Mikrobiální biofilm Jak žijí bakterie v přirozeném prostředí? JIŘÍ SCHINDLER
s s
O existenci bakterií v přírodě se ví všeobecně a také je všeobecně známo, že se bakterie pěstují na živných půdách ve skleněných nebo plastikových miskách. Rostou v malých kopečcích, jimž se trefně říká kolonie. Jak také jinak, když tímto způsobem bakterie kolonizují území, které jim pěstitel přidělil. Než však Robert Koch přišel na způsob jak pěstovat bakterie na pevných půdách, pěstovaly se po několik let v tekutinách, nejčastěji v bujonu. V něm se volně vznášely, plavaly a množily se, nebyl ale znám způsob jak je od sebe oddělit. To umožnily až Kochovy agarové půdy, díky nimž se dala získat čistá kultura a mohl začít zlatý věk bakteriologie. Ten byl naplněn studiem morfologie, fyziologie a genetiky bakterií – a vírou, že výsledky studia prozradí o bakteriích vše. Překvapivě věrně kopírovala bakteriologie cesty počátků zoologie až na to, že se kabinety bakteriologů neplnily vycpanými bakteriemi. Bakterie byly hodnoceny podle toho, co o nich mikrobiolog zjistil ve své malé zoologické zahradě. Změřil je, namaloval, vyfotografoval, prozkoumal jejich metabolizmus. Stejně tak to dělali ostatní přírodozpytci, kteří studovali zvířata v zajetí. Nikoho nenapadlo, že by bakterie ve své přirozenosti žily jinak než jako plankton volně se vznášející v mořích nebo jako kolonie na výživné podložce. Chování bakterií v jejich přirozeném prostředí se prostě předvídalo podle výsledků výzkumu čistých kultur. Z nedostatku pochyb o dogmatech upadla bakteriologie do pasti a ocitla se na scestí, což ovšem není tak vzácné. Dlouho platilo, že v žaludku člověka a jiných savců bakterie nemohou žít, protože je tam velmi kyselé prostředí (dnes víme nejméně o tuctu druhů, které v žaludku bývají). Také se nepředpokládalo, že by se některé bakterie mohly významně pomnožit v amébách jako legionely (gramnegativní nepohyblivé bakterie vyvolávající onemocnění dýchacího a cévního systému) nebo že se mikrob náročný na kultivační půdu nemůže přirozeně množit v chudém prostředí. Překvapení poskytly opět legionely. Trvalo dlouho, než jim podle rafinovaně sestaveného a kuriózního receptu mohla být nabídnuta bohatá kultivační půda, na jiné totiž nerostou. Přitom se ale dají snadno získat – z rezavé vody, kterou je naplněno ústřední topení. V čem spočívá scestí, jež se tu poněkud dramaticky líčí? Dlouho nikoho ani nenapadlo pátrat po tom, Na protější straně nahoře celkový pohled na Borobudur z východní strany, dole detail z druhé terasy.
jak žijí bakterie v přirozeném prostředí. Žije každá buňka sama pro sebe, nebo je ovlivňována ostatními a sama ovlivňuje druhé? Uplatňuje se už i u bakterií nějaký systém funkční diferenciace? Díky své fenotypové přizpůsobivosti představují bakterie nejúspěšnější formu existence života na Zemi. Mohou žít buď volně ve vodním prostředí jako plankton, nebo ve společenství, které vytváří tenkou vrstvu na pevných tělesech – biofilm. Ukazuje se, že existence v biofilmu je pro bakterie z mnoha důvodů výhodnější a ve většině prostředí také je základním způsobem jejich přirozené existence. V přírodě mají bakterie přirozenou tendenci lepit se, přilnout na pevný povrch. Přirozené tekuté prostředí pro bakterie jsou potoky, řeky, oceány, ale i odpadní vody, žumpy a průmyslové organické odpady. Zde všude biofilm přináší problémy, neboť přinejmenším znečisťuje povrch, na němž se tvoří, a někdy jej i chemicky poškozuje korozí. Zvětšuje například odpor lodního trupu při plavbě a poskytuje základ pro usazování řas a mušlí. V trubkách biofilm způsobuje turbulenci protékající tekutiny, černání kovů redukovaným železem nebo hnědnutí manganem. Podílí se také na korozi ropovodů či nádrží paliva v letadlech. V průmyslových výměnících tepla tvoří tepelnou izolační vrstvu a snižuje jejich účinnost. Zmenšuje průsvit potrubí pitné vody. Vhodné podmínky pro tvorbu biofilmu jsou také na cizích tělesech v lidském těle, jako jsou kanyly, katétry či plastikové protetické implantáty, kde bakterie mohou ohrozit léčbu, a tím i zdraví. Na druhou stranu biofilm střevní sliznice tvořený saprofytickými a symbiotickými bakteriemi člověka do jisté míry chrání před nevhodnými mikroby – i před patogeny. Struktura biofilmu K poznání struktury biofilmu nestačí běžné metody optické mikroskopie ani elektronová mikroskopie (mimo jiné proto, že nepracuje s živými objekty). Je nutno použít fyzikální a fyzikálněchemické metody. Například na konfokálním laserovém mikroskopu lze rastrovací technikou prohlížet plochy ve zvolené hloubce objektu. Biofilm se tak může zobrazovat jakoby v řezech a z nich lze poskládat celou prostorovou strukturu. Při snímání obrazů časosběrnou metodou se dá získat i animovaný záznam dějů probíhajících v biofilmu. Tloušťka biofilmu závisí na dostupnosti živin a na tom, zda je složen z jednoho či více bakteriálních druhů. V přirozeném prostředí je společenství více druhů obvyklejší. Naměřené hodnoty tloušťky biofilmu kolísají od několika téměř do stovky mikrometrů. Biofilm není homogenní, skládá se z agregátů a četných dutin. Jsou to spletité, vzájemně propojené kanálky rozmanitého tvaru. Pomocí mikroelektrod lze v něm měřit koncentraci kyslíku. Ta je důležitá pro společnou existenci bakterií aerobních (potřebujících kyslík) a anaerobních (žijících bez kyslíku). Koncentrace kyslíku na povrchu biofilmu je nízká, o trochu hlouběji stoupá a dále do hloubky podle očekávání klesá, takže v základní vrstvě je nulová. V různých vrstvách má biofilm různý elektrický náboj, což pomáhá transportu živin. Z pozorování a měření byl vytvořen model architektury a funkce biofilmu. Bakterie jsou v něm rozProf. MUDr. Jiří Schindler, DrSc., (*1931) vystudoval Lékařskou fakultu Univerzity Karlovy v Praze. Zabýval se taxonomií a identifikací bakterií, studiem a modelováním růstu kolonií, otázkami rezistence bakterií na antibiotika a lékařskou informatikou. http://www.cts.cuni.cz/vesmir l VESMÍR 80, duben 2001
203
loženy nerovnoměrně, rostou v mikrokoloniích, shlucích bakterií kuželovitého nebo houbovitého tvaru. Mikrokolonie jsou spojeny spletitými kanálky. Většími mikrokoloniemi kanálky procházejí, jsou však tenčí, představují jakési póry. Na povrchu je biofilm omýván okolní kapalinou obsahující molekuly živin. Ta proniká i do biofilmu a póry se dostává až do nitra mikrokolonií. Biofilm jediného bakteriálního druhu má jednodušší stavbu než biofilm obsahující společenství více druhů. Značná část experimentálního zkoumání byla prováděna s kulturami Pseudomonas aeruginosa. Jak biofilm vzniká Jestliže pohybující se (planktonické) buňky hladovějí, přichytí se svými aktivními molekulami na nějaký pevný povrch, který skýtá dostatečný přísun živin. Podle této funkce se těmto molekulám říká adheziny. Mohou to být molekuly látek různé povahy – bílkoviny, glykopeptidy, polysacharidy. Jakmile bakterie přilnou NOVÉ NÁSTROJE V NOVÝCH PODMÍNKÁCH Jestliže se má biofilm vytvořit, je nutné, aby se v nových podmínkách užívaly nové nástroje. Zejména se musí vytvořit matrice, v níž budou buňky usazeny. Matrici tvoří polysacharid nebo (u již zmíněné Pseudomonas aeruginosa) hlenovitý polymer alginát. Ten je syntetizován řadou enzymů určených několika po sobě spouštěnými geny. Je-li do řady experimentálně vložen další gen, jehož produkt způsobuje dobře patrnou reakci, pak je míra jeho aktivity stejná jako aktivita genů v dráze syntézy alginátu a ukazuje dynamiku syntézy. Takový indikační gen například způsobuje modré zbarvení v přítomnosti laktózy. Alginát je intenzivně syntetizován v neobvyklé míře již za 15 minut po přilnutí bakterie na povrch. n CHEMICKÉ SIGNÁLY. V husté populaci používají buňky chemické signály, jimiž upozorňují okolní buňky na svou přítomnost. Je to určitá forma boje o území. Signální látky jsou jednoduché molekuly složené z mastné kyseliny a aminokyseliny serinu. U grampozitivních mikrobů jsou to peptidy, jež lze přirovnat k feromonům nebo hormonům. Řídí dělení buněk, a tím hustotu populace v biofilmu a tvorbu hlenové matrice. Byly prokázány v přirozeném prostředí – na říčních kamenech potažených biofilmem a na močových katétrech zavedených do močového měchýře na delší dobu. Signální látky lze prokázat i na místě, odkud byl biofilm odstraněn. Mutanty v genu, který ovládá tvorbu signálních molekul, vytvářejí nepovedený tenký nediferencovaný biofilm a buňky jsou mnohem citlivější k detergentům. Jestliže se jim přidá uměle syntetizovaná signální látka, tvorba biofilmu je normální. Signální látky tvořené bakteriemi působí na týž druh, některé ale na mnoho příbuzných druhů. Jejich účinek je tedy dobře jištěn. n GENY ODPOVĚDNÉ ZA SIGNÁLY. Genů tvořících komplexní systém signálů o přítomnosti buněk je několik desítek. Bílkoviny, jež jsou těmito geny určovány, mají ale více funkcí. Kromě regulace se uplatňují také faktory virulence, toxiny a enzymy, jež sepodílejí na rozvoji infekce. Pravděpodobně způsobují jistou fenotypovou diferenciaci, protože jinak by se buňky na povrchu mikrokolonií, které mají snazší přístup k živinám, množily více a zcela by ucpaly póry. Přísun živin do nitra by ustal a buňky uvnitř by hynuly. Tato úvaha zatím není experimentálně prokázána. Je však jasné, že populace v biofilmu je pod přísným regulačním režimem. n PŘENOS GENŮ MEZI BUŇKAMI V BIOFILMU je až tisíckrát úspěšnější než přenos v kapalině mezi buňkami žijícími planktonicky. n FENOTYP BUNĚK V BIOFILMU SE RYTMICKY MĚNÍ. Aktivací genu pro syntézu enzymu, který matrici štěpí, se buňky ze společenství uvolňují, odplavují se, popřípadě kolonizují další povrch. Po nějakou dobu si však zachovávají některé vlastnosti, které měly v biofilmu, jako třeba vyšší rezistenci k antibiotikům.
204
VESMÍR 80, duben 2001 l http://www.cts.cuni.cz/vesmir
k povrchu, změní své chování, změní se jejich fenotyp. Produkují do prostředí velké množství polysacharidu, který je podobný škrobu a také má podobné lepivé vlastnosti. Hmotnost polysacharidu může být až stokrát větší než hmotnost bakteriálních těl, jež ho produkují. Z této látky vzniká hlenová matrice, která drží buňky pohromadě a vytváří lešení, v němž se buňky množí. Tvoří se mikrokolonie. Zároveň vznikají kanálky a již zmíněná složitá struktura. Některé buňky se také z mikrokolonií na určitý impulz odlučují, přecházejí do planktonického stavu (odplouvají) a kolonizují další části povrchu. Příčinou může být konkurence a neúnosnost další existence ve společenství. Chemické signály vycházející z buněk a umožňující buňkám zjišťovat existenci okolních buněk (a tím i hustotu populace) prostě dalšímu zhušťování populace zabrání. Tento již dosti prostudovaný jev je označován trefným termínem quorum sensing. Co se v biofilmu děje Pro biofilm má význam i tekutá fáze, která ho obklopuje. Biofilm je viskózní, elastický. V proudu tekutiny se jeho struktura chová dynamicky, vlní se. V silnějším proudu se posunuje po podložce a šíří se na neobsazená místa. Když elasticita nestačí udržet buňky pohromadě, části biofilmu se odtrhávají. Při dostatečné až nadbytečné koncentraci živin či zdroje energie v experimentu s glukózou se povrch biofilmu vyrovnává, vlnky zmizí a vytvářejí se opět při poklesu koncentrace glukózy. Kapalina, která biofilm omývá zvenčí, přináší zužitkovatelné organické i anorganické látky a odnáší produkty metabolizmu. Do hloubky jsou – stejně jako kyslík – zanášeny již zmíněným systémem kanálků. Lze v nich pozorovat proudění, a dokonce byla změřena hydrodynamika protékající tekutiny. Kanálky mají poměrně velký průsvit, proudem tekutiny jsou snadno unášeny částice latexu o průměru 0,3 µm. Rychlost proudění v kanálcích, které jsou hlouběji, je nižší než v kanálcích při povrchu. V polovině hloubky je průtok oproti povrchu asi pětkrát pomalejší. Z kanálků proudí kapalina póry do nitra větších mikrokolonií a dále už se dostává jen difuzí (do omezené hloubky). Pro polysacharidy však difuze není příliš účinná. Kyslíku do hloubky ubývá. Při bázi biofilmu jsou již jen bakterie anaerobní. Proto je také biofilm přísného aeroba Pseudomonas aeruginosa tenčí než biofilm složený z více druhů. Je otázka, jak bakterie poznají přítomnost vhodného povrchu, na němž se mohou přichytit. Těsně před přilnutím se řada genů spouští nebo dramaticky zvyšuje svou aktivitu. Uplatňují se bičíky, jimiž jsou některé bakterie opatřeny. Ve fázi dotyku se jejich tvorba zvyšuje, v biofilmu se pak snižuje nebo úplně ustává. Pomáhají i další struktury, například fimbrie. Od bičíků se dost liší, vypadají spíš jako třásně nebo chloupky, na buňce tvoří husté kartáčky. Při dotyku s vhodným povrchem jich vznikne víc. Některé bakterie dokonce vytvářejí nový typ fimbrií, které byly popsány terpve nedávno a dostaly poetické jméno curli (kudrlinky). Je jisté, že bakterie mají schopnost zjistit dotek s podložkou, po němž následuje řada nových syntéz včetně syntézy polysacharidové matrice. Zajímavé je, že bakterie Escherichia coli (což je snad nejprobádanější mikrob, který byl klíčem k rozmachu biochemie a později i genetiky) při kultivaci ve zkumavce volně plavou a neusazují se na stěnách. Když se však kultivují v nádobách, kam se pomalu kontinuálně přivádí živný roztok, vytvářejí na stěnách bio-
uvolòování
planktonické buòky
mikrokolonie
pøichycení
sliz kanálek
film. Buňky v povlaku jsou však odlišné. Jsou to formy, které už mají schopnost se přichytávat. Mutací je zaměněna jediná aminokyselina v regulační bílkovině genu, který spouští produkci bílkoviny, z níž jsou kudrlinky složeny. To způsobuje jejich vysokou produkci. V elektronovém mikroskopu lze spatřit, že jsou jimi buňky hustě obaleny. Když se bakterie přichytí na povrch, mění své vlastnosti, zprvu jen na úrovni regulace genů. Aktivují se geny, které produkují polysacharidy a polymery rozhodující pro vznik biofilmu. Experimentálně se to prokazuje označením genů, jejichž produkty lze pozorovat i světelným mikroskopem in vivo. Analýzou bílkovin byly zjištěny rozdíly mezi planktonicky žijícími buňkami a buňkami v biofilmu, kde se více tvoří například bílkoviny pórů v buněčné stěně, bílkoviny transportující živiny do buňky a bílkoviny syntetizující hlenový obal. Projevuje se to také v bílkovinné skladbě zevní membrány, jež je dotykovou strukturou s vnějším prostředím. V biofilmu buňky reagují na podněty z prostředí jinak než buňky planktonické. Spouštěcími podněty pro změnu regulace činnosti genů jsou zevní podmínky v tvořícím se biofilmu – zvýšený osmotický tlak, snížený obsah kyslíku a rostoucí hustota populace. Přechod z planktonického způsobu existence je pravděpodobně řízen transkripčním s-faktorem, podobně jako sporulace a disociace kolonií. Kolonie bakterií v určité disociační fázi, v níž se nacházejí, mají změněný vzhled a buňky změněné antigenní složení. Buňky, u nichž s-faktor přestane být aktivní, mění svůj fenotyp, produkují enzymy, které štěpí matrici, v níž jsou buňky uvězněny, ty se uvolňují, odplouvají a jsou opět planktonické. Dochází k tomu v určitém rytmu. Zdánlivě prostý jev usazování bakteriálního povlaku je spojen s komplikovanou souhrou mnoha genů. Nutno ovšem říci, že biofilm byl většinou studován a modelován u gramnegativních mikrobů. Je to snazší, protože tyto bakterie jsou lépe vybaveny pro přichycení na povrchu. Biofilm tvoří ovšem i bakterie ze skupiny grampozitivních, například stafylokoky, které jsou původci hnisavých povrchových i celkových infekcí. Některé kmeny vytvářejí sliz, jímž se mohou přichycovat a budovat matrici pro biofilm. Tento hlen je i nástrojem patogenity. Biofilm a medicína Za normálních podmínek je biofilm v lidském organizmu pravidelně přítomen jako zubní plak. Ten je nejstarším popsaným biofilmem v lidském těle, pozoroval ho už A. van Leewenhoek. Je víceméně fyziologický, vzniká přirozeně. Lze ho sice odstranit, ale vždy se vytvoří znovu. Jeho tvorbu zesiluje sacharó-
Vznik a struktura biofilmu. Planktonické buňky se pomocí bičíků nebo fimbrií přichytí na pevný povrch, který jim poskytuje živiny. Brzy začnou vytvářet mikrokolonie kuželovitého tvaru, které jsou propojeny spletitými kanálky. Biofilm je elastický a když jeho elastičnost nestačí udržet buňky pohromadě, odtrhávají se.
za, kterou konzumujeme v potravě. Po odstranění kartáčkem se zubní sklovina povlékne slinami obsahujícími minerály a organické látky. Na této velmi tenké blance se usazují bakterie (viz Vesmír 76, 612, 1997/11). V ústech jsou bakterie, které mají schopnost vylučovat hlenovitou hmotu, slepovat se a tak uvěznit další bakterie a kvasinkovité mikroby. Plak se ztlušťuje, stává se málo propustným, bakterie hladovějí, nouzově štěpí vlastní zásobní cukry a vzniklé kyseliny mohou sklovinu poškozovat. Biofilm vytvořený ve tkáních může být ohniskem infekce, která by mohla kdykoliv vzplanout. Vytváří se zejména v nekrotických tkáních, ve žlučových cestách, při infekci kostní dřeně, při zánětu prostaty či při cystické fibróze (viz Vesmír 75, 365, 1996/7). Zde masa slizu produkovaná zejména Pseudomonas aeruginosa a příbuznými bakteriemi ucpává dýchací cesty. Nejčastěji tvoří biofilm stafylokoky, pseudomonády, Escherichia coli, někdy streptokoky a aktinomycety. Biofilm bývá příčinou chronické infekce, jejíž příznaky nejsou tak zřetelně vyjádřeny jako při infekci akutní. Je-li do arterie, žíly, močové trubice či vzdušnice zavedena cévka, začne se biofilm na její stěně tvořit do několika dnů a představuje pak stálou hrozbu, která se podle stavu onemocnění může a nemusí splnit. Má-li pacient plastovou náhradu srdeční chlopně a dostanou-li se do krevního oběhu i málo virulentní bakterie, mohou se uchytit na povrchu chlopně a vytvořit biofilm (patologové mu říkají vegetace), který přispěje k uvolnění chlopně. Podobné nebezpečí hrozí při biofilmu na povrchu děložního tělíska, při nesprávném režimu v dialyzačním přístroji nebo při nesprávném hygienickém režimu s kontaktními čočkami. Naneštěstí patří k základní charakteristice biofilmu, že buňky jsou velmi odolné k antimikrobním látkám a dezinfekcím. Tento problém není prakticky zvládnut ani vysvětlen. Údajně jsou buňky biofilmu vůči antibiotikům až tisíckrát odolnější než buňky planktonické. (Tak vysoká odolnost se ale nepotvrdila úplně ve všech experimentech.) Vysvětlení zvýšené rezistence se hledá. Jako první se nabízí možnost, že je difuze antibiotika snížena hustým prostředím polysacharidové hmoty. Hraje tu roli i sorpce, avšak antibiotikum po určité delší době přecejen do biofilmu pronikne. Dokonce byl vytvořen umělý biofilm tím, že se bakterie za definovaných zvolených podmínek uvěznily v hlenové hmotě, kterou http://www.cts.cuni.cz/vesmir l VESMÍR 80, duben 2001
205
vytvářejí, a zjistilo se, že i když antibiotika hlenem pronikají, buňky jsou vůči nim o několik řádů odolnější. Je tedy snad možné, že se některá antibiotika navážou na polysacharid matrice, a tím ztratí svou aktivitu. Další domněnkou je, že buňky jsou v biofilmu převážně v klidovém stavu, množí se velmi pomalu, hladovějí a antibiotika, která působí jen na buňky rostoucí, zde neúčinkují. Jiní badatelé prokázali, že zvýšená rezistence na růstové rychlosti nezávisí. U rezistence k některým antibiotikům se současně uplatňuje gen označovaný mar (multiple antibiotic resistance), který ovládá gen, jenž spouští nespecifickou odtokovou pumpu, tj. univerzální mechanizmus rezistence k antibiotikům. Ten spočívá v tom, že antibiotikum, jež do buňky pronikne, je opět aktivně vypuzováno (viz Vesmír 78, 27, 1999/1). Ani tento mechanizmus však není v biofilmu zesílen. Zatím se tedy říká, že jde o jednu z fenotypových změn, které jsou pro buňky biofilmu charakteristické. Pro praxi se navrhují některé postupy: aplikace antimikrobních látek v intervalech, současné působení ultrazvuku a antibiotik, a působení antimikrobními látkami v elektrickém poli, což je kupodivu zatím v laboratorních podmínkách nejúčinnější. Biofilm mikrobiologům nastavil zrcadlo. Mohou si v něm prohlédnout svou dřívější tvář, v níž se zračí málo snahy pátrat po životě bakterií v přírodě a nedostatek skepse k laboratorním pokusům. Klinickým mikrobiologům vysvětluje nebezpečí, ale zatím nepřináší řešení. Hanbit se však není za co, protože tak to ve vědě a v poznání chodí od chvíle, co se člověk začal snažit něčeho se dopátrat. o 1. Nahoře: Segment vyříznutý ze spodní části potrubí plynovodu o průměru 800 mm, na němž byly pod porušenou izolací nalezeny četné krusty korozních produktů. Dole: Po mechanickém odstranění krust jsou ve stěně potrubí patrné důlky o hloubce až 7 mm (oba snímky © Vladimír Klemera).
Mikrobiální koroze kovů Biofilm škůdcem staveb uložených v zemi JAROSLAV JULÁK
Vzhledem k neobvyklým „stravovacím návykům“ a způsobům anaerobního dýchání mohou mnohé bakterie buď přímo konzumovat, nebo svými životními projevy mimoděk ničit (degradovat či korodovat) předměty a materiály, které lidé považují za důležité. Kromě degradace některých plastů, která životnímu prostředí prospívá, bývá působení mikrobů na předměty spíše škodlivé. K objektům mikrobiální koroze patří např. kámen, beton, živičné materiály a také kovové výrobky (např. měděná potrubí či hliníkové letecké nádrže korodované plísněmi rodu Cladosporidium), zejména železné. (O vlastnostech Prokaryont viz tabulku na s. 210) Koroze železných kovů Korozi železných kovů je možno rozlišit na aerobní (za účasti kyslíku) a anaerobní (bez účasti kyslíku). Tyto dva typy se ovšem mohou v různých podmínkách kombinovat a navzájem podporovat. Odedávna je známa aerobní koroze v podobě poměrně jednoduchého rezivění železa. Anaerobní koroze byla objevena až roku 1934. Mikrobiální korozi by měla být věnována pozornost zejména pro její ekonomický dopad. Namátkou uveďme několik čísel: Například v USA byly škody způsobené mikrobiální korozí za rok 1968 odhadnuty na miliardu amerických dolarů ročně; v roce 1972 tam bylo mikrobiální korozí způsobeno 77 % všech poruch v naftařském průmyslu; škody na podzemních potrubích činily 500–2000 milionů dolarů. Ve Velké Británii stály v šedesátých letech podobné poruchy 20–300 milionů liber ročně. Není mi známo, kolik činily škody u nás, ale z vlastní zkušenosti vím, že náklady na opravy potrubí jsou u nás značné, zejména v plynárenském průmyslu. Zvláště závažné by mohly být důsledky mikrobiální koroze nádob používaných pro skladování nukleárního odpadu (viz Vesmír 79, 190, 2000/4). Mikrobiální korozi podléhají všechny slitiny, naprosto spolehlivě odolává pouze titan. Nejnebezpečnějším typem mikrobiálních korozí je anaerobní koroze s tvorbou biofilmů za účasti sulfátredukujících bakterií. Doc. RNDr. Jaroslav Julák, CSc., (*1944) vystudoval anorganickou chemii na Přírodovědecké fakultě UK v Praze. V Ústavu pro lékařskou mikrobiologii na 1. LF UK se kromě výuky věnuje aplikacím instrumentálních metod chemické analýzy v mikrobiologické diagnostice, jakož i přípravě a studiu bakteriálních imunomodulátorů. (e-mail:
[email protected])
206
VESMÍR 80, duben 2001 l http://www.cts.cuni.cz/vesmir
Biofilm Biofilmem nazýváme společenstva bakterií i vyšších organizmů, která tvoří tenké povlaky na různých površích (viz též článek J. Schindlera na s. 203). Podmínkou jejich vzniku je přítomnost vody, živin a kyslíku (nebo jiného příjemce elektronů). K povrchu a zároveň k sobě navzájem přilnou bakterie svými povrchovými strukturami (polysacharidovými vlákny, fimbriemi). Uvnitř biofilmu probíhá látková výměna a soutěž o živiny. Typické biofilmy mívají svrchní vrstvu prokysličenou a spodní vrstvu bez kyslíku. Tato skutečnost je významná v dynamice jejich vzniku – například prvotní osídlení aerobními organizmy může umožnit sekundární osídlení organizmy anaerobními. Příkladem biofilmu je třeba zubní plak, za mikrobiální korozi může být považován i zubní kaz. Pro vznik mikrobiální koroze má biofilm velký význam. Sulfátredukující bakterie (SRB) Jde o taxonomicky různorodou skupinu, která podle posledních údajů zahrnuje 12 rodů a 42 druhů, převážně z říše Eubacteria, výjimečně i Archaea. Jsou to anaerobní organizmy, jejichž společným znakem je využití síranového aniontu (sulfátu) nebo i jiných kyslíkatých sloučenin či elementární síry jako akceptorů elektronů pro biologické oxidace. Místo kyslíku tedy vlastně „dýchají“ sulfáty, některé z nich též nitráty a snad i fosfáty. Různé druhy s různou morfologií (koky, tyčinky, vibria, spirály) mohou jako živiny a donory elektronů využívat různé organické kyseliny, alkoholy, cukry, aminokyseliny, uhlovodíky, ale i anorganické látky (viz Vesmír 71, 305, 1992/6); některé z nich mají enzym hydrogenázu, který jim umožňuje „živit se“ autotrofně jen vodíkem H2 a oxidem uhličitým. Kyslík je pro některé z nich jedem, ale některé jej v malé koncentraci tolerují, jiné snad i částečně využívají. Další (zejména rod Desulfotomaculum) mohou tvořit spory a přežívat tak nepříznivé podmínky, např. nedostatek vody a živin či nadbytek kyslíku. V přírodě jsou sulfátredukující bakterie téměř všudypřítomné, vyskytují se v půdě, vodách, a hlavně v usazeninách na dně moří i rybníků či v naplaveninách u ústí řek. Jejich role v přírodě je nezastupitelná, neboť jsou důležitými účastníky přírodního koloběhu síry. Téměř polovina lidské populace má tyto bakterie v ústní dutině (v mezizubních a dásňových kapsách) a v tlustém střevě, kde se možná účastní vzniku ulcerativní kolitidy. Byl popsán i jejich průnik do krve a následné horečnaté onemocnění. Kromě toho, že způsobují korozi kovů, mohou při přemnožení zamořit vodu i okolní atmosféru nadbytkem toxického sulfanu a způsobit úhyn ryb či vegetace.
sulfátredukující bakterie
Fe
FeS
2. Nesprávná představa mikrobiální koroze, podle níž sulfátredukující bakterie prostě „přijde“ a začne „dýchat“ sulfát
strukturou vznikne na vlhkém povrchu železa lokální elektrický článek. Na jeho anodě se železo rozpouští za vzniku Fe2+ (následně i Fe3+) a zároveň elektrony na katodě redukují kyslík za rozkladu vody a vzniku OH–. V čisté vodě jsou obě „elektrody“ blízko u sebe, vzniklá vrstvička hydroxidu železnatého a oxidů ulpívá pevně na povrchu kovu, čímž omezuje další korozi. Za přítomnosti elektrolytů (solí) mohou být katoda a anoda značně vzdálené, Fe2+ a OH– se setkají teprve po difuzi do roztoku a hydroxid železnatý se vylučuje jako porézní usazenina nebránící přístupu kyslíku a další korozi. Následnými reakcemi vznikají hydroxid železitý a oxid železitý, které mohou nad místem koroze vytvořit hrbolek; prasklinami obalu komunikuje jádro hrbolku s okolím, takže je možný přísun dalšího kyslíku. Taková místní koroze za vzniku důlků pod hrbolky (pitting, obr. 3) je velmi nebezpečná. Aerobní biofilm na povrchu kovu může zpomalovat přísun kyslíku, a tím i korozi. Na druhou stranu ale může korozi podpořit tvorbou koncentračních článků nebo působením kyselých produktů bakteriálního metabolizmu. n Abiotická anaerobní koroze. Korozním činidlem je při ní sulfan (postaru sirovodík), anodickou reakcí při ní vznikají sulfidy železa (obvykle mackinawit), na katodě je sulfan redukován na vodík H2 a anion HS–. Mackinawit netvoří na povrchu kovu ochranný film, může však přecházet na řadu jiných sulfidů železa lišících se složením a krystalovou strukturou, z nichž některé na povrchu kovu naopak pevně ulpívají a korozi zpomalují. Také v tomto případě se mohou kromě plošné koroze tvořit hrbolky, podobně jako při korozi aerobní. V obalech hrbolku a ve vnitřní dutině nalézáme (kromě složek uvedených v předchozím odstavci) různá množství sulfidů žele3. Schematický průřez místem důlkové koroze
Mechanizmy mikrobiální koroze Bakterie samy o sobě žádný korozní děj nezpůsobují, ale mnohé z nich (včetně sulfátredukujících bakterií) se korozních procesů účastní a výrazně je podporují. Představa mechanizmu mikrobiální koroze uvedená na obr. 2 rozhodně neodpovídá skutečnosti. Mechanizmy působení bakterií jsou totiž závislé na podmínkách v dané oblasti a mohou se uplatňovat následně, střídavě nebo současně. Přestože s korozí bylo provedeno mnoho pokusů, žádná z teorií vzniku a rozvoje koroze sama o sobě děje v přirozených podmínkách bezezbytku nevysvětluje. n Aerobní koroze. Typická aerobní koroze je elektrochemický proces, při němž v místě s odlišnou
voda praskliny
drob
ivá k
rusta
køehký obal
mazlavé jádro dutina korozní báze kov
http://www.cts.cuni.cz/vesmir l VESMÍR 80, duben 2001
207
H+ H
Fe2+ sulfidy kov
e–
oxický roztok
iviny SO42–
O2
oxický biofilm
anoxický biofilm
a
S0, SO42–
FeOOH
FeS2
HS–
FeS
H+ H
Fe2+ sulfidy kov
e–
b
4. Koroze pod anaerobním biofilmem (a); koroze pod aerobním a anaerobním biofilmem (b)
za. Rychlost anaerobní koroze je závislá na koncentraci solí a sulfanu. Při malé koncentraci vznikají hlavně ochranné sulfidy troilit a pyrit, větší koncentrace vedou převážně ke vzniku mackinawitu. Vylučování mackinawitu je závislé též na koncentraci vodíkových iontů: optimální je při pH 6,5–8,8, v kyselejším či zásaditějším roztoku vznikají převážně ochranné sulfidy. Korozi zpomaluje též vylučování vodíku, který svým přepětím polarizuje železnou katodu. Vznikající sulfidy jsou ovšem samy o sobě pro železo též korozivní. Jsou totiž dobrými vodiči elektřiny s malým přepětím vodíku, a pokud pokryjí katodové místo, stávají se samy katodou, depolarizují ji a článek je tak udržován v chodu. Zdá se, že nejméně aktivním depolarizátorem je opět pyrit, ostatní korozi významně urychlují. Tyto mechanizmy byly prokázány v řadě modelových experimentů, v terénních podmínkách se mohou uplatnit pouze při dostatečném zdroji sulfanu. n Koroze pod anaerobním biofilmem (obr. 4a). Za přítomnosti vrstvy sulfátredukujících bakterií je abiotická anaerobní koroze výrazně urychlována. Vysvětlením je teorie depolarizace katody, podle níž bakterie svou hydrogenázou spotřebovávají katodu polarizující vodík. Protože ovšem korozi významně urychlují i sulfátredukující bakterie, které hydrogenázu nemají, bylo nutné hledat alternativní vysvětlení, spočívající pravděpodobně ve velké koncentraci sulfanu v biofilmu. Ten je produkován aktivními sulfátredukujícími bakteriemi (ať už hydrogenázu mají nebo ne). Sekundární produkty, které při tom vzni-
208
VESMÍR 80, duben 2001 l http://www.cts.cuni.cz/vesmir
6,5; 0 %
1,5; 0 %
HS–
FeS1–x
40 000; 2–5 %
anoxický biofilm
MIKROBIÁLNÍ KOROZE TRANZITNÍHO PLYNOVODU Na potrubí uloženém v hloubce 2–3 m pod zemí a izolovaném polyetylenovou páskou byla r. 1984 zjištěna koroze (obr. 1). Projevovala se četnými důlky o hloubce až 7 mm, které byly pokryty hrbolky a krustami korozních produktů. Důlky se vyskytovaly na vnějším povrchu potrubí, v jehož spodní části byla izolace oddělena od kovu a deformována do „kapes“ naplněných vodou a korozními produkty. K výsledkům jsme dospěli vyšetřením více než 200 vzorků produktů koroze, zeminy a vody z různých lokalit. n Rozpoznávání mikrobiální koroze. Pro mikrobiální korozi je důležité složení zeminy v dané lokalitě, určující agresivitu zeminy. Korozi jsme pozorovali nejčastěji v lokalitách s vlhkou až bahnitou, obvykle jílovitou zeminou, vlastní výkop někdy fungoval jako drenáž povrchové vody. Na rozdíl od okolní „jalové“ zeminy obsahoval zásyp potrubí často větší množství organických příměsí. Po odkrytí potrubí se někdy koroze poznala podle charakteristického zápachu po sulfanu (sirovodíku) a dalších zplodinách metabolizmu sulfátredukujících bakterií. Když jsme odstranili porušenou izolaci, byl povrch potrubí často pokryt krustami zplodin, vyplněnými černou páchnoucí mazlavou hmotou; při pokročilé korozi pod nimi byly důlky s lesklou spodinou. Kolem důlků bylo někdy lesklé, rychle rezivějící mezikruží. n Důkaz mikrobiální koroze. Kultivací na syntetických médiích byly v produktech koroze i v okolní vodě a zemině prokazovány velké koncentrace sulfátredukujících bakterií. Tyto bakterie se elektronovou mikroskopií našly též v řezech korozních hrbolků a v jejich výplni. V korozních produktech a často i v okolní vodě či zemině se chemickou analýzou zjistily různé koncentrace sulfidů, ojediněle i fosfidů. n Vyhledávání mikrobiální koroze. U dlouhých podzemních potrubí je potřeba umět určit místo koroze, aby se odkrylo správné místo. Poruchy se zjišťují defektoskopickými metodami. Při preventivním „tipování“ rizikových lokalit se hledají místa s vysokou korozní agresivitou zeminy a místa s velkou koncentrací sulfátredukujících bakterií, jejichž počítání, tedy zjišťování „infekční dávky“ pro místa poruch, se nám při hledání rizikových lokalit osvědčilo nejvíce. V místech bez koroze byl obsah sulfátredukujících bakterií do 102 bakterií v 1 cm3 zeminy, zatímco v místech s korozí jich bylo nalézáno 103 až 105 v závislosti na místě odběru (obr. 5). Obsah bakterií lze ovšem stanovit až po odkrytí potrubí výkopem; pro praktické využití je třeba najít techniku bezvýkopového odběru vzorků z bezprostřední blízkosti potrubí.
300 000; 5–10 %
iviny SO42–
anoxický roztok
4 000; <2 % 5. Průřez okolím korozního místa plynovodu v lokalitě obce Třebýlinka (rozměry v obrázku neodpovídají skutečným poměrům). Na obrázku jsou uvedeny obsahy sulfátredukujících bakterií (počet bakterií v 1 cm3 zeminy) a semikvantitativní obsahy sulfidů v zemině v okolí tranzitního potrubí.
kají, nejenže ochranný povlak nevytvoří, ale dokonce již vytvořený povlak naruší. n Střídání aerobních a anaerobních podmínek. Rychlost koroze železa, respektive oceli, je výrazně větší, jestliže je v kapalině kyslík a sulfan zároveň, než když je tam jen jeden z nich. Totéž platí pro jejich střídavou přítomnost, tj. střídání aerobních a anaerobních podmínek. Korozními produkty jsou přitom převážně sulfidy železa. Vysvětlení tohoto zřejmě složitého jevu není dosud jednoznačné, přestože řada navržených mechanizmů byla již podpořena laboratorními pokusy. Významnou roli hraje přítomnost produktů reakcí sulfanu s kyslíkem, zejména korozivních polysulfidů a elementární síry, a dále siřičitanů, thiosíranů a síranů. Důležitá se zdá být též úloha kyslíku jako depolarizátoru katody. Také vzájemné přeměny oxických a anoxických produktů (obr. 4b), spojené s objemovými změnami, mohou narušovat ochranný povlak a urychlovat korozi. Ani
role sulfátredukujících bakterií, jejichž metabolizmus může zahrnovat všechny výše uvedené sloučeniny síry a přispívat tak k jejich vzájemným přeměnám, dosud není vysvětlena beze zbytku, i když jejich příspěvek k rychlosti koroze je nesporný. n Teorie korozivních metabolitů. Tato teorie předpokládá, že sulfátredukující bakterie produkují vysoce korozivní sloučeninu redukovaného fosforu, který velmi rychle napadá železný povrch, a tím vznikají fosfidy železa. Přestože tento korozivní metabolit je zatím jen hypotetický, není jeho spoluúčast na korozi vyloučena. Fosfan jako možný produkt rozkladu fosfidů jsme vedle sulfanu nalezli v několika případech i při našich pokusech. Známe-li mechanizmy mikrobiální koroze, máme více možností jí předcházet. Ze všeho ale nelze vinit bakterie – často by ke korozi vůbec nedošlo, kdyby u podzemních staveb, například u potrubí (viz rámeček), nebyla porušena izolace. o
Psi a tajemné cesty ničivek
MARIE LIPOLDOVÁ
Tropický parazit napadl americké lovecké psy. Zbláznila se příroda? Některé druhy tropických parazitických prvoků rodu Leishmania vnikají do sleziny, jater a kostní dřeně infikovaných živočichů a člověka. Výsledky působení parazita vhodně charakterizuje jeho starší český název – ničivka útrobní. Jestliže tato forma leishmaniózy není léčena, může skončit smrtí. Dosud byla nemoc rozšířena v tropických a subtropických oblastech; nejvíce případů onemocnění se vyskytuje v Jižní Americe, Africe, středomořské oblasti a v Indii. Leishmanie se šíří tak, že hmyzí přenašeči – drobní komárkové rodu Phlebotomus (koutule či též „flebotomové“) – nasají krev infikovaného jedince, potom bodnou zdravého člověka, a tím parazity přenesou. Oblasti mírného pásma jsou tohoto onemocnění ušetřeny, protože tam nejsou pro flebotomy vhodné životní podmínky. Proto bylo velkým překvapením, když byla u loveckých psů z 21 amerických států a u psů z kanadské provincie Ontario identifikována Leishmania infantum. Vědci vůbec netuší, jak se mohl parazit rozšířit tak daleko na sever. Sporadické případy nakažených psů mírného pásma se objevovaly už dříve. Vysvětlovalo se to nakažením během pobytu v zamořených oblastech a nikdo otázku původu parazita dále nestudoval. Situace se změnila v roce 1999. Lovečtí psi v exkluzivním klubu v Millbrooku, který je vzdálen 130 kilometrů od New Yorku, začali krvácet, hubnout, línat, trpět ledvinovou nedostatečností, a nakonec zemřeli. Nejdříve se příčinou onemocnění nikdo nezabýval, pak byl povolán specialista na nemoci přenášené klíšťaty, jimiž je tato oblast zamořená. V krvi psů nenašel nic. Až po delším zkoumání byly jako příčina onemocnění identifikovány leishmanie. Po tomto nečekaném odhalení bylo testováno téměř 11 000 loveckých psů a 12 % z nich mělo v krvi protilátky proti leishmaniím, což znamená, že se s chorobou museli setkat. Vědci pak testovali ještě potulné psy kolem Millbrooku a staré krevní vzorky z 450 psů. Všechny byly negativní. Zůstává otázkou, jakým způsobem mohlo být přes tisíc loveckých psů infikováno. Flebotomové nebyli pozorováni ani kolem Millbrooku, natož pak v Michiganu nebo v Kanadě. Přímý přenos krví bez přenašeče se sice výjimečně vyskytnout může, ale rozhodně jím nelze vysvětlit tak velké množství případů.
Jedním z možných vysvětlení jsou časté cesty „elitních“ psů na jih, kde se flebotomové vyskytují. Další možností je, že na severu žije nový druh flebotomů, přizpůsobený tamním podmínkám. Jiná teorie předpokládá nový druh přenašeče. Tato diskuse není pouze akademická. Jestliže flebotomové mohou přenést leishmanie na psy, mohli by je přenést také na lidi. Zatím důvod k panice není. Leishmania infantum je endemická kolem Středozemního moře, kde je jí nakaženo kolem 20 % psů. Klinická forma choroby se u většiny ras neprojevuje. K přenosu na člověka a k jeho onemocnění nedochází příliš často, v nebezpečí jsou hlavně děti a lidé s oslabeným imunitním systémem. Znalost způsobu přenosu bude důležitá také při pokusech o vyhlazení parazita ze Severní Ameriky. Jestliže jsou leishmanie přenášeny mezi psy přímo krví, stačí odstranit nakažená zvířata. Jestliže je ale přenášejí přizpůsobení flebotomové, mohou být infikováni další psi, kojoti, lišky – a už se leishmanie nikdy nebude možné úplně zbavit. (Science 290, 1881, 2000) ¨
Komárek rodu Phlebotomus, pro někoho raději česky koutule či též flebotom Snímek © Iva Rohoušová http://www.cts.cuni.cz/vesmir l VESMÍR 80, duben 2001
209
K nejproslulejším gejzírovým oblastem patří Yellowstonský národní park ve Wyomingu a v Montaně (USA). Nejvýznamnější gejzíry a horké prameny jsou soustředěny do několika míst: Old Faithfull Area (snímky vlevo), Norris Geyser Basin (snímek vpravo) a Mammoth Hot Spring. Horké prameny dosahují při vývěru až 95 °C (modrozelená jezírka na fotografiích). Život termofilních mikroorganizmů je však vázán na „nižší“ teploty a vizuálně ho lze identifikovat jako pestré zbarvení okrajů jezírek či potůčků. Žijí zde např. bakterie Thermocrinis ruber (růžové zbarvení, okolo 88 °C), sinice Synechococcus (rezavé zbarvení, 65 °C), fotosyntetická bakterie Chloroflexus (šedozelené zbarvení, 75 °C) a Sulfalobus acidocaldarius (skupina Archaea, 80 °C, pH3). K článkům J. Šindlera na s. 203, J. Juláka na s. 207 a k rubrice Data a souvislosti na s. 210; snímky © Stanislav Vaněk.
VESMÍR 80, duben 2001 http://www.cts.cuni.cz/vesmir
221
