Biogenní aminy a polyaminy ve vybraných fermentovaných potravinách

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin

Biogenní aminy a polyaminy ve vybraných fermentovaných potravinách Diplomová práce

Vedoucí práce:

Vypracovala:

prof. MVDr. Ing. Tomáš Komprda, CSc.

Bc. Monika Brázdová

Brno 2011

Prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Biogenní aminy a polyaminy ve vybraných fermentovaných potravinách vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MU v Brně. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům.

V Brně, dne …………..

Podpis

……………

Poděkování

Touto cestou bych chtěla poděkovat prof. MVDr. Ing. Tomáši Komprdovi, CSc. za odborné vedení při zpracování diplomové práce, za všechen jeho věnovaný čas a poskytnuté informace. Děkuji paní Ing. Evě Rejchrtové za pomoc při práci v laboratoři, za poskytnuté materiály a cenné rady. Dále děkuji tvarůžkárnám A. W. spol. s. r. o., zejména panu Ing. Pospíšilovi za poskytnuté vzorky sýrů a organizaci IGA MZLU v Brně za poskytnutou finanční podporu pro tento výzkum.

Abstrakt Diplomová práce se zabývá obsahem biogenních aminů (tryptamin, 2fenyletylamin, tyramin, histamin) a polyaminů (putrescin, spermin, spermidin) v sýrech zrajících pod mazem konkrétně v olomouckých tvarůžkách. Práce je zaměřena také na mikroorganismy

(enterokoky,

bakterie

mléčného

kvašení,

celkový

počet

mikroorganismů), které mohou biogenní aminy v sýrech produkovat. Sleduje se vliv několika faktorů jak na obsah aminů, tak na obsah zmíněných skupin mikroorganismů. V největších koncentracích se v detekovaných sýrech tvořil tyramin, putrescin, kadaverin a histamin. Množství polyaminů sperminu a spermidinu bylo nízké a významně se neměnilo. Počty bakterií mléčného kvašení se v průběhu celého výrobního procesu výrazně neměnily, celkové počty mikroorganismů klesaly a enterokoky nejdříve narůstaly, poté klesaly. Byly stanoveny většinou nízké hodnoty korelačních koeficientů mezi mikroorganismy a stanovovanými aminy.

Abstract The thesis dwells on content of biogenic amines (tryptamin, 2 – fenylethylamin, tyramin, histamin), polyamines (putrescin, spermin, spermidin) in Olomouc curd cheese and microorganisms (enterococcus, lactic acid bakteria, total count of microorganism), which the amines can produce in the cheese. There is shown to influence of several factors both on the content of amines and the content of certain groups of microorganisms. In detected cheese there were formed tyramin, putrescin, cadaverin and histamin in the largest concentrationes. The amount of polyamines spermin and spermidin was low and without change. During of all technological process the content lactic acid bakteria didn´t show any substantial change. Total count of microorganism went down and enterococci after primary increase also went down. There were defined mostly low values of correlative coefficient between microorganisms and amines.

Keywords: biogenic amines, polyamines, microorganism, Olomouc curd cheese

OBSAH 1 2

ÚVOD....................................................................................................................... 8 LITERÁRNÍ PŘEHLED .......................................................................................... 9 2.1 Mléko ................................................................................................................ 9 2.1.1 Definice mléka.......................................................................................... 9 2.1.2 Složení mléka............................................................................................ 9 2.1.3 Dusíkaté látky v mléce.............................................................................. 9 2.1.4 Srážení bílkovin ...................................................................................... 10 2.2 Sýr................................................................................................................... 11 2.2.1 Definice sýra ........................................................................................... 11 2.2.2 Rozdělení sýrů ........................................................................................ 12 2.2.3 Požadavky na mléko pro výrobu sýrů..................................................... 12 2.3 Tvaroh ............................................................................................................. 13 2.3.1 Definice tvarohu ..................................................................................... 13 2.3.2 Rozdělení tvarohů ................................................................................... 13 2.3.3 Výroba tvarohů (kyselých sýrů) ............................................................. 13 2.3.4 Složení a znaky průmyslového tvarohu .................................................. 15 2.3.5 Olomoucké tvarůžky............................................................................... 15 2.3.5.1 Výroba olomouckých tvarůžků........................................................... 16 2.3.5.2 Vady olomouckých tvarůžků .............................................................. 17 2.3.5.3 Složení olomouckých tvarůžků........................................................... 17 2.3.6 Mikrobiologie sýrů zrajících pod mazem ............................................... 18 2.4 Biogenní aminy a polyaminy.......................................................................... 20 2.4.1 Charakteristika biogenních aminů .......................................................... 20 2.4.2 Dělení biogenních aminů podle chemické struktury .............................. 20 2.4.3 Charakteristika polyaminů...................................................................... 20 2.4.4 Vznik biogenních aminů a polyaminů .................................................... 21 2.5 Faktory ovlivňující tvorbu biogenních aminů v potravinách.......................... 23 2.5.1 Faktory ovlivňující tvorbu biogenních aminů v potravinách.................. 23 2.5.2 Výskyt biogenních aminů a polyaminů v potravinách ........................... 24 2.5.2.1 Výskyt biogenních aminů a polyaminů v sýrech................................ 25 2.6 Fyziologické funkce a toxikologické účinky biogenních aminů a polyaminů v organismu člověka ................................................................................................... 27 2.6.1 Fyziologické funkce biogenních aminů a polyaminů ............................. 27 2.6.2 Toxikologické účinky a toxické dávky biogenních aminů a polyaminů 27 2.6.2.1 Toxicita histaminu .............................................................................. 30 2.6.2.2 Toxicita tyraminu................................................................................ 30 2.7 Hygienický význam biogenních aminů a polyaminů v potravinách............... 31 2.8 Mikroorganismy produkující biogenní aminy ................................................ 32 2.8.1 Mikroorganismy s dekarboxylázovou aktivitou ..................................... 32 2.8.2 Mikroorganismy produkující biogenní aminy v sýrech.......................... 33 2.8.3 Charakteristika významných mikroorganismů produkujících biogenní aminy ………………………………………………………………………….34 2.8.3.1 Bakterie mléčného kvašení (BMK) .................................................... 34 2.8.3.2 Bakterie rodu Enterococcus (ENC) .................................................... 35 2.9 Metody stanovení biogenních aminů a polyaminů ......................................... 35 2.9.1 Obecný princip chromatografie .............................................................. 36 2.9.2 Rozdělení chromatografických metod .................................................... 36 2.9.3 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) ............................... 37

3 4

5

6 7 8

9

CÍL PRÁCE ............................................................................................................ 38 MATERIÁL A METODIKA.................................................................................. 39 4.1 Materiál ........................................................................................................... 39 4.2 Metodika ......................................................................................................... 40 4.2.1 Stanovení biogenních aminů metodou HPLC ........................................ 40 4.2.2 Stanovení mikroorganismů ..................................................................... 41 4.2.2.1 Celkový počet mikroorganismů (CPM).............................................. 41 4.2.2.2 Bakterie mléčného kvašení (BMK) .................................................... 41 4.2.2.3 Bakterie rodu Enterococcus (ENC) .................................................... 42 4.2.2.4 Plísně a kvasinky ................................................................................ 43 4.2.2.5 Bakterie rodu Brevibacterium (BREVI) ............................................. 44 4.2.2.6 E. coli .................................................................................................. 44 4.2.3 Přístroje a pomůcky ................................................................................ 45 4.2.4 Vyhodnocení výsledků mikrobiologických stanovení............................ 46 4.2.5 Statistické zpracování výsledků.............................................................. 47 VÝSLEDKY A DISKUZE..................................................................................... 48 5.1 Vliv tvaru výrobku, teploty a doby skladování na obsah BA a PA ................ 48 5.2 Současný vliv teploty a doby skladování na obsah BA a PA ......................... 54 5.3 Množství BA a PA ve vstupní surovině.......................................................... 57 5.4 Vliv stáří výrobku na obsah BA a PA............................................................. 59 5.5 Vliv tvaru výrobku, teploty a doby skladování na počet mikroorganismů..... 62 5.6 Počet mikroorganismů ve vstupní surovině.................................................... 66 5.7 Počet mikroorganismů v průběhu výroby....................................................... 66 5.8 Počet mikroorganismů rodu Brevibacterium v průběhu výroby .................... 68 5.9 Korelační vztahy mezi obsahem BA, PA a počty mikroorganismů ............... 69 5.10 Korelační vztahy mezi jednotlivými skupinami mikroorganismů.................. 71 ZÁVĚR ................................................................................................................... 72 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY .................................................................... 74 SEZNAM TABULEK A OBRÁZKŮ .................................................................... 80 8.1 Seznam tabulek ............................................................................................... 80 8.2 Seznam obrázků.............................................................................................. 80 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK..................................................................... 82

1

ÚVOD Biogenní aminy jsou organické sloučeniny odvozené od aminokyselin, které se

uplatňují v metabolismu zvířat, rostlin, lidí a vykazují různé fyziologické účinky. V malém množství se vyskytují jako přirozené složky řady potravin. Ve vyšším množství se nacházejí ve fermentovaných potravinách, kde vznikají činností mikroorganismů. Schopnost mikroorganismů produkovat biogenní aminy je dána přítomností specifických dekarboxyláz. Nejčastěji se tato dekarboxylázová aktivita vyskytuje u laktobacilů, pediokoků, enterokoků a bakterií čeledi Enterobacteriaceae. Polyaminy, které byly původně klasifikovány do skupiny biogenních aminů, se nyní řadí jako samostatná skupina, která se odlišuje vznikem a fyziologickými účinky v organismu. Polyaminy spermidin a spermin nevznikají činností mikroorganismů, ale biosyntézou z putrescinu. Putrescin, přestože se strukturně řadí mezi diaminy, protože je prekurzorem sperminu a spermidinu, je zahrnován do polyaminů. Většinou nepředstavují biogenní aminy a polyaminy v potravinách pro zdravé jedince žádné riziko, avšak při nadměrném příjmu se mohou projevit nežádoucí účinky. Z důvodu negativního vlivu biogenních aminů a polyaminů na lidské zdraví je žádoucí, aby se tyto aminy v potravinách vyskytovaly v co nejmenším množství. Vedle ryb jsou sýry nejčastěji uváděnou potravinou spojovanou s intoxikací biogenními aminy a polyaminy. Sýr vytváří ideální prostředí pro tvorbu aminů. Tvarůžky jsou sýry zrající pod mazem a mohou obsahovat značné množství biogenních aminů a polyaminů. Na vzniku biogenních aminů v sýrech se často uplatňují kromě mikroorganismů kulturní mikroflóry i kontaminující mikroflóra. Obsah biogenních aminů a polyaminů je značně ovlivněn ošetřením a zacházením s výchozí surovinou a dalšími technologickými faktory, jako je koncentrace volných aminokyselin nebo peptidů, přítomnost bakterií schopných dekarboxylovat aminokyseliny, pH, koncentrace solí, vodní aktivitě apod.

8

2

LITERÁRNÍ PŘEHLED

2.1 Mléko 2.1.1

Definice mléka Syrovým mlékem se dle vyhlášky č. 203/2003 Sb. rozumí mléko produkované

sekrecí jedné nebo více krav, ovcí, koz nebo buvolích krav, které nebylo zahřáto na více než 40 °C nebo nebylo podrobeno žádnému jinému ošetření majícímu srovnatelný účinek. 2.1.2

Složení mléka

Tabulka č. 1 Základní složení kravského mléka (Simeonová, Ingr, Gajdůšek, 2008) Složka

Průměrný obsah (%)

Voda

87,50

Sušina

12,50

Tuk

3,80

Bílkoviny

3,20

Laktosa

4,70

Minerální látky 0,70 2.1.3

Dusíkaté látky v mléce Dusíkaté látky tvoří nejkomplexnější složku mléka. Jako bílkoviny mléka jsou

tradičně označovány všechny dusíkaté látky v mléce, stanovené po mineralizaci Kjeldahlovou metodou. Z celkového množství dusíku však tvoří kolem 5 až 7% nebílkovinné dusíkaté látky. Proto se pro rozlišení používají názvy hrubá neboli celková bílkovina (tj. dusík bílkovin i nebílkovinných dusíkatých látek × faktor 6,37) a čistá bílkovina (Simeonová, Ingr, Gajdůšek, 2008). Z nutričního hlediska jsou bílkoviny nejdůležitější součástí mléka a jejich obsah v mléce je proti vnějším vlivům poměrně stálý. Mléčné proteiny se dělí na dvě základní frakce: kaseiny a syrovátkové (sérové) bílkoviny (Velíšek, 2002).




Kasein Kasein je hlavní bílkovinná složka kravského mléka. Tvoří asi 80% mléčných

proteinů. Kromě prvků charakteristických pro složení bílkovin obsahuje i fosfor, patří

9

tedy mezi fosfoproteiny. Kaseinový komplex kravského mléka se skládá ze tří základních frakcí α, β a κ-kasein. γ-frakce je pouze výsledkem degradace β-kaseinu proteolytickými enzymy. Jednotlivé kaseinové frakce se navzájem liší nejen hodnotami poměrné molekulové hmotnosti, ale i elementárním složením, obsahem aminokyselin a hodnotami izoelektrického bodu (Lukášová a kol., 1999). Převážná část kaseinových frakcí je v mléce vázána do velkých koloidních útvarů neboli kaseinových micel. Kromě kaseinu tyto micely obsahují vápník, hořčík, citráty a fosfáty, souhrnně označované jako koloidní kalcium fosfát. Díky zápornému náboji jsou na povrchu micel elektrostaticky vázány molekuly vody, které tvoří hydratační obal. Základní význam pro stabilitu kaseinových micel má κ-kasein, který se na rozdíl od ostatních frakcí nesráží působením iontů vápníku a má tedy v mléce ochranou funkci před vysrážením.




Syrovátkové bílkoviny Jako syrovátkové bílkoviny se souhrnně označuje skupina bílkovin, které

zůstávají v roztoku (syrovátce) po vysrážení kaseinu. Jejich množství v kravském mléce se pohybuje asi kolem 20%, přičemž jejich zvýšená koncentrace je v mlezivu a v mléce od krav vykazující poruchy mléčné žlázy. Syrovátkové bílkoviny mají vyšší nutriční hodnotu než kasein. Nejvyšší podíl tvoří β-laktoglobulin, který je zastoupen asi z 50%, dále je to α-laktalbumin, imunoglobuliny, proteozopeptony a sérový albumin.


Nebílkovinné dusíkaté látky Tyto látky zůstávají v roztoku po vysrážení veškerých bílkovin 12% kyselinou

trichloroctovou. Největší podíl tvoří močovina, její obsah je asi 50% z celkových nebílkovinných dusíkatých látek. Patří sem i volné aminokyseliny, amoniak, kreatin, kyselina močová, hippurová apod. 2.1.4

Srážení bílkovin

 Sladké srážení bílkovin Sladké srážení bílkovin je srážení syřidlem, které můžeme obecně rozdělit do tří fází. V primární fázi dochází k proteolýze κ-kaseinu, čímž ztrácí svou ochrannou funkci při stabilizaci α- a β-kaseinu proti vysrážení volnými vápenatými ionty v mléce. Štěpením κ-kaseinu vzniká para-κ-kasein, který odpovídá 1 – 105 aminokyselině v

10

peptidu. Tento řetězec je hydrofobní a je zadržován ve vytvořené sýřenině. Část peptidu od 106 do 169 aminokyseliny označujeme jako κ-kaseinglykomakropeptid, který je hydrofilní a zůstává rozpuštěný v syrovátce. V sekundární fázi se mění micelární uspořádání kaseinového komplexu, který koaguluje v přítomnosti volných iontů vápníku. Koagulace je závislá na ztrátě vodného obalu micel a na snížení jejich záporného náboje. Dochází k tvorbě nové trojrozměrné struktury gelu, kde se kromě těchto účinků iontů vápníku uplatňují i hydrofobní interakce, vodíkové můstky či S-S vazby. Terciární fáze zahrnuje pokračující proteolýzu kaseinu, tedy vlastní zrání sýrů. Ukončení sýření lze podpořit pokrájením sýřeniny a zvětšením povrchu, přičemž se jednotlivá vlákna vysrážených bílkovin smršťují, zmenšuje se objem sraženiny a současně se uvolňuje syrovátka. Tento jev se nazývá synereze a lze jej podpořit záhřevem.

 Kyselé srážení bílkovin Přídavkem kyselin do mléka (kyselina octová, citronová) nebo mléčným kvašením, při kterém bakterie mléčného kvašení rozkládají laktózu na kyselinu mléčnou, dochází k okyselování mléka a po dosažení pH 4,6 kasein vyvločkuje a mléko se sráží. Vzniká gel, který má odlišné vlastnosti od gelu získaného enzymovým srážením. Tento gel se vyznačuje malou tuhostí a tříštivostí. Působením kyselin v mléce dochází ke ztrátě koloidní stability bílkovinné disperze kaseinového komplexu. Z hlediska micelární struktury znamená snížení pH k izoelektrickému bodu snížení celkového záporného náboje micel. Následkem toho se snižuje i povrchová hydratační vrstva kaseinu, který se po ztrátě náboje a vodného obalu snadno sráží. Největší množství kaseinu se vysráží z mléka o pH 4,2 – 4,6 a teplotě 40˚C.

2.2 Sýr 2.2.1

Definice sýra Jako sýr se dle vyhlášky č. 77/2003 Sb. označuje mléčný výrobek vyrobený

vysrážením mléčné bílkoviny z mléka působením syřidla nebo jiných vhodných koagulačních činidel, prokysáním a oddělením podílu syrovátky.

11

2.2.2

Rozdělení sýrů

 Rozdělení sýrů podle způsobu srážení mléka •

Tzv. sladké sýry – sýry vznikají sladkým, neboli syřidlovým srážením (většina sýrů, zejména tvrdé a polotvrdé sýry)

•

Tzv. kyselé sýry – sýry vznikají kyselým srážením (průmyslový tvaroh a výrobky z něj)

•

Sýry se smíšeným srážením – jde o měkké sýry a tvarohy

 Rozdělení přírodních sýrů podle zrání Tabulka č. 2 Klasifikace přírodního sýra podle zrání (Vyhláška č. 77/2003Sb.) Sýr

Charakteristika

Sýr nezrající

Čerstvý Termizovaný

Sýr zrající

Na povrchu S mazem na povrchu V celé hmotě

Z toho plísňový sýr S tvorbou charakteristické plísně na povrchu S tvorbou charakteristické plísně uvnitř hmoty Dvouplísňový

2.2.3

Požadavky na mléko pro výrobu sýrů Požadavky na jakost mléka jako suroviny pro výrobu sýrů jsou v podstatě stejné

jako pro konzumní mléko, jsou však doplněny ještě o další důležité speciální požadavky, které rozhodují o vhodnosti mléka k výrobě jednotlivých druhů sýrů. Je to syřitelnost mléka, neboli schopnost mléka k sýření syřidlem a vytváření sraženiny vhodné pevnosti a pružnosti. Dále kysací schopnost, což je aktivita ušlechtilých bakterií mléčného kvašení rozmnožovat se v mléce, a mikrobiologická čistota, která je ovlivněna zejména hygienou získávání a ošetřování mléka. Chemické složení mléka má zásadní význam pro výtěžnost výroby a složení sýra. Výtěžnost určuje především obsah kaseinu. Poměr tuku a kaseinu je rozhodující pro výsledný obsah tuku v sušině (Kadlec a kol., 2009).

12

Celkově je tedy možné definovat pojem technologické vhodnosti mléka pro výrobu sýrů jako soubor chemických, fyzikálních a mikrobiologických vlastností mléka, které příznivě ovlivňují jeho syřitelnost a kysací schopnost (Teplý a kol., 1985).

2.3 Tvaroh 2.3.1

Definice tvarohu Podle vyhlášky č. 77/2003 Sb. charakterizujeme tvaroh jako nezrající sýr získaný

kyselým srážením, které převládá nad srážením pomocí syřidla. 2.3.2

Rozdělení tvarohů

Tabulka č. 3 Rozdělení tvarohů (Vyhláška č. 77/2003 Sb.) Měkký nebo odtučněný

Termizovaný

Nízkotučný nebo jemný Polotučný Tvaroh Tučný Tvrdý nebo na strouhání nebo ke strouhání 2.3.3

Výroba tvarohů (kyselých sýrů)

 Úprava mléka před zpracováním Tvaroh se vyrábí většinou z odtučněného mléka šetrně pasterovaného při teplotě 74 – 76˚C nebo vysokopasterovaného při teplotě 85˚C po dobu 15 – 20 s. Při vysoké pasteraci dochází ke zvýšené denaturaci syrovátkových bílkovin, které přecházejí do tvarohové sraženiny. Zvyšuje se výtěžnost tvarohů, avšak vazbou vody se snižuje jejich sušina, konzistence tvarohů je jemnější. Ke zlepšení syřitelnosti mléka je možné přidat krystalický chlorid vápenatý. Přídavek CaCl2 se však většinou používá jen vyjímečně a to v množství maximálně 5 až 10 g na 100 l mléka (Gajdůšek, 2002).

 Výroba tvrdého tvarohu Tvrdý tvaroh se připravuje kyselým srážením pasterovaného odstředěného mléka mezofilní kulturou bez přídavku syřidla a následným zpracováním sraženiny. Tvrdý

13

tvaroh zahrnuje tvaroh pro přímý konzum, neboli tvaroh na strouhání, který se používá hlavně na posyp ovocných knedlíků či jiných sladkých pokrmů a tvaroh k dalšímu zpracování tzv. průmyslový tvaroh. Sušina tvrdého tvarohu je běžně 32%. Při výrobě tvrdého tvarohu se používá

dvoutepelný způsob, který je totožný s dvoutepelnou

výrobou průmyslového tvarohu.

 Výroba průmyslového tvarohu Průmyslový tvaroh je základní surovinou pro výrobu olomouckých tvarůžků. Vyrábí se nejčastěji dvoutepelným, případně jednotepelným způsobem. Při využití termofilních kultur je možné provádět termofilní způsob výroby. Zjednodušení představuje kontinuální výroba odstřeďováním.

Dvoutepelný způsob výroby: Teplota mléka se upravuje na 22 – 30˚C. Přidá se mezofilní zákys v množství 0,5 – 2% a nechá se prokysat 14 – 18 hodin. Po vysrážení se sraženina pokrájí sýrařským nožem na hranoly. Po dosažení kyselosti syrovátky 24 – 28 SH se sraženina začne zahřívat za občasného míchání na teplotu 38 – 42˚C. Po dosažení požadované teploty se nechá sraženina vystoupit na povrch, po jedné až dvou hodinách se odpustí syrovátka a sraženina se přepouští do tvarožníků, případně do lisovací vany a lisuje se. Vylisovaný tvaroh se rozemele nebo se ručně rozdrtí a vychladí se na teplotu 10˚C. Vychlazený tvaroh se plní do polyethylenových pytlů, ve kterých se dokonale udusá, aby se vypudil vzduch, který by způsobil oklihnutí tvarohu. Naplněné pytle se nechají v chladírně, před uzavřením se může tvaroh mírně prosypat solí. Pytle se uzavřou a až do expedice zůstávají v chladírně.

Jednotepelný způsob výroby: Od dvoutepelného způsobu výroby se tento postup liší prvotním zahřátím mléka na 32 – 38˚C. K mléku se přidá mezofilní kultura v množství asi 1%. Za 7 – 12 hodin, kdy titrační kyselost sraženiny dosáhne 22 – 24 SH, se začne opatrně promíchávat až do té doby, než kyselost syrovátky dosáhne 25 – 27 SH. Následně se odpustí uvolněná syrovátka a sraženina se přepouští do filtračních pytlů nebo lisovacích van. Po vylisování se mele, chladí a balí. Před plněním do expedičních obalů musí být tvaroh dobře vychlazený, neboť má sklon k zapařování.

14

Termofilní způsob výroby: Při tomto způsobu výroby se mléko zahřeje na teplotu 38 – 44˚C a probíhá srážení přidanými termofilními kulturami v množství asi 2%. Srážení trvá 2 až 4 hodiny, což je podstatně méně než při použití mezofilního zákysu. Jakmile sraženina dosáhne kyselosti 23 – 25 SH, ihned se krájí, lisuje a chladí. Celé zpracování trvá 4 – 6 hodin a umožňuje tak zvýšení kapacity tvarohárny.

Kontinuální způsob výroby: Výrobu průmyslového tvarohu je také možno provádět kontinuálně odstřeďováním. Vhodným typem pro výrobu průmyslového tvarohu jsou odstředivky dekantační – šnekové (Strmiska, Hušek, Minařík, 1991).

2.3.4

Složení a znaky průmyslového tvarohu

Tabulka č. 4 Složení a znaky průmyslového tvarohu (Strmiska, Hušek, Minařík, 1991) Obsah sušiny 32 % Kyselost

120 – 160SH

Chuť

Mléčně nakyslá

Konzistence

Hrudkovitá

2.3.5

Olomoucké tvarůžky Tvarůžky jsou domácí sýry s velmi starou tradicí. Podle písemných záznamů se

vyráběly v olomouckém kraji na Hané již v 15. století (Bílek a Pospěch, 1986). Pravé olomoucké tvarůžky jsou odtučněný měkký, pod mazem zrající sýr z netučného kyselého tvarohu. Mají zcela ojedinělou pikantní chuť, typickou vůni, povrch se zlatožlutým mazem a soudržnou poloměkkou až měkkou konzistenci s patrným světlejším jádrem. Tvar má zpravidla podobu kotoučků, kroužků, tyčinek nebo nepravidelných kousků. V roce 2010 olomoucké tvarůžky získaly chráněné zeměpisné označení Evropské unie. Dříve výrazná proteolýza umožnila dosažení silně ostré pikantní chuti olomouckých tvarůžků. Časem došlo z důvodu požadavku menší vyzrálosti, kvůli možnosti výskytu biogenních aminů, k tvorbě chuti méně výrazné. V současnosti se

15

tvarůžky vyrábí z průmyslového tvarohu, který se získává zejména v období nadbytečné produkce mléka. Monopolní výrobce tvarůžků v ČR je tvarůžkárna A. W. spol. s.r.o. v Lošticích. Jde o firmu s dlouholetou tradicí, která vyrábí asi 2400 tun ročně. 2.3.5.1 Výroba olomouckých tvarůžků Surovinou pro výrobu tvarůžků je nesýřený (kysele srážený) průmyslový tvaroh z odstředěného mléka. Tvaroh se opakovaně mele, prosoluje 4 – 5% kuchyňské soli a skladuje v kontejnerech 1 – 2 týdny při teplotě 15˚C (Kadlec a kol., 2009). Ve zhutnělém stavu a bez přístupu kyslíku dochází k samovolné homogenizaci a získání požadovaných vlastností. Před zpracováním se upravuje kyselost, sušina a obsah soli. Kyselost se snižuje hydrogenuhličitanem sodným či uhličitanem vápenatým. Sodné soli způsobují měkkou konzistenci a roztékání, vápenaté soli zase tuhou a pevnou konzistenci, proto se obě soli přidávají v požadovaném poměru. Sušina se upraví na 32%. Skladovaný tvaroh se před zpracováním míchá s čerstvým. Následně se hmota řádně promíchá, pomele na válcovém mlýnu a formuje se na formovacím stroji do tvaru koleček či tyčinek. Vytvarované tvarůžky se uloží na podložky a přemístí se do sušáren, kde se suší při teplotě 22 – 24˚C a relativní vlhkosti vzduchu 80 až 85% po dobu tří až čtyř dnů. Dochází ke zvýšení sušiny a na povrchu se vytvoří povlak kvasinek (např. Torulopsis, Candida, Oospora nebo bílá plíseň Geotrichum), které rozkládají kyselinu mléčnou na oxid uhličitý a vodu, proto je při sušení důležitý dostatečný přísun kyslíku. Po dosažení požadované sušiny 36 – 38% probíhá praní tvarůžků ve speciálních pračkách vodou o teplotě 13 – 17˚C, do níž se přidává mazová kultura (Brevibacterium linens, mikrokoky). Praním tvarůžků se odstraní z povrchu vzniklý křís a tvarůžky po odkapání zrají 4 až 8 dnů při teplotě 15 – 20˚C a relativní vlhkosti 80 – 90% (Gajdůšek, 2002). Ve zracích místnostech dochází k vlastnímu proteolytickému zrání od povrchu směrem do středu. Na povrchu se vytvoří maz a tvarůžky získávají zcela ojedinělou a typickou chuť, vůni a barvu. Po dosažení požadovaného stupně zrání se tvarůžky balí. Zabalené tvarůžky se skladují do doby expedice při 10˚C, přičemž pořád dozrávají.

16

2.3.5.2 Vady olomouckých tvarůžků Při výrobě i samotném zrání tvarůžků za nevhodných podmínek mohou vzniknout některé chyby těchto produktů.

Roztékání tvarůžků – na vzniku této vady se mohou podílet aerobní sporotvorné proteolytické bakterie Bacillus cereus, B. subtilis a jiné. Tyto bakterie se v tvarohu mohou rozmnožovat zejména při zvýšených teplotách (při zapaření). Nežádoucí je také pomnožení plísní Geotrrichum candidum. Tato plíseň je poměrně nenáročná na přítomnost vzdušného kyslíku a tudíž může růst i ve vnitřním tvarohu. Bílá mazovitost – vzniká při vysoké vlhkosti (uvolňování volné vody) a současném zrání při nízkých teplotách. Místo žlutého mazu se tvoří bílý až hnědý maz, tvarůžky nezrají a nepříjemně páchnou. Černání tvarůžek – bývá způsobené příliš vysokým obsahem železa a mědi v surovině, či v tvarohu. Kyselé prostředí tvarohu působí agresivně na železo a měď z nevhodného nářadí a zařízení. Při zrání se z tvarůžků uvolňují sirné sloučeniny včetně sirovodíku, který dává se železem nebo mědí tmavé sulfidy. Udává se, že surovina nesmí obsahovat více než 1 mg Fe.kg-1 a 5 mg Cu. kg-1. Tvarohovitost tvarůžků – jde o nezralý produkt. Tato vada se projevuje, pokud jsou tvarůžky příliš brzo zabaleny a chybí vzdušný kyslík, nebo když vyschne povrch tvarůžek a kulturní mikroflóra odumře. Hořká chuť – vzniká nesprávným zráním spojeným s roztékáním tvarůžků, které bývá způsobené přítomností a aktivitou aerobních sporotvorných bacilů B. cereus a jiných. Zatuchlá chuť – je způsobená nedostatečným přístupem vzduchu při sušení sýrů nebo přílišným pomnožením plísně Geotrichum candidum (Görner a Valík, 2004).

2.3.5.3 Složení olomouckých tvarůžků Tvarůžky se vyrábějí z nesýřeného kyselého tvarohu a kromě soli a regulátorů kyselosti se na výrobu nepoužívají žádné další konzervační látky. Díky velmi nízkému obsahu tuku jsou vhodné pro dietetickou stravu. Průměrná výživová hodnota tvarůžků na 100 g je 532 kJ (125 kcal).

17

Tabulka č. 5 Složení olomouckých tvarůžků Složení

Množství (100 g)

Bílkoviny 29,0 g Tuky

0,6 g

Sacharidy 1,0 g

2.3.6

Mikrobiologie sýrů zrajících pod mazem Pro sýry zrající pod mazem se využívají mazové kultury. Zahrnují koryneformní

bakterie, Gram-pozitivní koky a kvasinky. Do skupiny koryneformních bakterií se řadí rody Arthrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium a Microbacterium. Grampozitivní koky jsou reprezentovány rody Micrococcus, Staphylococcus a Kocuria. Z kvasinek jsou zastoupeny především rody Candida, Kluyveromyces a Debaryomyces (Kadlec a kol., 2009). V první fázi se uplatňuje aerobní zrání, kdy se v kyselém prostředí na povrchu tvoří kvasinky. Mezi nejvýznamnější z pohledu zrání sýrů od povrchu dovnitř patří Kluyveromyces

lactis,

Kluyveromyces

marxianus,

Debaryomyces

hanseni,

Sacharomyces cerevisce, Geotrichum candidum, Cryptococcus catenulata, Yarovia lipolitica. Oxidačně odkyselují povrch sýrů přeměnou kyseliny mléčné a mléčnanů na CO2 a H2O. Pomocí proteolytických a lipolytických enzymů kvasinek se tvoří různé sloučeniny, které difundují dovnitř sýra. Kvasinky asimilují laktáty, tvoří alkalické metabolity (NH3), produkují potřebné růstové faktory pro bakterie, působí lipolyticky a proteolyticky a různými metabolity přispívají k tvorbě aroma těchto sýrů. Kvasinky proto nejsou pouze spřaženou mikroflórou v procesu zrání sýrů, ale působí i jako kulturní mikroorganismy pro jejich zrání a tvorbu aroma (Görner a Valík, 2004). Po čase jejich počty klesají a následně se rozvíjí bakteriální složka mazových kultur. Pro správný průběh zracího procesu je nejdůležitějším mikroorganismem Brevibacterium linens, který se může uplatnit na povrchu sýra poté, co přítomná kyselina mléčná je metabolizovaná a neutralizovaná kvasinkami a koky a pH povrchu sýra stoupne k hodnotám pH 6,0 (Bockelmann, 2002). Brevibacterium linens je Gpozitivní halotolerantní až halofilní proteolytická krátká tyčinka s teplotním optimem kolem 21˚C. Dobře roste i v prostředí s 15% NaCl při pH 6,0 – 9,8. Brevibacterium linens

i bakterie rodu Arthrobacter jsou výrazně proteolytické. Degradují kasein,

bílkoviny syrovátky a aminokyseliny za vzniku amoniaku, metioninu a methanthiolu, 18

které vytváří výslednou chuť a vůni sýra. Z ostatních těkavých sloučenin ke vzniku typické chuti a vůně přispívá zejména kyselina máselná, kapronová, fenylmethanol, dimethyldisulfid a dimethyltrisulfid. Brevibacterium linens a zástupci rodu Micrococcus a Corynebacterium zase produkují typické žlutooranžové pigmenty a vytváří tak charakteristické zbarvení povrchu.

19

2.4 Biogenní aminy a polyaminy 2.4.1

Charakteristika biogenních aminů Biogenní aminy (BA) jsou nízkomolekulární organické báze, které vykazují

různou biologickou aktivitu. Jde o produkty metabolismu všech živých organismů. V potravinách a potravinových surovinách vznikají především působením hnilobných a některých mléčných bakterií, jejichž enzymy dekarboxylázy odštěpují karboxyl z aminokyselin. Takto vznikají zejména histamin z histidinu, tyramin z tyrosinu, 2-fenyletylamin z fenylalaninu, tryptamin z tryptofanu a kadaverin z lysinu (Kalač a Křížek, 2002). 2.4.2

Dělení biogenních aminů podle chemické struktury

•

Alifatické: kadaverin (CAD)

•

Aromatické: tyramin (TYR), 2-fenyletylamin (PEA)

•

Heretocyklické: histamin (HIS), tryptamin (TRY)

•

Polyaminy: putrescin (PUT), spermidin (SPD), spermin (SPM), agmatin (AGM)

2.4.3

Charakteristika polyaminů Dříve byly biogenní aminy a polyaminy (PA) zahrnovány do jedné skupiny, nyní

se však uvádějí jako dva typy látek, které se odlišují vznikem a biologickým účinkem. Polyaminy jsou bazické sloučeniny s alifatickou strukturou, které se vyskytují ve všech živých organismech. Uplatňují se zejména při buněčném růstu a proliferaci. V organismu existuje určitá zásoba neboli pool polyaminů, které vznikají endogenní biosyntézou, činností intestinální mikroflóry či příjmem z potravy. Mezi polyaminy patří putrescin, spermidin a spermin. V poslední době byl jako polyamin klasifikován i agmatin, derivát argininu, působící jako neurotransmitér (Larqué, Sabater-Molina, Zamora, 2007). Putrescin se se svým vznikem a strukturou řadí mezi BA, ale protože je prekurzorem spermidinu a sperminu (PUT→SPD→SPM), je zahrnován i do PA (Kalač, 2009).

20

2.4.4

Vznik biogenních aminů a polyaminů

Histidin

Histamin

Obrázek č. 1 Vznik histaminu z histidinu

Tyrosin

Tyramin

Obrázek č. 2 Vznik tyraminu z tyrosinu

Lysin

Kadaverin

Obrázek č. 3 Vznik kadaverinu z lysinu

Tryptofan

Tryptamin

Obrázek č. 4 Vznik tryptaminu z tryptofanu

21

Arginin

Citrulin AGMATIN Ornithin

N – karbamoylputrescin

S – adenosylmetionin

PUTRESCIN

Dekarboxylovaný S- adenosylmethionin

Aminpropyl

SPERMIDIN

SPERMIN

Obrázek č. 5 Biosyntéza polyaminů (upravený obrázek dle Lima a Glória, 1999 cit. dle Önal, 2007)

22

2.5 Faktory ovlivňující tvorbu biogenních aminů v potravinách 2.5.1

Faktory ovlivňující tvorbu biogenních aminů v potravinách

Podmínky vzniku biogenních aminů v potravinách jsou následující: •

Přítomnost aminokyselin v substrátu

•

Přítomnost mikroorganismů s dekarboxylázovou aktivitou

•

Nastolení vhodných podmínek pro růst, množení mikroorganismů a syntézu dekarboxyláz

Biogenní aminy se tvoří v potravinách na základě dekarboxylační aktivity bakteriálních enzymů nebo enzymů přítomných v potravinách. Tvorbu biogenních aminů lze tedy ovlivnit omezením bakteriálního růstu nebo inhibicí aktivity daných enzymů. Mikroorganismy a jejich enzymovou aktivitu je možno ovlivnit celou řadou faktorů jako je teplota, doba skladování, pH, obsah solí, přítomnost kyslíku, vodní aktivita nebo přítomnost kofaktorů dekarboxyláz např. pyridoxal, pyridoxin (Bover-Cid a Holzapfel, 1999). Jedním z nejvýznamnějších faktorů, které ovlivňují aktivitu mikrobiálních dekarboxylačních enzymů, je dostupnost substrátu. Význam má nejen přítomnost volných aminokyselin, ale také přítomnost využitelných cukrů v potravině. Jako optimální se uvádí koncentrace glukózy v rozmezí od 0,5 do 2,0%. Zatímco 3,0% glukózy v substrátu již inhibuje syntézu enzymů (Silla Santos, 1996). Dalším významným faktorem je teplota. Obecně platí, že množství BA se zvyšuje s dobou skladování a se zvyšující se teplotou. Tepelná úprava ovlivňuje množství vznikajících BA a PA v potravinách jen nepatrně. Obsah sperminu při vaření klesá, kdežto histamin je termostabilní a jeho koncentrace se během vaření nemění (Adams a Nout, 2001). Optimální hodnota pH pro aktivitu většiny dekarboxylačních enzymů a produkci biogenních aminů je slabě kyselá (5,0 – 5,5). Závisí také na druhu dekarboxylačního mikroorganismu. Nižší hodnoty pH inhibují bakterie čeledi Enterobacteriaceae, zatímco bakterie mléčného kvašení jsou tolerantní proti kyselejšímu prostředí (BoverCid a Holzapfel, 1999).

23

Přítomnost solí obecně inhibuje tvorbu biogenních aminů, ale na druhé straně histamin nebo tyramin působí na některé bakterie osmoprotektivně a jeho syntéza je tedy v přítomnosti NaCl v některých případech zvýšena (Komprda, 2005). Dalším faktorem je kyslík, ten může podporovat nebo omezovat tvorbu BA v závislosti na mikroorganismech aerobních, anaerobních a fakultativně anaerobních. Omezení růstu mikroorganismů s dekarboxylázovou aktivitou a tím i výskyt BA je podmíněn také přítomností konzervačních prostředků v potravinách. Např. některé koření a bylinky mohou mít antibakteriální vlastnosti. Také antibiotika v potravinách potlačují vznik BA (Adam a Nouts, 2001). Odstranění již jednou vzniklých biogenních aminů a polyaminů je velmi obtížné. K částečnému snížení obsahu aminů dochází v tepelně zpracovaných výrobcích jejich reakcí s redukujícími cukry, respektive s rozkladnými produkty cukrů v reakci Maillarda. Nejvhodnějším způsobem výroby potravin obsahujících malé množství BA je však dodržování technologických postupů a hygienických podmínek výroby, které brání jejich vzniku (Velíšek, 2002). 2.5.2

Výskyt biogenních aminů a polyaminů v potravinách Výskyt BA lze očekávat v každé potravině, která obsahuje proteiny či volné

aminokyseliny a jsou-li v ní vhodné podmínky pro rozvoj mikroorganismů. Celkové množství BA se liší v závislosti na původu potraviny a přítomnosti mikroorganismů. BA mohou být přítomny v mnoha potravinách jako jsou ryby a rybí produkty, masné výrobky, mléčné výrobky, vejce, víno, pivo, zelenina, ovoce, ořechy a čokoláda (Silla Santos, 1996). Z hlediska výskytu se obvykle potraviny dělí na nefermentované, v nichž BA vznikají především činností hnilobných bakterií, a na fermentované, v nichž je rozhodující působení bakterií mléčného kvašení. Vyšší hladiny spermidinu lze očekávat v potravinách rostlinného původu (květák, luštěniny, brokolice), zatímco spermin je typický pro potraviny živočišného původu (maso, masné výrobky). Vyšší množství putrescinu bylo zaznamenáno v citrusových plodech, džusech, kyselém zelí, kečupu, fermentovaných sójových produktech, rybách. Obsah všech polyaminů byl detekován i v sýrech, a to hlavně zrajících (Kalač a Krausová, 2005). Obvyklé obsahy jednotlivých aminů v potravinách se pohybují v řádu jednotek až desítek miligramů v kilogramu, hodnoty ve stovkách mg.kg-1 se již pokládají za vysoké

24

až velmi vysoké. Vyjímečně dochází i k překročení hladiny 1000 mg.kg-1 (Kalač a Křížek, 2005). 2.5.2.1 Výskyt biogenních aminů a polyaminů v sýrech Vedle ryb jsou sýry nejčastěji uváděnou potravinou spojovanou s intoxikací BA. Sýry představují ideální prostředí pro tvorbu BA, které vznikají převážně dekarboxylací volných aminokyselin za působení bakteriálních dekarboxyláz. Koncentrace volných aminokyselin v původní surovině i v nezrajícím sýru jsou tak nízké, že působením dekarboxyláz by vzniklo netoxické množství BA. V nekontaminovaném mléce obsah BA nepřesahuje 1mg.kg-1 (Standarová, Borkovcová, Vorlová, 2008). Proteolýza je tedy podmínkou vzniku toxického množství BA v sýrech. Při zrání sýru je proteolýza mléčných bílkovin považovaná za jeden z nejdůležitějších pochodů, které ovlivňují výslednou kvalitu sýra. Působením nativních enzymů z mléka, proteáz zákysových kultur, syřidlových enzymů a proteáz kontaminující mikroflóry probíhá rozsáhlá proteolýza, při které jsou mléčné bílkoviny rozkládány až na aminokyseliny (Greif a Greifová, 2006). Sýry obvykle obsahují jednotky až stovky mg.kg-1 histaminu, tyraminu, putrescinu a kadaverinu, jednotky až desítky mg.kg-1 2-fenyletylaminu a velmi malá množství tryptaminu. Obsahy BA však mohou vyjímečně dosáhnout až gramových množství v 1 kg sýra, což závisí na ošetření výchozí suroviny a technologických faktorech, jako jsou teplota sýřeniny, použití startovacích a plísňových kultur. Významné množství bylo zjištěno u sýrů z nepasterovaného mléka (Standarová, Borkovcová, Vorlová, 2008). Využitím vhodných startovacích kultur v sýrařské technologii je možné významně snížit koncentraci histaminu, ale i putrescinu a kadaverinu v sýrech. Nizin produkovaný Lactococcus Lactis a Enterococcus EFS 2 a Enterocin 4 produkovaný Enterococcus faecalis výrazně inhibují růst mikroorganismů produkujících histamin v sýrech, jehož producenti jsou zejména Lactobacillus buchneri a Lactobacillus brevis. BA lze fyziologicky deaktivovat použitím mikroorganismů, které mají aminooxidázovou aktivitu, kam patří např. Brevibacterium linens, který snižuje množství tyraminu a histaminu během zrání sýrů (Leuschner a kol., 1998). Příčinou otrav ze sýrů jsou vysoké obsahy tyraminu nebo histaminu. Nejvyšší obsahy těchto aminů jsou v sýrech zrajících pod mazem (typu tvarůžků, romaduru) a v sýrech

poloměkkých

a

plísňových.

Další

25

skupinou

jsou

sýry

vyráběné

z nepasterovaného mléka a za zhoršených hygienických podmínek, např. brynza. V tvrdých sýrech holandského typu jsou hladiny aminů nižší (Křížek a Kalač, 2005). I přestože jsou sýry vhodným substrátem pro tvorbu biogenních aminů, minimální výskyt otrav ukazuje, že při zachování správných technologických postupů se možnosti jejich tvorby minimalizují (Görner a Valík, 2004) Tabulka č. 6 Koncentrace BA a PA ve vybraných typech sýrů (Standarová, Borkovcová, Vorlová, 2008) Koncentrace BA mg.kg-1 Vzorek

TRY PEA PUT CAD HIS TYR SPD SPM x

7,7

4,8

29,5

20,8 37,8 206

3,5

3,8

Sýry s vysokodohřívanou sýřeninou xmin

1,2

ND

1,2

1,1

1,4

0,8

0,8

(a=32)

xmax

31,2 6,2

223

233

151 1123 6,7

9,1

x

2,0

1,5

37,7

66,9 12,6 70,2 1

2,4

Sýry s nízkodohřívanou sýřeninou

xmin

0,6

0,6

0,7

ND

0,6

3,4

0,4

0,6

(a=21)

xmax

8,2

5,8

184

432

58

360

2,7

11,3

x

2,3

1,8

61,3

51,5 8,2

12,9 5,3

0,9

Sýry s plísní na povrchu

xmin

0,4

0,3

17,9

0,3

0,6

0,4

0,1

(a=25)

xmax

8,8

9

266

388

116 187

x

2

5,6

28,5

37,9 8,3

63

17,7 1,8

Sýry s plísní uvnitř hmoty

xmin

0,6

0,3

7,3

ND

0,6

3,4

0,4

(a=24)

xmax

26

30,5 123

699

38

444

39,7 2,9

x

3,1

13

161

300

56,1 121

Měkké zrající sýry

xmin

0,5

5,5

4,2

7,8

8,1

(a=35)

xmax

49,2 53,2 591,1 1110 283 417

26,1 10,8

x

4,2

1,3

22

70,2 74

109

1,2

1

Kozí sýry

xmin

1,2

ND

1,4

ND

3

3

ND

ND

(a=10)

xmax

8

2,8

66,2

296

272 326

2

2

x

1,2

1,1

12,9

3,4

1,1

7,2

0,6

0,8

Tavené sýry přírodní

xmin

0,6

0,4

0,6

0,3

0,6

0,5

0,2

0,3

(a=12)

xmax

6,1

2,1

55,8

13,8 6,4

27,8 3,6

1,7

x

1,9

3,9

86,2

28,2 2,5

38,8 1,3

2,9

Tavené sýry ochucené

xmin

0,4

0,3

0,6

0,1

0,4

0,4

0,5

(a=12)

xmax

11,8 34,8 4219 242

16,7 161

5,5

6,8

0,6

3,4

0,6

12,5 29,8

0,6

8,1

7,2

28,1 ND

0,8

Vysvětlivky: x – průměrná hodnota, xmin – minimální naměřená hodnota, xmax – maximální naměřená hodnota, ND – nedetekováno 26

2.6 Fyziologické funkce a toxikologické účinky biogenních aminů a polyaminů v organismu člověka 2.6.1

Fyziologické funkce biogenních aminů a polyaminů BA mají v organismu významnou roli, neboť jsou zdrojem dusíku a prekurzory

hormonů, nukleových kyselin či proteinů. V potravinách jsou zase nositely aroma. Katecholamin, indolamin a histamin mají významné funkce v metabolismu, zejména v nervovém systému a při ovlivňování krevního tlaku. 2-fenyletylamin a tyramin způsobují zvýšení krevního tlaku a histamin naopak jeho snížení. Histamin se také účastní primární alergické odezvy organismu. Polyaminy jsou nepostradatelnou složkou pro růst a proliferaci buněk a pro normální funkci imunologického systému střeva. Přestože si tělo dokáže polyaminy samo syntetizovat, určité množství je přijímáno z potravy. Významné jsou i jejich antioxidační účinky. Polyaminy působí příznivě při zpomalování procesu opotřebování a stárnutí buněk. Jejich účinky spočívají ve schopnosti vychytávání volných radikálů. Spermidin a spermin stabilizují hydroperoxid a zháší singletový kyslík. Tyto účinky jsou patrně příčinou protizánětlivého působení při akutních či chronických zánětech v organismu (Kalač, 2009). Bylo prokázáno, že antioxidační efekt je přímo úměrný počtu amino skupin v těchto sloučeninách (Silla Santos, 1996). 2.6.2

Toxikologické účinky a toxické dávky biogenních aminů a polyaminů Přestože jsou biogenní aminy a polyaminy nezbytné v mnoha funkcích

organismu, jejich vysoký příjem v potravinách má toxický efekt. V organismu

člověka

působí

jako

látky

vasoaktivní

a

psychoaktivní.

Psychoaktivní aminy (histamin putrescin, kadaverin) ovlivňují nervový systém a působí jako neurální tranzmitéry, zatímco vasoaktivní aminy (2-fenylethylamin, tyramin, tryptamin) jsou součástí vaskulárního systému (McCabe-Sellers a kol., 2006). Konzumace potravy s vyšším obsahem biogenních aminů a polyaminů může vést k různým reakcím v organismu (viz. tabulka č. 7), může dojít i k alimentární intoxikaci (Shalaby, 1996). Histamin způsobuje vazodilataci cév a snížení krevního tlaku, je příčinou otravy z ryb (scombroid poisoning). Tyramin je příčinou migrén a hypertenzních krizí, tzv. reakce na sýr (cheese reaction), zejména u pacientů užívající antidepresiva.

27

Toxikologický

význam

polyaminů

spočívá

v jejich

schopnosti

vytvářet

karcinogenní N-nitrososloučeniny a zvýšit růst chemicky indukovaných (aberativních) ložisek krypt v kolonu. V důsledku účasti PA v buněčném růstu a proliferaci se PA hromadí v nádorové tkáni a jejich obsah se zvyšuje v tělních tekutinách u pacientů s rakovinou. V takovém případě může podávání léků inhibujících biosyntézu PA sloužit k zabránění rozšíření nádorového bujení (Kalač, 2009). Je také nutná kontrola polyaminů přijatých potravou u pacientů s rakovinou (Komprda a kol., 2008). Toxicita polyaminů se zvyšuje s jejich rostoucí molekulovou hmotností a nábojem (Komprda, 2005). Je však nutné uvést, že samy polyaminy nejsou karcinogeny, tudíž nejsou iniciátory nádorového bujení (Kalač a Křížek, 2005). U zdravých jedinců existuje v trávícím traktu poměrně účinný detoxifikační systém, který je schopen metabolizovat normální příjem BA a PA potravou. Rozhodující cestou odbourávání aminů v organismu člověka je oxidace: R-CH2NH-R´ + O2 + H2O → R-CHO +H2N-R´ + H2O2 (Leuschner a kol., 1998). Příslušné enzymy je možno rozdělit na monoaminooxidázy (MAO), diaminooxidázy (DAO) a polyaminooxidázy (PAO). MAO odbourávají především aromatické monoaminy. Jde o mitochondriální enzymy exprimované v játrech, slezině, ledvinách, mozku, plicích a především ve střevě. DAO oxidativně deaminují diaminy (PUT, CAD), nejvyšší aktivitu vykazují v tenkém střevě, v ledvinách a placentě. PAO používají jako substrát především polyaminy spermin a spermidin, mohou však odbourávat i mono a diaminy (Komprda, 2005). Detoxikační kapacita je však značně individuální. Navíc je omezená v dětství a snižuje se s rostoucím věkem (Kalač a Křížek, 2005). Detoxifikační systém může selhávat zejména u alergických jedinců, při příjmu vysokého množství biogenních aminů potravou nebo vlivem inhibitorů aminooxidáz (Adams a Nout, 2001). Jako inhibitory aminooxidačních enzymů působí některé léky ze skupiny psychofarmak, alkohol, kouření apod. Přestože mají putrescin a kadaverin nízkou toxickou aktivitu, vstupují do reakcí s aminooxidázami, inhibují je a násobí toxický efekt histaminu a tyraminu (NovellaRodríguez a kol., 2003). Halász a kol. (1994) popsali obdobné účinky u sperminu a spermidinu, které zvyšují transport histaminu ve střevní stěně a mohou taktéž působit jako potenciátoty účinku histaminu.

28

Podle Halásze a kol. (1994) je toxická dávku histaminu v potravinách 100 mg.kg1, u tyraminu se pohybuje v rozmezí 100 – 800 mg.kg-1 a u 2-fenyletylaminu 30 mg.kg-1. Množství 1000 mg.kg-1 celkové sumy aminů v jídle je považováno pro zdraví nebezpečné (Taylor, 1985 cit. dle Silla Santos, 1996). U citlivých jedinců může 3 mg 2-fenyletylaminu způsobit bolesti hlavy a migrény. Pro osoby požívající léky s inhibitory monoaminooxidáz je nebezpečná dávka 6 mg tyraminu (Vale a Glória, 1998).

Tabulka č. 7 Fyziologické funkce biogenních aminů a polyaminů (Shalaby, 1996) Biogenní aminy,

Prekurzor

Fyziologický efekt v organismu

Histidin

Uvolňování adrenalinu, noradrenalinu

polyaminy Histamin

Kontrakce hladké svaloviny dělohy, střeva a dýchacího ústrojí Stimulace senzorů a motorických neuronů Sekrece žaludečních šťáv Tyramin

Tyrosin

Periferní vasokonstrikce Zvýšení srdečního minutového objemu Slzení a slinění Zrychlení dýchání Zvýšení hladiny cukru v krvi Uvolnění

noradrenalinu

ze

sympatického

nervového systému Migrény Putrescin a kadaverin

Ornitin a

Hypotenze

lysin

Bradykardie Tonická křeč čelistních svalů Paréze okončetin Toxicita dalších aminů

2-fenyletylamin

Fenylalanin

Uvolnění

noradrenalinu

nervového systému Zvýšení krevního tlaku Migrény Tryptamin

Tryptofan

Zvýšení krevního tlaku

29

ze

sympatického

2.6.2.1 Toxicita histaminu Histamin se účastní mnoha reakcí v organismu. Je součást granulí žírných buněk a krevních basofilů. Kromě toho, že vyvolává imunologické reakce organismu (alergické reakce), uvolňuje se do krevního oběhu, kde se váže na membránové receptory a působením na sekreční žlázy ovlivňuje kardiovaskulární systém. Histamin přímo stimuluje srdeční činnost jako výsledek uvolňování adrenalinu a noradrenalinu z nadledvin a způsobuje stahy hladké svaloviny dělohy, střeva, dýchacího ústrojí, stimuluje motorické neurony a řídí sekreční činnost žaludku. Negativní účinky histaminu na organismus člověka se vyznačují kožními projevy, jako je vyrážka, kopřivka, edémy a lokální záněty. Mezi střevní potíže patří nevolnost, zvracení, průjem a břišní křeče. Další příznaky zahrnují hypotenzi, bolesti hlavy, brnění a červenání. V jiných případech se projevily pocity návalu tepla, bronchospasmus, potíže s dýcháním a dušnost. V letech 1976 – 1986 bylo ve Velké Británii vyšetřováno 250 lidí v souvislosti s otravami histaminu a jako nejčastější projevy byly zaznamenány vyrážka, průjem, červenání, pocity tepla a bolesti hlavy (Shalaby, 1996). Histamin je nejběžnější amin, který způsobuje otravy z potravin. Toxický efekt závisí na množství histaminu přijatého potravou, působení jiných aminů, aktivitě aminooxidáz a fyziologickém stavu střeva (Adams a Nout, 2001). Nicméně histamin je běžná součást těla a jeho koncentrace v krvi je přísně regulována (Fox a kol., 2004). 2.6.2.2 Toxicita tyraminu Význam tyraminu přijímaného potravou souvisí zejména s jeho schopností interagovat s inhibitory monoaminooxidáz (MAOI), což jsou léky ze skupin antidepresiv, a následně zvyšovat riziko hypertenzních krizí. Tyramin nepřímo uvolňuje noradrenalin ze sympatického nervového systému a tím způsobuje zvýšení krevního tlaku, zrychlení srdeční činnosti a periferní vasokonstrikci. Tyramin také rozšiřuje zornice, cévy víčka, způsobuje slzení, slinění, zrychlení dechu a zvýšení glykémie. MAOI inhibují enzymy monoaminooxidázy ve střevě, které by normálně odbourávaly tyramin přijatý potravou. To způsobí nárůst tyraminu v krevním oběhu, vzestup krevního tlaku a riziko hypertenzních krizí (Lawley, Curtis, Davis, 2008). Mohou se objevit silné bolesti hlavy, dojít ke krvácení do mozku či k srdečnímu infarktu. Zpočátku byly tyto projevy charakterizovány jako otravy ze sýrů (cheese

30

reaction), ukázalo se však, že stejné příznaky se mohou objevit i po požití jiných potravin jako jsou marinovaní sledi, masné výrobky či kuřecí játra (Shalaby, 1996).

2.7 Hygienický význam biogenních aminů a polyaminů v potravinách Z hygienického hlediska mohou BA u nefermentovaných potravin sloužit jako indikátory nežádoucí mikrobiální činnosti a jejich stanovení může být využito k posouzení míry rozkladu sledovaného materiálu. V případě skladování potravin může být obsah BA ukazatelem jakosti vstupní suroviny a úrovně hygieny během výrobního procesu a skladování (Standarová, Borkovcová, Vorlová, 2008). V této souvislosti byl zaveden tzv. index biogenních aminů (BAI), který využívá skutečnosti, že obsah histaminu, putrescinu a kadaverinu se v průběhu skladování daného produktu zvyšuje, na druhé straně se však množství polyaminů spermidinu a sperminu nemění nebo dokonce snižuje. SPD a SPM totiž primárně nevznikají činností mikrobiálních dekarboxyláz v potravině, ale vstupují do ní jako původní látky z použité suroviny.

Index biogenních aminů se uvádí jako:

BAI =

HIS + PUT + CAD [mg.kg-1], (1 + SPD + SPM )

čím je podíl indexu biogenních aminů vyšší, tím je kvalita a senzorické vlastnosti potravin horší (Komprda, 2004). V některých zemích byly maximální limity BA v určených potravinách stanoveny zákonem. Česká legislativa do roku 2004 obsahovala legislativní limity pro vybrané biogenní aminy v rybách, sýrech, pivu a vínu, ale nyní je v České republice platný pouze hygienický limit pro nejvyšší přípustné množství histaminu v rybách a rybích výrobcích 100 mg.kg-1, uvedený v Nařízení komise (ES) č. 2073/2005. Tento limit může být ve dvou vzorcích z devíti z jedné šarže překročen až do hodnoty 200 mg.kg-1. Legislativa neurčuje povinnost výrobcům uvádět množství biogenních aminů na obale.

31

2.8 Mikroorganismy produkující biogenní aminy 2.8.1

Mikroorganismy s dekarboxylázovou aktivitou Mezi bakterie schopné produkovat biogenní aminy patří mnoho druhů

mikroorganismů, které mají specifické dekarboxylázy. Dekarboxylázy jsou enzymy spadající do tříd lyáz. Existuje šest aminokyselinových dekarboxyláz, které jsou specificky orientované na L-izomery aminokyselin tyrosinu, lysinu, ornithinu, argininu, histidinu a kyseliny glutamové. Tyto enzymy jsou rozšířené u živočichů, rostlin i mikroorganismů, zejména u bakterií vykazují dekarboxylázy výraznou aktivitu. Dekarboxylační aktivitu vykazují rody Bacillus, Citrobacter, Clostridium, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Pediococcus, Streptococcus, Laktobacillus, Photobacterium (Silla Santos, 1996), Enterococcus, Hafnia, Morganella (Halász a kol., 1994). Schopnost dekarboxylázové aktivity je nejčastější u laktobacilů, pediokoků, enteroků a bakterií čeledi Enterobacteriaceae (Halász a kol., 1994).

32

Tabulka č. 8 Významné mikroorganismy produkující biogenní aminy (Velíšek, 2002) Potravina

Mikroorganismy

Ryby

Morganella

Produkované aminy morganii,

pneumonia,

Hafnia

alvei,

Klebsiella Histamin,

tyramin,

Proteus kadaverin,

putrescin,

mirabilis, Proteus vulgaris, Clostridium agmatin, perfringens,

Enterobacter

spermin,

aerogenes, spermidin

Bacillus sp., Staphylococcus xylosus Sýry

Lactobacillus buchneri, L. bulgaricus, L. Histamin,

kadaverin,

plantarum, L. casei, L. acidophilus, L. putrescin,

tyramin,

arabinosae, Streptococcus faecium, S. tryptamin mitis,

Bacillus

macerans,

Propionibacterium sp. Maso a masné Pediococcus

sp.,

Lactobacillus

sp., Histamin,

výrobky

sp.,

Streptococcus

sp., putrescin, tyramin, 2-

Pseudomonas

kadaverin,

Micrococcus sp., čeleď Enterobacteriaceae fenylethylamin, tryptamin Fermentovaná

Lactobacillus

plantarum,

Leuconostoc Histamin,

zelenina

mesenteroides, Pediococcus sp.

kadaverin,

putrescin, tyramin, 2fenylethylamin, tryptamin

Fermentované

Rhizopus

oligosporus,

Trichosporon Histamin,

produkty ze sóji

beiglii, Lactobacillus plantarum

putrescin,

kadaverin, tyramin,

tryptamin

2.8.2

Mikroorganismy produkující biogenní aminy v sýrech Mezi hlavní mikroorganismy produkující biogenní aminy v sýrech jsou bakterie

mléčného kvašení přidávané jako startovací kultury (Fernandéz-Garcia, 2000 cit. dle Komprdy a kol., 2007). Jde zejména o Lactobacillus lactis, L. bulgaricus atd. Dále jsou to nezákysové bakterie mléčného kvašení, které jsou tvořeny zejména mezofilními laktobacily (Latobacillus casei, L. rhamnosus, L. paracasei, L. plantarum. L. curvatus) a pediokoky (P. acidilactici, P. pentosaceus). Tyto bakterie pochází zejména z nepasterovaného mléka, u sýrů vyráběných z mléka pasterovaného je jejich zdrojem

33

rekontaminace mléka ze zařízení či z předešlé výroby. Mezi další mikroorganismy uplatňující se při tvorbě biogenních aminů v sýrech je spontánní mikroflóra mléka, zejména enterokoky (Roig-Saguéz, 2002 cit. dle Komprdy a kol., 2007). 2.8.3

Charakteristika významných mikroorganismů produkujících biogenní aminy

2.8.3.1 Bakterie mléčného kvašení (BMK) Mezofilní bakterie mléčného kvašení jsou bakterie, které za podmínek specifikovaných normou vytvářejí kolonie na tuhé selektivní půdě (MRS o pH = 5,7) po inkubaci při 30˚C za dobu 72 hodin (ČSN ISO 15214). Jde zejména o gramnegativní, nesporulující, nepohyblivé tyčinky a koky, které za fakultativně anaerobních (mikroaerofilních) podmínek fermentují sacharidy a produkují hlavně kyselinu mléčnou. Někteří zástupci bakterií mléčného kvašení se přidávají do potravin jako kulturní či startovací mikroflóra nebo jako probiotika. Jedná se zejména o bakterie rodu Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus a Pediococcus (Burdychová a Sládková, 2007), Enterococcus, Leuconostoc a nově rod Bifidobacterium (Görner a Valík, 2004). Kromě mléka a mléčných výrobků se vyskytují na rostlinách a rostlinných materiálech, v trávícím traktu zvířat a lidí, v dutině ústní a na sliznicích člověka, ve fermentované zelenině, trvanlivých tepelně neopracovaných salámech apod. Potravině BMK udělují konzervační vlastnosti, prodlužují její trvanlivost a vytváří v ní podmínky, které jsou nevhodné pro nežádoucí (patogenní) bakterie. Konzervační vlastnosti potraviny jsou dány zejména produkcí kyseliny mléčné popř. dalších kyselin a snížením pH pod 4, tvorbou nízkého redox potenciálu a tvorbou bakteriocinů. Bakterie mléčného kvašení se mohou řadit podle produktů fermentace sacharidů na homofermentativní (Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Enterococcus, Lactobacillus),

které

sacharidy

zkvašují

výhradně

na

kyselinu

mléčnou

a

heterofermentativní (Leuconostoc, Lactobacillus), které fermentují sacharidy na kyselinu mléčnou, octovou, CO2, etanol (Šilhánková, 2008).

34

2.8.3.2 Bakterie rodu Enterococcus (ENC) Enterokoky jsou gram pozitivní, fakultativně anaerobní, kataláza negativní koky, které se nejčastěji vyskytují v párech nebo vytváří krátké řetízky. Většina enterokoků je nepohyblivá. Schopnost pohybu některých kmenů je dána přítomností jednoho nebo dvou bičíků a je typická pro kmeny druhu E. casseliflavus, E. gallinrum. Enterokoky se vyznačují značnou fyziologickou odolností. Optimální teplota je 37˚C, ale rostou i při 10 a 45 ˚C. Snáší 6,5 % NaCl, pH 9,6, 40% žluč a přežívají teplotu 60 ˚C po dobu 30 minut (Franz a kol., 2003). Enterokoky se vyskytují v různém prostředí zejména proto, že jsou schopny přežívat a množit se i ve velmi nepříznivých podmínkách. Běžně osidlují gastrointestinální trakt lidí a zvířat. Jsou důležitou součástí střevní mikroflóry, zejména tlustého střeva. Enterokoky se v některých státech používají jako indikátorové organismy. Ve vodě rychle odumírají, proto jejich přítomnost ve vodě poukazuje na nedávné (čerstvé) fekální znečištění. Potraviny živočišného i rostlinného původu po mikrobiální fermentaci obsahují značné množství enterokoků, které se v nich považují za složky přirozeného mikrobiálního společenstva a uplatňují se zde na tvorbě senzoricky aktivních látek (vůně a chuť). Jeho pozitivní význam spočívá ve schopnosti zkvašovat glukózu na kyselinu mléčnou, čehož se v potravinářství využívá při výrobě masných a mléčných výrobků. Některé kmeny Enterococcus faecium byly popsány jako probiotické. Mezi nejvýznamnější druhy patří E. faecalis, E. faecium, E. durans, E. gallinarum, E. casseliflavus, E. avium.

2.9 Metody stanovení biogenních aminů a polyaminů Stanovení biogenních aminů a polyaminů je možné pomocí některé ze separačních technik: tenkovrstvé chromatografie, plynové chromatografie, kapilární elektroforézy, ale nejčastěji používaná technika je HPLC. Zde lze stanovit celou řadu aminů chromatografií na reversní fázi nebo iontově výměnnou chromatografií (Kubáň, 2007). Pro detekci se využívá UV nebo fluorescenční detektor. Začala se používat také elektrochemická, konkrétně amperometrická detekce nebo detekce pomocí nukleární magnetické rezonance (Gosetti a kol., 2007). Často se využívá spojení HPLC nebo GC s hmotnostní spektrometrií, zvláště pokud dochází ke koeluci více látek. 35

Kromě těchto osvědčených separačních technik byly popsány i další možnosti stanovení BA a PA v potravinách. Marcobal a kol. (2005) uvedli, že pro stanovení histaminu ve vínech lze použít enzymovou imunochemickou analýzu (ELISA). Stanovení celkového množství aminů v rybách lze podle Draisci a kol. (1998), provést pomocí elektrochemických biosenzorů. Přestože existuje řada metod pro stanovení biogenních aminů, vzhledem k různorodosti materiálu, žádná z nich není univerzální. 2.9.1

Obecný princip chromatografie Chromatografie je moderní separační technika, která slouží kromě preparativních

účelů také k chemické analýze. Tato metoda je založena na rovnovážné distribuci složek mezi dvě vzájemně nemísitelné fáze. Stacionární fáze je nepohyblivá, mobilní pohyblivá. Vzorek se umístí na začátek stacionární fáze a pohybem mobilní fáze přes stacionární je touto soustavou unášen. Při dělení dochází k opakovanému vytváření rovnovážných stavů separovaných látek mezi oběma fázemi. Složky vzorku mohou být stacionární fází zachycovány, a proto se v koloně zadržují. Tím dochází k postupné separaci složek, kdy každá z nich má jiný retenční čas, neboli dobu, kterou setrvává v koloně.

2.9.2

Rozdělení chromatografických metod

 Podle skupenství mobilní fáze:

Kapalinová Plynová

 Podle uspořádání stacionární fáze:

Sloupcová Plošná

 Podle povahy děje při separaci:

Rozdělovací Adsorpční Iontově – výměnná Gelová Afinitní

36

2.9.3

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) Vysokoúčinná kapalinová chromatografie je analytická metoda, která slouží k

separaci, identifikaci a kvantifikaci obsahu sledovaných látek v mobilní fázi. Je používána více jak padesát let a je jednou z hlavních analytických metod.

Kapalinový chromatogram se skládá z těchto částí: -

Zařízení pro uchování a transport mobilní fáze

-

Zařízení pro dávkování vzorku

-

Zařízení pro separaci látek

-

Zařízení pro detekci látek

Protože matrice vzorku obsahuje kromě BA a PA řadu dalších interagujících látek, je nutno nejdříve provést předčištění a izolaci stanovovaných složek. Pro extrakci z pevného vzorku se využívají různá organická rozpouštědla jako je kyselina chlorovodíková, trichloroctová, chloristá, petrolether atd. Dalším krokem úpravy vzorku před nástřikem na kolonu je derivatizace. Provádí se velice často pro zvýšení citlivosti a rozlišení. Byly popsány metody derivatizace před kolonou, přímo v koloně a za kolonou. Při UV detekci a kratších elučních časech se jako vhodné derivatizační činidlo prokázal dansyl chlorid (DCl). O-ftaldialdehyd (OPA) je vhodné použít při spektrofluorometrické detekci a delších elučních časech (Innocente a kol., 2007). Mezi další používaná derivatizační činidla patří dabsyl chlorid, benzoyl chlorid, fluorescein, 9-fluoromethyl chloroformát, naftalen-2,3 dikarboxaldehyd. Mobilní fáze je při tzv. izokratických podmínkách tvořena jednou látkou, při gradientové eluci jde o směs kapalin, jejichž vzájemný poměr je v průběhu procesu měněn tak, aby se postupně zvyšovala eluce sledovaných látek. Při izokratické eluci je mobilní fáze vedena do zásobníku mobilní fáze a vysokotlakého čerpadla. Při gradientové eluci se přiváděné proudy dvou nebo více zásobníků mísí podle programu ve směšovači, který je zařazen před nebo za vysokotlakým čerpadlem. Je nutné provést odplynění mobilní fáze, která je dále vedena přes dávkovací zařízení do chromatografické kolony, kde dochází k vlastní separaci. Kolona je přímo spojena s detektorem, který zachytí signál a s vyhodnocovacím zařízením umožňujícím zaznamenání signálu pomocí chromatogramu. Identifikace se provádí porovnáním retenčních časů standardů a přítomných látek ve vzorku.

37

3

CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce bylo stanovit množství biogenních aminů a polyaminů

v sýrech zrajících pod mazem a zjistit množství vybraných skupin mikroorganismů s dekarboxylázovou aktivitou. Dále bylo cílem posoudit vliv různých faktorů na tvorbu BA, PA a mikroorganismů v těchto sýrech. Sledovanými faktory byly jednotlivé fáze výroby sýra (respektive stáří výrobku), tvar sýrů (kolečka, tyčinky), doba skladování (0, 35, 56 dnů) a teplota při skladování (5˚C, 20˚C).

38

4

MATERIÁL A METODIKA

4.1 Materiál V rámci experimentu byly analyzovány vzorky sýrů zrajících pod mazem. Šlo o pravé olomoucké tvarůžky, které poskytl monopolní výrobce v ČR A. W. spol. s. r. o. Loštice. Vzorky sýrů byly odebírané během jarního období v několika fázích během celého výrobního procesu. Prvním odebraným vzorkem byla vstupní surovina (průmyslový tvaroh), dále se analyzovala upravená vstupní surovina (nasolený průmyslový tvaroh) a tvaroh po formování. Protože se jedná o tzv. zrající sýry, další odběr se prováděl během zrání, ve fázi osušení a odvětrání. Následně se prováděl odběr před balením výrobku, tedy po ukončení zrání ve zracích místnostech. Další vzorky tvořily již zabalené hotové výrobky analyzované v poslední den jejich minimální trvanlivosti (35. den). Poslední vzorky byly odebírány 56. den od zabalení, takže šlo o vzorky skladované po uplynutí doby minimální trvanlivosti. Tyto vzorky již nesloužily pro lidský konzum, ale pouze pro zjištění tendence nárůstu BA a PA po delší době skladování. V experimentu byl sledován vliv dvou různých tvarů výrobku (kolečka, tyčinky) stejného typu sýru. U skladovaných zrajících sýrů se navíc sledoval vliv různé teploty, neboť se odběr prováděl vždy při 5 a 20˚C.

Tabulka č. 9 Popis odběru vzorků ve výrobním procesu Číslo

Druh odběru (technologický proces)

odběru 1

Průmyslový tvaroh

2

Nasolený průmyslový tvaroh

3

Po formování

+

4

Po sušení, odvětrání

tyčinky

5

Po zrání

6

Konec doby trvanlivosti (35. den), skladovaný při 5˚C

7

Konec doby trvanlivosti (35. den), skladovaný při 20˚C

8

Po 56 dnech, skladovaný při 5˚C

9

Po 56 dnech, skladovaný při 20˚C

Kolečka

39

4.2 Metodika 4.2.1

Stanovení biogenních aminů metodou HPLC Z každého vzorku bylo po jejich homogenizaci naváženo 10 g (± 1 mg) do 85 ml

zkumavky, do níž bylo dále přidáno 0,5 ml vnitřního standardu (1, 7-diaminoheptanu o koncentraci 1mg.ml-1). Vzorky byly extrahovány 2 minuty s 30 ml 0,1 M HCl. Vzniklá suspenze byla centrifugována po dobu 10 minut při 4°C a rychlosti 3000 rpm (Hettich Universal 32R, Hettich, Německo). Supernatant byl filtrován přes papírový filtr a pevný podíl byl opět extrahován. Spojené supernatanty byly doplněny na 50 ml 0,1 M HCl. Z extraktu byl napipetován 1 ml do vialky (8 ml) k němu bylo přidáno 0,5 ml nasyceného Na2CO3 a 1 ml derivatizačního činidla dansylchloridu (5-dimethylaminoheptan-sulfonil chlorid, DCL), směs byla promíchána 1 minutu (MS2 Minishaker IKA, IKA Werme GmbH, Staufen, Německo). Derivatizace probíhala 1 hodinu při teplotě 40 °C. Dále bylo přidáno 0,250 ml roztoku NH3, suspenze byla řádně promíchána. Přidaný amoniak zreagoval se zbytkem dansylchloridu, hydrofobní deriváty aminů byly následně třikrát extrahovány diethyletherem v množství 1 ml. Organická fáze byla odpařena dosucha dusíkem a vzniklý odparek byl rozpuštěn v 1 ml acetonitrilu (ACN). Roztok byl zfiltrován přes nylonový membránový filtr 0,45 µm a nastříknut na chromatografickou kolonu. BA a PA byly separovány pomocí kapalinového chromatografu HP 1100 (Agilent Technologies, Wilmington, USA) složeného z kvartérní pumpy (G1311A), vakuového degaseru (G1322A), autosampleru (G1313A) a UV/VIS detektoru s proměnnou vlnovou délkou (G1314A). Separace po derivatizaci DCL byla provedena pomocí gradientové eluce H2O/ACN na koloně Zorbax Elipse XDB C18 s předkolonou Meta Gard ODS-2 při průtoku 0,8 ml.min-1 s použitím fotometrického UV/VIS detektoru při 245 nm. Byly stanoveny biogenní aminy: tyramin, histamin, 2fenyletylamin, kadaverin a polyaminy: putrescin, spermin a spermidin. Výsledky byly zpracovány a vyhodnoceny metodou jednoduchého třídění analýzy rozptylu (v programu Statistika verze 9 StatSoft.).

Stanovení biogenních aminů a polyaminů jsem neprováděla osobně, naměřené hodnoty jsem převzala, výsledky jsem sama dále zpracovala, interpretovala a použila pro ucelení výsledků mikrobiologických rozborů ve své Diplomové práci.

40

4.2.2

Stanovení mikroorganismů

4.2.2.1 Celkový počet mikroorganismů (CPM) Příprava media: Plate count agar (PCA) Trypton

5,0 g.l-1

Kvasniční extrakt

2,5 g.l-1

Glukóza

1,0 g.l-1

Bakteriologický agar

12,0 g.l-1

Do skleněné reagenční láhve bylo naváženo 6,15 g dehydratované půdy, která byla zalita jedním litrem destilované vody, směs se promíchala a nechala nabobtnat. Následně byla provedena sterilace v autoklávu při teplotě 121°C po dobu 20 minut. Po ukončení sterilace byla reagenční láhev se sterilní půdou vložena do vodní lázně vytemperované na teplotu 45°C.

Kultivace celkového počtu mikroorganismů U homogenizovaných vzorků bylo provedeno dekadické ředění. Do Petriho misek byl odpipetován vždy 1 ml vzorku. Inokulum bylo zalito kultivační půdou (Plate count agar, NOACK, Francie) ochlazenou na 45°C. Po zatuhnutí byly naočkované plotny inkubovány při teplotě 30°C po dobu 72 hodin za aerobních podmínek.

4.2.2.2 Bakterie mléčného kvašení (BMK) Příprava média: MRS agar (Man, Rogosa a Sharp) Polypepton

10,0 g.l-1

Masový extrakt

10,0 g.l-1

Kvasniční extrakt

5,0 g.l-1

Glukóza

20,0 g.l-1

Tween 80

1,08 g.l-1

Fosforečnan draselný

2,0 g.l-1

Octan sodný

5,0 g.l-1

41

Citrát sodný

2,0 g.l-1

Síran hořečnatý

0,2 g.l-1

Síran manganatý

0,05 g.l-1

Bakteriologický agar

15,0 g.l-1

Do skleněné reagenční láhve bylo naváženo 21,09 g dehydratované půdy, která byla zalita jedním litrem destilované vody, směs se promíchala a nechala nabobtnat. Následně byla provedena sterilace v autoklávu při teplotě 121°C po dobu 20 minut. Po ukončení sterilace byla vložena reagenční láhev se sterilní půdou do vodní lázně vytemperované na 45°C.

Kultivace bakterií mléčného kvašení U homogenizovaných vzorků bylo provedeno dekadické ředění. Do Petriho misek byl odpipetován vždy 1 ml vzorku. Inokulum bylo zalito selektivní živnou půdou (MRS, NOACK, Francie) ochlazenou na 45°C. Po zatuhnutí byly naočkované plotny inkubovány při teplotě 30°C po dobu 72 hodin anaerobně.

4.2.2.3 Bakterie rodu Enterococcus (ENC) Příprava media: Slanetz – Bartley agar Tryptóza

20,0 g.l-1

Kvasniční extrakt

5,0 g.l-1

Glukóza

2,0 g.l-1

Fosforečnan draselný

4,0 g.l-1

Azid sodný

0,4 g.l-1

2, 3, 5 – trifenyltetrazoliumchlorid (TTC)

0,1 g.l-1

Bakteriologický agar

10,0 g.l-1

Do skleněné reagenční láhve bylo naváženo 12,45 g dehydratované půdy, která byla zalita jedním litrem destilované vody, směs se promíchala a nechala 10 minut nabobtnat.

42

Poté se půda rozvářela až do úplného rozpuštění agaru a následně byla přenesena do vodní lázně vytemperované na 45°C. Těsně před zaléváním inokula se do kultivační půdy napipetoval suplement TTC.

Kultivace bakterií rodu Enterococccus U vzorků bylo po jejich homogenizaci provedeno dekadické ředění. Do Petriho misek byl nepipetován 1 ml vzorku. Inokulum v miskách bylo zalito asi 15 ml rozehřáté půdy

Slanetz-Bartley

(NOACK,

Francie)

se

suplementem

TTC

(2,3,5-

trifenyltetrazolium chlorid). Obsah v misce byl řádně promíchán a nechán zatuhnout. Následně byly naočkované plotny inkubovány 24 hodin při teplotě 37˚C v aerobním prostředí.

4.2.2.4 Plísně a kvasinky Příprava media: Chloramphenicol glukose agar (CHGA) Kvasniční extrakt

5,0 g.l-1

Glukóza

20,0 g.l-1

Chloramfenikol

0,1 g.l-1

Bakteriologický agar

15,0 g.l-1

Do skleněné reagenční láhve bylo naváženo 12,03 g dehydratované půdy, která byla zalita jedním litrem destilované vody. Směs se promíchala a nechala 10 minut nabobtnat. Následně byla provedena sterilace v autoklávu při teplotě 121°C po dobu 20 minut. Po ukončení sterilace byla reagenční láhev se sterilní půdou vložena do vodní lázně předem vytemperované na 45°C.

Kultivace kvasinek a plísní Po homogenizaci vzorků a dekadickém ředění bylo do Petriho misek sterilní pipetou přeneseno po 1 ml suspenze. Inokulum bylo zalito rozehřátou půdou CHGA (NOACK, Francie) a po promíchání ponecháno zatuhnout. Kultivace probíhala při 25°C tři až pět dní.

43

4.2.2.5 Bakterie rodu Brevibacterium (BREVI) Příprava media M17 Agar (Gelose M17) Trypton

2,5 g.l-1

Pepticky natrávené maso

2,5 g.l-1

Papaicky natrávená soja

5,0 g.l-1

Kvasniční extrakt

2,5 g.l-1

Masový extrakt

5,0 g.l-1

Laktóza

5,0 g.l-1

Glycerolfosfát sodný

19,0 g.l-1

Síran hořečnatý

0,25 g.l-1

Kyselina askorbová

0,5 g.l-1

Bakteriologický agar

15,0 g.l-1

Do skleněné reagenční láhve bylo naváženo 17,16 g dehydratované půdy a zalito jedním litrem destilované vody. Po nabobtnání byla láhev s půdou vložena do autoklávu a sterilizována 121°C 20 minut. Sterilní půda byla temperována ve vodní lázni o teplotě 45°C.

Kultivace bakterií rodu Brevibacterium U vzorků bylo po jejich homogenizaci provedeno dekadické ředění. Z každého ředění bylo nepipetováno 1 ml suspenze do Petriho misky. Inokulum bylo zalito M17 agarem, promícháno krouživým pohybem a ponecháno zatuhnout. Naočkované Petriho misky byly kultivovány při 30˚C po dobu 2 – 3 dnů. 4.2.2.6 E. coli Příprava media TBX agar (Gelose TBX) Trypton

20,0 g.l-1

Žlučové soli

1,5 g.l-1

BCIG

0,075 g.l-1

Bakteriologický agar

15,0 g.l-1

44

Do skleněné reagenční láhve bylo naváženo 9,18 g dehydratované půdy, zalito destilovanou vodou a ponecháno nabobtnat. Následně byla provedena sterilace v autoklávu při teplotě 121°C po dobu 20 minut. Po ukončení sterilace byla láhev s půdou vložena do vodní lázně vytemperované na 45°C.

Kultivace E. coli U homogenizovaných vzorků bylo provedeno dekadické ředění. Do Petriho misek byl nepipetován 1 ml požadovaného ředění. Inokulum v Petriho misce bylo zalito TBX agarem, promícháno krouživým pohybem a necháno zatuhnout. Poté následovala inkubace v termostatu při teplotě 44°C 18 – 24 hodin.

4.2.3

Přístroje a pomůcky

-

Laboratorní váhy, 220A (Schoeller instruments, Praha, ČR)

-

Odstředivka (Schoeller instruments, Praha, ČR)

-

Vodní lázeň, Julabo TW 20 (Schoeller instruments, Praha, ČR)

-

Horkovzdušný sterilizátor, D-91126, Mennert (Germany)

-

Autokláv, Sanyo MLS-3750/3780 (Schoeller instruments, Praha, ČR)

-

Myčka, G 7883, Miele professional (Labor, Brno)

-

Lednice, Liebherr, 7082218-01 (Germany)

-

Termostat, Sanyo (Schoeller instruments, Praha, ČR)

-

Anaerostat, Thermo Scientific (Trigon-plus s.r.o., ČR)

-

Homogenizátor, Bagnixer 400 (Fabrilabo, Francie)

-

Vortex, MS2 Minishaker, IKA Šerme (Německo)

-

Běžné laboratorní sklo a pomůcky

45

4.2.4

Vyhodnocení výsledků mikrobiologických stanovení U každého vzorku tvarůžků byl proveden dvojí mikrobiologický rozbor. Z těchto

dvou stanovení byl vypočítán aritmetický průměr. Po kultivaci byly z Petriho misek odečteny počty kolonií a pomocí rovnice [1] bylo určeno výsledné množství mikroorganismů N v jednotkách KTJ (kolonie tvořící jednotky) na 1 g zkoušeného vzorku.

Rovnice pro výpočet N KTJ mikroorganismů:

N=

∑C

rovnice [1]

V (n1 + 0,1n 2 )d

∑ C ……………součet kolonií spočítaných na vybraných plotnách n1 ………………počet ploten použitých pro výpočet z prvního ředění n2 ………………počet ploten použitých pro výpočet z druhého ředění d ………………první použité ředění pro výpočet

V……………….objem inokula v ml očkovaného na každou plotnu Výsledek se vyjádří jako číslo od 1,0 do 9,9 násobené 10x, kde x je příslušná mocnina 10.

46

4.2.5

Statistické zpracování výsledků Výsledky byly vyhodnoceny a statisticky zpracovány pomocí programu Statistica

StatSoft verze 9. Stanovovaly se základní statistické charakteristiky (průměr, střední chyba průměru) a následně byla provedena analýza rozptylu, regresní analýza a korelační analýza.

Analýza rozptylu Byla provedena pro zjištění rozdílu mezi jednotlivými vzorky. Pro určení homogenních skupin byl použit Duncanův test. Rozdíl byl stanoven jako neprůkazný (P>0,05) nebo průkazný na různých hladinách pravděpodobnosti. Rozdíl průkazný (P<0,05), vysoce průkazný (P<0,01), velmi vysoce průkazný (P<0,001).

Regresní analýza Prováděla se pro zjištění závislosti BA či mikroorganismů na čase v průběhu stáří výrobku, respektive v jednotlivých fázích výroby. Závislost byla hodnocena jako neprůkazná (P>0,05) nebo průkazná na různých hladinách pravděpodobnosti. Závislost průkazná (P<0,05), vysoce průkazná (P<0,01), velmi vysoce průkazná (P<0,001).

Korelační analýza Hodnotila se pro stanovení těsnosti vztahu mezi počty mikroorganismů a aminy. Pokud korelační koeficient nabývá hodnot r = 0 – 0,3, jde o nízký stupeň vztahu, při r = 0,3 – 0,6 střední stupeň vztahu a při hodnotách r = 0,6 – 1 jde o velice těsný vztah. Kromě těsnosti vztahu se hodnotil i směr závislosti. Záporné znaménko korelačního faktoru značí nepřímou závislost, kladné znaménko závislost přímou.

47

5

VÝSLEDKY A DISKUZE Bylo sledováno několik faktorů, které mají vliv na tvorbu biogenních aminů a

polyaminů, současně se sledoval vliv těchto faktorů na růst mikroorganismů v sýrech zrajících pod mazem. Mezi hlavní zkoumané faktory patřily tvar výrobku, doba skladování, teplota skladování a stáří výrobku, respektive posouzení jednotlivých fází výroby sýra. Hodnotil se vliv těchto faktorů na jednotlivé biogenní aminy, polyaminy a sumu všech aminů. Dále se zkoumal vliv uvedených faktorů na skupiny mikroorganismů schopných produkovat biogenní aminy, a to konkrétně na enterokoky (ENC), bakterie mléčného kvašení (BMK), celkový počet mikroorganismů (CPM) a koliformní bakterie (E.coli). Bakterie E.coli, které často vykazují dekarboxylázovou aktivitu, nebyly v mikrobiologických rozborech detekovány, proto nebyly zařazeny do výsledků. Součástí mikrobiologického vyšetření bylo stanovení množství kvasinek a plísní, jejichž počty se stanovovaly pouze pro určení kontaminace vstupní suroviny, proto ve výsledcích práce nejsou uvedeny. Dále se v mikrobiologických rozborech stanovovaly počty brevibakterií, které se záměrně přidávají při výrobě daných sýrů jako součást mazové kultury. Množství bakterií rodu Brevibacterium bylo stanoveno zejména z důvodu dalšího probíhajícího experimentu s cílem zjistit, zda vykazují dekarboxylázovou aktivitu, která u nich zatím nebyla prokázána. V závěru práce je tedy pouze pro zajímavost uveden růst brevibakterií v závislosti na stáří výrobku, ostatní výsledky ohledně těchto bakterií v práci nejsou uvedeny, neboť nebyly cílem mé práce.

5.1 Vliv tvaru výrobku, teploty a doby skladování na obsah BA a PA V první části výsledků (obrázek č. 6 - 11) je posuzován postupně vliv pouze jediného faktoru bez ohledu na ostatní. Obrázek č. 6 znázorňuje vliv tvaru výrobku na obsah jednotlivých biogenních aminů a polyaminů. Hodnotily se sýry dvou tvarů (kolečka a tyčinky). Statistický rozdíl na obsah aminů podle tvaru výrobku se prokázal pouze v obsahu kadaverinu, jehož množství bylo vyšší v kolečkách než v tyčinkách (P<0,05). U většiny ostatních aminů převažovalo jejich množství v tyčinkách, ale vliv tvaru na obsah aminů u nich nebyl prokázán (P>0,05). Několik autorů se již zabývalo distribucí biogenních aminů v různých částech sýra, což by se dalo srovnat s obsahem aminů v závislosti na tvaru výrobku.

48

Prokazatelně vyšší množství tyraminu a sumy biogenních aminů v okrajové části oproti středu tvrdých holandských sýrů zjistil Komprda a kol. (2007). Obdobné výsledky prokázala i Buňková a kol. (2010). Ve svém pokusu zjistila více putrescinu, kadaverinu, histaminu a tyraminu v okrajové části eidamského sýra oproti jádru. Své výsledky tito autoři obhájili skutečností, že jsou v okrajové části sýra zrajícího pod folií vhodnější podmínky pro růst anaerobních mikroorganismů schopných tvořit tyto biogenní aminy. Na druhé straně Novella-Rodríguez a kol. (2003) se zabývali zjišťováním obsahu a distribuce biogenních aminů a polyaminů v různých typech kozího sýra a zjistili vyšší hodnoty většiny aminů ve středové části sýra oproti okraji. Jako důvod uvedli různé podmínky prostředí pro růst mikroorganismů v různých částech sýra, např. aw, obsah O2,

proteolytická

aktivita,

což

může

způsobit

rozdílnou

distribuci

skupin

mikroorganismů a akumulaci aminů v jiných částech sýra spojených s těmito mikroorganismy. Boeckelmann a Hoppe-Seyler (2001) uvedli, že u sýrů zrajících pod mazem je výraznější proteolýza na povrchu ve srovnání se středem sýra. Jako

možný

důvod

různého

množství

aminů

v sýrech

dvou

tvarů

v předpokládaném experimentu mohou být tedy již zmíněné různé podmínky prostředí pro růst mikroorganismů, a tím rozdílné rozšíření skupin mikroorganismů produkující charakteristické aminy. Mikroorganismy produkující kadaverin mohou preferovat prostředí o vyšší vodní aktivitě a hromadit se převážně v sýrech tvaru koleček, mikroorganismům produkujících ostatní aminy může vyhovovat prostředí sýrů tvaru tyčinek, kde je nižší průměr a nižší vodní aktivita. U sperminu a spermidinu nelze očekávat rozdíly v obsahu v různých částech sýra, neboť tyto polyaminy nejsou tvořeny mikrobiální činností, ale do sýrů se dostávají z mléka (Novella-Rodríguez, 2003). V našem pokusu je tato skutečnost potvrzena, neboť nejsou prokázány rozdíly v obsahu sperminu a spermidinu v sýrech tvaru kolečka a tyčinky (P<0,05).

49

Obrázek č. 6 Vliv tvaru sýra zrajícího pod mazem na obsah BA a PA 150 A

A A

Biogenní aminy (mg.kg-1)

120

90 Kolečko A

Tyčinka

A

60 A

B A

A

30 A

A

A A A

A A

SPD

SPM

0 TRY

PEA

PUT

CAD

HIS

TYR

BA: TRY - tryptamin, PEA - 2-fenyletylamin, CAD - kadaverin, HIS - histamin, TYR tyramin, PA: PUT - putrescin , SPD - spermidin, SPM - spermin, Průměry označené různými písmeny (A, B) se pro daný amin průkazně liší (P<0,05)

Na obrázku č. 7 je znázorněn vliv tvaru sýra na celkové množství aminů. Vliv faktoru tvaru výrobku nebyl statisticky prokázán (P>0,05).

Obrázek č. 7 Vliv tvaru sýra zrajícího pod mazem na obsah sumy všech aminů ( Σ BA) 600

ΣBA (mg.kg-1)

A 400 A

200

0 Kolečko

Tyčinka Tvar výrobku

Průměry označené stejným písmenem (A) se průkazně neliší (P>0,05)

50

Dalším sledovaným faktorem byla doba skladování. Obrázek č. 8 udává množství BA a PA ve třech fázích skladování sýra. Hodnotil se obsah aminů v nultý den skladování (před zabalením výrobku), dále 35. den skladování, což odpovídalo době minimální trvanlivosti sýra a v 56. den skladování, neboli po uplynutí doporučené doby minimální trvanlivosti. V nultý den skladování (před zabalením výrobku) byl obsah BA a PA v tvarůžkách s výjimkou TYR (21,3 mg.kg-1) a HIS (12,8 mg.kg-1) do 5 mg.kg-1. Po 35 dnech skladování se obsah BA a PA výrazně zvýšil. V 56. den skladování se množství většiny aminů neměnilo či klesalo. V pokusu jsme prokázali zvýšené obsahy všech aminů v sýrech po 35 dnech skladování. Rozdíl průměrů byl velmi vysoce statisticky průkazný (P<0,001) s výjimkou histaminu, kde byl rozdíl průkazný (P<0,05). Růst aminů po 56 dnech skladování byl zaznamenán pouze u histaminu a putrescinu (P<0,001). Naopak pokles po 56 dnech skladování sýra byl statisticky průkazný u 2-fenylethylaminu, spermidinu a sperminu (P<0,001), u ostatních aminů se obsah významně neměnil (P>0,05). Podle Komprdy (2005) jsou některé bakterie schopny vytvořené BA ve skladované potravině rozkládat, např. Pseudomonas spp., Serratia marcescens, Sarcina. Podobný průběh množství biogenních aminů v olomouckých tvarůžkách při skladování zaznamenala Standarová a kol. (2009). Ve svém experimentu sledovala do určité doby nárůst biogenních aminů a následný pokles asi po 6 týdnech skladování. Leuschner a kol. (1998) uvedli, že pokles BA během skladování může souviset se sníženou aktivitou bakteriálních aminooxidáz.

51

Obrázek č. 8 Vliv doby skladování na obsah BA a PA 350 C

Biogenní aminy (mg.kg-1)

280 B B 210 0 35 56

140

B B B

C

B

70 B B A

B

A A

A

A

A

A

A B C

A

B

A

0 TRY

PEA

CAD

HIS

TYR

PUT

SPD

SPM

BA: TRY - tryptamin, PEA - 2-fenyletylamin, CAD - kadaverin, HIS - histamin, TYR tyramin, PA: PUT - putrescin, SPD - spermidin, SPM – spermin, 0 - skladování 0 dnů (před zabalením výrobku), 35 - skladování po 35 dnech, 56 – doba skladování po 56 dnech Průměry označené různými písmeny (A, B, C) se pro daný amin průkazně liší (P<0,05)

Na obrázku č. 9 můžeme pozorovat vliv doby skladování na celkovou sumu aminů. S rostoucí dobou skladování se prokázal nárůst celkové sumy všech aminů (P<0,01).

Obrázek č. 9 Vliv doby skladování na obsah sumy všech aminů (Σ BA) 800

C

B Σ BA (mg.kg-1)

600

400

200 A 0 0

35 Doba skladování (dny)

Průměry označené různými písmeny (A, B, C) se průkazně liší (P<0,01) 52

56

Dále se zkoumal vliv teploty skladování na obsah BA a PA. Hodnotily se vzorky sýrů skladované při teplotě 5˚C a 20˚C. Z obrázku č. 10 můžeme sledovat, že jsme, s výjimkou sperminu, prokázali (P<0,001) účinek teploty během skladování na zvyšování obsahu aminů v sýrech. Při 20˚C bylo množství BA a PA vyšší než při skladovací teplotě 5˚C. Výrazný byl zejména nárůst tyraminu, jehož hodnota přesáhla 300 mg.kg-1. Tento nárůst je statisticky velmi vysoce průkazný (P<0,001). Obdobné výsledky publikovala Buňková a kol. (2010), která sledovala množství tyraminu, putrescinu a kadaverinu v eidamských sýrech během zrání a skladování. Uvedla, že při skladovací teplotě 5˚C se tvořilo méně aminů a při skladování sýrů při 10˚C vznikalo aminů více. Valsamaki a kol. (2002) uvedli, že nižší teplota při skladování sýrů může inhibovat aktivitu dekarboxylačních enzymů mikroorganismů.

Obrázek č. 10 Vliv teploty skladování na obsah BA a PA 350

B

B

Biogenní aminy (mg.kg-1)

280

210 5 20

B 140

A A

B B 70

B

A

A

A

TRY

PEA

A A B

A A

SPD

SPM

0 CAD

HIS

TYR

PUT

BA: TRY - tryptamin, PEA - 2-fenyletylamin, CAD - kadaverin, HIS - histamin, TYR tyramin, PA: PUT – putrescin, SPD - spermidin, SPM – spermin, 5 - skladování při teplotě 5˚C, 20 - skladování při 20˚C Průměry označené různými písmeny (A, B) se pro daný amin průkazně liší (P<0,001)

Na obrázku č. 11 je uveden vliv teploty na obsah celkového množství aminů. Rozdíl v obsahu je velmi vysoce statisticky průkazný (P<0,001).

53

Obrázek č. 11 Vliv teploty na obsah sumy všech aminů (Σ BA) 1200 B

Σ B A (m g .kg -1)

900

600

A 300

0 5

20 Teplota skladování (˚C)

Průměry označené různými písmeny (A, B) se průkazně liší (P<0,001)

5.2 Současný vliv teploty a doby skladování na obsah BA a PA V následujících výsledcích (obrázek č. 12 - 14) je posuzován vliv dvou faktorů (vliv teploty a doby skladování) bez ohledu na ostatní faktory. Hodnotilo se množství putrescinu, kadaverinu, tyraminu a histaminu, což byly převládající aminy v detekovaných sýrech, dále suma těchto aminů a suma všech aminů. Tvrzení, že je převládajícím aminem v sýrech tyramin, putrescin, kadaverin a v menší míře histamin potvrdil i Novella-Rodríguez (2003), který se zabýval distribucí biogenních aminů a polyaminů v sýrech. U putrescinu, kadaverinu, histaminu a tyraminu došlo v průběhu skladování od 35. do 56. dne při teplotě 5˚C k nárůstu (obrázek č. 12). Při 20˚C narůstalo množství putrescinu a histaminu (P<0,01), u kadaverinu a tyraminu došlo k poklesu (P<0,001). Při skladovací teplotě 20˚C bylo množství většiny aminů několikanásobně vyšší než při skladování při 5 ˚C. Histamin, jehož dávka ve výši 100 mg.kg-1je dle Halásze a kol. (1994) považována pro člověka za toxickou, během experimentu nepřesáhl tuto hranici ani při skladování po 56 dnech (po uplynutí doby minimální trvanlivosti) při pokojové teplotě 20˚C. U tyraminu se za toxikologicky významné množství považuje koncentrace v rozmezí 100 – 800 mg.kg-1 (Halász a kol., 1994). V pokusu bylo jeho množství pod 100 mg.kg-1 pouze při skladování v 5˚C po 35 dnech, po stejnou dobu při 20˚C 54

množství tyraminu vystoupalo až na 361 mg.kg-1. Významné množství bylo zjištěno i u putrescinu a kadaverinu. Nejvyššího množství dosáhl putrescin po 56 dnech při teplotě 20˚C a to 400 mg.kg-1. Dvakrát až třikrát vyšší dávky u tyraminu, histaminu, putrescinu a kadaverinu v olomouckých tvarůžkách při skladování 20˚C v porovnání s 5˚C prokázala Standarová a kol. (2009). V pátém týdnu, což odpovídá 35. dnu skladování, naměřila při 5˚C 239 mg tyraminu.kg-1 a při 20˚C 895 mg tyraminu.kg-1, což jsou dosti vyšší hodnoty v porovnání s předloženou diplomovou prací. Rozdílné množství aminů je pravděpodobně způsobeno rozdílnou kvalitou výchozí suroviny, či jinými podmínkami v průběhu skladování.

Obrázek č. 12 Současný vliv teploty a doby skladování na obsah PUT, CAD, HIS, TYR

Biogenní aminy (mg.kg-1)

500

C C

400

D 5, 35

300

5, 56 20, 35 200

B

20, 56

C

A,B

B B

D 100

A

A

B

A

A

A A

0 PUT

CAD

HIS

TYR

PUT - putrescin, CAD - kadaverin, HIS - histamin, TYR - tyramin 5, 35 - skladování sýra 35 dní při teplotě 5˚C, 5, 56 - skladování sýra 56 dní při teplotě 5˚C, 20, 35 - skladování sýra 35 dní při teplotě 20˚C, 20, 56 - skladování sýra 56 dní při teplotě 20˚C Průměry označené různými písmeny (A, B, C, D) se pro daný amin průkazně liší (P<0,05)

Na obrázku č. 13 je znázorněn současný vliv teploty a doby skladování na obsah sumy putrescinu, kadaverinu, tyraminu a histaminu. V průběhu skladování od 35. do 56. dne se významně měnila suma stanovených aminů v závislosti na teplotě (P<0,001).

55

Kritická hodnota podle Spaniera a kol. (1991) cit. dle Valsamaki a kol. (2000) Σ PUT + CAD + HIS + TYR 900mg.kg-1 v sýru nebyla překročena ani při odběru po 56 dnech skladování při teplotě 20˚C.

Obrázek č. 13 Současný vliv teploty a doby skladování na sumu putrescinu, kadaverinu, histaminu a tyraminu (Σ PUT, CAD, HIS, TYR) 1200

-1

ΣPUT+CAD+HIST+TYR (mg.kg )

B 900 B 5

600

20 C

300 A

0 35

56 Doba skladování (dny)

5 - skladování při teplotě 5˚C, 20 - skladování při teplotě 20˚C Průměry označené různými písmeny (A, B, C) se průkazně liší (P<0,001)

Celková suma všech aminů se během skladování měnila v závislosti na různé skladovací teplotě (viz. obrázek č. 14). Při 5˚C se zvýšila suma všech aminů v sýrech skladovaných po dobu 35 a 56 dnů z téměř 200 mg.kg-1 na 358 mg.kg-1 (P<0,001). Suma všech aminů v sýrech skladovaných při teplotě 20˚C byla výrazně vyšší než při skladování v 5˚C (P<0,001). V pokusu bylo dokázáno, že celková suma aminů během skladování se dá významně ovlivnit teplotou a spotřebitel by měl dodržovat doporučení výrobce, zejména jedná-li se o teplotu skladování. I přesto však nebyla při skladování sýrů při 20˚C po uplynutí doporučené doby minimální trvanlivosti (po 56 dnech) překročena dávka celkové sumy aminů 1000 mg.kg-1, která by dle Taylora a kol. (1985) cit. dle Silla Santos (1996) mohla být nebezpečná pro zdraví člověka. Závěr, že se celkové množství aminů dá při skladování ovlivnit teplotou, potvrdila i Standarová a kol. (2010), která se zabývala množstvím aminů v olomouckých tvarůžkách v závislosti na době a teplotě skladování. Pozorovala množství všech aminů 56

v průběhu skladování sýrů po 8 týdnů s odběrem vzorků jednou za týden. Ve svém pokusu prokázala, že docházelo do určité doby skladování k nárůstu celkového množství aminů a poté došlo k poklesu. Tento rozdíl ve srovnání s mým pokusem může být zkreslený v důsledku malého počtu odběrů při skladování v mém experimentu, kdy se vzorky odebíraly pouze dvakrát po 35 a 56 dnech.

Obrázek č. 14 Současný vliv teploty a doby skladování na obsah sumy všech aminů (Σ BA) 1200 B

B

Σ BA (mg.kg-1)

900

5

600

20 C

300

A

0 35

56 Doba skladování (dny)

5 - skladování při teplotě 5˚C, 20 - skladování při teplotě 20˚C Průměry označené různými písmeny (A, B, C) se průkazně liší (P<0,001)

5.3 Množství BA a PA ve vstupní surovině V následující části (obrázek č. 15, 16) je znázorněn obsah aminů ve vstupní surovině před a po nasolení. Z obrázku č. 15 můžeme pozorovat, že obsah jednotlivých aminů ve vstupní surovině většinou nepřesáhl 1 mg.kg-1. Vyšší množství bylo zaznamenáno pouze u tyraminu a histaminu, kdy obsah tyraminu byl 1,2 a obsah histaminu 4 mg.kg-1. Ve vstupní surovině po nasolení došlo k nárůstu všech aminů. Množství tryptaminu, 2-fenyletylaminu, kadaverinu, spermidinu, sperminu a putrescinu se po nasolení zvýšilo v průměru o 0,16 mg.kg-1 .U tyraminu a histaminu byl nárůst výraznější, v průměru o 1,37 mg.kg-1 (obrázek č. 15). I přesto rozdíly průměrů ve vstupní surovině před a po nasolení nebyly statisticky průkazné (P<0,05).

57

Sýry představují ideální prostředí pro tvorbu proteolytických produktů zejména volných aminokyselin a biogenních aminů (Pinho a kol., 2001). Podle Gennara a kol. (2003) proteolytická aktivita bakterií produkujících biogenní aminy může být v potravinách regulována různými faktory jako je pH, teplota a koncentrace NaCl. V našem případě i po nasolení tvarohu došlo k mírnému nárůstu aminů. Zvýšená produkce biogenních aminů mikroorganismy po nasolení může být způsobena vlivem obranného mechanismu mikroorganismů, kteří produkují aminy následkem zvýšeného osmotického tlaku a nepříznivých podmínek prostředí (Maijala, 1994 cit. dle Vale a Glória, 1998). Významný nárůst histaminu a kadaverinu zaznamenali Yatsunami a Echigo (1993) cit. dle Silla Santos (1996) v sardinkách skladovaných při 30˚C po nasolení 2 % soli. Při stejné teplotě a koncentraci 12% NaCl se v sardinkách putrescin, kadaverin a histamin neustále tvořily.

Obrázek č. 15 Obsah BA a PA ve vstupní surovině před a po nasolení 7 A

Biogenní aminy (mg.kg-1)

6 5 A 4 1 2

3 A 2 1

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

0 TRY

PEA

PUT

CAD

HIS

TYR

SPD

SPM

BA: TRY - tryptamin, PEA - 2-fenyletylamin, CAD - kadaverin, HIS - histamin, TYR tyramin, PA: PUT - putrescin, SPD - spermidin, SPM – spermin 1 - vstupní surovina (tvaroh), 2 - vstupní surovina po nasolení (nasolený tvaroh) Stejně označené (A) průměry se pro daný amin neliší (P>0,05) Suma všech aminů ve vstupní surovině nepřesáhla 10 mg.kg-1 Po nasolení došlo k nárůstu na 13 mg.kg-1. Tento nárůst však nebyl statisticky průkazný (P>0,05).

58

Obrázek č. 16 Obsah sumy všech aminů (Σ BA) ve vstupní surovině před a po nasolení 15 A 12

Σ BA (mg.kg-1)

A 9

6

3

0 1

2

1 - vstupní surovina (tvaroh), 2 - vstupní surovina po nasolení (nasolený tvaroh) Stejně označené (A) průměry se neliší (P>0,05)

5.4 Vliv stáří výrobku na obsah BA a PA V následující části výsledků (obrázek č. 17 - 21) je znázorněn vliv stáří výrobku respektive vliv jednotlivých fází výroby na obsah tyraminu, histaminu, putrescinu, kadaverinu a sumy všech aminů. Závislost obsahu aminů na stáří výrobku je znázorněna pomocí lineární regrese. Odběr vzorků probíhal v průběhu výroby. První odběr se prováděl po příjmu tvarohu (1. den). Druhým odběrem byla nasolená vstupní surovina (5. den). 6. den se odebral vzorek po formování, 8. den po vysušení a odvětrání. 10. odběr byl již hotový tvarůžek před zabalením do obalu. Další odběry se prováděly v průběhu skladování již zabaleného sýra 35. a 56. den, neboli odběr byl proveden ve stáří výrobku 55 a 66 dní. Vyhodnocení závislosti se provedlo pomocí lineární regrese. V každém grafu je zohledněn faktor tvaru výrobku (kolečko, tyčinka) a to i v prvních dvou odběrech vzorků (první a pátý den), kdy surovina nebyla ještě zformovaná. Z obrázku č. 17 lze vidět nárůst tyraminu v průběhu jednotlivých fází výroby sýra u obou tvarů (P<0,001). Obsah tyraminu (y, mg.kg-1) v sýrech tvaru tyčinek se se stářím výrobku (x, dny) zvyšuje podle funkce y = -4,0 + 4,54x a v poslední fázi skladování přesahuje hodnotu 280 mg.kg-1. Růst v sýrech tvaru koleček je dle funkce y = 13,8 + 2,44x.

59

Obrázek č. 17 Závislost stáří sýra na obsah tyraminu (TYR) 350

Tyčinka y = -4,0 + 4,54x R2 = 0,58, P<0,001

TYR (mg.kg-1)

280

210

140

Kolečko y = 13,8 + 2,44x R2 = 0,36, P<0,001

70

0 0

10

20

30

40

50

60

70

Stáří výrobku (dny)

Na obrázku č. 18 je znázorněn zvyšující se obsah histaminu v průběhu výroby (P<0,001). Růst histaminu v tyčinkách je popsán funkcí y = -0,6 + 1,36x, v kolečkách y= 12,5 + 0,22x. Obsah histaminu je vyšší v tyčinkách, avšak nedosahuje takového množství jako tyramin.

Obrázek č. 18 Závislost stáří sýra na obsah histaminu (HIS) 100

Tyčinka y = -0,6 + 1,36x R2 = 0,43, P<0,001

HIS (mg.kg-1)

80

60

40

20

Kolečko y = 12,5 + 0,22x R2 = 0,15, P<0,001

0 0

10

20

30

40

50

60

70

Stáří výrobku (dny)

Na obrázku č. 19 je podle funkce y = -49,4 + 6,31x znázorněn nárůst putrescinu v tyčinkách (P<0,001). Maximální hodnoty přesahují obsah tyraminu (>300 mg .kg-1). Růst obsahu putrescinu v kolečkách vyjadřuje rovnice y = 0,3 + 1,40x (P<0,001).

60

Obrázek č. 19 Závislost stáří sýra na obsah putrescinu (PUT) 400 Tyčinka y = -49,4 + 6,31x R2 = 0,52, P<0,001

PUT (mg.kg-1)

300

200 Kolečko y = 0,3 + 1,40x R2 = 0,33, P<0,001 100

0 0

10

20

30

40

50

60

70

Stáří výrobku (dny)

Na obrázku č. 20 můžeme pozorovat rostoucí obsah kadaverinu během stárnutí výrobku (P<0,001) podle funkce y = -5,6 + 1,58x (tvar sýru kolečko) a y = -0,2 + 1,24x (tvar sýru tyčinka). Maximální množství kadaverinu přesahuje 90 mg.kg-1.

Obrázek č. 20 Závislost stáří sýra na obsah kadaverinu (CAD) 120 Kolečko y = -5,6 + 1,58x R2 = 0,41,P<0,001

CAD (mg.kg-1)

90

60 Tyčinka y = -0,2 + 1,24x R2 = 0,45, P<0,001

30

0 0

10

20

30

40

50

60

70

Stáří výrobku (dny)

Na obrázku č. 21 je znázorněna závislost obsahu sumy aminů u sýrů tvaru tyčinek (y = -5,2 + 14,8x) a koleček (y = 23,3 + 6,26x). Růst sumy aminů je statisticky velmi vysoce průkazný (P<0,001).

61

Obrázek č. 21 Závislost stáří sýra na obsah sumy všech aminů (ΣBA) 1000

Σ BA (mg.kg-1)

800

Tyčinka y = -51,2 + 14,8x R2 = 0,61, P<0,001

600

400

200

Kolečko y = 23,3 + 6,26x R2 = 0,41, P<0,001

0 0

10

20

30

40

50

60

70

Stáří výrobku (dny)

5.5 Vliv tvaru výrobku, teploty a doby skladování na počet mikroorganismů Součástí experimentu bylo, vedle stanovení biogenních aminů a polyaminů v sýrech zrajících pod mazem, současné stanovení producentů biogenních aminů, neboli mikroorganismů s dekarboxylázovou aktivitou (ENC - enterokoků, BMK - bakterií mléčného kvašení, CPM - celkového počtu mikroorganismů). V dané části výsledků (obrázek č. 22 - 24) je zohledněn vliv postupně pouze jednoho faktoru bez ohledu na ostatní. Jako hlavní faktor produkce biogenních aminů v sýrech se uvádí přítomnost mikroorganismů s dekarboxylázovou aktivitou (Martuscelli a kol., 2005). Schopnost mikroorganismů dekarboxylovat aminokyseliny se liší. Závisí na kmeni a druhu mikroorganismů a na podmínkách prostředí (Landete a kol., 2007). Kvalita a kvantita mikroorganismů se může v různých vrstvách sýra lišit (Komprda a kol., 2007). Studium distribuce mikroorganismů v různých částech sýra může přispět k prevenci výskytu biogenních aminů a zvyšování bezpečnosti potravin (Buňková a kol., 2009) V pokusu byl prokázán (P<0,01) vliv tvaru výrobku na obsah bakterií rodu Enterococcus, jejichž množství převažovalo v sýrech tvaru koleček. Obdobné výsledky

vykazovaly počty CPM, avšak rozdíl průměrů nebyl statisticky průkazný (P>0,05).

62

Počty bakterií mléčného kvašení byly vyšší v sýrech tvaru tyčinek (P>0,05). Vyšší množství mikroorganismů rodu Enterococcus a celkový počet mikroorganismů v kolečkách je zřejmě spojen s vyšším obsahem kadaverinu ve výrobcích tohoto tvaru. Vyšší počty bakterií mléčného kvašení v tyčinkách mohou být důvodem vyššího množství ostatních aminů přítomných v těchto sýrech. Podle Joostena (1987) cit. dle Vale a Glória (1998) jsou hlavním producentem kadaverinu a putrescinu bakterie čeledi Enterobacteriaceae, hlavním producentem histaminu jsou zase bakterie mléčného kvašení. Enterokoky mají podle Martuscelliho a kol. (2005) schopnost tvorby tyraminu a 2-fenyletylaminu.

Obrázek č. 22 Vliv tvaru sýra zrajícího pod mazem na počet enterokoků (ENC), bakterií mléčného kvašení (BMK) a celkového počtu mikroorganismů (CPM) 9

Mikroorganismy (log KTJ.g -1)

A

A

8

A A

7 Kolečko Tyčinka 6

A B

5

4 ENC

BMK

CPM

ENC - bakterie rodu Enteroccus, BMK - bakterie mléčného kvašení, CPM - celkový počet mikroorganismů, kolečko - sýry tvaru kolečka, tyčinka - sýry tvaru tyčinky Průměry označené různými písmeny (A, B) se pro dané mikroorganismy průkazně liší (P<0,01)

Na obrázku č. 23 je posuzován vliv doby skladování na počty skupin mikroorganismů. Po 35 dnech skladování došlo k nárůstu všech sledovaných skupin mikroorganismů, u enterokoků a bakterií mléčného kvašení byl nárůst velmi vysoce statisticky průkazný (P<0,001). Po 56 dnech skladování se množství bakterií mléčného

63

kvašení a celkového počtu mikroorganismů v sýrech výrazně neměnilo (P>0,05), u enterokoků nastal pokles (P<0,001). Martuscelli a kol. (2005) prováděli stanovení množství BA v sýrech z ovčího mléka. Ve svém pokusu uvedli, že počet BMK v sýru během doby zrání od 14 do 60 dnů se významně neměnil a pohyboval se v rozmezí 8,8 - 10,5 log KTJ .g-1. Počty enterokoků se během zrání zvýšily z 3,3 na 8,8 log KTJ. g-1. V předloženém experimentu se počty BMK taktéž výrazně neměnily a byl zaznamenán podobný nárůst enterokoků ze 4,2 na 5,8 log KTJ. g-1. Nižší počty bakterií v našem pokusu jsou pravděpodobně způsobeny rozdílným původem mléka, neboť na ovčí mléko se vztahují nižší legislativní nároky na obsah mikroorganismů, případně jiným technologickým procesem.

Obrázek č. 23 Vliv doby skladování na počet enterokoků (ENC), bakterií mléčného kvašení

(BMK)

a

celkového

počtu

mikroorganismů

(CPM)

9 A B B

-1

Mikroorganismy (log KTJ.g )

8

A

A

A 7 0 35 B

56

6 C 5 A 4 ENC

BMK

CPM

ENC - bakterie rodu Enteroccus, BMK - bakterie mléčného kvašení, CPM - celkový počet mikroorganismů, 0 - sýry skladované 0 dní (před zabalením), 35 - sýry skladované po dobu 35 dní, 56 - sýry skladované po dobu 56 dní Průměry označené různými písmeny (A, B) se pro dané mikroorganismy průkazně liší (P<0,05)

64

Vliv teploty na počty mikroorganismů (obrázek č. 24) se statisticky prokázal u bakterií mléčného kvašení a celkového počtu mikroorganismů (P<0,001). Množství těchto mikroorganismů bylo vyšší v sýrech skladovaných při teplotě 5˚C. Více entorokoků narostlo naopak v sýrech skladovaných při 20˚C (P>0,05). Vyšší nárůst BMK a CPM při nižší skladovací teplotě 5˚C je překvapivý, neboť vhodná teplota pro většinu mikroorganismů je 24˚C - 37˚C, proto bych čekala vyšší nárůst těchto mikroorganismů při vyšší skladovací teplotě 20˚C. Tento výsledek může být způsoben rychlým vyčerpáním živin vhodných pro růst MO při 20˚C a ty v průběhu skladování již nemají živiny pro další množení, na rozdíl od teploty skladování 5˚C, kdy je díky nižší teplotě čerpání živin pomalejší, MO se mohou množit bez omezení výživy.

Obrázek č. 24 Vliv teploty skladování na počet enterokoků (ENC), bakterií mléčného kvašení (BMK) a celkového počtu mikroorganismů (CPM) 9 A

-1

Mikroorganismy (logKTJ.g )

A 8

B B 5

7

20

6

A

A

5 ENC

BMK

CPM

ENC - bakterie rodu Enteroccus, BMK - bakterie mléčného kvašení, CPM - celkový počet mikroorganismů, 5 - sýry skladované při teplotě 5˚C, 20 - sýry skladované při teplotě 20˚C Průměry označené různými písmeny (A, B) se pro dané mikroorganismy průkazně liší (P<0,001)

65

5.6 Počet mikroorganismů ve vstupní surovině Obrázek č. 25 zobrazuje obsah skupin mikroorganismů ve vstupní surovině před a po nasolení. I přes inhibiční vliv soli na většinu mikroorganismů došlo po nasolení k nárůstu všech skupin mikroorganismů, u bakterií mléčného kvašení a celkového počtu mikroorganismů byl nárůst velmi vysoce statisticky průkazný (P<0,001). Nárůst mikroorganismů je pravděpodobně způsobený nárůstem bakterií odolných vůči NaCl, např. halotolerantních laktobacilů či jiných halotolerantních bakterií.

Obrázek č. 25 Počet mikroorganismů ve vstupní surovině před a po nasolení 8 B Mikroorganismy (log KTJ.g-1)

B 6

A

A

1

4

2 A

A 2

0 ENC

BMK

CPM

ENC - bakterie rodu Enterococcus, BMK - bakterie mléčného kvašení, CPM - celkový počet mikroorganismů, 1 - vstupní surovina (tvaroh), 2 - vstupní surovina po nasolení (nasolený tvaroh) Průměry označené různými písmeny (A, B) se pro dané mikroorganismy průkazně liší (P<0,001)

5.7 Počet mikroorganismů v průběhu výroby Obrázek č. 26 vyjadřuje závislost skupin mikroorganismů na stáří sýra (průběh celého výrobního procesu). Závislost je vyjádřena polynomickou regresí. Z obrázku je zřejmé, že počty enterokoků rostou do 45. dne, poté klesají (P<0,01). Množství bakterií

66

mléčného kvašení v závislosti na stáří sýra se významně nemění (P>0,05). Celkový počet mikroorganismů v průběhu výroby sýra klesá (P<0,01). Tvrzení, že počty BMK se v průběhu zrání sýra z ovčího mléka významně nemění potvrdil i Martuscelli a kol., (2005). Franz a kol. (2003) uvedl, že počty ENC v tvarohových sýrech se pohybují od 104 po 106 KTJ.g-1, což koresponduje s našimi výsledky. Nárůst enterokoků od počátku výroby sýra do 45. dne je pravděpodobně způsoben vhodným prostředím pro množení těchto mikroorganismů a dostatkem živin v počátku výrobního procesu. Pokles enterokoků od 45. dne stáří sýra a pokles celkového počtu mikroorganismů v průběhu výroby je způsoben zřejmě zhoršujícími se podmínkami prostředí, např. poklesem dostupného substrátu.

Obrázek č. 26 Závislost celkového počtu mikroorganismů (CPM), bakterií mléčného kvašení (BMK) a bakterií rodu Enterococcus (ENC) v log KTJ. g-1 na stáří výrobku ve dnech (všechny dané vzorky byly posouzeny jako jeden soubor bez ohledu na jednotlivé faktory)

Mikroorganismy (log KTJ.g-1)

10

CPM y = 8,4 - 0,01X + 0,0001x2 2 R = 0,07,P<0,01

8 BMK y = 7,7 + 0,01x - 0,0001x2 2

R = 0,03,P>0,05 6 ENC y =4,3 + 0,009x - 0,0012x2 2 R = 0,38,P<0,001 4

2 0

10

20

30

40

Stáří v ýrobku (dny)

67

50

60

70

5.8 Počet mikroorganismů rodu Brevibacterium v průběhu výroby V následující části diplomové práce (obrázek č. 27) je znázorněná závislost počtu brevibaketrií (y, log KTJ.g-1) na stáří sýra (x, dny). Stanovení brevibakterií nebylo cílem předložené diplomové práce, počty se zjišťovaly pouze z důvodu dalšího výzkumu. Závislost je vyjádřena lineární regresí. Množství brevibakterií se pohybovalo v rozmezí od 7,70 do 7,94 log KTJ. g-1. Závislost měla rostoucí tendenci (P<0,05) podle funkce y = 7,7 + 0,004x. Bockelmann a Hoppe-Seyler (2001) stanovovali povrchovou mikroflóru sýrů zrajících pod mazem z kravského a kozího mléka. V jejich pokusu bylo u těchto sýrů stanoveno v průměru 7,73 log KTJ.g-1 brevibakterií, což je hodnota, která koresponduje s množstvím brevibakterií v našem pokusu.

Obrázek č. 27 Závislost počtu mikroorganismů rodu Brevibacterium (BREVI) v log KTJ .g-1 na stáří sýra (dny) 7,98

BREVI (log KTJ.g-1)

7,91

7,84 y = 7,7 + 0,004x R2 = 0,04,P<0,05 7,77

7,7

7,63 0

10

20

30

40

Stáří výrobku (dny)

68

50

60

70

5.9 Korelační vztahy mezi obsahem BA, PA a počty mikroorganismů Z tabulky č. 10 je patrné, že nízké hodnoty korelačních koeficientů značí nízkou, případně střední těsnost vztahu aminů a vybraných skupin mikroorganismů. Všechny hodnoty byly v přímém vztahu (hodnoty korelačních koeficientů nabývaly pouze kladných hodnot). Obsah histaminu koreloval s počty enterokoků (r = 0,17, P <0,01), s počty bakterií mléčného kvašení (r = 0,16, P <0,01) a celkovým počtem mikroorganismů (r = 0,16, P <0,05). Pokud jde o tyramin, byl zjištěn vztah s enterokoky (r = 0,29, P <0,001), s bakteriemi mléčného kvašení (r = 0,21, P <0,01) a celkovým počtem mikroorganismů (r = 0,19, P <0,01). U kadaverinu se projevila střední těsnost vztahu s enterokoky (r = 0,41, P <0,001) a nízká těsnost vztahu s bakteriemi mléčného kvašení (r = 0,30, P <0,001) a celkovým počtem mikroorganismů (r = 0,27, P <0,001). Mezi putrescinem a enterokoky byla prokázána nízká těsnost vztahu (r = 0,18, P <0,05), stejně tak jako s bakteriemi mléčného kvašení (r = 0,18, P <0,01) a celkovým počtem mikroorganismů (r = 0,17, P <0,01). Podle Halásze a kol. (1994) je obsah histaminu ve většině jídel a nápojů způsoben dekarboxylázovou aktivitou kontaminující mikroflóry, zatímco zvyšovaní obsahu putrescinu, kadaverinu a tyraminu ve fermentovaných potravinách se přisuzuje činnosti startovacích kultur. Většinou nízké těsnosti korelačních vztahů uvedené v předložené práci značí, že schopnost mikroorganismů dekarboxylovat aminokyseliny je vlastnost pouze některých kmenů v rámci určitého druhu mikroorganismů. Střední těsnost vztahu mezi enterokoky a kadaverinem (r = 0,41, P<0,001) v našem pokusu je překvapivá, neboť Bover-Cid a kol. (1999) uvedli, že u většiny druhů bakterií rodu Enterococcus nebyla prokázána schopnost tvorby kadaverinu a putrescinu. Voight a Eitenmiller (1987) citace dle Leuschnera a kol. (1998) uvedli, že BA jsou fyziologicky deaktivovány aminooxidázami, což jsou enzymy vyskytující se u vyšších organismů a některých bakterií. Leuschner a kol. (1998) ve svém pokusu prokázali, že několik kmenů Brevibacterium linens obsahuje specifické aminooxidázy a jsou schopny degradovat histamin a tyramin. V našem pokusu však byly prokázány kladné korelace brevibakterií s histaminem (r = 0,24, P<0,001) a tyraminem (r = 0,31, P<0,001). Leuschner a kol. (1998) také zmínili, že aktivita aminooxidačních enzymů

69

bakterií, které odbourávají aminy v potravinách je ovlivněna faktory, např. obsahem NaCl či teplotou. Nevhodná teplota skladování či přítomnost NaCl u sýrů v našem pokusu může být tedy důvodem kladných korelačních vztahů brevibakterií s histaminem a tyraminem.

Tabulka č. 10 Korelační vztahy (hodnoty r) mezi obsahem aminů (BA: TRY - tryptamin, PEA - 2-fenyletylamin, CAD - kadaverin, HIS - histamin, TYR -tyramin,PA: PUT putrescin, SPD - spermidin, SPM - spermin) v mg.kg-1 a počty mikroorganismů (ENC enterokoky, BMK - bakterie mléčného kvašení, CPM - celkový počet mikroorganismů, BREVI - brevibakterie) v log KTJ.g1

Koeficient korelace (r)

TRY

PEA

PUT

CAD

HIS

TYR

SPD

SPM

Σ BA

ENC

BMK

CPM

BREVI

0,19

0,13

0,12

0,21

P <0,01

P<0,05

P>0,05

P <0,01

0,10

0,03

0,00

0,08

P>0,05

P>0,05

P>0,05

P>0,05

0,18

0,18

0,17

0,25

P<0,01

P<0,01

P<0,01

P<0,001

0,41

0,30

0,27

0,39

P<0,001

P<0,001

P<0,001

P<0,001

0,17

0,16

0,16

0,24

P<0,01

P<0,01

P<0,05

P<0,001

0,29

0,21

0,19

0,31

P<0,001

P<0,01

P<0,01

P<0,001

0,39

0,32

0,31

0,40

P<0,001

P<0,001

P<0,001

P<0,001

0,21

0,15

0,13

0,17

P<0,01

P<0,05

P<0,05

P<0,01

0,27

0,22

0,19

0,31

P<0,001

P<0,001

P<0,01

P<0,001

70

5.10 Korelační vztahy mezi jednotlivými skupinami mikroorganismů V tabulce č. 11 můžeme pozorovat korelační vztahy mezi jednotlivými skupinami mikroorganismů. Vysoká těsnost vztahu (r = 0,68, P<0,001) byla zjištěna u celkového počtu mikroorganismů a bakterií mléčného kvašení. Střední těsnost vztahu byla pozorována u brevibakterií a bakterií mléčného kvašení (r = 0,58, P<0,001) a brevibakterií a celkového počtu mikroorganismů (r = 0,39, P<0,001). Korelace ostatních skupin mikroorganismů byly nízké (r < 0,3). Kladné znaménko u všech hodnot určuje, že jsou dané skupiny mikroorganismů v přímém vztahu.

Tabulka č. 11 Korelační vztahy (hodnoty r) mezi počty skupin mikroorganismů (ENC enterokoky, BMK - bakterie mléčného kvašení, CPM - celkový počet mikroorganismů, BREVI - brevibakterie) v log KTJj.g-1

Koeficient korelace (r)

ENC

BMK

ENC

BMK

CMP

BREVI

1,00

0,13

0,19

0,12

P>0,05

P<0,05

P>0,05

1,00

0,68

0,58

P<0,01

P<0,001

1,00

0,39

0,13 P>0,05

CPM

BREVY

0,19

0,68

P<0,05

P<0,01

0,19

0,58

0,39

P>0,05

P>0,001

P<0,001

71

P<0,001 1,00

6

ZÁVĚR Diplomová práce se zabývala stanovením biogenních aminů a polyaminů v sýrech

zrajících pod mazem. Šlo o pravé olomoucké tvarůžky, které poskytl monopolní výrobce v ČR A. W. spol. s. r. o. Loštice. Dále se v diplomové práci posuzovaly počty mikroorganismů, které mohou být možnými producenty biogenních aminů v těchto sýrech. Vzorky sýrů byly odebírány v několika fázích během celého výrobního procesu od vstupní suroviny až po skladování již hotového baleného výrobku. Sledoval se vliv tvaru výrobku (tyčinky, kolečka), teploty skladování (5˚C, 20˚C), doby skladování (0, 35, 56 dnů) a vliv stáří výrobku, respektive vliv jednotlivých fází výroby. Prokazatelný vliv tvaru sýra na obsah aminů byl stanoven pouze u kadaverinu, jehož množství převažovalo v kolečkách (P<0,05), obsah ostatních aminů převažoval většinou v tyčinkách (P>0,05). Nárůst celkové sumy aminů v průběhu skladování se projevil po 35 i 56 dnech (P<0,001). Při hodnocení vlivu teploty na obsah aminů bylo zjištěno průkazně vyšší množství (P<0,001) všech jednotlivých aminů při teplotě skladování 20˚C oproti teplotě 5˚C. V průběhu jednotlivých fází technologického procesu narůstalo množství histaminu, tyraminu, putrescinu a kadaverinu, ale jejich suma během celého výrobního procesu nepřesáhla limit 900 mg.kg-1, který se uvádí jako zdraví nebezpečný. Množství tyraminu, jehož nebezpečná koncentrace pro potraviny se pohybuje v rozmezí 100 – 800 mg.kg-1, nepřesáhlo nižší hranici pouze při skladování po dobu 35 dní při 5˚C. Při skladování sýrů po 56 dnech nebo při vyšší teplotě 20˚C hodnoty tyraminu přesáhly 100 mg.kg-1. Co se týče histaminu, nebyla jeho kritická koncentrace 100 mg.kg-1 překročena ani po uplynutí doporučené doby minimální trvanlivosti ani při skladování při pokojové teplotě 20˚C. Obsah 2-fenyletylaminu v sýru skladovaném při teplotě 20˚C překročil množství 30 mg.kg-1. Z výsledků vyplývá, že skladování sýrů zrajících pod mazem při pokojové teplotě

či po uplynutí doby minimální trvanlivosti může vést ke zvýšenému množství tyraminu a 2-fenyletylaminu, jejichž koncentrace mohou vyvolat nepříznivé účinky v organismu. Proto by měl spotřebitel dodržovat doporučení výrobce, pokud jde o teplotu skladování a dobu minimální trvanlivosti u těchto sýrů. Rizikové skupiny osob, zejména osoby

72

užívající léky s inhibitory monoaminooxidáz a alergici, by se měly konzumaci těchto sýrů raději vyhnout. Při posouzení počtu aminů ve vstupní surovině před a po nasolení došlo po nasolení tvarohu k nárůstu všech stanovených aminů (P>0,05). Při hodnocení počtu mikroorganismů se prokázal vliv tvaru sýra u enterokoků, jejichž množství převažovalo v kolečkách (P<0,01). Při posuzování vlivu doby skladování se celkový počet mikroorganismů významně neměnil (P>0,05). Nárůst od 0. do 35. dne skladování se prokázal u enterokoků a bakterií mléčného kvašení (P<0,001). Po 56 dnech skladování se počty enterokoků snížily (P<0,001). Průkazně vyšší množství bakterií mléčného kvašení a celkového počtu mikroorganismů narostlo při nižší teplotě skladování (5˚C) oproti teplotě 20˚C (P<0,001). Po nasolení tvarohu se průkazně zvýšilo množství bakterií mléčného kvašení a celkového počtu mikroorganismů. V průběhu celého výrobního procesu se počty BMK významně neměnily (P>0,05), CPM klesaly (P<0,01) a počty enterokoků narůstaly pouze do 45. dne a poté taktéž klesaly (P<0,001). Pokles těchto mikroorganismů způsobuje pravděpodobně vyčerpání živin z dostupného substrátu či zhoršující se podmínky prostředí. Množství brevibakterií v průběhu výrobního procesu narůstalo (P<0,05). Hodnoty korelačních koeficientů nabývaly většinou nízkých hodnot, což naznačuje, že schopnost mikroorganismů dekarboxylovat příslušné aminokyseliny je vlastností pouze vybraných kmenů určitého druhu. Sledování prokázalo, že se suma všech aminů se stářím sýra zvyšovala. Jedinou možností dosažení nízkého množství biogenních aminů a polyaminů v hotovém výrobku je použití vhodné suroviny a při výrobě dodržovat technologické a hygienické požadavky s cílem zabránit sekundární kontaminaci.

73

7

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

ADAMS, R., M., NOUT, R., J., M.: Fermentation and food safety. An Aspen publication, 2001, 291 s.

BÍLEK, L., POSPĚCH, P.: Výroba Olomouckých tvarůžků, Minulost a současnost. MTZ Olomouc, 1986, 63 s.

BOCKELMANN, W.: Development of defined surface starter cultures for the ripening of smear cheeses. International Dairy Journal 12, 2002, 123-131

BOCKELMANN, W., HOPPE-SEYLER, T.: The surface flora of bacterial smearripened cheeses from cow´s and goat´s milk. International Dairy Journal 11, 2001, 307314

BOVER-CID, S., HOLZAPFEL, H., W.:Improved screening procedur for biogenic amine production by lactic acid bakteria. International Journal of Food Microbiology 53, 1999, 33 - 41

BUŇKOVÁ, L., BUŇKA, F., MANTLOVÁ, G., ČABLOVÁ, A., SEDLÁČEK, I., ŠVEC, P., PACHLOVÁ, V., KRÁČMAR, S.: The effect of ripenning and storage conditions on the distribution of tyramine, putrescine and cadaverine in Edam-cheese. Food Microbiology 27, 2010, 880-888

BURDYCHOVÁ, R., SLÁDKOVÁ, P.: Mikrobiologická analýza potravin. 1. vyd. MZLU Brno, 2007, 218s.

DRAISCI, R., VOLPE, G., LUCENTINI, L., CECILIA, A., FEDERICO, R., PALLESCHI, G.: Determination of biogenic amines with an electrochemical biosensor and its application to salted anchovies. Food Chemistry 62, 1998, 225-232

FERNÁNDEZ-GARCÍA, E., TOMILLO, J., NUNEZ, M.: Formation of biogenic amines in raw milk Hispánico cheese manufactured with proteinases and different levels of starter culture. Journal of Food Protection 63, 2000, 1551–1555 74

FOX, F., P., MCSWEENEY, H., L., P., COGAN, M., T., GUINEE, P., T.: CHEESE Chemismy, Physics and Mikrobiology. Elsevier Applied Science, Third edition, Vol. 1. General aspekt. 2004, 620 s.

FRANZ, CH., M., A., P., STILES, M., E., SCHLEIFER, K., H., HOLZAPFEL, W., H.: Enterococci in foods-a conundrum for food safety. International of Food Mikrobiology 88, 2003, 105-122

GAJDŮŠEK.: Mlékařství II. dotisk MZLU Brno, 2002, 142 s. ISBN 80-7157-342-6

GENNARO, M. C., GIANOTTI, V., MARENGO, E., PATTONO, D., TURI, R., M.: A chemometric investigation of the effect of the cheese-making process on contents of biogenic amines in semi-hard Italian cheese (Toma). Food Chemistry 82, 2003, 545-551

GÖRNER, F., VALÍK, L.: Aplikovaná mikrobiológia poživatin. 1. vyd. Malé centrum Bratislava, 2004. 528 s.

GOSETTI, F., MAZZUCCO, E., GIANOTTI, V., POLATI, S., GENNARO, M., C.: High performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry determination of biogenic amines in typical Piedmont cheeses. J. of chromatography A, 2007, 151-157

HALÁSZ, A., BARÁTH, A., SIMON-SARKADI, L., HOLZAPFEL, W.: Biogenic amines and thein production by microorganisms in food. Trend in Food Science and Technology 5, 1994, 42-48

GREIF, G., GREIFOVÁ, M.: Štúdium analýzy biogénnych amínov vo vybraných mliečnych výrobkoch. FCHPT STU Bratislava, Mliekarstvo 37, č. 2. 2006

INNOCENTE, N., BIASUTTI, M., PADOVESE, M., MORET, S.: Determination of biogenic amines on cheese using HPLC technique and direct derivatization of acid extract. Food Chemistry 101, 2007, 1285-1298

JOOSTEN, H., M., NORTHOLT, M., D.: Conditions allowing the formativ of biogenic amines in cheese. Neth. Milk Dairy Journal 41, 1987, 259-263 75

KADLEC, P., MELZOCH, K., VOLDŘICH, M. A KOL.: Co byste měli vědět o výrobě potravin. VŠCHT Praha, 2009, 536 s.

KALAČ, P., KRAUSOVÁ, P.: A review of dietary polyamines: Formativ, implications fr growth and health and occurrence in foods. Food Chemistry 90, 2005, 219 - 230

KALAČ, P.: Recent advances in the research on biological roles of dietary polyamines in man. Journal of Applied Biomedicine 7, 2009, 65-74

KLOUDA, P.: Moderní analytické metody. 2. vyd. Pavel Klouda Ostrava, 2003. 123 s.

KOMPRDA, T.: Obecná hygiena potravin. 1.vyd. MZLU Brno, 2004, 146 s.

KOMPRDA, T.: Biogenní aminy a polyaminy ve fermentovaných potravinách živočišného původu. Veterinářství č. 10, 2005, 646-649

KOMPRDA, T., SMĚLÁ, D., NOVICKÁ, K., KALHOTKA, L., ŠUSTOVÁ, K., PECHOVÁ, P.: Content and distribution of biogenic amines in Dutch - type hard cheese, Food chemistry 102, 2007, 129 - 137

KOMPRDA, T., BURDYCHOVÁ, R., DOHNAL, V., CWIKOVÁ, O., SLÁDKOVÁ, P.: Some factors influencing biogenic amines and polyamines content in Dutch-type semi-hard cheese. Food Research and Technology, 2008, 227: 29-36

KŘÍŽEK, M., KALAČ, P.: Biogenní aminy a polyaminy v potravinách a jejich vliv na lidské zdraví, Czech Journal of Food Science. 16, 2005, 151-159

KUBÁŇ, V., KUBÁŇ, P.: Analýza potravin. 1.vyd. MZLU Brno, 2007, 203 s.

LANDETE, M., J., DE LAS RIVAS, B., MARCOBAL, A., MUNOZ, R.: Molecular methods for the detection of biogenic amine-producing bacteria on foods. International Journal of Food Mikrobiology 117, 2007, 258 - 269

76

LARQUÉ, E., SABATER-MOLINA, M., ZAMORA, S.: Biological significance of dietary polyamines. Nutrition 23, 2007, 87 -95.

LAWLEY, R., CURTIS, L., DAVIS, J.: The Food Safety Hazard Guidebook. Royal Society of Chemistry, 2008, 442 s.

LEUSCHNER, G., R., HEIDEL, M., HAMMES, P., W.: Histamine and tyramine degradation by food fermenting microorganism. International Journal of Food Microbiology 39, 1998, 1 - 10

LUKÁŠOVÁ, J. A KOL.: Hygiena a technologie produkce mléka. 1. vyd. VFU Brno, 1999,101s.

MAIJALA, R.: Histamine and tyramine production by a Lactobacillus strain subjected to external pH decrease. Food Protect 51, 1994, 259-262

MARCOBAL, A., POLO, M., C., MARTÍN-ÁLVAREZ, P., J., MORENO-ARRIBAS, M., V.: Biogenic amine content of red Spanish wines: comparison of a direct ELISA and an HPLC method for the determination of histamine in wines. Food Research International 38, 2005, 387-394

MARTUSCELLI, M., GARDINI, F., TORRIANI, S., MASTROCOLA, D., SERIO, A., CHAVES-LÓPEZ, C., SCHIRONE, M., SUZZI, G.: Production of biogenic amines during the ripening of Pecorino Abruzzese cheese. International Dairy Journal 15, 2005, 571-578

McCABE-SELLERS, J., B., STAGGS, G., C., BOGLE, L., M.: Tyramine in foods and oxidase inhibitor drugs: A crossroad where medicine, nutrition, pharmacy, and food industry converge. Journal of Food Composition and Analysis 19, 2006, S58-S65

NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny

77

NOVELLA-RODRÍGUEZ, S., VECIANA-NOGUÉS, M., T., IZQUIERDO-PULIDO, M., VIDAL-CAROU, M., C.: Distribution of Biogenic Amines and Polyamines in Cheese. Journal of Food Science 68, 2003, 750-755

ÖNAL, A.: A rewiew: Current analytical methods for the determinativ of biogenic amines in foods. Food Chemistry 103, 2007, 1475-1486

PINHO, O., FERREIRA I., M., P., L., O., V., MENDES, E., M., OLIVEIRA, B., M., FERREIRA, M.: Effect of temperature on evolution of free amino acid and biogenic amine contents during storage of Azeitao cheese. Food chemistry 75, 2001, 287-291

ROIG-SAGUÉS, A., X., MOLINA, A., P., HERNÁNDES-HERRERO, M., M.: Histamine and tyramine-forming microorganisms in Spanish traditional cheeses. European Food Research and Technology 215, 2002, 96–100

SHALABY, R., A.: Significance of biogenic amines to food safety and human health, Food Research International 29, 1996, 675-690

SILLA SANTOS, H., M.: Biogenic amines: their importace in food. International Journal of Food Microbiology 29, 1996, 213-231

SIMEONOVÁ, J., INGR, I., GAJDŮŠEK, S.: Zpracování a zbožíznalství živočišných produktů. dotisk MZLU Brno, 2008. 124 s.

SMĚLÁ, D., PECHOVÁ, P., KOMPRDA, T., KLEJDUS, B., KUBÁŇ, V.: Chromatografické stanovení biogenních aminů v trvanlivých salámech během fermentace a skladování. Chemické listy 98, 2004, 432-437

STANDAROVÁ, E., BORKOVCOVÁ, I., VORLOVÁ, L.: Obsah biogenních aminů v sýrech z české obchodní sítě. Veterinářství č. 58, 2008, 735 -739

STANDAROVÁ, E., VORLOVÁ, L., KORDIOVSKÁ, P., JANŠTOVÁ, B., DRAČKOVÁ, M., BORKOVCOVÁ, I.: Biogenic Amine Production in Olomouc Curd

78

Cheese (Olomoucké tvarůžky) at Various Storage Conditions. Acta Veterinaria 79, Brno, 2010, 147 - 156

STRMISKA, J., HUŠEK, V., MINAŘÍK, R.: Výroba tvarohu a tvarohových specialit: Nové technologie. 1. vyd. NTL Praha, 1991, 271 s.

ŠILHÁNKOVÁ, L.: Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. 3.vyd. Academia Praha, 2008, 363 s.

TAYLOR, S., L.: Histamine poisoning associated with fis, cheese and other foods. Word Health Organization. WPH/FOS/85, 1985, 1-47

TEPLÝ, M. A KOL.: Technika a technologie potr. průmyslu, Výroba sýrů, kaseinů a kaseinátů, Novinky v technice a technologii. 1. vyd. SNTL Praha, 1985, 192 s.

VALSAMAKI, K., MICHAELIDOU, A., POLYCHRONIADOU, A.: Biogenic amine production in Feta cheese. Food Chemistry 71, 2000, 259-266

VELÍŠEK, J.: Chemie potravin 1. 2.vyd. OSSIS Tábor, 2002, 344 s.

VELÍŠEK, J.: Chemie potravin 3. 2.vyd. OSSIS Tábor, 2002, 368 s.

VOIGT, M., N., EITENMILLER, R.: Role of histidine and tyrosine decarboxylases and mono-diamine oxidases in amine buikl-up cheese. J. of F. Protection 41, 1978, 182-186

Vyhláška č. 77 / 2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro mléko a mléčné výrobky, mražené krémy a jedlé tuky a oleje

Vyhláška č. 203 / 2003 Sb., o veterinárních požadavcích na mléko a mléčné výrobky

YATSUNAMI, K., ECHIGO, T.: Studies on halotolerant and halophilic histamineforming bacteria. III. Changes in the number of halotolerant histamine-forming bacteria and contents of non-volatile amines in sardine meat with addition of NaCl. Bull. Japan Sot. Sci. Fisher. 59, 123-127 79

8

SEZNAM TABULEK A OBRÁZKŮ

8.1 Seznam tabulek Tabulka č. 1 Základní složení kravského mléka Tabulka č. 2 Klasifikace přírodního sýra podle zrání Tabulka č. 3 Rozdělení tvarohů Tabulka č. 4 Složení a znaky průmyslového tvarohu Tabulka č. 5 Složení olomouckých tvarůžků Tabulka č. 6 Koncentrace BA ve vybraných typech sýrů Tabulka č. 7 Fyziologické funkce biogenních aminů a polyaminů Tabulka č. 8 Významné mikroorganismy produkující biogenní aminy Tabulka č. 9 Popis odběru vzorků ve výrobním procesu Tabulka č. 10 Korelační vztahy (hodnoty r) mezi obsahem aminů (BA: TRY - tryptamin, PEA - 2-fenyletylamin, CAD - kadaverin, HIS - histamin, TYR -tyramin,PA: PUT putrescin, SPD - spermidin, SPM - spermin) v mg.kg-1 a počty mikroorganismů (ENC enterokoky, BMK - bakterie mléčného kvašení, CPM - celkový počet mikroorganismů, BREVY - brevibakterie) v log KTJ.g1

Tabulka č. 11 Korelační vztahy (hodnoty r) mezi počty skupin mikroorganismů (ENC enterokoky, BMK - bakterie mléčného kvašení, CPM - celkový počet mikroorganismů, BREVY - brevibakterie) v log KTJj.g-1

8.2 Seznam obrázků Obrázek č. 1 Vznik histaminu z histidinu Obrázek č. 2 Vznik tyraminu z tyrosinu Obrázek č. 3 Vznik kadaverinu z lysinu Obrázek č. 4 Vznik tryptaminu z tryptofanu Obrázek č. 5 Biosyntéza polyaminů Obrázek č. 6 Vliv tvaru sýra zrajícího pod mazem na obsah BA a PA Obrázek č. 7 Vliv tvaru sýra zrajícího pod mazem na obsah sumy všech aminů ( Σ BA) Obrázek č. 8 Vliv doby skladování na obsah BA a PA Obrázek č. 9 Vliv doby skladování na obsah sumy všech aminů (Σ BA) Obrázek č. 10 Vliv teploty skladování na obsah BA a PA Obrázek č. 11 Vliv teploty na obsah sumy všech aminů (Σ BA) 80

Obrázek č. 12 Současný vliv teploty a doby skladování na obsah PUT, CAD, HIS, TYR Obrázek č. 13 Současný vliv teploty a doby skladování na sumu putrescinu, kadaverinu, histaminu a tyraminu (Σ PUT, CAD, HIS, TYR)

Obrázek č. 14 Současný vliv teploty a doby skladování na obsah sumy všech aminů (Σ BA)

Obrázek č. 15 Obsah BA a PA ve vstupní surovině před a po nasolení Obrázek č. 16 Obsah sumy všech aminů (Σ BA) ve vstupní surovině před a po nasolení Obrázek č. 17 Závislost stáří sýra na obsah tyraminu (TYR) Obrázek č. 18 Závislost stáří sýra na obsah histaminu (HIS) Obrázek č. 19 Závislost stáří sýra na obsah putrescinu (PUT) Obrázek č. 20 Závislost stáří sýra na obsah kadaverinu (CAD) Obrázek č. 21 Závislost stáří sýra na obsah sumy všech aminů (ΣBA) Obrázek č. 22 Vliv tvaru sýra zrajícího pod mazem na počet enterokoků (ENC), bakterií mléčného kvašení (BMK) a celkového počtu mikroorganismů (CPM)

Obrázek č. 23 Vliv doby skladování na počet enterokoků (ENC), bakterií mléčného kvašení (BMK) a celkového počtu mikroorganismů (CPM)

Obrázek č. 24 Vliv teploty skladování na počet enterokoků (ENC), bakterií mléčného kvašení (BMK) a celkového počtu mikroorganismů (CPM)

Obrázek č. 25 Počet mikroorganismů ve vstupní surovině před a po nasolení Obrázek č. 26 Závislost celkového počtu mikroorganismů (CPM), bakterií mléčného kvašení (BMK) a bakterií rodu Enterococcus (ENC) na stáří výrobku (všechny dané vzorky byly posouzeny jako jeden soubor bez ohledu na jednotlivé faktory)

Obrázek č. 27 Závislost počtu mikroorganismů rodu Brevibacterium (BREVI) v log KTJ .g-1 na stáří sýra (dny)

81

9

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK

AGM – agmatin aw – vodní aktivita BA – biogenní aminy BMK – bakterie mléčného kvašení BREVI – bakterie rodu Brevibacterium CAD – kadaverin CPM – celkový počet mikroorganismů DAO – diaminooxidázy ENC – bakterie rodu Enterococcus GC – plynová chromatografie HIS – histamin HPLC – vysokoúčinná kapalinová chromatografie KTJ – kolonie tvořící jednotky MAO – monoaminooxidázy MAIO – inhibitory monoaminooxidázy PA – polyaminy PAO – polyaminooxidázy PEA – 2-fenyletylamin PUT – putrescin SPD – spermidin SPM - spermin TRY – tryptamin TYR – tyramin

82