Bevezetés az áramlási citometriába

SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST

Balicza-Himer Leonóra

Bevezetés az áramlási citometriába

I. Sz. Gyermekgyógyászati Klinika


Az áramlási citometria alapjai • Folyadékáramban lévő önálló részecskék gyors multiparaméteres mérése • Bizonyos molekulák észlelése nagyszámú molekula sokaságban, fluoreszcens festékkel jelölt specifikus antitest segítségével



Az áramlási citométer működési elve Sejtszuszpenzió áramoltatása nyomáskülönbség hatására zárt keringési rendszerben, köpenyfolyadék segítségével FACS: Fluorescence Activated Cell Sorter

FACS Aria

FACS Calibur I. Sz. Gyermekgyógyászati Klinika


Hidrodinamikai fókuszálás • Hidrodinamikai fókuszálás egy kis keresztmetszetű kapilláris fejbe, ebben egy kis térfogat (egy sejt) megvilágítása lézerrel • Nagy sebesség (akár 100.000 - 1.000.000 sejt/perc) köpeny folyadék

központi tér

hidrodinamikai fókuszálás

köpeny folyadék

egysejtes áramlás

minta

fluoreszcencia jel a festett sejtekről fényszórás jelek minden sejtről lézer fényforrás



A jel feldolgozása, sokszorozása • A sejtről érkező fényszórás és fluoreszcencia jelek detektálása • A sejtenként beérkező adatok digitalizálása és feldolgozása számítógépen áramlási rendszer (köpenyfolyadék) optikai rendszer

adatgyűjtés adatfeldolgozás adat analízis

fényforrás (lézer) FLUORESZCENCIA JELEK detektorok, jelsokszorozók (+ analóg-digitális konverter) Sejtek megvilágítása Jelek generálása

FÉNYSZÓRÁS JELEK



Az áramlási citométer felépítése áramlási kamra

mintavevő kamra

lézerek

detektorok

szeméttartály I. Sz. Gyermekgyógyászati Klinika


Az áramlási citométer felépítése



Az áramlási citometria előnyei • sejtenkénti multiparaméteres analízis (akár 8-12 féle tulajdonság/sejt) • nagy sebesség (akár 10.000 sejt / perc) • populáció / heterogenitás / korrelációanalízis lehetősége • sejtszortírozás (tetszőleges tulajdonság alapján) lehetősége

Az áramlási citométerrel begyűjthető optikai jelek Minden sejtről: fényszórás jelek • Előre irányuló fényszórás (FSC) • Oldalirányú fényszórás (SSC)

A jelölődött sejtekről: fluoreszcencia • többféle hullámhossztartományban



Fényszórás jelek feldolgozása Előre irányuló fényszórás Forward scatter (FSC) • sejtméret, sejtalak

Oldalirányú fényszórás Side scatter (SSC) • sejt intracelluláris fénytörése • granuláltság



A fényszórás jelek feldolgozása

SSC granuláltság

2D dot plot, vérminta

granulocita

monocita

FSC méret, alak vörösvérsejt

limfocita



A fluoreszcencia fogalma Egy anyag gerjesztés hatására bekövetkező fénykibocsátása

energiaveszteség

gerjesztés (excitáció)

Fluorofór: a fény kibocsátásáért felelős molekula, vagy annak egy része

gerjesztő fény

fénykibocsátás (emisszió)

kibocsátott fény

Stokes-törvény: Az emittált foton energiája mindig kisebb, hullámhossza pedig nagyobb, mint a gerjesztő fotoné



Fluoreszcencia a sejtanalitikában Hoechst DAPI fluoreszcein (FITC) Alexa 488 fikoeritrin (PE) Alexa 568 allofikocianin (APC) propidium-jodid Alexa 647 rodamin

Áramlási citofluorimetria Fluoreszcens mikroszkópos technikák Fehérje és DNS technikák I. Sz. Gyermekgyógyászati Klinika


A fluoreszcencia jelentősége • nagy érzékenység (~pmol/l) • veszélytelen a hasonló érzékenységű radioaktív detektálási módszerekkel szemben • detektálás: akár több millió“sötét”molekulához képest néhány fluoreszcens molekula kvantitatívan is detektálható (intenzitás)

A fluoreszcens festékekkel szemben támasztott követelmények • • • • • • •

Olyan hullámhosszon emittáljanak, ahol kicsi az autofluoreszcencia Az emissziós spektrumuk a lehető legkisebb mértékben fedjenek át (kompenzáció) Jól detektálható, erős fluoreszcenciát eredményezzenek (érzékenység) Alacsony legyen az aspecifikus kötődés mértéke Legyenek olcsók A fehérjék (antitestek) jelölése egyszerű protokollal legyen megvalósítható Ne módosítsák jelentősen a jelölt molekula tulajdonságait



A fluoreszcens fényjelek elkülönítése



Az áramlási citométerekben leggyakrabban alkalmazott lézerek, festékek



Színátfedés, színkompenzáció

%-os elektronikus jelerősség korrekció I. Sz. Gyermekgyógyászati Klinika


Az adatok értékelése

Hisztogram fluoreszcencia intenzitás -sejtszám

Dot plot FSC-SSC



A fluoreszcens jel intenzitása

• Összefüggés van a jelintenzitás (detektor feszültség), a fluoreszcencia intenzitás és a fluoreszcens molekulák száma közt: • A fényesebb sejtek nagyobb feszültség impulzust hoznak létre I. Sz. Gyermekgyógyászati Klinika


A célfehérjék detektálása

Quantum dot (Qdot) nanokristály technológia Qdot technológia: • kimutatás Qdot-biokonjugátummal • direkt jelölés Qdottal kapcsolt antitesttel

Qdot nanokristály: • a fluoreszcenciához hasonló, de más fizikai hátterű fénykibocsátásra alkalmas félvezető anyag • a Qdot mérete szabja meg a kibocsátott fény hullámhosszát Qdot nanokristály szerkezete

Előnyök: • a fluoreszcens technikát használó molekuláris biológiai módszerek bármelyikében használható • nincsenek átfedő spektrumok • egyetlen gerjesztő fényforrás elegendő • hosszú életidejű jel és stabilitás: hosszú távú vizsgálatok időbeli nyomonkövetésére alkalmas



Felhasználási területek • sejtek, receptorok aránya / mennyisége / eloszlása (sejtfelszíni vagy intracelluláris molekulák) • fehérjék (strukturális fehérjék, antigének, enzimaktivitás) • ionok, szabadgyökök, sejtpigmentek mérése • kromoszómák (DNS könyvtárak) • DNS, RNS tartalom (sejtciklus, sejtosztódás, proliferáció) • életképesség vizsgálat (apoptózis, nekrózis) • Kinetikus mérések (sejtaktiváció időbeli nyomonkövetése) • membrán fluiditás vizsgálat, Ph, membrán potenciálok • funkcionális vizsgálatok • sejtszortírozás



Általános jelölési protokoll A biológiai minta feldolgozása, egysejtes állapotba hozása A sejtek lecentrifugálása (ált. 100.000-1.000.000 sejt / minta) Direkt jelölés: 1. 2. 3. 4.

Fluoreszcensen jelölt specifikus antitest hozzáadása Vortex, inkubálás Mosás(ok): Centrifugálással a felülúszó eltávolítása A pellet felöntése pufferrel, vortex, mérés

Indirekt jelölés: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Specifikus 1. antitest hozzáadása Vortex, inkubálás Mosás(ok): Centrifugálással a felülúszó eltávolítása 1. antitesthez kötődő fluoreszcensen jelölt 2. antitest hozzáadása Vortex, inkubálás Mosás(ok): Centrifugálással a felülúszó eltávolítása A pellet felöntése pufferrel, vortex, mérés

Opcionális: • A vörösvérsejtek lízise • Intracelluláris jelölés: fixálás / permeabilizálás I. Sz. Gyermekgyógyászati Klinika


Sejtfelszíni markerek Sejtpopulációk Százalékos megoszlás

Dot plot FSC-SSC

Kvadráns dot-plot APC-PE

Hisztogram fluoreszcencia intenzitás -sejtszám



Intracelluláris markerek, sejtaktiváció

Negatív 5,1% RMF: 6,184

1. minta 28,3% RMF: 7,604

2. minta 48,9% RMF: 8,944

pozitív 95,3% RMF: 12,536 I. Sz. Gyermekgyógyászati Klinika


Sejtszám

Életképesség vizsgálatok

Propidium-jodid (PI)

PI fluoreszcencia intenzitás

-+

++

-+

++

-+

++

--

+-

--

+-

--

+-

AnnexinV-FITC



Sejtszám

Sejtciklus, proliferáció vizsgálatok

Sejtszám

Sejtszám

PI fluoreszcencia

CFSE fluoreszcencia

CFSE fluoreszcencia



Kinetikai vizsgálatok Intracellulaláris Ca2+ (Fluo3, Fura-Red)

Nitrogén-oxid termelés (DAFFM)

Plazmamembrán potenciál (DiBAC4(5)

Mitokondriális Ca2+ (Rhod2)

Szuperoxid termelés (DHE)

Mitokondrium membrán potenciál (TMRM, JC-1)



Sejt szortolás • Tetszőleges tulajdonság alapján a sejtek egyenkénti kiválogatása • Több különböző jelöléssel akár több (2-4) sejtpopulációt is szétválogathatunk • További vizsgálatokhoz (WB, PCR) használhatóak a kiszortolt sejtek • Létezik steril sortolás is • Elektromos feszültség hatására a sejtek egyenként, a lapátok mentén a megfelelő gyűjtőcsőbe folynak Tisztaság: > 95% Kiszortolt sejtek száma: 300 sejt/sec Visszanyert sejtek: > 50%



Az áramlási citometria használhatósága Egyedülálló molekuláris biológiai módszer • Egy heterogén populációból sejtenkénti multiparaméteres analizis • Nem csak az egyes sejtek többféle sejtfelszini és intracelluláris fehérje expresszióját, nukleinsavtartalmát, és még számos más paraméterét határozhatjuk meg, de aktuális aktivációs állapotukat is nyomon követhetjük az időben • Az egyes sejtek fehérjeexpressziójának mértéke is összehasonlithatóvá válik • Élő sejteket vizsgálhatunk, melyeket egy kívánt paraméterre kisortolva azok akár további vizsgálatokra is alkalmasak lehetnek • A jelölő antitestek más módszerekhez is használhatóak, gyors jelölési procedúra • Azonnal kvantitativan értékelhető eredményeket kapunk Számos más, csak szűk területen alkalmazható molekuláris biológiai módszer kiváltására alkalmas lehet


Bevezetés az áramlási citometriába

Recommend Documents