Summary
Bioenergetics of parasitic protozoa Promotor: Prof. dr. A.G.M. Tielens Co-promotor: Dr. J.J. van Hellemond
Thesis by Susanne van Weelden Universiteit Utrecht
SUMMARIZING DISCUSSION Introduction The study described in this thesis has been focused on the mitochondrial energy metabolism of procyclic Trypanosoma brucei. In particular the role of the Krebs cycle and the enzyme responsible for the production of acetate, acetate:succinate CoA-transferase (ASCT), were investigated. This energy metabolism is of special interest for the following reasons (I) the generation of energy by trypanosomes itself is essential for the viability of the parasite, because parasites cannot directly obtain energy from the host, in contrast to many nutritional elements for biosynthetic purposes, (II) from a bioenergetical point of view it is surprising that mitochondria of procyclic T. brucei partially oxidize substrates to mainly acetate and succinate, whereas they contain the entire set of Krebs cycle enzymes and a functional respiratory chain including an alternative oxidase, (III) the enzyme ASCT involved in acetate production is also known to be involved in the energy metabolism of parasitic helminths containing anaerobically functioning mitochondria and parasitic protists containing hydrogenosomes instead of mitochondria, and therefore, ASCT could be an excellent tool to study the evolutionary relation of these various energy generating organelles, and (IV) characterization of ASCT could be used as a target for anti-parasitic drug design, because this enzyme is absent in the host. This thesis describes the research performed to investigate the role of the Krebs cycle in energy generation in procyclic T. brucei (chapter 2 and 3). In addition, the gene encoding ASCT in procyclic T. brucei and its role in carbohydrate metabolism was investigated (chapter 4). Furthermore, the candidate gene encoding ASCT in hydrogenosomes of T. vaginalis was detected (chapter 5).
Energy generation in procyclic Trypanosoma brucei During its life cycle Trypanosoma brucei alternates between the bloodstream of the mammalian host and the blood-feeding insect vector, the tsetse fly. Differentiation of bloodstream form trypanosomes to procyclic (insect stage) forms is accompanied by several profound structural and biochemical changes. In the bloodstream of the mammalian host, T. brucei trypanosomes benefit from the constant conditions, including a continuous supply of glucose. The long slender bloodstream form depends entirely on glycolysis for energy generation and excretes pyruvate as the major end product of carbohydrate metabolism (1). During this life stage many mitochondrial functions are repressed. For instance, activities of
citrate synthase, isocitrate dehydrogenase, succinate dehydrogenase and fumarase could not be detected (2), and a classical respiratory chain is lacking. Instead, blood stream forms contain a plant-like alternative oxidase that is coupled to a glycerol-3-phosphate shuttle to maintain redox balance in the glycosome (3). In the procyclic stage, the end product of glycolysis, pyruvate, is not excreted but further metabolized inside a completely developed mitochondrion. Pyruvate is first oxidatively decarboxylated by pyruvate dehydrogenase to acetyl-CoA, which was then supported to be further degraded to carbon dioxide by the Krebs cycle. Upon differentiation of T. brucei from blood stream to insect stage, activities of all Krebs cycle enzymes can be detected. A large part of the acetyl-CoA, however, does not enter the Krebs cycle but is converted to acetate, which is excreted as end product. Succinate is also an end product from glucose degradation and is produced predominantly inside the glycosomes of procyclic trypanosomes (4). In contrast to blood stream form trypanosomes, procyclic forms are also able to use amino acids, such as proline and threonine, for energy generation (5, 6). In the insect vector, the trypanosomes encounter variations in the availability of glucose and amino acids depending on the feeding status of the tsetse fly. Shifts in metabolic patterns are needed to maintain functional homeostasis. The extend of the metabolic adaptations will give important information on the physiological limits of this organism. Changes in activities of metabolic enzymes forced upon the organism by alterations of the external conditions can reveal interesting properties of its energy metabolism and its capacity to adapt. To investigate the contribution of the Krebs cycle to carbon fluxes in the energy metabolism of procyclic trypanosomes, we studied the degradation of glycolytic and mitochondrial substrates by combined genetic and biochemical approaches.
Role of Krebs cycle in energy generation From the experimental results described in chapter 2 and 3 it can be concluded that proliferating procyclic T. brucei cells do not use Krebs cycle activity for generation of energy. Detection of intracellular levels of glycolytic- and Krebs cycle intermediates (chapter 2) in wild type procyclic cells and mutants with a targeted deletion of the gene encoding aconitase, revealed no differences except for citrate levels that accumulated up to 90-fold in the mutants, confirming the absence of aconitase activity in these mutants. Deletion of aconitase did not change differentiation to the procyclic stage, nor the growth rate or intracellular ATP/ADP ratio in those cells. Metabolic studies using radioactively labeled substrates and NMR analysis demonstrated that glucose and proline were not degraded via the Krebs cycle to carbon dioxide. Glucose was degraded to acetate, succinate and alanine, whereas proline was degraded to succinate. Absolutely no difference was detected in the metabolic end products released by the wild type and mutant cells. Hence, procyclic T. brucei do not use Krebs cycle activity for energy generation although Krebs cycle enzymes are present. The assumption was made that the Krebs cycle might play a role under other environmental conditions, for instance when substrate availability is limited. It is conceivable that the presence of large amounts of fermentable substrates present in the standard medium prevents the Krebs cycle from being used or from being induced, similar to the glucose repression of the Krebs cycle reported for bacteria and several types of yeast (7, 8). To investigate whether the availability of substrates for glycolysis influences the type of energy metabolism in procyclic T. brucei cells, we performed radioactive incubations with cells cultured in the absence and presence of glucose and/or glycerol (chapter 3). These investigations showed that the absence of carbohydrates did not induce a shift from a fermentative metabolism to the use of the Krebs cycle for complete oxidation of substrates. Apparently, glucose repression (Crabtree effect) does not occur in procyclic T. brucei. In fact, our data led to the proposal that the Krebs cycle 112
does indeed not function as a cycle in procyclic T. brucei, but that parts of the Krebs cycle machinery are used in other processes, such as partial degradation of amino acids and for biosynthetic purposes, such as fatty acid biosynthesis and gluconeogenesis. The gluconeogenic pathway is likely to be used by procyclic cells because the genes are expressed. In addition, trypanosomes are able to survive and even multiply without glucose and glycerol in the medium, but they need hexoses to synthesize their surface coat. Hence, the hexoses will have to be formed via gluconeogenesis under these conditions. Based on our results, a new function in the mitochondrial metabolism for six out of the eight enzymes of the Krebs cycle can now be described. We propose that the first enzyme of the Krebs cycle, citrate synthase, is used in procyclic T. brucei mainly for anabolic purposes, the formation of citrate for the biosynthesis of fatty acids. For this reaction to occur, also the last enzyme of the cycle, malate dehydrogenase has to participate for the formation of oxaloacetate that is needed in the citrate synthase reaction. a-Ketoglutarate dehydrogenase and succinyl-CoA synthetase are involved in the degradation pathway of proline to succinate, a clear catabolic function. Succinate dehydrogenase and fumarase are involved in another anabolic function that we propose for part of the Krebs cycle in procyclic T. brucei. These enzymes participate in the gluconeogenic pathway by the conversion of succinate to malate, which can then be transported to the cytosol for the synthesis of phosphoenolpyruvate. The anabolic function of this part of the Krebs cycle follows directly from our demonstration that proline is converted into acetate, or can be used for gluconeogenesis in the absence of glucose and glycerol. Since no direct pathway to acetate exists in the degradation of proline, this indicates that a small but significant amount of succinate is further metabolised to acetate. The most plausible pathway would be the conversion of succinate via fumarate to malate by the usual Krebs cycle enzymes, followed by malate export to the cytosol where either malate dehydrogenase and phosphoenolpyruvate carboxykinase will convert the malate to phosphoenolpyruvate, which can then be degraded via pyruvate to acetate, by the usual pathway also used for the degradation of glucose and glycerol to acetate, or alternatively, malic enzyme can convert malate directly to pyruvate and the NADPH so produced is used for biosynthetic purposes. Only for the mitochondrial aconitase and isocitrate dehydrogenase (NADP-dependent) no function in procyclic T. brucei is found, yet. This correlates with the absence of a specific phenotype in the energy metabolism of the aconitase knockout mutant of procyclic T. brucei (chapter 2). The activity of the mitochondrial NADP-dependent isocitrate dehydrogenase in T. brucei is very low (5-7 nmol.min-1.mg protein-1 (9)) and is not induced upon transformation from bloodstream form to procyclic stage (Opperdoes, unpublished), which might suggest that this enzyme is not involved in a major metabolic route in this stage.
Role of aconitase in procyclic T. brucei From our investigations described in chapter 2 and 3 it can be concluded that there is no clear metabolic function for the mitochondrial aconitase in procyclic T. brucei, although this enzyme was expected to operate in the Krebs cycle. A closer look at the aconitase expressed in T. brucei might reveal the true function of this enzyme. Mammalian cells have two aconitases encoded by separate nuclear genes: (a) the mitochondrial citric acid cycle enzyme and (b) a cytoplasmic aconitase, better known as iron regulatory protein (IRP-1) which acts as an iron sensor and post-transcriptional regulator and as signal transducer for oxidative stress. In contrast, aconitase in T. brucei is encoded by a single gene, which belongs to the IRP-1 subfamily and localizes in the mitochondrion as well as in the cytoplasm. Because of the absence of a second aconitase, a role in the mitochondrial metabolism for this IRP-like aconitase was assumed (10). Our investigations showed that there is no function in energy 113
metabolism for the mitochondrial aconitase in procyclic T. brucei, although, we still cannot exclude the possibility that the Krebs cycle may be operative and important at a later stage in the insect vector. It is also possible that the mitochondrial aconitase functions as a true iron regulatory protein. Cellular levels of iron, a potentially toxic metal ion, are regulated by mRNA-protein interactions. IRP1 and IRP2 control the synthesis of a number of proteins involved in iron metabolism by binding a stem loop structure, known as iron-responsive element (IRE), in the untranslated region (UTR) of several mRNAs. When iron is depleted, this binding decreases the synthesis of proteins involved in iron storage and mitochondrial metabolism, and increases the synthesis of proteins involved in iron uptake (e.g. transferrin receptor).
Role of respiratory chain and alternative oxidase in procyclic T. brucei It is surprising that mitochondria of procyclic T. brucei only partially oxidizes substrates to mainly acetate and succinate, whereas they contain the entire set of Krebs cycle enzymes and a functional respiratory chain including a plant-like alternative oxidase. The presence of a complete aerobic machinery together with the incomplete oxidation of substrates places these mitochondria in a special category in between classical aerobic mitochondria and the fully anaerobically functioning mitochondria of parasitic helminths. The investigations described in chapter 2 showed that procyclic T. brucei, either wild type or mutants without aconitase activity, are equally unable to survive under anaerobic conditions. Simultaneous inhibition of both the mammalian respiratory chain and the plant-like alternative oxidase resulted in cell death within 1 hour. On the other hand, survival and even growth continued when only one of the two terminal oxidases was inhibited. A more negative growth effect (likely to be due to inhibition of energy generation) was observed upon KCN inhibition of the cytochrome c oxidase complex of the classical respiratory chain as compared with SHAM inhibition of the plant-like alternative oxidase (chapter 2, fig. 5). These results confirm that both branches of the respiratory chain simultaneously play a role in normal functioning of procyclic cells, but apparently the activity of only one of both branches is sufficient for survival of the cells. Glucose and glycerol catabolism, as well as amino acid degradation, result in a significant net production of NADH in procyclic T. brucei (chapter 3). This substantial amount of NADH is reoxidized by the respiratory chain, since procyclic cells are known to consume significant amounts of oxygen by alternative oxidase and cytochrome c oxidase activity. Furthermore, this observed net NADH production is in agreement with the essential function of the respiratory chain in procyclic T. brucei.
Acetate production in procyclic Trypanosoma brucei The acetate production pathway in procyclic T. brucei can be considered as one of the most important metabolic degradation pathways of glucose. Earlier studies characterized ASCT as the enzyme responsible for the production of acetate in procyclic T. brucei (11). The enzyme acetate:succinate CoA-transferase (ASCT) transfers the CoA moiety of acetyl-CoA to succinate, yielding acetate and succinyl-CoA. In chapter 4 we describe the identification of ASCT in procyclic T. brucei, which is the first report identifying a gene encoding ASCT. Qualitative and quantitative analyses were performed to investigate the role of ASCT in acetate production. The obtained data suggested that additional pathways have to be involved in production of acetate from glucose, since 114
acetate excretion was only slightly reduced in the mutant cell lines devoid of ASCT activity. It should be noted that minor succinate-independent acetate production from acetyl-CoA was observed before (Van Hellemond 1998). This activity could be increased in the mutant cell lines as an adaptive change taking place during selection of the knock-out lines. However, several observations indicate that this alternative acetate producing pathway may not suffice to metabolize all the produced acetyl-CoA. First, the mutant cell lines excreted pyruvate and β-hydroxybutyrate in contrast to the wild type cells, which indicated that the mutant cells are less capable of converting acetyl-CoA into acetate, due to absence of ASCT. In the second place, the increase of glucose consumption in the absence of ASCT may be an adaptive compensation of reduced energy yield from glucose. Third, both the RNAi and KO mutant cell lines also show significant reduction of their growth rate, which indicates that ASCT activity is important for normal functioning of the procyclic cells. Next to the formation of acetate by ASCT, three other enzymes involved in acetate production from acetyl-CoA exist. (I) Many eubacteria produce acetate from acetyl-CoA via a two-step mechanism in which acetyl-phosphate occurs as an intermediate (12). (II) Saccharomyces cerevisiae is known to posses an acetyl-CoA hydrolase, this enzyme catalyzes the hydrolysis of acetyl-CoA (13). (III) In the amitochondriate protists Gardia lamblia and Entamoeba histolytica, acetate is produced from acetyl-CoA via an acetyl-CoA synthetase (ACS) (14-16). In this process the formation of acetate from acetyl-CoA concomitantly produces ATP from ADP. Next to this ADP-dependent ACS, an AMP-dependent ACS exists. A sequence homolog of an AMP-dependent acetyl-CoA synthetase can be found in the genome database of T. brucei (GeneDB), whereas no sequence homologs of the other acetate producing enzymes can be detected. Further investigations will have to prove whether this is indeed the other enzyme involved in acetate production in procyclic trypanosomes.
Acetate production in Trichomonas vaginalis The ASCT/SCS cycle is also described to be operative in the hydrogenosomal metabolism of T. vaginalis, producing acetate as end product (17, 18). Since the classical biochemical purification of this enzyme was not very successful, a combined genomic and proteomic approach was used to identify the gene encoding ASCT in T. vaginalis (chapter 5). Searching the TIGR genome database for possible acetate producing enzymes resulted in the detection of only one candidate gene, an acetyl-CoA hydrolase related sequence. The detected sequence of the ASCT candidate gene demonstrated high sequence similarity to acetyl-CoA hydrolase from Saccharomyces cerevisiae and to succinyl-CoA CoA-transferase from the anaerobically functioning bacterium Clostridium kluyveri. No other acetate producing enzymes like acetylCoA synthetase, phosphate acetyltransferase, acetate kinase or T. brucei ASCT related sequences could be detected in the TIGR genome database, leaving the acetyl-CoA hydrolase related sequence as the one and only candidate. The gene could be amplified by PCR using cDNA prepared from mRNA from T. vaginalis, which demonstrates that this gene is transcribed and is not a pseudogene. In addition, separation of isolated hydrogenosomal proteins by two-dimensional electrophoresis followed by ESI-Q-TOF-MS/MS analysis, revealed peptide sequences encoded by the acetyl-CoA hydrolase like gene from T. vaginalis. This demonstrates that the ASCT protein is present in hydrogenosomes. Two different heterologous recombinant expression systems of the ASCT protein were tested, none of these systems, however, resulted in cell lysates with increased ASCT activity, which might correlate with the earlier observed enzyme purification problems. Therefore, no kinetic studies could be performed, yet. These results suggest that inactivation of ASCT during purification might be caused by loss of a co-factor, or perhaps the protein is only operational when a heterodimeric structure with another compound is formed. 115
Earlier investigations on the mechanism of acetate production in T. vaginalis hydrogenosomes indicate that acetyl-CoA is not hydrolyzed but that the CoA-moiety is transferred to succinate (17, 18). From the literature it is also known that a single amino acid replacement can turn an enzyme normally operating as a CoA-transferase, into an enzyme showing acetyl-CoA hydrolase activity (19). Furthermore, another ‘hydrolase-like CoA-transferase’, succinyl-CoA CoA transferase of C. kluyveri, is described to be operative as a true CoA-transferase (20). These findings support the hypothesis that the detected acetyl-CoA hydrolase protein in T. vaginalis might be operative as a CoA-transferase in vivo.
ASCT as potential drug target Acetate production via ASCT occurs in many parasites (protozoa as well as helminths) but is absent in their vertebrate hosts. The enzyme seems, therefore, to be a logical target for broadspectrum anti-parasitic drug design. Unfortunately, this strategy will not be useful to combat African trypanosomiasis, as ASCT is not detected in the bloodstream stage of T. brucei infecting the mammalian host, and as could be concluded from our investigations that ASCT is not even essential for survival of procyclic stages in the insect vector. However, ASCT is present in infective stages of other trypanosomatids including Leishmania. Further investigations on the role of ASCT in the hydrogenosomal metabolism of T. vaginalis will have to be performed to reveal whether this enzyme can be a valuable target for drug design. Knowledge of the gene sequences of T. brucei ASCT and T. vaginalis ASCT could facilitate identification of the ASCT protein in parasitic helminths such as Fasciola hepatica.
ASCT as tool to study the evolutionary origin of mitochondria and hydrogenosomes The fact that the genes encoding ASCT in the mitochondria of T. brucei and in the hydrogenosomes of T. vaginalis are not phylogenetically related, indicates that distinct enzyme types in mitochondria and hydrogenosomes are responsible for acetate production. It can be concluded that the mitochondrial T. brucei ASCT and the hydrogenosomal T. vaginalis ASCT did not originate both from the ASCT present in the endosymbiotic ancestor. Therefore, lateral gene transfer must have occurred for one or both of the mitochondrial and hydrogenosomal ASCTs. Or otherwise, ASCT was not present in the ancestral endosymbiont at all and evolved later on from different enzymes in distinct lineages. Full characterization of the genes encoding ASCT proteins in other hydrogenosome-bearing organisms, such as chytrids and ciliates, and from anaerobically functioning mitochondria of parasitic helminths, such as Fasciola hepatica and Ascaris suum, will provide valuable data for reconstruction of the history of mitochondria and hydrogenosomes.
116
REFERENCES 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20.
Fairlamb, A.H. and Opperdoes, F.R. (1986) in Carbohydrate Metabolism in Cultured Cells (Morgan, M.J., ed.), pp 183-224, Plenum Press Durieux, P.O., Schütz, P., Brun, R. and Köhler, P. (1991) Mol. Biochem. Parasitol. 45, 19-28 Chauduri, M., Ajayi, W., Temple, S., and Hill, G.C. (1995) J. Eukaryot. Microbiol. 42, 467-472 Besteiro, S., Biran, M., Biteau, N., Coustou, V., Baltz, T., Canioni, P., and Bringaud, F. (2002) J. Biol. Chem. 277, 38001-38012 Evans, D.E. and Brown, R.C. (1972) J. Protozool. 19, 686-690 Cross, G.A., Klein, R.A. and Linstead, D.J. (1975) Parasitol. 71, 311-26 Trumbly, R.J. (1992) Mol. Microbiol. 6, 15-21 Gombert, A.K., Moreira dos Santos M., Christensen, B., and Nielsen, J. (2001) J. Bacteriol. 183, 1441-1451 Opperdoes, F.R., Borst, P. and Spits, H. (1977) Eur. J. Biochem. 76, 21-28 Saas, J., Ziegelbauer, K., von Haeseler, A., Fast, B., and Boshart, M. (2000) J. Biol. Chem. 275, 2745-2755 Van Hellemond, J.J., Opperdoes, F.R. and Tielens, A.G.M. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 3036-3041 Brown, T.D.K., Jones-Mortimer, M.C., and Kornberg, H.L. (1977) J. Gen. Microbiol. 102, 327-336 Lee, F.S., Lin, L., and Smith, J.A. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1297, 105-109 Sánchez, L.B, and Müller, M. (1996) FEBS lett. 378, 240-244 Sánchez, L.B, Galperin, M.Y., and Müller, M. (2000) J. Biol. Chem. 275, 5794-5803 Field, J., Rosenthal, B., and Samuelson, J. (2000) Mol. Microbiol. 38, 446-455 Lindmark, D.G., and Müller, M. (1975) J. Parasitol. 61, 552-554 Steinbüchel, A., and Müller, M. (1986) Mol. Biochem. Parasitol. 20, 57-65 Mack, M., and Buckel, W. (1997) FEBS Lett. 405, 209-212 Söhling, B., and Gottschalk, G. (1996) J. Bacteriol. 178, 871-880
117
samenvatting
Parasitisme is een levensvorm waarbij de één, de parasiet, ten koste leeft van de ander, de gastheer. De parasiet is fysiologisch afhankelijk van de gastheer voor zijn onderkomen en voeding en is tegelijkertijd schadelijk voor de gastheer. Naar schatting hebben wereldwijd minstens 4 miljard mensen last van parasitaire infecties. Parasieten vormen tevens een bedreiging voor de veestapel, met name in Afrika. Hoewel bacteriën en virussen ook leven ten koste van hun gastheer, definiëren we alleen meercellige organismen en eencellige protozoa als parasieten. Parasieten kunnen onderverdeeld worden in drie groepen; (1) parasitaire insecten, zoals muggen, teken en vliegen, (2) meercellige parasitaire wormen, zoals lintwormen en leverbotten, en (3) eencellige parasitaire protozoa, zoals Plasmodium (verwekkers van malaria) en trypanosomen (verwekkers van slaapziekte). Het onderzoek beschreven in dit proefschrift richt zich uitsluitend op de biochemie van twee verschillende parasitaire protozoa, Trypanosoma brucei en Trichomonas vaginalis. Het is de bedoeling dat de bestudering van het energiemetabolisme van deze parasieten uiteindelijk zal leiden tot nieuwe inzichten in de ontwikkeling van effectieve chemotherapeutica en vaccins. De eencellige parasiet, Trypanosoma brucei, is de veroorzaker van “slaapziekte” bij mensen en de ziekte “nagana” bij runderen in tropisch Afrika. Naar schatting is ruim een half miljoen mensen en een kwart van al het vee in Afrika besmet met deze parasiet. De invloed van de economische en sociale schade die deze ziektes hebben op de gezondheidszorg en het behoud van de veestapel wordt ernstig onderschat. De behandeling van slaapziekte bij mensen is tot nu toe niet succesvol, dit wordt veroorzaakt doordat geen van de ontwikkelde therapeutica in staat is om de bloed-hersenbarrière in de benodigde concentratie te passeren. T. brucei heeft een complexe levenscyclus, waarin twee verschillende gastheren voorkomen, een zoogdier en de tseetseevlieg (zie hoofdstuk 1, figuur 1). De zogenaamde “long slender” vorm van deze parasiet leeft in de bloedbaan van mens of dier. Deze vorm is in staat om te differentiëren, via een tussenvorm, naar de “short stumpy” vorm. Wanneer de tseetseevlieg een bloedmaaltijd nuttigt worden daarbij parasieten opgenomen, waaronder de “short stumpy” vormen, deze vormen differentiëren tot “procyclische” vormen in de darm van de vlieg. Na een periode van tien dagen migreren deze trypanosomen naar de speekselklieren van de vlieg, waar ze transformeren, via het “epimastigote” stadium, tot “metacyclische” vormen die uiteindelijk weer infectieus zijn voor mens en dier. De differentiatie van T. brucei gaat gepaard met verschillende structurele en biochemische veranderingen, onder andere in de energievoorziening van de cel. De bloedbaanvorm van T. brucei gebruikt glucose dat aanwezig is in het bloed om aan zijn energiebehoefte te voldoen. Glucose wordt afgebroken in een celorganel dat uniek is voor deze parasiet, het zogenaamde glycosoom. Het product van de glycosomale glucose afbraak wordt in het cytosol verder afgebroken tot pyruvaat waarbij energie vrijkomt in de vorm van ATP. Oók in de procyclische vorm van T. brucei wordt glucose omgezet tot pyruvaat, alleen is pyruvaat nu geen eindproduct maar wordt het nog verder afgebroken in een speciaal onderdeel van de cel, het mitochondrion. Pyruvaat wordt in het mitochondrion vervolgens omgezet tot acetyl coenzym A (acetyl-CoA). In het “klassieke” mitochondrion, zoals dat te vinden is bij bijvoorbeeld de mens, wordt acetyl-CoA via de Krebscyclus (ook wel citroenzuurcyclus genaamd) compleet geoxideerd tot CO2. Naast de vorming van CO2, worden er bij de reacties van de Krebscyclus electronen overgedragen op co-factoren. Deze gereduceerde elektronendragers worden via de ademhalingsketen geoxideerd, waarbij uiteindelijk energie wordt verkregen in de vorm van ATP. De Krebscyclus is om deze reden onlosmakelijk verbonden met de ademhalingsketen. De ademhalingsketen is alleen functioneel in de aanwezigheid van zuurstof. Het mitochondrion van procyclische trypanosomen is ook in staat om acetyl-CoA via de Krebscyclus af te breken, maar in tegenstelling tot het “klassieke” mitochondrion wordt het grootste gedeelte 118
van de gevormde acetyl-CoA omgezet tot het eindproduct acetaat. Het enzym acetaat:succinaat CoA-transferase (ASCT) wordt verantwoordelijk geacht voor deze vorming van acetaat. Het onderzoek dat wordt beschreven in dit proefschrift richt zich op het mitochondriale energiemetabolisme van procyclische T. brucei trypanosomen. Met name de rol van de Krebscyclus voor het genereren van energie, en het enzym dat verantwoordelijk is voor de productie van acetaat, ASCT, zijn onderzocht. De bestudering van het energiemetabolisme van deze parasiet is interessant omdat; (1) parasieten niet in staat zijn om directe energie te verkrijgen van de gastheer, waardoor de vorming van energie door de trypanosomen zèlf essentieel is voor de overleving van de parasiet, (2) het vanuit een bioenergetisch oogpunt verrassend is dat de mitochondriën van trypanosomen substraten slechts partieel afbreken tot acetaat en succinaat, terwijl alle Krebscyclusenzymen aanwezig zijn inclusief een ademhalingsketen en een alternatief oxidase systeem, (3) daarnaast het enzym dat verantwoordelijk is voor de productie van acetaat, ASCT, ook aanwezig is in de anaeroob functionerende mitochondriën van parasitaire wormen en in parasitaire protozoa die hydrogenosomen bevatten in plaats van mitochondriën, en (4) de karakterisering van het enzym ASCT waardevolle informatie op zou kunnen leveren voor de eventuele ontwikkeling van antiparasitaire geneesmiddelen, aangezien ASCT niet voorkomt in de gastheer. In hoofdstuk 2 wordt de rol van de Krebscyclus voor de vorming van energie in procyclische T. brucei cellen beschreven. Naast het verbruik van glucose als substraat, zijn procyclische trypanosomen ook in staat om aminozuren af te breken, waaronder proline. De afbraakroutes van glucose en proline zijn bestudeerd in normale procyclische trypanosomen en in zogenaamde “knock-out” cellen. In deze mutanten is het enzym aconitase uitgeschakeld, dat de tweede reactie van de Krebscyclus katalyseert, waardoor deze reactie niet kan verlopen en daardoor de hele cyclus niet. Metabole incubaties waarbij gebruik is gemaakt van radioactief gelabelde substraten en NMR (nuclear magnetic resonance) analyses, tonen aan dat glucose en proline niet afgebroken worden via de Krebscyclus tot CO2. Glucose wordt voornamelijk afgebroken tot acetaat, succinaat en alanine, en vanuit proline wordt voornamelijk succinaat gevormd. Er was absoluut geen verschil meetbaar in de eindproducten geproduceerd door de normale cellen en de aconitase “knock-out” cellen. Ondanks het feit dat alle Krebscyclus enzymen aanwezig zijn in procyclische trypanosomen, wordt deze cyclus niet gebruikt voor de vorming van energie. Deze resultaten leidden tot de veronderstelling dat door de aanwezigheid van de hoge concentratie fermenteerbaar substraat (glucose) in het kweekmedium, het gebruik van de Krebscyclus onderdrukt wordt. Dit is een bekend fenomeen in bacteriën en gist. Deze veronderstelling heeft geleid tot het onderzoek dat beschreven wordt in hoofdstuk 3. In hoofdstuk 3 wordt aangetoond dat de afwezigheid van glycolytische substraten niet leidt tot een verschuiving van een gedeeltelijk fermentatief energiemetabolisme naar de complete oxidatie van substraten via de Krebscyclus. De resultaten tonen aan dat glucose (en zelfs de glycolyse) niet essentieel is voor de overleving van procyclische trypanosomen. De afwezigheid van glucose in het kweekmedium leidt niet tot een toename van het verbruik in aminozuren (proline en threonine). Variaties in de concentraties van glucose en glycerol in het kweekmedium leiden echter wel tot aanpassingen van het energiemetabolisme. Deze aanpassingen vinden plaats op een dusdanige manier dat het glycosoom altijd in redoxbalans is. Dat wil zeggen dat er evenveel NADH afgebroken wordt als er wordt geproduceerd. Verder onderzoek naar de rol van de Krebscyclus toont aan dat procyclische trypanosomen delen van de Krebscyclus gebruiken voor andere doeleinden dan de complete afbraak van mitochondriale substraten. De cyclus kan opgedeeld worden in drie afzonderlijk delen, welke vervolgens betrokken zijn bij 1) de synthese van vetzuren, 2) de afbraak van proline en glutamaat tot het eindproduct succinaat, en 3) de vorming van substraten voor de synthese van glucose via gluconeogenese. 119
Hoofdstuk 4 beschrijft de identificatie van het gen dat codeert voor het enzym ASCT in procyclische trypanosomen. Dit is de eerste keer dat het gen voor ASCT beschreven wordt. Daarnaast is ook de rol van ASCT in de productie van acetaat bestudeerd. Cellen waarin overexpressie van ASCT plaatsvindt, produceren significant meer acetaat. Echter, uit de resultaten blijkt ook dat ASCT niet het enige enzym is dat zorgt voor de productie van acetaat in T. brucei. De productie van acetaat is namelijk niet minder in procyclische cellen waarin het gen dat codeert voor ASCT minder tot expressie komt (RNAi mutanten) of in cellen waarin het gen zelfs helemaal uitgeschakeld is (ASCT knock-out). Naast parasitaire protozoa die voor hun energievoorziening afhankelijk zijn van hun mitochondriën, bestaan er ook protozoa, zoals bijvoorbeeld Trichomonas vaginalis, die voor hun energievoorziening afhankelijk zijn van een ander organel, het zogenaamde hydrogenosoom. Hydrogenosomen zijn organellen die anaeroob energie (ATP) maken waarbij waterstof wordt gevormd. Er bestaan sterke aanwijzingen dat mitochondriën en hydrogenosomen evolutionair gezien aan elkaar verwant zijn. Het enzym ASCT is ook aanwezig in hydrogenosomen. De vergelijking van mitochondriaal ASCT en hydrogenosomaal ASCT is daarom een geschikt middel om meer te weten te komen over de evolutionaire relatie van deze energie-genererende organellen. In hoofdstuk 5 wordt de identificatie van een kandidaat gen voor ASCT in hydrogenosomen van T. vaginalis beschreven. Gezien het feit dat een klassieke biochemische zuivering van het enzym ASCT niet succesvol was, is er voor een gecombineerde aanpak gekozen, zowel op genomisch- als op eiwitniveau. In de genoomdatabank van T. vaginalis is gezocht naar genen die mogelijk coderen voor acetaat producerende enzymen. Slechts één kandidaat gen is gevonden in de databank, en dit gen was geannoteerd als een acetylCoA hydrolase. De sequentie van het gen vertoont grote homologie met acetylCoA hydrolase van de gist Saccharomyces cerevisiae en met succinylCoA:CoA-transferase van de anaerobe bacterie Clostridium kluyveri en verrassend genoeg niet met ASCT van T. brucei. Met behulp van de PCR-methode, waarbij gebruik is gemaakt van cDNA dat verkregen is uit mRNA van T. vaginalis, is het kandidaat gen voor ASCT vermenigvuldigd. Dit toont aan dat het gen in vivo tot expressie komt. Met behulp van twee-dimensionale gel electroforese zijn de hydrogenosomale eiwitten gescheiden op grootte en iso-electrisch punt. Analyse van de verschillende eiwitten met behulp van ESIQ-TOF-MS/MS is vervolgens toegepast om de eiwitten te identificeren en een aantal peptidensequenties die overeenkomen met het ASCT eiwit zijn gevonden. Dit toont aan dat het ASCT enzym aanwezig is in de hydrogenosomen van T. vaginalis. In een aantal pogingen is getracht het enzym ASCT van T. vaginalis recombinant tot expressie te brengen, maar helaas hebben deze pogingen niet geleid tot een actief enzym, waardoor kinetische studies uitgesloten waren. Het feit dat de genen die voor ASCT coderen in mitochondria van T. brucei en in hydrogenosomen van T. vaginalis niet evolutionair gerelateerd zijn aan elkaar, geeft aan dat verschillende typen enzymen in mitochondria en deze hydrogenosomen verantwoordelijk zijn voor de productie van acetaat. Kortom, dit onderzoek heeft geleid tot het oplossen van een aantal vraagstukken omtrent het mitochondriale energiemetabolisme van procyclische trypanosomen. Met name de bestudering van de rol van de Krebscyclus in de energievoorziening van de trypanosomen heeft geleid tot een aantal nieuwe inzichten. Karakterisering van ASCT genen van andere organismen die hydrogenosomen bevatten, zoals chytriden en ciliaten, en van organismen die anaeroob functionerende mitochondria bevatten, zoals parasitaire wormen, zal in de toekomst waardevolle additionele informatie op kunnen leveren voor het in kaart brengen van de evolutionaire oorsprong van mitochondria en hydrogenosomen. Mede door het onderzoek dat beschreven wordt in dit proefschrift is de karakterisering van ASCT in deze andere organismen wellicht een stuk eenvoudiger geworden.
120
121
