Biológia, Biotechnológia 2. ea

2013.02.18.

BME Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tsz.

Vegyészmérnöki MSc



Tartalomjegyzék: 1.ea: Sejbiológia

Biológia, Biotechnológia 2. ea

•Mikrobiológiai, és mikrobiális fiziológiai áttekintés •ipari mikrobák fajtái, •biokémiájuk főbb ismérvei: aerobok és anaerobok, •alapvető mikrobiális anyagcserefolyamatok

Biokémia vegyészmérnököknek

Dr Németh Áron Adjunktus http://f‐labor.mkt.bme.hu





Biotechnológia=alkalmazott (mikro)biológi

Bevezetés Biotechnológia=alkalmazott (mikro)biológia

Bevezetés

Insulin Production Flowsheet M e dia

Fermentation Section

W ater

P-2 / ST -101

M ixing

H ea t S teriliza tion

Primary Recovery Section

S-108

P-6 / AF-102

Enzim vs Mikroba

Air Filtra tion

S-107 S-106

P-1 / BT -101

E D T A S olution

T rit on -X -1 00 Liq W aste 2

L iq waste 1 S-142 P-11 / HG-101

S-101 Ammonia

S-104

P-5 / AF-101

Blending / S torag e

P-9 / DS-101

P-7 / FR-101

Air Filt ra tion

P-12 / DS-101 P-13 / BT-103

Ce ntrifu ga tion

Blending / S torag e

Centrifugation

P-8 / VT -101

Fe rme nta tion

S-118

H omoge nization

P-10 / BT-102

S tora ge

Air

S-110

S-143 4345.65 k g/ batc h

P-4 / G-101 S-1 09

Ce ntrifu ga l Compre ssion CN Br/ H CO O H

W FI-1

Liq W aste 3

M rE T OH / U rea W FI-2

S-103

S-127

S-122 S 122

S-121 S 121 S-114 P-14 / DS-101

P-16 / DF-101

G ua n H Cl

P-17 / DE-101

S-115

P-15 / V-101

D ia filt ra tion

D ea d-E n d Filtrat ion

S-111

Liq W aste 4

Ce ntrifu ga tion

I B S olu biliza tio n

P-18 / V-102 P-19 / CSP -101

P-21 / DF-101

Liq W aste 5

S ulf itolysis

S-125

Liq W aste 6

CN Br Clea v a ge

R ot ary E v apora tor

P-2 0 / V-103

D iafiltra tion 8369.71 k g/ batc h

Reactions Section S-1 48 S-135

S-147

S-146

S-160

S-159

S-158

S-134

S-154 S-102

S-131 W FI-3

W FI-4

Enzymes-New

S-149

S-136

S-123

S-133

S-152

P-28 / C-1 03

S-119

S-129

Liq W aste 9

S-144

P-25 / C-102

S-1 30 P-2 2 / C-101

H I C Column

S - Se ph arose

P-27 / DF-102

P-26 / V-105

S-138

E nzyme Co nv ersion

D iafiltra tion

Liq W aste 11

Liq W aste 10

Liq W aste 7 P-24 / DF-102

S -S epha rose

P-23 / V-104 MrEtOH

R e folding

D ia filtra tion

Liq W aste 8

S-1 61

S-132

S-173

S-165

S-174

S-162

S-1 26 S-1 86

1787.65 k g/ batc h

Final Purification Section S-166 S-175

S-137

S-167 W FI-5

W FI-6

11.50 kg/batch

S-124 S-172

P rodu ct P-36 / FDR-101

P-33 / DF-105

S-157

Fre e ze D rying

P-32 / C-105

D ia filt ra tion

G el Filtration

R P -H P LC

D ia filtra tion

Crysta lliza tion

Ba sk et Ce ntrifuga tion Liq W aste 17

P-30 / C-104

P-31 / DF-104

P-34 / V-106 P-35 / BCF-101

Liq W aste 15

Liq W aste 16

P-29 / DF-103

D ia filt ra tion Liq W aste 13

Liq W aste 14

Liq W aste 12

1

2013.02.18.





Bevezetés Biotechnológia=alkalmazott (mikro)biológia Fermentáció:

kívánt nyersanyag átalakítása valamely élőszervezet (v. annak egy részének) segítségével.

Élő szervezett v. része é

=

Mik Mikroorganizmus i v. enzim(e) i ( )

A biotechnológia mikroorganizmusokon alapszik ‐>

Mikrobiológia

Mikroorganizmus : mikroszkópikus élőlény, szabad szemmel nem látható Mottó 1: „ It might look that I am doing nothing, but at a cellular level I am really quite busy.” Comments: 1. „Nincs hülye mikroba” 2. A mikrobák csak élni akarnak 3. Mi önzően kiszolgáljuk (és kihasználjuk) őket 4. Ők cserébe nekünk profitot és megélhetést adnak 5. DE: láthatatlanok, így gyakran egyes kísérő jelenségeik is (pl.: befertőződés)

Általános mikrobiológia Szisztematikus v. részletes mikrobiológia (Rendszertan v. taxonómia)



Technológia fejlesztés ill. termelés – alkalmazott mikrobiológia: Természet

Agar lemez Petri csészében

Rázatott lombikos tenyészet

Labor fermentor


Általános Mikrobiológia

2. Mikrobiológiai műveletek:

Félüzem

Részletes Mikrobiológia

1. Mikrobiológiai ismeretek: A. Mikroba sejt felépítése B. Mikroszkópizálás C. Mikroökológia

I lálá Izolálás

Törzsgyűjtemény


A. B. C. D. E. F. G.

Rendszertan: ‐Fenotípusos ‐Genotípusos

Tápközegkészítés Izolálás Screening Identifikáció Tartósítás, fenntartás Átoltás Törzsfejlesztés

Üzem

2

2013.02.18.





Általános Mikrobiológia Mikroszkóp:

1. Mikrobiológiai ismeretek: B. Mikroszkópizálás

Baktériumok: 1‐2 µm

1000x

Élesztők: 10 µm

400x

Gombák: 10 µm‐1mm

100x



Baktériumok: 1‐2 µm

1000x

Élesztők: 10 µm

400x

Gombák: 10 µm‐1mm

100x

1. 2. 3. 4. 5 5. 6.

OD‐optical density (UV‐Vis photometer, 600‐660nm) Turbidimetria (online) Mikroszkóp – sejtszámlálás Bürker kamrával (10^6 db/ml) Cellcounter (10^6 db/ml) Sejt Szárazanyag (1 (1‐10 10 g/L) Higításos szélesztéses módszer (CFU/ml)

Gram+ Gram ‐


Általános Mikrobiológia Mikroba mérés:



Általános Mikrobiológia 1. Mikrobiológiai ismeretek: C. Mikroökológia µmax Élőhelyek: levegő, víz, talaj Életformák: szaprofita, szimbionita, kommenzalista, parazita, Életkörülmények: hőmérséklet tolerancia (pszichrofil, (pszichrofil mezofil, mezofil termofil) T(°C), pH pH tolerancia (acidophil, neutrophil, alkalophil) sótűrés (ozmotolerancia) Mikrobák szerepe a bioszférában: fotoszintetizálók: CO2‐t megköthetnek, E‐t termelhetnek lebontók: C, N, P körforgalomba visszajuttatása

3

2013.02.18.









A. Tápközegkészítés Tápoldat <‐> Táptalaj (+agar, v. gelrite) Mindekettőben: C‐forrás: cukrok N‐forrás: fehérjék, aminosavak, oligopeptidek, ammóniumsók P‐forrás: P forrás: foszfátok +sók, vitaminok, prekurzorok stb. Anaerobok: redukáló komponensek (DTT, NaSH)+O2 indikátor) Bakt.: szerves N‐forrás (fehérje), C‐forrás is ebben, nem (mindig) kell cukor Élesztő+gomba: N‐forrás lehet szervetlen só => könnyebb a downstream, olcsóbb up és downstream Tápközeg sterilezése: Fizikai módszerek (szűrés, besugárzás, hőkezelés) Kémiai módszerek (dezinficiáló szerek) Biológiai módszerek (sejtfalbontó enzimek)

B. Izoálás •SzilárdÆ ez a leggyakoribb (talaj), mert a legnagyobb diverzitás ‐minta‐>petrire Inkubálás ‐minta‐>vizes szuszpenzió‐>petrire ‐minta minta felszínéről steril vattával •Folyadék Æhígabb‐> dúsítás: előinkubáció v. szűrés+agar+inkubálás •Levegő

Izoláló petricsésze+agar: talajban kevert populáció‐>szelektív nyomás adalékok az agarhoz: pl.: antibiotikum‐>csak gombák nőnek antifungális szerek‐> bacik nőnek, savanyúbb közeg: élesztők

Nem minden komponenst lehet, néha külön kell



Általános Mikrobiológia 2. Mikrobiológiai műveletek: C. Screening Célja 2x: 1) keresni a célfeladathoz mikrobát a már izoláltak között 2a) jobb termelőt keresni a meglévő eljáráshoz 2b) törzsfejlesztés (ld később)



Általános Mikrobiológia 2. Mikrobiológiai műveletek: C. Screening ‐HTS rendszerek: High Througput System

Ehhez: nagyszámú (100‐1000 v. több) mikroba vizsgálata – nagy mintaszám=>automatizálni DE Minden feladat egyedi (mi a célparaméter, milyen módszerrel detektál stb.)‐>manuális

Kombinálják

‐manuális: agarba adalékok: ált. zavarosodás/tisztulás a céltelep körül pl.: CaCO3‐> savtermelők (tisztulás) szenzitív mikroba‐>antibiotikm termelők (tisztulás) olajemulzió+Ca‐>lipáz termelők (zavarosodás) kicsapott fehérje‐>proteáz termelők (tisztulás)

4

2013.02.18.







2. Mikrobiológiai műveletek: D. Identifikáció Cél: azonosítás, rendszertani csoportba besorolás

2. Mikrobiológiai műveletek: D. Identifikáció

‐HTS rendszerek: automatizált feno/genotípus alapján is fenotípus alapú: ~manuális (Ld. Köv) genotípus: konzervált genetikai állomány ‐>rokonság (filogenetikai családfa)

‐manuális: fenotípus és biokémiai tulajdonságok alapján pl.: makroszkópikus: telep színe, szaga, formája mikroszkópikusan: sejt alakja,csoportosulása, mozgásszerve, sejtmagja, sejtfala (Gram festés, más festések) Biokémiailag: oxidáz próba, aerob/anaerob dextróz fogyasztás, ureáz, kénhidrogén stb

Bővebben: részletes mikrobiológia




Általános Mikrobiológia 2. Mikrobiológiai műveletek: E. Tartósítás, fenntartás Izolátumok eltartása: ‐aktív formában: ‐szárítva ampullában (liofilezve) ‐lelassítva lelassítva agaron, hűtőben ‐ferdeagar kémcsőben (+olaj) ‐szúrt agar kémcsőben (anaerobok) ‐petricsészés agaron

‐inaktív formában: spórák, szaporítóképletek


Általános Mikrobiológia 2. Mikrobiológiai műveletek: F. Átoltás ‐Napi használat‐> aktív formában eltartás‐>de „öregszik” a tenyészet‐>átoltás ‐eltartó tenyészetből inokulum készítés (szilárdról folyadékra) Laminár boksz <> steril fülke

E kö ök Eszközök: ‐steril tér ‐steril kacs ‐bunzen égő ‐sterilezéshez_ autokláv ‐steril pipettahegy v. üvegpipetta+vatta (folyadék) ‐steril víz (szuszpenzióhoz) Átoltás: az új tenyészetet inkubáljuk, majd lezárjuk, hűtőben tároljuk. Legközelebb erről oltunk

5

2013.02.18.







2. Mikrobiológiai műveletek: G. Törzsfejlesztés

Mikroorganizmusok

Az élőszervezet képességeit a genomja határozza meg =>a fejlesztéshez genomot kell módosítani =mutáció Dózis: Fizikai mutagének: ‐sugárzó λ és intenzitás, ill. idő ‐besugárzás (UV, gamma) Kémiai mutagének: ‐ koncentráció+kontakt idő ‐DNS‐t megváltoztató anyagok (rákkeltők) 1. Mutáció‐>2.mutánsok kitenyésztése (izolálása)‐>3.mutánsok szűrése (ki lett jobb)‐> 4.kicsit jobbak újra mutáltatása







A) Prokarióták Bergey I. kiadás (1980‐90‐es évek) 4 divizió (tagozat) I. Gram (‐) baktériumok II. Gram (+) baktériumok III. Merev sejtfal nélküli baktériumok IV Ősbaktériumok IV. Fenotípus+Biokém. Bergey II. kiadás (2001‐től) 2 domén 25 törzs (phylum) I. Archea 1. A1 phylum 2. A2 phylum II. Eubacteria 1. B1 phylum … 23.B23 phylum

Genotípus

Sejtfal szerint: 1. Ősbaktériumok: nincs mureinháló v. pseudomurein 2. Gram (‐) baktériumok 3. Gram (+) baktériumok Alak szerint: 1. Gömb (Coccus) 2. Pálcika (bacillus) 3. Csavart (spirohéta)

6

2013.02.18.







A) Prokarióták

C) Eukarióták

Ősbaktériumok (Archeák) Coccusok Pálcák: Gram (‐)

Gram (+)

Protiszták ‐aerob ‐fakultatív anaerob ‐anaerob b

Coccusok Pálcák: ‐endospórás ‐spórátlan ‐spórátlan szabálytalan alakú

Pseudomonas, Brucella, Legionella Enterok :Escherichia, Klebsiella, Salmonella

Staphylococcus, Streptococcus

Gombák

Amőbák, Ostorosok Bazidomyceták Ascomyceták Zygomyceták

Bacillus (aerob), Clostridium (anaerob) Lactobacillus Corynebacterium, Streptomyces, Actinomyces

B) Parabióták (vírusok, prionok)


Perfect és Imperfect gombák = élesztő és fonalas forma


Biotechnológiai potenciál



Biotechnológiai potenciál Mit lehet előállítani mikrobákkal?

Mit lehet előállítani mikrobákkal? 1) Primer metabolitokat: normál élettani folyamatokat kísérő vegyületek: 2) Szekunder metabolitokat az élethez szorosan nem kapcsolt anyagcsere termékek (antibiotikumok) 3) Biokonverziós termékeket

1) Primer metabolitokat:

Energia termelés: glikolízis+Citrát kör glükóz/fruktóz/más cukrok

Kémiai energia: ATP v. NADH2

4) (rekombináns) fehérjéket, enzimeket Közvetlen E hasznosítás

ATP‐vé alakul és regenerálódik

Terminális oxidáció

7

2013.02.18.







Mit lehet előállítani mikrobákkal?

Mit lehet előállítani mikrobákkal?



A) Glikolízis+Terminális oxidáció Respiráció <> Fermentáció Szerves e‐donor Szerves e‐donor Aerob/anaerob Anaerob ‐ Sztlen e akceptor Szerves e‐akceptor

y g Ehhez kell O2 – aerob anyagcsere Ox. Nélkül (anaerob anyagcsere): Más úton regenerálódik a NADH, pl.: piruvát‐>tejsav redukció NAD képz. v. Ac‐CoA‐>AcOH


Egy sor termék, Különböző erjedések: ‐tejsavas (Lactobacillusok) ‐ecetsavas (Acetobacterek) ‐alkoholos (Élesztők: S. cerevisiae) ‐vajsavas (Clostridium butyricum) ‐aceton‐butanolos (C. acetobutylicum)


Biotechnológiai potenciál Mit lehet előállítani mikrobákkal? 1) Primer metabolitokat: Pl.: Tejsavas erjedés Homo/hetero fermentatív



Biotechnológiai potenciál Alk. Biotechnológia

Élelmiszeripar

Mit lehet előállítani mikrobákkal? Calvin ciklus ‐ kloroplaszt 1) Primer metabolitokat: B) C3‐ciklus (citrát kör, mitokondrium)

MIKROBÁK‐lebontás A ciklust megakasztva annak tagjai előállíthatóak ha van anaplerotikus reakcióút

NÖVÉNYEK‐felépítés

8

2013.02.18.







Boeringher Metabolic Pathway

Mit lehet előállítani mikrobákkal? 1) Primer metabolitokat: B) C3‐ciklus (citrát kör, mitokondrium) 1. Citromsav előállítás fonalas gombákkal (Aspergillus niger) 2 Itakonsav előállítás fonalas gombákkal (Aspergillus terreus) 2. 3. Aminosav ak előállítása: Lys, Glu (Corynebacterium) 2) Szekunder metabolitokat: ‐penicillinek (Penicillin G, 6APA, Penicillium crysogenum) ‐cephalosporinok (Cephalosporin C, Cephalosporium acremonium) ‐ Fumagillin (Aspergillus fumigatus) Mikroba célja: elnyomni „nehéz időkben” a konkurenciát (=bacikat)

CELL FACRORY


Biotechnológiai potenciál Mit lehet előállítani mikrobákkal? 3) Biokonverziók Eddig: de novo fermentációk = szintézisek (többnyire természetes reakciók) Most: kémiai szintézisekben 1 lépcsős átalakítások: ‐mert jó kitermelés ‐sztero specifitás ifi á ‐egyszerűbb megoldás egy funkc. csop. cseréjére, mint új totálszintézis




Biotechnológiai potenciál Mit lehet előállítani mikrobákkal? 4) Fehérjék – enzimek (rekombináns) ‐biokonverziókhoz ‐mosószerekhez Extra<>Intracelluláris ‐élelmiszeripari célra ‐terápiás célra ‐szerves ((heterogénfázisú) g ) katalízishez ‐mezőgazdaság: Bacillus thüringiensis endotoxin

9

Biológia, Biotechnológia 2. ea

Recommend Documents