství proteinů ve vzorcích bylo stanoveno metodou dle Bradfordové, pokud není uvedeno jinak.

4.5.2 Stanovení obsahu anthokyaninů a fenolových kyselin v dietě a biologických vzorcích Obsah anthokyaninů a fenolových kyselin v dietě, trusu, moči, plazmě a játrech byl stanoven LC/MS analýzou. Limit detekce byl 1,5 µg·ml-1 a limit kvantifikace 10 µg·ml-1.


51

4.5.2.1 Příprava vzorků Dieta, trus a játra (0,25 g) byly homogenizovány mechanickým homogenizátorem ve 2 ml 0,12% TFA v methanolu, vortexovány 1 minutu a centrifugovány 10 minut při 3000×g a 4 ºC. Supernatant (1,5 ml) byl odpařen pod dusíkem při 35 ºC. Moč (0,25 ml) byla smíchána s příslušnou mobilní fází A (0,25 ml), vortexována 1 minutu a centrifugována 10 minut při 13000×g, 4 ºC. Supernatant byl aplikován na LC kolonu (Gemini C18). 4.5.2.2 Stanovení fenolových látek Plazma byla naředěna fosfátovým pufrem (NaH2PO4, 50 mmol·l-1, pH 7,0) v poměru 1:1. Odpařené vzorky diety, trusu a jater byly rozpuštěny ve stejném fosfátovém pufru (1 ml). Roztok byl zfiltrován přes teflonový membránový mikrofiltr (porozita 0,45 µm). Takto připravené vzorky (1 ml) byly naneseny na kondiciovanou (methanol, fosfátový pufr) SPE kolonu (směsný sorbent, Strata Screen A). Kolona byla promyta 3 ml deionizované vody a eluována 3 ml methanolu a 3 ml 1% HCl v methanolu. Oba eluáty byly spojeny a odpařeny pod dusíkem při maximálně 35 ºC. Odparek byl rozpuštěn v 0,25 ml mobilní fáze A a analyzován LC/MS. HPLC analýza byla provedena na kapalinovém chromatografu Shimadzu Class VP stejně jako v kapitole 4.4.2.5. 4.5.2.3 Stanovení anthokyaninů Plazma byla smíchána s 0,01% HCl v poměru 1:1. Odpařené vzorky diety, trusu a jater (4.5.2.1) byly rozpuštěny ve stejném roztoku HCl (1 ml). Roztok byl zfiltrován přes teflonový membránový mikrofiltr (porozita 0,45 µm) a nanesen (0,5 ml) na kondiciovanou (methanol, 0,01% HCl) SPE kolonu (styren-divinylbenzen). Kolona byla promyta 3 ml 0,01% HCl a anthokyaniny eluovány 3 ml 0,01% HCl v methanolu. Eluát byl odpařen pod dusíkem při maximálně 35 ºC a odparek rozpuštěn v 0,25 ml mobilní fáze A (0,12% TFA a 5% acetonitril) a analyzován LC/MS. HPLC analýza byla provedena na kapalinovém chromatografu Shimadzu Class VP stejně jako v kapitole 4.4.2.6.


52

4.5.3 Stanovení parametrů klinické biochemie a hematologie Biochemické parametry krevní plazmy (sodík, draslík, chloridy, bilirubin, močovina, cholesterol, kreatinin, glomelurální filtrace, ALT, AST, ALP, CHE) a hematologické parametry krve (hemoglobin, hematokrit, erytrocyty, střední objem erytrocytů, trombocyty, leukocyty a diferenciální počet leukocytů) byly stanoveny na analyzátoru Ilab 600 (Instrumentation Laboratory, Španělsko) na Oddělení laboratorní medicíny v Nemocnici Šternberk.

4.5.4 Stanovení parametrů oxidačního stresu 4.5.4.1 Příprava vzorků Játra – po rozmražení byl připraven 10% a 1% homogenát ve vychlazeném PBS. Erytrocyty – před stanovením byl připraven 10% a 1% lyzát v PBS. Plazma byla použita ke stanovení přímo. 4.5.4.2 Stanovení produktů lipoperoxidačního poškození Princip stanovení viz kapitola 4.4.6.3. 100 µl plazmy / 500 µl 10% jaterního homogenátu / 200 µl 10% lyzátu erytrocytů bylo smícháno s 1000 µl směsi TBA - TCA a zahřáto (30 min., 90 °C). Po ochlazení a centrifugaci (6740×g, 10 min., 4 °C) byla měřena absorbance. Množství produktů lipoperoxidačního poškození (TBARS) vztažené na malondialdehyd bylo vypočítáno podle vztahu: Koncentrace TBARS (nmol·g-1) =

koeficient

MDA

(mol-1·l·cm-1);

ε ⋅ L⋅c

⋅ ředění

nepovařeného vzorku; ε … molární

Aa … absorbance vzorku; Ab … absorbance absorpční

( Aa − Ab )

L

c … koncentrace proteinů nebo hemoglobinu (g·l-1).

…

délka

optické

dráhy

(cm);


53

4.5.4.3 Stanovení glutathionu (GSH) Množství GSH bylo stanoveno na základě reakce s 5,5´-dithio-bis(benzoovou) kyselinou (DTNB) v alkalickém prostředí na 5-thio-2-nitrobenzoát (TNB). Absorbance produktu byla měřena při 412 nm (cit.159). 400 µl 10% lyzátu erytrocytů / 400 µl 10% jaterního homogenátu bylo přidáno ke 100 µl 25% TCA, promícháno na vortexu a centrifugováno (15 min., 4120×g, 4 °C). Ke 20 µl supernatantu/ 5% TCA (slepý vzorek) bylo přidáno 200 µl pracovního roztoku a reakce nastartovaná přídavkem 10 µl DTNB. Po 4 min. byla změřena absorbance. Množství GSH bylo vypočítáno podle vztahu: Koncentrace GSH (mmol·g-1) =

( Aa − Ab ) ε ⋅ L⋅c

⋅ ředění

Aa … absorbance vzorku; Ab … absorbance slepého vzorku; ε … molární absorpční koeficient (mol-1·l·cm-1); L … délka optické dráhy (cm); c … koncentrace proteinů nebo hemoglobinu (g·l-1). 4.5.4.4 Stanovení koncentrace SH-skupin Hladina SH-skupin byla stanovena dle Hu160. Metoda využívá stejný princip jako stanovení GSH (viz kapitola 4.5.4.3). 100 µl plazmy bylo smícháno s 300 µl GSH pufru, 20 µl DTNB (4 mg·ml-1), 1580 µl methanolu a vše bylo promícháno na vortexu. Po inkubaci (20 min., 4 °C) byl vzorek centrifugován (10 min., 610×g, 4 °C) a absorbance změřena při 412 nm. Koncentrace celkových SH-skupin byla vypočítána podle vztahu: ( A − Aa − Ab ) Koncentrace SH-skupin (µmol·g-1) = vz ⋅ ředění ε ⋅L⋅c Avz … absorbance vzorku; Aa … absorbance vzorku obsahujícího vše kromě DTNB; Ab … absorbance vzorku obsahujícího vše kromě plazmy; ε … molární absorpční koeficient (mol-1·l·cm-1); L … délka optické dráhy (cm); c … koncentrace proteinů (g·l-1).


54

4.5.4.5 Stanovení aktivity superoxiddismutasy (SOD) Aktivita SOD byla stanovena nepřímo v systému NBT/NADPH/PMS. Reakční směs produkuje superoxidový anion, který reaguje s tetrazoliovou solí. Absorbance produktu byla měřena při 560 nm (cit.161). Extrakce jaterního homogenátu: Ke 30 mg KH2PO4, 250 µl chloroformu a 900 µl vody bylo přidáno 100 µl homogenátu. Směs byla vortexována a centrifugována (30 min., 1080×g, 4 °C). Slepý extrakt obsahoval místo biologického vzorku 100 µl PBS. Po extrakci byly vzorky 10× ředěny. Ke 25 µl extraktu/ 1% lyzátu erytrocytů bylo přidáno 200 µl roztoku pro stanovení superoxiddismutasy v pufru. Reakce byla spuštěna přídavkem 25 µl PMS (33 µmol·l-1). Po 5 min. byla měřena absorbance. Aktivita SOD byla vypočítána podle vztahu: Aktivita SOD (U·g-1) =

( Aa − Ab ) − ( Avz − Ab ) ⋅ ředění ( Aa − Ab ) ⋅ ε ⋅ L ⋅ c

Avz … absorbance vzorku; Aa … absorbance slepého vzorku (25 µl slepého extraktu a 200 µl směsi NBT s NADH); Ab … absorbance pozadí (250 µl SOD pufru); ε … molární absorpční koeficient (mol-1·l·cm-1); L … délka optické dráhy (cm); c … koncentrace proteinů nebo hemoglobinu (g·l-1). 4.5.4.6 Stanovení aktivity glutathionperoxidasy (GPx) Ke stanovení

aktivity

GPx

byl

použit

systém

GSH/glutathionreduktasa/

NADPH/kumenhydroperoxid. V reakci katalyzované GPx je GSH oxidován a vznikající GSSG je zpětně redukován glutathionreduktasou za spotřeby NADPH, jehož pokles je měřen při 340 nm (cit.162). Ke 20 µl 1% lyzátu erytrocytů / 1% jaterního homogenátu bylo přidáno 200 µl roztoku pro stanovení GPx. Po inkubaci (5 min., 37 °C) bylo přidáno 10 µl kumenhydroperoxidu a měřena změna absorbance za 1 min. Aktivita GPx byla vypočítána podle vztahu:


55

 ∆Amin  Aktivita GPx (mol·l-1·min-1·g-1) =   ⋅ ředění ε ⋅ L⋅c  ∆Amin … změna absorbance (za minutu) při 340 nm; ε … molární absorpční koeficient (mol-1·l·cm-1); L … délka optické dráhy (cm); c … koncentrace proteinů nebo hemoglobinu (g·l-1). 4.5.4.7 Stanovení aktivity katalasy Ke stanovení aktivity katalasy byl použit systém obsahující peroxid vodíku. V reakci katalyzované katalasou je peroxid přeměněn na vodu a jeho úbytek je měřen při 240 nm (cit.163). 40 µl 1% lyzátu erytrocytů / 1% jaterního homogenátu bylo smícháno s 1960 µl pufru. Reakce byla nastartována 0,5 ml peroxidu vodíku (0,03 mol·l-1) a změna absorbance měřena při 240 nm po dobu 30 sekund. Aktivita katalasy byla vypočítána podle vztahu:  ∆Amin  Aktivita katalasy (mol·l-1·min-1·g-1) =   ⋅ ředění ε ⋅ L⋅c  ∆Amin … změna absorbance (za minutu) při 240 nm; ε … molární absorpční koeficient (mol-1·l·cm-1); L … délka optické dráhy (cm); c … koncentrace proteinů nebo hemoglobinu (g·l-1).

4.5.4.8 Stanovení aktivity glutathionreduktasy (GSHred) Ke stanovení aktivity GSHred byl použit systém GSSG/NADPH/GSHred. Při reakci dochází ke spotřebě NADPH přímo úměrné obsahu GSHred, který je měřen fotometricky při 340 nm (cit.164). Ke 5 µl 10% homogenátu jater bylo přidáno 175 µl GSH pufru, 10 µl GSSG (20 mmol·l-1 v deionizované vodě). Reakce byla nastartovaná přídavkem 10 µl NADPH (2 mmol·l-1 v roztoku pro stanovení GSHred) a změna absorbance za 1 min. měřena při 340 nm. Aktivita GSHred byla vypočítána podle vztahu:  ∆Amin  Aktivita glutathionreduktasy (µkat·l-1) =   ⋅ ředění ε ⋅ L⋅c  ∆Amin … změna absorbance (za minutu) při 340 nm; ε … molární absorpční koeficient (mol-1·l·cm-1); L … délka optické dráhy (cm); c … koncentrace proteinů (g·l-1).


56

4.5.4.9 Stanovení aktivity glutathiontransferasy (GST) Ke stanovení aktivity GST byl použit systém CDNB/GSH/GST. Při reakci vzniká konjugát CDNB s glutathionem. Jednotka enzymové aktivity je definovaná jako množství enzymu, které katalyzuje tvorbu 1 µmol S-2,4-dinitrofenylglutathionu za minutu165,166. K 10 µl erytrocytů (10% lyzátu) bylo přidáno 170 µl pufru a 10 µl GSH (20 mmol·l-1 v deionizované vodě). Reakce byla spuštěna přídavkem 10 µl CDNB (20 mmol·l-1 v 95% ethanolu) a ihned měřena změna absorbance při 340 nm. Aktivita glutathiontransferasy byla vypočítána podle vztahu:  ∆Amin  Aktivita glutathiontransferasy (µkat·l-1) =   ⋅ ředění ε ⋅ L⋅c  ∆Amin … změna absorbance (za minutu) při 340 nm; ε … molární absorpční koeficient (mol-1·l·cm-1); L … délka optické dráhy (cm); c … koncentrace proteinů nebo hemoglobinu (g·l-1). 4.5.4.10 Stanovení hladiny produktů pokročilé oxidace proteinů (AOPP) Metoda je založena na schopnosti oxidačních produktů proteinů absorbovat při 340 nm v prostředí jodidu draselného167. Pro sestrojení kalibrační přímky je používán roztok chloraminu-T . Ke 200 µl chloraminu-T (0, 1, 2, 5, 10 a 20 µmol·l-1), ředěné plazmy v PBS (1:5) bylo přidáno 10 µl KI (1,16 mol·l-1) a 20 µl ledové octové kyseliny. Ihned byla měřena absorbance při 340 nm. Koncentrace AOPP byla odečtena z kalibrační křivky. 4.5.4.11 Stanovení celkové antioxidační kapacity (TAC) Antioxidační kapacita byla stanovena v plazmě (ředěna 1:1, 50 mmol·l-1 fosfátovým pufrem, pH 7,4) a 10% jaterním homogenátu cyklickou voltametrií168. Při této metodě se na pracovní elektrodu vkládá potenciálový puls s určitou rychlostí polarizace a současně se sledují proudové odezvy v roztoku vzorku. Redukční schopnost látky se vyhodnocuje ze získaného záznamu - cyklického voltamogramu. Z jeho křivky je možné odečíst hodnotu půlvlnového anodického potenciálu oxidačního píku Ea/2 a odpovídající hodnotu anodického proudu Ia. Čím je hodnota Ea/2 menší, tím snadněji látka odevzdává elektrony a může být lepším redukčním činidlem.


57

Měření bylo provedeno s použitím Potenciostatu / Galvanostatu Model 273 v rozmezí od -0,2 do 1,0 V; rychlosti 100 mV·s-1 při pokojové teplotě. Pracovní elektroda byla před každým měřením leštěna 0,05 µm oxidem křemičitým. Ze získaných voltamogramů byl odečten Ea/2 charakterizující oxido-redukční vlastnosti látek (typ) a Ia charakterizující množství těchto látek. 4.5.4.12 Stanovení koncentrace hemoglobinu Metoda

je

založena

na

reakci

hemoglobinu

s kyanidem

za

vzniku

kyanomethemoglobinu, jehož koncentrace je přímo úměrná koncentraci hemoglobinu a měří se spektrofotometricky při 540 nm (cit.169). K 10 µl erytrocytů (1% a 10% lyzátu) bylo přidáno 200 µl pracovního roztoku a po 10 min. byla změřena absorbance při 540 nm. Množství hemoglobinu bylo vypočítáno podle vztahu: Koncentrace hemoglobinu (mmol·l-1) =

( Aa − Ab ) ε ⋅L

⋅ ředění

Aa … absorbance vzorku; Ab … absorbance slepého vzorku (PBS); ε … molární absorpční koeficient (mol-1·l·cm-1); L … délka optické dráhy (cm). 4.5.4.13 Stanovení SOD, GPx, GSHred a aktinu elektroforesou Proteiny

jsou

rozděleny

elektroforesou

v polyakrylamidovém

gelu

s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE), přeneseny na membránu a detekovány pomocí specifických protilátek. Po změření koncentrace proteinů byly vzorky supernatantu z jaterních homogenátů (25%) naředěny 5× vzorkovým pufrem a denaturovány povařením (5 min., 95 °C). V aparatuře pro elektroforézu byl připraven 10% (GPx, GSHred) a/nebo 15% (SOD) separační a 10% zaostřovací polyakrylamidový gel o tloušťce 1,5 mm. Do jamek zaostřovacího gelu byly aplikovány vzorky s obsahem 50 µg proteinu. Elektroforéza byla provedena v migračním pufru při proudu 15 mA. Po dosažení separačního gelu byla hodnota proudu zvýšena na 30 mA. Po rozdělení proteinů následoval jejich přenos („western blotting“) na polyvinylidendifluoridovou (PVDF) membránu v tankovém uspořádání v přenosovém pufru (60 min., 400 mA, 4 °C).


58

Po ukončení přenosu byla membrána 3× promyta (5 min., TBS) pro odstranění přenosového pufru, blokována (2 hod., TBS/T/mléko, pokojová teplota) a inkubována s primární králičí protilátkou (SOD1, SOD2, GPx a GSHred - rabbit polyklonal IgG, TBS/T/mléko, 1:500) při 8 °C přes noc. Po inkubaci byla membrána promyta (3× 5 min., TBS/T) a inkubována se sekundární kozí (SOD1, SOD2, GPx a GSHred; goat anti-rabbit IgG-HRP, TBS/T/mléko, 1:10000, 2 hod., pokojová teplota) protilátkou značenou křenovou peroxidasou. Po promytí (3× 5 min., TBS/T) byla membrána detekována kitem pro western blot (western blotting luminol reagent) a vzniklá chemiluminiscence zaznamenána na fotografický film. Stanovení aktinu Po stanovení specifických proteinů byla membrána zbavena navázaných protilátek aplikací „stripping“ pufru (60 °C; 30 min.), promyta deionizovanou vodou, blokována (1 hod., TBS/T/mléko, pokojová teplota) a inkubována s primární kozí protilátkou (actin I-19; goat polyclonal antibody, TBS/T/BSA, 1:500, 8 °C) přes noc. Po promytí (3×, 5 min., TBS/T) následovala inkubace se sekundární králičí protilátkou značenou křenovou peroxidasou (rabbit anti-goat IgG-HRP, TBS/T/mléko, 1:10000, 2 hod., pokojová teplota), promytí (3×, 5 min., TBS/T) a detekce. Vzniklá chemiluminiscence byla zaznamenána na fotografický film.

4.5.5 Stanovení koncentrace cytochromu P450 Cytochrom P450 v komplexu s oxidem uhelnatým poskytuje charakteristické absorpční spektrum s maximem při 450 nm (cit.170). Jaterní mikrosomy byly izolovány dle postupu popsaného v kapitole 4.4.4. K získanému sedimentu mikrosomů byl přidán promývací pufr, směs jemně zhomogenizována ručním homogenizátorem (Potter Elvehjemův homogenizátor) a centrifugována (90 min., 82600×g, 4 °C). Pelet byl rozmíchán v promývacím pufru (1 g původní tkáně; 0,2 ml pufru), rozdělen na alikvoty a zamrazen (-80 °C). Ve vzorcích byla stanovena koncentrace proteinů s použitím kyseliny bicinchoninové171.


59

Koncentrace cytochromu P450 Vzorky mikrosomů byly 50× naředěny (40 µl mikrosomů a 1960 µl pufru), přidáno 30 mg Na2S2O4 a směs promíchána. Roztok byl přepipetován do dvou kyvet, jedna z nich nasycena CO a absorbance změřena při 450 a 500 nm. Množství cytochromu P450 bylo vypočítáno podle vztahu: Koncentrace cytochromu P450 (µmol·g-1) =

A450 − A500 ⋅ ředění ε ⋅L⋅c

A450 … absorbance při 450 nm; A500 … absorbance při 500 nm; ε … molární absorpční koeficient (mol-1·l·cm-1); L … délka optické dráhy (cm); c … koncentrace proteinů (g·l-1). Stanovení cytochromu P450 1A1/2 Exprese

proteinu

cytochromu

P450

1A1/2

byla

stanovena

SDS-PAGE

elektroforézou, western blot analýzou a chemiluminiscenční detekcí. Vzorky mikrosomů byly naředěny 5× vzorkovým pufrem a denaturovány povařením (5 min., 95 °C). Zpracování vzorků a analýza byly provedeny podle postupu uvedeného v kapitole 4.5.4.13 s následujícími rozdíly: primární kozí protilátka (CYP1A1 G-18; goat polyclonal IgG, TBS/T/BSA (1:500), sekundární králičí protilátka značená křenovou peroxidasou (rabbit anti-goat IgG HRP, TBS/T/mléko, 1:10000.

4.5.6 Histologická analýza Tkáňové vzorky jater, ledviny, srdce a střeva byly po odběru fixovány v Bakerově směsi (10% formaldehyd, 35 mmol·l-1 CaCl2 ve vodě), odvodněny a zality do parafinu. Poté byly nakrájeny na 7 µm silné řezy na rotačním mikrotomu. Pro znázornění buněčných struktur bylo použito barvení hematoxylinem - eosinem, Alcianovou modří a reakcí PAS. Preparáty byly vyhodnoceny s použitím světelného mikroskopu Olympus BX 40. Morfologická analýza byla provedena na Ústavu histologie LF UP.

4.5.7 Stanovení poškození DNA (Comet assay) Metoda Comet assay je založena na sledování poškozené DNA v jednotlivých buňkách. Buňky jsou zality do tenké vrstvy agarosy a podrobeny lýze a elektroforéze.


60

Jednovláknové zlomy DNA se projeví změnou tvaru jádra za vzniku útvarů připomínajících

kometky,

které

jsou

sledovány

mikroskopicky

po

obarvení

fluorescenčním barvivem172. Stanovení jednovláknových zlomů DNA metodou Comet assay bylo provedeno v izolovaných lymfocytech. Příprava sklíček Mikroskopická sklíčka (76×26 mm) byla vyvařena v 6% peroxidu vodíku (30 min.), důkladně promyta v deionizované vodě a usušena. Poté byla potažena z jedné strany 1% agarosou, usušena volně na vzduchu a následně v sušárně (60 °C; 30 min.). Před pokusem bylo na potažené sklíčko aplikováno 85 µl vysokotuhnoucí agarózy (1%) a přikryto krycím sklíčkem. Po ztuhnutí agarózy (15 min.; 4 °C) bylo krycí sklíčko sejmuto. Izolace lymfocytů Ke 30 µl krve byl přidán 1 ml 10% FCS v PBS, vzorek byl promíchán a inkubován 30 min. na ledě. Po inkubaci byla směs podvrstvena 100 µl Histopaku 1077 a centrifugována (3 min., 200×g, 4 °C). Po centrifugaci byly lymfocyty (střední bílá vrstva mezi PBS a Histopakem) přepipetovány do 1 ml 10% FCS v PBS a opět centrifugovány (3 min., 200×g, 4 °C). Pelet byl odsát do sucha, resuspendován v 50 µl 10% FCS v PBS a přidán k 85 µl 1% nízkotuhnoucí agarosy vytemperované na 37 °C. Příprava buněčných preparátů 85 µl směsi obsahující asi 2·104 buněk bylo přeneseno na vrstvu vysokotuhnoucí agarosy, překryto krycím sklíčkem a ochlazeno na 4 °C (5 minut). Po zatuhnutí agarosy bylo krycí sklíčko sejmuto, podložní sklíčka s buňkami zafixovanými v gelu přenesena do vychlazeného lyzačního pufru (1 hod., 4 °C) a následně do elektroforetického pufru (40 min., 4 °C), aby došlo k rozvolnění šroubovice DNA. Poté byla provedena elektroforetická separace DNA (20 min., 20 V, 4 °C), sklíčka 3× promyta neutralizačním pufrem (5 min.) a usušena. S buňkami bylo pracováno při červeném osvětlení. Vyhodnocení SYBR®Green (20 µl, 10000×) byl aplikován na plochy agarosy s buňkami. Poškození DNA (vzniklé „kometky“) bylo pozorováno mikroskopicky s využitím fluorescenčního mikroskopu Olympus IX 70 a programu Olympus MicroImage. Poškození bylo vyhodnoceno na 100 jádrech/sklíčko. Buňky byly vizuálně rozděleny do skupin od


61

0 (nepoškozené) do 4 (úplně poškozené), viz obr. 13. Každá „kometka“ byla zařazena do skupiny podle uvedené klasifikace. Celkové poškození bylo v rozmezí od 0-400 arbitrárních jednotek. Ke kvantifikaci byl použit následující vztah173: Celkové poškození =

(N 0 ⋅ 0 + N1 ⋅ 1 + N 2 ⋅ 2 + N 3 ⋅ 3 + N 4 ⋅ 4) N 0 + N1 + N 2 + N 3 + N 4

⋅ 100

N0, N1, N2, N3, a N4 … množství buněk ve skupinách od 0 do 4

Obr. 13. Příklady poškozené buněčné DNA pro vizuální hodnocení poškozené DNA.

4.6 Stanovení koncentrace proteinů 4.6.1 Metoda kyseliny bicinchoninové Metoda je založena na alkalické redukci Cu2+ proteinem na Cu+ a následné chelataci Cu+ kyselinou bicinchoninovou, měřené při 562 nm (cit.171). Ke 25 µl standardu / vzorku v jamce mikrotitrační desky bylo přidáno 200 µl pracovního roztoku (BCATM protein assay kit), promícháno (30 s) a inkubováno (30 min., 37 °C). Po inkubaci byla deska ochlazena na pokojovou teplotu a měřena absorbance.


62

4.6.2 Metoda dle Lowryho Atomy dusíku peptidové vazby reagují s Cu2+ v alkalickém prostředí za vzniku Cu+ iontů, které redukují Folin-Ciocalteauovo činidlo za vzniku produktu, jehož množství je měřeno při 680 nm (cit.151). Ke 20 µl standardu / vzorku bylo přidáno 100 µl pracovního roztoku a inkubováno (10 min.). Poté bylo přidáno 10 µl Folin-Ciocalteauova činidla (ředěno 1:1 vodou) a po 30 min. inkubace ve tmě byla měřena absorbance.

4.6.3 Metoda dle Bradfordové Stanovení je založeno na tvorbě komplexu mezi barvivem (Coomassie Brilliant Blue G-250) a proteiny ve vzorku. Barvivo se vyskytuje ve třech formách: kation (470 nm), neutrální molekula (650 nm) a anion (595 nm). Vazba proteinu stabilizuje aniontovou formu a vyvolává změnu zbarvení, která je změřena při 595 nm (cit.152). K 10 µl standardu / vzorku bylo přidáno 100 µl pracovního roztoku a po promíchání byla měřena absorbance. Hodnota byla odečtena z kalibračního grafu.

VÝSLEDKY

63

5. VÝSLEDKY 5.1 Obsahové látky a biologická aktivita L. caerulea L. 5.1.1 Nutriční složky, minerály, vitaminy a kontaminanty V plodech L. caerulea L. vypěstovaných v ČR byly stanoveny základní nutriční složky, minerály, vitaminy a kontaminanty (tab. IV). Pro srovnání jsou v tabulce uvedeny naměřené hodnoty u této plodiny pěstované v témže roce v Číně. Tabulka IV. Základní nutriční složky, minerály, vitaminy a mikroorganismy v lyofilizovaných plodech L. caerulea L. Základní nutriční složky

L. caerulea (ČR)

L. caerulea (Čína)

Metoda

1350

1360

Vyhláška 293/1997 Sb.

Bílkoviny (%)

7,7

7,3

Kjeldahl x 6,25

Lipidy (%)

7,5

9,4

ČSN 588786

Nenasycené mastné kyseliny (%)

4,89

6,15

GC/FID

Nasycené mastné kyseliny (%)

0,28

0,32

GC/FID

55,1

52,4

HPLC

Fruktosa (%)

20,6

14,1

HPLC/RID

Glukosa (%)

18,8

12,2

HPLC/RID

Vláknina (%)

16,0

21,7

Ewers

Vlhkost (%)

9,8

5,4

Gravimetrie

Popel (%)

3,89

3,84

Gravimetrie

-1

Energetická hodnota (kJ·100g )

Cukry (%)

Minerály a kontaminanty Sodík (mg·kg-1)

130

19,1

AAS

-1

12500

10800

AAS

-1

Hořčík (mg·kg )

690

1440

AAS

-1

9,67

68,3

AAS

<0,000800

0,0161

AAS

1730

2610

AAS

Zinek (mg·kg )

11,4

35,3

AAS

-1

29,0

121

AAS

-1

Draslík (mg·kg )

Mangan (mg·kg ) Selen (mg·kg-1) -1

Vápník (mg·kg ) -1

Železo (mg·kg ) Fosfor (mg·kg )

2550

3060

Fotometrie

-1

7,41

9,67

AAS

-1

Rtuť (mg·kg )

0,004

0,003

AMA

-1

Arsen (mg·kg )

0,032

0,041

AAS

Kadmium (mg·kg-1)

0,0565

0,0506

AAS

0,146

0,219

AAS

Měď (mg·kg )

-1

Olovo (mg·kg )

VÝSLEDKY

64

Vitaminy

L. caerulea (ČR)

L. caerulea (Čína)

Metoda

<0,10

<0,10

HPLC/FLD

3,53

2,11

HPLC/FLD

2,63

1,98

HPLC/FLD

70,4

31,4

ELISA

B6 – Pyridoxin (mg·kg )

2,00

1,59

HPLC/FLD

B12 – Kobalamin (mg·kg-1)

1,10

0,98

ELISA

1300

486

HPLC/DAD

58,8

59,0

HPLC/FLD

K1 – Fylochinon (mg·kg )

5,80

4,21

HPLC/FLD

β-Karoten (mg·kg-1)

17,2

12,3

HPLC/VIS

50

950

MB rozbor

Clostridium perfringens (CFU·g )

<10

<10

MB rozbor

Escherichia coli (CFU·g-1)

<10

<10

MB rozbor

<10

10

MB rozbor

190

120

MB rozbor

22

90

MB rozbor

-1

A – Retinol (mg·kg ) -1

B1 – Thiamin (mg·kg ) -1

B2 – Riboflavin (mg·kg ) -1

B5 – Pantotenová kyselina (mg·kg ) -1

-1

Vitamin C (mg·kg ) -1

α-Tokoferol (mg·kg ) -1

Mikroorganismy Bacillus cereus (CFU·g-1) -1

-1

Kvasinky (CFU·g ) -1

Plísně (CFU·g ) -1

Celkový počet MO (CFU·g )

AMA - analyzátor stopových množství rtuti, MB - mikrobiologie, CFU - kolonie tvořící jednotky (colony forming units).

5.1.2 Cukry V lyofilizovaných (tab. IV) a čerstvých plodech L. caerulea L. byla stanovena koncentrace cukrů. V čerstvých plodech bylo HPLC analýzou prokázáno 7,2 % cukrů, z toho ve volné formě glukosa (3,2 %) a fruktosa (2,9 %) a ve vázané glukosa (0,8 %), galaktosa (0,2 %) a arabinosa (0,1 %).

5.1.3 Lipidy Podíl lipidů v čerstvých plodech byl 1,52 % hmotnosti (tab. V). Nezmýdelnitelný podíl, tj. steroly, alkoholy a uhlovodíky, představoval 0,46 % hmotnosti plodů. Převládal α a β-amyrin (tab. V). Mastné kyseliny tvořily 0,89 % hmotnosti plodů, s největším zastoupením palmitové kyseliny (obr. 14, tab. VI).

VÝSLEDKY

65 Tabulka V. Obsah lipidů v plodech L. caerulea L.

Lipidy

Rel. %

Nezmýdelnitelný podíl

Rel. %

Uhlovodíky+vosky+steroly

32

α-Amyrin

29,6

Triacylglyceroly

27

β-Amyrin

24,7

Fosfatidylcholin

21

Stigmasterol

14,8

Volné mastné kyseliny

7

Ursolová kyselina

11,5

Fosfatidová kys., fosfatidylserin

6

Triterpeny

5,3

Digalaktosyldiglycerol

4

Sitosterol

4,9

Fosfatidylethanolamin

3

∆7-Stigmasterol

3,3

Oleanová kyselina

3,3

Campesterol

2,0

Brassicasterol

0,6

Tabulka VI. Obsah mastných kyselin v plodech L. caerulea L. Kyselina

Rel. %

Palmitová

38,2

Olejová

27,6

Stearová

14,7

Myristová

9,2

Linolová

5,9

Palmitolejová

2,8

Laurová

1,6

Obr. 14. Analýza mastných kyselin GC-HP 6869. Kapilára SPB-35, teplotní program od 50 ºC, gradient 15 ºC/min, výsledná teplota 300 ºC, konstantní průtok He 1,2 ml/min.

5.1.4 Organické kyseliny Organické kyseliny (12,2 % sušiny) byly v čerstvých plodech reprezentovány malonovou, chininovou, jablečnou a citronovou kyselinou. Ve fenolové frakci se nacházela pouze citronová a jablečná kyselina (tab. VII). Tabulka VII. Obsah organických kyselin L. caerulea L. Kyselina

Celý plod (mg·g-1)

Fenolová frakce (mg·g-1)

Malonová

38,12 ± 0,53

Chininová

151,57 ± 0,81

39,84 ± 0,54

Citronová

88,45 ± 0,42

62,90 ± 0,62

Jablečná

24,64 ± 0,65

VÝSLEDKY

66

5.1.5 Fenolové látky Fenolové kyseliny Čestvé plody L. caerulea L. obsahovaly 0,025 % fenolových kyselin. Mezi nimi převládala chlorogenová (0,018 %), gentisová (0,005 %), protokatechová, ferulová, kávová a kumarová kyselina (tab. VIII). Ve fenolové frakci byla stanovena chlorogenová (0,42 % fenolové frakce), kávová (0,14 %) a ferulová (0,10 %) kyselina. Protokatechová, gentisová, rozmarýnová a vanilová kyselina tvořily dohromady pouze 0,08 % frakce. Tabulka VIII. Obsah fenolových kyselin v plodech L. caerulea L. Kyselina

Rel. %

Protokatechová

1,54

Gentisová

20,53

Vanilová

-

Rozmarýnová

-

Elagová

2,62

Ferulová

1,02

Kávová

3,21

Chlorogenová

71,02

Kumarová

0,05

Anthokyaniny Vysokoúčinná chromatografie na tenké vrtsvě (HPTLC) Kvalitativní

analýza

fenolových

látek

byla

provedena

vysokoúčinnou

chromatografií na tenké vrstvě (HPTLC; obr. 15). Srovnáním se standardy byl potvrzen nejvyšší obsah anthokyaninů (především kyanidin-3-glukosidu) ve fenolové frakci, připravené extrakcí kyselinou fosforečnou. Pro srovnání jsou uvedeny i sušené šťávy a celý lyofilizovaný plod Vaccinium macrocarpon Ait. použité při studiu biologické aktivity in vivo.

VÝSLEDKY

67

Obr. 15. Srovnání různých typů zpracování L. caerulea L. a V. macrocarpon Ait. Kya … kyanidin-3-glukosid, Peo … peonidin-3-glukosid, Pela … pelargonidin-3-glukosid, koncentrace standardů 0,4 mg·ml-1, naneseno 5 µl; 1 … celý lyofilizovaný plod, 2 … fenolová frakce L. caerulea, 3 … frakce 8/1, 4 … frakce 8/2, 5 … frakce 10/1, 6 … frakce 10/2, 7 … frakce 12/1, 8 … HI-PAC 4.0, 9 … NUTRICRAN®90S, 10 … PACRAN®, koncentrace všech vzorků 4 mg·ml-1 methanolu, naneseno 10 µl. Mobilní fáze A: HCl/CH3COOH/H2O, 3:15:82; Mobilní fáze B: H2O/CH3COOH, 4:6.

Metoda LC/MS Metodou LC/MS (obr. 16, tab. IX) byl stanoven obsah anthokyaninů v celém plodu a fenolové frakci. Dominantním anthokyaninem byl kyanidin-3-glukosid, což potvrzuje kvalitativní analýzu chromatografií na tenké vrstvě. Obsah anthokyaninů a jejich poměrné zastoupení se mezi frakcí a celým plodem mírně lišilo, což může být způsobeno technologickým postupem zpracování plodů. Čerstvé plody obsahovaly 0,31 % anthokyaninů, z čehož 83,3 % zaujímal kyanidin-3-glukosid, následovaly deriváty kyanidinu, peonidinu, pelargonidinu, delfinidinu a petunidinu. Získané kolizní spektrum monoglykosidů anthokyaninů bylo jednoduché s převládajícím signálem aglykonových forem. Hlavním dějem během fragmentace bylo odštěpení dehydratovaných sacharidů od anthokyaninů substituovaných dvěma hexosami (∆m/z 162) a rutinosami (∆m/z 162 + 146 = 308), což mělo za následek vznik monoglykosidů či aglykonů. Fenolová frakce (0,4 % čerstvých plodů) obsahovala 77 % anthokyaninů a kyanidin-3-glukosid v ní zaujímal 60 %.

VÝSLEDKY

68

Obr. 16. LC/MS analýza anthokyaninů L. caerulea L. A … kyanidin-3-glukosid, B … peonidin-3-glukosid, C … delfinidin-3-glukosid, D … pelargonidin-3glukosid, E … peonidin-3,5-dihexosid, F … delfinidin-3,5-dihexosid, G … izotop píku peonidin-3,5dihexosidu, H … peonidin-3-rutinosid, I … kyanidin-3,5-dihexosid, J … delfinidin-3-rutinosid, K … pelargonidin-3,5-dihexosid, L … kyanidin-3-rutinosid, M … pelargonidin-3-rutinosid. Mobilní fáze A: 0,12% TFA/5% acetonitril ve vodě, mobilní fáze B: 0,12% TFA v acetonitrilu; gradientová eluce 0-30min. 10-90% B, 35-40 min. 90% B; kolona Gemini C18 (Phenomenex, USA).

Tabulka IX. Obsah anthokyaninů v plodech a fenolové frakci L. caerulea L. Anthokyanin

Celý plod (rel. %)

Fenolová frakce (rel. %)

Kyanidin-3-glukosid

83,3

60,0


1,9

9,9


3,3

7,3

Delfinidin-3-arabinosid-hexosid

0,3

0,0

Delfinidin-3-glukosid

2,1

1,2

Delfinidin-3-rutinosid

1,2

2,0


0,6

3,3

Pelargonidin-3,5-diglukosid

0,5

0,6

Pelargonidin-3-rutinosid

0,1

0,1

Peonidin-3-glukosid

5,9

5,8

Peonidin-3,5-diglukosid

0,4

8,1


0,4

0,5

Petunidin-3-glukosid

0,1

0,0

VÝSLEDKY

69

Další fenolové látky V celých plodech zimolezu modrého byl nalezen kvercetin (0,004 %), rutin (0,006 %), katechin a epikatechin (0,003 %). Fenolová frakce obsahovala 0,1 % kvercetinu, 0,06 % jeho -3-glykosidu a 0,75 % -3-rutinosidu. Byla nalezena i stopová množství epikatechinu a apigeninu.

5.2 Antioxidační aktivita fenolové frakce L. caerulea L. 5.2.1 Stanovení redukční kapacity Redukční kapacita fenolové frakce byla stanovena reakcí s Folin-Ciocalteauovým činidlem a dosahovala hodnoty 335 ± 15 µg ekvivalentů galové kyseliny·mg-1, což je rovno 1405 mg·kg-1 váhy čerstvých plodů.

5.2.2 Zhášení DPPH radikálu K určení antiradikálové aktivity fenolové frakce byla použita metoda zhášení DPPH radikálu (obr. 17). Výsledek byl vyjádřen jako koncentrace testované látky, která způsobila 50% pokles absorbance reakční směsi při vlnové délce 517 nm (IC50). Tato hodnota byla 4,4 ± 0,5 µg·ml-1. 0,30

Absorbance

0,25

0,20

0,15

0,10

0,05

0,00 0

5

10

15

20

25 -1

Koncentrace fenolové frakce (µg·ml )

Obr. 17. Zhášení DPPH radikálu fenolovou frakcí.

30

VÝSLEDKY

70

5.2.3 Interakce se superoxidovým radikálem Schopnost zhášet superoxidový radikál byla ověřena na modelu tvorby O 2

•−

systémem NADH/PMS. Fenolová frakce zhášela superoxidový radikál úměrně koncentraci s hodnotou IC50 115,3 ± 11,4 µg·ml-1.

5.2.4 Inhibice lipoperoxidace Antioxidační účinek frakce byl ověřen na modelu inhibice lipoperoxidačního poškození jaterních subcelulárních membrán, indukovaným tBH. Fenolová frakce (0-250 µg·ml-1) byla schopna inhibovat lipoperoxidaci v použitém experimentálním modelu (obr. 18). Úplné (100 %) inhibice lipoperoxidace bylo dosaženo při hodnotách nad 500 µg·ml-1. Hodnota IC50 byla 160 ± 20 µg·ml-1. 100

Inhibice (%)

75

50

25

0 0

50

100

150

200

250

300

-1

Koncentrace fenolové frakce (µg·ml )

Obr. 18. Inhibice lipoperoxidace mikrosomálních membrán indukované tBH. Hodnoty jsou průměrem ± SD z pěti měření provedených v tripletu.

5.2.5 Inhibice oxidace lidských LDL Lidské

lipoproteiny

o

nízké

hustotě

(100

µg·ml-1

v PBS),

izolované

ultracentrifugací krevní plasmy, byly oxidovány CuSO4 (10 µg·l-1, 37 ºC) v přítomnosti 0,5, 1,0 a 2,0 µg·ml-1 fenolové frakce. Jako pozitivní kontrola sloužil roztok askorbové kyseliny v PBS (5 µmol·l-1). Oxidace LDL byla měřena spektrofotometricky a odolnost LDL vůči oxidaci byla vyjádřena prodloužením „lag“ fáze. Fenolová frakce prodloužila

VÝSLEDKY

71

„lag“ fázi oxidace v závislosti na koncentraci. Procentuální prodloužení bylo pro nejnižší koncentraci (0,5 µg·ml-1) 130 ± 20 %, pro 1,0 µg·ml-1 200 ± 30 % a pro 2,0 µg·ml-1 dosahovalo 400 ± 10 %. Askorbová kyselina v koncentraci 5 µmol·l-1 (880 µg·l-1) prodloužila „lag“ fázi o 150 ± 20 %. Obr. 19 znázorňuje reprezentativní oxidační křivky jednoho z osmnácti nezávislých měření. kontrola fenolová frakce (0,5 µg•ml-1) fenolová frakce (1,0 µg•ml-1) fenolová frakce (2,0 µg•ml-1) askorbová kyselina (5,0 µmol•l -1)

0,9 0,8

∆Absorbance

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0

50

100

150

200

250

300

350

Čas (min)

Obr. 19. Inhibice oxidace LDL indukované CuSO4. Oxidace LDL měřená spektrofotometricky jako tvorba konjugovaných dienů lipidových hydroperoxidů při 37 ºC. Odolnost LDL vůči oxidaci byla vyjádřena jako prodloužení „lag“ fáze. Reprezentativní výsledky jednoho z osmnácti nezávislých měření.

5.3 Vliv fenolové frakce L. caerulea L. na buněčné kultury 5.3.1 Primární kultury potkaních hepatocytů Stanovení cytotoxicity fenolové frakce Vliv fenolové frakce na životnost primárních kultur potkaních hepatocytů byl sledován v koncentračním rozmezí 0 až 1000 µg·ml-1 po 4 hod. (a), 6 hod. (b), 24 hod. (c) a 48 hod. (d) inkubace (obr. 20). Vedle vizuálního hodnocení morfologických změn byla kvalita kultury hodnocena MTT a LDH testem. Výsledky byly pro větší přehlednost vyjádřeny jako životnost buněk (%) ve srovnání s kontrolní kulturou, která byla inkubována stejnou dobu v médiu bez

VÝSLEDKY

72

testovaných látek. Pro srovnání jsou v grafech uvedeny hodnoty pro buněčnou kulturu po lýze tritonem (T). Výsledky prokázaly netoxický charakter fenolové frakce.

Obr. 20. Vliv fenolové frakce na životnost primárních kultur potkaních hepatocytů. Životnost primárních potkaních hepatocytů po inkubaci s fenolovou frakcí o koncentraci 0 až 1000 µg·ml-1 po dobu a) 4 hod., b) 6 hod., c) 24 hod. a d) 48 hod. měřená LDH a MTT testem. T…triton; hodnoty jsou průměrem ± SD ze čtyř měření provedených v tripletu. * Tato hodnota je signifikantně odlišná od kontroly (p < 0,05).

Cytoprotektivní aktivita fenolové frakce Pro stanovení protektivního účinku byly hepatocyty preinkubovány s fenolovou frakcí po dobu 30 min. Poté byl přidán toxin (tBH; 0,5 mmol·l-1; 1,5 hod.). Po skončení doby inkubace s toxinem bylo hodnoceno buněčné poškození membrán jako aktivita uvolněné LDH a aktivita oxidoreduktas (MTT). tBH působil poškození buněčné membrány (LDH test) a pokles metabolické aktivity buněk (MTT test, obr. 21). Preinkubace kultury se zvyšující se koncentrací fenolové frakce signifikantně neovlivňovala životnost buněk. Pouze při nejvyšší použité koncentraci (1000 µg·ml-1) došlo k signifikantnímu protektivnímu účinku ovlivňujícímu viabilitu buněk u obou parametrů.

VÝSLEDKY

73

Obr. 21. Vliv fenolové frakce na životnost primárních kultur potkaních hepatocytů intoxikovaných tBH. Hepatocyty byly preinkubovány s fenolovou frakcí (0 až 1000 µg·ml-1) po dobu 30 min., poté byl přidán tBH (0,5 mmol·l-1) po dobu 1,5 hod. Životnost buněk byla měřena MTT a LDH testem. T…triton; hodnoty jsou průměrem ± SD ze čtyř nezávislých měření provedených v tripletu. * Tato hodnota je signifikantně odlišná od kontroly poškozené tBH (p < 0,05).

5.3.2 Primární kultury endotelových buněk Stanovení cytotoxicity fenolové frakce Vliv fenolové frakce na životnost buněčné kultury byl sledován na modelu primárních kultur lidských endotelových buněk v koncentračním rozmezí 0 až 1000 µg·ml-1 po 2 hod. (a), 4 hod. (b), 8 hod. (c) a 24 hod. (d) inkubace (obr. 22). Vedle vizuálního hodnocení morfologických změn byla kvalita kultury hodnocena MTT, NR a LDH testem. Výsledky byly pro větší přehlednost vyjádřeny jako životnost buněk (%) ve srovnání s kontrolní kulturou, která byla inkubována stanovenou dobu v médiu bez testovaných látek. Fenolová frakce nebyla v testovaných koncentracích cytotoxická ani na tomto modelu.

VÝSLEDKY

74

Obr. 22. Vliv fenolové frakce na životnost primárních kultur lidských endotelových buněk. Životnost primárních endotelových buněk po inkubaci s fenolovou frakcí v koncentraci 0 až 1000 µg·ml-1 po dobu 4 hod. (a), 6 hod. (b), 24 hod. (c) a 48 hod. (d) měřená LDH, NR a MTT testem. T…triton; hodnoty jsou průměrem ± SD ze čtyř měření provedených v tripletu. * Tato hodnota je signifikantně odlišná od kontroly (p < 0,05).

Cytoprotektivní aktivita fenolové frakce vůči poškození vyvolaném tBH Pro stanovení protektivního účinku byla fenolová frakce aplikována na endotelové buňky ve stabilizované primární kultuře na dobu 30 min. Poté byl na 1,5 hod. přidán tBH (0,5 mmol·l-1) vyvolávající oxidativní poškození buněk. Buněčné poškození bylo hodnoceno LDH a MTT testem. tBH (0,5 mmol·l-1) působil zvýšení aktivity LDH a pokles metabolické aktivity buněk (MTT, obr. 23). Preinkubace kultury se zvyšující se koncentrací fenolové frakce signifikantně ovlivňovala životnost buněk měřené LDH testem. V případě meření MTT testem bylo dosaženo signifikantního protektivního účinku pouze u nejvyšší použité koncentrace (1000 µg·ml-1).

VÝSLEDKY

75

Obr. 23. Vliv fenolové frakce na životnost primárních kultur lidských endotelových buněk intoxikovaných tBH. HUVEC byly preinkubovány s fenolovou frakcí (0 až 1000 µg·ml-1) po dobu 30 min., poté byl přidán tBH (0,5 mmol·l-1) po dobu 1,5 hod. Životnost buněk byla měřena MTT a LDH testem. T…triton; hodnoty jsou průměrem ± SD ze čtyř měření provedených v tripletu.* Tato hodnota je signifikantně odlišná od kontroly poškozené tBH (p < 0,05).

Protektivní aktivita fenolové frakce vůči poškození vyvolaném oxLDL Pro optimalizaci a stanovení vlivu oxidace lipoproteinů o nízké hustotě na lidské endotelové buňky byly LDL naředěny na koncentraci proteinů 1, 5, 10, 25, 50, 100 a 200 µg·ml-1 a oxidovány pomocí CuSO4 (10 µmol·l-1) po dobu 2, 4, 8 a 24 hod. při 37 ºC. Oxidace byla zastavena přídavkem EDTA (100 µmol·l-1) a butylhydroxyanisolu (BHA; 200 µmol·l-1). Tyto roztoky byly aplikovány na primární kulturu endotelových buněk po dobu 2 hod. (obr. 24), 4 hod. (obr. 25), 8 hod. (obr. 26) a 24 hod. (obr. 27). Na konci inkubace byl měřen LDH, MTT a NR test. Oxidované LDL působily na endotelové buňky signifikatně toxicky již při koncentraci 5 µg·ml-1 (2 hod. oxidace, 2 hod. inkubace), měřeno MTT testem (obr. 24). Životnost buněk byla v závislosti na zvoleném parametru ovlivněna při kombinaci různých koncentrací, doby oxidace i inkubace. Pro určení protektivního účinku fenolové frakce byla zvolena koncentrace lipoproteinů 200 µg·ml-1, doba oxidace 24 hod. a doba inkubace s buňkami 2 hod. Tato kombinace signifikantně snižovala viabilitu endotelových buněk při měření LDH a NR testem.

VÝSLEDKY

76

Obr. 24. Vliv oxidace LDL na lidské endotelové buňky po 2 hod. inkubaci. LDL byly naředěny na koncentraci proteinů 1, 5, 10, 25, 50, 100 a 200 µg·ml-1 a oxidovány pomocí CuSO4 (10 µmol·l-1) po dobu 2, 4, 8 a 24 hod. při 37 ºC. Oxidace byla zastavena přídavkem EDTA (100 µmol·l-1) a BHA (200 µmol·l-1). Tyto roztoky byly aplikovány na primární kulturu endotelových buněk po dobu 2 hod. T…triton; hodnoty jsou průměrem ± SD ze čtyř měření provedených v tripletu. * Tato hodnota je signifikantně odlišná od kontroly (p < 0,05).

VÝSLEDKY

77

Obr. 25. Vliv oxidace LDL na lidské endotelové buňky po 4 hod. inkubaci. LDL byly naředěny na koncentraci proteinů 1, 5, 10, 25, 50, 100 a 200 µg·ml-1 a oxidovány pomocí CuSO4 (10 µmol·l-1) po dobu 2, 4, 8 a 24 hod. při 37 ºC. Oxidace byla zastavena přídavkem EDTA (100 µmol·l-1) a BHA (200 µmol·l-1). Tyto roztoky byly aplikovány na primární kulturu endotelových buněk po dobu 4 hod. T…triton; hodnoty jsou průměrem ± SD ze čtyř měření provedených v tripletu.* Tato hodnota je signifikantně odlišná od kontroly (p < 0,05).

VÝSLEDKY

78


VÝSLEDKY

79


VÝSLEDKY

80

Obr. 28. Vliv fenolové frakce L. caerulea L. na endotelové buňky po inkubaci s oxLDL. Endotelové buňky byly inkubovány s fenolovou frakcí (0-1000 µg·ml-1) po dobu 2 hod. a následně s oxLDL (24 hod. oxidace, 200 µg·ml-1) po dobu 2 hod. T…triton; hodnoty jsou průměrem ± SD ze čtyř měření provedených v tripletu. * Tato hodnota je signifikantně odlišná od kontroly (p < 0,05).

VÝSLEDKY

81

Pro určení protektivního účinku byla na endotelové buňky nejprve aplikována fenolová frakce (0-1000 µg·ml-1) po dobu 2 hod. a následně oxLDL (200 µg·ml-1, 24 hod. oxidace) po dobu 2 hod. Potenciální protektivní účinek byl hodnocen MTT a LDH testem a stanovením produktů lipoperoxidace (obr. 28). Protektivní aktivita fenolové frakce byla na tomto modelu zaznamenána v koncentraci 0,1 µg·ml-1. Účinek byl na zvolené hladině významnosti (p < 0,05) signifikantní při měření LDH a MTT testem a nesignifikantní při měření TBARS. Nejvyšší testovaná koncentrace (1000 µg·ml-1) signifikantně snižovala tvorbu TBARS, ale zároveň zvyšovala aktivitu uvolněné LDH do média.

5.4 Vliv Vaccinium macrocarpon Ait. na vybrané fyziologické parametry a metabolismus potkana 5.4.1 Spotřeba krmiva a tělesná hmotnost Denní dávka NUTRICRAN®90S, HI-PAC 4.0 a PACRAN® byla průměrně 52 mg na zvíře, což odpovídá 222 mg/kg tělesné hmotnosti zvířete, na počátku experimentu a 98 mg/kg na konci experimentu. Tabulka X. Vliv V. macrocarpon Ait. na hmotnost potkanů a orgánů. Hmotnost (g)

Skupina zvířat krmená standardní dietou obsahující NUTRICRAN®90S

HI-PAC 4.0

PACRAN®

Tělesná hmotnost

542,8 ± 45,9

521,3 ± 25,6

533,7 ± 28,1

529,5 ± 25,2

Hmotnost jater

17,33 ± 2,14

15,58 ± 1,66

16,59 ± 1,61

14,74 ± 1,29

Hmotnost pravé ledviny

1,51 ± 0,12

1,48 ± 0,11

1,57 ± 0,11

1,38 ± 0,12

Hmotnost levé ledviny

1,54 ± 0,09

1,50 ± 0,10

1,57 ± 0,10

1,37 ± 0,11

Hmotnost srdce

1,23 ± 0,14

1,18 ± 0,14

1,27 ± 0,12

1,28 ± 0,15

Játra

3,21 ± 0,41

2,99 ± 0,32

3,10 ± 0,17

2,78 ± 0,15

Pravá ledvina

0,28 ± 0,02

0,28 ± 0,03

0,29 ± 0,01

0,26 ± 0,02

Levá ledvina

0,29 ± 0,02

0,29 ± 0,03

0,29 ± 0,01

0,26 ± 0,02

Srdce

0,23 ± 0,02

0,23 ± 0,02

0,24 ± 0,02

0,24 ± 0,03

Hmotnost orgánů/ tělesná hmotnost (%)

VÝSLEDKY

82

Hmotnost zvířat a orgánů (jater, ledvin a srdce) byla po ukončení experimentu srovnatelná u kontrolní skupiny zvířat i u potkanů dlouhodobě krmených dietou obsahující 1500 ppm NUTRICRAN®90S, HI-PAC 4.0 či PACRAN® (tab. X). V grafech jsou zaznamenány růstové charakteristiky zvířat (obr. 29) a spotřeba krmiva (obr. 30), které jsou rovněž srovnatelné u všech testovaných skupin. V průběhu experimentu nebylo pozorováno zhoršení zdravotního stavu u žádné z experimentálních skupin zvířat. 600

Tělesná hmotnost (g)

500

400

300 Standardní dieta Dieta obsahující NUTRICRAN®90S 200

Dieta obsahující HI-PAC 4.0 Dieta obsahující PACRAN®

100

0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Čas (dny)

Obr. 29. Hmotnost potkanů experimentálních skupin v průběhu pokusu. Potkani byli krmeni ad libitum standardní dietou nebo dietou obsahující 1500 ppm NUTRICRAN®90S, HI-PAC 4.0 a PACRAN®. Tělesná hmotnost byla kontrolována dvakrát týdně.

18 Standardní dieta Dieta obsahující NUTRICRAN®90S

16 Spotřeba krmiva (g/den/100 g tělesné hmotnosti)

Dieta obsahující HI-PAC 4.0 14

Dieta obsahující PACRAN®

12 10 8 6 4 2 0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Čas (dny)

Obr. 30. Spotřeba krmiva potkany jednotlivých experimentálních skupin. Potkani byli krmeni ad libitum standardní dietou nebo dietou obsahující 1500 ppm NUTRICRAN®90S, HI-PAC 4.0 a PACRAN®. Spotřeba krmiva byla kontrolována dvakrát týdně.

VÝSLEDKY

83

5.4.2 Stanovení fenolových kyselin a anthokyaninů v dietě, moči, trusu, játrech a plazmě Koncentrace fenolových kyselin a anthokyaninů v původních surovinách je uvedena v tabulce XI. Ve specifikaci výrobce je stanoven i obsah proanthokyanidinů, který po přepočtu na obsah surovin v dietě je: 21 mg·kg-1 (NUTRICRAN®90S), 71,25 mg·kg-1 (HI-PAC 4.0) a 22,5 mg·kg-1 (PACRAN®). Tabulka XI. Obsah fenolových kyselin a anthokyaninů/anthokyanidinů v NUTRICRAN®90S, HI-PAC 4.0 a PACRAN®. NUTRICRAN®90S

HI-PAC 4.0

PACRAN®

(%)

(%)

(%)

Kyseliny

0,351

0,436

0,169

Protokatechová

0,065

0,077

0,052

Gentisová

0,008

0,023

-

Kávová

0,010

0,014

0,006

Dihydrokávová

0,121

0,129

0,053

Chlorogenová

0,025

0,035

-

p-Kumarová

0,079

0,075

0,047

Vanilová

0,021

0,052

-

Anthokyanin/anthokyanidin

0,440

0,610

0,105


0,024

0,070

0,012


0,054

0,081

0,021

Kyanidin-3-glukosid

0,031

0,010

0,003

Kyanidin-3-pentosid

0,013

-

0,001

-

0,05

-

Delfinidin

0,008

-

0,003


0,025

0,109

0,016


0,135

0,220

0,041


0,106

0,050

0,002

Peonidin-3-glukosid

0,045

0,030

0,006

Kyanidin-3,5-dihexosid

Proanthokyanidiny*

1,4 4,75 * Údaj převzatý ze specifikace výrobce.

1,5

Koncentrace fenolových kyselin v dietě byla 0,3 ± 0,4 µg·g-1 (standardní dieta), 5,5 ± 0,9 µg·g-1 (dieta obsahující NUTRICRAN®90S), 8,2 ± 0,5 µg·g-1 (dieta obsahující HI-PAC 4.0) a 6,9 ± 0,2 µg·g-1 (dieta obsahující PACRAN®). Benzoová kyselina zaujímala v dietě 1,0 ± 0,5 µg·g-1 (standardní dieta), 2,0 ± 0,9 µg·g-1 (NUTRICRAN®90S), 5,0 ± 1,0 µg·g-1 (HI-PAC 4.0), 3,5 ± 1,1 µg·g-1 (PACRAN®). Flavonoidy byly nalezeny

VÝSLEDKY

84

jen ve stopovém množství. Množství anthokyaninů bylo určeno v původních surovinách V. macrocarpon Ait. Jejich koncentrace přepočítaná na obsah surovin v dietě byla 6,6 µg·g-1 (NUTRICRAN®90S), 9,2 µg·g-1 (HI-PAC 4.0) a 1,5 µg·g-1 (PACRAN®). Koncentrace fenolových kyselin, hippurové kyseliny, flavonoidů a anthokyaninů v moči, trusu, plazmě a játrech stanovená metodou LC/MS u zvířat krmených experimentálními dietami je uvedena v tab. XII. Tabulka XII. Obsah fenolových kyselin, hippurové kyseliny, flavonoidů a anthokyaninů v trusu, plazmě, moči a játrech. Skupina zvířat krmená standardní dietou obsahující Fenolové kyseliny Plazmaa Moč

NUTRICRAN®90S

HI-PAC 4.0

PACRAN®

n.d.

0,53 ± 0,03*

0,55 ± 0,08*

0,59 ± 0,10*

a

n.d.

2,66 ± 1,60*

2,57 ± 2,46*

2,66 ± 4,71*

b

1,39 ± 0,13

4,66 ± 1,06*

6,04 ± 1,51*

5,43 ± 0,87*

b

n.d.

0,63 ± 0,09*

1,22 ± 0,71

1,24 ± 0,46*

Trus

Játra

Flavonoidy Plazmaa Moč

n.d.

n.d.

n.d.

n.d.

a

n.d.

n.d.

n.d.

n.d.

b

n.d.

n.d.

n.d.

stopy

b

n.d.

n.d.

stopy

n.d.

Trus

Játra

Hippurová kyselina Plazmaa Moč

2,70 ± 0,99

5,74 ± 1,65

6,08 ± 2,05

6,17 ± 2,23

a

29,99 ± 12,14

139,44 ± 42,96*

127,54 ± 22,94*

262,30 ± 69,59*

b

1,58 ± 0,18

4,46 ± 0,48*

2,40 ± 1,95

2,80 ± 0,46

b

0,68 ± 0,09

0,95 ± 0,08

1,54 ± 0,63

1,77 ± 0,70

Trus

Játra

Benzoová kyselina Plazmaa Moč

stopy

stopy

stopy

0,12 ± 0,01*

a

n.d.

stopy

0,21 ± 0,07*

0,26 ± 0,17

b

2,16 ± 0,40

1,70 ± 0,08

1,58 ± 0,33

1,66 ± 0,48

Trus

b

Játra 0,91 ± 0,45 0,50 ± 0,19 0,71 ± 0,41 0,55 ± 0,32 Potkani v experimentálních skupinách byli krmeni dietou obsahující 1500 ppm suroviny V. macrocarpon Ait.; a µg·ml-1; b µg·g-1; n.d.- pod hranicí kvantifikace * Tato hodnota je signifikantně odlišná od kontroly (p < 0,05).

Fenolové kyseliny a hippurová kyselina byly nalezeny v moči, játrech, trusu i plazmě. Hippurová kyselina se v nejvyšší koncentraci nacházela v moči všech zvířat a její množství bylo u zvířat krmených experimentálními dietami signifikantně vyšší než u zvířat krmených standardní dietou. Moč obsahovala i menší množství ostatních kyselin,

VÝSLEDKY např.

85

3-hydroxy-3-fenylpropionové,

elagové,

ferulové,

kávové,

dihydrokávové,

salicylurové a hydroxyderivátů fenyloctové kyseliny. Benzoová kyselina se nacházela ve všech testovaných vzorcích, kromě moči zvířat krmených standardní dietou. Její koncentrace však nebyla významná. V játrech zvířat krmených experimentálními dietami byly identifikovány hippurová, kávová a benzoová kyselina, ve stopách rozmarýnová, dihydrokávová, chlorogenová a galová kyselina. Plazma obsahovala chlorogenovou a hippurovou kyselinu, benzoová kyselina zaujímala jen stopové množství. V trusu se majoritně nacházela hippurová, ferulová, dihydrokávová, 4-hydroxyfenyloctová, galová a benzoová

kyselina,


minoritně salicylová,

protokatechová, 4-hydroxybenzoová,

gentisová,

elagová,

rozmarýnová,

kávová,

chlorogenová, 3-hydroxyskořicová a salicylurová kyselina. Anthokyaniny nebyly v těchto vzorcích detekovány.

5.4.3 Biochemická analýza V plazmě byly vyšetřovány následující parametry: sodík, draslík, chloridy, bilirubin, cholesterol, močovina, kreatinin, ALT, AST, ALP, CHE a celková koncentrace bílkovin (tab. XIII). Tabulka XIII. Vliv V. macrocarpon Ait. na biochemické parametry plazmy. Skupina zvířat krmená standardní dietou obsahující Parametr

Jednotka

Sodík

mmol·l-1

Draslík Chloridy

NUTRICRAN®90S

HI-PAC 4.0

PACRAN®

142,0 ± 1,0

142,0 ± 2,0

141,0 ± 1,0

142,0 ± 2,0

-1

3,7 ± 0,3

3,8 ± 0,2

3,9 ± 0,1

3,8 ± 0,2

-1

mmol·l

101,0 ± 2,0

100,0 ± 2,0

100,0 ± 1,0

100,0 ± 2,0

Bilirubin

-1

µmol·l

1,3 ± 0,2

1,3 ± 0,1

1,3 ± 0,2

1,3 ± 0,3

Cholesterol

µmol·l-1

2,0 ± 0,8

1,8 ± 0,3

1,7 ± 0,4

1,8 ± 0,1

6,5 ± 0,8

6,7 ± 0,7

6,6 ± 0,7

6,8 ± 1,0

Močovina Kreatinin

mmol·l

-1

mmol·l

-1

61,0 ± 2,5

62,5 ± 5,5

67,8 ± 21,3

60,7 ± 2,9

ALT

-1

µkat·l

1,2 ± 0,3

1,3 ± 0,4

1,5 ± 0,5

0,9 ± 0,8

AST

µkat·l-1

1,3 ± 0,2

1,4 ± 0,4

1,7 ± 0,5

1,1 ± 0,1

ALP

-1

1,9 ± 0,2

1,5 ± 0,3*

2,1 ± 0,4

1,6 ± 0,3

-1

µkat·l

4,2 ± 1,2

4,8 ± 1,2

4,7 ± 0,8

3,2 ± 0,8

-1

73,0 ± 2,1

71,7 ± 4,2

71,8 ± 2,1

73,2 ± 3,4

CHE Celkový protein

µmol·l

µkat·l

g·l

* Hodnota se statisticky významně lišila od kontroly (p < 0,05).

VÝSLEDKY

86

Hladina ALP byla u skupiny zvířat krmených dietou obsahující NUTRICRAN®90S signifikantně snížena. Žádné další naměřené hodnoty nebyly signifikantně odlišné od kontrolní skupiny zvířat.

5.4.4 Hematologické vyšetření Ve vzorcích krve byly stanoveny parametry hematologie: hemoglobin, hematokrit, erytrocyty, střední objem erytrocytů, trombocyty, leukocyty a diferenciální počet leukocytů. V porovnání s kontrolní skupinou nedošlo k žádnému signifikantnímu ovlivnění měřených hodnot (tab. XIV). Tabulka XIV. Vliv V. macrocarpon Ait. na hematologické parametry krve. Skupina zvířat krmená standardní dietou obsahující NUTRICRAN®90S

HI-PAC 4.0

PACRAN®

0,44 ± 0,04

0,44 ± 0,03

0,44 ± 0,03

0,43 ± 0,03

8,7 ± 0,7

8,6 ± 0,7

8,5 ± 0,6

8,4 ± 0,7

51,3 ± 1,8

52,2 ± 1,2

51,8 ± 1,0

51,3 ± 1,2

7,6 ± 2,4

7,3 ± 1,9

7,0 ± 1,4

5,9 ± 1,7

Neutrofilní segment

0,17 ± 0,07

0,17 ± 0,08

0,14 ± 0,03

0,15 ± 0,06

Lymfocyty

0,79 ± 0,07

0,80 ± 0,08

0,84 ± 0,08

0,83 ± 0,06

868 ± 265

1064 ± 158

854 ± 223

795 ± 225

157 ± 12

157 ± 7

159 ± 9

150 ± 10

Parametr

Jednotka

Hematokrit Erytrocyty Střední objem erytrocytů Leukocyty

9 -1

10 ·l

-15

10 ·l 6 -1

10 ·l

Trombocyty Hemoglobin

-1

g·l

5.4.5 Parametry oxidačního stresu a obsah cytochromu P450 U sledovaných parametrů oxidačního stresu byly nalezeny některé signifikantní rozdíly mezi zvířaty krmenými standardní dietou a dietami experimentálními. Došlo k signifikantnímu poklesu aktivity GSHred a hladiny glutathionu u skupiny zvířat krmených dietou obsahující PACRAN® (tab. XV).

VÝSLEDKY

87

Tabulka XV. Vliv experimentálních diet na chemické a biochemické parametry oxidačního stresu v plazmě, erytrocytech a játrech. Skupina zvířat krmená standardní dietou obsahující Parametr

µA

TACa a

-1(d)

SH-skupiny

mmol·g

a

-1(d)

TBARS GSH

NUTRICRAN®90S

HI-PAC 4.0

PACRAN®

5,76 ± 1,42

5,96 ± 1,89

4,17 ± 1,28

5,28 ± 2,34

3,27 ± 0,57

3,79 ± 3,53

3,68 ± 1,77

3,32 ± 0,88

127,7 ± 7,7

130,3 ± 20,4

131,9 ± 13,4

136,4 ± 12,0

13,11 ± 2,31

12,99 ± 4,01

11,90 ± 1,6

14,44 ± 4,29

0,49 ± 0,08

0,49 ± 0,06

0,42 ± 0,04

0,41 ± 0,08

Jednotka

nmol·g

µmol·g

b

-1(e)

b

-1(e)

TBARS

nmol·g

GPx

µmol·min ·g

130,6 ± 20,2

121,8 ± 29,0

129,7 ± 37,6

113,5 ± 24,4

GST

µmol·min ·g

9,57 ± 1,77

8,38 ± 1,64

7,93 ± 1,62

8,75 ± 1,23

U·g

2,34 ± 0,49

1,97 ± 0,65

1,98 ± 0,50

2,08 ± 0,34

µmol·min-1·g-1

77,8 ± 30,7

89,5 ± 36,6

74,6 ± 20,5

85,6 ± 45,8

c

µA

c

µmol·g

b

SOD

-1 -1

b b

TAC

4,11 ± 0,40

3,91 ± 0,22

3,63 ± 0,68

3,73 ± 0,84

-1(d)

22,9 ± 3,7

19,3 ± 4,8

24,4 ± 7,2

14,6 ± 6,1*

-1(d)

80,8 ± 17,7

79,4 ± 19,8

100,7 ± 19,2

79,0 ± 29,0

µmol·min-1·g-1(d)

237,9 ± 77,9

248,1 ± 45,9

247,6 ± 112,0

237,2 ± 30,5

c

µmol·min ·g

600,1 ± 82,2

588,4 ± 67,5

624,5 ± 112,0

506,1 ± 50,0*

c

µmol·min ·g

39,8 ± 2,4

42,7 ± 2,9

44,4 ± 6,0

36,9 ± 2,5

8,08 ± 1,28

7,56 ± 1,69

8,17 ± 1,63

7,66 ± 1,61

0,36 ± 0,21

0,43 ± 0,21

0,39 ± 0,18

0,44 ± 0,17

c

TBARS

nmol·g

c

GPx

GSHred

Katalasa SOD

-1(e)

-1(e)

Katalasa

GSH

-1(e)

-1 -1

c

-1(d)

U·g c

-1(d)

Cytochrom P450 µmol·g a

-1(d) -1(d)

Plazma; b Erytrocyty; c Játra; d Hodnota vztažená na 1 g proteinů; e Hodnota vztažená na 1 g hemoglobinu;* Hodnota se statisticky významně lišila od kontroly (p < 0,05).

V obsahu proteinů SOD1/2, GPx ani GSHred stanovených pomocí western blotu nebyly zaznamenány žádné signifikantní rozdíly mezi kontrolní skupinou a skupinami krmenými experimentálními dietami (obr. 31). Ve směsných vzorcích jaterních mikrosomů byl stanoven obsah cytochromu P450 1A1/2 western blotem (obr. 32). Ani v tomto případě nedošlo k signifikatnímu ovlivnění stanovených hladin u žádné experimentální skupiny v porovnání s kontrolní skupinou zvířat.

VÝSLEDKY

88

Obr. 31. Vliv experimentálních diet obsahujících NUTRICRAN®90S, HI-PAC 4.0 a PACRAN® na expresi antioxidačních enzymů. Kontr … skupina zvířat krmená standardní dietou, Sk. 1 … skupina zvířat krmená dietou obsahující NUTRICRAN®90S; Sk. 2 … skupina zvířat krmená dietou obsahující HI-PAC 4.0; Sk. 3 … skupina zvířat krmená dietou obsahující PACRAN®. Reprezentativní výsledky jednoho z šesti měření.

Obr. 32. Vliv experimentálních diet obsahujících NUTRICRAN®90S, HI-PAC 4.0 a PACRAN® na hladinu cytochromu P450 1A1/2. Kontr … skupina zvířat krmená standardní dietou, Sk. 1 … skupina zvířat krmená dietou obsahující NUTRICRAN®90S; Sk. 2 … skupina zvířat krmená dietou obsahující HI-PAC 4.0; Sk. 3 … skupina zvířat krmená dietou obsahující PACRAN®. Reprezentativní výsledky jednoho z šesti měření.

5.4.6 Vliv experimentálních diet na poškození DNA Stanovení jednovláknových DNA zlomů (Comet assay) v lymfocytech neprokázalo signifikantní rozdíl v poškození DNA u kontrolní skupiny zvířat ani potkanů krmených experimentálními dietami obsahujícími V. macrocarpon Ait. (tab. XVI).

VÝSLEDKY

89

Tabulka XVI. Vliv experimentálních diet na poškození DNA (tvorba jednovláknových zlomů) lymfocytů. Skupina zvířat krmená standardní dietou obsahující Parametr Poškození lymfocytů 3,8 ± 5,2

NUTRICRAN®90S

HI-PAC 4.0

PACRAN®

4,4 ± 4,0

2,3 ± 3,4

9,7 ± 10,2

5.4.7 Morfologická struktura ledvin, jater, srdce a střeva U skupin zvířat krmených experimentálními dietami nebyly nalezeny žádné morfologické změny u tkáně ledviny, jater, srdce ani střeva v porovnání s kontrolní skupinou zvířat (obr. 33).

Obr. 33. Vybrané fotografie mikrostruktur ledviny, jater, srdce a střeva u kontrolní skupiny a skupin krmených experimentálními dietami obsahujícími NUTRICRAN®90S, HI-PAC 4.0 a PACRAN® (zvětšeno 60×).

DISKUSE

90

6. DISKUSE V rozvinutých zemích celého světa dochází v současné době ke zvýšení výskytu poruch metabolismu. Metabolický syndrom je souhrný název pro současný výskyt abdominální obezity,

zvýšené hladiny triglyceridů, snížené koncentrace HDL

cholesterolu, hypertenze a hyperglykémie nalačno. Kromě něj patří k civilizačním nemocem dnešní doby zejména kardiovaskulární a nádorová onemocnění. Vedle genetických příčin se na vzniku těchto chorob podílí řada dalších vlivů, např. styl života, nevhodné složení potravy či zhoršující se životní prostředí, a to zejména v průmyslových a urbanizovaných oblastech. Složení diety patří mezi jedny z nejdůležitějších faktorů, které mohou ovlivňovat vznik některých chronických onemocnění. Z těchto důvodů je věnována pozornost racionální stravě se zaměřením na její složení a látky, zodpovědné za pozitivní účinky na lidský organismus. Bobulovité plody rostlin Lonicera caerulea L. a Vaccinium macrocarpon Ait. patří k potravinám s řadou zajímavých příznivých účinků, pro které jsou využívány i v tradiční medicíně. L. caerulea L. nebyla dosud detailně studována. Proto hlavním cílem disertační práce bylo charakterizovat její základní komponenty a biologické účinky její fenolové frakce. Na druhé straně plody V. macrocarpon Ait. či jejich části jsou dnes běžně dostupné v celé řadě doplňků stravy. Proto byla studována jejich bezpečnost in vivo.

6.1 LONICERA CAERULEA L. Cukry, lipidy a další látky Existuje jen málo zdrojů, uvádějících množství alespoň některých základních nutričních složek L. caerulea L.20 Z obsahových látek je v literatuře popsáno složení cukrů v plodech20 i vrcholových částech rostliny16, především ve vztahu k toleranci vůči mrazu. Koncentrace lipidů ani celková nutriční analýza prozatím publikovány nebyly. Uváděné údaje se nevztahují na kultivary pěstované na území České republiky, a proto se disertační práce zabývala nejen získáním nových dat, ale i porovnáním naměřených hodnot v plodech L. caerulea L. pěstovaných v místě přirozeného výskytu (Čína) a v našich klimatických podmínkách. Výsledky byly v dobré shodě (tab. IV).

DISKUSE

91

Z mikroelementů převládal draslík, což odpovídá již publikovaným výsledkům20. Obsah vitaminu C byl u plodů pěstovaných na našem území asi třikrát vyšší. Vyšší bylo i množství sodíku, naopak nižší koncentrace manganu, hořčíku, fosforu, vápníku, zinku i železa. Thiaminu a riboflavinu obsahovaly plody z ČR méně než bylo publikováno20. Z naměřených hodnot je patrné, že zimolez modrý lze pěstovat na území ČR bez větších problémů, neboť množství obsahových látek se podstatně nelišilo od složení plodů této rostliny pěstované v oblasti jejího původního výskytu. U plodů a fenolové frakce z území ČR byla provedena podrobnější analýza. Předchozí studie již dříve identifikovaly převládající cukry (5-10 %), a to glukosu (75 %), galaktosu, sacharosu a manosu20. U plodů z ČR bylo potvrzeno procentuální zastoupení cukrů (7,2 %) i jejich převládající forma (glukosa, 56 %). Byla dokázána i přítomnost galaktosy, avšak místo sacharosy a manosy se v plodech nacházela fruktosa a arabinosa. Tyto rozdíly lze vysvětlit klimatickými podmínkami či způsobem zpracování a skladování (rozklad sacharosy na glukosu a fruktosu). V plodech byl stanoven obsah lipidů a zastoupení jejich jednotlivých typů (tab. V) s majoritními uhlovodíky a triacylglyceroly, dále nezmýdelnitelný podíl a množství mastných kyselin, mezi nimiž převládala palmitová a olejová kyselina (tab. VI). Koncentrace organických kyselin v plodech byla 12,2 % s majoritní chininovou kyselinou, zatímco literatura20 uvádí maximálně 4,5 % s převládající citronovou kyselinou. Dalšími identifikovanými kyselinami byly citronová, malonová a jablečná. Ve fenolové frakci byla stanovena pouze citronová a chininová kyselina.

Fenolové látky V čestvých plodech L. caerulea L. byla nalezena chlorogenová a gentisová kyselina jako majoritní, ferulová, kávová, protokatechová a kumarová pouze v malém množství. Ve fenolové frakci převládala chlorogenová, kávová a ferulová kyselina a v menším množství se nacházela protokatechová, gentisová, rozmarýnová a vanilová kyselina. V literatuře je zmíněna i přítomnost dimethoxyskořicové, hydroxykávové, galové, či hydroxyfenyloctové kyseliny29, což potvrzeno nebylo.

DISKUSE

92

Vysokoúčinnou chromatografií na tenké vrstvě (HPTLC) byla ověřena přítomnost barevných pigmentů a porovnáním se standardy i majoritní zastoupení kyanidin-3glukosidu. Tato kvalitativní analýza umožnila porovnat různé postupy přípravy frakcí a zvolit z nich frakci ekonomicky nejvýhodnější s nejvyšším obsahem anthokyaninů. Anthokyaniny a fenolové kyseliny byly kvantifikovány kapalinovou chromatografií s hmotnostní detekcí. Dosud publikovaná literatura uvádí obsah glukosidu a rutinosidu kyanidinu, glukosidu pelargonidinu a glukosidu a rutinosidu peonidinu13. Přítomnost peonidin-3,5-diglukosidu, delfinidin-3-glukosidu a -3-rutinosidu, pelargonidin-3,5diglukosidu a -3-rutinosidu zatím nikde popsána nebyla. Naproti tomu Terahara et al.33 zaznamenali i přítomnost malvidin-3-glukosidu a kyanidin-3-gentobiosidu. Při porovnání množství anthokyaninů s příbuznými bobulovitými plody ostružiny174, borůvky175 a klikvy48 je zřejmé, že se různé plody liší v jejich celkovém množství i procentuálním zastoupení (tab. XVII). Zatímco glykosidy kyanidinu převládají u zimolezu (Lonicera caerulea L.) a ostružiny (Rubus occidentalis L.), glykosidy kyanidinu a delfinidinu u borůvky (Vaccinium myrtillus L.), glykosidy peonidinu jsou převažujícími pigmenty klikvy (Vaccinium macrocarpon L.). Ve fenolové frakci zimolezu se poměrné zastoupení anthokyaninů mírně lišilo, kyanidin-3-glukosid však zůstal majoritním anthokyaninem. V celých plodech byl v pořadí druhým nejzastoupenějším peonidin-3-glukosid, kdežto ve fenolové frakci kyanidin-3,5-diglukosid. Byla potvrzena i přítomnost flavonoidu rutinu, jehož koncentrace však byla nižší než uvádí literatura20. Dalšími prokázanými flavonoidy byly kvercetin, katechin, epikatechin a ve fenolové frakci i apigenin.

Antioxidační aktivita Korelace obsahu fenolových látek s antioxidační aktivitou u rostlin byla již mnohokrát prokázána144,176. Proto bylo možné předpokládat dobré antioxidační účinky i u fenolové frakce L. caerulea L. Pro orientační hodnocení antioxidačního účinku byly nejprve zvoleny nebuněčné modely měření redukční kapacity Folin-Ciocalteauovým činidlem a zhášení stabilního 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazylového radikálu (DPPH).

DISKUSE

93

Tabulka XVII. Porovnání obsahu anthokyaninů/anthokyanidinů v plodech L. caerulea L. a jiného bobulovitého ovoce. Relativní obsah (% w/w) 175

174

L. caerulea

V. macroc.177

Kyanidin

-

-

1,2

-


-

5,5

7,1

-


-

7,1

19,0

-

Kyanidin-3-glukosid

83,3

12,3

10,0

7,1


1,9

-

-

-

Kyanidin-3-pentosid

-

2,9

-

-


3,3

-

-

51,8

V. myrt.

R. occidentalis

Kyanidin-3-sambubiosid

-

-

-

3,5

Kyanidin-3-xylosylrutinosid

-

-

-

36,8

Delfinidin

-

1,8

1,4

-

0,3

-

-

-

-

-

11,6

-

Delfinidin-3-glukosid

2,1

-

13,3

-

Delfinidin-3-rutinosid

1,2

-

-

-


0,6

-

-

-

Pelargonidin-3,5-diglukosid

0,5

-

-

-

Pelargonidin-3-rutinosid

0,1

-

-

0,8

Delfinidin-3-arabinosid-hex Delfinidin-3-galaktosid

Peonidin

-

-

0,2

-


-

5,7

0,5

-


-

10,2

0,9

-


-

24,1

-

-

Peonidin-3-glukosid

5,9

60,7

4,1

-

Peonidin-3,5-diglukosid

0,4

-

-

-


0,4

-

-

-

Petunidin

-

-

0,5

-

Petunidin-3-arabinosid

-

-

2,7

-

Petunidin-3-galaktosid

-

-

4,0

-

Petunidin-3-glukosid

0,1

-

9,0

-

Malvidin

-

-

0,5

-

Malvidin-3-arabinosid

-

-

1,9

-

Malvidin-3-galaktosid

-

-

3,2

-

Malvidin-3-glukosid

-

-

8,9

-

100

100

100

100

Celkové anthokyaniny/anthokyanidiny

Srovnání obsahu anthokyaninových/anthokyanidinových pigmentů ze zimolezu modrého (Lonicera caerulea L.), klikvy velkoplodé (Vaccinium macrocarpon Ait.), brusnice borůvky (Vaccinium myrtillus L.) a ostružiníku ojíněného (Rubus occidentalis L.).

DISKUSE

94

Měření dle Folin-Ciocalteaua bývá někdy mylně zaměnováno se stanovením obsahu fenolových látek, proto je celková hodnota vztažena na ekvivalenty galové kyseliny (GAE). Thompson a Chaovanalikit9 určili tuto hodnotu na 427 až 1142 mg GAE/100 g čerstvých plodů. V případě plodů z ČR dosahovala pouze 140,5 mg GAE/100 g plodů. Hodnota IC50 fenolové frakce při zhášení DPPH radikálu byla stanovena na 4,4 ± 0,5 µg·ml-1. Podobně je tomu i u vitaminu C (3,7 µg·ml-1) či α-tokoferolu (6,8 µg·ml-1; cit.178,179). Test zhášení DPPH je in vitro všeobecně uznávaný pro hodnocení antioxidačního potenciálu přírodních látek178,180,181. Tento radikál se však za fyziologických podmínek v organismu nevyskytuje a jeho stanovení se provádí v methanolu. Z těchto důvodů byl studován vliv extraktů na superoxidový radikál generovaný neenzymaticky systémem NADH/PMS. Hodnota IC50 byla v tomto případě výrazně vyšší, a to 115,3 ± 11,4 µg·ml-1. Za stejných podmínek zháší vitamin C superoxidový radikál s hodnotou IC50 29,2 µg·ml-1 a α-tokoferol 33,5 µg·ml-1 (cit.179,182). Pro detailnější ověření antioxidační aktivity přímo v biologickém systému byl studován protektivní účinek vůči poškození mikrosomálních membrán potkaních hepatocytů a lidských lipoproteinů o nízké hustotě (LDL). Mikrosomální membrány slouží jako vhodný model pro hodnocení protektivity vůči lipoperoxidačnímu poškození na jejich hydrofobně-hydrofilním rozhraní. Hodnota IC50 při oxidativním poškození membrán vyvolaným tBH byla 160 ± 20 µg·ml-1. Schopnost fenolových látek inhibovat lipoperoxidaci je v literatuře dobře dokumentována, a to především na modelu LDL lipoproteinů84,183. Mechanismus inhibice spočívá v zabránění řetězové radikálové reakce. U fenolů je pro tyto vlastnosti důležité množství a poloha hydroxylových skupin navázaných na základní skelet a schopnost poskytovat vodíkové ionty volnému radikálu84. Předpokládá se, že inhibice peroxidace lipidů a ochrana organismu před vznikem chronických onemocnění není vlastností jen jedné látky, ale spíše kombinace různých látek184. Výhodné se tak jeví použití rostlinných extraktů, které takovou směs látek obsahují. Připravená fenolová frakce inhibovala oxidaci lidských LDL částic vyvolanou mědnatými ionty, a to v závislosti na koncentraci.

DISKUSE

95

Vliv na buněčné kultury Stanovení toxického účinku přírodních látek je nezbytné pro posouzení jejich bezpečnosti a možnosti uplatnění. Dnes využívané subbuněčné a buněčné modely mají nezastupitelnou úlohu pro určení toxického účinku, biologické aktivity, mechanismu působení a metabolizace v organismu185. Při hodnocení výsledků je nutné brát v úvahu celou řadu faktorů, které tyto modely nejsou schopny obsáhnout. Jedná se zejména o přeměnu látek v organismu, absorpci z trávicího traktu či dosažitelnou koncentraci látek v krvi a vnitřním prostředí. V návaznosti na prokázané antioxidační vlastnosti byla testována schopnost fenolová frakce L. caerulea L. chránit potkaní hepatocyty a lidské endotelové buňky proti poškození indukovanému tBH. U endotelových buněk bylo testováno i jejich poškození oxidovanými LDL. Obě kultury v organismu přicházejí do kontaktu s xenobiotiky. Hepatocyty jsou hlavním místem biotransformace cizorodých látek175. Tyto látky navíc mohou při průchodu krevním řečištěm narušit funkci endotelu, a tak zvýšit riziko vzniku různých kardiovaskulárních onemocnění. Ani u jedné z experimentálních kultur nebyla v experimentech prokázána toxicita fenolové frakce v testovaných koncentracích (0-1000 µg·ml-1) ani časovém intervalu (0-48 hod.). Proto byl dále studován protektivní účinek fenolové frakce. tBH způsobuje poškození buněk hydroxylovými (HO·), hydrogenperoxidovými (HOO·) či alkoxylovými (RO·) radikály, na které se snadno rozpadá. U obou kultur došlo po poškození tBH k signifikantnímu protektivnímu účinku pouze v nejvyšší testované koncentraci. Takto vysoké koncentrace jsou po orálním podání v organismu však jen těžko dosažitelné. Kultura lidských endotelových buněk byla dále vystavena působení lidských oxidovaných LDL, které jsou jedním z hlavních faktorů vzniku aterosklerosy. Literatura uvádí působení fenolových látek proti apoptose endotelových buněk vyvolané oxidovanými LDL (cit.186). Možným mechanismem působení polyfenolových sloučenin je pravděpodobně ochrana endotelových buněk před apoptosou vyvolanou oxidačním stresem187. Anthokyaniny jsou navíc schopny udržovat permeabilitu cév, snižují intenzitu zánětlivé odpovědi a agregaci krevních destiček62,112. Inkubace buněk s oxidovanými LDL vedla k vzestupu aktivity LDH a poklesu životnosti buněk měřené MTT testem.

DISKUSE

96

Preinkubací buněk s fenolovou frakcí a následnou inkubací s oxidovanými LDL bylo dosaženo rozporuplných výsledků. Při koncentraci 0,1 µg·ml-1 došlo k signifikantnímu pozitivnímu ovlivnění životnosti buněk měřené LDH i MTT testem. Tvorba TBARS byla ovlivněna pouze nesignifikantně. Účinek nejvyšší koncentrace (1000 µg·ml-1) byl v tomto případě zavádějící. Přestože vyvolával pokles tvorby konjugovaných dienů, došlo k vzestupu aktivity LDH. Nicméně, jak již bylo uvedeno, takto vysoké koncentrace nejsou pravděpodobně po perorálním podání v plazmě dosažitelné. Perspektivní se jeví použití lokálních forem ošetření, např. v dutině ústní či na kůži. Na našem pracovišti již byla prokázána ochrana lidských keratinocytů před poškozením UVA zářením188 a gingiválních fibroblastů před vznikem zánětu a oxidačním stresem vyvolaným lipopolysacharidy189. Z dalších účinků uváděných v literatuře je zajímavé působení extraktu z plodů L. caerulea L. na endotoxinem vyvolanou uveitidu potkanů mechanismem inhibice aktivace NF-κB (cit.79) a potlačení růstu nádorů u potkana190. Jednotlivé složky frakce vykazují významné ovlivnění procesu karcinogeneze. Kyanidin a jeho -3-glykosidy snižují poškození DNA lidských lymfocytů ex vivo. Kyanidin-3-rutinosid a -3-glukosid potlačují tvorbu metastas buněk rakoviny plic A579 (cit.120). Kyanidin, delfinidin, malvidin i peonidin inhibují proliferaci rakovinných buněk odvozených od různých tkání, především tlustého střeva191,192. Polyfenolové frakce různých rostlin vykazují účinky podobné insulinu a snižují hladinu krevní glukosy po příjmu potravy83. Hlavní účinek spočívá ve snížení aktivity α-glukosidasy/maltasy.

Účinky fenolové frakce získané v rámci disertační práce na modelech in vitro je nutné ověřit také in vivo. Předběžné výsledky imunoregulačních účinků u myší typu Balb/c i antimikrobiální aktivity zubního gelu obsahující připravenou fenolovou frakci ukazují na významné antiadherenční a antibakteriální účinky (Roční zpráva o řešení projektu v programu TANDEM k 31. 12. 2008). Tyto výsledky potvrzují antibakteriální, antipyretické a protizánětlivé působení příbuzných zimolezů používaných již mnoho let na území Číny a Japonska21,23. Zimolez modrý může být úspěšně pěstován v klimatických

DISKUSE

97

podmínkách střední Evropy, aniž by se výrazně měnil obsah jeho biologicky aktivních látek, a tak být vyhledávanou funkční potravinou obohacující naši dietu.

6.2 VACCINIUM MACROCARPON AIT. Plody klikvy velkoplodé („brusinky“) i šťáva z nich lisovaná se používají již staletí, převážně na území Spojených států amerických, v prevenci infekcí močových cest46. V současné době na našem trhu přibývá přípravků obsahujících „brusinku“ či její frakce. Jejich použití je zaměřeno nejen na prevenci nemocí močového systému, ale i dutiny ústní. Existují ve formě tablet, bonbonů, ústních vod i žvýkaček. Vychází se z poznatku, že klikva obsahuje velké množství proanthokyanidinů typu A, které vykazujují silné antiadherenční vlastnosti, především na patogenní druhy E. coli (cit.193). Za synergický účinek je považováno i snížení pH prostředí kyselinami a znesnadnění uchycení bakterií na stěny močového měchýře a dutiny ústní58. Klinická studie provedená na Ústavu lékařské chemie a biochemie UP v Olomouci prokázala, že po konzumaci 1200 mg klikvové šťávy denně po dobu 8 týdnů dochází u žen k poklesu plazmatických hladin pokročilých produktů oxidace proteinů a vzorky moče snižují adhezi uropatogenních kmenů E. coli. Pokles pH moče prokázán nebyl48. V současné době je věnována velká pozornost také potencionálním chemoprotektivním účinkům plodů V. macrocarpon Ait. Šťáva z klikvy modulovala expresi COX-2 indukovanou TNF-α (cit.194) a vykazovala protikarcinogenní účinky na rozličných typech lidských rakoviných buněk195 in vitro. U samic potkana kmene Fischer 344 byl zaznamenán nižší výskyt abnormálních ohnisek střevních krypt vyvolaných azoxymethanem196 a u myší typu Balb/c nu/nu snížení růstu štěpů lidského nádoru žaludku197. Maher a spol.198 prokázal na modelu potkana po intravenosním podání šťávy z klikvy velkoplodé vasodilatační a hypotensivní účinky a Reed a spol.140 snížení hladiny cholesterolu v plazmě u hypercholesterolemických prasat. I přes dlouholeté používání a desítky nejrůznějších studií in vitro je stále diskutováno možné negativní působení těchto látek na zdraví člověka. Jedním z cílů disertační práce bylo ověřit možné negativní důsledky orálního podání sušené šťávy a celého plodu Vaccinium macrocarpon Ait. u potkana. Pro

DISKUSE

98

experiment byla zvolena desetkrát vyšší dávka testovaných přípravků, než bylo nejvyšší použité množství v pokusu na lidech ve výše zmíněné klinické studii48. K potvrzení nebo vyvrácení subchronického toxického účinku V. macrocarpon Ait. byla provedena studie, v níž byla potkanům po dobu 100 dnů podávána dieta obsahující 1500 ppm jedné z forem V. macrocarpon Ait. (NUTRICRAN®90S; HI-PAC 4.0; PACRAN®). Cílem bylo objasnit vliv těchto látek na chemické a biochemické parametry krve a na parametry oxidačního stresu v organismu potkana. Rovněž byla sledována případná distribuce obsahových látek V. macrocarpon Ait. a jejich metabolitů v těle potkana a možné genotoxické účinky. Takováto komplexní bezpečnostní studie dle našeho vědomí dosud provedena nebyla. Po 100 denní aplikaci 1500 ppm všech tří forem V. macrocarpon Ait. nebyly nalezeny negativní účinky na spotřebu krmiva ani na růst potkanů. Součástí studie byla identifikace fenolových kyselin, anthokyaninů a jejich metabolitů v plazmě, játrech, moči a trusu potkana. Stanovení bylo zaměřeno i na obsah benzoové a hippurové kyseliny. Byla prokázána přítomnost alespoň stopových množství fenolových kyselin ve všech sledovaných vzorcích experimentálních skupin, zatímco u skupiny kontrolní podobné výsledky zaznamenány nebyly. V játrech zvířat krmených experimentálními dietami převládala hippurová, kávová a benzoová kyselina. Plazma obsahovala chlorogenovou a hippurovou

kyselinu, v trusu

převažovala

hippurová,

ferulová,

dihydrokávová,

4-hydroxyfenyloctová, galová a benzoová kyselina. Z výsledků je patrné, že zatímco benzoová kyselina se v částech těla ani odpadních sekretech nevyskytovala ve významném množství, u hippurové kyseliny tomu bylo naopak. Hippurová kyselina byla jako pravděpodobně hlavní metabolit (obr. 34) vylučována zejména močí, a to ve stonásobném množství oproti fenolovým kyselinám. Velké rozdíly byly zaznamenány mezi kontrolní skupinou, u které se koncentrace hippurové kyseliny v moči pohybovala okolo 30 µg·ml-1, a skupinami experimentálními, u nichž byly nalezeny hodnoty minimálně čtyřikrát vyšší. Nejvyšších hladin dosahovala skupina krmená celým lyofilizovaným plodem (PACRAN®). Moč obsahovala i menší množství ostatních kyselin, např. 3-hydroxy-3-fenylpropionovou, elagovou, ferulovou, kávovou, dihydrokávovou, salicylurovou a hydroxyderiváty fenyloctové kyseliny. Klikva pravděpodobně nesnižuje aciditu moče, ale pouze upravuje poměr mezi jednotlivými

DISKUSE

99

kyselinami, především zvyšuje množství hippurové kyseliny. Ta pak působí svým antiadherenčním účinkem na patogenní bakterie osídlující stěny močového ústrojí. Vznik hippurové kyseliny v těle může být odvozen nejen z benzoové kyseliny a fenolových kyselin, ale pravděpodobně alespoň částečně i z anthokyaninů či proanthokyanidinů (obr. 34). Tyto závěry byly na našem pracovišti ověřeny na modelu lidských hepatocytů, kde se jako hlavní metabolit objevuje právě hippurová kyselina (nepublikované výsledky). Anthokyaniny bylo možné detekovat pouze v původních surovinách pro přípravu diety, v získaných vzorcích se jejich koncentrace pohybovala pod limitem kvantifikace. Parametry klinické biochemie a oxidačního stresu se ve většině případů mezi kontrolní skupinou a skupinou krmenou dietou obsahující V. macrocarpon Ait. statisticky významně nelišily. V porovnání s kontrolní skupinou došlo ke statisticky významnému snížení hladiny alkalické fosfatasy v plazmě u skupiny 2 (1500 ppm NUTRICRAN®90S) a glutathionreduktasy a gluthationu v játrech u skupiny 4 (1500 ppm PACRAN®; tab. XIII a XV). Ovlivnění exprese glutathionreduktasy při stanovení western blotem potvrzeno nebylo (obr. 31). Parametry, které byly pozorovány v játrech, mohou být vysvětleny intenzivní metabolizací složek diety v tomto orgánu nebo vyšší tvorbou konjugátů glutathionu199.

Obr. 34. Metabolizace aromatických látek v těle. V lymfocytech nebyla pozorována genotoxicita studovaných látek. Tříměsíční vystavení organismu účinkům V. macrocarpon Ait. nemělo vliv na celkový obsah cytochromů P450, hladinu SOD1/2, GPx a GSHred stanovených western blotem. Histologická

analýza

vzorků

jater,

střeva,

srdce

a ledvin

neprokázala

rozdíl

DISKUSE

100

v morfologické struktuře těchto orgánů u kontrolní skupiny a skupin krmených experimentálními dietami. Lze tedy konstatovat, že 14-týdenní podávání diety obsahující studované suroviny z V. macrocarpon Ait. v denní dávce 100 mg přípravků/kg živé váhy potkanů nejevilo známky systematického toxického působení a bylo pro zvířata bezpečné. Působení klikvy na močové ústrojí žen je dobře známo a popsáno v několika studiích200,201, proto by bylo vhodné provést studii na samicích potkana nebo jiného zvířecího modelu, doplněnou histologickým vyšetřením močového měchýře a stanovením koncentrace proanthokyanidinů. Dále je potřeba věnovat pozornost možnosti přeměny proanthokyanidinů na jejich metabolity. Již nyní byla prokázána vysoká hladina hippurové kyseliny v moči, jakožto prvního možného metabolitu těchto látek. V. macrocarpon Ait. je, vedle její současné aplikace v přípravcích s antiadherenční aktivitou, zajímavá i pro výrobu doplňků stravy s potencionálním hypolipidemickým či vasodilatačním účinkem140,198.

ZÁVĚRY

101

7. ZÁVĚRY Předkládaná disertační práce se zabývala studiem chemického složení plodů a fenolové frakce Lonicera caerulea L., jejich biologickou aktivitou na nebuněčných systémech a vybraných buněčných modelech in vitro a sledováním vlivu konzumace Vaccinium macrocarpon Ait. na vybrané fyziologické parametry potkana. Ze získaných výsledků lze vyvodit tyto závěry:

Bylo zjištěno, že produkce zimolezu modrého je na území ČR možná. Vedle vysokého množství zdraví prospěšných látek, je nespornou výhodou velice brzká doba sklizně (květen). Byla vypracována technologie zpracování plodů L. caerulea L. pro farmaceutické či potravinářské účely a provedena nutriční analýza. V plodech zimolezu modrého byly identifikovány a stanoveny základní sacharidové a lipidové složky, zastoupení mastných kyselin a steroidů a určena koncentrace organických kyselin. V plodech byly stanoveny převládající fenolové kyseliny, a to chlorogenová a gentisová; ve fenolové frakci chlorogenová, kávová a ferulová kyselina. Z anthokyaninů byl v obou případech nejvíce zastoupený kyanidin-3-glukosid, což odpovídá údajům z literatury. Navíc byly identifikovány peonidin-3,5-diglukosid, delfinidin-3-glukosid a -3-rutinosid a pelargonidin-3,5-diglukosid a -3-rutinosid. Připravená fenolová frakce z plodů zimolezu vykazovala redukční kapacitu při měření Folin-Ciocalteauovým činidlem a intereagovala s DPPH i superoxidovým radikálem, neenzymaticky generovaným v systému NADH/PMS. Fenolová frakce účinně koncentračně závisle inhibovala radikálové poškození potkaních mikrosomálních membrán vyvolané tBH i oxidaci lidských lipoproteinů o nízké hustotě indukovanou inkubací s Cu2+. Fenolová frakce při dlouhodobé inkubaci s primárními kulturami potkaních hepatocytů a lidských endotelových buněk nepůsobila cytotoxicky ani při nejvyšší testované koncentraci a době inkubace (1000 µg·ml-1, 48 hod.). Vykazovala mírný cytoprotektivní účinek na primární kultury potkaních hepatocytů i lidských endotelových buněk po intoxikaci tBH, ale pouze při nejvyšší použité koncentraci

ZÁVĚRY

102

(1000 µg·ml-1). Po poškození endotelových buněk oxidovanými LDL částicemi byl signifikantní protektivní účinek fenolové frakce zaznamenán při koncentraci mnohem nižší (0,1 µg·ml-1).

Podávání diety (100 dnů) obsahující 1500 ppm různě upravených plodů Vaccinium macrocarpon Ait. (NUTRICRAN®90S; HI-PAC 4.0; PACRAN®) nemělo vliv na tělesnou hmotnost, hmotnost orgánů ani spotřebu krmiva. Byly detekovány fenolové kyseliny, benzoová a hippurová kyselina v plazmě, moči, trusu a játrech. Flavonoidy a anthokyaniny nebylo v těchto matricích možné stanovit, neboť byly pod limitem kvantifikace. Jako hlavní metabolit fenolových látek byla identifikována hippurová kyselina, vylučovaná močí, jejíž hladina byla u zvířat krmených experimentálními dietami mnohonásobně vyšší při porovnání s kontrolní skupinou. Nedošlo k žádnému ovlivnění exprese enzymů oxidačního stresu měřené western blotem. U biochemických parametrů došlo ke snížení hladiny alkalické fosfatasy v plazmě u skupiny krmené dietou obsahující NUTRICRAN®90S a u parametrů oxidačního stresu ke snížení hladiny glutathionreduktasy a glutathionu v játrech u skupiny krmené dietou obsahující PACRAN®. Experimentální diety neměly vliv na morfologickou strukturu sledovaných vzorků tkání jater, srdce, ledviny ani střeva. Přípravky V. macrocarpon Ait. nezpůsobily poškození jaderné DNA lymfocytů a neměly vliv na celkový obsah cytochromů P450 ani na jeho expresi v játrech.

Výsledky získané v disertační práci jsou součástí souboru výsledků, které budou použity pro dokumentaci doplňků stravy obsahujících fenolovou frakci L. caerulea L. a plody V. macrocarpon Ait. nebo jejich části.

SEZNAM PRACÍ VZTAHUJÍCÍCH SE K DISERTACI

103

8. SEZNAM PRACÍ VZTAHUJÍCÍCH SE K DISERTACI Publikace: 1. Švarcová I., Heinrich J., Valentová K.: Berry fruits as a source of biologically active compounds: The case of Lonicera caerulea. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 151, 163-174 (2007). 2. Heinrich J., Švarcová I., Valentová K.: Plody Lonicera caerulea: Perspektivní funkční potravina a zdroj biologicky aktivních látek. Chem. Listy 102, 245-254 (2008). IF = 0,593 3. Palíková I., Heinrich J., Bednář P., Marhol P., Křen V., Cvak L., Valentová K., Růžička F., Holá V., Kolář M., Šimánek V., Ulrichová J.: Constituents and antimicrobial properties of blue honeysuckle, a novel source for phenolic antioxidants. J. Agric. Food Chem. 56, 11883-11889 (2008). IF = 2,562 4. Palíková I., Valentová K., Oborná I., Ulrichová J.: Protectivity of Blue Honeysuckle extract against oxidative human endothelial cells and rat hepatocytes damage. J. Agric. Food Chem. 57, 6584-6589 (2009). IF2008 = 2,562 5. Palíková I., Vostálová J., Zdařilová A., Svobodová A., Kosina P., Večeřa R., Stejskal D., Prošková J., Hrbáč J., Bednář P., Černochová D., Ulrichová J., Šimánek V.: A 14-week toxicity study of cranberries in rodents. Zasláno do časopisu

Prezentace na konferencích: 1. Švarcová I., Heinrich J., Bednář P., Křen V., Cvak L., Ulrichová J., Šimánek V., Valentová K.: Main components and radical scavenging activity of Lonicera caerulea L. var. kamtschatica berries. 50 Years of the Phytochemical Society of Europe. 11.-14.4.2007, Cambridge, Velká Británie. 2. Švarcová I., Bednář P., Maier V.: Biological activity of phenolic fraction from Lonicera caerulea L. var. kamtschatica berries. Seminář k vědeckovýzkumnému záměru MŠM 6198959216: Karlov pod Pradědem 2007. 10.-12.5.2007, Karlov pod Pradědem, Česká republika.


104

3. Švarcová I., Valentová K., Ulrichová J., Šimánek V.: Antioxidant activity of phenolic fraction from Lonicera caerulea L. var. kamtschatica berries. XXIV. Xenobiochemické

sympózium.

22.-24.5.2007,

Liptovský Ján,

Slovenská

republika. 4. Švarcová I., Valentová K., Oborná I., Ulrichová J.: The effect of the phenolic fraction from Lonicera caerulea L. var. kamtschatica on HUVEC. 6th International Conference of PhD students. 12.-18.8.2007, Miskolc, Maďarsko. 5. Ulrichová J., Bednář P., Křen V., Valentová K., Heinrich J., Švarcová I., Svobodová A., Reichenbach R., Cvak L., Šimánek V.: Characterization of Lonicera caerulea anthocyanines and phenolics by µLC-MS2 and assessment of their biological activities. 3rd International Conference of Polyphenols and Health. 25.-28.11.2007, Kyoto, Japonsko. 6. Švarcová I.: A new dietary supplement – The combination of cranberry fruit, silymarin and flaxseed, the assessment of safety in a 100-day pilot study in rat. Seminář k vědeckovýzkumnému záměru MŠM 6198959216: Karlov pod Pradědem 2008. 10.-12.5.2008, Karlov pod Pradědem, Česká republika. 7. Růžička F., Švarcová I., Holá V., Bednář P., Valentová K., Křen V., Šimánek V., Ulrichová J.: The constituents and antimicrobial properties of the Blueberry Honeysuckle. XXIVth International Conference on Polyphenols. 8.-11.7.2008, Salamanca, Španělsko. 8. Palíková I.: Cranberry fruit, silymarin and flaxseed – A new dietary supplement assessment of safety in a 100-day study in rat. Konference vědeckých prací studentů DSP 2008. 3.-4.9.2008, Olomouc, Česká republika. 9. Švarcová-Palíková I., Vostálová J., Vrublová E., Zdařilová A., Svobodová A., Večeřa R., Ehrmann J., Ulrichová J., Šimánek V.: A safety study of oral cranberry products administration to rats. International PSE Symposium on Natural Products in Cancer Therapy. 23.-26.9.2008, Neapol, Itálie.


105

10. Palíková I., Heinrich J., Bednář P., Šíma P., Růžička F., Šimánek V., Ulrichová J.: Fruits of Lonicera caerulea: A prospective food for Central Europe. Food and Function 2009. 9.-11.6.2009, Žilina, Slovenská republika. 11. Ulrichová J., Palíková I., Vostálová J., Zdařilová A., Svobodová A., Kosina P., Večeřa R., Stejskal D., Prošková J., Hrbáč J., Bednář P., Černochová D., Šimánek V.: A 14-week dietary toxicity study with cranberries in rats. NutriConference 2009. 17.-18.6.2009, Lille, Francie. 12. Palíková I., Valentová K., Vostálová J., Šimánek V., Ulrichová J.: The biological activity of Lonicera caerulea L. and Vaccinium macrocarpon Ait. berries. Konference vědeckých prací studentů DSP 2009. 8.-9.9.2008, Olomouc, Česká republika.

OSTATNÍ PRÁCE

106

9. OSTATNÍ PRÁCE Prezentace na konferencích: 1. Štoudková H., Zemanová J., Švarcová I., Popelková M., Loupancová B.: Analýza obsahu gama linolenové kyseliny v oleji pupalky dvouleté. Chem. Listy 100, 729 (2006). ISSN: 0009-2770, IF = 0,431. 2. Štoudková H., Zemanová J., Švarcová I., Loupancová B., Vítová E.: Fatty acids contained in select vegetable oils. Vitamins – Health Ingredients Metabolism Analysis. ISBN: 80-7194-855-1, 11.-13.9.2006, Pardubice, Česká republika. 3. Štoudková H., Švarcová I., Zemanová J.: Stanovení tukových charakteristik různých typů olejů pupalky dvouleté. International Conference of Cosmetology, ISBN: 80-227-2487-4, 4.-6.10.2006, Bratislava, Slovenská republika. 4. Štoudková H., Švarcová I., Zemanová J., Loupancová B., Vítová E.: Využití plynové chromatografie k analýze vybraných rostlinných olejů. Proceedings of 15th International Conference Chromatographic Methods and Human Health. ISSN: 1335-5236, 13.11.2006, Piešťany, Slovenská republika. 5. Zemanová J., Vítová E., Švarcová I., Popelková M., Štoudková H.: Significance of gamma linolenic acid in cosmetics. Proceedings Radanal. 2007, s. 1-5. Pardubice, Česká republika. 6. Vrublová E., Holčapek M., Vostálová J., Švarcová I., Večeřa R., Ehrmann J., Ulrichová J., Šimánek V.: A 90-day safety study of isomerized hop extract in rats. International PSE Symposium on Natural Products in Cancer Therapy. 23.-26.9.2008, Neapol, Itálie. 7. Palíková I., Vostálová J., Vrublová E., Zdařilová A., Svobodová A., Večeřa R., Ehrmann J., Ulrichová J., Šimánek V.: A safety study of oral Polygonum bohemicum in rats. XIII. Setkání biochemiků a molekulárních biologů. 14.-15.4.2009, Brno, Česká republika. 8. Heinrich J., Hrstková H., Palíková I.: Monitoring of children taking a food supplement. Food and Function 2009. 9.-11.6.2009, Žilina, Slovenská republika.

LITERATURA

107

10. LITERATURA 1. 2. 3. 4.

Bollinger M. Keře. Praha: Ikar; 1998. Kubát K, ed. Klíč ke květeně České republiky. Academia: Praha. 927, 2002 Huxley A. The New Royal Horticultural Society Dictionary of Gardening. London: Micmillan; 1992. Erstad JLF. Annual shoot growth in different populations of Lonicera involucrata collected in North America and grown in Norway. Euphytica 1991; 53:165-171. 5. Plekhanova MN. Blue Honeysuckle: a new berry from Russia. Pomona 1996; 29:46 - 48. 6. Herman DE, Davidson CG. Evaluation of Lonicera taxa for honeysuckle aphid susceptibility, winter hardiness and use. J Environ Hort 1997; 15:177 - 182. 7. Heinrich J, Švarcová I, Valentová K. Plody Lonicera caerulea: Perspektivní funkční potravina a zdroj biologicky aktivních látek. Chem Listy 2008; 102:245-254. 8. Naugžemys D, Žilinskaité S, Denkovskij J, Patamsyté J, Leterskis J, Žvingila D. Biologija. 2007. 9. Thompson M, Chaovanalikit, A. Preliminary observations on adaptation and nutraceutical values of blue honeysuckle (Lonicera caerulea) in Oregon, USA. Acta Hortic 2003; 626:65-72. 10. Bors B. http://www.fruit.usask.ca/articles/blue_honeysuckle2.pdf. Blue Honeysuckle 2004 [citováno 17.2.2007]. 11. Hummer KE. Blue honeysuckle: A new berry crop for North America. J Am Pomol Soc 2006; 60:38. 12. Plekhanova MN. Blue honeysuckle (Lonicera caerulea L.) - a new comercial berry crop for temperate climate: genetic resources and breeding. Acta Hortic 2000; 538:159 - 164. 13. Chaovanalikit A, Thompson MM, Wrolstad RE. Characterization and quantification of anthocyanins and polyphenolics in blue honeysuckle (Lonicera caerulea L.). J Agric Food Chem 2004; 52:848-852. 14. Zicha O. www.biolib.cz. Biological Library 1999-2009 [citováno 31.5.2009] 15. Solov´eva LV, Plekhanova MN. Karyotype of blue honeysuckle species (Lonicera subset. caeruleae, Caprifoliaceae). Tsitol Genet 2003; 37:34-42. 16. Imanishi HT, Suzuki T, Masuda K, Harada T. Accumulation of raffinose and stachyose in shoot apices of Lonicera caerulea L. during cold acclimation. Sci Hort 1998; 72:255-263. 17. Goldstein G, Nobel PS. Water relations and low-temperature acclimation for cactus species varying in freezing tolerance. Plant Physiology 1994; 104:675-681. 18. Imanishi H, Takada K, Masuda K, Suzuki T, Harada T. Changes in freezing tolerance and protein constituents of Lonicera caerulea during cold acclimation. Acta Hortic 2003; 626:445. 19. Machida K, Asano J, Kikuchi M. Analysis of the components of Lonicera species. 3. Caeruleoside-a and caeruleoside-B, bis-iridoid glucosides from Lonicera caerulea. Phytochemistry 1995; 39:111-114. 20. Marková R. Study of vegetative, growing and economic character of genus Lonicera subsect. caerulea Rehd. 9th International Conference of Horticulture. 2001 3.-6.9.2001; Lednice, Czech Republic; 2001. p. 130-135. 21. Xiang T, Tezuka Y, Wu LJ, Banskota AH, Kadota S. Saponins from Lonicera bournei. Phytochemistry 2000; 54:795-799. 22. Kwak WJ, Han CK, Chang HW, Kim HP, Kang SS, Son KH. Loniceroside C, an antiinflammatory saponin from Lonicera japonica. Chem Pharmaceut Bull 2003; 51:333-335. 23. Kakuda R, Imai M, Yaoita Y, Machida K, Kikuchi M. Studies on the constituents of Lonicera species part 14 - Secoiridoid glycosides from the flower buds of Lonicera japonica. Phytochemistry 2000; 55:879-881. 24. Kita M, Kigoshi H, Uemura D. Isolation and structure of korolkoside, a bis-iridoid glucoside from Lonicera korolkovii. J Nat Prod 2001; 64:1090-1092. 25. Liu YP, Liu J, Jia XS, Mao Q, Madhu C, Klaassen CD. Protective effects of fulvotomentosides on acetaminophen-induced hepatotoxicity. Acta Pharmacol Sin 1992; 13:209-212. 26. Liu YP, Liu J, Jia XS, Mao Q, Klaassen CD. Protective effects of fulvotomentosides on cadmiuminduced hepatotoxicity. Acta Pharmacol Sin 1992; 13:213-217. 27. Dinda B, Debnath S, Harigaya Y. Naturally occurring secoiridoids and bioactivity of naturally occurring iridoids and secoiridoids. A review, part 2. Chem Pharmaceut Bull 2007; 55:689-728.

LITERATURA

108

28. Machida K, Kikuchi M. An iridoid glucoside from Lonicera caerulea. Phytochemistry 1995; 40:603604. 29. Zadernowski R, Naczk M, Nesterowicz J. Phenolic acid profiles in some small berries. J Agric Food Chem 2005; 53:2118-2124. 30. Lin WL, Hsieh YJ, Chou FP, Wang CJ, Cheng MT, Tseng TH. Hibiscus protocatechuic acid inhibits lipopolysaccharide-induced rat hepatic damage. Arch Toxicol 2003; 77:42-47. 31. Chen SS, Gong J, Liu FT, Mohammed U. Naturally occurring polyphenolic antioxidants modulate IgE-mediated mast cell activation. Immunology 2000; 100:471-480. 32. Yip ECH, Chan ASL, Pang H, Tam YK, Wong YH. Protocatechuic acid induces cell death in HepG2 hepatocellular carcinoma cells through a c-Jun-N-terminal kinase-dependent mechanism. Cell Biol Toxicol 2006; 22:293-302. 33. Terahara N, Sakanashi T, Tsukui A. Anthocyanins from the berries of Haskaap, Lonicera caerulea L. J Home Econ Jpn 1993; 44:197-201. 34. Oszmianski J, Kucharska A, Gasiewicz E. Usefulness of honeysuckle fruits for juice production. Fruit and Vegetable Juices and Drinks - Today and in the XXI Century. 1999 Rytro, Poland. Research Institute of Pomology and Floriculture; 1999. p. 251-259. 35. Aviram M, Fuhrman B. Wine flavonoids protect against LDL oxidation and atherosclerosis. Ann N Y Acad Sci 2002; 957:146-161. 36. Zafra-Stone S, Yasmin T, Bagchi M, Chatterjee A, Vinson JA, Bagchi D. Berry anthocyanins as novel antioxidants in human health and disease prevention. Mol Nutr Food Res 2007; 51:675-83. 37. Kim YC, Chung, SK. Reactive oxygen radical species scavenging effects of Korean medicinal plant leaves. Food Sci Biotechnol 2002; 11:407-411. 38. Powell EA, Kron KA. An analysis of the phylogenetic relationships in the wintergreen group (Diplycosia, Gaultheria, Pernettya, Tepuia; Ericaceae). Syst Bot 2001; 26:808-817. 39. Janča J, Zentrich JA. Herbář léčivých rostlin. Praha: Eminent; 1994. 40. Anderson K, Brenner J, Carlson P, Guala G, Henson J, Hernandez H, et al. http://plants.usda.gov/java/profile?symbol=VAMA [citováno 8.6.2009]. 41. Bhagdeo M. Determination of extractables from cranberry seeds using supercritical CO2, in Faculty of Virginia Polytechnic Institute and State University. 2004, Virginia Tech. 42. Sialiano AA. Cranberry. Herbalgram. 1998. 43. Foo LY, Lu YR, Howell AB, Vorsa N. The structure of cranberry proanthocyanidins which inhibit adherence of uropathogenic P-fimbriated Escherichia coli in vitro. Phytochemistry 2000; 54:173-181. 44. www.gaiaherbs.com/images_herbs/CranberryHoW.jpg. [citováno 8.4.2009] 45. http://www.wildcanada.ca/Plants/VinesShrubsTrees/Plants/americanhighbushcranberry.html. [citováno 8.4.2009] 46. Klein MA. Cranberry (Vaccinium macrocarpon) Aiton, in Encyclopedia of Dietary Supplements, M. Dekker, Editor. 2005, P. Coates: New York. 47. Mateljan G. Cranberries: In-depth nutrinet analysis. World's Healthiest Foods, 2001-2009 [citováno 26.4.2009] 48. Valentova K, Stejskal D, Bednar P, Vostalova J, Cihalik C, Vecerova R, et al. Biosafety, antioxidant status, and metabolites in urine after consumption of dried cranberry juice in healthy women: A pilot double-blind placebo-controlled trial. J Agric Food Chem 2007; 55:3217-3224. 49. Zafriri D, Ofek I, Adar R, Pocino M, Sharon N. Inhibitory activity of cranberry juice on adherence of type-1 and type-P fimbriated Escherichia coli to eukaryotic cells. Antimicrob Agents Chemother 1989; 33:92-98. 50. Howell AB. Bioactive compounds in cranberries and their role in prevention of urinary tract infections. Mol Nutr Food Res 2007; 51:732-737. 51. Beachey EH. Bacterial adherence - Adhesion-receptor interactions mediating the attachment of bacteria to mucosal surfaces. J Infect Dis 1981; 143:325-345. 52. Kim KA, Lee JS, Park HJ, Kim JW, Kim CJ, Shim IS, et al. Inhibition of cytochrome P450 activities by oleanolic acid and ursolic acid in human liver microsomes. Life Sci 2004; 74:2769-2779. 53. Novotny L, Vachalkova A, Biggs D. Ursolic acid: An anti-tumorigenic and chemopreventive activity. Neoplasma 2001; 48:241-246. 54. ElSaady D, Simon A, JayatVignoles C, Chulia AJ, Delage C. MCF-7 cell cycle arrested at G1 through ursolic acid, and increased reduction of tetrazolium salts. Anticancer Res 1996; 16:481-486.

LITERATURA

109

55. ElSaady D, Simon A, Ollier M, Maurizis JC, Chulia AJ, Delage C. Inhibitory effect of ursolic acid on B16 proliferation through cell cycle arrest. Cancer Lett 1996; 106:193-197. 56. Choi YH, Baek JH, Yoo MA, Chung HY, Kim ND, Kim KW. Induction of apoptosis by ursolic acid through activation of caspases and down-regulation of c-IAPs in human prostate epithelial cells. Int J Oncol 2000; 17:565-571. 57. Kondo M. Phytochemical studies on extracts from cranberry (Vaccinium macrocarpon) with anticancer, antifungal and cardioprotective properties, in University of Massachusetts. 2006, University of Massachusetts: Dartmouth. 58. Santillo VM, Lowe FC. Cranberry juice for the prevention and treatment of urinary tract infections. Drugs Tod 2007; 43:47-54. 59. Neto CC. Cranberry and its phytochemicals: A review of in vitro anticancer studies. J Nutr 2007; 137:186-193. 60. Neto CC. Cranberry and blueberry: evidence for protective effects against cancer and vascular diseases. Mol Nutr Food Res 2007; 51:652-64. 61. Kandil FE, Smith MAL, Rogers RB, Pepin MF, Song LL, Pezzuto JM, et al. Composition of a chemopreventive proanthocyanidin-rich fraction from cranberry fruits responsible for the inhibition of 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA)-induced ornithine, decarboxylase (ODC) activity. J Agric Food Chem 2002; 50:1063-1069. 62. Bagchi D, Sen CK, Bagchi M, Atalay M. Anti-angiogenic, antioxidant, and anti-carcinogenic properties of a novel anthocyanin-rich berry extract formula. Biochemistry (Moscow) 2004; 69:75. 63. Foo LY, Lu YR, Howell AB, Vorsa N. A-type proanthocyanidin trimers from cranberry that inhibit adherence of uropathogenic P-fimbriated Escherichia coli. J Nat Prod 2000; 63:12251228. 64. Karlsson PC, Huss U, Jenner A, Halliwell B, Bohlin L, Rafter JJ. Human fecal water inhibits COX-2 in colonic HT-29 cells: Role of phenolic compounds. J Nutr 2005; 135:2343-2349. 65. Rhee KY, Charles M. Antimicrobial mechanisms of cranberry juice. Clin Infect Dis 2004; 39:877877. 66. Carlsson S, Wiklund NP, Engstrand L, Weitzberg E, Lundberg JON. Effects of pH, nitrite, and ascorbic acid on nonenzymatic nitric oxide generation and bacterial growth in urine. Nitric Oxide Biol Chem 2002; 5:580-586. 67. Schmidt DR, Sobota AE. An examination of the anti-adherence activity of cranberry juice on urinary and nonurinary bacterial isolates. Microbios 1988; 55:173-181. 68. Burger O, Weiss E, Sharon N, Tabak M, Neeman I, Ofek I. Inhibition of Helicobacter pylori adhesion to human gastric mucus by a high-molecular-weight constituent of cranberry juice. Crit Rev Food Sci Nutr 2002; 42:279-284. 69. Henig YS, Leahy MM. Cranberry juice and urinary-tract health: Science supports folklore. Nutrition 2000; 16:684-687. 70. Kessler T, Jansen B, Hesse A. Effect of blackcurrant, cranberry and plum juice consumption on risk factors associated with kidney stone formation. Eur J Clin Nutr 2002; 56:1020-1023. 71. Garcia-Calatayud S, Cordoba JJL, Torre MJLdl. Cranberry intoxication in a 4-month-old infant. An Esp Pediatr 2002; 56:72-73. 72. Shahidi F, Naczk M. Phenolics in Food and Nutraceuticals. CRC Press: Boca Raton, FL; 2003. 73. Manach C, Williamson G, Morand C, Scalbert A, Remesy C. Bioavailability and bioefficacy of polyphenols in humans. I. Review of 97 bioavailability studies. Am J Clin Nutr 2005; 81:230S242S. 74. Karakaya S. Bioavailability of phenolic compounds. Crit Rev Food Sci Nutr 2004; 44:453-464. 75. McDougall GJ, Dobson P, Smith P, Blake A, Stewart D. Assessing potential bioavailability of raspberry anthocyanins using an in vitro digestion system. J Agric Food Chem 2005; 53:58965904. 76. Cotelle N. Role of flavonoids in oxidative stress. Curr Top Med Chem 2001; 1:569-590. 77. Paganga G, RiceEvans CA. The identification of flavonoids as glycosides in human plasma. FEBS Lett 1997; 401:78-82. 78. Scalbert A, Williamson G. Dietary intake and bioavailability of polyphenols. J Nutr 2000; 130:2073S-2085S. 79. Jin XH, Ohgami K, Shiratori K, Suzuki Y, Koyama Y, Yoshida K, et al. Effects of blue honeysuckle (Lonicera caerulea L.) extract on lipopolysaccharide-induced inflammation in vitro and in vivo. Exp Eye Res 2006; 82:860-867.

LITERATURA

110

80. Duthie SJ, Jenkinson AM, Crozier A, Mullen W, Pirie L, Kyle J, et al. The effects of cranberry juice consumption on antioxidant status and biomarkers relating to heart disease and cancer in healthy human volunteers. Eur J Nutr 2006; 45:113-122. 81. Duthie SJ. Berry phytochemicals, genomic stability and cancer: Evidence for chemoprotection at several stages in the carcinogenic process. Mol Nutr Food Res 2007; 51:665-74. 82. Roy S, Khanna S, Alessio HM, Vider J, Bagchi D, Bagchi M, et al. Anti-angiogenic property of edible berries. Free Radic Res 2002; 36:1023-1031. 83. Broadhurst CL, Polansky MM, Anderson RA. Insulin-like biological activity of culinary and medicinal plant aqueous extracts in vitro. J Agric Food Chem 2000; 48:849-852. 84. Chalas J, Claise C, Edeas M, Messaoudi C, Vergnes L, Abella A, et al. Effect of ethyl esterification of phenolic acids on low-density lipoprotein oxidation. Biomed Pharmacother 2001; 55:54-60. 85. Clifford MN. Chlorogenic acids and other cinnamates - nature, occurrence and dietary burden. J Sci Food Agric 1999; 79:362-372. 86. Pietta PG. Flavonoids as antioxidants. J Nat Prod 2000; 63:1035-1042. 87. Plumb GW, Garcia-Conesa MT, Kroon PA, Rhodes M, Ridley S, Williamson G. Metabolism of chlorogenic acid by human plasma, liver, intestine and gut microflora. J Sci Food Agric 1999; 79:390-392. 88. Kroon PA, Williamson G. Hydroxycinnamates in plants and food: current and future perspectives. J Sci Food Agric 1999; 79:355-361. 89. Olthof MR, Hollman PCH, Katan MB. Chlorogenic acid and caffeic acid are absorbed in humans. J Nutr 2001; 131:66-71. 90. Peppercorn MA, Goldman P. Caffeic acid metabolism by bacteria of human gastrointestinal tract. J Bacteriol 1971; 108:996-1000. 91. Gonthier MP, Verny MA, Besson C, Remesy C, Scalbert A. Chlorogenic acid bioavailability largely depends on its metabolism by the gut microflora in rats. J Nutr 2003; 133:1853-1859. 92. Andreasen MF, Kroon PA, Williamson G, Garcia-Conesa MT. Intestinal release and uptake of phenolic antioxidant diferulic acids. Free Radic Biol Med 2001; 31:304-314. 93. Adam A, Crespy V, Levrat-Verny MA, Leenhardt F, Leuillet M, Demigne C, et al. The bioavailability of ferulic acid is governed primarily by the food matrix rather than its metabolism in intestine and liver in rats. J Nutr 2002; 132:1962-1968. 94. Ferguson LR, Zhu ST, Harris PJ. Antioxidant and antigenotoxic effects of plant cell wall hydroxycinnamic acids in cultured HT-29 cells. Mol Nutr Food Res 2005; 49:585-593. 95. Kikugawa K, Hakamada T, Hasunuma M, Kurechi T. Reaction of para-hydroxycinnamic acidderivatives with nitrite and its relevance to nitrosamine formation. J Agric Food Chem 1983; 31:780-785. 96. Ahn D, Putt D, Kresty L, Stoner GD, Fromm D, Hollenberg PF. The effects of dietary ellagic acid on rat hepatic and esophageal mucosal cytochromes P450 and phase II enzymes. Carcinogenesis 1996; 17:821-828. 97. Seeram NP, Adams LS, Henning SM, Niu YT, Zhang YJ, Nair MG, et al. In vitro antiproliferative, apoptotic and antioxidant activities of punicalagin, ellagic acid and a total pomegranate tannin extract are enhanced in combination with other polyphenols as found in pomegranate juice. J Nutr Biochem 2005; 16:360-367. 98. Mandal S, Shivapurkar NM, Galati AJ, Stoner GD. Inhibition of N-nitrosobenzylmethylamine metabolism and DNA-binding in cultured rat esophagus by ellagic acid. Carcinogenesis 1988; 9:1313-1316. 99. Mandal S, Stoner GD. Inhibition of N-nitrosobenzylmethylamine-induced esophageal tumorigenesis in rats by ellagic acid. Carcinogenesis 1990; 11:55-61. 100. Rice Evans CA, Miller NJ, Paganga G. Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radic Biol Med 1996; 20:933-956. 101. Olthof MR, Hollman PCH, Vree TB, Katan MB. Bioavailabilities of quercetin-3-glucoside and quercetin-4 '-glucoside do not differ in humans. J Nutr 2000; 130:1200-1203. 102. Sesink ALA, O'Leary KA, Hollman PCH. Quercetin glucuronides but not glucosides are present in human plasma after consumption of quercetin-3-glucoside or quercetin-4'-glucoside. J Nutr 2001; 131:1938-1941. 103. Bourne LC, Rice-Evans CA. Urinary detection of hydroxycinnamates and flavonoids in humans after high dietary intake of fruit. Free Radic Res 1998; 28:429-438. 104. Fang J, Xia C, Cao ZX, Zheng JZ, Reed E, Jiang BH. Apigenin inhibits VEGF and HIF-1 expression via P13K/AKT/p70S6K1 and HDM2/p53 pathways. FASEB J 2005; 19:342-353.

LITERATURA 105. 106. 107.

108. 109.

110. 111. 112. 113.

114. 115. 116.

117.

118. 119.

120.

121.

122.

123.

124.

125. 126. 127. 128.

111

Katiyar S, Elmets CA, Katiyar SK. Green tea and skin cancer: photoimmunology, angiogenesis and DNA repair. J Nutr Biochem 2007; 18:287-296. Leung HWC, Wu CH, Lin CH, Lee HZ. Luteolin induced DNA damage leading to human lung squamous carcinoma CH27 cell apoptosis. Eur J Pharmacol 2005; 508:77-83. Leung HWC, Kuo CL, Yang WH, Lin CH, Lee HZ. Antioxidant enzymes activity involvement in luteolin-induced human lung squamous carcinoma CH27 cell apoptosis. Eur J Pharmacol 2006; 534:12-18. Clifford MN. Anthocyanins - nature, occurrence and dietary burden. J Sci Food Agric 2000; 80:1063-1072. Seeram NP, Nair MG. Inhibition of lipid peroxidation and structure-activity-related studies of the dietary constituents anthocyanins, anthocyanidins, and catechins. J Agric Food Chem 2002; 50:5308-5312. Kowalczyk E, Krzesinski P, Kura M, Szmigiel B, Blaszczyk J. Anthocyanins in medicine. Pol J Pharmacol 2003; 55:699-702. McGhie TK, Walton MC. The bioavailability and absorption of anthocyanins: towards a better understanding. Mol Nutr Food Res 2007; 51:702-13. Ali BH, Mousa HM, El-Mougy S. The effect of a water extract and anthocyanins of Hibiscus sabdariffa L. on paracetamol-induced hepatoxicity in rats. Phytother Res 2003; 17:56-59. Rechner AR, Kuhnle G, Hu HL, Roedig-Penman A, van den Braak MH, Moore KP, et al. The metabolism of dietary polyphenols and the relevance to circulating levels of conjugated metabolites. Free Radic Res 2002; 36:1229-1241. Macheix J, Fleuriet A, Billot J. Fruit phenolics. Boca Raton: CRC Press; 1990. Wang MF, Li JG, Rangarajan M, Shao Y, LaVoie EJ, Huang TC, et al. Antioxidative phenolic compounds from sage (Salvia officinalis). J Agric Food Chem 1998; 46:4869-4873. Walgren RA, Karnaky KJ, Lindenmayer GE, Walle T. Efflux of dietary flavonoid quercetin 4 'beta-glucoside across human intestinal Caco-2 cell monolayers by apical multidrug resistance-associated protein-2. J Pharmacol Exp Ther 2000; 294:830-836. Matsui T, Ueda T, Oki T, Sugita K, Terahara N, Matsumoto K. Alpha-glucosidase inhibitory action of natural acylated anthocyanins. 1. Survey of natural pigments with potent inhibitory activity. J Agric Food Chem 2001; 49:1948-1951. Umoren J, Kies C. Commercial soybean starch blocker consumption - Impact on weight-gain and on copper, lead and zinc status of rats. Plant Food Hum Nutr 1992; 42:135-142. Block TM, Lu XY, Platt FM, Foster GR, Gerlich WH, Blumberg BS, et al. Secretion of human hepatitis-B virus is inhibited by the imino sugar N-butyldeoxynojirimycin. PNAS 1994; 91:2235-2239. Chen PN, Chu SC, Chiou HL, Kuo WH, Chiang CL, Hsieh YS. Mulberry anthocyanins, cyanidin 3-rutinoside and cyanidin 3-glucoside, exhibited an inhibitory effect on the migration and invasion of a human lung cancer cell line. Cancer Lett 2006; 235:248-259. Lee LT, Huang YT, Hwang JJ, Lee PPH, Ke FC, Nair MP, et al. Blockade of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase activity by quercetin and luteolin leads to growth inhibition and apoptosis of pancreatic tumor cells. Anticancer Res 2002; 22:1615-1627. Kwon JY, Lee KW, Hur HJ, Lee HJ. Peonidin inhibits phorbol-ester-induced COX-2 expression and transformation in JB6 P+ cells by blocking phosphorylation of ERK-1 and -2. Sig Transduct Path 2007; 1095:513-520. Martin S, Giannone G, Andriantsitohaina R, Martinez MC. Delphinidin, an active compound of red wine, inhibits endothelial cell apoptosis via nitric oxide pathway and regulation of calcium homeostasis. Br J Pharmacol 2003; 139:1095-1102. Hamdy MK, Pratt DE, Powers JJ, Somaatmadja D. Anthocyanins 3. Disc sensitivity assay of inhibition of bacterial growth by pelargonidin 3-monoglucoside and its degradation products. J Food Sci 1961; 26:457. McDougall GJ, Stewart D. The inhibitory effects of berry polyphenols on digestive enzymes. BioFactors 2005; 23:189-195. Camire ME. Billberries and blueberries as functional foods and nutraceuticals. Herbs, Botanicals and Teas. Lancaster: Technomic Publishing Company; 2000. Porter LJ. Flavans and proanthocyanidins. The Flavonoids: Advances in Research Since 1986, ed. J.B. Harborne. London: Chapman and Hall; 1994. Cowan MM. Plant products as antimicrobial agents. Clin Microbiol Rev 1999; 12:564-582.

LITERATURA 129.

130. 131.

132. 133. 134. 135.

136.

137.

138.

139.

140. 141. 142. 143. 144. 145. 146.

147.

148. 149. 150. 151. 152.

112

Santos-Buelga C, Scalbert A. Proanthocyanidins and tannin-like compounds - nature, occurrence, dietary intake and effects on nutrition and health. J Sci Food Agric 2000; 80:1094-1117. Salunkhe DK, Chavan JK, Kadam SS. Dietary tannis: Consequence and remedies. Boca Raton: CRC Press; 1989. Rios LY, Gonthier MP, Remesy C, Mila L, Lapierre C, Lazarus SA, et al. Chocolate intake increases urinary excretion of polyphenol-derived phenolic acids in healthy human subjects. Am J Clin Nutr 2003; 77:912-918. Rios LY, Bennett RN, Lazarus SA, Remesy C, Scalbert A, Williamson G. Cocoa procyanidins are stable during gastric transit in humans. Am J Clin Nutr 2002; 76:1106-1110. Rechner AR, Kuhnle G, Bremner P, Hubbard GP, Moore KP, Rice-Evans CA. The metabolic fate of dietary polyphenols in humans. Free Radic Biol Med 2002; 33:220-235. Beecher CR. Proanthocyanidins. Encyclopedia of Dietary Supplements, ed. P.M. Coates, et al. New York: Marcel Dekker; 2005. Bagchi D, Garg A, Krohn RL, Bagchi M, Bagchi DJ, Balmoori J, et al. Protective effects of grape seed proanthocyanidins and selected antioxidants against TPA-induced hepatic and brain lipid peroxidation and DNA fragmentation, and peritoneal macrophage activation in mice. Gen Pharmacol Vasc Syst 1998; 30:771-776. Ye X, Krohn RL, Liu W, Joshi SS, Kuszynski CA, McGinn TR, et al. The cytotoxic effects of a novel IH636 grape seed proanthocyanidin extract on cultured human cancer cells. Mol Cell Biochem 1999; 196:99-108. Kim H, Hall P, Smith M, Kirk M, Prasain JK, Barnes S, et al. Chemoprevention by grape seed extract and genistein in carcinogen-induced mammary cancer in rats is diet dependent. J Nutr 2004; 134:3445-3452. Neto CC, Krueger CG, Lamoureaux TL, Kondo M, Vaisberg AJ, Hurta RAR, et al. MALDI-TOF MS characterization of proanthocyanidins from cranberry fruit (Vaccinium macrocarpon) that inhibit tumor cell growth and matrix metalloproteinase expression in vitro. J Sci Food Agric 2006; 86:18-25. Verstraeten SV, Keen CL, Schmitz HH, Fraga CG, Oteiza PI. Flavan-3-ols and procyanidins protect liposomes against lipid oxidation and disruption of the bilayer structure. Free Radic Biol Med 2003; 34:84-92. Reed J. Cranberry flavonoids, atherosclerosis and cardiovascular health. Crit Rev in Food Sci Nutr 2002; 42:301-316. Buchta M, Cvak L. Czech Patent 292834. 2004: Czech Republic. Folch J, Lees M, Stanley GHS. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J Biol Chem 1957; 226:497-509. Christie WW. Gas chromatography and lipids: a practical guide, ed. Somerset. Bridgwater; 1989. Velioglu YS, Mazza G, Gao L, Oomah BD. Antioxidant activity and total phenolics in selected fruits, vegetables, and grain products. J Agric Food Chem 1998; 46:4113-4117. Deby C, Magotteaux, G. Relationship between essentially fatty acids and tissue antioxidant levels in mice. CR Seanc Soc Biol 1970; 164:2675-2681. Joyeux M, Mortier F, Fleurentin J. Screening of antiradical, antilipoperoxidant and hepatoprotective effects of 9 plant-extracts used in caribbean folk medicine. Phytother Res 1995; 9:228-230. Valentao P, Fernandes E, Carvalho F, Andrade PB, Seabra RM, Bastos ML. Antioxidant activity of Centaurium erythraea infusion evidenced by its superoxide radical scavenging and xanthine oxidase inhibitory activity. J Agric Food Chem 2001; 49:3476-3479. Buege JA. Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol. 1978. Haraguchi H, Saito T, Okamura N, Yagi A. Inhibition of lipid-peroxidation and superoxide generation by diterpenoids from Rosmarinus officinalis. Planta Medica 1995; 61:333-336. Mathiesen L, Malterud KE, Sund RB. Antioxidant activity of fruit exudate and C-methylated dihydrochalcones from Myrica gale. Planta Medica 1995; 61:515-518. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 1951; 193:265-275. Bradford M. A rapid and sensitive method for the qauntification of microgram quantities of protein using the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976; 72:248-54.

LITERATURA 153.

154. 155. 156.

157. 158. 159. 160. 161. 162. 163. 164. 165. 166. 167.

168.

169. 170. 171. 172. 173.

174.

175. 176. 177.

178. 179.

113

Kleinveld HA, Haklemmers HLM, Stalenhoef AFH, Demacker PNM. Improved measurement of low-density-lipoprotein susceptibility to copper-induced oxidation - Application of a short procedure for isolating low-density-lipoprotein. Clin Chem 1992; 38:2066-2072. Moldeus P, Horberg J, Orrenius S. Isolation and use of liver cells. Methods Enzymol.; 1978. Berry MN, Edwards AM, Barrit GJ. Isolated hepatocytes, preparation, properties and application. New York: Elsevier; 1991. Sieuwerts AM, Klijn JGM, Peters HA, Foekens JA. The MTT tetrazolium salt assay scrutinized How to use this assay reliably to measure metabolic-activity of cell-cultures in-vitro for the assessment of growth-characteristics, IC50-values and cell-survival. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1995; 33:813-823. Bergmeyer HU, Bernt E. Lactate dehydrogenase: UV-assay with pyruvate and NADH. Methods in Enzymatic Analysis. New York and London: Academic Press; 1974. Maines MD. Current protocols in toxicology, ed. K.S. Morgan. 1998. Sedlak J, Lindsay RH. Estimation of total, protein-bound, and nonprotein sulfhydryl groups in tissue with Ellman's reagent. Anal Biochem 1968; 25:192-205. Hu ML. Measurement of protein thiol groups and glutathione in plasma. Methods Enzymol. 1994. Ewing JF, Janero DR. Microplate superoxide dismutase assay employing a nonenzymatic superoxide generator. Anal Biochem 1995; 232:243-8. Tappel AL. Glutathione peroxidase and hydroperoxides. Methods Enzymol. 1978. Beers RF, I.W. S. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J Biol Chem 1952; 195:133-140. Carlberg I, Mannervik B. Glutathione reductase. Methods Enzymol. 1985. Meister A. Glutathione metabolism and its selective modification. J Biol Chem 1988; 263:1720517208. Warholm M, Guthenberg C, Bahr Cv, Mannervik B. Glutathione transferases from human liver. Methods Enzymol. 1985. p. 499-504. WitkoSarsat V, Friedlander M, CapeillereBlandin C, NguyenKhoa T, Nguyen NT, Zingraff J, et al. Advanced oxidation protein products as a novel marker of oxidative stress in uremia. Kidney International 1996; 49:1304-1313. Kohen R, Vellaichamy E, Hrbac J, Gati I, Tirosh O. Quantification of the overall reactive oxygen species scavenging capacity of biological fluids and tissues. Free Radic Biol Med 2000; 28:8719. Evelyn KA, Malloy HT. Micro determination of oxyhemoglobin, methemoglobin and sulfhemoglobin in a single sample of blood. J Biol Chem 1938; 126:655-662. Omura T, Sato R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. II. Solubilization, purification, and properties. J Biol Chem 1964; 239:2379-85. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano MD, et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem 1985 150:76-85. Tice RR, Andrews PW, Singh NP. The single cell gel assay: a sensitive technique for evaluating intercellular differences in DNA damage and repair. Basic Life Sci 1990; 53:291-301. Li Y, Yao J, Chang M, Cuendet M, Bolton JL. Altered apoptotic response in MCF 10A cells treated with the equine estrogen metabolite, 4-hydroxyequilenin. Toxicol Lett 2004; 154:22533. Tian QG, Giusti MM, Stoner GD, Schwartz SJ. Characterization of a new anthocyanin in black raspberries (Rubus occidentalis) by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Food Chem 2006; 94:465-468. Valentova K, Ulrichova J, Cvak L, Simanek V. Cytoprotective effect of a bilberry extract against oxidative damage of rat hepatocytes. Food Chem 2007; 101:912-917. Zheng W, Wang SY. Antioxidant activity and phenolic compounds in selected herbs. J Agric Food Chem 2001; 49:5165-5170. Valentova K, Stejskal D, Bednar P, Vostalova J, Cihalik C, Vecerova R, et al. Biosafety, antioxidant status, and metabolites in urine after consumption of dried cranberry juice in healthy women: A pilot double-blind placebo-controlled trial. J Agric Food Chem. 2007; 55:3217-3224. Aruoma OI. Methodological considerations for characterizing potential antioxidant actions of bioactive components in plant foods. Mutat Res Fundam Mol Mech Mut 2003; 523:9-20. Ay M, Bahadori F, Ozturk M, Kolak U, Topcu G. Antioxidant activity of Erica arborea. Fitoterapia 2007; 78:571-573.

LITERATURA 180. 181.

182. 183. 184. 185.

186.

187. 188.

189.

190.

191.

192. 193. 194.

195.

196.

197.

198.

199. 200. 201.

114

Lu YR, Foo LY. Antioxidant activities of polyphenols from sage (Salvia officinalis). Food Chem 2001; 75:197-202. Mensor LL, Menezes FS, Leitao GG, Reis AS, dos Santos TC, Coube CS, et al. Screening of Brazilian plant extracts for antioxidant activity by the use of DPPH free radical method. Phytother Res 2001; 15:127-130. Kumar S, Kumar D, Prakash O. Evaluation of antioxidant potential, phenolic and flavonoid contents of Hibiscus tiliaceus flowers. E J E A F Che 2008; 7:2863-2871. Saija A, Scalese M, Lanza M, Marzullo D, Bonina F, Castelli F. Flavonoids as antioxidant agents: importance of their interaction with biomembranes. Free Radic Biol Med 1995; 19:481-486. Milde J, Elstner EF, Grassmann J. Synergistic effects of phenolics and carotenoids on human low-density lipoprotein oxidation. Mol Nutr Food Res 2007; 51:956-961. Dvorak Z, Kosina P, Walterova D, Simanek V, Bachleda P, Ulrichova J. Primary cultures of human hepatocytes as a tool in cytotoxicity studies: cell protection against model toxins by flavonolignans obtained from Silybum marianum. Toxicol Lett 2003; 137:201-212. Jeong YJ, Choi YJ, Kwon HM, Kang SW, Park HS, Lee M, et al. Differential inhibition of oxidized LDL-induced apoptosis in human endothelial cells treated with different flavonoids. Br J Nutr 2005; 93:581-591. Das DK, Sato M, Ray PS, Maulik G, Engelman RM, Bertelli AAE, et al. Cardioprotection of red wine: Role of polyphenolic antioxidants. Drugs Exp Clin Res 1999; 25:115-120. Svobodova A, Rambouskova J, Walterova D, Vostalova J. Protective effects of phenolic fraction of blue honeysuckle fruits against UVA-induced damage to human keratinocytes. Arch Dermatol Res 2008; 300:225-233. Zdarilova A, Svobodova A, Chytilova K, Simanek V, Ulrichova J. Lipopolysaccharide-induced oxidative stress and inflammation in gingival fibroblast is reduced by polyphenolic fraction of Lonicera caerulea L. fruits, in Future trends in phytochemistry in the global era of agri-food and health, CSIC, Editor. 2009: Murcia, Spain. p. 100. Gruia MI, Oprea E, Gruia I, Negoita V, Farcasanu IC. The antioxidant response induced by Lonicera caerulaea berry extracts in animals bearing experimental solid tumors. Molecules 2008; 13:1195-1206. Serraino I, Dugo L, Dugo P, Mondello L, Mazzon E, Dugo G, et al. Protective effects of cyanidin3-O-glucoside from blackberry extract against peroxynitrite-induced endothelial dysfunction and vascular failure. Life Sci 2003; 73:1097-1114. Cooke D, Steward WP, Gescher AJ, Marczylo T. Anthocyans from fruits and vegetables - Does bright colour signal cancer chemopreventive activity? Eur J Cancer 2005; 41:1931-1940. Jepson RG, Craig JC. Cranberries for preventing urinary tract infections. Cochrane Database of Systematic Reviews 2008. Boivin D, Blanchette M, Barrette S, Moghrabi A, Beliveau R. Inhibition of cancer cell proliferation and suppression of TNF-induced activation of NF kappa B by edible berry juice. Anticancer Res 2007; 27:937-948. Ferguson PJ, Kurowska EM, Freeman DJ, Chambers AF, Koropatnick J. In vivo inhibition of growth of human tumor lines by flavonoid fractions from cranberry extract. Int Nutr Cancer 2006; 56:86-94. Boateng J, Verghese M, Shackelford L, Walker LT, Khatiwada J, Ogutu S, et al. Selected fruits reduce azoxymethane (AOM)-induced aberrant crypt foci (ACF) in Fisher 344 male rats. Food Chem Toxicol 2007; 45:725-732. Liu M, Lin LQ, Song BB, Wang LF, Zhang CP, Zhao JL, et al. Cranberry phytochemical extract inhibits SGC-7901 cell growth and human tumor xenografts in Balb/c nu/nu mice. J Agric Food Chem 2009; 57:762-768. Maher MA, Mataczynski H, Stefaniak HM, Wilson T. Cranberry juice induces nitric oxide dependent vasodilation and transiently reduces blood pressure. FASEB J 1999; 13:A884A884. Slanina J, Táborská E. Příjem, biologická dostupnost a metabolismus rostlinných polyfenolů u člověka. Chem Listy 2004; 98:239-245. Guay DRP. Cranberry and urinary tract infections. Drugs 2009; 69:775-807. Cimolai N, Cimolai T. The cranberry and the urinary tract. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2007; 26:767-776.

BIOLOGICKÁ AKTIVITA BOBULOVITÝCH PLODIN LONICERA CAERULEA L. A VACCINIUM MACROCARPON AIT

Recommend Documents