BELSİ ÉS KÜLSİ TÉNYEZİK HATÁSA A VÖRÖSVÉRSEJTEK (vvs) LIPIDPEROXIDÁCIÓS (LP) ÉS ANTIOXIDÁNS FOLYAMATAIRA
(szarvasmarhákban, juhokban, kutyákban és patkányokban végzett vizsgálatok) 1999. Vajdovich Péter Témavezetı: Mézes Miklós tanszékvezetı egyetemi tanár, a mezıgazdaságtudomány kandidátusa, Szent István Egyetem, Mezıgazdaság és Környezettudományi Kar, Takarmányozástani Tanszék
0
Jelölések és rövidítések jegyzéke
αT.: oxidált E-vitamin αTH: α-tokoferol, E-vitamin αTQ: tokoferolkinon 1 O2: szinglet-oxigén 3HAA: 3-hidroxiantranilsav A: dehidro-alkohol vegyület (aldehid) A: dehidro-aszkorbinsav ADP: adenozin-difoszfát AH-: aszkorbát-anion AH.: mono(dehidro)aszkorbát-gyök AH2: alifás alkohol vegyület AH2: aszkorbinsav Alb: albumin ALKP: alkalikus-foszfatáz ALT: alanin-aminotranszferáz AMP: adenozin-monofoszfát Amyl: α-amiláz AST: aszparaginsav-aminotranszferáz ATP: adenozin-trifoszfát BHA-butil-hidroxi-anizol BHT: butil-hidroxi-toluol Br-LOO.: bilirubin-lipidperoxid Br-LOOH: bilirubin-lipidhidroperoxid Br.: bilirubin-gyök Br: bilirubin BU: Bergmeyer-egység (-unit) C5a: komplemet-5a (kemotaktikus peptid) C9: komplemet-9 Ca: összkalcium CAT: kataláz CCl3.: triklórmetil-szabadgyök CCl4: széntetraklorid CClOO3.: triklórmetil-peroxid-szabadgyök Koleszt: összkoleszterin CK: kreatinin-foszfokináz CN: cián vagy cianid-csoport cNOS: konstitutív nitrogénoxid-szintetáz CoA: koenzim-A Crea: kreatinin CuZnSOD: réz-, cinktartalmú szuperoxiddizmutáz
D: dalton (molekulatömeg mértékegysége) dirBR: direktbilirubin DNS: dezoxi-ribonukleinsav DPPD: N,N-difenil-p-feniléndiamin DTNB: ditiobisz-2-nitrobenzoesav e-: eletron EDTA: etiléndiamin-tetraecetsav EKG: elektrokardiográfia EMQ: ethoxiquin (etoxi-metil-kinolin) FAD: flavin-adenin-dinukleotid Fe: vas Fe-kötı kap.: vaskötı kapacitás FeS-: vas- és kénközpontú rész FMN: flavin-adenin-mononukleotid fvs: fehérvérsejt G6P: glükóz-6-foszfát G6PD: glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz GDP: guanozin-difoszfát GGT: γ-glutamil-transzferáz Glob: globulin GMP: guanozin-monofoszfát GS-: glutation-tiolát-anion GS.: glutationil-gyök vagy tiil-gyök GSH-Px: glutation-peroxidáz GSH-red: glutation-reduktáz GSH: redukált-glutation GSSG: oxidált-glutation, glutation-diszulfid GST: glutation-S-transzferáz GTP: guanozin-trifoszfát H+: hidrogén-ion H2O: víz H2O2: hidrogén-peroxid H3N+: protonált amingyök Hb: hemoglobin HCl: sósav HCO3-: hidrogénkarbonát-ion HDL: high density lipoprotein HO2.-: perhidroxi-gyök HPETE: hidroxieikozatetraénsav Ht: hematokrit IgA: immunglobulin-A
1
IgG: immunglobulin-G IL-1: interleukin-1 iNOS: indukálható nitrogénoxid-szintetáz K+: kálium-ion (koncentráció) Karb: karbamid L-NAME: NGnitro-L-arginin-metilészter L.: lipid-szabadgyök vagy lipd-alkilgyök LDL: low density lipoprotein Lipa: Lipáz LH: zsírsav LOO.: lipid-peroxidgyök LOOH: lipidhidroperoxid LP: lipidperoxidáció M: mól MAC: membrane attack complex (membránkárosító komplex) MCH: mean corpuscular hemoglobin, a vvs-ek átlagos hemoglobintartalma MCHC: mean corpuscular hemoglobin concentration, a vvs-ek átlagos hemoglobinkoncentrációja MCV: mean corpuscular volume, a vvs-ek átlagos térfogata MDA: malondialdehid Me: átmeneti fém MnSOD: mangántartalmú szuperoxiddizmutáz MPO: mieloperoxidáz MTDQ: 5,6-metilén-bisz/-2,2,3-trimetil1,2-dihidrokinolin n= töltések száma NAD+: oxidált nikotinamidadenindinukleotid NADH + H+: redukált nikotinamidadenindinukleotid NADP+: oxidált nikotinamidadenindinukleotid-foszfát NADPH + H+: redukált nikotinamidadenindinukleotid-foszfát NAPH-ox: redukált nikotinamidadenindinukleotid-foszfát-oxidáz NO.: nitrogénoxid-gyök NO: nitrogénoxid NOS: nitrogénoxid-szintetáz O2.-: szuperoxid-aniongyök
O2: oxigénmolekula OH-: hidroxil-anion-csoport OH.-: hidroxil-gyök ONO2.-: peroxinitrit-anion-gyök OD: optikai sőrőség (denzitás) OD532: 532 nm-en mért optikai sőrőség összBR: összbilirubin oxidált-6PG: oxidált 6-foszfoglukonát P~: makroergfoszfát-csoport pCO2: parciális széndioxid-nyomás PGE2: prosztaglandin-E2 PGF2: prosztaglandin-F2 PGG2: prosztaglandin-G2 PGH2: prosztaglandin-H2 PGI2: prosztaciklin PHS: pulmonáris hipertenzió szindróma Pi: anorganikus-foszfát pO2: parciális oxigén-nyomás PUFA: többszörösen telítetlen szabadzsírsav (polyunsaturated fatty acid) Q: ubi(szemi)kinon QH.: szemiquinon-gyök R-: anion-molekula R-CH2OH: alkoholmolekula R-CHO: aldehidmolekula R.: szabadgyök vagy lipid-szabadgyök RNS: ribonukleinsav ROH: hidroxilipid ROI: reaktív oxigén intermedier ROOH: lipid-hidroperoxid SeGSH-Px: szeléntartalmú glutationperoxidáz SH-: szulfhidril-csoport SOD: szuperoxid-dizmutáz TBA: tiobarbitursav Thrc: thrombocyta TNF: tumor nekrózis faktor TP: összfehérje ttkg: testtömeg kilogram TXA2: tromboxán-A2 Vminta: a minta össztérfogata Vössz: az oldatok össztérfogata vvs: vörösvérsejt X-: halid-anion XO-: hipohalit-ion vagy halogenit-ion
2
I. BEVEZETÉS
I. 1. A téma jelentısége A szabadgyökök hatásait széles körben vizsgálják. Az utóbbi idıben a kutatások nyomán a szabadgyökök vizsgálata, szinte önálló tudományterületté fejlıdött. A kutatások elsısorban alapkutatási, kísérleti jellegőek (101) (323) (324) (325) (399), másodsorban alkalmazott szintőek. Ezek nagy része humánorvoslási vonatkozásúak (61) (149) (320) (400), azonban az elmúlt 15-20 évben azonban az agrár és veteriner szférában is figyelemre méltó eredmények születtek (14) (15) (171) (287) (338), de a biológiai, a növénytani, a vegyészeti és a gyógyszertani tudományterületeken belül is egyre nagyobb tért hódítanak a gyökös folyamatokkal kapcsolatos kutatások. A szabadgyökös reakciók a biológiai rendszerek számos élettani biokémiai folyamatában részt vesznek a reakciók fı-, vagy részlépéseiben, de nem csak élettani szerepük lehet. A szabadgyökök keletkezhetnek ugyanis számos idegen anyag vagy gyógyszer hatására fıvagy melléktermékként, és megjelenésükkel alapvetıen befolyásolhatják a biológiai rendszerek mőködését. A szabadgyökök reakciói általában a többi biokémiai folyamathoz hasonlóan a szervezetben szabályozottan zajlanak le, de kóros mértékben fokozódva, vagy csökkent módon is végbe mehetnek. A szabadgyökös folyamatok szoros összefüggésben állnak a sejtek anyagcseréjével. A legelterjedtebb gyökök az oxigén eredető ún. reaktív oxigén intermedierek (ROI), amelyek elsısorban a légzési lánc lépéseiben keletkeznek. Ezek "in loco", sejten belül képesek a funkciójukat ellátó molekulákkal reagálni, esetleg azokat károsítani. Egy-egy gyökös reakció azonban nem marad helyhez kötötten. Láncreakciók sorozata alakul ki és terjed szét a környezı szövetekben, ill. a szervezetben, ami révén további gyökök képzıdnek és befolyásolják a természetes biokémiai reakciókat, ezáltal jelentısen károsíthatják az adott biológiai rendszert. A metabolikus folyamatokon belül az ROI-k zsíranyagforgalommal való kapcsolata azért emelhetı ki, mert a sejtorganellumok alaphártyája az ún. lipid kettısréteg nagy mennyiségő többszörösen telítetlen zsírsavat (polyunsaturated fatty acid, PUFA) tartalmaz, és a PUFA-k a legnagyobb mértékben vannak kitéve az ROI-k károsító hatásainak. A többszörösen telítetlen zsírsavakban lévı kettıs kötések láncolata "jó talajt" biztosít a gyökökként mőködı molekulák vagy molekulafragmensek kötıdéséhez. A lipidek gyökreakciói ezért speciális szerepet játszanak az említett folyamatokban, oxidációjuk során oxid-, peroxid-, hidroperoxidderivátumok képzıdnek. Ezt a folyamatot nevezzük lipidperoxidációnak (LP). A sejtek és a sejtorganellumok hártyáinak károsodása permeabilitási zavarokat hozhat létre a sejten belül, illetve a sejt és a külsı környezet között. A védekezı rendszer enzimatikus vagy nem enzimatikus tagjai azonban olyan széles körben mőködnek sejt- és szövetszinten egyaránt, hogy élettani körülmények között nem találkozunk jelentıs mértékő membránkárosodással. A védekezı mechanizmust antioxidáns rendszernek nevezzük, mert a kóros oxidáció megelızését, esetleg hatástalanítását célozza. E rendszer egyes elemei (pl. az E-vitamin, a β-karotin stb.) a már képzıdött szabadgyökök
3
"eltakarításáért" felelısek, ezért ezeket "scavenger"-eknek nevezzük (scavenger = söprögetı). A gyökös folyamatok felgyorsulása, esetleg lelassulása, és/vagy a védekezı rendszer elégtelensége kóros folyamatokat eredményezhet. A mezıgazdasági és az állatorvosi kutatásokban Magyarországon eddig elsısorban az élettani reakciók, a szelén- és az E-vitamin-hiányos betegségek, valamint egyes toxikológiai vonatkozások vagy speciális kórképek tanulmányozása keretében foglalkoztak a szabadgyökös reakciókkal, illetve változásaival (47) (171) (172) (257) (284) (338) (404) (405) (475) (476). E korábbi kutatásokhoz kívántam csatlakozni vizsgálataimmal, melyek célját az alábbiakban foglalom össze. I. 2. A kitőzött célok és a megoldandó feladatok Kutatómunkámban a vörösvérsejtek (vvs) egyes LP-s reakciókban részt vevı paraméterei alapján kívántam adatokat nyerni a szervezetben zajló szabadgyökös folyamatokról élettani és kóros esetekben. A vizsgálatokat részben kérıdzıkön (szarvasmarha, juh), részben kutyákon, valamint két modellkísérlet esetében patkányokon végeztem. Négy fı témakörben végeztem vizsgálatokat: 1. a szarvasmarhák és a kutyák vvs-jeiben zajló LP-s reakciók kor függı és a kutyák esetében ivar függı vizsgálata; 2. a juhok és a kutyák vvs-jeiben a xenobiotikumok (CCl4, alloxán) hatására bekövetkezı LP-s reakciók vizsgálata; 3. a hypoxia - reperfusio okozta fokozott LP-s reakciók vizsgálata kutyák és patkányok vvs-jeiben; 4. egyes anyagforgalmi és szervi kórfolyamatok hatására bekövetkezı LP-s reakciók vizsgálata szarvasmarhák és kutyák vvs-jeiben. A hypoxia-reperfusiós vizsgálatok fejezetben, a kutya mellett szereplı faj nem kérıdzı, mint a többi fejezetben, hanem a patkány. Ebben a két kísérletben a mőtéti megoldások bonyolultsága miatt a patkány alkalmasabb fajnak bizonyult. Olyan módszereket választottam, amelyek gyorsak, viszonylag könnyen, kis mőszerezettséggel elvégezhetık és rutinvizsgálatokban felhasználhatók. Ezen okokból kutatási módszerként több lehetıség közül állati vérmintákból a vvs-ek feldolgozása került elıtérbe. Ennek részletes okait az alábbiakban foglalom össze: 1. A vérminták vétele rutinszerő és egyszerően kivitelezhetı. 2. A vvs-ek membránja gazdag PUFA-kban, amelyek érzékenyek az LP-s folyamatokra és ezek a reakciók (elsıdlegesen vagy másodlagosan) viszonylag gyorsan kialakulnak bennük. 3. A vvs-ek a szabadgyökök szempontjából és a bennük lévı antioxidánsok révén raktározó és szállító szerepet is betöltenek, hiszen mind a bennük keletkezı gyökös vegyületek, mind az antioxidánsok a vérkeringés révén idıben és térben különbözıen fejthetik ki hatásaikat. A vvs-ek minden szervbe és szövetbe eljutnak, ahol LP-s reakciók folyhatnak, így a keletkezett gyökök a vvs-ek révén eljuthatnak a keletkezés helyérıl, egy addig még fokozott gyökös reakcióban részt nem vevı területre. Ezekbıl a megfontolásokból kiindulva érthetı, hogy nemcsak a fokozott LP-ben részt vevı szövetekbıl, hanem a vvs-ekbıl mérhetı gyökök, ill. a gyökreakciók elemei is jelzik a
4
szervezet szabadgyökös reakcióit. Az antioxidánsokat a szervezet szükség esetén azonnal mozgósítja, és azok felhasználódnak az adott igényeknek megfelelıen az adott helyen, így a vvs-ekben az antioxidáns enzimek aktivitásváltozása és az antioxidáns szubsztrátok koncentrációváltozása is jelzi a megváltozott szöveti, szervezeti igényt. 4. Egyes kóros folyamatokban, a vvs-ekbıl vizsgálható szabadgyökös paraméterek elemzése információt szolgáltathat a kórképek súlyosságának megítéléséhez is. A kísérletek során a szabadgyökös folyamatok vizsgálatára alkalmas egyszerőbb laboratóriumi módszereket alkalmaztam. Ezeket a biokémiai paramétereket a vvs-ek hemolizátumából végeztem. A szabadgyökös paraméterek vizsgálatát kiegészítettem a vérbıl, tejbıl, takarmányokból mérhetı egyéb biokémiai, valamint egyes esetekben hematológiai paraméterekkel, sıt a kísérleti alanyok egyéb élettani paramétereinek és klinikai tüneteinek vizsgálatával. A kísérletek elrendezése során alapelvként szerepelt, hogy a laboratóriumi paraméterek változását nem egy elıre meghatározott normálértékhez hasonlítottam, hanem minden esetben a vizsgálati eredmények egymáshoz viszonyított változását értékeltem. Az alapértékek felvétele céljából általában minden beavatkozás elıtt mintavétel történt, majd a beavatkozások után további mintákat vettem azok hatásának megállapítása céljából.
5
6
II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS
II. 1. A szabadgyök fogalma Ismeretes, hogy a legtöbb kémiai anyag elektronorbitálján két elektron kering, amelyeknek ellenkezı elıjelő spinjük (azaz pályamenti mozgásuktól független saját impulzusmomentumuk) van. Szabadgyöknek nevezünk minden molekulát vagy molekula-fragmenst, amelynek külsı orbitálján egy párosítatlan elektron van (130) (398). Mivel az elektronok párképzıdésre hajlamosak, a párosítatlan elektron jelenléte miatt a szabadgyökök kifejezett reaktivitást mutatnak, és mint gyökök, rövid az élettartamuk. Biradikálisnak nevezzük azokat a molekulákat, amelyek külsı elektronhéjukon két párosítatlan elektront tartalmaznak, ilyen pl. a molekuláris oxigén és a szuperoxid aniongyök (O2-.) is (398). Ismeretes a gyökion elnevezés is, ami arra utal, hogy az adott + gyök pozitív vagy negatív töltéső (H3N - protonált amingyök, O2-. - szuperoxid aniongyök) (398). A kémiai kötés hasadhat szimmetrikusan (A:B ⇒ A. + B.), amikor szabadgyökök keletkeznek, vagy aszimmetrikusan (A:B ⇒ A- + B+), amikor ionok jönnek létre. II. 2. Az oxigén eredető szabadgyökök és a képzıdésükhöz vezetı néhány folyamat A molekuláris oxigén alapállapotban "biradikális", külsı orbitálján két paralel spinő párosítatlan elektront tartalmaz. A paralel elektronok spinelrendezıdése megakadályozza az elektronpár direkt addícióját egy adott molekulához, meggátolva a kémiai kötés képzıdését. A kötésképzıdéshez elıbb egy elektronspin megfordulásának kell létrejönnie. Mivel a spin megfordulási folyamata lassú, a molekuláris oxigén alapállapotában relatíve gyenge oxidáns. A kémiai reakciók létrejöttéhez aktiválás szükséges. Az aktiválás révén az oxigénmolekulából elıbb aktiválási komplexek, oxigén eredető gyökök keletkeznek, ezek már gyors reakciókra képesek. Az oxigén reaktív közbülsı termékei az ún. reaktív oxigén intermedierek (ROI) (149). A molekuláris oxigénbıl keletkezı gyökök az élettelen természetre és az élıvilágra egyaránt nagy veszélyt jelenthetnek. Az élettelen természetben elıforduló szabadgyökös reakciók: pl. a motorokban a benzin vagy a gázolaj égése, a szmogképzıdés, a fémek és a mőanyagok korróziója, a zsírok, az olajok, a vaj avasodása (210). Az oxigén komplett, tetravalens (4 elektronnal történı) redukciója során víz keletkezik: O2 ⇒ 4e- + 4H+ ⇒ 2H2O. Ha azonban univalens (1 elektronos) redukcióban vesz részt, ami a természetben energetikai okokból könnyebben végbemegy, akkor ROI keletkezik, mint pl. a szuperoxid anion gyök (O2-.). A divalens (2 elektronos) redukció során pl. a szinglet-oxigén, a hidrogén peroxid (H2O2) és a hidroxil gyök (OH.) keletkezik (266). Az O2 uni-, és divalens redukciója az alábbiakban látható: O2⇒+e-⇒ O2.-⇒ +e-+2H+⇒ H2O2⇒+e-+H+-H2O⇒OH.-⇒+e-+ H+⇒H2O. Kismennyiségő ROI képzıdése történhet enzimatikus úton, például olyan enzimek révén, amelyek képesek az oxigén (energetikailag kedvezıtlenebb) divalens és tetravalens redukciójára. Az egyik legfıbb ilyen enzim a citokrómoxidáz, amely az
7
oxigén tetravalens redukcióját hajtja végre a sejtlégzés során. Ez a folyamat az ROI-k keletkezésének egyik (fı) forrása. További ROI-k esetenként nagyobb mennyiségben egyéb oxido-redukciós enzimatikus folyamatok (pl. a xantin-oxidáz katalizálta reakció) révén keletkeznek a sejtorganellumokban, a thrombocyták és a fagocita sejtek mőködése során stb. (329). Az élılényekben az ROI-k másik forrása nem enzimatikus úton jön létre a különbözı kémiai vegyületek autooxidációja, vagyis az O2 univalens redukciója révén, pl. az ubiszemikinon O2-vel zajló reakciója során O2.- képzıdik (180). II. 2. 1. Szuperoxidanion-gyök (O2.-) Jelentısebb mennyiségő O2.- képzıdik nem enzimatikus úton (pl. a hidrokinonokból (348)), és enzimatikus úton a molibdoflavoprotein-oxidázok (pl. a xantin-oxidáz) révén. A xantin-oxidáz hatelektronos redukált formája mobilizálható elektronjait két kételektronos és két egyelektronos lépésben adhatja le. A hat- és a négyelektronos redukált forma H2O2-ot, míg a két- és az egyelektronos redukált forma O2.--t képez. Ha a szubsztrát (xantin) koncentrációja nagy, akkor megmarad az enzim redukált formája. Ez az enzimnek az O2-vel zajló reakciója révén a H2O2 képzıdésének kedvez. Az alkalikus pH, az alacsony xantin-, és a magas O2-koncentráció az O2.képzıdését erısíti (221). Az O2.- a flavoprotein-dehidrogenázok mőködése révén is képzıdhet. Ilyen enzimek pl. a mikroszómális NADPH-citokróm-P450 (497), a mitokondriális NADHdehidrogenáz (496), a dihidroorotsav-dehidrogenáz (158), a ribulóz-1,5-difoszfátkarboxiláz (55) és az ubiszemikinon (158). A gyökképzı reakciókban katalizátor hatású fémek (pl. vas) mellett egyes enzimek is részt vesznek. A NADPH-citokróm-P450-reduktáz révén O2.- keletkezhet NADPH és ADP-hez kapcsolódott vas (Fe3+) jelenlétében a mikroszómákban és a liposzómákban (156). Ez az enzim (NADPH-citokróm-P450-reduktáz) az alábbi reakciót katalizálja (383): 2O2 + NADPH ⇒ NADP+ + H+ + 2O2.-. Izolált májsejtmagok képesek voltak a NADPH jelenlétében O2.--t képezni, Patton és mtsai. szerint ennek a hátterében egy FAD-monooxigenáz enzim áll (381). Az O2.- keletkezhet különbözı vegyületek autooxidációja esetén. Autooxidációra képes vegyület pl. a mitokondriumokon belül a légzési lánc tagja a redukált citokróm-c (91), a vvs-ekben a hemoglobin (346), az izomsejtekben a mioglobin (187), valamint egyéb sejtekben a leukoflavinok (29), a tetrahidropterinek (361), a katekolaminok (347), a polihidrofenolok (313) és a tiolok (349). Az O2.- maga kevésbé reaktív, de az átmeneti fémeket, azok komplexeit és egyéb organikus szubsztrátokat oxidálni képes. Kapcsolódhat egyes fémekhez így más reaktívabb ROI keletkezését készítheti elı. Az O2.- perhidroxi gyökké (HO2.-) való alakulása, szintén könnyen végbemegy, ha az O2.- a vizes közegbıl a lipidfázisba jut. A lipidmicellák, membránok kisebb pH-jú környezete teremti meg a protonáció feltételeit. A membránok felszínének polianionokat tartalmazó része az ellentétes töltéső H+ionokat vonzza a felszín közelébe, így az O2-. protonálódik perhidroxi gyökké (HO2.-): H+ + O2-. - HO2.- (167). A képzıdött HO2.- könnyen reagál tovább linolén és arachidonsavval (179).
8
II. 2. 2. Hidrogén-peroxid (H2O2) A H2O2 képzésében a legfontosabbak az intracelluláris flavin-kötı oxidázok, és a flavoenzimek (337). Ezeknek a szubsztrátja az O2, végtermékük a H2O2 és csak elenyészı mennyiségő O2.--t képeznek (459). Ezek közé az enzimek közé tartoznak a majdnem minden sejtben a mitokondriumok külsı membránján lévı monoaminooxidázok (162). Néhány H2O2-t képzı flavoprotein a peroxiszómákban fordul elı (490). Ilyen az emlısık peroxiszómáiban elıforduló urát-oxidáz, aminek "magjában" egy réztartalmú cuproprotein helyezkedik el (128). Hidrogén peroxidot képzı flavoenzimek közé tartozik továbbá a glikolát-oxidáz, az aminosav-oxidáz és a zsírsav-oxidáz is (422). Hidrogén-peroxidot képzı enzimek az amin-oxidázok és a tiol-oxidázok (288) is. Az egyik legfontosabb H2O2-képzı enzim azonban a szuperoxid-dizmutáz (SOD) (166). II. 2. 3. Hidroxil(anion)-gyök (OH.-) Az OH.- a legreaktívabb oxigéngyök. Ez az ROI az O2-bıl és az O2.--bıl képzıdik a vas- vagy rézkatalizálta Haber-Weiss reakció révén (59) (196). A biológiai rendszerekben a vas szállító vagy raktározó fehérjékhez kapcsolódik (transzferrin, ferritin), és ezekben a formákban nem képes katalizálni az OH.--t képzı reakciókat (202). Az O2.- képes a ferritinbıl felszabadítani a vasat, míg a transzferrinbıl erre nem képes (57). A sejtekben a vas az ATP-hez, a GTP-hez és a citráthoz kötıdik. Ezek a vaskelátok az Fe3+ gyorsabb redukciója révén még a szabad vasnál is jobban katalizálják az OH.-t képzı reakciót. Ezek a kelátok vízben jelentısen jobban oldhatók, mint a szabad vas, ami valójában Fe(H2O)63+ precipitátum formájában fordul elı. Egyes megfigyelések szerint a szabad vas koncentrációját csökkentı, azt kelát formájában megkötı anyagok, mint pl. az etiléndiamin-tetraecetsav (EDTA), bár csökkentik az Fe3+-szintet, azonban az OH.- képzıdését nem (199). Az említett OH.- képzıdésére vezetı reakcióút az ún. Haber-Weiss-reakció (167) (196): O2-. + H2O2 ⇒ O2 + OH- + OH.-. Ebben az esetben a reakcióhoz szükséges H2O2 a molekuláris oxigén divalens redukciójával a glükóz-oxidáz mőködése révén vagy az O2.- -bıl a SOD hatására (2O2.+ 2H+⇒H2O2 + O2) keletkezik. Ebben a formában csak néhány esetben alakulnak ki a fenti reakciók, fıként ha katalizálja más vegyület, pl. a tiolok (423). A Haber-Weiss reakció lejátszódhat a májsejtek mikroszómáinak nem specifikus alkohol-oxidázának mőködése révén (93), valamint a neutrophil granulocytákban (415) is. Az alloxán diabetogén hatása is gyaníthatóan e reakció révén keletkezı OH.- miatt alakul ki (214). A Haber-Weiss-reakció az élı szervezetekben lassú folyamat, de fémkatalízis hatására felgyorsul. Ez következik be pl. a laktoferrinben lévı vas (Fe2+) (6) és a réz (Cu2+) (433) hatására. A vas nagymértékben felgyorsítja a reakciót pl. EDTÁ-val kötött formájában (Fe-EDTA), vagy a hem részeként porfirin-vas formában (200). A fémkatalizálta Haber-Weiss reakció az ún. Fenton-reakció (167): O2.- + Me(n+1)+ ⇒ Men+ + O2 ⇒ Me(n+1)+ + OH.- + OHMen+ + H2O2 O2.- + H2O2 ⇒ O2 + OH.- + OH(Me = átmeneti fém, n = + töltések száma).
9
Ha a vas a katalízisért szereplı átmeneti fém, a Fenton-reakció az alábbiak szerint alakul (18): O2.- + Fe3+ ⇒ Fe2+ + O2 Fe2+ + H2O2 ⇒ Fe3+ + OH.- + OHEzen az úton jelentıs mennyiségő OH.- keletkezhet. A Fenton-reakció analógiájára a H2O2-ot hidroperoxidok is helyettesíthetik (jelen esetben a katalízisért a vas-ion felelıs): Fe2+ + ROOH ⇒ Fe3+ + RO. + OH-. II. 2. 4. Alkoxi-gyökök (RO.) Az RO.-k kevésbé reaktívak, mint a OH.-, de jelentıs lehet a károsító hatásuk fıként, ha egy H-atom áttevıdik és hidroxialkil-gyökök képzıdnek belılük: RO. + RH ⇒ ROH + R. (143). II. 2. 5. Szinglet-oxigén (1O2) Az 1O2 akkor képzıdik, amikor energia-abszorpcióval a molekuláris oxigén két párosítatlan elektronja közül az egyik spin-inverzióval egy nagyobb orbitálra kerül (266). A szinglet-oxigén képzıdésének legjelentısebb módja, amikor a laktoperoxidáz (252), a kloroperoxidáz (251), vagy a mieloperoxidáz (262) a H2O2-t halidok közremőködésével bontja. Az 1O2 képzıdésében részt vesz továbbá, a prosztaglandinendoperoxid-szintáz (87), a citokróm-P450-enzimrendszer (86) és a tormaperoxidáz is (amely a késıbbiekben említésre kerülı malondialdehid oxidációját is katalizálja) (504). Szinglet-oxigén keletkezik a késıbb kifejtésre kerülı lipidperoxidációs reakciók terminális lépésében is: LOO. + LOO. ⇒ LO + LOH + 1O2 (471); az oxigénnek a triplet-karboxilvegyületekkel (pl. 4-hidroxi-2,3-transznonenal /RO./) történı reakciója révén: RO. + O2 ⇒ RO + 1O2 (527); valamint a xenobiotikumok NADPH-citokrómP450-reduktáz által katalizált univalens redox-ciklus melléktermékeként (253), amire a késıbbiekben szintén utalok. II. 3. Az ROI-k keletkezésének sejtszintő forrásai Michaelis már 1946-ban azt feltételezte, hogy a bivalens szerves molekulák oxidációját meg kell elıznie intermedierek keletkezésének (344). Eszerint a teória szerint az O2 redukciójából származó intermedierek univerzálisak az aerob életben, és szükségszerően létre kell jönniük olyan toxikus, erısen reaktív anyagoknak is, mint az O2.- és a H2O2. Az élı szervezetekben számos enzim és szubsztrát mőködik közre az ROI-k képzésében, de ezeknek csak egy része mutatható ki közvetlenül. A sejtek organellumaiban a szabadgyök-képzésben részt vevı fontosabb elemeket az alábbiakban foglalom össze:
10
II. 3. 1. Mitokondriumok A legtöbb ROI a mitokondriumokban képzıdik, mert a mitokondriumokban zajlanak a légzési lánc lépései (66). A légzési láncban az O2.- képzıdésének fı helye a szukcinát-dehidrogenáz-citokróm-b-szegmens (222), de az O2-. képzıdésében a NADHubikinon-reduktáz és az ubikinol-citokróm-c-reduktáz (85) és a flavoproteindihidroorotsav-dehidrogenáz (159) mőködése is szerepet játszik. A szabadgyökök képzıdésére vezetı reakcióutak légzési láncban való megjelenésének sematikus ábrázolása az 1. ábrán látható. 1. ábra A mitokondriumban mőködı légzési lánc sematikus ábrázolása (132) ⇒citokróm b, c1-FeS⇒ ⇒citokróm a és a3-réz⇒ ⇒ O2 NADH⇒ ⇒FeS-FMN-FeS2⇒KoenzimQ⇒ ↑ →⇑ FeS-FAD ⇑ Szukcinil-dehidrogenáz rövidítések: NADH = redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid FeS = nem hembıl származó vas- és kén-tartalmú fehérjeközpontok FMN = flavinadenin-mononukleotid FAD = flavinadenin-dinukleotid ↑ = szabadgyök-képzıdésre vezetı reakcióutak (az FeS-központok, a flavincsoportok és a KoenzimQ interakciói) II. 3. 2. Peroxiszómák A peroxiszómákban a flavoproteinek, a D-amino-oxidáz, az L-α-hidroxisav-oxidáz, a zsírsav-acil-CoA-oxidáz és egyes fajokban (nem primatákban) a réztartalmú húgysavoxidáz mőködése révén jön létre az ROI-k döntı hányada (317). A peroxiszómák kataláza hozza létre a H2O2 nagy részét, mégis a képzıdött H2O2 11-42%-a kijut a citoszolba (67). II. 3. 3. Endoplazmatikus retikulum Az endoplazmatikus retikulum membránjában szintén képzıdnek ROI-k (181). Itt a flavoprotein-NADPH-citokróm-c-reduktáz rendszer és a citokróm-P450 mőködése a fıbb forrás (220). II. 3. 4. Citoszol A citoszol enzimjei közül a xantin-oxidáz és az aldehid-oxidáz a fıbb ROI-képzık. Ezek az enzimek a sejtek által képzıdött H2O2, mintegy 5%-ának képzıdéséért felelısek
11
(67). Itt említhetı meg, hogy a nem enzimatikus forrásokból, a tiolok autooxidációja révén szintén keletkezhetnek ROI-k, így H2O2 is (349). II. 3. 5. Sejtmag A sejtmag szintén rendelkezik energiafüggı légzési aktivitással (114). Patkány májsejtmagból (115) és ascitesbıl származó tumorsejtbıl (39) flavinokat és citokrómokat mutattak ki, melyek elektrontraszferként is mőködnek. Az említett sejtek magjaiból O2.és H2O2 képzıdést, sıt SOD-aktivitást is kimutattak (40). II. 4. A lipidperoxidáció (LP) fogalma és folyamata A biomolekulák közül azok, amelyeknek telítetlen kettıskötései vannak (pl. acilláncok, zsírsavak, foszfolipidek, koleszterin) kifejezetten érzékenyek a patológiás gyökreakciók károsító hatásaira (448). Ennek három fı oka van: (1.) a PUFA-k αmetilén szénatomja a kettıskötések szénatomjai mellett igen könnyen reakcióba lépnek a szabadgyökökkel (131); (2.) a molekuláris oxigénnek hétszer nagyobb az oldékonysága az apoláros közegben, mint a vizes fázisban (290); (3.) a molekuláris oxigénnek külsı orbitálján párosítatlan elektronok vannak, amelyek révén az O2 könnyen iniciálhat szabadgyökös láncreakciókat (398). A lipidek in vivo (pl. az öregedési pigmentekben található peroxidált lipidek) és in vitro (pl. a zsír avasodása) is oxidálódhatnak. Ha egy adott lipidet egy szabadgyökiniciátor segítségével hidrogénelvonással lipid-szabadgyök (R.) állapotba hozunk, könnyebben képes reakcióba lépni a molekuláris oxigénnel. A reakció során peroxiszabadgyök (ROO.) keletkezik. Ezt a folyamatot nevezzük lipidperoxidációnak. A peroxidációra fıleg a PUFA-k hajlamosak, mivel a kettıs kötés melletti ún. α-metilén szénatomjaik C-H kötése gyengébb, így részlegesen aktiváltnak tekinthetık. Az LP kezdeti lépéseként errıl a szénatomról történik a hidrogénelvonás. Az α-metilén szénatom hidrogénjét allil-hidrogénnek is nevezik (398). A kezdeti lépések láncreakciót indítanak el, amely a környezı molekulákat tovább károsíthatják. A lipidek autooxidációja során új C-C-kötések, és keresztkötések képzıdnek. Ezek fıképp a membránok lipid-kettısrétegének sérülését eredményezhetik. Az autooxidációt meggyorsítja az egyes fémek jelenléte, mert fokozzák a hidroperoxidok bomlását. A láncreakcióban létrejövı, a fémek által is katalizált oxidációs lépésekben részt vesznek az egyébként kevésbé reakcióképes, nem lipid-típusú, más sejt- ill. membránalkotó vegyületek. Élettani körülmények között ez azonban igen lassú folyamat, patológiás körülmények között azonban extrém felgyorsulása következhet be (132). Az LP során kelekezı ún. metastabil lipidperoxidok, aldehidek (pl. a malondialdehid), vagy más végtermékek (2-alkenálok, 4-hidroxil-2-alkenálok) is keletkeznek, amelyek noha nem szabadgyökök, mégis rendelkeznek bizonyos reaktivitással. Ezek relatív stabilitásuk révén a keringési rendszeren keresztül eljuthatnak a keletkezésük helyétıl távol esı szövetekbe, így ott is súlyos károsodásokat okozhatnak (149).
12
Az LP mechanizmusát a következıkben Aust és mtsai. (1982) által közöltek felhasználása alapján foglalom össze (18), a más szerzıktıl származó kiegészítéseket külön jelölöm: Az alábbiakban alkalmazott, eddig nem szereplı rövidítések: LH = zsírsav, LOOH = lipidhidroperoxid, L. = lipid-alkilgyök, LOO. = lipid-peroxigyök. II. 4. 1. Iniciáció (bevezetı szakasz) I. lehetıség LH + O2 ⇒ L. + HO2. Ez lipid-hidroperoxid képzıdése nélkül lejátszódó iniciáció, vagyis LOOH-independens folyamat. Ez a reakció önmagában nem zajlik le, mert kifejezetten endoterm, igen magas aktivációs energájú, élettani körülmények között ilyen nem jöhet létre, de bekövetkezhet, ha egy fémion katalizálja a folyamatot. II. lehetıség A másik esetben az iniciáció egyik reakcióalanya egy olyan lipidmolekula, amely már tartalmaz egy peroxid-csoportot, ilyen pl. a PUFA-hidroperoxid. Ebben a reakcióban PUFA-alkoxi- vagy PUFA-peroxi-gyökök keletkeznek. LOOH ⇒ szabadgyök A lipid-hidroperoxidok ilyen típusú reakciója az ún. terminális homolízis. Önmagában szintén lassú folyamat, annak ellenére, hogy következményesen iniciált reakció, és a katalízisben szereplı részben aktivált komponensek már eleve jelen vannak. E folyamatot is felgyorsítja a fémkatalízis. A reakcióban részt vevı vas pl. az oxidált hembıl származhat. II. 4. 2. Propagáció (tovaterjedés szakasza) Az iniciáció után a propagáció következik amely több lépést foglal magában és közben nagyszámú szabadgyök jön létre. L. + O2 ⇒ LOO. LOO. + LH ⇒ LOOH + L. Ha az iniciáció hidrogénelvonással történt, és PUFA-alkil-gyök jött létre, a propagáció során következı lépésként arra két oxigénatom kapcsolódik. A propagáció lezajlása függ a reakcióelegyben lévı oxigén parciális nyomásától is. Ez alapján tehát, a lipidperoxidáció propagációs lépése magában foglalja a PUFAmetilén-hidrogén elvonását a PUFA-peroxigyök által. Ennek a rekciónak a terméke a PUFA-hidroperoxid és a PUFA-alkilgyök. A PUFA-alkilgyökhöz ezután oxigén kapcsolódik és újraképzıdik a PUFA-peroxigyök. A propagáció egyik módosulata során egy PUFA-peroxigyök belülrıl generál egy cirkulációs folyamatot és PUFA-endoperoxid-gyök jön létre. Ez az ún. belsı endoperoxid formáció. A PUFA-endoperoxid-gyökhöz O2 kapcsolódik és PUFA-
13
endoperoxid-peroxigyök alakul ki. A PUFA-endoperoxid-peroxi-gyök részt vesz azután a propagáció lépéseiben hasonlóképpen, mint bármely más PUFA-peroxigyök. A belsı endoperoxid formáció és a ß-helyzető C-atomhoz történı oxigénkapcsolódás alakítja ki azt a tulajdonságot, hogy az endoperoxidok kimutathatóvá válnak a tiobarbitursavas módszerrel. Az endoperoxidok az ún. tiobarbitursav-reaktív anyagok. Felhalmozódásuk a lipidperoxidáció folyamatát és kiterjedését jelzi. A tiobarbitursavval oxo-, vagy dioxo-vegyületek is képesek reagálni, és sárgás-vöröses színő komplexet hoznak létre hevítés hatására savanyú közegben (391). II. 4. 3. Termináció (befejezı szakasz) A harmadik fázis a termináció, amelynek végtermékei nem szabadgyökök, de rendelkeznek bizonyos reaktivitással. Ilyen stabil termékek a kilélegzett levegıbıl mérhetı etán és pentán (134) valamint a testfolydékokból és a szövetekbıl kimutatható metastabil tiobarbitursav-reaktív malondialdehid (31). További stabil végtermék például a 8-epi-prosztaglandin-F2-α (413) is. A biológiai membránokban a terminációs lépés reakcióiba beletartoznak a PUFAgyökök és a membránalkotók (α-tokoferol, koleszterin, glutation, fehérjék) reakciói is. Az LP összefoglaló folyamatának rövid áttekinthetı összegzése Demopoulos és mtsai. (1980) nyomán (132), a „Mellékletek” fejezetben található. II. 5. Az LP sejtszintő következményei A sejtekben és a szövetekben létrejövı LP-s folyamatoknak számos károsító hatása van, amik nagymértékben befolyásolják az élı szervezet mőködését, sıt gyakran morfológiai elváltozásokat is okoznak. Az alábbiakban rövid összefoglalását kívánom adni a sejtek szintjén jelentkezı LP okozta káros behatásoknak. II. 5. 1. Membránok mikroarchitektúrájának károsodása Ez a folyamat azáltal alakul ki, hogy hidrofil részek jönnek létre az alaphártyában. A membránkárosodás olyan mértékő lehet, hogy a lipidek szénláncai megszakadhatnak és végsı következményként fokozott (esetleg csökkent) membránpermeabilitás alakulhat ki. A vvs-ek membránkárosodása következtében pl. hemolízis alakulhat ki (145). II. 5. 2. A sejtenzimek mőködésének gátlása A sejtenzimek gátlása elsısorban a hidroperoxidok hatására következik be, pl. az izocitrát-dehidrogenáz-aktivitás szinte teljesen megszőnik a májsejtek mitokondriumaiban a vas-ionok által indukált linolénsav-hidroperoxidok károsító hatása miatt (334). A szulfhidril-(SH-) csoportok és/vagy a cisztein-tartalmú fehérjék oxidációja is közrejátszik az enzimaktivitások megváltozásában (109) (110).
14
II. 5. 3. A lebontási (vég)termékek károsító hatásai A metastabil végtermékek közül a malondialdehidnek (MDA-nak) ismertek a károsító hatásai. Degradációjának két lehetséges útja van. Az egyik út az MDA oxidációja az aldehid-dehidrogenázok révén, egyéb metabolikus változások kíséretben (226), a másik út az ún. Schiff-bázisok kialakulása mellett, pl. a lizin ε-amino csoportjaival történı reakció révén jöhet létre (103). Ebben a reakcióban keresztkötések alakulhatnak ki különbözı enzimeken belül is. Kimutatták, hogy pl. a ribonukleáz-A-ban keresztkötések alakultak ki az MDA hatására csakúgy, mint más LP-t iniciáló anyag jelenlétében. II. 5. 4. Fehérjék és nukleinsavak károsodása Az albuminban, ami jelentıs mennyiségő PUFA-t szállíthat, hasonlóan egyéb fehérjékhez, szintén keresztkötések alakulhatnak ki az LP hatására. Más amino csoportot tartalmazó anyagok esetében is létrejöhetnek ezek a reakciók, pl. RNS-ben, DNS-ben stb. A keresztkötéses sejtszintő komponensek fluoreszcens tulajdonságai hasonlítanak a lipofuszcin (idıs kori pigment) tulajdonságaira (101). II. 6. A szabadgyökökkel szembeni védekezés és elemeinek intracelluláris lokalizációja A szabadgyökök, lipidperoxidok hatását az E-vitamin (α-tokoferol) általánosan kivédi (445). Élettani körülmények között azonban, a védekezı rendszer fı tagjai, a kataláz (CAT), a glutation-peroxidáz (GSH-Px) és a szuperoxid-dizmutáz (SOD) eliminálja a szabadgyököket, és a kis mennyiségben jelen lévı E-vitamin a második védelmi vonalat képviseli (481). II. 6. 1. Mitokondrium A mitokondriumban keletkezı O2.- és H2O2 a mitokondriumot magát is károsíthatja. A légzési lánc, mint gyökképzı folyamat szintén károsodhat a gyökök által okozott esszenciális zsírsavak oxidációja miatt. Tyler kimutatta, hogy az O2.- a NADHdehidrogenáz aktivitását is gátolta (498). Ezért lényeges, hogy az antioxidánsvédekezésben szereplı enzimek (GSH-Px, SOD) jelen legyenek a mitokondriumon belül. A mitokondriális citokróm-c-peroxidáz, amelyet pl. élesztı mitokondriumban találtak, a következı reakciót katalizálja (531): H2O2 + 2 citokróm-c2+ + 2H+ ⇒ 2H2O + 2 citokróm c3+. A mitokondriumok mátrixában a légzési láncban keletkezı O2.--t a Mn-t tartalmazó SOD alakítja H2O2-vé (519). II. 6. 2. Citoszol Nohl és Hegner feltételezik, hogy a képzıdött O2.- 20%-a "megszökik" a mitokondriális SOD elıl és kilép a citoszolba (364). Más vizsgálatok azt bizonyítják,
15
hogy a mitokondriumból jelentıs mennyiségő H2O2 képes távozni (301). Ezért nagy jelentısége van a citoszolban lévı antioxidáns enzimek, anyagok jelenlétének is. A SOD két formában jelenik meg az eukaryota sejtekben. A citoszol réz- és cinktartalmú SOD-ot (CuZnSOD) tartalmaz (519). A GSH-Px szintén megtalálható a citoszolban és a mitokondrium mátrixában. A nem szelén tartalmú GSH-Px elsısorban a citoszolban található és kisebb affinitást mutat a H2O2 iránt (82). II. 6. 3. Szubcelluláris struktúrák A sejtek szubcelluláris struktúrái közé tartoznak a peroxiszómák, az endoplazmatikus retikulum, a Golgi-apparátus stb. A CAT fıként a peroxiszómákban vagy más szubcelluláris mikrotestecskékben jelenik meg, de nem a mitokondriumban (128). Az említett enzimek, folyamatok leegyszerősített ábrán (2. ábra).
intracelluláris
lokalizációja
látható
a
2. ábra A O2.- és H2O2 metabolizmusának intracelluláris lokalizációja (157)
rövidítések: szuperoxid-aniongyök: O2.-; szeléntartalmú glutation-peroxidáz: SeGSH-Px; nem szeléntartalmú glutation-peroxidáz: GSH-Px; mangántartalmú szuperoxid dizmutáz: MnSOD; réz- és cinktartalmú szuperoxid-dizmutáz: CuZnSOD; kataláz: CAT; alifás alkohol vegyület: AH2; dehidro-alkohol vegyület (aldehid): A * Ebben a folyamatábrában a szerzık jelölnek H-donort a CAT számára, amire csak bizonyos esetekben van szükség az enzim mőködéséhez. II. 7. Az antioxidáns enzimek lokalizációja a vvs-ekben A keringı Hb 3%-a oxidálódik és redukálódik naponta a methemoglobin-reduktáz segítségével. Ebben a reakcióban folyamatosan képzıdnek O2.--k, amelyek az oxiHb-t methemoglobinná oxidálhatják. A O2.--bıl a peroxidokkal való interakció révén OH.- is képzıdhet, amely a legveszélyesebb vvs-membrán-károsító (487). A vvs-ekben az antioxidáns védelemért felelıs a szelénfüggı GSH-Px, a SOD, a CAT. A GSH-Px hidrofób része a vvs-ek sejthártyájához kapcsolódik és redukálja az itt képzıdött lipidhidroperoxidokat (104). A szelén GSH-Px-be való beépülése az erythropoiesis során következik be (197).
16
A CAT a vvs-ekben a membránhoz kapcsolódik, és részt vesz a GSH-Px-el együtt a Hb oxidatív károsító folyamatainak gátlásában (104). A vvs-ek antioxidáns védekezırendszerének mőködésének fıbb elemeit lásd még a 8. ábrán . II. 8. Regulációs mechanizmusok II. 8. 1. A szervezet védekezése a fokozott oxigéntenzióval szemben A szervezet a szöveti oxigéntenziót viszonylag stabilan alacsony szinten tartja egyrészt a mikrovascularis rendszeren keresztül másrészt a nagy oxigén grádiens fenntartása révén. Az arteriolák constrictióval reagálnak a magas oxigéntenzióra, így a keringést csökkentik az életfontosságú szervek, mint pl. az agy irányába. Ezáltal a magas nyomású oxigén káros hatásai az agyban sokkal késıbb jelentkeznek, mint pl. a tüdıben (96). Lényeges, hogy a létfontosságú szervekben (szív, agy) nagy az interkapilláris távolság. Ezzel a kapilláris és a szövet közötti oxigénkoncentrácó grádiens, akár 100vagy 1000-szeres is lehet (278). A többi védekezési lépés az antioxidáns enzimek és szubsztrátok mőködésének útján megy végbe (371). Fontos szerep hárul a már említett citokrómoxidázra is az antioxidáns védekezés szempontjából. A sejten belüli oxigénredukciós lánc fı elektron-transzfere, a citokrómoxidáz ("zsebe" segítségével) a mitokondriumból nem engedi ki a közbülsı termékeket (pl. az O2.--t). A lekötött termékekbıl a folyamatban végül víz képzıdik (99). II. 8. 2. Az antioxidáns védekezés regulációja Lotscher és mtsai. kimutatták, hogy a H2O2 és más hidroperoxidok szerepet játszanak a megfelelı NAD(P)H / NAD(P) arány kialakulásában (303). Az összefüggés a szelénfüggı GSH-Px és a NADPH-függı glutation-reduktáz mőködése révén jelentkezik: H2O2 (ROOH) + 2 GSH ⇒ H2O2 (ROH) + GSSG GSSG + NADPH + H+ ⇒ 2 GSH + NADP Májsejteken végzett vizsgálatok azt valószínősítik, hogy a májsejtek mitokondriumjai és a citoszolja között létrejövı Ca2+ egyensúly szintén az adott NAD(P)H + H+ / NAD(P) arány kontrollja alatt áll (294). A Ca2+ felvétele az ATPhidrolízis közvetítette energia révén jöhet létre (442). A NAD(P)H + H+ / NAD(P)+ párok mőködése összekapcsolódik egy energia-függı transzhidrogenázzal a mitokondriumon belül: NADH + ATP + NADP+ ⇒ NAD+ + ADP + P~ + NADPH + A NAD(P)H + H /NAD(P)+ párok és a H2O2 egymásra is hatnak. Ez az egymásra hatás úgy jön létre, hogy a H2O2 termelıdésének mértéke szabályozza a redukáló rendszer (NAD(P)H + H+/NAD(P)+) mőködését a Ca2+-felvétel, a GSH-Px, a glutationreduktáz és a mitokondriális transzhidrogenáz mőködése által. A H2O2-produkciót a
17
mitokondrium állapota szabályozza, vagyis amikor ADP van jelen és amikor a NADH oxidációja maximális szinten van, akkor a H2O2-produkció leáll. Az O2.- és a H2O2 hatása révén keletkezı lipid-hidroperoxidok szintén befolyásolják a mitokondriális funkciót (260). Watanabe és Nakamura kimutatták, hogy a linolsav-hidroperoxidok gátolták a mitokondriumban zajló oxidatív foszforilációt, fokozták az Mg-ATP-áz aktivitását és "uncoupling"-ként mőködtek (513). Mások bizonyították, hogy a lipidhidroperoxidok megváltoztatták a mitokondriumok permeabilitását egyes kationokkal szemben (17). Érdekes tapasztalat, hogy a szubmitokondriális partikulumok nem képeznek O2.--t, ha nincs jelen SOD. Bizonyítást nyert, hogy a SOD jelenlétében az energetikailag kedvezıtlenebb O2.--képzı reakció játszódik le. A SOD ezáltal gátolja a szemikinongyök (QH.) reakcióit és H2O2-t képez (157): O2 + QH. ⇒ O2.- + Q + H+; 2O2.- + 2H+ ⇒ H2O2 + O2. II. 9. Antioxidáns és prooxidáns enzimek II. 9. 1. Kataláz (CAT) (EC: 1.11.1.6) Briggs és Haldane 1925-ben feltételezték olyan enzimek jelenlétét, amelyek H2O2-t használnak fel (73). Theorell 1951-ben ezeket az enzimeket hidroperoxidázoknak nevezte (483). Kimutatták a H2O2 reakcióinak szerepét a mikroszómákban, mitokondriumokban és a peroxiszómákban (127). A mitokondriumoknak a peroxidok termelıdésben betöltött szerepét vizsgáló kutatások adták az alapját a mitokondriális hidrogéntranszfer reakciók feltérképezésének (66). A H2O2 bontásáért elsısorban a szubcelluláris frakcióban lévı CAT a felelıs. A kataláz szinte minden állati sejtben megtalálható, molekulatömege 240.000 D, négy alegysége van, aktív centruma az Fe3+-at tartalmazó protoporfirin-IX (483). Mőködését az O2.- gátolni képes (270). A kataláz az egyetlen olyan enzim, amely kettıs funkciót képes ellátni teljesen különbözı kinetikus karakterrel. Fıbb reakcióinak a magyarázatát az ún. I. komponens, mint köztianyag (aktiválási komplex) felfedezése segítette elı (94). Az I. komponens teljes kémiai struktúráját pontosan nem ismerjük, de biztos, hogy a vas és a peroxid oxidációs terméke (35). A reakció végén a szabad kataláz újjáalakul, és molekuláris oxigén képzıdik. Az összes oxigén 0,5 %-a szinglet-oxigénként kerül ki a rendszerbıl (392). A kataláznak nagy a specifitása egyes peroxidokra nézve, pl. a hidrogén-peroxidra, a metil- és az etilhidroperoxidokra. A H2O2 helyi koncentrációja és a kataláz aktivitása biológiai rendszerekben általában egyenesen arányos, így az enzim megfelelı szinten képes tartani az intracelluláris H2O2 koncentrációt (101). A kataláz két kinetikailag is eltérı funkciója úgy változik, hogy amikor a H2O2 koncentráció kicsi, akkor a peroxidatív mőködés lép elıtérbe, amikor pedig nagy, akkor a katalitikus út dominál (98). Az enzim mennyisége (és aktivitása) más enzimek mellett hormonális, táplálkozási, farmakológiai körülményektıl függ (227). A "peroxiszóma koncepciót" De Duve és Baudhuin dolgozta ki (128). Immunológiai módszerekkel igazolást nyert, hogy a kataláz
18
a peroxiszómákon kívül szintetizálódó prekurzorokból a peroxiszómában válik aktív enzimmé (126). A vörösvérsejtekben a kataláz enzimnek csekély jelentısége van élettani viszonyokban, mivel a képzıdı gyökök degradációját a glutation-rendszer végzi (104). Bizonyítást nyert azonban, hogy nagyobb H2O2 koncentrációnak kitett sejtekben a kataláz gyorsabban bontja a H2O2-ot, mint a GSH-Px, gyaníthatóan annak következtében, hogy ennek az enzimnek a mőködéséhez nincs minden esetben szükség hidrogén donorra (2). Egy leegyszerősített reakciósorozat látható a 3. ábrán, amely a CAT két reakcióciklusát ábrázolja. A felsı rész a katalitikus, az alsó pedig a peroxidatív reakciót ábrázolja. A peroxidatív reakcióban az I. komponens és az alkohol reakcióterméke egy aldehid molekula (444). 3. ábra A CAT I. komponensének feltételezett reakciója (444)
rövidítések: X: szubsztrátkötı, az enzimhez tartozó fehérje molekula; L: az enzim struktúrális, vaskötı része; R-CH2OH: alkohol-molekula, mely H-donorként mőködik; RCHO: aldehidmolekula, a peroxidatív reakció végterméke; a nyilak a reakcióutakat és az elektronátadást jelölik. II. 9. 2. Glutation-peroxidáz(ok) (GSH-Px) (EC: 1.11.1.9) és a glutation-S-transzferáz (GST) (EC: 2.5.1.18) A GSH-Px-et és biokémiai funkcióját Mills 1957-ben fedezte fel (345). A szelénfüggı enzimnek (molekulatömege: 88.000 D) négy alegysége van, aktív centruma a szelén, amelybıl alegységenként egyet tartalmaz (154). A szelénfüggı GSH-Px aktív centrumában a katalízisért felelıs csoport a szelenocisztein, redukált formában SeHcsoport található (161). A GSH-Px a H2O2 és a hidroperoxidok katalitikus bontását végzi azáltal, hogy a redukált glutationt (GSH) oxidálja glutation diszulfiddá (GSSG) (303): H2O2 + 2 GSH ⇒ 2H2O + GSSG ROOH + 2 GSH ⇒ H2O + ROH + GSSG A képzıdött hidroxi-lipid a késıbbiekben a β-oxidációban további bontásra kerülhet (104).
19
A GSH-Px aktivitása nagy a májban és az erythrocytákban, kicsi a szívben és a tüdıben valamint az izomszövetben. A GSH-Px specifikus a hidrogén donorjára, a GSHra nézve, és nem specifikus a hidroperoxidokra nézve, hiszen azok széles spektrumával (a H2O2-tıl kezdve a szerves hidroperoxidokig, a zsírsav hidroperoxidokat, a nukleotidés szteroid hidroperoxid derivátumokat beleértve) képes reagálni. A GSH-Px "osztozik" a H2O2-on a kataláz enzimmel és egyedül képes hatékonyan reagálni a szerves hidroperoxidokkal. Patkány májsejtjein belül a GSH-Px 2/3 része a citoszolban, 1/3-a pedig a mitokondriumban található. A peroxiszómákból nem mutatható ki (153). A sejten belüli migrációja során kapcsolódik a membránstruktúrában lévı hidrofób lipidhidroperoxidokhoz. A szervezetbe juttatott LP-t fokozó szubsztrát adása a szöveti GSH-Px aktivitását jelentısen növeli. Lipidperoxidok felvétele után a bélnyálkahártya és a májszövet GSHPx aktivitása nı (410) csakúgy, mint a tüdıszöveté ózon belélegeztetése után vagy 8590%-os oxigén 14 napig történı inhalálását követıen (265). Patkányok májának GSHPx-aktivitása nı ösztrogén adagolása után is (390). A Se-bevitellel a GSH-Px aktivitása is nı egy adott szintig, és Se-hiányában pedig az enzim aktivitása csökken. Ezt a folyamatot számos szervben és a vvs-ekben is ki lehet mutatni (197) (169). Megemlítendı azonban, hogy a GSH-Px mérésével inkább a Sehiány mutatható ki, mint a Se-túladagolás. A Se-bevitel fokozása esetén ugyanis nem szoros korrelációban emelkedik az enzim aktivitása. Megemlítendı, hogy a GSH-Px aktivitásában jelentıs faji diverzitás is jelentkezik (169) (338), sıt ivari differenciát is igazoltak (a nıstény patkányok mája kisebb aktivitási értékeket mutat) (390). Létezik egy nem szelénfüggı GSH-Px is. Megfigyelték, hogy a szelénhiányos patkányokban a hidroperoxidok eliminálása nem vált teljesen gátolttá. Ennek a felfedezésnek a nyomán mutatták ki a szelén-independens glutation peroxidázt, melyet glutation transzferáz B-nek, vagy glutation-S-transzferáznak (GST) neveztek el (396). Lawrence és Burk patkányok májhomogenizátumán végzett vizsgálatai is bizonyították ennek az enzimnek a meglétét (291). A lipidhidroperoxidok és a H2O2 bontását vizsgálták és kimutatták, hogy molekulatömegük alapján egészséges állatokban két enzim figyelhetı meg. Az egyik enzim mindkét anyag bontását képes volt katalizálni, míg a másik csak lipid-hidroperoxidokat bontott. A nem szelénfüggı GSH-Px molekulatömege 46.000 D, dimer struktúrájú, a két alegység önmagában is funkcióképes (396). Sárvári összefoglaló munkájában részletezi a GST szerepét és mérésének jelentıségét a klinikai diagnosztikában. A GST-nek számos funkcióját ismerjük: a szerves hidroperoxidokat közömbösíti, peroxidáz-aktivitása van, a glutation tiolát-anion (GS-) konjugációját végzi számos hidrofób molekula elektrofil centrumával, alkil-, aralkil-, aril-, alkán- és epoxidtranszferáz aktivitása van, katalizálja a tiolízist, nitrocsoportot hasít le egyes szubsztrátokról, ketoszteroid izomeráz aktivitása van, a szerves halogenizált benzolszármazékok károsító csoportjait átalakítja. Számos reaktív metabolit képes a GST-hez kovalensen kötıdni, ezért feltételezik intracelluláris transzport protein, illetve receptor szerepét is (435). A GST szubcelluláris szinten megtalálható a citoszolban, az endoplazmatikus retikulumban, a mikroszómákban, és a mitokondriumok külsı membránján (292).
20
Ismeretes egy a klasszikus Se-dependens, GSH-Px-hez hasonló aminosavszekvenciájú és kinetikájú, 20.000 D molekulatömegő monomer enzim is az ún.: foszfolipid-hidroperoxid glutation-peroxidáz (PHGSH-Px), eredeti nevén: "peroxidation-inhibiting-protein" (PIP), amelyet sertések májszövetébıl izoláltak. Ez az enzim képes redukálni a kumén- és a t-butil-hidroperoxidot, valamint a klasszikus GSHPx-tıl eltérıen a foszfolipid-hidroperoxidokat is. Fıleg a sejtmembrán védelmében játszik szerepet (499). Emberi vérplazmából izoláltak egy, az elızıekhez hasonló, glutation-peroxidáz funkciójú enzimet, a plazma-GSH-Px-et, amit vese eredetőnek tartanak. Szintén négy Setartalmú alegységbıl áll, azonban aminosavszekvenciája eltér a "klasszikus" GSH-Px-tıl (169). II. 9. 3. Hem-peroxidázok A hem-peroxidázok természetben széles körben elıforduló enzimek, amelyek a növényekben (pl. a tormában) jelennek meg különösen nagy mennyiségben (95). Az emlısökben elıforduló peroxidázok prosztetikus csoportja a hem (529). A laktoperoxidáz az emlı- és a nyálmirigyben fordul elı (351), hidrogéndonorjai a pirogallol, a guajakol, az aszkorbinsav és a benzidin (440), de a tirozint is képes jodinálni (42). A laktoperoxidázokhoz hasonló tulajdonságokkal rendelkeznek azok a peroxidázok, amelyek az eozinofil sejtekben (12) és a bél nyálkahártyában (466) találhatók. Sokféle peroxidázt izoláltak állati szövetekbıl, bár sokak szerint ezek nem olyanok, amelyek az adott helyen termelıdnek (thyreoid-peroxidáz és a mieloperoxidáz /MPO/ kivételével), hanem pl. az eosinophil granulocyták szállítják az adott szövethez (424). Mégis, egy bizonyítottan szöveti eredető enzim az ún. uterin-peroxidáz, amelynek fokozódik az aktivitása ösztrogén és luteinizáló hormon hatására (4). A thyreoid-peroxidáz szorosan kötıdik a szövethez (kísérletes körülmények között a pajzsmirigy szövethomogenizátumhoz), katalizálja a jód oxidációját a mirigyen belül és fontos feladatot lát el a thyreoid hormonok szintézisében (440). Az MPO a neutrophil granulocytákban található, két vas atomot tartalmaz egy-egy hemcsoportjában és reagálni képes a H2O2-vel és a cianidokkal is (3). Az MPO fenolokat, kinonokat, aszkorbinsavat stb. használ fel hidrogéndonorként. Legfıbb szerepe a fagocitózisban van (101). II. 9. 4. Tiol-transzferázok A fehérjék és a kis molekulatömegő tiolok tiol-diszulfid cserereakciói enzimatikusan és enzimatikus reakciók nélkül is létrejöhetnek (275) (535). Jól ismertek azok az enzimatikus reakciók, amelyek során a protein-diszulfidok kis molekulatömegő tiolok által történı redukciója zajlik (163), azonban kevésbé ismertek azok, amelyek során a protein-tiolok kis molekulatömegő diszulfidokkal történı reakciói zajlanak. Ezeket a folyamatokat nevezik S-tiolációnak (108) (190). Patkányok májából izolált tioltranszferáz katalizálja a reverzibilis tiol-diszulfid cserét a GSSG és a patkánymájból származó tiol-tartalmú fehérje között (311). A tiol-transzferázok képesek a fehérjék
21
között ill. fehérjéken belül a kevert diszulfidok képzıdését vagy bontását katalizálni. Ezek alapján ezek az enzimek szerepet játszanak a GSH/GSSG aránytól függı sejtfunkciókban (422). II. 9. 5. DT-diaforáz (EC: 1.6.99) A DT-diaforáz egy flavoprotein, amely általában kételektronos reduktázként mőködik, és számos szubsztráttal képes reagálni. Fontos szerepet játszik a redox-funkciót végzı kinonok detoxikációjában. A kinonok egyelektronos, a DT-diaforáz által katalizált redukciója esetén egy redox-ciklus indul be, melyben szemikinon-gyökök képzıdnek, ezek egyes esetekben a molekuláris oxigénnel képesek reakcióba lépni, miközben O2.képzıdik, és a kinon regenerálódik (489). A kinonok, az enzim által katalizált kételektronos redukciója esetén stabil hidrokinonok képzıdnek, amelyek könnyen konjugálódnak és excretálódnak, így a potenciálisan reaktív kinonok eltávoznak a rendszerbıl. Ezáltal a kinonok oxigéngyököket képzı egyelektronos redukciója megelızhetı (296). A DT-diaforáz redukáló kofaktorként mind a NADH + H+-t, mind NADPH + H+-t fel tudja használni, mőködését a dikumarol gátolja (142). Patkányok és egerek májában a DT-diaforáz a kinonok legfontosabb redukálója (395). Ismeretes, hogy nemcsak a kinonok, de más funkcionális csoportok, mint pl. az azo-, és a nitrocsoportok redukcióját is végezheti (142). Az emberek májában a kinonok redukálását elsısorban nem a DT-diaforáz, hanem a karbonil-reduktáz végzi (521). II. 9. 6. Citokrómoxidáz (citokróm-a3) (EC: 1.9.3.1) A sejtlégzésben szereplı enzimcsoport három fı katalitikus részbıl áll - citokróma, -c és -a3. A citokróm-a3 a sejtlégzés terminális oxidáza. Molekulatömege kb. 240.000 D, membránhoz kötött. Ezt az enzimet Warburg fedezte fel (509). A citokrómoxidáz az elektrontranszport során oxidált, az oxigén pedig redukált állapotba kerül. Az oxidációs folyamatban a citokróm-c és a citokróm-a is oxidálttá válik. Az oxido-redukciós folyamatban nagy szerep jut a vas- és fıként a rézionoknak (100). Az oxigén redukciója a citokrómoxidáz aktív helyén következik be és peroxid típusú vegyület képzıdik belıle (99), amely szorosan kapcsolódik a hemhez, amíg vízzé nem alakul át. Ezzel a szoros kötıdéssel megvédi a környezetét a peroxid káros hatásától egy "zsebet" képezve számára a felületén (4. ábra). Kis mennyiségő gyöktermék azonban kiszabadul a "zsebbıl" ezek a glutation rendszer által eliminálódnak (168). A reakciósor eredménye az oxidatív foszforiláció révén végül is az ATP szintézis. 4. ábra A citokrómoxidáz aktív helyén képzıdı ROI-k (101)
22
II. 9. 7. Kevert funkciójú oxidázok A kevert funkciójú oxidázok az állati szervezetek több enzimet magában foglaló csoportja. Számos oxido-redukciós reakcióban vesznek részt. Elsısorban a sejtek szubcelluláris struktúráiban fordulnak elı. Különbözı szervek (pl. a vese, a mellékvesekéreg), de fıképp a máj sejtjeinek mikroszómáiban, esetleg mitokondriumjaiban találhatók. A májsejtekben az endoplazmatikus reticulum membránjához (181), vagy az egyéb sejtek mitokondriumának membránjához kötötten fordulnak elı (101). A kevert funkció elnevezés azon alapul, hogy oxidáció és redukció szintén egyazon enzim funkciójaként jelentkezik attól függıen, hogy milyenek a szubsztrátok mennyiségi arányai, illetve hogy milyen az adott enzim környezetének energetikai állapota (258). A máj kevert funkciójú mikroszómális oxidázai a legfontosabb enzimek azok közül, amelyek a különbözı xenobiotikumok farmakológiai és toxikológiai hatásáért felelısek (258). A kevert funkciójú oxidázok egyik legjelentısebb képviselıje a citokróm-P450. A citokróm-P450-csoportba tartozó enzimek fı helye a máj, de kisebb mennyiségben megtalálhatók minden szövetben a vörösvérsejteken és a vázizomszöveten kívül. Monomer hemoproteinek és molekulatömegük 45000-60000 D. Ma már a biológiai rendszerekben mőködı több mint 100 izoenzim struktúrája ismert. Az emlısökben a sejtek membránjának belsı felületén találhatók, és hidrofóbok. A xenobiotikumokat metabolizálók az endoplazmatikus reticulumban, a szteroidhidroxilálók a mitokondriumok belsı felületén találhatók. A citokróm-P450 valójában hem tartalmú monooxigenáz rendszert foglal magában, amely elsıdlegesen a szteroid hidroxilációban, a gyógyszer ill. méreg detoxikációban és különbözı xenobiotikumok (az alifás és az aromás szénhidrogének) oxidatív degradációjában vállal szerepet (192). A kevert funkciójú oxidázok a xenobiotikumok bontásán kívül alapvetı részt vállalnak az arachidonsav metabolizmusában is (425). A citokróm-P450-rendszer a lipid hidroperoxidok oxidatív bontását is végzi, és alkoxi-, valamint peroxigyököket képez, amelyek további láncreakciókba képesek lépni, ugyanakkor H2O2-t és O2.--t is termel (249). Az enzimrendszer funkciója azon alapul, hogy a molekuláris oxigént redukálja. Ezután az oxigénatomokat különbözı szubsztrátokra (pl. xenobiotikumokra) köti. Ezáltal a hidrofób anyagokat hidrofillé változtatja. Egy reaktív csoportnak egy másik molekulára való illesztése azt is okozhatja, hogy ez a csoport stabil kovalens kötést létesíthet egy fehérjével, vagy nukleinsavval, ami toxikus, mutagén, esetleg karcinogén hatást is eredményezhet (414). Az citokróm-P450 enzimrendszer tagjai a monooxidázok, a reduktázok (elsısorban a NADPH-citokróm-P450-reduktáz /EC: 1.6.99.3/) és a membránfoszfolipidek is. Az oxidázok a molekuláris oxigén aktiválásához szükséges elektront a NADPH-citokrómP450-reduktáztól nyerik, amely egy flavoprotein, és szintén membránhoz kötötten fordul elı. A membránokban létrejövı, az oxidázok és a reduktázok közti elektroncsere nagymértékeben függ a membránfoszfolipidek állapotától is (414). Mind a citokrómP450, mind a NADPH-citokróm-P450-reduktáz indukálható fenobarbitállal (113). A korábban igazoltak alapján a patkányok májának mikroszómáiban a fenobarbitállal indukálható citokróm-b5, a kevert funkciójú oxidáz rendszer részeként, az említett reduktázhoz hasonlóan, szintén egy elektront juttat a NADH-ról a citokróm-
23
P450-re (280). Barros és Kaplan kimutatta, hogy a citokróm-b5 szolubilis, membránhoz kötött reduktáza, a NADH-citokróm-b5-reduktáz (EC 1.6.2.2), szintén indukálható fenobarbitállal (37). Kutatási eredmények alapján azt is bizonyították, hogy a máj endoplazmatikus membránjában fordított arány van a citokróm-P450-enzimrendszer aktivitása és az LP között (248). Ugyanakkor az is bizonyítást nyert, hogy nem maga az LP elsıdleges termékei pl. lipid-hidroperoxidok okozzák a citokróm-P450-rendszer degradációját, hanem a másodlagosan kialakuló peroxidácós termékek (pl. aldehidek) és más enzimatikus folyamatok vesznek részt (449). Az LP fokozódása révén növekszik az endogén foszfolipázok és proteázok aktivitása, ami a citokróm-P450-rendszer degradációját okozza (123). A citokróm-P450-rendszer mőködése függ: (1.) az izoenzimek genetikai meghatározottságától, (2.) az indukáló anyagok mennyiségétıl, (3.) az enzimek szubsztrátok indukálta intramolekuláris konformációs változásaitól, (4.) az intermolekuláris citokróm-P450-oxidáz/reduktáz interakciótól, és ennek modulációjától a foszfolipidek révén, (5.) a mőködésük közben megjelenı ROI-k hatására fokozatosan romló szubsztrát-oxidációtól (414). II. 9. 8. Szuperoxid-dizmutáz (SOD) (EC:1.15.1.1) A SOD a szuperoxidanion-gyököt (O2.-) dizmutáló enzim, amely pl. a kataláztól eltérıen igen változatos formákban jelenik meg (166). A vastartalmú (FeSOD) (159) és a mangántartalmú enzim (MnSOD) (76) jellemzı a prokaryotákra és aminosav szekvenciájuk is hasonló. A Gram pozitív baktériumokban inkább csak MnSOD található, míg a Gram negatívokban mindkét típus jelen van (76). Az eukaryotákban fıképp réz- és cinktartalmú SOD (CuZnSOD) fordul elı (330), bár MnSOD is elıfordul bennük (518). Aminosavstruktúrájuk azonban nem hasonlít a prokaryoták SOD-jaira (165). Az enzimet régen ismerik, "cuprein"-nek nevezték el, mert az emlıs állatok SODenzimjének prosztetikus csoportja a réz (cuprum). A vvs-ben elıforduló SOD-ot régen "haemocuprein"-nek, vagy "erythrocuprein"-nek nevezték, a májban lévıt "hepatocuprein"-nek, az agyi eredetőt "cerebrocuprein" néven illették (453). Enzimatikus aktivitására csak 1969-ben McCord és Fridovich munkássága révén derült fény (330). Az enzim nagy mennyiségben található a vvs-ekben és a mitokondriális belsımembrán által határolt térben. Az élesztıben (408), egyes növényekben (43), a baromfi, a patkány májában és a sertés szívében cianidra nem érzékeny MnSOD található a mitokondriális mátrixon belül és cianidérzékeny CuZnSOD a citoszolban (518). Ez a megoszlás általánosan jellemzı az eukaryotákban. Az eukaryoták MnSOD-ja 80.000 D molekulatömegő és négy alegységbıl áll. A prokaryoták MnSOD-jai azonban csak 33.000 D nagyságúak. Az eukaryoták CuZnSOD-ja 16.000 D, két nem kovalens úton kötıdı alegységbıl áll, aktív centrumában a Cu2+ található. Az enzim mőködése során dizmutáció történik. Ennek a kémiai reakciónak az a lényege, hogy a katalízisben részt vevı enzim, ill. annak aktív centruma a reakció közben ciklikusan redukálódik és oxidálódik (101).
24
Az enzim egyik prosztetikus csoportján a rézen a reakció során redukciós és oxidációs lépések követik egymást (151): E-Cu2+ + O2.⇒ E-Cu+ + O2 + .+ E-Cu + O2 + 2H ⇒ E-Cu2+ + H2O2 E-Cu2+ + O2.⇒ E-Cu-O2.E-Cu-O2.- O2 + 2H+ ⇒ E-Cu2+ + H2O2 + O2 Ugyanez a reakció zajlik le az FeSOD és az MnSOD hatására is, de ott a vas és a mangán az oxidoredukciós folyamatokban részt vevı prosztetikus csoportok. Az elsı O2.- hatására a Cu-ion redukálódik, míg a második hatására pedig oxidálódik. A CuZnSOD aktivitása H2O2-vel gátolható (71). Ez az inaktiváció a H2O2 hatására képzıdı OH.-nak tudható be, ami az enzim aktív centrumán lévı Cu2+-val reagál (327). A SOD-aktivitás azokon az intracelluláris helyeken mutatható ki, amelyeken a O2.-képzıdése jelentkezik. Kimutatták, hogy a SOD-aktivitás a citoszolban nagyobb, a mitokondriumokban a SOD-aktivitásnak kb. 15-20%-a van jelen (376). A mitokondriumon belül, a mátrixban a SOD, mintegy fele mutatható ki, a másik fele pedig a mitokondriális belsı és külsı membránon található. A peroxiszómák nem mutattak SOD-aktivitást (385). Novák és mtsai. vizsgálatokat végeztek a SOD mőködésének genetikai kontrollja kapcsán, és igazolták, hogy a cianid-érzékeny CuZnSOD aktivitásának mértéke (így feltételezhetıen a szintézise) egy, az MHC-hez (major histocompatibility complex) kapcsolódó génhez kötött (366). A keringı vvs-ek Hb-jának közel 3%-a oxidálódik naponta. A redukciót a methemoglobin-reduktáz végzi, ez a ciklus azonban folyamatosan termeli az O2.--ot (346). A termelıdı O2.- képes tovább oxidálni az oxiHb-t metHb-ná, sıt peroxidokkal való reakciója által kifejezetten toxikus OH. is képzıdhet (487). Ezért a vörösvérsejtek mőködésében az O2.--t átalakító SOD-nak a védı szerepe nagy jelentıségő (104). Egyes szerzık külön tesznek említést egy extracellulárisan elhelyezkedı ún. ECSOD-ról, ami egy tetramer glükoprotein. Nagysága alegységenként 30.000 D. Egy-egy alegysége egy Cu- és egy Zn-atomot tartalmaz, de aminosav-szekvenciája nem hasonlít a CuZnSOD-ra. Az EC-SOD a legfıbb extracelluláris SOD izoenzim, de egyes szövetekben is megtalálható (314) (315). II. 9. 9. Glutation-reduktáz (EC:1.6.4.2) Az enzim redukált formájának szerepe a GSSG redukálása GSH-vá, NADPH, mint H-donor jelenlétében (54). Az emberi vörösvérsejtek glutation-reduktáza két alegységbıl álló dimer, amelyben egy alegység 148 aminosavat és egy flavin-adenin-dinukleotidot (FAD) tartalmaz, mint prosztetikus csoportot (254). A glutation-reduktáz mőködését döntıen a NADPH- és a GSSG-koncentráció határozza meg. Ha a NADPH intracelluláris koncentrációja eléri a kritikus értéket és GSSG sincs jelen, akkor az enzim inaktiválódik, ugyanakkor az aktív glutation-reduktáz hiányában megnövekszik a GSSG koncentrációja, és ez az enzim reaktivációját idézi elı (299).
25
II. 9. 10. Repair-enzimek A repair-enzimek csoportjába tartoznak azok a katalitikus hatású proteinek, amelyek az oxidatív károsodást szenvedett nukleinsavakat regenerálják. Az aerob biológiai rendszerekben a sejtek örökítıanyagainak, így a DNS- és az RNS-láncok oxidatív károsodása általánosan elıfordul. Példaként említhetı a hidroxil-gyökök DNS-ekkel létrejövı reakciói, amelynek során a DNS-láncok megszakadhatnak (78), valamint a DNS-láncok és a fehérjék között keresztkötések alakulhatnak ki (144). A timin, a timidin-glikol (92), az 5-hidroximetil-uracil (482) és a 8-hidroxi-guanozin (155) fokozott képzıdése jelzi a DNS-károsodást. Az enzimatikus rendszerek közül nagy jelentıségőek a glükozilázok, az endo- és exonukleázok, valamint a ligázok (297). A DNS-láncokhoz kötıdı oxidatív úton károsodott fehérjék detoxikációja létrejöhet a tiol/diszulfid csere révén. A súlyos károsodást szenvedett fehérjék intracelluláris szelektív proteolízise is bekövetkezhet (124). II. 10. Az LP elleni celluláris védekezés egyéb tényezıi II. 10. 1. A glutation-rendszer A redukált glutation (GSH) és a glutation diszulfid (oxidált glutation - GSSG) jelenlétének nagy jelentısége van a sejtek anyagcseréjében. Maga a GSH vízoldékony, tripeptid struktúrájú, γ-glutamil-ciszteinglicin, amely a citoszolban található 1-10 mmol mennyiségben. Legfıbb funkciója a H2O2-re és a lipidperoxidokra kifejtett redukáló hatása, bár a nem enzimatikus antioxidáns reakciói is ismertek (275): O2.- + H+ +GSH ⇒ GS. + H2O2 .OH + GSH ⇒ GS. + H2O 1O + GSH ⇒ GSox (cisztein-sav) 2 A tiil-gyök (GS.) viszonylag stabil és nem okoz további károsodást. Gyakran összekapcsolódik egy másik tiil-gyökkel, azonban reagálni képes a C-vitaminal, a NAD(P)H-val vagy a citokróm-c-vel is (160). A GSSG redukciója a NADPH-függı glutation-reduktáz révén jöhet létre. A NADPH-t a hexóz-monofoszfát-shunt szolgáltatja: glükóz-6-foszfát + NADP+ ⇒ NADPH + 6-foszfoglukonát (ezt a reakciót a glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz katalizálja), NADPH + GSSG ⇒ 2GSH + NADP+ (ezt a reakciót a glutation-reduktáz katalizálja). Több kutatócsoport igazolta, hogy a celluláris szulfhidril (SH-) csoportok egyharmada kevert diszulfidokként van jelen (212) (350). Ilyenek a koenzim-A (CoA), cisztein, hemoglobin, albumin, a szemlencse fehérjéi stb. (50) (465). A kevert diszulfidok redukciójának katalízise több úton zajlik. Direkt módon a NADPH jelenlétében a glutation-reduktáz vagy a CoA-SSG-reduktáz hatására, indirekt módon egyéb tiol-transzferázok révén megy végbe a folyamat. Ez utóbbi a GSH jelenlétében zajlik. A reakció során GSSG képzıdik, amibıl a GSH ismét regenerálódik a NADPHfüggı glutation-redultáz által (403). Egyes glutation-transzferázok képesek az oxidált sejtkomponensek védelmére az alábbi reakció révén:
26
RSSR + 2GSH ⇒ 2RSH + GSSG (R= fehérje). A redukált glutation oxidációjának mértékét a H2O2 és a hidroperoxidok GSH-Px általi redukciója befolyásolja. A GSSG-szint pedig a NADPH-függı glutation-reduktáz aktivitásától függ. A hidroperoxidok redukcióját befolyásolja a NADPH-oxidáció a transzhidrogenáz reakciósor útján, amely viszont a mitokondriális redox-rendszerrel van kapcsolatban (455). A NADPH-képzı reakciók a pentóz-foszfát-ciklus, az izocitrátdehidrogenáz és a malát-enzim mőködése révén jönnek létre, ezek más NADPH-t igénylı reakciókat is befolyásolhatnak, mint pl. a lipogenezis, a monooxigenáz-reakciók stb. Ezek alapján látható, hogy milyen sok biokémiai részfolyamatot befolyásol a tiolok redox-státusza, azonban nagyobb biológiai "események" is összefüggenek a tiolokkal, ilyen pl. a sejtosztódás (36), a fehérjeszintézis (272), a hormonelválasztás (215), a neurotranszmitterek felszabadulása és a memória kialakulása (272) is. Azt is megfigyelték, hogy az inzulin kötıdése a sejtfelületi receptorhoz elıidézi egyes specifikus szulfhidril csoportok oxidációját a membránon, befolyásolva a zsírsejtek hexóz-transzportját (120). A GSH/GSSG arány az egészséges emlıssejtekben magas (275), perfundált patkánymájban az arány: 300:1, bár a többi szerv sejtjeiben kisebb arányról számoltak be (72) (535). II. 10. 2. Nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (NADP) Nagyobb hidroperoxid-koncentráció hatására a NADPH nagy része oxidálódik, és koncentrációja minimálisra süllyed. Az eredeti koncentráció helyreállásához a glükózigényes redukcióra van szükség, igazolva a pentóz-foszfát reakciósor szükségességét a folyamatban (455). A NADPH képzıdése akkor akadályozott, ha a hexóz-monofoszfát-shunt bármely tagja hiányosan mőködik. Ennek leggyakoribb formája a glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz hiánya (53). A glutation-rendszer és a hexóz-monofoszfát shunt kapcsolata az 5. ábrán látható. 5. ábra A glutation-rendszer és a hexóz-monofoszfát shunt kapcsolata Chance és mtsa. (101), valamint Ross és mtsa. (422) alapján
rövidítések: G6PD: glukóz-6-foszfát-dehidrogenáz; G6P: glukóz-6-foszfát; oxidált-6PG: oxidált 6foszfoglukonát; GSH: (redukált) glutation; GSSG: glutation-diszulfid (oxidált glutation); GSH-Px: glutation peroxidáz; GSSG-red: glutation-reduktáz; ROOH: lipid-hidroperoxid; ROH: hidroxi-lipid
27
II. 11. Az antioxidáns szubsztrátok Az antioxidánsok azok a vegyületek, amelyek az ROI-k hatásaitól védenek. Az LP különbözı fázisaiban hatnak: 1. iniciáció gátlása: pl. E vitamin 2. hidroperoxidok keletkezésének gátlása (láncmegszakító antioxidánsok): E és C vitamin 3. hidroperoxidok elbontása olyan módon, hogy nem keletkeznek újabb gyöktermékek: GSH, tiolok 4. fémkatalízis gátlása: D-penicillinamin, deferoxamin 5. szabadgyök-termékek megkötése (scavenger aktivitás): E- és A-vitamin (30) (225). II. 11. 1. Fıbb természetes antioxidáns szubsztrátok:
II. 11. 1. 1. E-vitamin Az α-tokoferol (α-TH) lipidoldékony antioxidáns, hatását döntıen a sejtmembránon ill. a sejtmembránban fejti ki azáltal, hogy a hidroperoxidoknak hidrogént ad le. Itt említhetı meg, hogy az E-vitamin vérplazmából a sejtekbe és sejtmembránokba történı transzportjában az inzulin is szerepet játszik (174). Az E-vitaminnak az O2.--t redukáló hatása is ismert. Fitil-oldallánca az antioxidáns hatású kromán-győrőt azzal segíti, hogy beilleszkedik a membrán hidrofób részébe (225). Az E-vitamin a legfıbb antioxidáns a biológiai membránok védelmében, mert az E-vitamin majdnem az egyetlen ún. lánctörı antioxidáns a membránokban, továbbá az E-vitamin a membránok "antioxidációjának" központja, amelynek funkciója kapcsolatban van a lipidoldékony ubikinonnal, a hidrofil C-vitaminnal, a glutationnal stb. is (249). Feltételezik, hogy az E-vitaminnak a C-vitaminnal zajló reakciójában az E-vitamin elveszít egy H-atomot, amelynek során oxidált E-vitamin, vagy α-tokoferil-gyök alakul ki. Az elvesztett H-t a C-vitamin pótolja. Ezt azáltal igazolták, hogy a metil-linolsav autoxidációjnak E- és C-vitaminnal történı gátlását vizsgálták az idı függvényében. A vizsgált vegyület autooxidációja sokkal hosszabb ideig bizonyult gátoltnak E- és Cvitamin együttes adásával, mint a külön-külön adott antioxidánsok hatására. Ugyanakkor az együttes adás során a gátlás teljes hossza alatt annak mértéke azonos volt azzal, mint amikor az E-vitamint egyedül adagolták a rendszerhez, de nagyobb volt a C-vitamin egyedüli hatásához képest (358). Tekintve, hogy az E-vitamin az instabil PUFA-kat védi a gyökképzıdéstıl, vizsgálatokat végeztek arra irányulóan, hogy miként befolyásolja a PUFA-bevitel az Evitamin igényt. Ez alapján bizonyítást nyert, hogy növekvı PUFA-bevitel hatására az Evitamin-szükséglet is növekszik, ugyanis a szervezet érzékenyebbé válik az oxidatív gyökhatásokra. Matematikai vizsgálatok szerint, ha a takarmány 1%-át PUFA teszi ki, akkor 30 mg E-vitamin / testtömeg kilogramm (ttkg) adása szükséges (517).
28
A vörösvérsejtek E-vitaminja jelentıs szerepet tölt be a sejt védekezésében. Tappel vizsgálatai szerint mőködése a következıkben foglalható össze (481): ROO. + αTH ⇒ ROOH + αT. ROO. + αT. ⇒ ROOH + αTQ rövidítések: ROO.: lipid-peroxigyök, αTH: E-vitamin, ROOH: lipid-hidroperoxid, αT.: oxidált Evitamin, αTQ: tokoferol-kinon A fenti esetben az E-vitamin H-atomot ad le a peroxi-szabadgyöknek hidroperoxidot hozva létre. A hidroperoxid azután a GSH-Px segítségével képes detoxikálódni. Az Evitamin képes reagálni az O2.--vel és az 1O2-vel is (188). Az E-vitamin szállításában a plazmaproteinek vesznek részt. Koncentrációja függ a plazma lipoprotein-koncentrációjától és a lipoprotein-partikulum E-vitaminnal való telítıdésének mértékétıl. Az elıbbi a táplálék összetételétıl, az utóbbi pedig a vitaminbeviteltıl függ. Szarvasmarhákban a lipoprotein-frakciókban a koleszterin és az E-vitamin azonos hányadban található. A lipoprotein koncentráció tehát az E-vitamin koncentrációját is alapvetıen befolyásolja. A lipoprotein-frakciók között az E-vitamin szempontjából a HDL a legfontosabb, mert 80%-a ebben a frakcióban fordul elı (216). Lucy feltételezi, hogy az E-vitamin scavenger aktivitásán kívül membrán-szerkezetalkotó tulajdonsággal is rendelkezik, in vivo stabilizálja a foszfolipideket és modulálja azok struktúráját valamint a membránok permeabilitását (307). Valószínőleg nem antioxidáns hatásának tudható be az is, hogy oxidatív hatásoknak kitett patkány aortából származó preparátum norepinefrin okozta kontrakciójának acetilkolin által indukált relaxációja az E-vitamin hatására jelentısen javult, ugyanakkor a szerzık semmilyen antioxidáns hatást nem tudtak kimutatni (193). Fontos szerepet játszik az arachidonsav metabolizmusában, így a tromboxán, a leukotrién, a prosztaglandin és a prosztaciklin képzıdésében is. Szerepet játszik a DNSszintézisben valamint az immunitásban (401). Az utóbbit bizonyítja az is, hogy a Thelper sejteket E-vitaminnal stimulálni lehetett (478). II. 11. 1. 2. C-vitamin (aszkorbinsav /AH2) Az aszkorbinsav, az α-gulonsav laktonja, vízoldékony antioxidáns hatású vegyület. Erıs redukálószer, hidrogénatomjait könnyen leadja. Élettani pH-n döntıen aszkorbátion (AH-) formájában fordul elı. Az aszkorbinsav kételektronos redukálószer és oxidált formája stabil egyelektronos forma, ez a mono(de)hidro-aszkorbát-gyök (AH.). A mono(de)hidro-aszkorbát-gyök akkor képzıdik, amikor az aszkorbát-ion reakcióba lép egy szabadgyökkel (R.): AH- + R. ⇒ AH. + RA mono(de)hidro-aszkorbát-gyök egy másik szabadgyökkel is képes reakcióba lépni, ekkor dehidroaszkorbinsav (A) keletkezik: AH. + R. ⇒ A + R- + H+ Elıfordulhat, hogy az AH. egy másik AH.-val lép reakcióba, ekkor is dehidroaszkorbinsav (A) keletkezik (56): AH. + AH. ⇒ AH- + A + H+ Som és mtsai. szerint a dehidro-aszkorbinsavat a GSH redukálhatja aszkorbinsavvá (462). Nem hagyható figyelmen kívül, hogy a mono(de)hidro-aszkorbát-gyök Cvitaminná (aszkorbinsavvá) való regenerációja még sejten belül is végbemehet. A
29
redukciót, a NADH oxidációja mellett, a mitokondrium külsı membránján lévı citokróm-b5-szerő hemfehérje katalizálja. Ezt az enzimet más néven monodehidroaszkorbát-reduktáznak is nevezik (233). A C-vitamin reakcióba léphet a peroxi-gyökökkel, az O2.--vel (362) és az OH.-val is (150). Ezekkel reagálva dehidro-aszkorbát (A) és AH. keletkezik. AH- + O2.- + 2H+ ⇒ AH. + H2O2 AH. + O2.- + H+ ⇒ A + H2O2 AH- + OH. ⇒ AH. + OH. . AH + OH ⇒ A + H2 O Számos szabadgyökkel, így a szinglet oxigénnel folytatott reakciója is ismert (105). Egyes vizsgálatok alapján igazolták, hogy az oxidatív károsodást szenvedett fehérjék kémiai reparációjában is részt vesz, minthogy az oxidált triptofánnal és tirozinnal is reagál (223). Ahogy már említésre került, a C-vitaminnak szerepe van az E-vitamin regenerációjában is (373)(6. ábra). 6. ábra Az E-vitamin regenerációs mechanizmusa AH. NADH αTH
NAD
αT.
AH2 rövidítések: αTH: E-vitamin; αT.: oxidált E-vitamin; AH.: monohidro-aszkorbát-gyök; AH2: aszkorbinsav A C-vitamin nagy koncentrációban fordul elı a patkányok (502), valamint a csirkeembriók és a csirkék agyszövetében (473), ahol az egyik legfontosabb antioxidáns hatású szubsztrátként tartjuk számon, ugyanis az agyszövetben más antioxidáns, pl. az Evitamin, alig mutatható ki (172). Nem hagyható figyelmen kívül a C-vitamin prooxidáns, sıt genotoxikus hatása sem (452). Az aszkorbinsav a Fenton-reakcióban is részt vesz azáltal, hogy redukálni képes a makromolekulákhoz kötött átmeneti fémionokat. Ha a rendszerben az aszkorbinsav kis koncentrációban van, akkor a jelenlevı átmeneti fémek (vas, réz) redukcióját végezheti, elısegítve ezzel a fémkatalízist. Ha a sejteken belül nagyobb koncentrációban van jelen akkor egyes fémionok megkötése révén az antioxidáns hatása lép elıtérbe (225). Amint a redukált fémionokat a H2O2 reoxidálja, az egyik legtoxikusabb gyök, az OH.- képzıdik (432). A genotoxicitást a C-vitamin xantin-oxidázt potenciáló hatása révén képzıdött O2.- okozza (520).
30
II. 11. 1. 3. Glutation (redukált glutation - GSH) A GSH védıhatását elsısorban a már említett glutation-rendszerben való részvételével fejti ki. A vörösvérsejtek is képesek elıállítani, a következı lépések során (438): γ-glutamilcisztein-szintetáz glutaminsav + cisztein + ATP
⇒
γ-glutamilcisztein + ADP + P~
glutation-szintetáz γ-glutamilcisztein + glicin + ATP ⇒
GSH + ADP + P~
A glutation szerepet játszik a közvetlen antioxidáns védekezésben azáltal, hogy reagálni képes a hidroxil- és a szuperoxid-gyökökkel (421). A glutation és a reaktív gyökök reakciója révén glutationil-gyök (GS.) képzıdik (275). Az is igazolást nyert, hogy a glutation egy hidrogénatom transzferáló rendszeren keresztül az E-vitamin analóg, Trolox C-bıl képzıdött fenoxil-gyökbıl az eredeti molekulát képes visszaalakítani. Hasonló hatású az aszkorbinsav is (125). Ezzel bizonyítást nyert, hogy nemcsak a C-vitamin, de a glutation is részt vehet az E-vitamin regenerációjában, miáltal hatékonyabbá válik a gyökök elleni védekezés. Ez a tény további adatokkal gazdagodott, amikor igazolták, hogy a GSH az E-vitamin-hiányos mikroszómákban képes volt a Cvitaminnak a fémek redukciója révén bekövetkezı prooxidáns hatását is kivédeni (516). II. 11. 1. 4. A-vitamin és karotin Lipidoldékony antioxidánsok, bár antioxidáns hatással egyértelmően a β-karotin rendelkezik, az A-vitaminról ugyanez indirekt vizsgálatok alapján feltételezhetı. Hatásuk részben a telítetlen kettıskötésekkel rendelkezı izoprén oldalláncukkal, részben a βjonon győrőjükkel lehet összefüggésben (501). A telítetlen kettıs-kötések által redukáló tulajdonságuk is van (460). A ß-karotin nem konvencionális antioxidáns, ugyanis gyökfogó funkcióját 150 Hgmm alatti oxigénnyomáson fejti ki, nagyobb oxigénnyomáson autokatalitikus prooxidánsként viselkedik (83). Antioxidáns hatása elsısorban a szingletoxigén hatástalanítása révén nyilvánul meg (106). Kísérleti adatok bizonyítják, hogy patkányokban az A-vitamin-bevitel növelésével csökken májszövetük LP-s hatásokra jelentkezı érzékenysége (491). Az A-vitamin-hiányos patkányok májában az E-vitamin koncentráció növekedését tapasztalták, ugyanakkor a májszövet LP-ra való érzékenysége nem változott (386). Az A-vitamin-hiány során létrejövı E-vitaminkoncentráció növekedés a szervezet májat érintı védelmének kompenzációs hatásaként értelmezhetı, ugyanis az oxidatív hatásoknak nagymértékben kitett máj antioxidáns védelme létfontosságú (106). Vásárhelyi és mtsai. (501) részletes összefoglalást adnak az A-vitamin és a retinoidok hatásairól és hatásmechanizmusáról, kiemelve azt a tényt, hogy ezek a derivátumok a sejtek magreceptoraihoz kötıdve befolyásolják egyes specifikus gének expresszióját.
31
II. 11. 1. 5. Egyéb természetes antioxidáns szubsztrátok K-vitamin A K-vitamin elektrondonor antioxidáns hatása kinonstruktúrája révén jön létre (149). Ubikinon Az ubikinon (koenzim-Q) a mitokondriális légzési lánc tagja, szerkezete, bizonyos szempontból, az E- és a K-vitaminokhoz hasonló, így antioxidáns hatása is ezekével megegyezı (149). Tiolok A tiolok hatására az SH-csoportból a H+ leszakad és "tiil"-gyök képzıdik, amely azután diszulfid kötéssé alakul. Fı tagja a már több ízben említett GSH (136). Glükóz A glükóz élettani koncentrációban (3,3-5,5 mmol/l) gyenge OH.--scavenger hatású, ugyanis gátolja a xantin-oxidáz és xantin által indukált benzoesav oxidációját. A benzoesav oxidációját a zimozánnal stimulált granulocytákban, és az arachidonsavval stimulált thrombocytákban (426) is gátolja. A hypergylcaemia ugyanakkor gyökképzı hatású (525). Cöruloplazmin A cöruloplazmin egy α2-glükoprotein, az extracelluláris tér egyik fı antioxidánsa, az emlısök plazmájában koncentrációja mintegy 3 mg/ml. Rézmegkötı kelát, a plazmabeli réz gyakorlatilag általa kötött formában van jelen, így fıként a réztranszportban van szerepe. A ferrovasat (Fe2+) ferrivassá (Fe3+) alakítja (másik neve: ferroxidáz), ezáltal a fémkatalízist (Fenton-reakciót), tehát az OH.- képzıdését gátolja (195) ezen kívül direkt O2.--scavenger hatását is feltételezik (136). A rézmegkötés fontos lehet a sejtek DNS-ének védelmében is, ugyanis igazolást nyert, hogy a rézsók H2O2 jelenlétében károsítják a DNS-láncokat a poliguanozin szekvenciáknál (427). Transzferrin és ferritin A transzferrinek vaskötı glükoproteinek. Három fı típusuk van: szérumtranszferrin, vagy a sziderofillin, a laktotranszferrin és az ovotranszferrin (5). Ezeknek a fehérjéknek két vasion- és egy anionkötı régiójuk van. Az anion-kötı régió bikarbonát-, vagy karbonátionnal kötött (41). Élettani állapotban a vérplazmában a transzferrin csak kb. 30%-ban kötött vassal, így a szabad-vasionok plazmabeli koncentrációja igen alacsony.
32
A ferritinben a bioszintézishez aktuálisan nem szükséges vasionok tárolódnak vas(Fe3+)hidroxi-foszfát formájában (247). A vas ferritinbıl történı mobilizálódása redukálóanyagok segítségével történik, amely során ferrovas (Fe2+) képzıdik, majd azt kelátok szállítják tovább (5). Igazolást nyert, hogy a szuperoxid és a bipiridilum-eredető herbicidekbıl (paraquat) képzıdı gyökök képesek elısegíteni a vasionok ferritinbıl történı felszabadulását, így elısegíteni azok részvételét a Fenton-reakcióban (486) (485). Húgysav A húgysav a purin-metabolizmus végterméke, plazma scavenger, amely képes megkötni a peroxigyököket (515), ugyanakkor a máj peroxiszómáinak egyik legjelentısebb szubsztrátja, amely az urát-oxidáz hatására H2O2 képzıdése közben lebomlik (67). A húgysavnak 1O2-fogó képessége van (83). A vérben tehát, a szinglet oxigénnel és a hidroxil-gyökökkel való interakciója révén, a vörösvérsejtek peroxidatív károsodásától és következményes lízisétıl való védelmét biztosítja (7). A húgysavnak fontos szerep juthat a C-vitamin vérplazmában való védelmében is (451). A húgysav a vérplazmán kívül a nyálban és a liquorban is kimutatható. A nyálban a plazmabeli koncentráció fele, a liquorban annak 1/10-e található. A húgysav ezekben a testfolyadékokban részt vehet a gyökfogó mechanizmusban. Valószínő, hogy a húgysavnak fontos szerep jut a gastrointestinalis traktus védelmében is, hiszen ebben a szövetben is nagy koncentrációban van jelen (7). A húgysav alacsony koncentrációban hatékony antioxidánsként viselkedik a DNS-láncokat károsító oxigén eredető szabadgyök-reakciók gátlása révén (107). Ugyanakkor ezt a képességét más szerzık nem tudták bizonyítani (276). Taurin A taurin a cisztein oxidatív bomlása során képzıdött végtermék, aminek membránprotektív és antioxidáns hatást tulajdonítanak (526). Bilirubin A bilirubin (Br), a hemoproteinekbıl származó protohem degradációs termléke. Nagyobb koncentrációban toxikus, míg metabolizmusának prekurzora a biliverdin peroxil-gyökfogóként viselkedik (468). Hatékony peroxil-gyökfogóként és "lánctörı" antioxidánsként is viselkedik in vitro: LOO. + Br ⇒ LOOH + Br. vagy LOO. + Br. ⇒ Br-LOOH Br. + O2 ⇔ Br-OO. (Br. = Br-gyök) Ha a levegıben az oxigén térfogatszázaléka 20-ról - 2%-ra csökken a harmadik reakció fordított irányú. Az alacsony oxigénnyomás a Br. képzıdésének kedvez. A vérben a bilirubin antioxidáns hatása élettani oxigéntenzióban nagyobb, mint a levegıben. Egy liposzóma-modellben igazolást nyert, hogy élettani oxigénnyomáson a bilirubin hatékonyabb antioxidánsnak bizonyult, mint maga az α-tokoferol. Azonban azt is igazolták, hogy a bilirubin és oxidált formája, a biliverdin, az E-vitaminnal együtt szinergista módon védi a a sejteket a lipidperoxidációtól (468).
33
Wayner és mtsai. azt találták, hogy a plazma összes antioxidáns kapacitásának 3536%-át a húgysav, 0-24%-át a C vitamin, 5-10%-át az E vitamin és 10-50%-át a különbözı plazmaproteinek adják (515). Piroszılısav és az α-ketosavak A piruvátnak és más α-ketosavaknak a H2O2-vel intracellulárisan zajló reakcióikban jelentkezik az antioxidáns hatásuk (8). Az α-ketosavak oxidatív dekarboxilációjával egyidejőleg a H2O2 lebomlik (81). L-Karnozin (ß-alanil-L-hisztidin) Ez a vegyület az 1O2-nek hatékony gyökfogója (121). Aminosavak A hisztidin, a triptofán és a metionin hatékony 1O2-fogóként ismert (121) (318), ugyanakkor a hisztidinnek .OH-fogó képességét is ismerik (70). II. 11. 2. Mesterséges antioxidáns szubsztrátok Egyes szintetikus antioxidánsok az LP minden fázisában hatnak, ilyenek pl. a butilhidroxi-anizol (BHA), butil-hidroxi-toluol (BHT), etoxi-metil-kinolin (EMQ) stb. (30). Mások az LP-s folyamatok egyes specifikus lépését gátolják: pl. a deferoxamin és az allopurinol. Számos egyéb antioxidáns szubsztrát ismert, amelyeket itt nem részletezek. II. 11. 2. 1. A butil-hidroxi-anizol (BHA), a butil-hidroxi-toluol (BHT) és az ethoxiquin (EMQ) A szintetikus antioxidánsok a takarmányok, a táplálékok, az ételek, a gyógyszerek fontos konzerváló anyagai, de a kozmetikumokban, a gumiban és a mőanyagokban is elıfordulnak. A forgalomban lévı szintetikus antioxidánsok közül a butil-hidroxi-anizol (BHA), és a butil-hidroxi-toluol (BHT) kb. 75%-ban képviseltetik magukat. A BHT és a BHA egyszerő fenolvegyületek, amelyeken szterikusan eltérı helyeken, könnyen leadható hidrogéncsoportok helyezıdnek (19). Az EMQ egy kinolon-derivátum, és elektrondonorként viselkedik. Elsısorban a takarmányok tartósítására alkalmazzák (457). II. 11. 2. 2. A deferoxamin Az egyik leghatékonyabbnak bizonyuló antioxidáns - a vasat kelát formájában kötni -képes deferoxamin. A készítmény az antioxidáns védekezésben a vas-katalizálta Fentonreakciót, így a HO.--képzıdését gátolja. Számos vizsgálat szerint igen hatékonynak bizonyul a hypoxia-reperfusio okozta károsodások kivédésében (285).
34
II. 11. 2. 3. Az allopurinol Az allopurinol hatását a szabadgyökös folyamatokra számos vizsgálat igazolja. Az allopurinol (1H,5H-pirazolo(3,4-d)pirimidin-4-on), összegképlete: C5H4N4O, kémiai szerkezete: O C CH HN HC
C C
N NH
N Minthogy szerkezete hasonló a purinvázéhoz, annak analógjaként a purinvázas vegyületek lebontásában részt vevı xantin-oxidáz mőködését kompetitív úton gátolja. Ezúton csökkenti a termelıdı húgysav mennyiségét (anti-urikémiás hatású). Csökkenti a vizelet húgysav szintjét, elısegíti a húgysavlerakódások oldódását különbözı betegségekben elıforduló szekunder hiperurikémiában (polycythaemia vera, myeloid metaplasia, húgysav-nephropathia) is. A humán gyógyászatban köszvény kezelésére, köszvényes rohamok megelızésére, sugár-, vagy kemoterápia okozta húgysavszintnövekedés (leukémiában, daganatos betegségekben) és nephrolythiasis (húgysavkı) megelızésére használják (1). Az allopurinol a szabadgyökök képzıdését is gátolja azáltal, hogy megelızi azt a folyamatot, amikor az enzim "O"-formájának mőködése során a xantin és a hipoxantin átalakításakor O2.- keletkezik. Mivel a xantin-oxidáz mőködése nagy szerepet játszik a hypoxiát követı reperfusio hatására kialakuló szabadgyökös károsodásokban, az allopurinol e folyamatokra jótékony hatással van (189). II. 12. A szervezet élettani szabadgyökös reakciói II. 12. 1. Alkohol-oxidáció Az alkohol elsı metabolitját, az acetaldehidet nemcsak az acetaldehid-dehidrogenáz metabolizálja (bár ez a legfontosabb enzimatikus út), hanem a xantin-oxidáz is. Az egészséges sejtekben a xantin-oxidáz a NAD+-ot redukálja, és nem oxidázként viselkedik. Egyes károsító hatások révén kialakuló ischaemia és proteolízis megváltoztatja az enzim kinetikus tulajdonságát és oxidázként viselkedik. Ilyen esetekben a hipoxantin helyett az acetaldehidet oxidálja ecetsavvá miközben O2.képzıdik a reakcióban szintén részt vevı molekuláris oxigénbıl. Ezt a hipotézist patkányokon azáltal bizonyították, hogy tolbutamiddal gátolták az aldehiddehidrogenázt, és azt tapasztalták, hogy alkohol hatására jelentısen csökkent a sejthomogenizátumok GSH koncentrációja, ugyanakkor a xantin-oxidázt gátló allopurinolnak fordított hatása igazolódott (367). Az alkohol metabolizmusa során létrejövı LP-fokozódásra további elméletek születtek, amelyek feltételezik az alkoholnak
35
a máj mikroszómális enzimrendszerén keresztül történı átalakítását. Ez szintén jelentıs forrása az ROI-k képzıdésének (377). Nem hagyható figyelmen kívül az a tény sem, hogy az acetaldehid maga is képes kötıdni egyes molekulák SH-csoportjaihoz, amelyek a GSH képzıdésének elıanyagait jelenthetnék, ez a folyamat is közrejátszhat az alkohol hatására jelentkezı GSH-csökkenésnek (178). Az alkohol további metabolikus útja a kataláz enzim révén létrejövı etanol oxidáció, amelyet a CAT viszonylag kis mennyiségő NADH-képzés mellett végez a májsejtek citoplazmájában (484). A kataláz alkohol-oxidációs hatását azzal igazolták, hogy szubsztituált pirazollal gátolták az alkohol-dehidrogenázt és megfigyelték, hogy az alkohol metabolizmusa nem változott. A kataláz-H2O2-komponens oxidálta az etanolt, a hangyasavat és a metanolt egyaránt (484). II. 12. 2. A fagocitózis Ha a bekebelezı funkcióra képes sejteket (neutrophil granulocyta, eosinophil granulocyta, mononukleáris fagocita rendszer tagjai) adott inger éri, akkor összehangolt metabolikus reakciósor megy végbe bennük, amit "respiratory burst"-nek (légzési robbanás) nevezünk (22). A "respiratory burst" célja az, hogy oxidáló ágenseket szolgáltasson a fagociták által bekebelezett sejtek, kórokozók, vagy idegen anyagok eliminálása céljából (22). A reakciósorozat során a H2O2, a O2.- és a OH.koncentrációja drámai módon emelkedik a fagocita sejtekben ill. azok környezetében (23). Azt is megfigyelték, hogy a fagocitózis során keletkezı H2O2 mennyisége, a cianid-független oxigénfelvétel és a pentóz-foszfát-ciklus aktivitása jelentısen növekedett (44) (441). Ezek a vizsgálatok felvetették azt a hipotézist, hogy a NAD(P)H + H+ oxidációja a H2O2 képzés forrása (27). Azt is igazolták, hogy az O2.koncentrációja szintén növekszik a fagocitózis során (267) csakúgy, mint a glutationreduktáz aktivitása (365). A "respiratory burst" kialakulásához a sejtek membránjának depolarizációja szükséges, majd legtöbbször degranuláció és az intracelluláris cAMPszint változása következik be az O2.--képzés során (173). Megfigyelték, hogy az O2.termelıdhet a sejtek plazmamembránján és azok külsı felszínén is. Ennek lehetséges magyarázatát az adja, hogy a NADPH-oxidáz valószínőleg úgy helyezkedik el a membránban, hogy a NADPH kötıhelye a citoplazmatikus felszín felé néz, mivel a NADPH a citoplazmában foglal helyet. Az enzim O2.--t képzı része a kettısmembránban (lipid kettısmembrán) van. A fagocitotikus vakuólumban a plazmamembrán eredeti külsı felszíne belülre kerül, így az O2.- a vakuólum belsejében keletkezik (21) (20). A keletkezı O2.--t a SOD H2O2-vé alakítja. A fagocitált mikroorganizmus vagy partikulum a vakuólumba kerül, majd összeolvad azurofil (primer) granulumokkal. Az azurofil garnulumokban található mieloperoxidáz (MPO) enzim a H2O2 felhasználásával baktericid hatást eredményez (420). Az MPO az ubikviter halidionok (halogenidionok) hipohalit-ionokká (halogenitionokká) történı oxidációját katalizálja a H2O2 által az alábbi képlet szerint (X: halid ion): X- + H2O2 ⇒ XO- + H2O A Cl--, Br-- és I--ionok egyaránt oxidálódhatnak hipohalit formájúvá. Közülük valósznőleg a Cl- a leggyakoribb szubsztrát, mivel a sejtekben ez a legbıségesebben megtalálható halid (267).
36
A NAD(P)H-oxidáz O2.- termelése, mint elsı lépcsı, és az MPO között a granulumon belül ezáltal szoros funkcionális kapcsolat van (250). A fagociták mőködése során feltételezhetı, hogy a Fenton-féle reakció révén OH.is keletkezik a sejtek membránjában a fagocitózis folyamán létrejövı alkilhidroperoxidoknak O2.--kel való reakciója miatt (25). A O2.- és a H2O2 egy része valószínőleg átszivárog a vakuólumból a citoplazmába, majd az extracelluláris térbe, ahol a védekezı rendszer aktivitása, illetve hatása (cöruloplazmin, transzferrin, SOD) kisebb, ezért az ROI-k kijutása révén szöveti destrukció következhet be. Ezzel magyarázható a fagocitózist kísérı gyulladásos elváltozások kialakulása is (149). Megfigyelték, hogy az indukált fagocitózis során CAT és SOD enzimeket adva a baktericid hatás csökkent (246), míg a sejtek élettartama meghosszabbodott (428). A macrophag sejtek mőködését vizsgálva azt tapasztalták, hogy az intracelluláris gyökképzıdés mellett antioxidáns hatás is érvényesül bennük. Thomas és mtsai. igazolták, hogy a macrophagokban γ-interferon által indukált triptofán degradáció következtében antioxidáns hatású 3-hidroxiantranilsav (3HAA) képzıdik. Ezt azzal bizonyította, hogy a 3HAA sejtekbıl történı kiáramlásának hatására a szója lipoxigenázt tartalmazó gyökképzı közegben az E-vitamin és az LDL oxidációjának mértéke csökkent (488). Az említett enzimek és szubsztrátok a fagocitózis folyamatában lezajló feltételezett reakcióit a 7. ábrán láthatjuk . 7. ábra A szuperoxid-anion és a hidrogén-peroxid képzésének és felhasználásának feltételezett útja a fagocitózis során (420)
rövidítések: I-: jodid-ion; NADPH-ox: NADPH-oxidáz II. 12. 3. Az immunitás Az immunkomplexek fizikokémiai tulajdonságai nagymértékben befolyásolják a neutrophil granulocyták O2.--képzését. A vízoldékony IgG komplexek (antigén-antitest arány = 1:2) maximális O2.--képzıdést stimuláló hatásúak, míg a nagyobb komplexek (antigén-antitest arány = 1:5) kevésbé hatékonyak (368). Megfigyelték, hogy az immunkomplexek által okozott oxigén-szabadgyökképzıdést fokozni lehet gyulladásos mediátorokkal és komplementekkel is. Van Epps azt találta, hogy a C5a (kemotaktikus peptid) kifejezetten fokozta a szuperoxidanion-gyökképzést a neutrophilokban abban az esetben, amikor zimozánt is adtak a rendszerhez (500). A macrophagok proteázok segítségével növelték gyökképzésüket, amikor forbol-
37
mirisztát-acetátot adtak a rendszerhez (463). A neutrophilok és a macrophagok egyaránt fokozott O2.--képzést mutattak, amikor a C5a és egyes immunkomplexek adták a stimulust (511). Az immunkomplex-betegségekben jelentıs mértékő szövetkárosodás is fellép többek között komplement és más mediátorok által stimulált gyökképzés miatt. A szövetkárosodás kialakulásában tehát, a C5a-nak is központi szerep jut annak ellenére, hogy ez nem része az ismerten szövetkárosodást okozó komplexnek az ún: MAC-nak (MAC = membrane attack complex). A MAC terminális aktiváló komplementjei, a C5b és a C9, szintén oxigéngyök indukciót hoznak létre a sejtekben (458). Az IgG-komplexek által stimulált fagocita sejtek polielektrolitok hatására, pl. aminosav-kationok (polihisztidin, poliarginin) vagy anionok (polianetolszulfonát), szintén fokozottabb gyökképzést mutattak (182). A thrombocyták által termelt mediátorok, a macrophag eredető citokinek, az interleukin-1 (IL-1), valamint a tumor nekrózis faktor (TNF) hasonló hatást váltott ki IgG-stimulált macrophagokban (512). Az IgG-komplexek által stimulált neutrophil garnulocytákat szintén nagyobb O2.--képzésre serkentették a thrombocyta eredető mediátorok, a TNF és a thrombocyta eredető adeninnukleotidok (ATP, ADP), ugyanakkor a TNF önmagában is, elızetes IgG-stimuláció nélkül is, fokozta a gyökképzıdést (510). Az IgA immunkomplexek által kiváltott tüdıszövet károsodásban jelentıs szerepe van az oxigén-gyököknek. Bizonyítja ezt az a tény is, hogy a SOD, a CAT, a dimetilszulfoxid (DMSO) és a deferoxamin is hatékonyan kivédte a károsító hatásokat (368). II. 12. 4. A thrombocyták mőködése A thrombocyták mőködésének vizsgálatai során kimutatták az O2.- keletkezését, amelyet az arachidonsav-metabolizmus melléktermékének tartanak (203). A gyökképzés az arachidonsav folyamatos oxidációjának eredménye, mivel a thrombocytákban a felvett oxigén teljes mértékben az endogén arachidonsav oxidációjára fordítódik (312). A szabadgyökök, ill. az LP melléktermékei valószínősíthetıen fokozzák a thrombocyták membrán-foszfolipidjeibıl az arachidonsav felszabadulást, elısegítve ezzel az aggregációs folyamatokat. Az aggregáció azáltal jön létre, hogy a prosztaciklin : tromboxán-A2 (PGI2/TXA2) egyensúly a tromboxán-A2 javára tolódik el (149). Az oxigén eredető gyökök aggregációban való részvételét azzal is bizonyították, hogy amikor E-vitaminnal csökkentették a szabadgyökök mennyiségét, a thrombocytaaggregáció csökkent (302). II. 12. 5. Az arachidonsav-metabolizmus A arachidonsav lebontásnak három útja lehetséges: (1.) ciklooxigenáz hatására, amely a prosztaglandinok, a tromboxán-A2 és a prosztaciklin kialakulásához vezet; (2.) lipooxigenáz hatására, amikor a folyamat végén a hidroxi- és a dihidroxieikozatetraénsav, valamint a leukotriének keletkeznek; (3.) a citokróm-P450-függı monooxigenáz-rendszer segítségével, amely oxigenált termékeket képez az arachidonsavból, mint pl. a hidroxi-eikozatetraénsav, epoxi-eikozatetraénsav (425). A membrán-foszfolipáz-A2 a membránfoszfolipidekbıl arachidonsavat szabadít fel. Az ROI-k ezt a lépést fokozzák (184). A szabadgyökök ezáltal befolyásolják a
38
véralvadást (a PGI2/TXA2 - arány szabályozása révén) és a gyulladást (a leukotriének képzése révén) (393). A prosztaglandin-szintézisben a TXA2-szintézis melléktermékeként MDA keletkezik (184). Az ROI-k szerepe az arachidonsavból történı prosztaglandin-endoperoxid-szintézisben is jelentkezik, amelyet egy ciklooxigenáz- és peroxidáz-aktivitással rendelkezı enzim a prosztaglandin endoperoxid-szintetáz katalizál. Ebben a folyamatban a dioxigenálás és a ciklizáció szabadgyökös mechanizmus (90). Bár vizsgálatok szerint az E-vitamin gátolja a membránból történı arachidonsavfelszabadulást és a lipoxigenáz aktivitását, de nem gátolja a ciklooxigenázt, így növeli a PGI2-szintet azáltal, hogy megvédi a PGI2-szintetázt a lipid-hidroperoxidok gátló hatásával szemben (375). II. 12. 6. Az LP szerepe a mellékvesekéreg hormonok szintézisében A mellékvesekéregben található nagyfokú antioxidáns védelem arra utal, hogy a szervben fokozott LP lehet (224). A mellékvesekéreg hormonjainak szintéziséhez szükséges hidroxilációkat a citokróm-P450-rendszer tagjai (pl. a citokróm-P450koleszterin-metil-oxidáz, a citokróm-P450-11β- és a citokróm-P450-21-hidroxiláz stb.) végzik a mitokondriumokban és a mikroszómákban (225). Az enzimek mőködése során jelentıs mennyiségő O2.- szabadul fel. Bachmann (1954) hipotézise szerint a mellékvese sejtjei a rétegeknek megfelelı irányban (zona glomerulosa, zona fasciculata, zona reticularis) a velıállomány felé haladva fokozatosan "öregednek", bennük a lipidakkumuláció fokozódik, metabolikus folyamatai megváltoznak, és a szteriodhormonok termelése csökken (24). Ezt igazolta Hornsby és Crivello (1983) is, akik további hipotézist állítottak fel, miszerint az említett "öregedési" folyamat az enzimek mőködése során a fokozatosan keletkezı szabadgyökök hatására következik be (225). II. 12. 7. Az öregedés szabadgyökös reakciókkal összefüggı vonatkozásai Harmann 1982-ben tette közzé az öregedés általa megfogalmazott szabadgyökös elméletét, amelyben feltételezte, hogy a sugárzások ellen használatos antioxidáns hatású gyógyszerek hatással lehetnek az emlısök életének meghosszabbítására. A sugárzás károsító hatásai a szabadgyökös reakciók révén jelentkeznek, így az antioxidáns vegyületek használhatók e hatások kivédésére (207). Harman bizonyította, hogy egyes antioxidánsok növelték az egerek átlagos élettartamát, ugyanakkor az E-vitaminnak ilyen hatása nem volt, annak ellenére, hogy az az egyszerőbb szervezetek élettartamára egyértelmően pozitív módon hatott (208). Különbözı vizsgálatok bizonyították továbbá, hogy oxidatív károsodások révén keletkezı celluláris komponensek akkumulálódnak az idıs szervezetekben. Ezek pl. a szemlencsében lerakódva lencsehomályt idézhetnek elı. Hasonló eredető a lipofuszcin is, amely a bır alatt és más szervekben pl. az agyban is felhalmozódhat (372). A lipofuszcint, idıskori pigmentnek ("age pigment") is nevezik. Tappel mutatott rá, hogy az a fluoreszkáló pigment, amely kromofórokat tartalmaz, az MDA és egyes nitrogéntartalmú anyagok reakciójából származik (480). Vizsgálatok bizonyítják, hogy speciális tápon (amely PUFA-ban és rézben szegény, valamint természetes antioxidánsokban pl. szelénben és E-vitaminban gazdag) tartott patkányokban az LP-s folyamatok csökkentek és az állatok átlagos élettartama
39
növekedett (210). Boross és mtsai. igazolták, hogy egerek különbözı szöveteiben, illetve patkányok vvs-jeiben a kor elırehaladtával megnövekedett az MDA-képzıdés, és a szövetekben nıtt a lipofuszcin-tartalom. Ezek a megfigyelések is alátámasztják azt a feltevést, hogy az öregedés összefüggésben van a szövetek oxidatív károsodásával (65). Más vizsgálatokban az LP-s reakciók és az antioxidáns kapacitás változását tapasztalták a kor függvényében patkányok agy-, tüdı- és májszöveteiben (326). Megfigyelték, hogy a CAT- és a GSH-Px-aktivitás a májszövetben csökkent, míg az E-vitamin koncentráció a tüdıben és a májban nıtt a kor elırehaladtával. Ebben a kísérletben nem tapasztaltak kor függı szöveti MDA koncentráció emelkedést. A kor függı antioxidáns változásokat nemcsak a szöveti homogenizátumokban tudták detektálni, hanem a vörösvérsejtekben is. Igazolták, hogy újszülött patkányokban a szöveti mikroszómális eredető TBA-reaktív anyagok mennyisége kevés volt a 4 napos korban, de a kor elırehaladtával nıtt a koncentrációjuk (382). II. 12. 8. Az antioxidáns védekezés egyes elemeinek élettani változásai Számos állatban vizsgáltak élettani szabadgyökös reakciókat, azonban a vizsgálataimban szereplı fajok közül csak a kérıdzıkben vizsgáltak szélesebb körben természetes változásokat. A szarvasmarhák esetében az E-vitamin plazmabeli alapszintjének élettani változásait (443), valamint a Se és a GSH-Px közötti összefüggéseket tárgyalták (169). A juhokban több szempontból vizsgálták az LP élettani változását. A juhok, mint kifejezetten extenzíven tartott állatok, fokozottabb mértékben vannak kitéve a környezeti hatásoknak, a napfény és a hımérséklet ingadozásainak, mint a többi állatfaj. Mézes szezonális LP-s változásokat tapasztalt juhok vérplazmájában és vörösvérsejt hemolizátumában. Azt tapasztalta, hogy a téli hónapokban emelkedett az MDA-koncentráció, februárban csökkent a CAT-aktivitás, amely márciusban fokozódott. A GSH-Px-aktivitásban szintén csökkenés jelentkezett a téli hónapokban (338). Bedı és mtsai. egy vizsgálat során azt tapasztalták, hogy különbözı genotípusú, más-más fajtájú anyajuhokban (pl. a magyar és a német húsmerinó esetében) a vérplazma E-, és Avitamin-tartalma általában a téli hónapokban kicsi, míg a nyáriakban nagy, ugyanakkor a booroola fajtában fordított a helyzet (45). Bedı és mtsai. merinó anyajuhok tejének karotin-, E-vitamin- és A-vitamin-tartalmát vizsgálta a téli és a nyári hónapokra jellemzı takarmányozási viszonyok között. Azt tapasztalták, hogy a tej A-vitamin-, és karotintartalma májusban és a júniusban volt a legnagyobb, míg augusztusban már csökkenés mutatkozott, és a téli hónapokban tovább csökkent. Az E-vitamin-tartalom májusban és júniusban volt a legnagyobb és a júliusi, augusztusi értékek a téli hónapokkal egyezıek voltak, amit a szerzık azzal magyaráztak, hogy az E-vitamint a szervezet jobban raktározza. A szerzık gyanítják, hogy ez annak tudható be, hogy a télen etetett, fıképp konzervált takarmányok kevesebb vitamint tartalmaznak (46). Khan és mtsai. a vvs-ekben GSH-Px-, SOD-, acetil-kolin-észteráz-, és glükóz-6foszfát-dehidrogenáz- (G6PD) aktivitást mértek, és a vér Se-tartalmát is vizsgálták. Felvették az alapadatokat, és összehasonlították az eredményeket a nemek között. Azt tapasztalták, hogy az állatokban a vér Se-tartalma és a vvs-ek GSH-Px aktivitása szoros korrelációt mutatott. A nemek között nem tapasztaltak különbségeket (263).
40
Garber és mtsai. megfigyelték, hogy a szarvasmarhák takarmányának DL-αtokoferil-acetáttal történı kiegészítése nem befolyásolta a húsmarhák és a tejelıtípusúak növekedési mutatóit, húsuk érzékszervi vizsgálati eredményeit, valamint húsuk tárolhatóságát, azonban a húsok E-vitamin-koncentrációja nıtt, az LP és a felületi metmioglobin-képzıdés mértéke csökkent, valamint az állatok immunválasza javult (177). II. 13. A takarmányozással összefüggı szabadgyökös folyamatok A szervezet LP-s folyamataira jelentıs mértékben hatnak azok a tényezık, amelyek a takarmányfogyasztással illetve az antioxidáns és a prooxidáns hatású anyagok felvételével függenek össze. II. 13. 1. A takarmányok táplálóanyagainak (szénhidrátok, fehérjék, zsírok) hatása a szervezet LP-s folyamataira Az éhezés, illetve az energiahiány LP-s hatásait számos kísérletben vizsgálták. Gaál és mtsai. juhokban minden takarmány-összetevı együttes hiányát idézték elı és azt találták, hogy a vvs-ekben és a vérplazmában a GSH-koncentráció és a GSH-Px-aktivitás csökkent, valamint az MDA-koncentráció emelkedett (171). A zsírmobilizációs betegség kezelése során Rings és mtsai. azt tapasztalták, hogy az E-vitamin és a szelén adása jótékony hatású (419). Ez a tény felveti annak a gyanúját, hogy ezekben a folyamatokban is szerepet játszanak a gyökös rekciók. Ezt a feltevést támasztja alá az a megfigyelés is, hogy az ilyen betegségben szenvedı állatok májának A- és E-vitamin-koncentrációja jelentısen kisebb volt az egészségesekénél (219). Mézes és mtsai. tenyészbikákon vizsgálták az energiahiányos takarmányozás következményeit, és azt tapasztalták, hogy amikor az állatok öt héten át a szükségleti értékeinél lényegesen kevesebb táplálóanyagot vettek fel, akkor vvs-jeik GSH-Px-aktivitása jelentısen kisebbnek bizonyult (339). Kennedy és mtsai. azt tapasztalták, hogy a takarmány többszörösen telített szabadzsírsav-tartalmának emelése izomdegenerációt okozhat szarvasmarhákban, valamint fokozza az E-vitamin szükségletet (261). A fehérjebevitel csökkenésével elsısorban az LP-s folyamatokban résztvevı enzimek de novo szintézise szenvedhet zavart, azonban meg kell említenünk az SHcsoportot tartalmazó cisztein (74) (359) és a másik kéntartalmú aminosav a metionin központi szerepét a szabadgyökök hatása elleni védekezés szempontjából (77). Említést érdemel, hogy a fehérjék biológiai hatékonyságát csökkentik az oxidáló lipidek, mint pl. a metil-linolénsav, mert rontják a lizin, a triptofán, a cisztein és részben a metionin értékesülését (357). Khan és mtsai igazolták, hogy az általuk nem részletezett tartalmú, de a National Research Council ajánlásai alapján összeállított koncentrált takarmányozás javította a szarvasmarhák vérének GSH-Px-, SOD- és G6PD-aktivitását. A takarmány nagy (0,75 %-os) kéntartalom nem befolyásolta jelentısen az állatok egészségét és szabadgyökös paramétereit (263).
41
II. 13. 2. A takarmányok vitamintartalmának hatása az LP-s folyamatokra A vitaminok antioxidáns, és - bizonyos körülmények között jelentkezı - prooxidáns hatásáról már részletesen tettem említést. Itt csak néhány érdekesebb összefüggésrıl kívánok megemlékezni. Az LP fokozódásáért leggyakrabban a vitaminhiány a felelıs, azonban a zsíroldékony vitaminok túladagolása szintén jelentıs takarmányozástani problémákat vethet fel, aminek szintén lehet köze a szabadgyökök képzıdéséhez. A takarmányok E-vitamin-tartalma jelentısen befolyásolja az állatok egészségét. Jelentıségét és a különbözı állatok E-vitaminszükségletét Putnam és Comben részletezik (401). Az antioxidáns vitaminok és a karotin adásának számos kedvezı hatását vizsgálták különbözı állatokon, pl. az immunitás javítása (404) (111), vagy egyes betegségek kivédése (mint pl. a csirkék encephalomalatia betegsége) szempontjából (429). A takarmány E-vitaminnal történı kiegészítése javítja szubklinikai betegségben szenvedı broilercsirkék ellenállóképességét, táplálóanyag-konverziós és egyéb mutatóit is, amit a szerzık az E-vitamin antioxidáns hatásának tudnak be (333). Az E-vitamin hiányában számos betegség kialakulását igazolták különbözı állatfajokban, pl. patkányokban a májelfajulást (446), csirkékben exsudativ diathesist (363), bárányokban az ún. Zenker-féle izomelfajulást (308), szarvasmarhákban a fehérizom-betegséget (68), borjakban szintén a myodegenerációt (261), sertésekben a szederszív betegséget (508) és szintén az izomelfajulást (191), nyulakban az újszülöttek elhullását és ebben a fajban is az izomelfajulást (530). A felsoroltak közül a szerzık minden esetben a Se hiányát is megemlítik, mint az említett kórképek potenciális hajlamosító tényezıjét, sıt a sertések esetében a többszörösen telítetlen zsírsavak fokozott felvételét is lényeges faktornak tartják. A szerzık minden esetben az oxidatív stesszt és az LP fokozódását is említik, mint közvetlen oktani tényezıt. Chow említi, hogy az E-vitamin hatását nemcsak annak bevitele, hanem a takarmány Se-, C-vitamin-, retinoid-, β-karotin-, kéntartalmú aminosav-, Mn-, Zn-, Cu-, Fe-, valamint többszörösen telítetlen zsírsavtartalma is befolyásolja (106). Nemcsak az E-vitamin, hanem a riboflavin hiánya is befolyásolja az antioxidáns rendszert, ugyanis ilyen esetben szintén csökkent antioxidáns enzimaktivitást igazoltak malacok májban és vvs-jeiben (69). Említésre érdemes, hogy egyes vitaminok túladagolása is fokozott LP-t hozhat létre. Az A-vitamin túladagolásának hatását Mézes és Sályi vizsgálta, és igazolták az LP fokozódását kacsákban (341). II. 13. 3. A takarmányok mikroelemtartalmának hatása az LP-s folyamatokra Korábban elsısorban a Se hiányát említették, mint a fokozott LP-vel járó kórformák oktani tényezıjét. Patkányokban igazolást nyert, hogy a Se-hiány a vvs-ekben és a plazmában kisebb GSH-Px-aktivitás mellett kompenzatórikus nem Se-függı GSH-Pxaktivitás emelkedést eredményezett (198). Ugyanezt a kompenzációs hatást kacsákban nem tudták bizonyítani (528). A Se túladagolása azonban szintén fokozott LP-t eredményezhet (197). A Se toxikus hatását és az általa okozott fokozott LP-t Mézes és Sályi igazolta baromfiban (340).
42
Számos más mikroelem LP-t fokozó hatását is vizsgálták. Az egyik legjelentısebb a juhokon megfigyelt Cu okozta toxikózis, ami májelfajulásban és hemolízisben, valamint fokozott LP-ben nyilvánul meg (437). A Mg-hiány patkányokban (505) és a Zn-hiány csirkékben (52) szintén fokozott LP-t eredményezhet. Jelentıs még a Cd- (64), az Fe(411), és a Pb- (283) gyökképzıdést fokozó hatása is. II. 13. 4. A takarmányok egyéb adalékanyagainak hatása az LP-s folyamatokra A takarmányok adalékanyagokkal történı kiegészítése ma már szinte elengedhetetlen az állatok gyors és hatékony nevelésében. Ezek egy része közvetlenül antioxidáns (EMQ, BHT), és azért alkalmazzák, hogy a különbözı takarmányféleségek tárolás közben ne károsodjanak. Mások hozamnövelı hatásúak (monenzim, salinomycin stb.), amelyeket elsısorban azért alkalmazunk, hogy a bélbeli mikrobák által okozott táplálóanyag-veszteséget minél alacsonyabbra szorítsuk, így a takarmányértékesítést javítsuk. Az ethoxyquin (EMQ) hatékony volt a szelén- és az E-vitamin-hiányos takarmányon tartott sertésekben kialakuló klinikai tünetek kivédésében (457). A monenzin LP-t fokozó akut toxikus hatását Sályi és mtsai. vizsgálták, és azt találták, hogy 150 mg/ttkg adagban adva a broilercsirkék májában fokozta az LP-t, amit az MDA-koncentráció emelkedésével igazoltak, továbbá növekedett a máj CATaktivitása is, míg a vérben és az izomszövetben a monenzin LP-s paraméterekre gyakorolt hatását nem tudták igazolni (430). A furazolidon hatásait Sas vizsgálta, és azt tapasztalta, hogy csirkéknek 300 mg/kg takarmány szárazanyag furazolidont 3 napig adva különbözı szöveteikben igazolni lehetett a fokozott LP hatásait (436). A szalinomicin és a tiamulin akut toxikus és LP-t fokozó hatását Mézes és mtsai. vizsgálták (342). II. 13. 5. A takarmányok nem esszenciális alkotóelemeinek és egyes mérgezı növényeknek hatása az LP-s folyamatokra A növényekben lévı antinutritív hatású anyagok, így egyes pillangósokban (szója, csillagfürt, lóbab) lévı lipoxigenáz hatású enzimek csökkenthetik a táplálékok E- és Avitamin-, valamint karotin-tartalmát (474). Más anyagok, mint pl. a szójában lévı αtokoferol-oxidáz közvetlenül az E-vitamint károsíthatja (524). Egyes növények nitrit- és nitráttartalma a vörösvérsejtek Hb-jának fokozott oxidációját eredményezi, így methemoglobinaemiát okozhat, továbbá az antioxidáns hatású A-vitamin képzıdését gátolja azáltal, hogy rontja a karotinból történı átalakulását (522). Egyes növényfajok (kb. 1000) ciántartalmának (CN) legfıbb toxikus hatása a terminális oxidáció gátlása, mert a citokrómoxidáz vastartalmához kötıdve azt gátolni képes. Tapasztalatok alapján a cianidok a máj citokrómoxidázát nem, de az agyban lévıt gátolják (514). További toxikus hatásukként számos metalloenzimet gátolnak pl. SOD-ot (117) (330).
43
A szaponin- és a szolanintartalmú növények pl. a konkoly vagy a burgonyafélék és az ebszılı csucsor a sejtek membránját károsítja (204), ha ez a vvs-ek hemolízisére vezet, akkor megnıhet a plazma szabad vastartalma (283), ami az LP fokozódásához vezethet. Egyes növények fényérzékenyítı hatásúak. A fototoxikus hatás azt jelenti, hogy bizonyos kémiai anyagok a 320-420 nm-es hullámhosszúságú fény hatására a szerevezetben toxikussá válnak. A növények fototoxikus hatásának két fı oka lehet. Az elsıdleges folyamatban az egyes növényekben lévı anyagok (pl. a pohánka fagopirin vagy az orbáncfő hipericin alkaloidája) lipotrop hatásuk révén a bırben felhalmozódnak, és a napfény hatására mérgezıvé válnak. A másodlagos folyamatban a máj elégtelen mőködése következtében alakulnak ki a kóros anyagcseretermékek. Ilyenkor egyes növényi metabolitok (pl. a filloeritrin) kiválasztódása csökken, így azok felhalmozódhatnak a szervezetben. A bırben a metabolitok a napfény hatására reaktívvá válnak, a reaktív anyagok és az O2 reakciója 1O2-t, O2.--t és OH.--t eredményez (60). A tiamináz-aktivitással rendelkezı saspáfrány és mezei zsurló szintén gyökképzı hatású (102). A száraz takarmányhoz szokott szarvasmarhákban a friss legelıfüvek felvétele heveny tüdıödéma és -emfizéma-szindrómát (acute bovine pulmonary edema and emphysema, ABPE) okozhat. Ennek hátterében számos kutatás szerint az állhat, hogy ezeknek a növényeknek magas a D,L-triptofán-tartalma. A triptofán a kérıdzık bendıjében és a monogasztrikus állatok vastagbelében 3-metilindollá és indollá metabolizálódik, aminek szabadgyökképzı hatása kifejezetten érvényesül a tüdıszöveti mikroszómákban. Elsısorban a citokróm-P450-monooxigenázok felelısek az ún. pneumotoxinok bioaktivitásáért, a toxikus hatás eredményeképpen azonban számos más gyökképzı lépést igazoltak (89). A takarmányok gombatoxin-szennyezıdése szintén jelentıs LP-t fokozó tényezı lehet. Omar és mtsai. igazolták, hogy az ochratoxin in vitro körülmények között az MDA-koncentráció emelkedését okozza (369). A takarmányokban felhalmozódó T2-toxinról szintén kimutatták, hogy fokozza az LP-t. Krappen és mtsai. igazolták, hogy a trichotecen-tartalmú takarmány etetése egerekben fokozta a máj tiobarbitursav-reaktív anyagainak képzıdését (277). Ugyanık hasonló kísérletekben vizsgálták a csirkékben és prémesállatokban a toxin hatását. Azt tapasztalták, hogy a trichotecenmérgezés fokozza az LP-t a vizsgált állatokban (277). II. 13. 6. Egyéb szennyezıdések A szennyvizek hatására egyes növényekben, illetve a szennyezett takarmányok felvétele révén fokozódhatnak a szervezetek LP-s folyamatai (298). Az olajosmagvak extrahálása során szintén fokozódhat a gyökképzıdés. A kenderbıl kannabiol, a repcébıl mustárolaj-glikozid, a gyapotmagból gossypol, a ricinusmagból ricin és antricin a lenmagból cianidok keletkezhetnek, amelyek potenciálisan egyrészt gyökképzık lehetnek, másrészt az E- és az A-vitaminnal reagálva csökkenthetik azok koncentrációját (204).
44
A gumósok kezelése során szintén prooxidánsok jöhetnek létre. Ilyenek a takarmányrépából származó betain (trimetil-amin) és nitrit, valamint a burgonyából származó szolanin és a csicsókából keletkezı inulin (204). II. 14. Káros szabagyök reakciók A szabadgyök reakciók számos klinikai kórfolyamatot idéznek elı, azonban gyakran tapasztaljuk, hogy lassú hatásúak és az átlagos élettartamot rövidítik, vagy a termelıképességet rontják. II. 14. 1. Az ún. prooxidáns rendszerek Prooxidánsanak nevezzük azokat az anyagokat, molekulákat, metabolitokat és folyamatokat, amelyek az oxigén eredető gyökképzıdést kiválthatják. Számos ismert prooxidáns hatás említhetı meg, pl. a redoxi-ciklusos komponensek, a hidroperoxidok, a nitrogénoxid stb., de ilyen pl. a C-vitamin bizonyos körülmények között vagy a nagyobb koncentrációban adott A-vitamin is, amelyek direkt gyökképzı hatásúak. A többszörösen telítetlen zsírsavaknak, egyes növényeknek és takarmányalkotórészeknek is lehet prooxidáns hatása. Redoxi-ciklusos komponensek Ezek a komponensek oxigéngyököket képezhetnek az alábbi általános mechanizmus alapján: +1eR ⇔ R.
O2.-
O2 ⇒
Fe2+⇒ OH.-
H2 O2 Az elıbb ábrázolt reakciósorban részt vehetnek a kinonok, a bipiridil-herbicidek (116) és a nitro-csoportokat tartalmazó komponensek is (394). Hidroperoxidok Az élı szervezeten belül képzıdı hidrogén-peroxid keletkezésének lépéseivel a korábbiakban foglalkoztunk. A lipidperoxidok a lipidperoxidáció korábban leírt lépéseiben képzıdnek, azonban itt is említést kell tennünk arról, hogy képzıdésük enzimatikus úton is végbemehet az arachidonsavból, pl. a macrophagokban és a neutrophil granulocytákban. Ilyenek pl. a ciklikus endoperoxid köztianyagok, amelyek a ciklo-oxigenáz hatására képzıdnek,
45
valamint a PGG2, a PGH2, és a hidroxi-eicosatetraensav (HPETE), amelyek a lipoxigenázok révén keletkeznek (422). Számos kutatómunka igazolja a hidroperoxidok hatását az említett folyamatokban, mégis azokat a molekuláris mechanizmusokat, amelyek a sejtek oxidatív károsodását elıidézik, még sok homály fedi. A hidroperoxidok hatására sejten belül legtöbbször az alábbi folyamatok fordulhatnak elı: a lipidperoxidáció, a DNS-károsodás, az intracelluláris ATP gyors lebomlása (464), az intracelluláris szulfhidril csoportok gyors oxidációja, az intracelluláris NAD+ koncentrációjának növekedése, a poli-ADP-ribózpolimeráz aktivációja, a citoszol Ca2+-koncentrációjának növekedése (9), a sejtek mikrotubuláris rendszerének károsodása (231), és a glikolitikus reakciósor csökkent mőködése (422). Mindezek a változások megelızik azokat a mérhetı hatásokat, amelyek a sejthártya károsodása miatt jönnek létre. Igazolást nyert az is, hogy a peroxidok közvetlen oxidatív károsodást okozó hatásuk mellett, stimulálják az arachidonsavmetabolizmust izolált sejtekben és perfundált szövetekben is (235). A hidroperoxidok indukálta arachidonsav-metabolizmus és prosztanoid-szintézis pontos mechanizmusa csak részben ismert (205), azonban a vizsgálatok alapján gyanítható, hogy nem a lipiperoxidációnak, hanem inkább a foszfolipáz-A2 aktivációjának van közvetlen hatása ebben a folyamatban (194). A nitrogénoxid (NO) és szerepe a szabadgyök-képzı folyamatokban Az oxigénközpontú szabadgyökök mellett a biológiai rendszerekben kiemelten fontosak a nitrogénközpontú gyökös vegyületek is. Ezek közül a biológialag legsokoldalúbb hatással a nitrogénoxid (NO) rendelkezik. Ezt mutatja, hogy vasodilatator hatása révén bizonyított szerepe van az erek nyugalmi tónusának fenntartásában a legkülönbözıbb szövetekben, neurotranszmitter szerepe van egyes agyi, valamint vegetatív idegrendszeri funkciókban (nem kolinerg és nem adrenerg enterális idegrendszerben) (434). Az NO legfontosabb keletkezési forrása a szervezetben az Larginin, aminek guanidin csoportjából a nitrogénoxid-szintetáz enzim (NOS) hatására keletkezik, miközben az L-arginin L-citrullinná alakul át. Az említett enzimnek két típusa ismert, a konstitutív (cNOS) és az indukálható (iNOS). A konstitutív forma, Ca2+dependens, felelıs a folyamatos élettani NO-szintézisért az endotheliális- és a simaizomsejtekben, valamint az enteralis idegsejtekben. Ez az enzim valószínőleg a nyálkahártya és a microvascularis védelem egyik fontos szabályzója. Az indukálható forma különbözı kórfolyamatokban (pl. a gyulladásban, az endotoxinsokkban) aktiválódik, fıként egyes citokinek hatására a Ca2+-tól független módon. Hatására a vérnyomás jelentıs csökkenése, valamint csökkent szívizom-kontraktilitás figyelhetı meg. Az iNOS a hízósejtekben, a hámsejtekben, a neutrophil granulocytákban, a monocytákban és az izomsejtekben fordul elı nagyobb mennyiségben. A két enzimtípust egyaránt gátolja az NG-nitro-L-arginin-metilészter (L-NAME), azonban csak az indukálható formát az iNOS-t gátolják a glükokortikoidok (279). Az NO mediátor és simaizom-relaxáló szerepén kívül szabadgyökként is viselkedhet, egy elektront veszítve (NO.) maga is szabadgyökké alakulhat, valamint különbözı oxigén eredető gyökökkel pl. O2.--vel peroxinitrit-aniongyök (ONO2.-) is
46
képzıdhet belıle. Ez viszonylag rövid ideig életképes, és könnyen lebomlik nirogéndioxidra és hidroxilgyökre (217). Számos vizsgálatot végeztek annak felderítése érdekében, hogy milyen szerepet játszik az NO az ischaemia - reperfusiós jelenség patomechanizmusában. Egyes szerzık macska modellen vizsgálva azt tapasztalták, hogy a különbözı NO-donor vegyületek (pl. L-arginin) reperfusiót megelızı adása a jelentısen csökkentette a sejtek permeabilitását, és javította a bélszövet regenerációját. Azt is megfigyelték, hogy az endogén NOszintézis gátlása esetén (NOS-inhibitorok) a repefusiókor jelentkezı elváltozások a kontroll csoportokhoz képest fokozottabbak voltak. Az NO szerepét vizsgálva a reperfusiós hatások kivédése szempontjából a szerzık gyanítják, hogy az NO egyrészt csökkenti a szabadgyökképzıdésért felelıs neutrophil granulocyták adhesióját a posztkapilláris vénákhoz, másrészt, a xantin-oxidáz mőködése révén keletkezı szuperoxid-anion-gyökkel való reakciója, azok detoxikációját eredményezheti (279). Mézes és mtsai. említést tesznek arról, hogy csirkékben az NO-donorként ismert Larginin takarmánykiegészítıként való adása fokozta a pulmonáris hypertensio szindrómája (PHS) elıfordulását (343). A két típusú NO-képzı enzim hatása és az általuk létrehozott NO prooxidáns, vagy antioxidáns hatása még nem teljesen tisztázott, mindenesetre megállapítható, hogy az NO a belek ischaemia-reperfusiójában hatékony scavengerként mőködik, míg a szív és a tüdı megbetegedéseiben, valamint az endotoxinsokkban prooxidánsként, a kórfolyamat súlyosbításáért felelıs (279). Érdekes összefüggés tapasztalható a xantin-oxidáz-rendszer és az NO között. Czakó és mtsai. patkányokban igazolták, hogy az NO képzıdését indukáló L-arginin pancreatitist idéz elı, ugyanakkor ez a hatás a xantin-oxidáz-gátló allopurinol hatására kivédhetı volt (119). II. 14. 2. A vörösvérsejtek LP okozta károsodásai Hemoglobin (Hb) károsodása Különbözı vizsgálatokkal igazolták a Hb-nak az oxidatív károsodások révén kialakult szerkezeti és mőködésbeli változásait (236). Ezek a változások a Hb-molekula denaturációját és a vörösvérsejten belüli precipitációját, így a Heinz-féle testek kialakulását foglalják magukban, a következı mechanizmuson keresztül (355): Az oxidáló anyagok Hb-nal kapcsolatba lépve, H2O2-t képeznek (104). Ez a kapcsolat metHb-t és O2.--t hoz létre (346). A O2.--bıl a vörösvérsejten belüli SOD dizmutációs hatása révén O2 és H2O2 keletkezik. Az oxidálószer vagy a képzıdı szabadgyökök a redukált glutationt (GSH) is oxidálhatják (274) valamint GSH-tiil gyököt (RS.) képezhetnek. Ezek és az egyéb molekulán illetve sejten belüli szulfhidril csoportok kevert diszulfidokat alakíthatnak ki (273). A molekulán belüli diszulfidok konformációs változásokat eredményezhetnek (388). A molekulakonformáció megváltozása irreverzibilis aggregációt hozhat létre, coccoid granulumok képzıdnek és kialakulnak a Heinz-féle testek, amelyek a sejt belsejében képzıdnek, de késıbb a membránhoz kapcsolódnak (418). Az ilyen sejtek membránjának megváltozik a permeabilitása, ozmotikus károsodásokat szenvedve sejtlízisük következhet be (238).
47
A vvs-ek oxidatív károsodásának Hb-ra kifejtett hatását, valamint a vvs-ek antioxidáns védekezırendszerének fıbb elemeit látjuk a 8. ábrán. 8. ábra A vvs-ek antioxidáns védekezırendszere és a Hb oxidatív károsodása, Chiu nyomán (104)
II. 14. 3. A membránkárosodás A vörösvérsejteknek nagy a PUFA-tartalmuk, így az LP-re igen érzékenyek. Kimutatták, hogy a H2O2 átal okozott MDA-koncentráció növekedés mellett a vörösvérsejtek súlyos membránkárosodást, hemolízist mutatnak (469). Az MDAkoncentráció vörösvérsejteken belüli növekedése ebben a kísérletben megelızte a hemolízist. Jacob és Lux (237) valószínősítik, hogy mintegy 7nm nagyságú rések keletkeznek az oxidatív károsodást szenvedı sejtek membránján, amelyek befolyásolják a permeabilitást, és a folyamat hemolízisre vezet. A peroxidációs hatás, amely az ATPben szegény vvs-ek membránlipidjeit érinti, a szomszédos fehérjék SH-csoportjait is befolyásolja a kevert diszulfid-kötések kialakulása révén, így a membránfehérjék struktúrális változása, valamint az ennek következtében kialkuló csökkent deformabilitás is hozzájárul a permeabilitás növekedéshez (374). Kimutatták, hogy a peroxidációs hatásnak kitett emberi vörösvérsejtek belsı felületén lévı Na+-K+-ATP-áz aktivitása jelentıs mértékben romlik, ezáltal a sejt nagymennyiségő K+-ot veszít, majd a sejtek hemolízise következik be (104). Goldstein és Balchum (185) az ózonnak kitett vörösvérsejteket figyelte és megállapította, hogy a sejtek ozmotikus fragilitása fokozódik, és MDA koncentrációjuk emelkedik. Kimutatták továbbá, hogy ezekben a sejtekben a GSH-Px-aktivitás is fokozódik, valószínősíthetıen az enzim oxigén okozta allosztérikus aktivációja révén (387). II. 14. 4. Az oxigéntoxicitás Az oxigéntoxicitás tüneteit mintegy 70 évvel ezelıtt már Shilling leírta. Az oxigén toxikus hatása akkor érvényesült, amikor az állati szervezetet 1500-2300 Hgmm oxigénnyomásnak tették ki, ennek hatására generalizált görcsroham (454), majd súlyosfokú tüdıkárosodás jelentkezett (243). Chance is foglalkozott a hypoxia / hyperoxia hatásával. A nagyobb oxigénnyomásnak kitett szövetekben a microvascularis
48
kontroll ellenére növekedett az O2.-, a H2O2 valamint az LP-s köztianyagok koncentrációja (100). Nishiki és mtsai. figyelték meg, hogy a 3100 Hgmm oxigéntenziónak kitett májszövetben már 15 perc múlva jelentısen nıtt a glutationdiszulfid (GSSG) koncentráció. Hasonló változásokra vezetett az oxigén tüdıszövetre gyakorolt hatása (360). Az E-vitamin-hiányos, valamint az éhezı állatok ezen szöveteiben felerısödtek az LP-s folyamatok a magas O2-tenzió hatására (336) (495). Az eredmények hasonlóan alakultak az oxigén hatására az agyszövetben (244) és a vörösvérsejtekben (245). A gyorsan kialakuló válaszreakciók mellett (GSSG fokozott termelıdése, NADPH oxidációja) megfigyelték a piridin-nukleotidok oxidációját is (97). II. 14. 5. A szabadgyökök károsító hatása újszülöttekben Az újszülött állatok kifejezetten érzékenyek a szabadgyökök hatásaira, hiszen a születés pillanatában hirtelen megterheli ıket az extrauterinális környezet a méhen belülihez képest nagyobb koncentrációban lévı oxigénje. Az oxigén nyomása a tüdı alveolusaiban ötször akkorára növekszik, mint amilyen az intrauterinális környezetben volt. A koraszülött csecsemıkben ez a probléma még fokozódik azáltal, hogy az ún. "respiratory distress syndrome" kezelése során csaknem 100%-os oxigéntenziónak teszik ki ıket (354). Az oxigénnel történı direkt kontaktus különbözı betegségekben nyilvánulhat meg. Ilyenek a hemolitikus anaemia, a bronchopulmonális dysplasia, a retrolentális fibroplasia (újszülöttek retinopathiája) és esetenként az agykérgen belüli vérzés (354). Ezek a tünetek elsısorban E-vitamin hiányban szenvedı újszülöttekben fordultak elı, különös tekintettel azokra, akik az említett oxigénkezelésben részesültek (118). Wispe és mtsai. bizonyították, hogy az újszülöttekben az LP mértéke kb. tízszerese a felnıttekének ezt a tiobarbitursav-reaktív anyagok (MDA) vérbeli koncentrációjának nagyobb voltával és az etánnak, valamint a pentánnak a kilélegzett levegıben való fokozott megjelenésével igazolták (523). Varga és mtsai. (1985) vizsgálatai alapján az érett újszülöttek vvs-jeiben a SOD-, a CAT- és a GSH-Px-aktivitás jelentısen fokozottabbnak, valamint az LP mértéke kisebbnek bizonyult, mint a koraszülöttekben. A szerzık ezt a tényt a biokémiai rendszer éretlenségének tudják be. Sertéseken végzett vizsgálatok azt bizonyítják, hogy a belsı szervek (máj, tüdı, vese) peroxidatív folyamatainak szintje nagyobb a két napos malacokban, mint az idısebbekben. Ebben a kísérletben azt találták, hogy az antioxidáns védekezésben szerepet játszó enzimek aktivitása is fokozottabb volt (293). Az adatokból az is látható, hogy az újszülöttek viszonylag gyengébb ellenállóképességgel rendelkeznek az LP káros hatásai ellen, mint az idısebb egyedek. II. 15. Xenobiotikumok okozta szabadgyökös károsodások A xenobiotikumok a biológiai szervezetek LP-jének egyik legfontosabb iniciátorai közé tartoznak. A dialursav, a 6-hidroxidopamin kémiai szerkezeténél fogva autooxidáció során könnyen alakul gyöktermékké ill. ROI-ré (213), a szulfonamidokból pl. az UV fény hatására alakulnak ki ún. fototoxinok (493), míg egyes anyagok enzimatikus úton, az anyag tulajdonságaitól függı metabolizmusok során válnak szabadgyökké, ilyen pl. az etanol is (133). Ebben a fejezetben nem tárgyalom a
49
természetben jelenlevı és a szintetikus eredető xenobiotikumok széles körének hatását a szabadgyökképzıdésre, csak azon anyagokat említem, amelyekkel vizsgálataimat végeztem. II. 15. 1. Széntetraklorid (CCl4) Az enzimatikus szabadgyök-, illetve ROI-képzıdés, valamint a zsíros és a cirrhotikus májelfajulás egyik klasszikus modelljét adja a régen anthelmintikumként használt széntetraklorid (416). A toxikus hatás leginkább érintett szerve a máj, amelyben zonális centrolobuláris nekrózis, zsíros degeneráció és cirrhosis alakul ki. Ennek egyik indirekt bizonyítékát az adta, hogy egyes antioxidánsok (pl. N,N-difenil-p-feniléndiamin, DPPD) jelentıs mértékben csökkentették a májszövet Ccl4 okozta zsíros infiltrációját, nekrózisát és progresszív cirrhotikus elváltozásait (133). Hasonló tapasztalatokra jutottak Fehér és mtsai., akik a CCl4 hepatotoxikus hatását nagymértékben csökkenteni tudták az antioxidáns hatású MTDQ-val (MTDQ: 5,6-metilén-bisz/-2,2,3-trimetil, 1,2dihidrokinolin) (146). A CCl4-mérgezés állatokban korábban is elıfordult, fıképp anthelmintikumként való kiterjedt alkalmazása miatt. A mérgezés súlyos klinikai tünetekkel jár (étvágytalanság, hastáji fájdalom, hasmenés, sárgaság stb.) (450). Di Luzio szerint a CCl4 mérgezı hatását szelektíve egyes szubcelluláris frakciókban az enzimatikus lipoperoxid-képzıdés révén fejti ki (133). Bizonyította, hogy hatására a máj mikroszómális frakcióiban konjugált diének képzıdnek és az antioxidánsok (pl. aszkorbinsav) megfogynak. Ezek a változások azonban nem alakulnak ki a mitokondriumokban. A CCl4 toxikus hatásának kialakulásához az eredmények szerint szükség van a máj ún. mikroszómális, kevert funkciójú oxidázainak aktivitására, amelyek alapvetı részt vállalnak a CCl4 metabolizmusában (335). A CCl4 okozta LP-fokozódás a triklórmetil-szabadgyök képzıdésével kezdıdik (CCl3.). Ez a gyökös vegyület és ennek peroxid derivátja (CCl3OO.) hidrogén atomot képes elvonni a telítetlen zsírsavakról és/vagy kovalens-kötést képez a lipid- és a fehérjemolekulákkal (282). A hidrogénatomok elvonása a telítetlen zsírsavakról széncentrumú lipidgyökök képzıdését indukálhatja (328). Ezek a lipid eredető gyökök könnyen reakcióba lépnek a molekuláris oxigénnel, miáltal lipidperoxid-gyökök alakulnak ki, így az LP iniciációja következhet be. Ha ezeket a lipidperoxid-gyököket nem hatástalanítja az E-vitamin, vagy más gyökfogó vegyület, a folyamat propagációs stádiuma indul el azáltal, hogy további lipidmolekulákról további hidrogén atomok elvonása következik (295). A CCl4 a kevésbé kötött elektronokkal reagálni képes, ekkor a Cl- leválhat róla, az alapmolekulából szabadgyök képzıdik. Ezt a folyamatot nevezzük "disszociatív elektrontranszfer"-nek: e- + CCl4 → Cl- + CCl3.. A CCl4 toxikus reakciója a mikroszómális eredető citokróm-P450 mőködését is feltételezi, amely vasatomjának oxidációja ezt a disszociációt katalizálja (409): CCl4 CCl3. + ClFe2+
Fe3+
50
Az etán és a pentán nagyobb mennyiségben történı kilélegzése szintén egyértelmő bizonyítéka a CCl4 LP-t fokozó hatásának. A többszörösen telítetlen zsírsavak hidroperoxidjai etil- és pentilgyököket képeznek, majd az etil- és pentilgyökök etánná és pentánná konvertálódnak (397). II. 15. 2. Alloxán Az alloxán önmagában is szabadgyökképzı vegyület, amely hatását a hasnyálmirigy Langerhans-sziget ß-sejtjeinek és a máj sejtjeinek károsítása révén éri el. Az alloxán (2,4,5,6-tetraoxipirimidin v. 5,6-dioxiuracil) igen reaktív anyag. Szerkezeti képlete (214): O O C C N . x H 2O C
C
O N. O Diabetogén hatása azzal függhet össze, hogy a vegyület és a redukált formája, a dialursav között redox-ciklus alakul ki, amelynek során aerob körülmények között, szuperoxidanion-gyök és hidrogénperoxid képzıdik (412). A dialursav képzıdésének elsı lépését a GSH idézi elı azáltal, hogy az alloxánból egy elektron elvonásával szabadgyök intermediert képez, majd ismételt egyelektronos redukcióval dialursav keletkezik (214). A ß-sejtkárosodás pontos mechanizmusa nem teljesen ismert, bár Dillard és mtsai. igazolták az alloxán LP-t fokozó hatását, ami által a sejtkárosodás létrejöhet (135). Malaisse és mtsai. kimutatták, hogy az alloxánra a ß-sejtek kifejezetten érzékenyek és hatására izolált patkánysejtekben csökkent a GSH/GSSG arány (310). Fischer és Hamburger kimutatták, hogy a SOD és a CAT megvédte a ß-sejteket az alloxán hatásától (152). Halliwell és mtsa. feltételezte, hogy olyan reaktív gyök is kialakulhat az alloxán hatására, mint pl. az OH.-. Ennek képzıdéséhez a vasionok katalizálta Fenton-reakcióra van szükség (201). Reif és mtsai. igazolták a vasionok szerepét és kimutatták, hogy az alloxán GSH általi redukciója során a ferritinbıl vasionokat képes mobilizálni csakúgy, mint a GSH-ból származó tiil-gyök, ami az elıbbi reakció során szintén keletkezik (412). A ferritin-vas redukcióját, amely a vasionok felszabadulását eredményezi más szabadgyökök is kiválthatják, mint pl. az O2.- (486). Igazolták, hogy a cöruloplazmin hatékony inhibitora a GSH és az alloxán okozta ferritinvas felszabadulásnak éppúgy, mint Samokyszyn vizsgálatai alapján az O2.-- és ferritin dependens LP-nek (431). Ez a folyamat azon alapul, hogy a cöruloplazmin képes a vasat visszaépíteni a ferritinbe. A hasnyálmirigy Langerhans-sziget ß-sejtjeinek károsodása Takasu és mtsai. szerint azáltal jön létre, hogy az inzulintermelés genetikai zavara alakul ki. Véleményük szerint az alloxán hatására H2O2 képzıdik, ami a ß-sejtekben a DNSláncok széttöredezését okozza (477). A DNS-láncok széttöredezésének "kijavítása" céljából a poli-ADP-ribóz-szintetáz NADH + H+-t használ fel, amelynek eredményeképpen csökken a sejtek NAD-koncentrációja és ez lehet az oka a kialakuló diabetes mellitus-nak (477). Itt említem meg, hogy a diabetes mellitus kiváltásában
51
használatos másik derivátum, a streptozotocin is a szabadgyök-képzıdést kiváltó tulajdonsága miatt okozza a Langerhans-sziget ß sejtjeinek károsodását azáltal, hogy a sejtekbe jutva az NO produkcióját indítja el, ami az O2.--vel peroxinitrit-gyököt hoz létre. Ezt a folyamatot és ennek az egyéb szervekben okozott általános LP-s hatását elemzik Matkovics és mtsai. egy patkánykísérlet kapcsán, amelyben streptozotocinnal váltottak ki diabetes mellitus-t (319). II. 15. 3. Halotán A halotán az aneszteziológiában gyakran használt inhalációs narkotikum. Használata az orvosi és az állatorvosi gyakorlatban is elterjedt. Ez a derivátum is fokozhatja az LP-s folyamatokat, mert metabolizmusa során belıle peroxid-gyök (CF3CHClOO.) képzıdhet (409). Gyakori tapasztalat, hogy alkalmazását követıen májkárosodás jön létre, amit a májkárosodást jelzı vérparaméterek (pl. AST-, ALTGGT-aktivitás stb.) változása is jeleznek. Az általa kialakított károsodás súlyosságát számos hajlamosító faktor (pl. genetikus eredet, ismételt alkalmazás, nıi nem, életkor, elhízás, intrahepatikus hypoxia stb.) befolyásolja (148). A halotán LP-t fokozó tulajdonságát érdemes figyelembe venni, nemcsak a hepatotoxicitás miatt, hanem abban az esetben is, ha a szabadgyök-képzıdés vizsgálatát mőtéti elrendezés során tervezzük. II. 16. Egyes természetes kórfolyamatokban jelentkezı LP-s reakciók A szabadgyökös folyamatok felgyorsulásának nagy jelentısége van a különbözı kórképek kialakításában, illetve a kóros állapotok súlyosbításában. Ezek a folyamatok elsıdleges okként is szerepelhetnek, azonban általában másodlagosan jelentkeznek és ezzel alapvetıen megváltoztathatják a folyamat kimenetelét. A fıbb folyamatokban részt vevı enzimek, szubsztrátok, metabolitok mind a növény-, mind az állatvilágban megtalálhatók és nemcsak tulajdonságaikban, de felépítésükben is sok hasonlatosságot mutatnak. Ezeknek a folyamatoknak a vizsgálatához az állatvilágban széleskörő modellezési lehetıségeink vannak. A kóros gyökreakciók hasonló alapon ugyan, mégis a fajtáktól függıen, széles diverzitást mutatnak, az általuk kialakított kórképek jelentısen eltérıek lehetnek. Néhány fontosabb kórfolyamatra ebben a fejezetben térek ki. Ahol lehetett, ott a kérıdzıkben és a kutyákban megfigyeltekre összpontosítottam. II. 16. 1. Gyulladásos, fertızéses és immunológiai eredető LP-s hatások különbözı állatokban Commins és mtsai. a Babesia bovis szarvasmarhák vörösvérsejtjeire kifejtett hatását vizsgálták (112). Megállapították, hogy a parazitás fertızöttség során a sejtek E-vitamintartalma csökkent, az MDA- és az összlipid-koncentráció emelkedett. Az MDA emelkedését az oxigén eredető szabadgyökök károsító hatásának tekintették. Véleményük szerint a fertızıdés a fagocita sejtek (macrophagok, neutrophilok) aktivációját vonja maga után, és ezek termelik az oxidáló ágenseket, másrészt a parazita és a gazdaszervezet interakciója valószínőleg vasionok által katalizált folyamatok révén a gyökök képzıdését is maga után vonja. Az E-vitamin-csökkenés okát abban látják, hogy
52
az a növekvı gyöktermelés hatására felhasználódik. Az arachidonsav-metabolizmus termékeit a prosztaglandin-E2-t (PGE2), a prosztaglandin-F2-t (PGF2), a tromboxán-B2t Atroshi és mtsai. vizsgálták a tejelı tehenek tıgygyulladása során (16). Azt találták, hogy az említett gyulladásos mediátorok koncentrációja a vérben és a tejben egyaránt emelkedett, és ez az emelkedés szoros összefüggésben volt a tej sejtszámának, valamint elektromos vezetıképességének növekedésével. Ugyanakkor fordítottan arányos volt a tej E-vitamin-koncentrációjával. A tıgygyulladásban szenvedı tehenek vörösvérsejtjeinek GSH-Px-aktivitása, GSH- és E-vitamin-koncentrációja is alacsonyabb volt a kontrollok értékeihez viszonyítva. Atroshi és mtsai. egy késıbbi közleményben leírták, hogy a tıgygyulladásos tehenek vérplazmájában az alkalikus-foszfatáz-aktivitása és az LP mértéke 44%-kal és 38%-kal nagyobb, a GSH-Px-aktivitása kisebb volt, mint az egészségesekben (14). A szerzık gyanítják, hogy ezek a leletek összefüggésben vannak a tıgygyulladásos állatokban kialakult fokozott prosztaglandinképzıdéssel, valamint az oxidatív stresszel. II. 16. 2. A hyperglycaemia LP-s hatásai A hyperglycaemia szabadgyököket és fokozott LP-t indukáló kórforma. Számos vizsgálat igazolta, hogy a nagy vércukor-koncentrációjú emberek egyes szerveiben, sejtjeiben olyan rendellenességek tapasztalhatók, amelyek az in vitro elıidézett fokozott LP során is észlelhetık (176). Megállapították, hogy az emberi diabetes mellitusban a vörösvérsejtek élettartama rövidebb (322), a sejtek aggregációra való hajlama nagyobb (439), kettıs membránjuk amino-foszfolipid elrendezıdése megváltozik, és növekszik a vörösvérsejtek adherenciája az endotheliális sejtekhez (242). Emberi vörösvérsejteken in vitro (240), valamint patkányok (241) és nyulak vörösvérsejtjein in vivo végzett vizsgálatok nyomán bizonyították, hogy a sejtmembránon kialakuló fokozott LP során szintén az elıbb említettekhez hasonló változások következnek be (240). Ugyancsak igazolták, hogy néhány antioxidáns enzim (GSH-Px, SOD, CAT stb.) aktivitása (176), valamint egyes, az LP-ben szerepet játszó szubsztrátok (MDA, GSH, H2O2, peroxizsírsavak stb.) koncentrációja a cukorbetegség során is változásokat mutat (242). Kimutatták, hogy huszonöt és harmincöt év közötti cukorbeteg emberek vörösvérsejtjeinek GSH-Px- aktivitása fokozódik, SOD-aktivitásuk pedig csökken (316). Más vizsgálatok azt bizonyítják, hogy a diabeteses emberek vörösvérsejtjeinek membránjában az LP-s folyamatok végtermékeként keletkezı MDA koncentrációja magasabb szintet mutat, mint az egészségesek esetében (241). A cukorbetegek vörösvérsejtjeiben a szabadgyököket indukáló reakciók fokozódásának részletes magyarázata még nem teljesen ismert, mégis valószínősíthetı okát az adja, hogy a cukor, mint más α-hidroxialdehidek redukálni képesek a molekuláris oxigént a fémionok katalitikus hatásának segítségével (316). Ennek eredményeképpen α-ketoaldehidek és oxigén intermedierek képzıdnek (525). Valószínősíthetı az is, hogy a glükóz autooxidációja során lassanként H2O2 és hidroxil-szabadgyökök képzıdnek. Bizonyították továbbá, hogy ha egy ilyen autooxidáción átesett glükózmolekula fehérjemolekulával érintkezik, abban struktúrális változásokat és fragmentációt idézhet elı in vitro (229).
53
II. 16. 3. A gastrointestinalis tractus gyulladásos folyamataiban jelentkezı LP-s hatások A szabadgyökök gyulladásos folyamatokban való részvételérıl már a bevezetıben volt szó, ilyenkor a fagocitasejtek saját maguk termelik a gyökként viselkedı reaktív molekulákat, molekulafragmenseket. A gyulladásos bélbetegségek során Parks szerint az emberek bélfalában fehérvérsejtek halmozódhatnak fel, az általuk termelt reaktív oxigén intermedierek a nyálkahártyák permeabilitását fokozhatják. Ezek a folyamatok gyakran társulhatnak a különbözı fokú ischaemia, majd reperfusio jelenségeivel, amelyekben a xantin-oxidáz révén a hipoxantin és a molekuláris oxigén reakciója játssza a vezetı szerepet (380). Hasonló módon a hasnyálmirigy heveny gyulladásos elváltozásaiban is megfigyelték a szabadgyökök képzıdését, illetve a gyulladás létrejöttében ezen folyamatok jelentıségét. Parks és mtsai. kimutatták, hogy a kutyákban kísérletesen elıidézett hasnyálmirigy-gyulladásban a beadott CAT és SOD hatására jelentısen csökkent a pancreas-oedema és a szérum-amiláz aktivitásának értékei csökkentek (379). II. 16. 4. A máj funkciózavarában jelentkezı LP-s hatások A májkárosodások létrejöttében is nagy jelentıségőek lehetnek a szabadgyökök által indukált mechanizmusok. Egyes szerzık megfigyelték, hogy emberekben az epeköves betegek vérplazmájában és májában fokozottabb LP jelentkezett az egészségesekhez viszonyítva, a sárgaságot mutató betegek értékei pedig még jelentısebb LP-fokozódást jeleztek. Azt is megállapították, hogy az E-vitamin-koncentráció jelentısen kisebb volt mind a sárgaságot mutató, mind a sárgaságot nem mutató betegek vérplazmájában (494). A primer biliáris cirrhosis létrejöttéért többen a májszövetben felhalmozódó réz-ionokat teszik felelıssé (137), bár egyesek a réz toxikus hatását nem tekintik nagy jelentıségőnek ebben a betegségben (141). Fehér és mtsai. számos munkájukban foglalkoznak a májmegbetegedések és az LP kapcsolatáról különbözı betegségek és toxikózisok kapcsán, természetes és modellezett viszonyok között (147) (148) (149). Blázovics kísérletes körülmények között igazolta az LP meghatározó szerepét a májelzsírosodás patomechanizmusában (61). Bedlington terrier kutyákban megfigyelték, hogy a réz öröklıdı májbeli akkumulációja révén krónikus aktív hepatitis és cirrhosis alakult ki. Számos paraméter vizsgálata alapján megállapították, hogy a kialakuló progresszív májdegeneráció mellett a májban fokozódott az LP, ugyanakkor az MDA-koncentráció a várttal ellentétben csökkent. A szerzık ezt az ellentmondást a májszövetben felhalmozódó nagymennyiségő réz okozta labormetodikai hibának tulajdonítják (228). Mudron és mtsai. igazolták, hogy a baloldali oltógyomor-helyzetváltozással mőtött tejelı tehenek májában megnıtt a TG-koncentráció, azonban az E-vitamin-koncentráció csökkent a májban és a vérplazmában, ugyanakkor a májban az MDA-koncentráció magasabb szintet mutatott a kontrollokéhoz képest (352). Bodnár és mtsai. igazolták, hogy tejelı tehenek közül azok, amelyek mája nagyobb zsírtartalmú volt, a vérplazmájukban és a vvs-jeikben az MDA-koncentráció értékek nagyobbak, a vérplazma GSH-Px-aktivitási értékek kisebbek, és a vvs-jeikben a CAT-aktivitási értékek szintén kisebbek voltak a kontroll, élettani májzsírtartalmú állatok értékeihez képest (63).
54
Sasinanea és mtsai. azt tapasztalták, hogy ha juhok takarmányát a szükségleti értékeknél nagyobb mennyiségő rézsókkal egészítették ki, akkor az állatokban hemolízis lépett fel, a vérszérum savanyú-foszfatáz-aktivitása emelkedett, a máj Cu-tartalma, az LP mértéke és a SOD-aktivitása fokozódott, a GSH-koncentrációja csökkent (437). II. 16. 5. A vizeletkiválasztó rendszer kórfolyamataiban jelentkezı LP-s hatások Nemcsak a gastrointestinalis szervek kórfolyamataiban tapasztalható a szabadgyökös elváltozások szerepe, hanem a húgyúti szervek, fıképp a vese elváltozásaiban is. Itt is megfigyelhetı a gyulladásos mechanizmusokban a szabadgyökök károsító hatása. Egerekben immunkomplexekkel glomerulonephritist idéztek elı, aminek következtében neutrophilok és monocyták halmozódtak fel a vese szövetében, jelentıs mérétkő fehérjevizelés jelentkezett és a veseszövetbeli SOD aktivitása csökkent (370). Az állatoknak a H2O2 hatásainak kivédése céljából SOD-ot és CAT-ot adtak, ennek hatására nem szignifikánsan ugyan, de enyhült a fehérjevizelés mértéke. A dimetiltiourea hatására, ami hidroxilgyök-scavenger, szignifikánsan csökkent a proteinuria. Ezek alapján a szerzık feltételezik a szabadgyökök (fıképpen a hidroxilgyök) jelentıségét az immunkomplex glomerulonephritisben. Asayama és mtsai. krónikus veseelégtelenségben szenvedı betegek fehérvérsejtjei közül a lymphocytákban és a monocytákban vizsgálták a SOD aktivitását, és azt találták, hogy ezekben a sejtekben fokozódott az enzimaktivitás, ugyanakkor a vörösvérsejtekben és a plazmában sem a SOD-, sem a CAT-aktivitás változását nem tapasztalták. Az MDA-koncentráció viszont emelkedett a vérplazmában (13). Andreoli egy összefoglaló írásában arról tájékoztat, hogy igen sok vesebetegség, pl. a glomerulonephritis, a toxikus nephropathiák, a pyelonephritis és a heveny veseelégtelenség kialakulásában és következményeiben fontos szerepet játszanak az oxigén eredető károsító mechanizmusok (10). II. 16. 6. Az izomdegenerációban jelentkezı LP-s hatások különbözı állatokban Alacsony szelén- és E-vitamin-tartalmú takarmányon tartott borjak vérében csökkent α-tokoferol-koncentrációt és GSH-Px-aktivitást mértek, a CK-aktivitás a plazmában megnıtt és az állatok az enyhe izomdegeneráció klinikai jeleit mutatták. Takarmányukat PUFÁ-val (linolénsavval) kiegészítve a plazmájukban a CK-aktivitás, jelentıs mértékben növekedett, súlyos szív- és tüdıbetegség tüneteit mutatták, az EKGvizsgálattal szívizom-degenerációra utaló jeleket találtak, és myoglobinuria is jelentkezett (261). Angliában 1975-80-ig az izomdegenerációt mutató szarvasmarhákat klinikai és laboratóriumi vizsgálataik alapján hasonlították össze. Azt találták, hogy a borjakban a leggyakoribb klinikai tünetek a nehezített légzés, a mozgási, a testtartási zavarok és a hirtelen halál voltak, a tehenekben azonban a tünetek az ellési bénuláshoz hasonlítottak. Megfigyelték, hogy ezen esetek oktanában a takarmány alacsony szelén- és E-vitamin hiánya állt. A tünetek megjelenése összefüggött a hideg, esıs idıjárással, az állatok hirtelen mozgatásával, a nehézelléssel, a takarmányváltással, az együtt tartott állatok létszámának emelésével. A betegség elıfordulását szelénpótlással csökkenteni lehetett (68). Hasonló tünetek jelentkeztek vemhes, tejelı tehenekben alacsony Evitamin- és szelénbevitellel kapcsolatban. Az állatok kötötten mozogtak, egyesek
55
elfeküdtek, az ellési bénuláshoz hasonló tünetek nem múltak el a konvencionális terápia hatására. Az ellés után elhullott, vagy levágott állatokban váz- és szívizomelfajulást találtak, míg borjaikban nem tapasztaltak izomdegenerációra utaló jeleket. Az életben maradt tehenek nagy részében magzatburok-visszamaradás is elıfordult (183). Az E-vitamin és a szelén hiányában fellépı izomelváltozás a juhfajban a legjelentısebb, ugyanis évtizedek óta ismert, hogy a takarmány megnövekedett peroxidtartalma, fokozott "avasodása" az ún. alimentáris eredető izomelfajulást okozza (256). A kórkép kifejezett fajtajellegének vizsgálata céljából széleskörő kutatásokat végeztek juhokon is. Egy vizsgálat alapján egyéves korú bárányokaban E-vitamin- és szelénhiánnyal összefüggı izomdegenerációt találtak. A szérum AST-aktivitása emelkedett, az alacsony vérbeli Se- és E-vitamin-koncentráció mellett. A szerzık felhívják a figyelmet arra, hogy ezek a tünetek nem téveszthetık össze a szopós bárányokban tapasztalható hasonló klinikai képet mutató izomdegenerációs formával, amelynél a vér szelén-koncentrációja normális szintő (308). A lovak myoglobinuriájához hasonló, izomfestékvizeléssel járó, megerıltetés utáni vázizomdegenerációt (rhabdomyolysis) figyeltek meg juhokban, amikor kutyák szabadultak be juhok istállójába és többnek az elhullását is okozták. Ezeknek az állatoknak élettani szintő volt a vér Se-koncentrációja. A szerzık szerint ebbıl arra lehet következtetni, hogy az izomdegeneráció kialakulásában fontos, de nem minden esetben oktani, hanem valószínőleg következményes tényezı a tapasztalható fokozott LP (384). A juhokhoz hasonló izomkárosodásos jelenségeket kecskegidákban is találtak. Az izomdegenerációt mutató kecskék vérében alacsony szelén- és E-vitamin-koncentrációt találtak. A szerzık azt gyanítják, hogy a kecskék izombetegségeinek gyakori elıfordulása a többi kérıdzıhöz képest azzal függ össze, hogy nagyobb a szelén- és E-vitaminigényük (406). II. 16. 7. Hypoxia - reperfusió LP-s hatásai A szabadgyökök okozta károsodások egyik legjellemzıbb formája a hypoxiát követı reperfusióval függnek össze. Ha a szöveti véráramlás csökken vagy leáll, akkor a szöveti károsodás gyakran nem az ischaemiás fázisban, hanem a reperfusiókor (a szöveti véráramlás helyreállásakor) jön létre. Bizonyították a szabadgyök-reakciók szerepét intestinalis ischaemia modellekben, valamint több szerv mellett a máj és a vese természetes úton jelentkezı és mesterségesen elıidézett ischaemiája vagy transzplantációja során, vagy agyi traumák esetén stb. (132). Az orvosi, állatorvosi gyakorlatban is nagy jelentıséggel bírnak a hypoxia-reperfusióval összefüggı problémák. Leggyakrabban az emberek bélelzáródása, a csecsemık vastagbélinvaginatioja, a kutyák gyomorcsavarodása, valamint a kisállatok (kutyák, macskák) és a lovak ileusos (bélelzáródásos, bélcsavarodásos) betegségeinél találkozunk az ilyen alapon kialakuló szabadgyökös károsító hatásokkal. A hypoxia-reperfusio során jelentkezı szabadgyökös károsodások témaköre az eddigiekben vizsgált körülményekhez képest sokkal egyértelmőbb okokra vezethetı vissza. Megfigyelték, hogy ha a szöveti véráramlás csökken vagy leáll, akkor a kezdeti sérülés a szövet kapillárisainak fokozott permeabilitásához és az ödémaképzıdéshez vezet. A szöveti károsodást kialakító tényezık fıképp a reperfusiókor jönnek létre. A
56
reperfusiót a hypoxiás helyzethez képest relatíve hyperoxiásnak tekinthetjük. Elıször Granger és mtsai. bizonyították a szabadgyök-reakciók szerepét macska intestinalis ischaemia modelljében (189). A xantin-oxidáz volt az elsı dokumentált biológiai forrása a ischaemiás vékonybélben képzıdı szuperoxid anion gyöknek (O2.-), bár az enzim in vivo formája nem O2.- gyököt képzı enzim (D-típus), de szulfhidril-oxidációval vagy mérsékelt proteolízis során irreverzibilisen gyökképzıvé (O-típussá) alakul: hipoxantin + H2O + 2O2 ⇒ O-típus ⇒ xantin + 2O2.- + 2H+ xantin + H2O + 2O2 ⇒ O-típus ⇒ húgysav + 2O2.- + 2H+ + hipoxantin + H2O + NAD ⇒ D-típus ⇒ xantin + NADH + H+ xantin + H2O + NAD+ ⇒ D-típus ⇒ húgysav + NADH + H+ Azt is igazolták, hogy ischaemia hatására nagyon gyorsan végbemegy a D - O konverzió. Mivel, a hypoxiás sejt energiatartalma gyorsan csökken, és a kationgradiens fenntartása energia-függı folyamat, így valószínő, hogy a hypoxia vezet az ionizált kalcium intracelluláris beáramlására. A Ca2+-influx egyes, kalmodulin által szabályozott proteolitikus enzimeket aktivál, amik felelısek a D - O konverzióért (331). A xantinoxidáz kinetikus tulajdonságának megváltozása az ischaemiás szövetben önmagában nem elegendı a szabadgyökös károsodások létrejöttéhez, ahhoz szubsztrátokra is szükség van. Az elsı szubsztrát a hipoxantin, felhalmozódását kimutatták az ATP katabolizmus eredményeképpen ischaemiás szövetekben (62). Hypoxia esetén az ATP defoszforilálódik, ami az ADP, majd további energia hiányában az AMP-szintet növeli a sejtekben. Az AMP ezután tovább katabolizálódik adenozinná, inozinná és végül hipoxantinná. A másik szubsztrát, amire szükség van, az maga az oxigénmolekula, amely a reperfusiokor kerül az ischaemiás szövetbe (331). A D-típusú xantin-oxidáz másik neve, a xantin-dehidrogenáz, egyes szerzık szerint ez az ami a NAD-ot NADH + H+-ra redukálja (285). A hypoxia során az említett Ca2+beáramlás és kalmodulin-aktiváció hatására a sejtmembránok károsodnak, így a foszfolipázok aktivitása is fokozódik. Ez a szabadzsírsavak membránból történı kiszabadulását erdeményezi, majd ezáltal az arachidonsav-kaszkád is aktiválódik. A gyökképzıdés fı helye az intestinalis endothelium (285). Parks és mtsai., valamint Del Maestro ischaemia - reperfusios modellen végzett kísérleteikben kimutatták, hogy az O2.- -bıl másodlagosan a Haber-Weiss-féle reakció során keletkezı OH.- lehet a felelıs az észlelt vascularis permeabilitás változásáért (379) (129). Amióta igazolták az OH.--nak a reperfusiós károsodásokban betöltött meghatározó szerepét, egyes kutatócsoportokban felmerült, hogy maga a xantin-oxidáz lenne a felelıs ennek az igen toxikus gyöknek a kialakulásáért. Britigan és mtsai. bizonyították, hogy nem a xantin-oxidáznak, hanem a vas-ionok katalizáló hatásának van az OH.--képzésben meghatározó szerepe (75). Bizonyítást nyert, hogy maga a xantin-oxidáz hatására képzıdött szuperoxidanion-gyök az Fe3+-t redukálhatja Fe2+-ra, aminek következtében az intracelluláris ferritinbıl vas szabadul ki, ami tovább oxidálódik a reperfusiókor. Ennek során a Fenton-reakcióhoz megfelelı katalizátor is rendelkezésre áll, így adott minden a legtoxikusabb szabadgyök, a HO.- képzıdésére (285). A szabadgyökök fokozott képzıdésének hatására kifejezetten károsodnak a sejtmembránok, a nukleinsavak, a struktúrális- és az enzim-fehéréjék. Ugyanakkor az oxigén eredető szabadgyök-képzıdés hatására a neutrophil granulocyták kemotaxisa és a sérült endothelhez való adherenciája is megfigyelhetı, majd a sejtek granulumjaiban
57
képzıdı oxigén eredető gyökök és a halid-gyökök hatására tovább súlyosbodik a folyamat (285). Kubes igazolta, hogy macskák vékonybél hypoxia-reperfusiós károsodásában az NO-donorként ismert L-arginin révén a szervezetbe juttatott NO kivédte a súlyosabb károsodásokat, míg az L-NAME, ami NO-megkötı hatású, súlyosbította a bélfal permeabilitását és a szöveti nekrotikus folyamatokat (279). A szerzı említést tesz arról is, hogy más vizsgálatokkal azt bizonyították, hogy az L-NAME hatékonynak bizonyult a szívizom-kontrakció megtartásában endotoxinsokk esetén, míg az L-arginin súlyosbította azt. A szerzı feltételezi a bélfal és a szívizom eltérı érzékenységét az NO hatásaira. A vastagbélben kialakuló ischaemiás károsodások elıidézıje valószínőleg nem a xantin-oxidáz-mechanizmus, mert a vékonybéllel ellentétben a vastagbél xantin-oxidáz aktivitása relatíve alacsony. A vastagbél nyálkahártyája azonban gazdag aldehidoxidázban, amely képes a reaktív oxigén intermedierek (ROI) felszabadítására (379). Nemcsak a bél kerülhet hypoxiás állapotba. A myocardiális infarktus kórtanával kapcsolatban számos szerzı igazolta a hypoxia-reperfusió okozta fokozott LP károsító hatását (264) (534) (38). A vese mesterségesen elıidézett ischaemiája során nyúlkísérletben tapasztalták, hogy az OH.--scavanger mannitol és klórpromazin szintén protektív hatásúnak bizonyult (380). Kimutatták, hogy az antioxidáns hatású, multivitamin-tartalmú infúzió (amely C-, E-, A- vitaminokat, valamint B-vitamin komplexet tartalmazott) adása emberekben a vesetranszplantáció során a reperfusio elıtt adva jótékony hatásúnak bizonyult, amit az MDA-koncentráció csökkenésével igazoltak (402). Hasonló jelenségeket lehetett tapasztalni a sokk kialakulásában is. A sokk során jelentkezı szelektív vasoconstrictió révén a béltraktusban az ATP a hypoxiás szövetekben lebomlik és hasonló módon, mint az elıbb említett bélischaemia során, a keletkezı hipoxantin a vérkeringésbe kerül (380). A szövet- illetve szervtranszplantációk során szintén hasonló retrospektív következtetést vonhatunk le annak alapján, hogy ha a hypoxiás, beültetésre váró vese tápfolyadékába antioxidánsokat pl. allopurinolt (xantin-oxidáz-inhibitort) adnak, akkor javul a poszttranszplantációs vesefunkció (380). A vesetranszplantáció során más szerzık a vér E-vitamin- és myeloperoxidáz- (MPO) szintjét vizsgálták. Mind a rövidebb, mind a hosszabb ideig tartó ischaemiát követı reperfusio során azt tapasztalták, hogy a vér Evitamin szintje jelentısen csökkent, míg az MPO értékei nıttek (389). A kutyákban is gyakran találkozunk a hypoxia - reperfusio problémakörével. A gyomorcsavarodás során biztos és tartós megoldásnak a mőtéti kezelés bizonyul. A sikeres mőtétet követıen a reperfusio során hosszabb-rövidebb idı múlva sokszor elhullanak a betegek. Ennek okát keresve egyes szerzık kimutatták az LP-s hatásokat, amelyeknek kialakulásáért a xantin-oxidázt teszik felelıssé. Azt tapasztalták, hogy allopurinollal az LP-s hatások részben kivédhetıek voltak (26). Az LP-változások más bizonyításaként Lantz és mtsai. kimutatták az MDA-koncentráció szöveteken belüli emelkedését. Azokban a kutyákban, amelyek a reperfusio után elhullottak, súlyos nekrotikus gastritis, enteritis, májelégtelenség és tüdıödéma jelentkezett. Ugyanebben a kísérletben azt találták, hogy a reperfusio után kialakult változásokat az allopurinol kisebb, a deferoxamin nagyobb mértékben védte ki (286). A deferoxamin hatékonyságát gyomorcsavaros kutyák reperfusios károsodásainak kivédésére Lantz és mtsai. késıbb is igazolták (287).
58
III. ANYAG ÉS MÓDSZER A kísérletekben alkalmazott analitikai és kiegészítı módszerek III. 1. A vérvételek módja A vizsgálatokhoz szükséges vérmintákat szarvasmarhák, juhok és patkányok esetében a vena jugularisból, a kutyákon végzett kísérletek során a vena cephalica antebrachiibıl vettem. Kétféle véralvadásgátlót alkalmaztam. A hematológiai vizsgálatok céljára vett mintákhoz kálium-etiléndiamin-tetraecetsavat (K-EDTA), a szérum biokémiai és az LP-s paraméterek vizsgálatához lítium-heparint használtam alvadásgátlóként. III. 2. A vérminták elıkészítése Az LP-s változások vizsgálatához szükséges paramétereket mosott vörösvérsejtek hemolizátumából mértem. A vérmintákat 2000/perc fordulatszámon 10 percen keresztül centrifugáltam Janetzky-540 típusú hőtıcentrifugával. A vérplazma leszívása után 1 ml vörösvérsejtre 4 ml 0,9%-os NaCl oldatot rétegeztem, az elegyet óvatosan összekevertem, majd a centrifugálást megismételtem. A vörösvérsejtek mosását mintánként háromszor végeztem. A 0,5 ml-nyi mosott vörösvérsejtet kipipettáztam, majd 1:9 arányban kétszer desztillált vízbe mostam. Ezután néhány erıs mozdulattal összeráztam, hogy a hemolízist elısegítsem. A mintákat a vizsgálandó paramétereknek megfelelı számban 0,5 ml-es adagokban -18 oC-on mélyhőtıben tároltam. A paraméterek meghatározása a vérvételtıl számítva 2 héten belül megtörtént. A meghatározások elıtt a fagyasztott mintákat szobahımérsékleten (21 oC-on) lassan engedtem fel. III. 3. Az alkalmazott laboratóriumi módszerek III. 3. 1. Az LP-s paraméterek meghatározására alkalmazott laboratóriumi módszerek
III. 3. 1. 1. Malondialdehid (MDA) Az MDA a többszörösen telítetlen zsírsavak peroxidációja során keletkezı végtermék. Kimutatásának lényege, hogy a tiobarbitursav (TBA) hı hatására savas közegben a dioxo-MDÁ-val reagálni képes, a reakció során sárgás-vöröses vízben oldható komplex keletkezik, amely 532 nm-en elnyelési maximumot ad, így kolorimetriás eljárással mérhetı. Az abszorbancia koncentrációfüggı (391). Valójában össz-TBA-reaktív anyagmennyiséget mértem, de MDÁ-val számoltam, mert Placer és mtsai., akik ezt a módszert elıször alkalmazták, a kalibrációs görbét MDÁ-val készítették. A vizsgálataim során az említett módszert alkalmaztam Matkovics és mtsai. által módosított formában (324). Részletesen lásd: Mellékletek fejezet.
59
III. 3. 1. 2. Redukált glutation (GSH) A redukált glutation vizsgálatát az ún. Ellman-féle reagens (5,5'-ditiobisz-2nitrobenzoesav, DTNB) segítségével végeztem, amelynek lényege, hogy az az SHcsoportokkal lúgos közegben reagálni képes, és sárgás színő terméket hoz létre, amely spektrofotométerrel 412 nm hullámhosszon mérhetı. Az SH-csoportokat ugyan a vvsekben több molekula tartalmazhat, de döntıen a GSH-ból származik (447). Ezt a módszert Matkovics és mtsai. által módosított formában alkalmaztam (324). Részletesen lásd: Mellékletek fejezet. III. 3. 1. 3. Glutation-peroxidáz (GSH-Px) A glutation-peroxidázt szintén az Ellmann-féle reagens segítségével, két szubsztrát, a kumén-hidroperoxid és a GSH felhasználásával határoztam meg. Ennek a meghatározásnak lényege, hogy a GSH-Px 37 oC-on idıegység alatt adott mennyiségő H2O2-t képes bontani a GSH oxidálása közben. A feleslegben adott GSH mérése után adtam a rendszerhez a H2O2-t, majd inkubálás után vizsgáltam a maradék GSH mennyiségét (291). Ezt a módszert Matkovics és mtsai. által módosított formában alkalmaztam (324) (321). Részletesen lásd: Mellékletek fejezet. III. 3. 1. 4. Szuperoxid-dizmutáz (SOD) A szuperoxid-dizmutáz mérése azon az elven alapul, hogy ez az enzim lúgos közegben (pH: 10,2) képes az adrenalin rózsavörös adrenokrómmá való átalakulását gátolni. Ez a módszer kinetikus mérést igényel, a kiírószerkezettel ellátott (UV-VIS) spektrofotométer a színintenzitás idıbeli változását grafikonszerően kirajzolja. A SOD egy egységnyi (Egység = Unit, U) aktivitására utal az 1 perc alatti 50%-os gátlás a kontrollal (SOD nélküli spontán adrenalin ⇒ adrenokróm átalakulás) összhasonlítva (347) (321) (323). Részletesen lásd: Mellékletek fejezet. III. 3. 1. 5. Kataláz (CAT) A kataláz mérése azon alapul, hogy ez az enzim képes bontani a 240 nm hullámhosszúságú fényben maximális elnyelıdést mutató H2O2-t (48). A rendszerhez adott H2O2 idıegység alatti bontásának mértéke, vagyis a minták abszorbanciájának csökkenése arányos a CAT aktivitásával. A CAT-aktivitást Bergmeyer-egységben (BU) adjuk meg. Ezt a módszert Matkovics és mtsai. által módosított formában alkalmaztam (321). Részletesen lásd: Mellékletek fejezet.
III. 3. 1. 6. E-vitamin A vérplazma, a tej és a takarmány E-vitamin-tartalmának meghatározása azon az elven alapul, hogy a Fe/III/-klorid redukáló ágens (pl. α-tokoferol) jelenlétében Fe/II/kloriddá alakul, amely 2,2-dipiridillel vörös színő komplexet képez, miközben az α-
60
tokoferol kinonná oxidálódik (58). A komplex 520 nm hullámhosszon abszorbanciamaximot ad. A spektrofotométeres mérés során a minták abszorbanciája, vagyis a komplexképzıdés mértéke utal az E-vitamin koncentrációjára. Részletesen lásd: Mellékletek fejezet. III. 3. 1. 7. Összkarotin A vérplazma, a tej és a takarmányok összkarotin tartalmának meghatározása azon az elven alapul, hogy a minták fehérjementesítése után a lipidoldékony anyagok petroléteres "kirázással" kivonhatók és e fázisban a karotinoidok 452 nm-es hullámhosszúságú fényen abszorbanciamaximumot adnak. A spektrofotométeres mérés során a minták abszorbanciája arányos az összkarotin-koncentrációval (58) (79). Részletesen lásd: Mellékletek fejezet. III. 3. 2. Egyéb biokémiai paraméterek meghatározásához használt laboratóriumi módszerek A kiegészítı klinikai biokémiai laboratóriumi vizsgálatokat a Diagnosticum Kft. által forgalmazott reagens-kittekkel végeztem a javasolt elıírások szerint. Részletesen lásd: Mellékletek fejezet. A validálási vizsgálatok az Állatorvostudományi Egyetem Belgyógyászati Tanszék és Klinika klinikai laboratóriumában havonta történtek. A savbázis paraméterek meghatározásához ABL4-es (Radiometer, Copenhagen) típusú vérgázanalizátort használtam, aminek kalibrálása 3 óránként történt a gyár által forgalmazott kalibráló oldatok segítségével. III. 3. 3. A hematológiai paraméterek meghatározásához használt laboratóriumi módszerek A kísérletek során a rutin hematológiai paramétereket Twincell (Diatron Kft.), valamint Baker 8000- típusú hematológiai analizátor segítségével állapítottam meg. Ezeket a mőszereket a gyártó, ill. a szervízt irányító cég az adott állatfaj vérmintáira kalibrálta. III. 3. 4. A vizeletvizsgálat során alkalmazott laboratóriumi módszerek A vizeletvizsgálatot egyrészt a rutinvizsgálatok során megszokott Uriscan (Yeongdong, Pharamceutical Corp., Korea) tesztcsíkkal végeztem. A tesztcsík a vizelet különbözı paramétereinek meghatározásához szemikvantitatív eljárást biztosít. A kísérletek során tesztcsíkot az alábbi paraméterek meghatározásához használtam: vizelet cukorkoncentrációja, vizelet Hb-tartalmának meghatározása, pH. A cukorürítés súlyosságát +/- jellel és különbözı számú + jellel jelöltem, ahol: +/-: 2,5-5,5 mmol/l-nek, +-5,5-10,0 mmol/l-nek, ++- 10,0-14,0 mmol/l-nek, +++-14,0-28,0 mmol/l-nek, ++++->28,0 mmol/l-nek felel meg. A hemoglobin vizeletbeli megjelenésének mértékét szintén +/- jellel és különbözı számú + jellel jelöltem, ahol: +/-: 1,0-3,0 g/100 ml-nek, +- 3,0-6,0 g/100 ml-nek, ++-6,09,0 g/100 ml-nek, +++-9,0-12,5 g/100 ml-nek, ++++->12,5 g/100 ml-nek felel meg.
61
A vizelet pH-ját a tesztcsíkon lévı pH-indikátor zóna színváltozása alapján határoztam meg. A vizelet fehérjetartalmát a szemikvantitatív szulfoszalicilsavas próbával határoztam meg. Ennek a próbának a lényege, hogy a 20%-os szulfoszalicilsav a vizeletben lévı fehérjéket kicsapja, és ez a folyamat abban különbözı mértékő zavarosodást okoz. A próbát az alábbi módon végeztem: kémcsıbe kb. 2 ml-nyi mennyiségő vizeletet pipettáztam, majd abba 3-4 csepp 20%-os szulfoszalicilsavat cseppentettem. A fehérjekicsapódás okozta zavarosodás mértéke arányos a vizelet fehérjetartalmával. A zavarosodás mértékét +/- jellel és különbözı számú + jellel jelöltem, ahol: +/-: 0,5-2,0 g/l-nek, +-2,0-5,0 g/l-nek, ++-5,0-10,0 g/l-nek, +++-10,0-20,0 g/l-nek, ++++-> 20,0 g/lnek felel meg. A vizelet ketonanyagtartalmát Ross-próbával állapítottam meg. Ez a próba alkalmas a vizeletben, a vérplazmában és a tejben megjelenı aceton és acetecetsav szemikvantitatív kimutatására. A Ross-próba lényege, hogy a próbában alkalmazott ún. Ross-reagens elszínezıdésének mértéke arányban áll a minták keton-koncentrációjával. A reagens összetétele: 1g nitroprusszid-Na, 50g vízmentes NaCO3, 100g (NH4)2SO4. Ha 0,5-1 g-nyi reagensre 2-3 csepp mintát cseppentünk, akkor annak a színe szürkésfehérrıl rózsaszínővé, esetleg püspöklilává változik. A színintenzitás mértéke arányos a minta aceton- és acetecetsav-tartalmával. A színintenzitás mértékét +/- jellel és különbözı számú + jellel jelöltem, ahol: +/-: 0,5-1,5 mmol/l-nek, +-1,5-3,0 mmol/l-nek, ++-3,0-6,0 mmol/l-nek, +++-6,0-10,0 mmol/l-nek, ++++-> 10,0 mmol/l-nek felel meg. A rutin vizeletvizsgálatban alkalmazott módszer a vizeletüledék vizsgálata is. A kísérletekben alkalmazott módszert az alábbiak alapján végeztem: kb. 5 ml vizeletet centrifugacsıbe pipettáztam, majd azt 2000/perc fordulatszámon 5 percig centrifugáltam. A vizelet felülúszóját határozott mozdulattal leöntöttem az üledékrıl és biokémiai vizsgálatokra félretettem. Az üledéket a kémcsı faláról lefolyó felülúszóval reszuszpendáltam, majd tárgylemezre cseppentettem, és fedılemezzel lefedtem. Ezután 400x-os nagyítással mikroszkóppal elemeztem az üledékben megjelenı alkotókat (pl. vvs-eket, fvs-eket, hólyaghámsejteket, vesetubulus-hámsejteket, cilindereket, kristályokat stb.). A különbözı alkotóelemek üledékben való megjelenését látóterenkénti számukkal jelöltem. III. 4. Az alkalmazott statisztikai analízisek módja A kísérletek eredményeinek statisztikai értékelését variancia analízissel (ANOVA) végeztem, az egyedek illetve csoportok közötti különbségek mérése pedig a páros Student-féle t-próbával történt. Az adatok rögzítésére és a statisztikai vizsgálatok kivitelezésére a Microsoft Excel 4.0, a SAS/SAT, valamint az SPSS számítógépes programokat használtam. A vizsgálati eredményeimet táblázatokon tüntettem fel. A táblázatokban átlagértékek és "±" jellel kiemelt szórásértékek szerepelnek. Az adott kísérleti csoportok között P<0,05 szinten szignifikánsan eltérı átlagértékeket különbözı betőkkel jelöltem (A, B, C, D stb.). Azokat az eltéréseket, amelyek szorosabb szignifikancia szinteken jelentkeztek (P < 0,01; P < 0,001), külön feltüntettem a táblázatokban.
62
IV. EREDMÉNYEK, KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK
IV. 1. A vörösvérsejtek szabadgyök reakciói élettani körülmények között szarvasmarhában és kutyában IV. 1. 1. Szarvasmarhák ontogenezise során fellépı szabadgyök reakciók Lényegesnek tartottam, hogy megfigyeljem az újszülött koruktól a 3 hónapos korukig bezáróan a szarvasmarhák szervezetében zajló élettani LP-s változásokat. Ebben az állatfajban az LP-s kutatások szempontjából viszonylag kevés vizsgálati eredmény született, azok is fıleg az E-vitamin- és a szelénhiányos takarmányok hatásaival voltak kapcsolatosak (68) (183). Ezekbıl a vizsgálatokból is kitőnik a fiatalabb egyedek fokozottabb érzékenysége az oxidatív stressz okozta következményekre. Az újszülöttkori hemolitikus anaemia, a bronchopulmonáris dysplasia, újszülöttkori retinopathia a humán pediatriában mindennaposak, de a borjak esetében is ismeretesek. A szarvasmarhában az elváltozások, a gyakorlati tapasztalatok szerint, nem az oxigén toxikus hatása miatt alakulnak ki, hanem pl. a késıbbi légzıszervi zavarok a születéskori légtelenség (asphyxia) miatt, és fıképpen a nehézellés esetén. IV. 1. 1. 1. Újszülött borjak vizsgálata A kísérlet célja A kísérletet abból a célból végeztem, hogy adatokat győjtsek a borjak újszülöttkori LP-s értékeirıl életük elsı félórájától 10 napos korukig néhány egyéb hematológiai és biokémiai paraméter változásának figyelembevételével. Vizsgálataimat kiegészítettem a tehenek hasonló paramétereinek vizsgálatával is. Anyag és módszer Kísérletemet egy tehenészeti telepen végeztem. A kísérletben hét, ellési segélynyújtás nélkül született, újszülött borjút vizsgáltam, életük elsı perceitıl kezdve két napos korukig. Az állatok születésük után a föcstejet még anyjuktól kapták, majd Steinmann-ketrecekben helyezték el ıket, ahol fölözött tehéntej és föcstej keverékét kapták. Ezen intervallumon belül összesen hét idıpontban történt vérvétel. Mintákat vettem a borjak születése után: 1. fél óra, 2. egy óra, 3. három óra, 4. hat óra, 5. tizenkét óra, 6. egy nap, 7. két nap múlva. A vérmintákból hematológiai vizsgálatot végeztem (mennyiségi vérkép, hematokritérték: Ht, hemoglobinkoncentráció: Hb), melyet kiegészítettem a vérplazma összfehérje (TP) vas- (Fe), vaskötı kapacitás(Fe-kötı kap.), valamint E-vitamin- és összkarotinkoncentrációjának meghatározásával. A vörösvérsejtek hemolizátumából pedig LP-s paramétereket vizsgáltam: MDA- és GSH-koncentrációt, valamint GSH-Px-, SOD- és CAT-aktivitást. A hét anyatehén föcstejébıl szintén E-vitamin- és összkarotinkoncentrációt határoztam meg.
63
Eredmények 1. táblázat 1/a. táblázat Az újszülött borjak életének elsı két napján megfigyelhetı néhány vvs-LP-s paraméter változása, a tehenek ugyanazon paramétereivel kiegészítve. (Az MDA- és a GSHkoncentrációt, a SOD- és a CAT-aktivitást a vvs-ek hemolizátumából vizsgáltam, az összkarotin- és az E-vitamin-koncentrációt pedig a vérplazmából.) Vérvételi idıpontok
MDA µmol/l
GSH mmol/l
GSH-Px SOD CAT ÖsszEU/g U/mg BE/g karotin vitamin fehérje fehérje fehérje mg/l mg/l A A 0. óra 225,6 2,6 39,6 20,9 8,3 1,7 3,6 ±36,2 ±0,45 ±9,5 ±1,9 ±2,0 ±0,3 ±1,7 3. óra 230,3A 2,5 43,7 24,6 9,5 1,3 A 2,8 ±22,8 ±0,34 ±12,6 ±8,7 ±1,7 ±0,5 ±0,9 6. óra 221,0A 2,5 42,0 22,2 9,2 1,2A 2,8 ±34,6 ±0,8 ±9,8 ±2,5 ±2,1 ±0,4 ±1,6 9. óra 232,7A 2,1 36,1 21,1 8,7 1,9 A 3,5 ±25,0 ±0,9 ±4,2 ±4,9 ±1,3 ±0,4 ±1,3 12. óra 232,6A 2,4 37,3 22,7 8,8 1,6 A 2,8 ±38,3 ±0,7 ±5,6 ±6,7 ±1,8 ±04 ±0,6 24. óra 256,5A* 2,3 37,1 21,7 9,8 1,5 A 3,2 ±60,3 ±0,8 ±6,7 ±2,6 ±2,2 ±0,4 ±0,6 48. óra 223,3A 2,3 35,3 21,2 8,3 1,2 A 2,9 ±63,3 ±0,6 ±2,3 ±1,0 ±1,6 ±0,6 ±0,7 tehén 263,6B* 1,5 36,6 23,5 8,4 4,0 B 3,8 ±8,5 ±0,5 ±2,1 ±2,7 ±2,0 ±1,2 ±1,3 *A borjak vvs-jeiben, a 24. órában mért MDA-koncentrációk szignifikánsan nem különböznek a tehenek értékeitıl. Az adott paraméterek oszlopain belül az azonos betőkkel jelzett értékek között nincs szignifikáns különbség. Az A-, B-jelzéső csoportok közötti különbség P<0,05 szinten szignifikáns. Az adott paraméterek oszlopain belül alapnak az 1. vérvételi idıpontban vett minták értékeit tekintettem, ezért azokat A-val jelöltem.
64
1/b. táblázat Az újszülött borjak életének elsı két napján megfigyelhetı néhány hematológiai és biokémiai paraméterek változása Vérvételi idıpontok
TP g/l
Hb Fe Fe-kötı FvsVvsHt g/100 µmol/l kap. szám szám l/l ml µmol/l x109/l x1012/l 0. óra 63,0 9,5 21,8 A 83,6 9,3 5,8 0,29 ±4,4 ±1,9 ±7,3 ±6,6 ±1,5 ±0,8 ±0,09 3. óra 60,9 9,2 19,9A 88,7 8,4 6,6 0,31 ±4,9 ±2,0 ±8,0 ±10,7 ±2,1 ±1,0 ±0,09 6. óra 57,5 9,4 15,6B* 92,7 9,1 6,8 0,32 ±4,5 ±2,1 ±5,1 ±10,1 ±2,6 ±1,3 ±0,11 9. óra 63,6 10,0 13,4B 87,2 12,0 6,6 0,30 ±4,0 ±2,1 ±5,1 ±8,5 ±4,4 ±0,6 ±0,08 12. óra 62,3 9,9 15,0B 99,7 10,4 6,6 0,31 ±4,2 ±1,9 ±4,3 ±18,4 ±1,6 ±0,8 ±0,07 24. óra 60,9 9,3 12,1C* 86,0 11,5 7,6 0,33 ±2,5 ±1,8 ±5,3 ±12,6 ±5,4 ±0,8 ±0,08 48. óra 57,4 8,2 10,5C 99,6 9,8 8,2 0,34 ±14,6 ±1,6 ±0,6 ±5,0 ±1,7 ±0,4 ±0,07 tehén 60,8 11,2 18,2 A 69,1 8,9 6,6 0,31 ±4,3 ±0,6 ±7,3 ±26,9 ±0,3 ±0,6 ±0,08 *A borjak 6. órás idıpontban mért plazmavas koncenrációi szignifikánsan nem különböznek a 24. órában mért értékektıl. Az adott paraméterek oszlopain belül az azonos betőkkel jelzett értékek között nincs szignifikáns különbség. Az A-, B-, C-jelzéső csoportok közötti különbség P<0,05 szinten szignifikáns. Az adott paraméterek oszlopain belül alapnak az 1. vérvételi idıpontban vett minták értékeit tekintettem, ezért azokat A-val jelöltem. Az E-vitamin- és az összkarotinkoncentráció a tehenek föcstejében az alábbi volt: E-vitamin: 0,65-0,9 mg/l, összkarotin: 0,75-1,22 mg/l. A vérvizsgálatok eredményét az 1. táblázat mutatja. A hematológiai vizsgálatok azt bizonyították, hogy a borjak plazmájának vaskoncentrációja fokozatosan a 24-48. órára felére, ugyanakkor a vörsvérsejtszám 30-40%-kal emelkedett. A tehenek vvs-száma az újszülött borjak értékeivel mutattak hasonlóságot. A borjak között a többi paraméterben nem találtam szignifikáns eltérést, bár a vvs-ek MDA-koncentrációjában enyhe, nem szignifikáns emelkedést a 24. órában vett mintában regisztrálni tudtam. A borjak MDAértékei (a nagy szórások ellenére), a 24. órás érték kivételével viszont szignifikánsan, mintegy 20 %-kal alacsonyabbaknak bizonyultak a tehenek értékeinél. A tehenek vvsGSH-koncentrációja, bár nem szignifikáns mértékben, alacsonyabb volt a borjak értékeinél. A CAT-, a SOD-, és a GSH-Px-aktivitási értékekben nem jelentkezett
65
szignifikáns eltérés és az átlagértékekbıl sem lehet a változás tendenciájára következtetni. Az E-vitamin-koncentráció a tehenek és a borjak vérplazmájában szignifikáns eltérést nem mutatott. A tehenek összkarotinértékei a borjakéhoz viszonyítva szignifikánsan (kb. 2-2,5-szeresével) nagyobbaknak bizonyultak (1. táblázat). Következtetések és javaslatok A föcstej összkarotin- és E-vitamin-koncentrációja az irodalmi adatoknak megfelelıen kielégítı ellátást tettek lehetıvé (16). Az újszülöttkori enyhe anaemiás állapotból a második napra már élettani értékek alakultak ki. Ebbıl az következtethetı, hogy a borjakban a vvs-képzıdés az ellést követıen hirtelen megindult, vagy legalábbis a raktárakból nagyszámú vvs jutott a keringésbe. A fokozott sejtképzıdés a vas fokozott beépülését igényli, ezért a vérszérum mobilizálható vastartalma valószínőleg erre fordítódott. Ez lehet a magyarázata annak, hogy a vérplazmában a vas koncentrációja megfogyott, ugyanis ezidı alatt a borjak csak kis mennyiségő vasat tudnak a vasban viszonylag szegény föcstejbıl felvenni. Az a tény, hogy a tehenek vvs-száma hasonló a borjak születés utáni értékeihez, élettaninak tekinthetı (239). Megállapítható, hogy a komplikációktól mentes körülmények között született borjak vvs-jeiben a vizsgált LP-s paraméterek koncentrációja, illetve aktivitása jelentısen nem változik. Az MDA-koncentráció enyhe emelkedése a 24. órában és a tehenek MDAértékeinek nagyobb volta, a születés-, illetve az ellés körüli stressznek lehet a következménye. A stersszhatásról, mint az LP-t fokozó tényezırıl Hornsby és Crivello tesz említést (224). Egyes szerzık ennek tudják be pl. az újszülött borjak vérében tapasztalható nagyobb neutrophil granulocyta-számot (45-55%) (239). A tehenek összkarotinértékeinek az újszülöttekhez képest mintegy kétszer nagyobb volta abból fakadhat, hogy a bendı raktározó funkciója révén a szálastakarmányokból a karotinfelszívódás, illetve a májból a retinol és retinil-palmitát mobilizációja folyamatos, míg az újszülött borjúmagzatok szervezetébe az A-vitamin provitaminja a β-karotin az epitheliochorialis placentán nem jut át (11). Megemlíthetı, hogy a kielégítı takarmányozás esetén az eredetileg magas összkarotinérték az ellés körüli idıben csökken, mert a karotinoidok a tıgybe mobilizálódnak (443). Ebben a vizsgálatban az újszülöttkori karotinértékek nem mutattak szignifikáns változást, de a kezdeti értékek sem kifejezetten alacsonyak. Ezzel az eredménnyel nem egyezik Bárdos és mtsai. tapasztalata, mely szerint az újszülött borjakban kifejezetten alacsonyak a karotinértékek, amelyek nınek a kolosztrum elfogyasztása után (33). Az ellentmondó eredmény a laboratóriumi módszerek különbözısége, vagy a vizsgált állatok eltérı karotinoid tartalékai miatt születhetett. A tapasztalatok, mint kiindulási adatok alapján javasolható a kóros körülmények között (pl. nehézelléssel) született borjak további vizsgálata hasonló paraméterek alapján.
66
IV. 1. 1. 2. Szopós és növendék korú borjak vizsgálata A kísérlet célja A szarvasmarhák fıként a születésük utáni idıszakban a természetestıl viszonylag eltérı tartási, takarmányozási körülmények között élnek. Ennek az oka részben a gazdaságosabb és a fertızıdésekkel szemben biztonságosabb intenzív rendszer technológiája. Ez a sajátos tartási-, takarmányozási mód adott alapot arra, hogy vizsgálatokat végezzek borjak vvs-jeinek LP-s státuszáról életük elsı három hónapjában. Anyag és módszer Egy tejelı tehenészeti gazdaságból tíz borjú vizsgálatát végeztem születésüktıl 3 hónapos korukig. Összesen hat alkalommal vettem vérmintát az alábbi idıpontokban. 1, A születést követı elsı félórában. Ügyeltem arra, hogy a vérvétel a föcstej kiszopása elıtt történjék. 2, Három napos korban. Ebben az idıszakban a borjak fölözött tehéntej és föcstej keverékét kapják, és ekkor helyezik el ıket az ún. Steinmann-ketrecekben. 3, Tíz napos korban. Ebben az idıszakban kezdıdik a szilárd takarmányra való szoktatásuk. Az állatok napi 5-7 l-nyi fölözött tehéntej és vízzel hígított tejpor (Primalac-α, Bábolna RT) keverékét kapják, valamint naponta kb. 150 g borjútáp (kukoricamagból, árpamagból, búzamagból, és lucernalisztbıl készült dercésre darált abrakkeverék), és ad libitum adagolt víz és lucernaszéna már van elıttük. 4, Harminc napos korban. Ebben az idıszakban 5-6 l vízzel hígított tejpor, 200-250 g borjútáp, valamint ad libitum adagolt víz és lucernaszéna a borjak takarmánya. 5, Hatvan napos korban. Ebben az idıszakban a borjak elhagyják a Steinmannketreceket, kiscsoportokba osztva a borjúnevelıbe kerülnek. Itt kb. 1-1,5 kg-os napi adagokban adott nevelıtápot (a borjútáphoz hasonló összetételő, de annál nagyobb energiatartalmú és ásványianyag-kiegészítıket is tartalmazó dercésre darált abrakkeverék), ad libitum adagolt lucernaszénát és vizet kapnak. 6, Kilencven napos korban. Ebben az idıszakban takarmányuk már egy hónapja naponta, kb. 2 kg-nyi nevelıtáp, lucerna- és rétiszéna, valamint víz. A kísérlet során az alábbi paramétereket határoztam meg: Vérplazmából: összfehérje-, összkarotin- és E-vitamin-koncentráció. Vvs-hemolizátumból: hemoglobin-, fehérje-, MDA-, GSH-koncentráció, valamint GSHPx-, SOD- valamint CAT-aktivitás. A föcstejbıl, a tejpótlóból és a granulált takarmányból: összkarotin- és E-vitaminkoncentráció.
67
Eredmények 2. táblázat 2/a. táblázat A vvs-ek egyes LP-s paraméterének változása a borjak életének elsı három hónapjában Vérvételi idıpontok 0. nap 3. nap 10. nap 30. nap 60. nap 90. nap *A vvs-ek egymástól.
MDA µmol/l
146,4 A ±32,8 161,1 A ±20,2 194,3 B ±28,1 252,1 B ±26,3 367,2 C ±13,1 220,6 C ±33,4 30. napi és
GSH mmol/l
GSH-Px SOD CAT vvs-Hb U/g U/mg BE/g g/100ml fehérje fehérje fehérje A A A 1,9 44,6 27,5 10,5 A 23,9 A ±0,5 ±8,9 ±2,5 ±2,45 ±3,9 1,8 A 45,0 A 28,0 A 11,5 A 23,7 A ±0,4 ±8,5 ±3,4 ±4,4 ±2,7 1,6 B 43,8 B 24,8 A 10,0 A 25,6 A ±0,4 ±8,0 ±5,0 ±3,0 ±4,6 1,1 C 29,2 C 30,4 A* 7,0 B 23,0 A ±0,1 ±6,3 ±5,3 ±2,2 ±1,3 1,3 C 35,5 C 27,9 A 3,5 B 16,1 B ±0,2 ±1,8 ±3,6 ±1,5 ±3,4 1,7 A 53,2 A 33,3 B* 7,1 B 22,7 A ±0,3 ±3,7 ±3,6 ±2,8 ±1,4 90. napi SOD-aktivitási értékei szignifikánsan nem térnek el
2/b. táblázat Borjak életének elsı három hónapjában megfigyelhetı plazma E-vitamin- valamint összkarotin-koncentrációbeli változások Vérvételi idıpontok 0. nap 3. nap 10. nap 30. nap 60. nap 90. nap
Összkaro tin mg/l 1,8 A ±0,2 2,0 A ±0,2 1,6 A ±0,2 4,3 C ±0,4 3,3 B ±0,3 1,6 A ±0,3
Evitamin mg/l 4,7 A ±0,4 4,4 A ±0,3 4,4 A ±0,4 5,7 C ±0,6 5,9 C ±0,3 5,4 B ±0,6
Az adott paraméterek oszlopain belül az azonos betőkkel jelzett értékek között nincs szignifikáns különbség. Az A-, B-, C-jelzéső csoportok közötti különbség P<0,05 szinten szignifikáns. Az adott paraméterek oszlopain belül alapnak az 1. vérvételi idıpontban vett minták értékeit tekintettem, ezért azokat A-val jelöltem.
68
A tej és a tejpótló összkarotin-tartalma 0,6-1,0 mg/l volt, és E-vitamin-tartalma 0,40,8 mg/l-nek adódott. A granulált takarmány 10-15 mg/kg összkarotint és 8-12 mg/kg Evitamint tartalmazott. A vérvizsgálatok eredményét a 2. táblázat mutatja. A vvs-ek Hb-tartalma jelentıs változást mutatott. Az alap (születéskori) értékekhez képest a második hónapos korban jelentkezett a legalacsonyabb Hb-koncentráció (kb. 30 %-os csökkenés). A 90. napos korban azonban a születéskoritól szignifikánsan el nem térı, de annál nagyobb értékeket mutatott. A vvs-ek MDA-koncentrációja ugyanebben az idıszakban érte el a születéskori értékekhez képest legmagasabb (háromszorosára emelkedett) szintjét, majd a következı vérvétel során csökkent az értéke (a születéskorihoz képest azonban kétszeresére emelkedett szintet mutatott). A GSH- és a GSH-Px-értékek az MDA-val ellenkezı tendenciát mutattak, bár legalacsonyabb szintjüket a 30. napos korban érték el. A CATaktivitás is ebben az idıszakban mutatott csökkenést. A SOD-aktivitás 26-33 U/mg fehérje körül mozgott a vérvételek során, legmagasabb értéke azonban a 90. nap körül jelentkezett. A vérplazma összkarotin-koncentrációja is ebben az idıszakban mutatott szignifikáns változást, a 30. napon 140%-kal, a 60. napon 85%-kal nıtt, majd a 90. napon az alapszintre tért. Az E-vitamin koncentrációja a 30. napon 21%-kal, a 60. napon 25%-kal, a 90. napon 15-%-kal mutatott nagyobb értékeket az alaphoz képest. Következtetések és javaslatok A tej és a granulált takarmány összkarotin- és E-vitamin-koncentrációja az irodalmi adatokkal megfelelıen kielégítı ellátást tettek lehetıvé (16) (401) Hiba! A könyvjelzı nem létezik.. A Hb-koncentráció csökkenésének egyik oka lehet a tejpótló hosszantartó itatása. Ennek hatása annak ellenére is észlelhetı volt abban az idıszakban, amikor már borjútáp és lucernaszéna is volt az állatok elıtt (a 60. napos korban). Bár az alacsonyabb Hbtartalom heveny hypotoniás hyperhydratio miatt is léterjöhet, így a csökkenés nemcsak abszolút, de relatív is lehet. Ilyen állapotot okozhat a fokozott vízfelvétel is, amely során a vvs-ek Hb-tartalma a sejtek duzzanata miatt hígul. A haemodilutiónak azonban ellentmond a vérplazmában mért E-vitamin- és karotinkoncentráció alaphoz képest nagyobb volta. Az alacsony Hb-tartalom, egyébként a vvs-eknek szabadgyökökkel szembeni érzékenységét fokozhatja Vettore és Griffin megfigyelései szerint (503). A fokozott szabadgyökképzıdést egyrészt az MDA-koncentráció emelkedésében, másrészt a többi antioxidáns hatású komponens (GSH-koncentráció, GSH-Px- és CAT-aktivitás) csökkent értékeiben nyilvánult meg. Az LP-s folyamatok fokozódása nemcsak az enyhe hypochrom anaemia, hanem annak a stresszhatásnak a következménye is lehet, amely akkor éri az állatokat, amikor a Steinmann-ketrecbıl a borjúnevelı csoportokba való áttéréskor jelentkezik. Hornsby és Crivello szerint a stressz miatt létrejövı ACTH-hatás a szabadgyökös reakciókat is fokozza (224). Összefüggés gyanítható a CAT-aktivitás és a Hb-koncentráció 60. napos kori alacsony volta között. A CAT aktív centruma a vas(III)-tartalmú protohem (444), hasonló struktúrája van a Hb hem-részének is. A két paraméter azonos idıben jelentkezı alacsonyabb értékei összefüggésben lehetnek például a csökkent vasfelvétellel. Ennek hátterében a takarmány kis vastartalma, esetleg a vasfelszívódás romlása állhat.
69
A vérplazma összkarotin- és E-vitamin-koncentrációjának a 60. napig tartó fokozatos emelkedése a karotinban és az E-vitaminban gazdagabb abrak-, illetve szálastakarmányra való áttérést jelezte. Az összkarotinértékek a 90. napra csökkentek. Ez a karotinoidok csökkent felvételére utalhat, ami azzal magyarázható, hogy a kísérlet ezen szakasza már az ısz végi, téli eleji idıszakra esett, amikor a takarmányok kevesebb karotinoidot tartalmaznak. A tapasztalatok alapján javasolható, hogy a borjak elhelyezésének és részben a takarmányozásának kb. 60 napos korban történı változtatása nagyobb odafigyeléssel, kifejezetten fokozatos átmenettel történjen. IV. 1. 2. A szabadgyökös reakciók változása kutyákban a kor függvényében IV. 1. 2. 1. Beagle kutyák vörösvérsejtjeiben tapasztalható szabadgyökös paraméterek és klinikai biokémiai vérparaméterek változásainak kor és ivar szerinti vizsgálata A kísérlet célja Célom az volt, hogy elemezzem az öregedés szabadgyökös vonatkozásainak néhány elemét kutyákon. Ebbıl a célból kor és ivar függı vérparaméterbeli változásokat vizsgáltam. Anyag és módszer A kísérlet során két korcsoporthoz tartozó 28 egészséges, 12-16 kg-os testtömegő beagle kutya vérmintáinak számos paraméterét elemeztem. A 14 fiatal (1 évesnél fiatalabb) és 14 idıs (9 évesnél idısebb) állatot ivarok szerint is (7-7) külön csoportokba állítottam. A kutyák nemük és korcsoportjaik szerint külön kennelekben kerültek elhelyezésre. Naponta egyszer kaptak kb. 600-800 g eleséget, ügyelve arra, hogy minden egyed elfogyassza a testtömegének megfelelı adagot. Vízhez ad libitum jutottak. Eleségük kutyatáp volt, amely átlagosan 70% fehérjét, 25% szénhidrátot és 5% zsírt tartalmazott. A mintavétel elıtt megfigyeltem az állatok csoportokon belüli viselkedését, majd egyedenként klinikai alapvizsgálatot végeztem. A vérvétel 6 órával etetés után történt. A vérmintákból meghatároztam a klinikai laboratóriumi diagnosztikában alkalmazott fıbb hematológiai- és biokémiai paramétereket, a vörösvérsejtek hemolizátumából pedig egyes LP-s paramétereket (MDA-, GSH-koncentráció, GSH-Px-, CAT-, SOD-aktivitás). A klinikai laboratóriumi paramétereket összehasonlítottam az Állatorvostudományi Egyetem Belgyógyászati Tanszékének klinikai laboratóriumában használt élettani átlagértékekkel, amelyeket részben saját vizsgálatok, részben forrásmunka (84) alapján állítottak össze.
70
Eredmények 3. táblázat 3/a. táblázat Fiatal és idıs beagle kutyák hematológiai és kliniai biokémiai paraméterei Hematológiai paraméterek Vvs-szám x1012/l Fvs-szám x109/l Hb g/100 ml Hematokrit l/l MCV fl MCH pg MCHC % Thrc-szám x109/l Biokémiai paraméterek TP g/l Alb g/l Glob g/l ALKP U/l ALT U/l Koleszt mmol/l Ca mmol/l Pi mmol/l Karb mmol/l Crea µmol/l összBR µmol/l
Fiatal (n=14) 5,9 ±0,3 11,0 ±2,5 13,1 A ±0,7 0,38 ±0,3 65,1 ±2,5 22,1 A ±0,7 33,7 ±1,0 386 ±94 Fiatal (n=14)
Idıs (n=14) 6,3 ±0,8 8,7 ±2,1 14,9 B ±1,9 0,43 ±0,6 68,1 ±3,5 23,4 B ±1,1 34,3 ±1,3 456 ±98 Idıs (n=14)
54,5 A ±1,2 32,3 ±0,8 22,3 A ±1,2 90,2 ±21,3 28,5 ±6,8 2,7 ±0,5 2,6 ±0,1 0,9 A ±0,3 4,6 ±1,2 48,8 ±15,3 7,8 ±1,6
60,0 B ±1,4 31,5 ±2,9 28,4 B ±3,4 128,5 ±85,4 34,6 ±14,6 3,4 ±0,8 2,7 ±0,2 0,7 B ±0,25 4,4 ±1,7 60,2 ±6,6 8,0 ±1,8
Élettani átlagértékek 4,7-7,3 5,2-12,1 9,1-15,2 0,35-0,45 60,1-70,2 28,3-32,4 32,4-38,5 200-800 Élettani átlagértékek 50,5-62,4 27,4-38,3 17,2-30,5 1,0-174,5 1,0-77,6 3,5-7,3 2,1-2,9 0,6-1,3 1,9-8,0 30,5-130,7 1,0-9,5
Az adott paraméterek sorain belül az azonos betőkkel jelzett értékek között nincs szignifikáns különbség. Az A-, B-jelzéső csoportok közötti különbség P<0,05 szinten szignifikáns. Az adott paraméterek sorain belül alapnak a fiatalok vérmintáinak értékeit tekintettem, ezért azokat A-val jelöltem.
71
3/b. táblázat Fiatal és idıs beagle kutyák néhány vvs-LP-s paraméterei Fiatal
Idıs
Vizsgált paraméterek MDA µmol/l GSH mmol/l GSH-Px U/g fehérje SOD U/mg fehérje
kan n=7 224,2 A ±22,4 2,5 A ±0,3 18,8 A ±0,5 6,7 A ±0,7
szuka n=7 220,4 A ±22,4 2,6 A ±0,4 18,9 A ±1,2 8,1 A ±1,2
kan n=7 380,3 B ±91,3 1,1 B ±0,1 29,5 B ±0,3 10,8 B ±2,2
szuka n=7 257,1 A ±38,2 2,3 A ±0,2 57,8 C ±1,9 14,1 C ±2,0
Szignifikanciaszintek P<0,05 P<0,001 P<0,001 P<0,01
Az adott paraméterek sorain belül az azonos betőkkel jelzett értékek között nincs szignifikáns különbség. Az A-, B-, C-jelzéső csoportok közötti különbség min. P<0,05 szinten szignifikáns. Az adott paraméterek sorain belül alapnak a fiatal kanok vérmintáinak vvs-hemolizátumból nyert értékeket tekintettem, ezért azokat A-val jelöltem. A hematológiai és a plazmabiokémiai paraméterek eredményeit, az Állatorvostudományi Egyetem, Belgyógyászati Tanszék klinikai laboratóriumában elfogadott és alkalmazott élettani értéktartományok feltüntetésével a 3. táblázat tartalmazza. Az LP-s paraméterek eredményeit a 4. táblázatban tüntettem fel. (A 3. és a 4. táblázat a vizsgált paramétereket illetıen a többitıl eltérıen horizontális elrendezésben készült a nagyszámú paraméter könnyebb elrendezése végett.) A hematológiai és a plazmabiokémiai paraméterek mind élettani tartományokon belül voltak, mégis néhány esetben a fiatalok és az idısek értékei között szignifikáns eltérés jelentkezett. Az idıs kutyákban a Hb és az MCH (mean corpuscular haemoglobin concentation, a vvs-ek átlagos Hb-tartalma) értékek, valamint a TP- és a globulin- (Glob) koncentráció (13, 6, 10 és 15 %-kal) magasabb szintet mutatott, mint a fiatalokban. A szérum anorganikusfoszfát-tartalma 30%-kal alacsonyabbnak mutatkozott az idıs korcsoportban. Ezek között az értékek között nem volt nemek közötti különbség. Az LP-s paraméterek közül jelentıs kor- és ivar szerinti különbség jelentkezett. Az MDA-koncentráció 30%-kal volt magasabb, ugyanakkor a GSH-Px- és a SOD-aktivitás közel kétszer annyi volt az idısebbekben mint a fiatalokban. A GSH-koncentráció az idıs kutyákban 30%-kal kisebb volt. Az ivari különbségek elsısorban az idıs kan kutyák esetében voltak feltőnıek: az MDA-, a GSH-Px- és a SOD- értékeik szignifikánsan magasabbak, a GSH-koncentrációik alacsonyabbak voltak a többi csoportokénál. Az antioxidáns védekezésben szerepet játszó GSH-Px- és SOD-aktivitások az idıs szukáknál mutatkoztak a legmagasabbnak.
72
Következtetések és javaslatok A vér hematológiai és egyes plazmabiokémiai mutatóinak az öregedés során bekövetkezı változásait Lowseth és mtsai. vizsgálták fiatalabb (3 éves) és idısebb (1213 éves) kutyákban (306). Azt tapasztalták, hogy a kálium-, az összfehérje-, és a globulin koncentráció, valamint a tejsav-dehidrogenáz- (LDH) aktivitás emelkedett a korral, míg a karbamid-, a kreatinin- és az albumin-tartalom, valamint a γ-glutamil-transzferáz- (GGT) aktivitás csökkent. A hematológiai paraméterekben nem találtam jelentısebb eltérést. Bush szerint azonban van változás egyes hematológiai paraméterekben is, mint pl. a Hbkoncentráció emelkedése, a fehérvérsejtek számának megszaporodása stb. (84). Hematológiai és plazmabiokémiai vizsgálataim számos elemében hasonlóak Lowseth (306) és Bush (84) adataihoz. Az idıs kutyák magasabb TP-koncentrációja valószínőleg az emelkedett globulinkoncentrációnak köszönhetı, ami azért alakulhat ki, mert az idısebb kutyák hosszabb ideig vannak kitéve immunstimuláló hatásoknak a különbözı erısségő antigénterhelés miatt. Nem hagyható figyelmen kívül, hogy a kor elırehaladtával a szervezet víztartalma, így az extracelluláris tér folyadéktartalma is csökken, ezért a plazma TP-koncentrációja és Ht-értéke is nı (84). A fiatalok kissé alacsonyabb Hb-koncentrációja azzal magyarázható, hogy a fiatalabb kutyákban a vörösvérsejtek életideje viszonylag rövidebb, így feltételezhetıen több a fiatal alak a sejtek között. A fiatalabb sejtek viszont átlagosan kevesebb Hb-t tartalmaznak. Ez lehet az oka az alacsonyabb Hb-koncentrációnak az 1 évesnél fiatalabb kutyákban (84). A fiatalokban enyhén alacsonyabb Ht-értékeket kaptam, mint az idısekben. Az idıs kutyák vérplazmájában mért alacsonyabb anorganikus-foszfát- (Pi) tartalom oka többek között a kevésbé hatékony intestinalis foszfát-abszorpció vagy a fokozottabb renális kiválasztás lehet. Az öregedés szabadgyökös elmélete még nem minden részletében tisztázott. A felvett oxigén 90%-a a mitokondriumokban hasznosul (210), mennyiségét szigorú genetikai kontroll szabályozza. A légzési lánc mőködése során folyamatosan keletkezı O2.--nek lassú kumulatív károsító hatása lehet a mitokondriumokra nézve az adott mitokondrium metabolizmusának arányában (207) (208). A védekezı rendszer csökkent mőködése, mitokondriális és extramitokondriális károsodások tapasztalhatók az öregedés során (206). Ezeket a károsodásokat detektálni lehet a mitokondriumok morfológiai elváltozásainak és az enzimjeinek csökkent mőködése alapján (206). Az egyedek élete során a szabadgyökök felhalmozódását számos genetikai és szerzett tényezı befolyásolhatja. Vizsgálataim eredményeinek értékelése során is, korábbi kutatásokban már vizsgált tényezıket vettem figyelembe. A kutatók egy része az öregedı szervezetekben kialakuló közvetlen szabadgyökös hatásokat figyelték meg. Mások indirekt módon, a szabadgyökképzı folyamatok csökkentések az öregedésre gyakorolt hatását elemezték. Az antioxidánsokat tartalmazó speciális diéta, egyes megfigyelések szerint, csak az extramitokondriális LP-s folyamatok gátlásában játszik szerepet, így ez csak a várható átlagos élettartamot (egy adott korosztály tagjainak az adott halandósági viszonyok mellett várható élettartamát) növeli, a potenciális élettartam (egy adott fajhoz tartozó egyed genetikailag meghatározott maximális élettartama) növekedésére nincs hatással (209). A potenciális élettartam növelésére több kísérletet végeztek és a megoldást a szigorú energiamegvonásban és az átlagos testhımérséklet
73
csökkenésében látják (507). Matsuo és mtsai. kimutatták például, hogy az in vivo LP-s folyamatok az öregedéssel összefüggésben fokozódnak és a táplálékfogyasztás korlátozásakor csökkennek (326). Az a tény régóta ismert, hogy a kisebb mérető állatoknak, illetve azoknak, amelyeknek nagyobb a légzési frekvenciájuk, rövidebb az élettartamuk. A kis légzési frelkvenciájú, nagyobb állatok viszont tovább élnek (399). Sohal kimutatta, hogy a házilegyek légzési frekvenciája csökkenthetı azáltal, ha redukálják aktivitásukat, ez úgy vitelezhetı ki, hogy kisebb helyen tartják ıket. Ezeknek az állatoknak az élettartama jelentısen meghosszabbodott (461). Kísérletemben az idıs kutyák vörösvérsejtjeiben az emelkedett MDA-koncentráció egyértelmően jelzi a fokozott LP-t. A védekezı enzimek aktivitása ugyancsak növekedett, ami a kompenzáció jelenségeként értelmezhetı. A GSH-koncentráció csökkenése feltételezhetıen a fokozott GSH-Px-aktivitásnak köszönhetı, amely oxidálja ezt a komponenst. Az idıs szuka kutyák magasabb GSH-koncentrációja és enzimaktivitási értékei a hatékonyabb enzimatikus védekezést jelzik. Annak a magyarázata, hogy az idıs kanok vvs-jeiben miért mutatkozott nagyobb mérvő LP és antioxidáns védekezés, részletesebb vizsgálatokat igényelne, mégis feltételezhetı, hogy az okok az egyedek fokozottabb anyagcseréjében rejlenek. A rutin klinikai vizsgálatok során megfigyelhetı volt ugyanis, hogy az idıs kanok reakcióképessége, fizikai és pszichikai aktivitása kifejezettebben jelentkezett a többi csoport tagjaihoz képest. Az eredmények alapján javasolható, hogy további vizsgálatok történjenek arra vonatkozólag, hogy statisztikailag kimutatható módon jelentkezik-e a kan kutyák fokozottabb érzékenysége a különbözı megbetegedések iránt az idısebb korban, ha igen, akkor mi lehet ennek a konkrét oka, továbbá hogyan lehetne a fokozottabb érzékenységet csökkenteni. IV. 2. A CCl4 és az alloxán okozta LP-s hatások vizsgálata a vörösvérsejtekben IV. 2. 1. A széntetraklorid (CCl4) juhok és kutyák vörösvérsejt-LP-s paramétereire kifejtett hatásainak vizsgálata A CCl4 mérgezés következtében kialakuló szabadgyökös reakciókat széles körben tanulmányozták annak érdekében, hogy modellezhetık legyenek egyes májbetegségekben kialakuló elváltozások. Ezeket a vizsgálatokat fıképp patkányon végezték (133) (34). Minthogy igazolva látszik, hogy a CCl4 egy olyan vegyület, amely tipikusan szabadgyökképzésen alapuló elváltozásokat hoz létre, fontosnak tartottam, hogy ilyen irányú vizsgálatokat végezzek juhokon, majd kutyákon. IV. 2. 1. 1. CCl4 hatása a juhok vörösvérsejtjeinek LP-s reakcióira A kísérlet célja Bár, a CCl4 számos, a vvs-ek szabadgyökös paramétereire kifejtett hatását igazolták, nem találtam adatokat arról, hogy kérıdzıkön is vizsgálták-e ezeket a folyamatokat, noha a CCl4-ra egyesek, pl. az alacsony szeléntartalmú táplálékot fogyasztó juhok kifejezetten érzékenynek bizonyultak (353). Ezekbıl a megfontolásokból kiindulva a CCl4 szubletális dózisával kezeltem juhokat és
74
figyelemmel kísértem a májelfajulásra és a szabadgyökös folyamatok vizsgálatára alkalmas, a vérplazmában és a vvs-hemolizátumban mérhetı paraméterek változását. A máj mőködésére utaló enzimek közül, a kérıdzıkben májspecifikusnak tekinthetı AST vérplazmabeli aktivitásának mérését, a szubsztrátok közül a plazma össz-, és a direktbilirubin- (összBR, dirBR) koncentrációjának mérését választottam. Anyag és módszer Hét nem vemhes, két-három éves Merino fajtájú jerkét állítottam kísérletbe, amelyeket 0,3 ml/testtömeg kg adagban 1:1 arányú széntetraklorid : paraffinolaj-oldattal kezeltem egyszeri alkalommal nyelıcsı-szondán keresztül. A kezelés elıtt és azt követıen a kísérlet során naponta klinikai alapvizsgálatot végeztem. A juhok mélyalmos istállóban egy csoportban voltak elhelyezve. A kezelést megelızıen és utána az állatok ad libitum lucernaszénát és az életfenntartó szükségletnek megfelelı juhtápot kaptak. Vizet szintén ad libitum ihattak az állatok. Vérmintákat a kezelés elıtt, majd a kezelést követı elsı, második, harmadik, hetedik és tizedik napon vettem. A mintákból a vvs-ek egyes LP-s paraméterein (MDA, GSH-Px, SOD, CAT) kívül a plazma AST-aktivitását, össz- és direktbilirubin-koncentrációját (totBR, dirBR) határoztam meg. Eredmények 4. táblázat 4/a táblázat Juhok néhány vvs-LP-s paraméterének változásai a CCl4 beadásának hatására Vérvételi idıpontok alap 1. nap 2. nap 3. nap 7. nap 10. nap
MDA µmol/l 204,4 A ±27,6 265,5 B ±15,3 332,3 C ±25,1 274,5 B ±19,7 305,1 B ±29,1 323,9 C ±26,6
GSH-Px U/g fehérje 16,6 A ±2,2 18,3 A ±3,7 25,4 B ±7,0 40,4 C ±9,4 46,6 C ±12,2 40,2 C ±10,3
SOD U/mg fehérje 23,9 ±6,4 22,6 ±4,7 21,8 ±5,6 23,9 ±3,4 21,5 ±1,9 26,3 ±6,2
CAT BE/g fehérje 20,5 ±6,8 21,6 ±13,5 26,7 ±12,4 24,3 ±12,4 25,1 ±10,7 19,9 ±14,2
Az adott paraméterek oszlopain belül az azonos betőkkel jelzett értékek között nincs szignifikáns különbség. Az A-, B-, C-jelzéső csoportok közötti különbség P<0,05 szinten szignifikáns. A CCl4 beadása elıtti vérvételi idıpontban vett minták értékeit tekintettem alapnak, ezért azokat A-val jelöltem.
75
4/b táblázat Juhok vérplazmájából mért klinikai biokémiai paraméterek változásai a CCl4 beadásának hatására Vérvételi idıpontok alap 1. nap 2. nap 3. nap 7. nap 10. nap
AST U/l 54,4 A ±9,3 125,3 B ±31,2 130,4B ±46,1 110,3 B ±33,1 87,2 B ±26,4 66,4 A ±20,3
összBR µmol/l 5,2 ±1,3 5,4 ±1,1 5,8 ±1,5 7,1 ±1,4 6,0 ±1,3 4,6 ±1,4
dirBR µmol/l 1,2 ±0,3 2,1 ±0,6 2,1 ±0,4 2,4 ±0,7 2,2 ±0,6 1,7 ±0,7
Az adott paraméterek oszlopain belül az azonos betőkkel jelzett értékek között nincs szignifikáns különbség. Az A-, B-, Cjelzéső csoportok közötti különbség P<0,05 szinten szignifikáns. A CCl4 beadása elıtti vérvételi idıpontban vett minták értékeit tekintettem alapnak, ezért azokat Aval jelöltem.
A kezelést követı elsı napon az állatok bágyadttá és étvágytalanná váltak, percenkénti szívverés- és légzésszámuk fokozódott, a nyálkahártyáik színe kissé anaemiásnak mutatkozott. A laboratóriumi leletek korreláltak a klinikai tünetekkel a kísérlet folyamán. A 10-12. napra az állatok tünetmentesek lettek. A laboratóriumi leletek a 4. táblázatban láthatók. Az AST-aktivitás kétszeres növekedést jelzett a második és a harmadik napon, a kísérlet végére azonban csökkent az értéke. Az összBR- és a dirBR-koncentráció fokozatos, nem szignifikáns kétszeres emelkedést mutatott a kísérlet elején, majd csökkentek az értékek. Az MDA-koncentráció 30 %-kal és a GSH-Pxakivitás több mint 50 %-kal fokozódott a kísérlet során úgy, hogy az MDA-értékek emelkedése megelızte a GSH-Px-értékeinek emelkedését. A kezdeti (második napon jelentkezı) MDA-érték-emelkedést a harmadik napon csökkenés követte, a hetedik és a tizedik napon ismét fokozatos koncentrációnövekedés mutatkozott. A SOD- és a CATaktivitás nem mutatott változást a kísérlet során (CAT: 19,9-26,7 BE / g fehérje között, SOD 21,5-26,3 U/mg fehérje között ingadozott). Következtetések A CCl4 toxikus hatásai a klinikai tüneteket illetıen megegyeztek az irodalmi adatokban feltüntetett változásokkal (353). A májsejt-szétesést jelezte az AST-aktivitás emelkedése, az epeérobstrukció és a májszövet károsodása az össz- és a direktblirubinkoncentráció növekedésében is megmutatkozott. A változások tendenciája megegyezett Kondos és mtsai. eredményeivel (269). Az MDA-koncentráció emelkedése, a CCl4 LP-t fokozó hatása miatt jöhetett létre. A GSH-Px-aktivitás szintén emelkedett, amelynek az oka feltehetıen, kompenzációs jelenség. Az enzim-károsodás a GSH-Px-et nem érintette. Ennek hátterében az állhat, hogy a triklórmetil-gyökbıl fıként a membránban képzıdı (133) szuperoxid- (és peroxid-) derivátumok valószínőleg az elsı védelmi vonalban lévı
76
molekulákat (pl. membrán lipideket, esetleg a CAT-enzimet) támadják elıször (385). A GSH-Px a membránban alig található meg, fı helye a citoszol, ezért az enyhefokú károsító hatás ezt az enzimet kevésbé érintette (153). IV. 2. 1. 2. A CCl4 hatása a kutyák vörösvérsejtjeinek LP-s reakcióira A kísérlet célja A májelfajulással, és a májcirrhosissal járó megbetegedések gyakoriak kutyákban is, ezért a juhok esetében végzett hasonló típusú kísérletet kutyákon is elvégeztem. A CCl4mérgezés hatását kutyákon Harper és Robinson is vizsgálta (211). Összehasonlította a majmok, a kutyák, a patkányok és az egerek esetében, hogy erre az anyagra 258 Hgmm oxigén inhalációja mellett milyen változások következtek be. Azt találta, hogy a magas oxigén tenziójú levegı súlyosbította a CCl4 májelfajulást okozó hatását ezekben a fajokban (211). Vörös és mtsai. igazolták a CCl4 hatására bekövetkezı májkárosodást ultrahangos felvételekkel és biopsziás szövettani vizsgálatokkal (506). Ezekbıl az ismeretekbıl kiindulva vizsgáltam, hogy a CCl4 szubletális dózisával kezelt kutyákban hogyan változnak a vérplazmában mérhetı, a májelfajulás mértékét jelzı fıbb klinikai biokémiai paraméterek, valamint a vvs-hemolizátumban az LP-s folyamatok mőködésére utaló enzimaktivitások és szubsztrátkoncentrációk. A kutyák májmőködésére utaló enzimek közül a vérplazma ALT-aktivitásának mérését választottam, mert ez az enzim a húsevıkben májspecifikusnak tekinthetı. A szubsztrátok közül a plazma összBR- és dirBR-koncentrációját vizsgáltam. Anyag és módszer A kutyák CCl4-gyel történı kezelése hasonlóképpen zajlott, mint a juhok esetében. A kísérletben 10 db, 4-5 éves korú, keverék, 25-30 kg-os, nem vemhes szuka kutya szerepelt. A CCl4 adagolásának módja a juhok kezeléséhez hasonló volt. Az állatoknak 0,3 ml/ttkg adagolásban 1:1 arányú széntetraklorid : paraffinolaj-elegyet adagoltam egyszeri alkalommal gyomorszondán át. A kutyák ketrecekben kerültek elhelyezésre, az etetések módja a kísérletet megelızıen és a kísérlet alatt ugyanúgy történt. Eleségük naponta 800-1000 g volt, amely mintegy 70% fehérjét, 25% szénhidrátot és 5% zsírt tartalmazott. Etetésük naponta egyszer történt. Ivóvízhez ad libitum jutottak az állatok. A kezelés elıtt és azt követıen, a kísérlet során naponta klinikai alapvizsgálatot végeztem. Vérmintákat a CCl4-gyel történı kezelés elıtt, majd a kezelést követıen az 1., 2., 3., 7. és 10. napon vettem. A mintákból a vvs-ek egyes LP-s paraméterein (MDA, GSHPx, CAT, SOD) kívül, a plazma ALT-aktivitását, össz- és direktBR-koncentrációját határoztam meg.
77
Eredmények 5. táblázat 5/a táblázat Kutyák néhány vvs-LP-s paraméterének változásai CCl4 hatására Vérvételi idıpontok alap 1. nap 2. nap 3. nap 7. nap 10. nap
MDA µmol/l 246,6 A ±28,2 256,2 A ±20,7 294,8 B ±44,5 256,6 A ±37,5 269,6 A ±54,7 292,7 B ±42,4
GSH-Px U/g fehérje 36,1 A ±9,3 27,8 B ±3,6 25,5 B ±4,4 29,9 B ±11,5 26,1 B ±11,9 40,4 A ±12,3
SOD U/mg fehérje 21,8 A ±4,5 19,3 A ±3,6 13,9 B ±4,1 15,8 B ±3,4 12,9 B ±1,9 28,2 C ±6,2
CAT BE/g fehérje 25,4 ±7,8 23,6 ±15,7 27,8 ±15,3 24,5 ±12,4 26,2 ±11,8 21,9 ±15,3
5/b táblázat Kutyák plazmabiokémiai paramétereinek változásai a CCl4 beadásának hatására Vérvételi idıpontok alap
ALT összBR dirBR U/l µmol/l µmol/l 25,4 A 8,2 2,2 ±8,3 ±2,3 ±0,3 1. nap 210,5 C 7,9 2,5 ±44,3 ±3,1 ±0,7 2. nap 198,3 C 8,8 2,7 ±51,2 ±2,5 ±0,5 3. nap 185,2 C 7,5 2,8 ±38,4 ±3,4 ±0,8 7. nap 158,1 C * 8,1 2,7 ±36,3 ±4,3 ±0,9 10. nap 105,2 B * 7,6 2,1 ±32,3 ±3,7 ±0,6 *A 7. napi ALT-érték nem különbözik szignifikánsan a 10. napitól. Az adott paraméterek oszlopain belül az azonos betőkkel jelzett értékek között nincs szignifikáns különbség. Az A-, B-, C-jelzéső csoportok közötti különbség P<0,05 szinten szignifikáns. A CCl4 beadása elıtti vérvételi idıpontban vett minták értékeit tekintettem alapnak, ezért azokat A-val jelöltem.
78
Vizsgálataim eredményét az 5. táblázatban tüntettem fel. Az állatok a kísérlet folyamán a CCl4 adagolását követı elsı napon étvágytalanná, bágyadttá váltak, szívverésük és légzésük percenkénti száma jelentısen (a normál érték 150-160 %-ára) nıtt. Az ALT-aktivitás kutyákban szignifikánsan, az alapértékekhez képest 6-8-szorosára nıtt. A második naptól kezdve, átlagértékeit tekintve a hetedik és a tizedik napra azonban csökkenı tendenciát mutatott, de így is az alapértékekhez képest 5-szörös értékek jelentkeztek. Az össz- és a direktbilirubin koncentrációja azonban a juhokhoz hasonlóan szintén nem emelkedett szignifikánsan a kísérlet során (8-13 µmol/l között ingadozott). Az MDA-koncentráció értékei szintén a juhokéhoz hasonlítottak tendenciájukban. Itt a növekedés az 1. naptól kezdıdött, de ez a változás nem volt szignifikáns, a 2. napra viszont jelentıs mértékő, 20 %-os növekedés következett. A 3. napon visszatért a második napi értékek közelébe, a 7. napon ismét nem szignifikáns (10 %-os) emelkedés jelentkezett, a 10. napon viszont szignifikáns (20 %-os) emelkedés mutatkozott. A GSHPx aktivitása a vvs-ekben a kezelést követı 1., 2., 7. napon 10-15 %-os csökkenést mutatott, a 3. és a 10. napon nem tért el szignifikánsan az alapértékektıl. A 10. napon nem szignifikáns 10 %-os emelkedés volt tapasztalható. A CAT-aktivitás a juhok értékeihez hasonlóan nem mutattak szignifikáns eltérést (az értékek 15-20 BE / g fehérje között ingadoztak), azonban a SOD-aktivitás értékei hasonló változást mutattak, mint a GSH-Px értékei. A 2. naptól a 7. napig az alapértékekhez képest majnem felére csökkentek (szignifikánsan, P<0,05), majd a 10. naptól jelentıs, 30 %-os aktivitásbeli emelkedés volt tapasztalható. Következtetések és javaslatok Az állatok klinikai tünetei, az ALT-aktivitás plazmabeli emelkedésének az alapértékekhez viszonyított mértéke, a vörösvérsejtek GSH-Px- és SOD-aktivitásainak kezdeti jelentıs csökkenése alapján elmondható, hogy a kutyák a juhoknál a CCl4 toxikus hatásaira érzékenyebbeknek bizonyultak. Annak ellenére, hogy az MDAkoncentráció változása a juhok esetében valamivel súlyosabb LP-s folyamatokra utalt, a kutyák antioxidáns enzimaktivitásbeli változásai mégis fokozottabb szabadgyökös károsodásokat jeleztek. A fokozottabb érzékenység magyarázata egyrészt az lehet, hogy a juhok mája a bendı raktározó funkciójának következtében fokozatosabban lett a toxikus hatásnak kitéve, mint a kutyáké, másrészt a kutyák sokkal élénkebb állatok, metabolizmusuk is valószínőleg gyorsabb, a fokozottabb anyagcsere a gyökképzıdést is meggyorsítja (461). Egy harmadik magyarázat lehet még, hogy a kutyák fıképpen a hastájéki fájdalmakra kifejezettebben reagálnak, ezért szervezetükben a stressz okozta ACTH-hatásra bekövetkezı fokozott LP (224) kialakulására nagyobb esély van, mint pl. az indolens juhok esetében. A kutyák májsejt-elfajulását a nagy ALT-értékek igazolták. Az LP-s paraméterek ingadozása jelezte a szervezet védekezésének stádiumait. Gyanítható, hogy a fokozatosan szaporodó gyökök egyre több védekezı mechanizmust tettek hatástalanná az enzimeken okozott toxikus károsodás miatt. Az enzimaktivitások csökkenése a SOD és a GSH-Px esetében egyaránt jelentkezett. Ez a jelenség arra utalhat, hogy a toxikus hatás a kutyák esetében olyan erıs volt, hogy a keletkezı gyöktermékek a membránból, illetve annak közelébıl kikerültek a citoszolba is (133), így nemcsak a membránhoz közeli
79
szubsztrátokat, enzimeket, de a citoszolbeli SOD-ot (385) és GSH-Px-et (153) is károsították. Valószínőleg a kezdeti gyökképzıdést egy ideig képes volt kompenzálni a meglévı enzimgarnitúra, ezért csökkenı tendenciát láthatunk az MDA-koncentrációban, késıbb azonban a lipidperoxidok egyre nagyobb mértékben képzıdhettek, így az MDAkoncentráció is nıtt. Az idı elırehaladtával azonban a szervezet kompenzáló mechanizmusa gyaníthatóan nagyobb mértékő antioxidáns enzimaktivitás-növekedést indukált, így ezen enzimek aktivitása a kísérlet végére ismét emelkedı tendenciát mutatott. A juhok esetében az enzimkárosító hatás nem mutatkozott, hiszen a GSH-Px aktivitása az idı elırehaladtával fokozatosan nıtt, és a többi enzimben sem mutatkozott jelentısebb csökkenés. Az enzimaktivitás fokozódását azzal lehet magyarázni, hogy a gyökképzı ágensek hatására fokozatosan képzıdı H2O2 és lipidperoxidok allosztérikusan aktiválják a GSH-Px-et. A GSH-Px allosztérikus aktivációjának lehetıségérıl számos szerzı tett említést (387) (49). A SOD esetében is hasonló aktivációt lehet gyanítani, bár ennek egyértelmő bizonyítása szükséges. Lényeges szempont, hogy a vvs-ekben az antioxidáns enzimek aktivitásának növekedése valószínőleg nem a de novo szintézis miatt jött létre, ugyanis ehhez több idıre lett volna szükség. Gyanítható azonban, hogy a gyökképzı folyamatok miatt károsodott vvs-ek (amelyek már rossz enzimgarnitúrával rendelkeztek) lebomlottak az MPS-ben, a lépben és a májban. A sejtkárosodás mindaddig tarthatott, amíg a szervezet nem volt képes eliminálni a károsító ágenseket. Azonban, már e folyamat közben a lépben és a csontvelıben raktározott, viszonylagos védettséget élvezı, ép vvs-ek kijuthattak a keringésbe. Ezeknek megfelelı enzimgarnitúrájuk volt. A vvs-ek dinamikus lebomlása és az „újak” keringésbe kerülése a gyökös hatások csökkenése révén napok alatt oda vezethetett, hogy a vérmintákban az enzimaktivitások javuló tendenciát mutattak, és az alapértékekhez közeli, vagy magasabb értékeket kaptam. A juhokon és a kutyákon végzet kísérletek alapján javasolható, hogy részletes elemzéseket végezzünk különbözı fajoknak, és fajtáknak a szabadgyökképzı xenobiotikumokra mutatott eltérı válaszkészségérıl és felvessük azt a kérdést, hogy minek van jelentısebb szerepe az antioxidáns védekezésben, az egyed genetikai adottságainak, vagy az aktuális (elhelyezés, takarmányozás stb. által meghatározott) antioxidáns státuszának. Ebbıl kiindulva arra is választ kaphatunk, hogy egy genetikailag kevésbé kielégítı antioxidáns védekezési készségő állat LP-s hatások elleni védettsége milyen mértékben javítható a takarmányozás módosításával, és az gazdaságilag mennyire jövedelmezı, továbbá nem elınyösebb -e az antioxidáns védekezıképességen állattenyésztési, biotechnológiai eszközökkel segíteni. IV. 2. 2. Az alloxán LP-s hatásainak vizsgálata A xenobiotikumok egy másik képviselıjével, az alloxánnal végeztem a következı modellkísérletet kutyán és juhon, hogy vizsgáljam annak hatását a vvs-ek LP-s reakcióira. Az alloxánt nemcsak, mint a fokozott LP, hanem mint a diabetes mellitus modellezésére alkalmas anyagot választottam. Össze kívántam hasonlítani, hogy milyen különbségek adódnak a vizsgált fajok között e xenobiotikum hatására.
80
IV. 2. 2. 1. A vörösvérsejtek LP változásai kutyák alloxán - diabetesében A kísérlet célja Az alloxánról régóta ismert, hogy az állati szervezetben szabadgyök-képzı hatású, amely elsısorban a májat és a hasnyálmirigyet érinti (412). Ez utóbbi szervi hatás miatt vált alkalmassá a cukorbetegség vizsgálatára. Célom az volt, hogy az alloxán szubletális dózisával kezelt kutyákban vizsgáljam annak vércukorszint-növelı, májkárosító és LP-t fokozó hatásait néhány paraméter alapján. A májmőködés vizsgálatára a kutyákban májspecifikusnak tekinthetı ALT plazmabeli aktivitásának mérését választottam. Anyag és módszer Öt, vegyes ivarú, 25-35 kg testtömegő, 1-5 éves korú keverék kutyát állítottam kísérletbe. Az állatoknak 200 g/l koncentrációjú, desztillált vízzel hígított alloxánt adtam intravénásan 60 mg/testtömeg kg adagolásban. A kutyák egyedi ketrecekben kerültek elhelyezésre, az etetések módja a kísérletet megelızıen és a kísérlet alatt ugyan úgy történt. Naponta 800-1300 g, mintegy 70% fehérjét, 25% szénhidrátot és 5% zsírt tartalmazó kutyatápot ettek napi egyszeri adagolásban. Ivóvízhez ad libitum jutottak az állatok. A kísérlet során, az állatok kezelése elıtt, majd azt követıen klinikai alapvizsgálatot végeztem. A vérmintavétel a vena cephalica antebrachii-bıl történt az alloxánnal való kezelés elıtt és utána négy napon keresztül. A vérplazmából glükózkoncentrációt és ALTaktivitást, a vvs-ek hemolizátumából MDA-koncentrációt, GSH-Px-, SOD- és CATaktivitást mértem. A vizelet cukorkoncentrációját, és fehérjetartalmát is megállapítottam. Eredmények 6. táblázat 6/a táblázat Néhány vvs-LP-s paraméter változása kutyák alloxán okozta diabetes mellitusában Vérvételi idıpontok
MDA µmol/l
alap
190,2 A ±15,7 239,2 B ±25,8 278,2 B ±28,4 400,5 C ±35,3 412,2 C ±32,6
1. nap 2. nap 3. nap 4. nap
GSHPx U/g fehérje 30,5 A ±6,7 36,2 C ±8,5 48,3 B ±11,3 30,4 A ±7,4 26,5 A ±9,4
SOD U/mg fehérje
CAT BE/g fehérje
11,7 ±3,4 12,7 ±4,5 12,8 ±3,3 11,8 ±3,6 11,7 ±2,9
12,2 ±6,5 17,4 ±5,7 17,2 ±6,8 17,7 ±7,3 16,5 ±4,8
Az adott paraméterek oszlopain belül az azonos betőkkel jelzett értékek között nincs szignifikáns különbség. Az A-, B-, Cjelzéső csoportok közötti különbség P<0,05 szinten szignifikáns. Az alloxán beadása elıtti vérvételi idıpontban vett minták értékeit tekintettem alapnak, ezért azokat A-val jelöltem.
81
6/b táblázat Kutyák vérplazmájából mért biokémiai paraméterek változásai kutyák alloxán okozta diabetes mellitusában Vérvételi idıpontok alap 1. nap 2. nap 3. nap 4. nap
Glükóz mmol/l 3,6 A ±1,2 18,4 B ±5,3 36,6 C ±4,4 39,5 C ±5,7 45,4 C ±6,9
ALT U/l 16,2 A ±3,6 122,5 B ±5,6 125,4 B ±8,7 120,5 B ±4,9 117,0 B ±7,8
Az adott paraméterek oszlopain belül az azonos betőkkel jelzett értékek között nincs szignifikáns különbség. Az A-, B-, C-jelzéső csoportok közötti különbség P<0,05 szinten szignifikáns. Az alloxán beadása elıtti vérvételi idıpontban vett minták értékeit tekintettem alapnak, ezért azokat A-val jelöltem.
A kutyák az alloxán beadását követıen étvágytalanná, bágyadttá váltak, hasi fájdalomra utaló jeleket mutattak, vizeletükben különbözı mennyiségő fehérje (szulfoszalicilsavas próbával: ++-+++), valamint glükóz (tesztcsíkkal: +++-++++) jelent meg. A kezelés hatására bekövetkezı változásokat a 6. táblázat tartalmazza. A vércukorszint a kezelést követı elsı napon enyhébb (mintegy 5-szörös: 3,6-18,4 mmol/l), a harmadik és a negyedik napon fokozottabb (10-szeres: 36,6 - 39,5 mmol/l) emelkedést mutatott. A vérplazma ALT-aktivitása már az elsı naptól kezdve 7-8-szorosára (16,225,4 U/l) fokozódott. A vörösvérsejtek MDA-koncentrációja az alloxán beadása utáni elsı két napon kisebb mértékben (25 %-osan), a harmadik és a negyedik napon kétszeresére emelkedett. A GSH-Px-aktivitás értékei a második napra váltak fokozottabbá, majd csökkent az értékük. A SOD-aktivitásban nem mutatkozott változás. A GSH-Px-hez hasonló tendenciát mutatott a CAT-aktivitás is, bár értékei nem tértek el szignifikánsan egymástól. Következtetések Az emelkedett vércukorszint a xenobiotikum specifikus hatása következtében alakulhatott ki. Tekintve, hogy az alloxán károsítja az inzulint termelı Langerhans-sziget ß-sejtjeit, az inzulin hiányában hyperglikaemia jön létre. Egy másik oka az emelkedett vércukorszintnek a heveny májsejt-széteséskor tapasztalható gyors glikogenolízis lehetett. Egy harmadik lehetıség a stressz-hatás miatt kialakuló hyperglykaemia, amelyet a heveny a szöveti destrukció okozta fájdalomérzet is okozhatott (224). Az ALT-ativitás értékeinek emelkedése a méreganyag másodlagos hatásának, a májsejt-károsításának a révén jöhetett létre. Az LP-s paraméterek vizsgálatának eredményei egyeztek más ilyen típusú kísérletek eredményeivel (176). A folyamatok ebben az állatfajban is hasonló módon következhettek be, mint a cukorbeteg emberek (242), vagy az alloxánnal kezelt patkányok (234) (412) esetében. Az emelkedett MDA-koncentráció az alloxán LP-t fokozó (a PUFA-k peroxidációját iniciáló) hatásának tudható be. A GSH-Px és a CAT
82
aktivitási értékeinek hullámzása úgy értelmezhetı, hogy a fokozott gyökképzés nagyobb mennyiségő szubsztrátot hozhatott létre, ennek következtében az ezeket eltüntetni igyekvı GSH-Px allosztérikus aktivációja alakulhatott ki. Ezt a fokozott enzimatikus válaszkészséget számos szerzı leírta (176) (316) (371). A késıbbi napokon az enzimaktivitási értékek csökkentek, ami azzal magyarázható, hogy az alloxán hatására létrejövı, szabadgyököket indukáló láncreakció, toxikus hatása révén károsíthatta a fehérjéket, így ezeket az enzimeket is. A fokozott gyökképzés a kialakuló hyperglykaemia következménye is lehetett, hiszen a glükóz autooxidációja szabadgyökök kialakulását is eredményezhette. A glükóz a molekuláris oxigént enolizálni, redukálni képes. Ennek a folyamatnak a végterméke a fémionok jelenlétében a szabadgyökképzést iniciálhatja (525) (241). IV. 2. 2. 2. A vörösvérsejtek LP változásai juhokban az alloxán hatására A kísérlet célja Az alloxánt, mint a máj és a hasnyálmirigy LP-jét fokozó xenobiotikumot régóta ismerik. A juh faj alkalmas modellnek bizonyult Hidari és mtsai. kísérletében (218), azonban abban a szerzık nem a szabadgyökös változások vizsgálatát tőzték ki célul. Fontosnak tartottam, hogy a kutyák alloxán okozta diabetes mellitusában a vvs-ekben jelentkezı néhány LP-s paraméterbeli változás ismerete után megfigyeljem ennek az anyagnak a hatását a juhok hasonló paramétereire is. A kísérlet beállítását az is indokolta, hogy a juhoknak a monogasztrikus kutyákhoz képest eltérı a metabolizmusuk, továbbá ez a faj, számos megfigyelés alapján, különösen érzékeny a szabadgyökös hatásokra. Célom az volt, hogy az alloxán szubletális dózisával kezelt juhokban vizsgáljam annak vércukorszint-növelı, májkárosító és LP-t fokozó hatásait a vérplazmából és a vvs-ek hemolizátumából mérhetı néhány paraméter alapján. A máj mőködésére utaló enzimek közül, a kérıdzıkben májspecifikusnak tekinthetı AST vérplazmabeli aktivitásának mérését választottam. Anyag és módszer Négy, Merinó fajtájú, 2-4 éves korú, nem vemhes jerkét állítottam kísérletbe. Az állatoknak a kutyákhoz hasonló módon 200 g/l koncentrációjú desztillát vízzel hígított alloxánt adtam intravénásan 60 mg/testtömeg kg adagolásban. A juhok mélyalmos istállóban egy csoportban voltak elhelyezve. A kezelést megelızıen és utána az állatok ad libitum lucernaszénát és az életfenntartó szükségletnek megfelelı juhtápot kaptak. Vizet szintén ad libitum ihattak az állatok. A kísérlet során, az állatok kezelése elıtt és azt követıen klinikai alapvizsgálatot végeztem. A vérmintavétel az alloxánnal való kezelés elıtt és utána tíz napon keresztül történt. A vérminták plazmájából a glükózkoncentrációt és az AST-enzimaktivitást, a vörösvérsejtek hemolizátumából pedig MDA-koncentrációt, valamint GSH-Px-, CAT- és SOD-aktivitást vizsgáltam. A vizeletbıl tesztcsíkkal a cukorkoncentrációt, szulfoszalicilsavas próbával a fehérjetartalmat állapítottam meg.
83
Eredmények 7. táblázat Néhány vvs-LP-s és vérplazmából mért paraméter változása juhok alloxán okozta diabetes mellitusában vvs-LP-s paraméterek Vérvételi idıpontok
MDA µmol/l
GSH-Px U/g fehérje
vérplazmaparaméterek Glükóz AST mmol/l U/l
SOD CAT U/mg BE/g fehérje fehérje alap 160,2 A 34,1 A 27,9 22,8 2,8 A ±28,2 ±3,3 ±15,2 ±10,0 ±0,3 1. nap 180,3 A 29,2 B • 25,4 11,2 3,9 B ±30,4 ±1,8 ±1,4 ±1,5 ±0,5 2. nap 338,1 B 25,4 C 27,1 16,8 7,3 C ±12,8 ±1,5 ±5,6 ±4,9 ±1,5 3. nap 400,4 C 26,5 C 26,6 19,1 7,4 C ±23,8 ±3,8 ±3,4 ±6,0 ±0,9 4. nap 234,2 D 21,4 C 20,4 28,5 6,8 C ±24,3 ±3,5 ±4,2 ±17,2 ±0,7 D C 5. nap 230,3 21,1 22,7 17,8 6,9 C ±30,9 ±2,3 ±4,3 ±5,1 ±1,0 E C 6. nap 194,8 19,1 26,8 13,1 6,2 C ±41,6 ±4,7 ±1,9 ±10,1 ±0,7 7. nap 224,9 D * 24,5 C • 25,8 19,7 6,4 C ±10,7 ±2,8 ±4,2 ±11,8 ±0,8 8. nap 230,1 D * 19,1 C 22,6 17,1 4,7 B ±60,9 ±4,3 ±2,9 ±2,3 ±0,6 9. nap 207,7 F * 23,3 C 25,1 23,7 3,0 A ±19,8 ±1,7 ±6,1 ±10,4 ±0,6 *A 7., 8. napi MDA-értékek nem különböznek a 9. napiaktól. • Az 1. napi GSH-Px-aktivitások nem különböznek a 7. napi értékektıl.
55,3 A ±12,1 87,9 B ±18,2 156,7 C ±20,6 197,5 D ±32,3 205,6 D ±25,7 185,5 D ±37,5 163,3 C ±16,2 148,4 C ±20,3 98,6 B ±18,4 80,4 B ±11,5
Az azonos betőkkel jelzett értékek között nincs szignifikáns különbség. Az A-, B-, C-, D, E-, F- jelzéső csoportok közötti különbség P<0,05 szinten szignifikáns. Az alloxán beadása elıtti vérvételi idıpontban vett minták értékeit tekintettem alapnak, ezért azokat A-val jelöltem. A kezelést követıen az állatok étvágytalanná, bágyadttá váltak. Vizeletük az elsı két napon élénkpiros színővé változott, benne fehérje (szulfoszalicilsavas próbával: +/-++), valamint glükóz (tesztcsíkkal: +-++) jelent meg. A laboratóriumi vizsgálatok eredményeit a 7. táblázat mutatja. A vércukorszint a juhokban a kezelést követı elsı naptól fogva a kutyákhoz képest kevésbé kifejezetten emelkedett (2,5-szeresére), majd az
84
ötödik naptól csökkent, de csak a kilencedik napra érte el a kiindulási értéket. Az AST aktivitása a vérplazmában szintén kifejezetten, az alapértékhez viszonyítva négyszeresére emelkedett, majd a hatodik naptól csökkent. A vörösvérsejtek MDA-koncentrációja hasonlóan növekedett, mint a kutyákban és közel 2,5-szörös emelkedést mutatott a második napra. A negyedik napon alacsonyabb, bár az alaphoz viszonyított másfélszeres értékeket mértünk. Ez az emelkedett tendenciát mutató érték a kísérlet végére közelített az alapszinthez. A GSH-Px-aktivitás az alaphoz képest a 2. napig csökkent, a további idıpontokban ez a csökkenés nem volt karakterisztikus, azonban a legalacsonyabb érték az ötödik napon volt megfigyelhetı, a nyolcadik naptól ismét közelített a 2. napos szinthez. A SOD- és a CAT-aktivitás nem mutatott jelentıs változást, az értékekben jelentıs szórás mutatkozott. Következtetések és javaslatok A kutyáknál tapasztalható alapvetı klinikai és laboratóriumi változások a juhoknál is észlelhetık voltak. A juhok általános állapota nem romlott oly mértékben, mint a kutyáké, a hastájéki fájdalom sem volt annyira jelentıs. A vizeletvizsgálat során a fehérje- és a cukorürítés mértéke sem volt olyan kifejezett, mint a kutyákban, a vizelet színe azonban élénk pirosra változott, bár vért nem tartalmazott. Ennek a jelenségnek az okaként az alloxán metabolitját a dialursavat feltételezhetjük. A vércukorszint emelkedése sem jelentkezett olyan mértékben, mint a kutyákban. Ezt magyarázhatja, hogy a juhok mobilizálható glükózkészlete is kisebb, mint a monogasztrikus állatoknak, hiszen ebben az állatfajban az energia fıképp az illózsírsavakból származik. Az alloxánnak az illózsírsav-metabolizmusra kifejtett hatásaival kapcsolatban Hidari és mtsai. megállapították, hogy az alloxán csökkenti az illózsírsavak hasznosulását is juhokban (218), mert az ecetsav, a propionsav és a vajsav májszövetbe történı beépülése csökkent az alloxán adagolását követıen. Ugyanebben a kísérletben a szerzık megfigyelték az alloxán okozta fokozott szabadzsírsav-mobilizációt és a ketonanyagok koncentrációjának növekedését is. Az LP-t jelzı paraméterek közül az MDA koncentrációjának fokozódása hasonló okokból jöhet létre, mint a kutyákban. Az antioxidáns enzimek változásai azonban a kutyákéhoz képest eltérıek voltak. Az enzimek kompenzáló aktivitásfokozódása a juhoknál nem volt tapasztalható, csak a GSH-Px aktivitásának szignifikáns csökkenése. Ez nagy valószínőséggel a kutyáknál is említett folyamatok révén jelentkezhetett, a szabadgyökök okozta enzimkárosodás miatt. A GSH-Px szubsztráthiánya a következményesen kialakult csökkent táplálóanyag felvétel miatt alakulhatott ki. Az enzimaktivitások az alloxán hatásainak csökkenése után tértek vissza az alapszintre. A kutyákkal való összehasonlítás után megfigyelhetı, hogy a juhok kisebb érzékenysége az alloxánnal szemben ebben a kísérletben is részben tapasztalható volt csakúgy, mint a CCl4 adását követıen. Ez leginkább abban nyilvánult meg, hogy a juhok általános állapota kevésbé romlott, és a vércukorszintjük kevésbé emelkedett az alloxán hatására, mint a kutyák esetében. A juhokon és a kutyákon végzett vizsgálatok alapján javasolható azon okok tisztázása, hogy a juhok bár jelentısen érzékenyek a szabadgyökös károsodásokra (pl. a rézmérgezés, vagy a Se-, és az E-vitamin-hiányos izomelfajulás), mégis a toxikus alloxánra nem mutattak fokozottabb érzékenységet a kutyáknál, amelyekrıl nem ismert az oxidatív károsodások iránti kifejezett fogékonyság.
85
IV. 3. A hypoxia - reperfusiónak a vvs-ek LP-s paramétereire kifejtett hatásainak vizsgálata Patkány és kutya fajokban végzett bél- és vesemőtétek során vizsgáltam a vérben és a szövetekben jelentkezı hypoxia-reperfusiós hatásokat a vvs-ek egyes LP-s paraméterei alapján. Három kísérletet végeztem, kettıt patkányokban, és egyet kutyákban. A patkány fajt csupán ebben a kísérletsorozatban alkalmaztam. Itt a jelenség általános kórélettani modellvizsgálata volt a fı szempont, nem pedig az adott faj speciális válaszának elemzése. Ilyen típusú vizsgálatokra a patkány bizonyult az egyik legalkalmasabbnak. A harmadik kísérletben a kutya ismét szerepel, bár csak modellként. Ez utóbbi kísérletben egy parenchymás szerv hypoxia-reperfusiójának elemzését tőztem ki célul és mőtéttani okokból erre a kutya veséjének autotranszplantációja tőnt a legmegfelelıbbnek és a legbiztonságosabbnak. IV. 3. 1. Hypoxia - reperfusio LP-s hatásainak vizsgálata patkánykísérletek során IV. 3. 1. 1. Hypoxia - reperfusio hatásának vizsgálata a vörösvérsejtek LP-s paramétereire patkány arteria mesenterica craniálisának átmeneti ligatúrája és reperfusiója során. A kísérlet célja A hypoxia - reperfusio a természetes kórképekben elıforduló egyik leggyakoribb fokozott LP-t okozó jelenség. Számos kórfolyamatban pl. a traumás bántalmakban, a thrombosisos kórképekben stb. jelentkezik. Fontosnak tartottam, hogy a patkányon, mint "klasszikus" modellállaton végezzek vizsgálatokat a vvs-ek LP-s reakciói kialakulása szempontjából a bél hypoxiája és reperfusiója során. Tettem ezt abból a megfontolásból is, hogy a gastrointestinalis tractus hypoxia - reperfusiós folyamatai néhány szempontból speciálisnak tekinthetık, és az alapvetı reakciók eredményei patkányban jól vizsgálhatók. Anyag és módszer A kísérletet 10 db, nıivarú, White Whistar patkányon végeztem az Országos Frédérique Joliot Currie Sugárbiológiai és Sugáregészségügyi Kutatóintézetben az elıkísérletek után. A fıkísérlethez az állatokat 0,4 mg/ttkg adagolásban intraperitoneálisan 0,1 %-os pentobarbitál-Na-val narkotizáltam. A narkózis beállta után a preparált torkolati barázda helyének megfelelıen a vena jugularis-ból Li-heparinos vérvételi fecskendıkbe 1-1 ml vérmintát győjtöttem. A vérminta győjtés szakaszai: a mőtéti beavatkozás (a. mesenterica cranialis ligatura) elıtt (alap vérminta), a ligatura után 45 perccel (2. vérminta), majd a reperfusio után 45 perccel (3. vérminta). A harmadik vérvétel után 10-20 perc múlva az állatok, mintegy 50%-a elhullott, az életben maradt állatokat túldozírozott pentobarbitálNa-t felhasználva extermináltam. A kísérlet során megfigyeltem az állatok reakcióit és vizsgáltam néhány klinikai alapparamétert is.
86
A laboratóriumi vizsgálatok során a vörösvérsejtekbıl a következı LP-s paraméterek vizsgálatát végeztem: MDA-, GSH-koncentráció és GSH-Px-, valamint SOD-aktivitás. Eredmények 8. táblázat Hypoxia reperfusio hatása patkányok néhány vvs-LP-s paraméterére Vérvételi idıpontok
MDA µmol/l
GSH mmol/l
1. minta (0. perc) 2. minta (45. perc) 3. minta (90. perc) Szignifikanciaszintek
244,9 A ±67,6 247,5 A ±62,1 279,0 B ±54,6 P< 0,01
0,96 ±0,24 1,01 ±0,37 0,97 ±0,48
GSH-Px U/g fehérje 47,8 A ±18,1 34,3 A ±17,9 32,03 B ±16,2 P< 0,05
SOD U/mg fehérje 30,05 A ±6,41 45,3 A ±25,5 18,04 B ±6,6 P< 0,001
Az adott paraméterek oszlopain belül az azonos betőkkel jelzett értékek között nincs szignifikáns különbség. Az A-, B-jelzéső csoportok közötti különbség min. P<0,05 szinten szignifikáns. Az adott paraméterek oszlopain belül alapnak az 1. vérvételi idıpontban vett minták vvs-hemolizátumból nyert értékeit tekintettem, ezért azokat A-val jelöltem. Kísérletem során az elülsı bélfodri verıér lekötését követıen már néhány másodperc múlva látható volt a lekötött artériájú bélkacsok savóshártyáin az erek színének cianotikus elváltozása, az artériák pulzációjának renyhülése, majd elmaradása, a savóshártyák színének "elszürkülése". A bél hypoxiájának ideje alatt az állatok légzése, szívverése nem változott. A reperfusio után az erek fokozatosan élénkebb rózsavörös színővé változtak, a pulzáció kifejezettebb volt, néhány perc elteltével az állatok szívverés- és légzésszáma fokozódott. A laboratóriumi vizsgálatok eredményét a 8. táblázat tartalmazza. A vörösvérsejtek MDA-koncentrációja 45 perccel a reperfusio után 30 %-kal emelkedett. Szintén ebben a vérvételi idıszakban mutattak változást a GSH-Px és a SOD aktivitási értékei is, mindkettı jelentıs mértékben, 15-20 %-kal csökkent az alapértékekhez viszonyítva. A GSH-koncentrációban szignifikáns eltérés nem mutatkozott. Következtetések A reperfusio hatása igen kifejezett volt az állatok fizikális vizsgálata során is, azonban a laboratóriumi eredmények alapján objektíven is megítélhetıvé vált a változás. Az MDA-koncentráció emelkedése a fokozott LP-t jelezte. Ez a folyamat a
87
vékonybélben a xantin-oxidáz hatására jöhetett létre, amelynek során O2.- keletkezik, ami az LP-s reakciók iniciátora lehet (189). A reperfusios gyökreakciók során jelentıs permeabillitási zavarok is kialakulhatnak (380) (129), a folyamat elırehaladtával pedig a láncreakciók folytán keletkezı lipidperoxidok egyre több, a védekezésben szerepet játszó anyagot használnak fel, illetve roncsolnak. Yoshikava és mtsai. vizsgálatai alapján, a patkányok gyomorfalában a hypoxia-reperfusio hatására nagymértékben csökkent a szérum E-vitamin-szintje is, ami a fokozott felhasználást jelezte (533). Stone és mtsai. SOD-ot alkalmaztak patkányok bélszövetének hypoxia-reperfusios hatásainak kivédésére abból a megfontolásból, hogy a hiányzó enzimkészlet pótlásával kivédjék a károsító mechanizmusokat (470). Enzimvizsgálataim is igazolták a szabadgyökök károsító hatását, hiszen mind a GSH-Px, mind a SOD szignifikánsan alacsonyabb aktivitást mutatott a reperfusiót követı 45. percben. IV. 3. 1. 2. Hypoxia - reperfusio hatásának vizsgálata a vörösvérsejtek LP-s paramétereire patkány arteria mesenterica craniálisának átmeneti ligatúrája és reperfusiója során allopurinolos elıkezelésben. A kísérlet célja Ebben a kísérletben az elızıhöz hasonló elrendezést alkalmaztam, azonban itt a mőtétet és a vérvételeket megelızıen allopurinollal a xantin-oxidáz gátlását hoztam létre. Az enzimgátlást annak érdekében alkalmaztam, hogy vizsgálhassam, vajon a vvs-ekben is csökkennek -e az LP-s folyamatok, mint az a korábbiakban megfigyelhetı volt a bélszövetek allopurinolos elıkezelését követıen. Anyag és módszer A kísérletet 12 db nıivarú White-Whistar patkányon végeztük az Országos Féderique Joliot Curie Sugárbiológiai és Sugáregészségügyi Kutatóintézetben. A patkányokat a mőtét elıtt 48 és 24 órával, valamint 30 perccel intraperitoneális allopurinolos elıkezelésben részesítettem 20 mg/ttkg adagban. Az allopurinolt, arra nézve 20%-os koncentrációban, fiziológiás NaCl-dal készített oldattal adagoltam. Az állatokat a mőtét elıtt narkotizáltam 0,1%-os pentobarbital-Na-oldattal 0,4 mg/ttkg dózisban intraperitoneálisan. A narkózis beállta után az elızıekben leírt kísérletet megismételtem. Mindkét v. jugularis-t preparáltam, innen Li-heparinos fecskendıbe 1-1 ml vért győjtöttem (alap vérminta). A hasüreg megnyitása után az arteria mesenterica cranialis lekötése következett, majd 45 perc múlva ismét 1-1 ml vért győjtöttem minden állattól (második vérminta), ezután a lekötéseket felengedtem és meggyızıdtem arról, hogy a véráramlás megindul az addig lekötött erekben és a bélfalban. A ligaturák felengedése utáni 45. percben ismét vérminta-győjtés következett (haramadik vérminta). Ezután 20-25 perc múlva az állatokat túldozírozott pentobarbital-Na-mal extermináltam. A kísérlet során megfigyeltem az állatok reakcióit és vizsgáltam néhány klinikai alapparamétert is. A laboratóriumi vizsgálatok során a vvs-hemolizátumból a következı paramétereket határoztam meg: MDA-, és GSH-koncentráció, valamint GSH-Px- és SOD-aktivitás.
88
Eredmények 9. táblázat Hypoxia reperfusio hatása patkány néhány vvs-LP-s paraméterére allopurinolos elıkezelés során Vérvételi idıpontok
MDA µmol/l
GSH mmol/l
1. minta (0. perc) 2. minta (45. perc) 3. minta (90. perc) Szignifikanciaszintek
220 ±15 226 ±14 209 ±16
1,10 A ±0,23 1,17 A ±0,11 1,34 B ±0,08 P<0,01
GSH-Px U/g fehérje 34 ±5,8 38 ±6,3 44 ±6,9
SOD U/g fehérje 32 ±7,2 43 ±6,4 42 ±3,5
Az adott paraméterek oszlopain belül az azonos betőkkel jelzett értékek között nincs szignifikáns különbség. Az A-, B-jelzéső csoportok közötti különbség min. P<0,05 szinten szignifikáns. Az adott paraméterek oszlopain belül alapnak az 1. vérvételi idıpontban vett minták vvs-hemolizátumból nyert értékeit tekintettem, ezért azokat A-val jelöltem. Az állatok bélfalán szabadszemmel is láthatóak voltak a lekötést követı elváltozások, hasonlóan az elızı kísérletben leírtakhoz. Az erek lekötése után pár másodperc múlva a lekötött artériájú bélkacsok ereinek pulzációja megszőnt, a savóshártyájuk színe szürkéskék lett, majd a ligatura feloldása után az erek pulzációja visszatért, a savóshártyák színe újra rózsavörös színővé vált. A vizsgált paraméterek változása a 9. táblázatban látható. Egyedül a GSHkoncentráció mutatott szignifikáns változást, értéke a második idıpontban vett vérmintákban 24%-kal volt magasabb az alapmintákéhoz képest. Az MDA-koncentráció alig változott a kísérlet során, a GSH-Px- és a SOD-aktivitás szintén nem mutatott szignifikáns eltérést, bár mindkettı aktivitása enyhe fokban emelkedett a második és a harmadik idıpontokban vett vérmintákban. Következtetések és javaslatok Bár a hypoxia-reperfusió hatásának jelei jól láthatóak voltak a mőtétek során, mégis érdekes megfigyelésünk volt, hogy az állatok az utolsó vérminták vételét követıen nem hullottak el. (Az elızı kísérletben a patkányok 10-20 percen belül 50%-a elhullott.) A laboratóriumi vizsgálatok alapján azt tapasztaltam, hogy az elızı kísérletben igazolt jelentıs LP-s hatások a jelen kísérletben nem alakultak ki. Ezt az eredményt részben az MDA-koncentráció alapszinten maradása jelezte, ami arra enged következtetni, hogy az LP folyamatai nem erısödtek fel a hypoxia-reperfusio során, továbbá az antioxidáns
89
védekezésben szerepet játszó enzimek aktivitása sem csökkent. A GSH szignifikánsnak tekinthetı koncentráció-emelkedésére elfogadható magyarázatot nem találtam. Az elvégzett kísérlet alapján feltételezem, hogy patkányokban a hypoxia-reperfusio LP-t fokozó hatásait az allopurinol kivédi. Az allopurinolnak ebben az értelemben vett kedvezı hatása mind az állatok mortalitási mutatójában, mind a laboratóriumi eredményekben megmutatkozott. Az allopurinolnak LP-t gátló hatása nagy valószínőséggel azon a tényen alapul, hogy gátolja a xantin-oxidáz mőködését, így az enzim által katalizált folyamatban az O2.- képzıdését. Kísérletemmel azt is igazolni tudtam, hogy a vvs-ek vizsgálata kielégítıen jelezte LP-s folyamatok változását. A várt változások az elızı és a jelenlegi kísérletben is igazolódtak. Fontos azonban megjegyezni, hogy az allopurinol hatása, így a xantinoxidáz meghatározó szerepe a hypoxia-reperfusiós folyamatokban nem minden állatfajban igazolódott úgy, mint patkányban (268), ugyanis a kutyákban végzett hasonló vizsgálatok alapján az allopurinol nem bizonyult hatékonynak (287). A patkányokon végzett mőtétek alapján javasolható az ileus szabadgyökös hatásainak más állatfajokon történı vizsgálata. Továbbá más antioxidáns hatású anyagok, pl. a deferoxamin és az L-arginin hatékonyságának modell-jellegő és természetes körülmények közötti elemzése. IV. 3. 2. Hypoxia - reperfusio hatásának vizsgálata a vörösvérsejtek LP-s paramétereire kutya vese-autotranszplantáció során A kísérlet célja A patkányokon végzett vizsgálatok nyomán információt szerezhettem a vvs-ek néhány LP-s paraméterének változásáról, amely a bélszövet hypoxia -reperfusiója miatt alakult ki. Fontosnak bizonyult, hogy nemcsak a bél, hanem egy parenchymás szerv hasonló hatásra bekövetkezı LP-s válaszáról is győjthessek adatokat a vvs-ek vizsgálata révén. Ebbıl a megfontolásból kiindulva terveztem modell-kísérletet kutyákon, amelyeken a vesének, mint parenchymás szervnek hypoxia - reperfusióját idéztük elı autotranszplantációval. Ezzel a kísérlettel nemcsak a kórkép kialkulásának szabadgyökös változásait kívántuk modellezni, hanem a kutyákon létrehozható transzplantáció lebonyolításának lehetıségét is. Eben a kísérletben az állatok antikoaguláns heparinnal történı elıkezelése és a kioperált vesék hideg Ringer-oldattal való átmosása történt korábbi, más célból végzett hasonló kísérlet alapján (380). Erre azért volt szükség, mert a vesét, mint egy erekkel gazdagon átszıtt szervet ismételten keringésbe állítani csak úgy lehet, ha érhálózata nem trombotizálódik. Ugyanakkor várható volt, hogy a szöveti hőtés befolyással lehet a szabadgyökös folyamatok erısségére is. Szöveti hőtésben nem részesülı kontrollcsoport beállítására nem volt lehetıség, mert az az állatok mortalitását növelte volna. Anyag és módszer A kísérletben 7 egészséges (4 szuka, 3 kan), 5-8 éves korú kutyát használtam fel. A mőtéti beavatkozásokat az Állatorvostudományi Egyetem Sebészeti Tanszékén, és annak munkatársai segítségével végeztem. A kutyákat ketamin-xylazin premedikáció után halotánnal inhalációs úton narkotizáltuk, majd 100 NE/testtömeg kg Na-heparin
90
intravénás adását követıen az egyik veséjüket az erek és az ureter lekötése után eltávolítottuk. Ezután vettük az elsı (alap) vérmintát a vena cephalica antebrachiibıl. Ezután a kiemelt vesét 5 percig 0-2 oC-ra hőtött Ringer oldattal átmostuk, majd visszahelyeztük a mőtött állat hasüregébe. Az arteria renalist az arteria iliaca externába, a vena renalist a vena iliacába szájaztattuk, az uretert pedig a húgyhólyagba vezettük. Az erek felengedése után a hasfali sebet zártuk. A vese reperfusiója utáni 5., 10., 20., 30., 60. percben, valamint 24 órával késıbb vérmintákat győjtöttem. A kísérlet folyamán a kutyák klinikai alappvizsgálatát is elvégeztem. A vérvételek után közvetlenül sav-bázis paramétereket (pH, pO2, pCO2, HCO3-- és + K - koncentráció) határoztam meg. A vörösvérsejtekbıl az elsı kísérletnél is említett LP-s paraméterek vizsgálatát (MDA, GSH, GSH-Px, SOD) végeztem. A hematológiai mintákból a hemoglobin-koncentráció (Hb) és a hematokritérték (Ht) meghatározása történt. A vérplazmából összfehérjét (TP), kreatinint (Crea), karbamidot (Karb) és kreatin-kinázt (CK) mértem. A kutyák vesemőködését a mőtétet követıen napokig ellenıriztem a vizeletürítés módjának, frekvenciájának és mennyiségének megfigyelésével, valamint a vizelet és a vér laboratóriumi vizsgálatával. A harmadik napon kiválasztásos urográfiás radiológiai módszerrel is kiegészítettük kontrollvizsgálatokat. Eredmények 10. táblázat 10/a. táblázat A hypoxia - reperfusio hatása a kutya néhány vvs-LP-s paraméterére vese autotranszplantáció során Vérvételi idıpontok alap
MDA µmol/l 272,6 A ±50,5 294,9 A ±87,6 310,3 A * ±78,2 338,9 A *
GSH GSH-Px SOD mmol/l U/g fehérje U/mg fehérje 0,89 18,7 20,3 ±0,3 ±3,94 ±11,5 5 perc 1,05 19,4 20,3 ±0,36 ±3,13 ±10,8 10 perc 1,03 20,5 16,8 ±0,36 ±4,1 ±5,6 20 perc 0,95 20,9 16,9 ±55,9 ±0,3 ±4,3 ±5,0 30 perc 321,0 A * 1,02 20,8 17,9 ±53,3 ±0,34 ±3,2 ±5,5 60 perc 333,9 A * 1,01 19,9 18,5 ±40,0 ±0,37 ±2,4 ±4,5 24 óra 370,7 B * 1,08 20,6 17,2 ±55,6 ±0,35 ±2,1 ±6,9 *A 10., a 20., a 30. és a 60. percben vett vérmintákban a vvs-ek MDA-koncentrációja szignifikánsan nem tér el a 24. órás értékektıl
Az adott paraméterek oszlopaiban az azonos betőkkel jelzett értékek között nincs szignifikáns különbség. Az A-, B-jelzéső csoportok közötti különbség min. P<0,05 szinten szignifikáns. Az adott paraméterek oszlopain belül alapnak a reperfusio elıtti mintákból nyert értékeket tekintettem, ezért azokat A-val jelöl-tem.
91
10/b. táblázat A hypoxia - reperfusio hatása a kutya néhány klinikai biokémiai és sav-bázis paraméterére vese autotranszplantáció során Vérvételi idıpontok alap 5 perc 10 perc 20 perc 30 perc 60 perc 24 óra
Karb mmol/l 12,14 ±10,8 13,1 ±13,2 12,3 ±11,7 12,1 ±10,6 12,8 ±10,9 13,6 ±12,8 18,0 ±12,4
Crea µmol/l 168,3 ±107 181,2 ±116 201,1 ±113 193,6 ±126 159,1 ±64,2 198,8 ±117 293,2 ±155
CK U/l 166,9A ±77 204,0A ±111 169,3A
pH 7,1A ±0,2 7,05 ±0,1 7,06A
±80 153,4A ±57 246A ±138 2165B ±220 2036B ±567
±0,2 7,1A ±0,1 7,16A ±0,1 7,26B ±0,1 7,32B ±0,2
pCO2 Hgmm 66,6 ±28,9 75,9 ±26,4 80,4 ±30,4 71,9 ±37,7 70,1 ±12,5 60,2 ±11,5 43,01 ±9,9
pO2 Hgmm 76,6 ±57,8 102,2 ±52,8 106,4 ±60,2 117,1 ±78,5 68,8 ±18,8 46,6 ±18,8 49,6 ±23,1
K+ mmol/l 4,0 ±0,7 4,0 ±0,9 4,0 ±0,98 4,1 ±0,98 3,9 ±0,5 4,0 ±0,67 4,0 ±0,6
HCO3mmol/l 20,8 ±1,9 20,06 ±2,5 19,86 ±3,0 19,5 ±3,0 20,4 ±2,4 20,1 ±2,5 21,6 ±4,9
Az adott paraméterek oszlopain belül az azonos betőkkel jelzett értékek között nincs szignifikáns különbség. Az A-, B-jelzéső csoportok közötti különbség P<0,05 szinten szignifikáns, kivétel a CK értékei, mert ott P<0,01szintő szignifikanciát kaptam. Az adott paraméterek oszlopain belül alapnak a reperfusió elıtt vett minták vvs-hemolizátumból nyert értékeket tekintettem, ezért azokat A-val jelöltem. Az állatok mőtéte során a klinikai vizsgálat alapján, változást csak a reperfusiót követıen lehetett tapasztalni, a szívverésszám (80/p-rıl 150/p-re), a légzésszám (35/p-rıl 55/p-re) nıtt. Ez a fokozott légzés és szívverés még a 60. percben is tapasztalható volt, a 120. percben azonban élettani értékeket mutatott. A mőtét után az állatok bágyadtak és étvágytalanok lettek, vörhenyes-véres színő vizeletet ürítettek. A vizelet Hb-tartalma ++/+++ volt, üledékvizsgálattal három-négy napig látóterenként 50-100 vvs-et, 40-80 neutrophil granulocytát, 2-3 hólyaghámsejtet és 5-6 vesetubulusból származó hámsejtet lehetett látni. A mőtét után három napig három kutya rektális hımérséklete 40 oC-körüli volt. A mőtétet követı öt nap után minden állat tünetmentes, élénk, jó étvágyú lett, minden vizsgált vesefunkciót jelzı paraméter (Karb, Crea) valamint a vizeletvizsgálati lelet élettani szintő volt. A kiválasztásos urográfia alapján a transzplantált vesék kielégítıen mőködtek. A plazmabiokémiai, a vérgáz-analitikai és a vvs-LP-s vizsgálatok, eredményeit a 10. táblázat tartalmazza. A kísérlet során szignifikánsan eltérı volt a pH, a
92
pCO2, a CK és az MDA. A pH értékeinek az acidózis irányából az élettani szint felé történı emelkedése a reperfusiót követı 60. perctıl vált kifejezetté, ekkor már a mőtéti narkózis véget ért. A 24. órában, szinte élettaninak tekinthetı értékeket mértem. A pCO2 a reperfusio után az 5. és a 10. percben emelkedett, a 24. órában pedig élettani szintre csökkent. A CK már a 60. percben szignifikáns, csaknem 10-szeres aktivitásfokozódást mutatott. Az LP-s paraméterek közül csak az MDA-koncentráció mutatott szignifikáns, 30 %-os növekedést. Az alap és a reperfusiót követı 5. percben vett vérmintában mérhetı MDA-értékekhez képest szignifikánsan emelkedtek a 24. órában mért értékek, bár az MDA-koncentráció emelkedése már a 10. percben megkezdıdött. A GSH és a GSH-Px értékei nem változtak a kísérlet során, a SOD-aktivitás értékei, bár nem szignifikánsan, de már a 10. percben elkezdtek csökkenni és ez a csökkent aktivitás még a 24. órában is megmaradt. Következtetések és javaslatok A pH kezdeti alacsony szintje a narkózis következménye lehet, ami a hyperkapnia miatt alakulhatott ki (ezt a pCO2 növekedése is jelezte, ugyanakkor a HCO3-koncentráció nem változott). A három paraméter együttes értékelésével megállapítható, hogy a folyamat respiratoricus acidosis volt. A reperfusio utáni 60. perctıl, a respiratoricus acidosis megszőntével a pH lassú rendezıdése következhetett be. A pCO2, mint respiratorikus komponens, emelkedett szintjének kialakulása hátterében a narkózis légzést deprimáló hatásai állhattak. A mőtét alatt a lélegeztetı készülék ballonjának pumpálásával, valamint a belélegeztetett O2 nyomásának emelésével rendezni lehetett az állat "sekély" légzésének vérgáz-változásait. A CK fıként az izmokból származik, vérplazmabeli aktivitása izomsérülések esetén emelkedik (84). A mi kísérletünkben ez a hatás már a 60. percben kifejezett volt és a 24. órában is magas szintet mutatott. Az MDA-koncentráció vérplazmabeli emelkedését Pincemail és mtsai. is tapasztalták humán veseátültetés során (389). Szerintük ennek a paraméternek a növekedése a mőtétet követı neutrophil-aktiváció miatt alakulhatott ki, amit az általuk igazolt MPO-aktivitás fokozódása is jelzett. A mi esetünkben szintén kialakulhatott a veseszövet enyhe gyulladásos elváltozása, neutrophil granulocytás infiltrációja. Erre a vizeletüledékben kimutatható nagy fehérvérsejtszám is utalt. Ez a jelenség annak ellenére is kifejezett volt, hogy a mőtétet teljesen steril körülmények között hajtottuk végre. Pincemail és mtsai. megfigyeléseiben természetes lehetett a gyulladásos beszőrıdés az átültetett idegen szövetben, mert ık az emberekben a vese heterotranszplantációjának hatását vizsgálták. Parks és mtsai. allopurinollal ki tudták védeni a vese reperfusiós károsodásait nyulakban, ami arra utalt, hogy a vese LP-s folyamataiban a xantin-oxidáz vezetı szerepet játszhat (380). Nath és mtsai. patkányokon végzett vese hypoxia - reperfusiós kísérlet során azt tapasztalták, hogy a reperfusio után a vérben nıtt az LP mértéke, a GSH-Px-aktivitás, mintegy 5%-kal csökkent, és a plazma E-vitamin-koncentrációja szintén jelentıs csökkenést mutatott azokban az állatokban, amelyek E-vitamin- és szelénhiányos táplálékot fogyasztottak (356). Kónya és mtsai. kimutatták ugyan a kutyák veséjében létrehozott hypoxia-reperfusio okozta MDA-koncentráció emelkedést, de a változások nem voltak szignifikánsak (271). Ugyanık azt is megfigyelték, hogy az allopurinol nem volt hatékony az LP-s folyamatok végtermékeként létrejövı MDA-koncentráció csökkentésében. Vizsgálatomban a nem szignifikáns SOD-aktivitás-csökkenés a fokozott
93
lebomlás következménye lehetett. Ebben a kísérletben az MDA-koncentráció emelkedése jelezte ugyan a hypoxia-reperfusiónak a vvs-ek LP-s folyamataira kifejtett hatását, azonban ez enyhe reakció volt, ami a kioperált vese hideg Ringer-oldattal történt átmosása miatt jelentkezhetett. Hasonló hatást támaszt alá Barta és mtsai. megfigyelése is, akik szintén azt találták, hogy a szíven végzett sebészeti beavatkozások során alkalmazott megfelelı szöveti hőtés elegendı a reperfusióba állított szövet LP-s folyamatainak kivédésére (38). A kutyák vizsgálata alapján javasolható, hogy a szervtranszplantációs mőtétek során minden esetben alkalmazzanak szöveti hőtést, továbbá érdemes hasonló paraméterek alapján más állatfajon is (pl. macskán) vizsgálni a vesetranszplantáció LP-s következményeit, de nemcsak az autotranszplantáció, hanem a heterotranszplantáció esetében is. IV. 4. Jellemzı szervkárosodásokban és/vagy anyagforgalmi betegségben szenvedı kutyák és szarvasmarhák vörösvérjetjeinek LP-s változásai Az elızetes megfigyelések késztettek arra, hogy vizsgálatokat végezzek kutyák és szarvasmarhák egyes természetes kórfolyamatainak szabadgyökös hatásairól a vvs-ek néhány LP-s paramétere alapján. Minden esetben a betegcsoportok között hasonló körülmények között lévı egészséges (kontroll) társaikkal összehasonlítva végeztem a vizsgálatokat. IV. 4. 1. Egyes jellemzı szervkárosodásban szenvedı kutyák vörösvérjetjeinek LP-s változásai A vizsgálat célja Ebben a kísérletben arra kerestem a választ, hogy különbözı természetes szervkárosodásban, illetve -funkciózavarban (a máj, a vese, a hasnyálmirigy megbetegedéseiben és a heveny gyulladással járó folyamatokban) szenvedı kutyák kórfolyamataiban kialakulnak-e a vvs-ekben mérhetı fokozott szabadgyök-képzıdésre utaló jelek. A csoport-alanyok kiválasztásában általános szempontként az volt a legfontosabb, hogy a csoportokba azon állatok kerüljenek, amelyek szervi betegségeit nem egyértelmően szabadgyökképzı folyamatok váltották ki. Ebben a kísérletben a szervi elváltozások okozta LP-s folyamatok felderítését céloztam, nem pedig olyan gyökképzı folyamatokat, amelyek esetleg szervekre lokalizálódó betegségeket is okoznak. Ebbıl a megfontolásból kiindulva kiszőrtem mindazon betegeket, amelyek esetében a kórelızményi adatokból kiderült, hogy xenobiotikum okozta szervi betegségben szenvednek. Anyag és módszer Az Állatorvostudományi Egyetem Belgyógyászati Tanszék és Klinika kisállatkórházába különbözı kórképekkel került kutyák közül kiválasztottam hasonló korú (4-8 éves), hasonló testtömegő (25-30 kg-os), különbözı fajtájú és nemő állatokat. Heveny-félheveny veseelégtelenségben szenvedık közül 7 kutyát, félheveny-idült májelégtelenségben szenvedık közül 14-et, 5 heveny hasnyálmirigy-gyulladásost, 5
94
heveny, nem specifikus gyulladás tüneteit mutató állatot, valamint 7 egészséges kutyát. Az állatokat ketrecekben egyenként helyeztük el. A kutyák mindegyikébıl a vérvételek a kórházi felvétel idıpontjában, a terápiás beavatkozásokat megelızıen, de a klinikai vizsgálatukat követıen történtek. A teljes vérbıl rutinhematológiai vizsgálatokat (vörösvérsejtszám /vvs-szám/, fehérvérsejtszám /fvs-szám/, hematokritérték /Ht/ stb.) végeztem. A vérplazmából karbamid- (Karb), kreatinin- (Crea), anorganikus-foszfát- (Pi) koncentrációt, alanin-transzamináz- (ALT), alkalikus-foszfatáz- (ALKP), α-amiláz(Amyl), lipáz- (Lipa) aktivitást mértem. A vörösvérsejtek hemolizátumából MDA- és GSH-koncentrációt valamint GSH-Px- és SOD-aktivitást mértem. Az említett csoportok kialakításának speciális szempontjai a következık voltak: 1. Félheveny-idült veseelégtelenségben szenvedık csoportja (n=7): • kritériumok a kórelızmény és a klinikai vizsgálatok tekintetében: nem toxikus anyag (pl. nem etilénglikol), nem hemolízis (pl. nem babesiosis) okozta elváltozás, nem túlheveny folyamat, viszont polyuria-polydypsia, esetleg hányás; • kritériumok a klinikai biokémiai paraméterek tekintetében: Karb > 20 mmol/l, Crea > 350 µmol/l, Pi > 2 mmol/l, Amyl > 800 U/l; • kritériumok a vese ultrahangdiagnosztikai leleteinek tekintetében: echodús vagy vegyes echodenzitású vesekéreg, esetleg fibrotikus folyamatok jelei, közepesen tág, vagy fiziológiás nagyságú vesemedence; • kritériumok a vizeletvizsgálati leletek tekintetében: vizeletürítés mértéke > 100 ml/ttkg/nap, proteinuria > +/- (szulfoszalicilsavas módszerrel), üledékben megjelenı vesetubulus-hámsejtek > 4-5/ látótér, esetleg cilinderek megjelenése. 2. Félheveny-idült májelégtelenségben szenvedık csoportja (n=14): • kritériumok a kórelızmény és a klinikai vizsgálatok tekintetében: nem toxikus anyag (pl. nem metaldehid), nem portoszisztémás shunt, nem egyértelmően daganatok okozta elváltozás, nem túlheveny folyamat, viszont enyhén-közepesen kifejezett acholiás bélsár ürítése, esetleg sárgaság jelei; • kritériumok a klinikai biokémiai paraméterek tekintetében: ALT > 100 U/l, ALKP > 400 U/l; • kritériumok a máj ultrahangdiagnosztikai leleteinek tekintetében: echodús vagy vegyes echodenzitású májállomány, megnagyobbodott máj, esetleg cirrhoticus folyamatok jelei, közepesen, vagy kifejezetten tág epehólyag, esetleg tág májvénák; • kritériumok a vizeletvizsgálati leletek tekintetében: vizeletürírtés mértéke > 50 ml/ttkg/nap, enyhe bilirubinuria, urobilinogénuria, esetleg az üledékben megjelenı tirozin-, vagy cisztinkristályok. 3. Heveny hasnyálmirigy-gyulladásban szenvedık csoportja (n=5): • kritériumok a kórelızmény tekintetében: nem toxikus anyag vagy ileus okozta elváltozás, viszont általános hasi fájdalom, esetleg hányás, közepesen híg bélsár; • kritériumok a klinikai biokémiai paraméterek tekintetében: Amyl > 1000 U/l, Lipa > 800 U/l, Crea < 250 µmol/l, Karb < 15 mmol/l, ALT < 100 U/l, ALKP < 400 U/l; • kritériumok a hasnyálmirigy ultrahangdiagnosztikai leleteinek tekintetében: a hasüregben könnyen felkereshetı, duzzadt vagy vegyes echodenzitású hasnyálmirigy, a belekben folyadék és gáz látható, de ingamozgás nem figyelhetı meg;
95
• kritériumok a vizeletvizsgálati leletek tekintetében: vizeletürítés mértéke < 50 ml/ttkg/nap, proteinuria < ++ (szulfoszalicilsavas módszerrel), enyhe bilirubinuria, urobilinogénuria, üledékben megjelenı vesetubulus-hámsejtek < 2-3/ látótér. 4. Nem specifikus gyulladásos folyamatban szenvedık csoportja (n=5): • kritériumok a kórelızmény és a klinikai vizsgálatok tekintetében: nem toxikus anyag (pl. nem paraquat, nem sav, nem lúg), nem jelentıs szöveteszétesés (nem égés, nem súlyos trauma, nem daganat, stb.) okozta elváltozás, viszont közepesen súlyosfokú bronchitis, tonsillitis esetleg gastritis jelei, jelentıs szervi károsodás nem tapasztalható, testhımérséklet < 40,0 oC; • kritériumok a hematológiai paraméterek tekintetében: fiziológiás Ht-érték és vvsszám mellett, fvs-szám < 20 x 109/l; • kritériumok a klinikai biokémiai paraméterek tekintetében: a paraméterek mind az élettani értéktartományokon belül vannak; • kritériumok a vizeletvizsgálati leletek tekintetében: vizeletürítés mértéke < 50 ml/ttkg/nap, proteinuria < + (szulfoszalicilsavas módszerrel), enyhe bilirubinuria, urobilinogénuria, üledékben megjelenı vesetubulus-hámsejtek < 1-2/ látótér, fehérvérsejtek < 2-3/ látótér. 5. Egészséges kutyák csoportja (n=7): A klinikai vizsgálatok és a laboratóriumi paraméterek tekintetében szervkárosodás tüneteit nem mutató, egészséges állatok.
96
Eredmények 11. táblázat Jellemzı szervkárosodásban szenvedı kutyák vizsgált vvs-LP-s, hematológiai és plazmabiokémiai paraméterei Vizsgált paraméterek Vvs-MDA µmol/l Vvs-GSH mmol/l Vvs-GSH-Px U/g fehérje Vvs-SOD U/mg fehérje Vvs-szám x 1012/l Fvs-szám x 109/l Ht l/l ALT U/l Karb mmol/l Crea µmol/l Amyl U/l Pi mmol/l ALKP U/l
Vesefunkció Májfunkció- Hasnyálmirigy zavar -gyulladás zavar 348,1 B 360,9 B 383,4 B ±34,2 ±56,1 ±38,4 1,5 1,2 1,1 ±0,8 ±0,4 ±0,3 34,8 30,5 32,3 ±05,3 ±1,0 ±11,7 13,2 B 9,7 C 15,4 B ±3,8 ±2,7 ±3,7 6,4A 6,8A 6,7A ±1,8 ±1,3 ±1,2 15,9A 14,6A 15,1A ±4,4 ±7,9 ±9,3 A A 40,4 44,2 43,3A ±12,9 ±8,4 ±7,6 78,0A 191,6B 36,0A ±49,9 ±67,2 ±9,6 42,9 B 4,8 A 11,6 A ±19,7 ±1,2 ±3,9 605,9 B 66,9 A 178,4 A ±269,9 ±28,9 ±126,2 1345,1 B 556,2 A 1410,6B ±254,3 ±125,1 ±244,9 3,7 B 1,7 A 1,3 A ±1,4 ±0,8 ±0,4 132,5 A 762,7 B 366,2 A ±65,4 ±329,6 ±157,6
Nem specifikus gyulladás 374,9 B ±53,8 1,3 ±0,5 29,5 ±5,8 21,2 A ±3,6 5,3B ±1,1 30,4B
Egészséges
±5,8 32,9B ±6,2 86,5A ±70,1 9,4 A ±4,2 176,0 A
±3,6 42,5A ±3,7 43,9A ±17,7 8,1 A ±1,3 105,7 A
±106,2 345,2 A ±154,4 1,3 A ±0,4 234,6 A ±154,7
±43,6 431,1 A ±104,3 1,2 A ±0,3 146,7 A ±76,3
253,7 A ±31,6 1,3 ±0,5 38,8 ±4,3 24,1 A ±3,4 6,5A ±1,2 10,3A
Az adott paraméterek sorain belül az azonos betőkkel jelzett értékek között nincs szignifikáns különbség. Az A-, B-jelzéső csoportok közötti különbség min. P<0,05 szinten szignifikáns. Az adott paraméterek oszlopain belül alapnak az egészséges csoport mintáiból nyert értékeket tekintettem, ezért azokat A-val jelöltem.
97
A vizsgálatok eredményét a 11. táblázat tartalmazza. A félheveny-idült veseelégtelenségben szenvedık vörösvérsejtjeiben az MDA-koncentráció a kontrollokhoz képest (30 %-kal) nagyobb volt, a GSH- és a GSH-Px-értékek nem változtak szignifikánsan, a SOD-aktivitás azonban majdnem 50 %-kal kisebbnek bizonyult. A félheveny-idült májelégtelenségben szenvedı állatok esetében a vörösvérsejt hemolizátumban az MDA-koncentráció 35 %-kal nagyobbnak adódott, a GSH- és a GSH-Px-értékek nem változtak szignifikánsan, a SOD-aktivitás pedig jelentısen, 60 %kal csökkent az egészségesek értékeihez viszonyítva. A heveny hasnyálmirigy-gyulladásban szenvedıknél a vörösvérsejtek MDAkoncentrációja 45 %-kal nagyobb volt, a GSH- és a GSH-Px-értékek nem változtak szignifikánsan, a SOD-aktivitásokat pedig a kontrollok hasonló értékeihez képest 35 %kal kisebbnek mértem. A heveny, nem specifikus gyulladásos folyamatban szenvedı, lázas kutyák vörösvérsejtjeiben az MDA-koncentráció 50 %-kal nıtt, a GSH-, a GSH-Px-, és a SODértékek közül, azonban a kontrollok értékeihez képest egyik sem tért el. Következtetések és javaslatok A veseelégtelenségben szenvedı kutyák vvs-jeiben az MDA-koncentráció emelkedése azzal magyarázható, hogy a vese elsıdleges- vagy másodlagos gyulladása a fagociták aktivitását eredményezve hozhatja létre a szabadgyökös reakciótermékeket. A vese számos, potenciálisan szabadgyökös reakciót elıidézı anyag kiválasztó szerve, így veseelégtelenségben ezen anyagoknak a vérben való felhalmozódása fokozott LP-s folyamatokat eredményezhet. A vesefunkció zavarában az egyik potenciálisan felhalmozódó anyag a hidrogénion, amely azáltal iniciál LP-t, hogy redukálja a molekuláris oxigént (266). A mitokondriumokban keletkezı O2.- is könnyebben tud redukálódni hidrogénion jelenlétében perhidroxigyököt képezve (164). A SOD-aktivitás csökkenése egyrészt a szabadgyökök okozta direkt károsodás miatt jöhet létre, másrészt a betegségben jelentkezı intermedier anyagcsere zavar (pl. nem evés, metabolikus acidosis stb.) csökkentheti az enzim de novo szintézisét (13). A májbeteg kutyák esetében a májsejt-elfajulás másodlagos gyulladással, valamint egyes toxikus metabolitok (pl. NH3, lysosomalis szubsztrátok, enzimek, aminosavak derivátumai stb.) felhalmozódásával járhat, ami fokozott gyökképzésre vezethet (472). Ezekben a betegségekben a lipidmolekulák (TG, PUFA) fokozott lerakódása sem elhanyagolható, ami szintén jó "táptalaja" a lipidhidroperoxidok képzıdésének. A SODaktivitás csökkenése a vesénél említett okokból következhet be, itt azonban jelentısebb lehet a szintézis zavara, hiszen a máj fehérjeanyagcsere-zavara igen hamar bekövetkezik annak megbetegedése során. Feltehetıleg ezt jelzi az igen kis SOD-érték. A hasnyálmirigy gyulladásos mechanizmusában nemcsak a fagocitasejtek képesek szabadgyököket termelni, hanem a szerv "önemésztıdési" folyamata is jelentıs LP-t fokozó tényezı lehet (479). Érdekes tapasztalatukat közlik Matkovics és mtsai. (320), hogy azon pancreatitises embereknek akiknek magas vérplazmabeli Lipa- és Amylaktivitásuk volt, nemcsak vérplazmájuk MDA-koncentrációja volt nagyobb és GSHkoncentrációja volt kisebb, de vvs-jeik membránstruktúrája is megváltozott. Ez utóbbit haemorrheologiai (vvs-deformabilitási) vizsgálatokkal igazolták. Ebben a vizsgálatban a
98
betegek vvs-jeiben kisebb MDA- és nagyobb GSH-koncentrációkat, valamint nagyobb SOD- és kisebb GSH-Px-, valamint kisebb CAT-aktivitási értékeket mértek. Ezek az eredmények részben ellentmondanak az én vizsgálati eredményeimnek. Véleményem szerint azonban, ennek a hátterében az állhat, hogy az általam vizsgált esetek kifejezetten hevenyek voltak, míg az embereknél számos esetben a krónikus folyamatban szenvedık kerültek vérvételere a vizsgálathoz. A heveny gyulladásos, magas fehérvérsejt-számmal járó folyamatok szintén jelentıs LP-t fokozó hatásúak a vörösvérsejtekre nézve, hiszen a fagocitasejtek nagy számban vannak jelen a vérpályában. A megfigyelések eredményei alapján javasolható a kutyák számos klinikai kórfolyamatainak részletesebb vizsgálata az LP szempontjából. Továbbá annak elemzése, hogy a kórfolyamatok gyógykezelésének antioxidáns hatású anyagokkal történı kiegészítése milyen mértékben segíti elı a gyógyulást. IV. 4. 2. Az ellést követı relatív energiahiány hatása szarvasmarhák vörsvérsejtjeinek egyes LP-s paramétereire A vizsgálatok célja Szinte tényszerőnek tartjuk, hogy a nagy tejtermelésre szelektált holstein-fríz fajtájú szarvasmarhák a magyarországi átlagos takarmányozási viszonyokon az ellés körüli idıszakban katabolitikus állapotba kerülnek. Ez a folyamat egyes egyedekben klinikai tünetekben is megnyilvánuló betegségeket okozhat pl. ketózis, májelzsírosodás, szaporodásbiológiai zavarok, rossz ellenállóképesség stb. (63). Vizsgálataim során arra kívántam fényt deríteni, hogy azokban az állatokban, amelyekben az ellést követıen azonosnak tekinthetı takarmányozási viszonyok mellett alakult ki az energiahiány (vagyis az erre utaló ketonaemia és ketonuria), illetve a májelfajulás (vagyis az erre utaló magas AST-aktivitás), vvs-jeik egyes paraméterei alapján ki lehet-e mutatni az LP fokozódását. Kontrollként azok az állatok szerepeltek, amelyekben nem alakultak ki ezek a klinikai laboratóriumi tünetek. A cél tehát az ellés körüli energiahiány és a májelfajulás okozta LP igazolása volt és nem az LP-t fokozó tényezık miatt kialkuló energiahiányos állapot és májelfajulás detektálása. Ezekbıl a megfontolásokból kiindulva azok az állatok kerültek a vizsgálati csoportokba, amelyek a fizikális vizsgálatok alapján nem mutattak lábvégmegbetegedésre, tıgy-, méhgyulladásra, vesegyulladásra vagy egyéb toxicus ártalomra (pl. mycotoxicosis, nitritmérgezés stb.) jellemzı tüneteket és a fizikális vizsgálatok során sem voltak keringési rendszeri (pl. pericarditis), légzıszervi (bronchits, pneumonia stb.), hasőri (pl. peritonitis) és az említetten kívüli egyéb enterális (bendıfelfúvódás, oltógyomor helyzetváltozás, bélgyulladás stb.) kórfolyamatra utaló elváltozásaik. Anyag és módszer Az ellést követı 2-3 napon belül 31 holstein-fríz szarvasmarhából győjtöttem vérmintákat. Az állatok egy 300-as tehenészetbıl származtak, és kb. 2-4 éves korúak voltak. A tehenészetben kötött tartású technológiát alkalmaztak, testömegük kb. 550-650 kg volt, laktációs tejtermelésük mintegy 4900-5600 l. A takarmányozásukat az életfenntartó és a laktációs energiaigényüknek megfelelıen állították össze. Ennek fıbb
99
komponensei a silókukorica-szilázs, a tejelıtáp és a lucernaszéna volt. Az állatok vízhez ad libitum jutottak. A vizsgálatban szereplı minden állat részesült ebben a takarmányozásban, azonban a takarmányfelvétel egyedi ellenırzésére nem volt lehetıség. Az állatok kiválasztása után vizeletminták vétele történt, majd az állatok mellett elvégeztem a vizeletvizsgálatot, különös tekintettel a vizelet ketonanyag koncentrációjára, amihez a Ross-próbát alkalmaztam. Ezután vérmintavétel következett. A vérminták feldolgozása során a vérplazmából Ross-próbával ellenıriztem a ketonkoncentráció mértékét, majd vizsgáltam a karbamid- és a glükózkoncentrációt, valamint az AST-aktivitást. Ezután az állatokat három csoportba osztottam, majd a vörösvérsejtek hemolizátumából MDA-, GSH-koncentrációt és GSH-Px- és SODaktivitást mértem. A csoportba osztás általános szempontja az volt, hogy létrehozzak három csoportot, egyet az energiahiányos állapotot mutató, egyet a májelfajulást mutató és egyet az egészséges állatok közül. Az elsı csoportba azokat soroltam, amelyekben az energiahiányos állapot laboratóriumi jelei (ketonuria, ketonaemia) mutatkoznak. Ennek biokémiai magyarázatát az adta, hogy a máj elegendı szénhidrát, illetve az abból is képzıdı oxálecetsav hiányában a zsírsavak lebontásából származó acetil-koenzim-A molekulákat nem tudja a citrátkörbe kapcsolni, így azok egymással kapcsolódva ketonanyagokat hoznak létre. A ketonanyagok koncentrációnövekedése a vizeletbıl vérplazmából kimutatható (281). A második csoportba azokat az állatokat soroltam, amelyek AST-aktivitása nagy volt. A csoportba osztásnak ezt a szempontját az alábbiak indokolták. A korábbi vizsgálatokkal igazolni lehetett (63), hogy az energiahiány következtében a májban megnövekvı zsírtartalom sok esetben olyan mértékő lehet, hogy a sejtek károsodása révén az AST vérplazmabeli aktivitásának jelentıs emelkedését okozza. Az AST-aktivitás enyhe emelkedését enyhefokú zsírlerakódásban is tapasztalni lehet, amikor az ellés körüli idıszakban élettaninak tekinthetı zsírlerakódás alakul ki a májban, ami kb. 100-120 g/kg zsírtartalmat jelent (230). Figyelembe vettem azt is, hogy ennek az enzimnek az aktivitása nemcsak a májelzsírosodás következtében kialakuló sejtkárosodáskor emelkedik meg, hanem más toxikus jellegő májelfajulás, sıt jelentısebb izomkárosodás esetén is (255). Az izomkárosodás látható, vagy gyanítható jeleit mutató állatokat a fizikális vizsgálatok idején "kiszőrtem", így vérmintáik eredményei ebben a kísérletben nem szerepelnek. A csoportok kialakításának speciális szempontjai a következık voltak: 1. Az energiahiányra utaló jeleket mutató állatok csoportja (n=10): • kritériumok a kórelızmény és a klinikai vizsgálatok tekintetében: renyhe bendımozgások (bendımozgás < 1-2/5 perc), közepes-rossz kondíció; • kritériumok a vérplazma és a vizelet ketonkoncentrációjának tekintetében: vizeletketon: ++/+++, plazmaketon: +/++; • kritériumok a máj laboratóriumi paramétereinek tekintetében: AST: 60-150 U/l. 2. A májelfajulásra és energiahiányra utaló jeleket mutató állatok csoportja (n=10): • kritériumok a kórelızmény és a klinikai vizsgálatok tekintetében: renyhe bendımozgások (bendımozgás < 1-2/5 perc), jó-közepes kondíció; • kritériumok a vérplazma és a vizelet ketonkoncentrációjának tekintetében: vizeletketon: +/++, plazmaketon: +/-; • kritériumok a máj laboratóriumi paramétereinek tekintetében: AST > 200 U/l.
100
3. Az egészséges szarvasmarhák csoportja (n=11): • kritériumok a kórelızmény és a klinikai vizsgálatok tekintetében: élénk bendımozgások (bendımozgás > 5/5 perc), közepes-jó kondíció; • kritériumok a vérplazma és a vizelet ketonkoncentrációjának tekintetében: vizeletketon:- , plazmaketon: -; • kritériumok a máj laboratóriumi paramétereinek tekintetében: AST < 60 U/l. Eredmények 12. táblázat Energiahiányos és májelfajulásra utaló kórképben szenvedı szarvasmarhák vérplazmájából mért klinikai biokémiai és néhány vvs-LP-s paraméterének változása Csoport Energiahiányos Májelfajulásos és energiahiányos Egészséges
Glükóz mmol/l 2,2 ±0,5 2,3 ±0,5
Karb mmol/l 3,9 B ±1,1 4,1 B ±1,2
MDA µmol/l 415 B ±59 414 B ±70
GSH mmol/l 1,6 ±0,6 1,63 ±0,9
GSH-Px U/g fehérje 18,6 B ±7,9 18,4 B ±9,6
SOD U/mg fehérje 23,9 ±8,8 24,3 ±11,1
2,6 ±0,7
2,4 A ±0,6
351 A ±41
1,53 ±0,54
27,9 A ±6,5
27,8 ±10,0
Az adott paraméterek sorain belül az azonos betőkkel jelzett értékek között nincs szignifikáns különbség. Az A-, B-jelzéső csoportok közötti különbség min. P<0,05 szinten szignifikáns. Az adott paraméterek oszlopain belül alapnak az egészséges csoport mintáinak vvs-hemolizátumból nyert értékeket tekintettem, ezért azokat A-val jelöltem. A kísérlet vizsgálati eredményeit a 12. táblázat tartalmazza. Az állatok glükóz koncentrációja nem mutatott szignifikáns eltérést a betegek és az egészségesek között, a karbamid koncentráció azonban mindkét beteg csoportban kétszeresére emelkedett az egészségesekhez képest. A vörösvérsejtek MDA-koncentrációja mindkét beteg csoportban 20 %-kal emelkedett a kontrollhoz képest, a GSH-Px-aktivitás pedig 30 %kal kisebb értékeket mutatott a betegekben. A GSH- és SOD-értékek nem mutattak szignifikáns eltérést. Következtetések és javaslatok Bár az energiahiány jelei egyértelmőek voltak az adott csoportokban, ezt nem kísérte az állatok vércukorkoncentrációjának szignifikáns változása a csoportok között. Természetesen a vércukorszint a monogasztrikus állatokénál jóval kisebb volt. Megemlítendı, hogy a kérıdzık kisebb vércukorkoncentrációja megmutatkozik abban is, hogy ezeknek az állatoknak kisebb a glikohemoglobin-koncentrációja is, amit a szerzık annak tiobarbitursavval való reakciójával mutattak ki (32). Ugyanık gyanítják, hogy a glikohemoglobin koncentrációjának csökkenése utalhat a szarvasmarhák néhány héttel
101
korábban lezajlott energiahiányos állapotára is. A karbamid koncentráció emelkedése a beteg állatokban valószínősíthetıen annak köszönhetı, hogy a bendı energiahiánya folytán csökken a mikróbák fehérjefelépítése, a felvett N-tartalmú anyagokból ammónia képzıdik, az ammónia a még viszonylag épp májmőködés esetén karbamiddá alakul, a vérbe kerül és így plazmabeli koncentrációja emelkedik (309). Az MDA-koncentráció emelkedése a májelfajulás esetében egyrészt a kutyáknál leírt okokból kifolyólag (zsírlerakódás, toxinok, másodlagos gyulladás) alakulhat ki, másrészt a ketózishoz hasonlóan azért, mert a csökkent táplálóanyag bevitel, vagy a gyors felhasználás esetén csökken az antioxidáns védekezésben szerepet játszó anyagok pl. GSH-, E- és A-vitamin koncentráció a májban és a vérplazmában. A csökkent GSH-koncentráció önmagában is, de következményesen a szubsztráthiány révén kialakuló GSH-Px-aktivitás csökkenése miatt is az LP-s folyamatok fokozódásához vezethet. A GSH-Px-aktivitás csökkenését igazolni is tudtam hasonlóan Gaál és mtsai. éheztetési kísérletükben tapasztaltakhoz (171). Vizsgálataimból kiderült, hogy mind a klinikailag beteg kutyáknál, mind a szarvasmarháknál a betegség kialakulásában döntı szerepet játszanak az LP-s rekciók, amelyek nemcsak mellékhatásként, hanem súlyosbító tényezıként is részt vehetnek a kórfolyamatokban. Vizsgálataimmal megerısíthettem Gaál és mtsai. által nyert vizsgálati eredményeket, miszerint azon szarvasmarhákban, amelyek májszövetében jelentıs a zsírfelhalmozódás (májlipid %: 16,13), vvs-jeikben és vérplazmájukban az MDAkoncentráció nagyobb, vérplazmájukban a GSH-Px-aktivitás és vvs-jeikben a CATaktivitás szignifikánsan kisebb a kontroll kisebb zsírtartalmú májjal rendelkezı (májlipid %: 9,88) állatokhoz viszonyítva (170). Hasonló eredményekre vezetett Mézes és mtsai. vizsgálatai, akik tenyészbikákon vizsgálták a relatív energiahiány hatásait. A szerzık adatai azt bizonyítják, hogy az energiahiányos állatokban a vvs-ekben szignifikánsan nagyobb MDA-koncentráció és kisebb GSH-Px-aktivitás jelentkezett a kontrollcsoporthoz viszonyítva (339). Tekintve, hogy ki lehetett mutatni a fokozott LP jeleit azokban az állatokban, amelyekben a ketonaemia és a ketonuria jelentkezett, felmerül a ketonanyagok koncentrációemelkedésének a fokozott LP-val való oktani viszonya is. Megemlíthetı, hogy a Se-hiányos takarmányozás mellett a 2-3 napig éhezı patkányokban hamarabb jelentkezı és fokozottabb ketonürítés volt tapasztalható a megfelelı Se-ellátottságú 2-3 napig éhezı állatokhoz képest (532). Ez alapján gyanítható, hogy nem a ketonképzıdés miatt jelentkezik LP-fokozódás, hanem fordítva, a csökkent antioxidáns védekezés miatt alakul ki fokozott ketonürítés. Kialakítható az a vélemény, hogy ha maguk a ketonanyagok nem is okoznak direkt gyökképzıdést, az általuk kiváltott metabolikus acidosis jelentıs szabagyökképzı tényezı lehet. A metabolikus acidosis ilyen típusú hatását Siesjö és mtsai. állapították meg az agyszöveti acidosis és a következtében kialakuló fokozott LP in vitro vizsgálata során (456). A szerzık megemlítik, hogy az acidosis során az O2.- protonálódhat, mielıtt a SOD és más antioxidánsok eliminálnák, lipidoldékony vegyületek képzıdhetnek belıle, sıt ez a folyamat a ferritinben kötésben lévı vasat is felszabadíthatja, ami a Fenton-reakció fokozódásához vezethet. Az eredmények alapján javasolható az energiahiányos állapotban kialakuló anyagforgalmi jellegő kórképekben az antioxidáns hatású anyagok felhasználása a gyógykezelésben, valamint azok hatékonyságának ellenırzése az alkalmazott paraméterek alapján.
102
V. ÖSSZEFOGLALÁS
Bevezetés Dolgozatomban a szabadgyökök hatásaival foglalkoztam kutyák, szarvasmarhák, juhok és patkányok esetében. Vizsgálataimat különbözı elıkísérletek után végeztem. Célom az volt, hogy olyan laboratóriumi módszereket használva jussak eredményre a lipidperoxidációs kutatásokban, amelyek könnyen kivitelezhetık, így remény van arra, hogy azok a gyakorlat számára is hasznosak lehetnek. Úgy ítéltem meg, hogy a vérminták feldolgozása célszerőnek tekinthetı, hiszen a fokozott LP-t elıidézı folyamatok hatására a vörösvérsejtek egyes szabadgyökös paramétereiben is jelentıs változások alakulnak ki. A vörösvérsejtek vizsgálata alapján, tehát adatok nyerhetık a szöveti, szervi eseményekrıl is. Vizsgálataimat négy fı irányban végeztem: I. a fiziológiás gyökreakciók elemzése; II. a széntetraklorid és az alloxán okozta szabadgyökös folyamatok elemzése; III. a hypoxia-reperfusio hatására létrejövı szabadgyökös folyamatok elemzése; IV. egyes természetes kórfolyamatok hatására jelentkezı szabadgyökös folyamatok elemzése. Az eredmények és a következtetések alapján összeállított, pontokba szedett új tudományos eredmények felsorolása, mintegy összegzésképpen a dolgozat alábbi részében található. Téma feldolgozása, eredmények, következtetések, javaslatok Az elsı kísérletben hét újszülött borjút vizsgáltam életük elsı perceitıl kezdve két napos korukig abból a célból, hogy megfigyeljem a születés körüli változásokat a vvs-ek LP-s paramétereinek tekintetében. Az eredmények az tanúsítják, hogy a születés nem okozott jelentısebb eltérést a vvs-ek LP-s paramétereiben. A vvs-szám emelkedése mellett a vérplazma vastartalmának csökkenését tapasztaltam, a kettı között összefüggés abban állhat, hogy a vas a vvs-ek termelésére fordítódott. A tehenek nagyobb összkarotin- és E-vitamin-koncentrációja arra utalhat, hogy a felnıtt állatoknak jobb tartalékai voltak ezekbıl a táplálóanyagokból a folyamatos szálastakarmányozás miatt. Javasolható a kóros körülmények között (pl. nehézelléssel) született borjak további vizsgálata. A második kísérletben tíz borjút vizsgáltam születésüktıl 3 hónapos korukig. Abból a célból, hogy megfigyeljem a vvs-ek LP-s paraméterbeli változásait ezen idıszakon belül. Az eredményekbıl azt a következtetést vontam le, hogy vvs-ek vizsgált LP-s folyamatai a 60. napos korban fokozódtak, ez részben a takarmányozás változása, részben a stresszállapot miatt alakulhatott ki, ugyanis az állatok ebben az idıszakban kerültek az egyedi elhelyezésbıl a borjúnevelıbe. Az összkarotin- és az E-vitaminkoncentráció értékei a születést követıen emelkedtek, gyaníthatóan a szálastakarmányra való fokozatos áttérés miatt. Javasolható, hogy a borjak elhelyezésének és részben a takarmányozásának kb. 60 napos korban történı változtatása nagyobb odafigyeléssel, kifejezetten fokozatos átmenettel történjen.
103
A harmadik kísérletben két korcsoporthoz tartozó 28 egészséges beagle kutya vérmintáinak számos paraméterét elemeztem. Vizsgáltam a vvs-ek kor és nem függı LPs paraméterebeli változásait. Az eredményekbıl azt a következtetést vontam le, hogy a kutyák klinikai hematológiai és biokémiai paraméterei élettani szinten jelezték az öregedésnek ismert kórélettani változásait. A vvs-ek LP-s paraméterei pedig jelezték az idısebb korban jelentkezı fokozott szabadgyökös folyamatokat, azonban ez a jelenség az idıs kanok esetében volt a legkifejezettebb, amelyeknél az antioxidáns védekezı képességet jelzı GSH-Px aktivitása sokkal kisebb volt. Javasolható, hogy további vizsgálatok történjenek arra vonatkozólag, hogy statisztikailag kimutatható módon jelentkezik-e a kan kutyák fokozottabb érzékenysége a különbözı megbetegedések iránt az idısebb korban és ha igen, akkor ez összefüggésben állhat-e a csökkent antioxidáns védekezéssel, hogyan lehetne a fokozottabb érzékenységet csökkenteni. A negyedik kísérletben hét Merino fajtájú jerkét vizsgáltam széntetrakloridos kezelés elıtt és utána 10 napig. Arra kerestem választ, hogy hatással van-e ez a kezelés a vvs-ek LP-s folyamataira. Az eredményekbıl azt a következtetést vontam le, hogy a széntetraklorid kifejezett májelfajulást okozott továbbá hatására a vvs-ekben fokozott LP jelentkezett, amit az MDA-koncentráció növekedése jelzett, ugynakkor a GSH-Pxaktivitás is nıtt, ami kompenzáló hatásként magyarázható. Az ötödik kísérletben 10 kutya CCl4-es kezelése történt. A vizsgálatok a kezelés elıtt és utána 10 napig történtek. Arra kerestem választ, hogy hatással van-e ez a kezelés a vvs-ek LP-s folyamataira. A CCl4 adagolása a juhok kezeléséhez hasonló volt. Az eredményekbıl azt a következtetést vontam le, hogy a juhokhoz hasonlóan a kutyákban is májelfajulás jelentkezett a széntetraklorid hatására, továbbá a vvs-ek LP-s paraméterei is bizonyos ingadozások mellett jelezték a fokozott szabadgyökös reakciókat, amit a kutyák esetében az MDA-koncentráció növekedése mellett a GSH-Px-, és a SODaktivitásának kezdeti csökkenése jelzett. Késıbb az antioxidáns enzimek aktivitásának kompenzációs hatással magyarázható növekedése volt tapasztalható. Javasolható, hogy további részletes elemzéseket végezzünk különbözı fajoknak és fajtáknak a szabadgyökképzı xenobiotikumokra mutatott eltérı válaszkészségérıl és felvessük azt a kérdést, hogy minek van jelentısebb szerepe az antioxidáns védekezésben, az egyed genetikai adottságainak, vagy az elhelyezés, takarmányozás stb. által meghatározott aktuális antioxidáns státuszának. A hatodik kísérletben öt kutyát vizsgáltam, amelyeknek hígított alloxánt adtam intravénásan. A vizsgálatokat a kezelés elıtt és utána 4 napig végeztem. Arra kerestem választ, hogy hatással van-e ez a kezelés a vvs-ek LP-s folyamataira. Az eredményekbıl azt a következtetést vontam le, hogy az alloxán a kutyákban diabetes mellitust és májelfajulást okozott, a vvs-ek LP-s paraméterei fokozott szabadgyökös folyamatokról tanúskodtak, amit az MDA-koncentráció növekedése mellett az antioxidáns GSH-Px aktivitásának csökkenése jelzett. A hetedik kísérletben négy, Merinó fajtájú jerkét állítottam kísérletbe. Az állatoknak a kutyákhoz hasonló módon és adagban alloxánt adtam intravénásan. A vizsgálatokat a kezelés elıtt és utána 10 napig végeztem. Arra kerestem választ, hogy hatással van-e ez a kezelés a vvs-ek LP-s folyamataira. Az eredményekbıl azt a következtetést vontam le, hogy az alloxán a juhokban enyhe hyperglycaemiát és májelfajulást okozott, a vvs-ek LPs paraméterei fokozott szabadgyökös folyamatokról tanúskodtak, amit csak az MDA-
104
koncentráció növekedése jelzett. Ebben a kísérletben is igazolható volt a juhoknak a xenobiotikummal szembeni csökkent érzékenysége. Javasolható annak tisztázása, vajon miért tapasztalhattuk, hogy a juhok bár kifejezetten érzékenyek a szabadgyökös károsodásokra (pl. a rézmérgezés, vagy a Se-, és az E-vitamin-hiányos izomelfajulás), mégis a kifejezetten toxikus alloxánra kisebb érzékenységet mutattak, mint a kutyák, amelyekrıl nem ismert az oxidatív károsodások iránti fogékonyságuk. A nyolcadik kísérletet 10 patkányon végeztem abból a célból, hogy megfigyeljem az elülsı bélfodri verıér lekötése, majd felengedése okozta LP-s változásokat a vvs-ekben. Az eredményekbıl azt a következtetést vontam le, hogy a bél hypoxia-reperfusió hatására az LP-s folyamatok fokozódnak a vvs-ekben, amit az MDA-koncentráció növekedése és az antioxidáns enzimek (GSH-Px, SOD) aktivitásának csökkenése jelzett. A kilencedik kísérletet 12 patkányon végeztem abból a célból, hogy megfigyeljem a vvs-ek szabadgyökös paramétereit az elızı kísérleti elrendezést részben megismételve, és allopurionolos elıkezelést alkalmazva. Az eredményekbıl azt a következtetést vontam le, hogy az allopurinol gátolta a bél hypoxia-reperfusio okozta, vvs-ekben jelentkezı LP-s folyamatait. Erre az alapján következtettem, hogy az elızı kísérletben tapasztaltakkal ellentétben az MDA-koncentráció emelkedése és az antioxidáns enzimek aktivitásának csökkenése nem jelentkezett, ugyanakkor a GSH-koncentráció növekedése volt tapasztalható. Ez utóbbi jelenségre egyértelmő magyarázatot nem tudtam adni. Javasolható az ileus szabadgyökös hatásainak más állatfajokon történı vizsgálata. Továbbá más antioxidáns hatású anyagok pl. a deferoxamin és az L-arginin hatékonyságának modell-jellegő és természetes körülmények közötti elemzése. A tizedik kísérletben 7 kutyát vizsgáltam abból a célból, hogy vese autotranszplantációs mőtét következtében kialakulnak -e vvs-jeikben fokozott LP-t jelzı folyamatok. Az eredményekbıl azt a következtetést vontam le, hogy a veseautotranszplantáció hatására csak enyhefokú LP-fokozódás jelentkezett a vvs-ekben, amelyet az MDA-koncentráció növekedése jelzett. Az enyhe reakció annak tudható be, hogy a kiemelt, majd átültetett vesét a mőtét közben átmostuk és lehőtöttük, ami az LP-s folyamatokat kivédhette. A 24. órában tapasztalt MDA-koncentráció növekedés a másodlagos gyulladásos folyamatok révén is létrejöhetett. A reaktív gyulladásos folyamatok a vizeletvizsgálat alapján igazolhatók voltak. Javasolható, hogy a szervtranszplantációs mőtétek során minden esetben alkalmazzanak szöveti hőtést, továbbá érdemes hasonló paraméterek alapján más állatfajon is (pl. macskán) vizsgálni a vesetranszplantáció LP-s következményeit, de nemcsak az autotranszplantáció, hanem a heterotranszplantáció esetében is. A tizenegyedik kísérletben arra kerestem választ, hogy a különbözı betegségekben szenvedı kutyákban milyen mértékben jellentkezik a vvs-ek LP-s károsodása. A kísérletbıl azt a következtetést vontam le, hogy minden betegcsoportban fokozott LP jelentkezett a vvs-ekben, ami azokban az állatokban volt a legsúlyosabb, amelyek gyulladásos folyamatokban szenvedtek, ugyanakkor a májelfajulásos betegeknél jelentkezett a lekisebb SOD-aktivitás. Javasolható a kutyák számos klinikai kórfolyamatainak részletesebb vizsgálata az LP szempontjából. Továbbá annak elemzése, hogy a kórfolyamatok gyógykezelésének antioxidáns hatású anyagokkal történı kiegészítése milyen mértékben segíti elı a gyógyulást.
105
A tizenkettedik kísérletben arra kerestem választ, hogy az ellést követı 2-3 napon belül szarvasmarhákban kialakuló ketonuriás, ketonaemiás, májelfajulásos kórképek során jelentkezik-e a vvs-ek fokozott LP-je. Az eredményekbıl azt a következtetést vontam le, hogy mindkét betegcsoportban fokozott LP-s folyamatok zajlanak a vvsekben, amelyet az MDA-koncentráció fokozódása és a GSH-Px-aktivitás csökkenése jelzett. A bendı energiahiányát a vérplazma karbamidkoncentrációjának emelkedése is jelezte. Javasolható az energiahiányos állapotban kialakuló anyagforgalmi jellegő kórképekben az antioxidáns hatású anyagok felhasználása a gyógykezelésben, valamint azok hatékonyságának ellenırzése az alkalmazott paraméterek alapján. A vizsgált négy fı témakör elemzésével képet kívántam adni a szabadgyökös reakciók élettani, kórélettani vonatkozásairól. Az eredmények alapján úgy vélem, hogy az általam vizsgált folyamatokban igen jelentıs szerepet játszanak a szabadgyökök által indukált reakciók. Egyes esetekben (pl. a CCl4, az alloxán, a hypoxia-reperfusio) elsıdlegesnek tekinthetı a kialakult fokozott LP, másokban (pl. a természetes kórképekben) az másodlagos körülményként jelentkezik. Vannak azonban olyan folyamatok is, amelyekben nem egyértelmően ítélhetı meg az LP-s reakciók elsıdleges vagy másodlagos volta. Ilyen például az öregedés. Dolgozatomban fel kívántam hívni a figyelmet ezen folyamatok fontosságára a kórélettani kutatásokban, illetve a mezıgazdasági és az állatorvosi gyakorlatban, hiszen akár elsıdleges, akár másodlagos a detektálható LP, az bizonyítottan hatással van a szervezet élettani folyamatainak mőködésére, a biológiai rendszerek, élılények egészségére. Hiszem, hogy vizsgálataim eredményei hozzájárulnak e tudományterület teljesebb megismeréséhez, az eddig ismert kórtani, kórélettani jelenségek, jobb megértéséhez, továbbá felhasználhatóvá válnak a gyakorlat számára is. Kutatómunkám alapján az általam újnak ítélt tudományos eredményeimet a következıkben foglalom össze. Új tudományos eredmények I, a, Borjak posztnatális életének elsı két napján lezajló LP-s reakciók a vörösvérsejtekben nem mutattak jelentıs változást annak ellenére, hogy a születéskor a hirtelen oxigéndús környezetbe kerülésük feltételezné a szabadgyökös folyamatok felgyorsulását. b, A borjak életének elsı három hónapjában végzett vizsgálatok alapján megállapítottam, hogy a 60. napos korban, amikor az állatok a borjúnevelıbe kerülnek, jelentıs LP-fokozódás jelentkezett a vörösvérsejtekben, az antioxidáns védekezésben szerepet játszó vizsgált enzimek és szubsztrátok egyidejő funkciócsökkenése mellett. II, A fiatal és az idıs kutyák vörösvérsejtjei jelentıs különbségeket mutattak a vizsgált lipidperoxidációs paraméterek tekintetében. Az idıs kutyák vörösvérsejtjeiben a lipidperoxidációs folyamatok fokozottabban jelentkeztek, fıként a kanokban. Az idısek
106
között a vizsgált antioxidáns enzimek kompenzáló hatását igazolni lehetett, különösen a szukákban. III, a, A CCl4-toxikózis mind juhokban, mind kutyákban kimutathatóan súlyos májkárosodás mellett, a vvs-ekben jelentıs LP-fokozódáshoz és antioxidáns-, enzimaktivitás-csökkenéshez vezetett. A kutyák esetében a károsító hatások súlyosabban jelentkeztek. b, Az alloxán, cukorbetegséget a vizsgált fajok közül kutyákban idézett elı, de kutyákban és juhokban heveny tünetekkel járó májsejtnekrózist okozott, valamint fokozta a vörösvérsejtek szabadgyökös reakcióit a vizsgált antioxidáns enzimek károsítása mellett. A toxikus hatások a kutyákban kifejezettebbek voltak. IV, a, A patkányok vékonybéltraktusának elsı szakaszát ellátó elülsı bélfodri verıér lekötése, 45 percig tartó hypoxiája, majd felengedése (reperfusio) után 45 perc múlva jelentıs mértékő LP-fokozódás jelentkezett a vörösvésejtekben, ami a vizsgált antioxidáns enzimek ativitásának csökkenésével társult. A fokozott LP allopurinollal kivédhetı volt. b, Kutyák veseautotranszplantációja során a vese hypoxiás állapota utáni reperfusiót követıen az LP enyhe fokozódása következett be, a vizsgált antioxidáns enzimek aktivitása azonban nem változott. V, a, Kutyák félheveny veseelfajulása és májfunkciózavara, valamint heveny hasnyálmirigy-gyulladása és nem specifikus gyulladásos kórképe során a vörösvérsejtek LP-ja fokozódott, ami a gyulladással járó kórképekben volt a legkifejezettebb, a vizsgált antioxidáns enzimek károsodása (fıként a szuperoxid-dizmutázé) pedig a májelfajulásos csoportnál volt a legkifejezettebb. b, A nem kielégítı energiastátuszban lévı szarvasmarhák ketonaemiás és májelfajulásos kórképeiben a vörösvérejtekben fokozott LP volt tapasztalható, a vizsgált antioxidáns enzimek közül ezekben a patológiás folyamatokban a glutation-peroxidáz aktivitásának csökkenése volt jelentıs.
107
SUMMARY Internal and external effects on the lipid peroxidation and antioxidative reactions of red blood cells (examinations on cattle, sheep, dog and rat) I examined the effects of free radicals in case of cattle, sheep, dog and rat. The research was done after preliminary experiments. My aim was to utilise laboratory methods in free radical research that are easy to perform and there is a hope to use them more routinely. I thought that the use of blood samples in this study is valuable, as the free radical parameters of red blood cells can be much altered by lipidperoxidative effects. There can be gained several data about the tissue or organ centred effects by the examination of red blood cell parameters. I organised my research in four directions: I. research on physiological free radical reactions, II. research on the free radical reactions of carbon-tetrachloride and alloxane, III. research on the free radical reactions of hypoxia-reperfusion, IV. research on the free reactions caused by some natural pathological conditions. According to the results of my experiments I summarised the new scientific findings. I, a, Free radical reactions in red blood cells were not significantly altered during the first two days of life of dairy calves, in spite of the fact that during their birth they get into a relative oxygen rich environment from uterus, and this effect might cause the increase of the free radical reactions. b, After the examinations of calves during the first three month of their life I concluded that the parameters of red blood cells showed an increase of free radical reactions at their 60th day of life, as the lipidperoxidation increased and the activities of the antioxidant enzymes showed some decrease. II, a, After the examinations of young and old dogs I concluded that the lipidperoxidation parameters of red blood cells showed increased free radical effects in old dogs especially in males. The compensatorical increase of enzyme activities was also detected especially in old female dogs. III, a, Carbontetrachloride toxicosis caused severe hepatic injury and increase of lipidperoxidation in dog and sheep, the activities of antioxidant enzymes were decreased, too. The harmful effects were more obvious in case of dogs. b, Alloxane caused diabetes mellitus in dogs, and also caused acute hepatic injury in dogs and sheep. Increased lipidperoxidation and the deteriorating function of antioxidant
108
enzymes was detectable in both species, too. It was concluded in this experiment, too, that the harmful effects were more obvious in case of dogs. IV, a, The 45 minutes long hypoxia of jejunum, after ligating arteria mesenterica cranialis caused increased lipidperoxidation and the decrease of antioxidant enzyme activities in red blood cells of rats 45 minutes after reperfusion. This effects were prevented by using allopurinol. b, Hypoxic state and reperfusion of kidney during autotransplantation caused a slight increase of lipid peroxidation, but the activities of the antioxidant enzyme were not altered in red blood cells of dogs. V, a, Subacute-chronic kidney failure, liver failure, acute pancreatitis and non specific inflammatory condition of dogs caused increase of lipidperoxidation and decreased activity of antioxidant superoxide-dismutase in red blood cells of dogs. Most severe lipidperoxidation was detected in patients that were suffering of inflammatory diseases, and the most decreased activity of superoxide-dismutase was detected in the group of dogs having liver failure. b, Free radical parameters of red blood cells of dairy cattle having ketonuria, ketonemia and liver failure showed marked increased lipidperoxidation and decreased activity of antioxidant enzymes. The activity of glutathione-peroxidase showed the most severe alteration. I hope that my results increase our knowledge about the free radical reactions and will give some practical considerations, too.
109
MELLÉKLETEK
Irodalmi hivatkozások jegyzéke
1. 2. 3. 4. 5. 6.
7.
8.
9. 10. 11. 12. 13.
14.
15.
Ádám M, Dobson S, Lontay I, Papp K, Paulai A, Paulai A. Pharmindex kompendium. Budapest: MediMedia Információs Kft., 1998. Aebi A, Suter H. Über die peroxydempfindlichkeit von Akatalasie-Erythrocyten. Humangenetic (2): 328, 1966. Agner K. Studies on myeloperoxidase activity. Spectrophotometry of the MPOH2O2 compound. Acta Chem Scand (17, Suppl): 332-338, 1963. Agrawal P, Laloraya M. Iduction of peroxidase in corpora lutea of rat ovary by lutropin. Biochem J (166): 4-8, 1977. Aisen P, Listowsky I. Iron transport and storage proteins. Annu Rev Biochem (49): 357, 1980. Ambruso D, Johnson R. Lactoferrin enhances hydroxyl radical production by human neutrophils, neutrophil particulate fractions, and an enzymatic generating system. J Clin Invest (67): 352-360, 1981. Ames BN, Cathcart R, Schwiers E, Hochstein P. Uric acid provides an antioxidant defense in humans against oxidant- and radical-caused aging and cancer: a hypothesis. Proc Natl Acad Sci USA (78): 6858, 1981. Andrae U, Singh J, Ziegler-Skylakakis K. Pyruvate and related alpha-ketoacids protect mammalian cells in culture against hydrogen peroxide-induced cytotoxicity. Toxicol Lett (28): 93, 1985. Andreoli S. Mechanism of endothelial cell ATP depletion after oxidant injury. Pediatr Res (25): 97, 1989. Andreoli S. Reactive oxygen molecules, oxidant injury and renal disease. PediatrNephrol 6 (5): 733-42, 1991. Andrews A, Blowey R, Boyd H, Eddy R. Bovine Medicine: Diseases and Husbandry of Cattle: Blackwell Scientific Publications, 1992. Archer G, Air G, Jackas M, Morell D. Studies on rat eosinophil peroxidase. Biochim Biophys Acta (99): 96-101, 1965. Asayama K, Shiki Y, Ito H, Hasegawa O, Miyao A, Hayashibe H, Dobashi K, Kato K. Antioxidant enzymes and lipoperoxide in blood in uremic children and adolescents. Free Radic Biol Med 2 ( 9): 105-9, 1990. Atroshi F, Parantainen J, Sankari S, Jarvinen M, Lindberg M, Saloniemi H. Changes in inflammation-related blood constituents of mastitic cows. Veterinary Research 2 (27): 125-132, 1996. Atroshi F, Sankari S, Kangasniemi R, Parantainen J. Enzymes and trace elements in bovine mastitis: possible wider applications. In: 37th Annual Meeting of the European Association for Animal Production, 1-4 September 1986, Budapest, Hungary, 1986.
110
16. Atroshi F, Työppönen J, Sankari S, Kangasniemi R, Parantainen J. Possible roles of vitamin E and glutathione metabolism in bovine mastitis. Internat J Vit Nutr Res 57: 37-43, 1986. 17. Augustin W, Gellerich F, Wiswedel I, Evtodienko Y, Zinchenko I. Inhibition of cation efflux by antioxidants during oscillatory ion transport in mitochondria. FEBS Lett 107: 151-154, 1979. 18. Aust S, BA S. The Role of Iron in Enzimatic Lipid Peroxidation. In: Pryor W, ed. Free Radicals in Biology. Vol. 5. New York: Academic Press, pp. 1-26, 1982. 19. Babich H. Butylated hydroxytoulene (BHT): a review. Environ Res (29): 1, 1982. 20. Babior B. Oxygen-dependent microbial killing by phagocytes (first of two parts). N Eng J Med 12 (298): 659-668, 1978. 21. Babior B. Oxygen-dependent microbial killing by phagocytes (second of two parts). N Eng J Med 13 (298): 721-725, 1978. 22. Babior B, Curnutte J, McMurrich B. The particulate superoxide-forming system from human neutrophils. Properties of the system and further evidence supporting its participation in the respiratory burst. J Clin Invest (58): 989-996, 1976. 23. Babior B, Kipnes R. Superoxide-forming enzyme from human neutrophils: evidence for a flavin requirement. Blood (50): 517-524, 1977. 24. Bachmann R. Blutgefäss- und lymphgefässaparat. In: Bargmann W, ed. Handbuch der mikroscopischen anatomie des Menschen. Vol. 6. 5 ed. Berlin: Springer Verlag, pp. 1-952, 1954. 25. Badwey J, Karnovsky M. Active oxygen species and the functions of phagocytic leuokcytes. Ann Rev Biochem (49): 695-726, 1980. 26. Badylak S, Lantz G, Jeffries M. Prevention of reperfusion injury in surgically induced gastric dilatation volvulus in dogs. Am J of Vet Res 2 (51): 294-299, 1990. 27. Baehner R, Gilman N, Karnovsky M. Respiration and glucose oxidation in human and guinea pig leukocytes: somparative studies. J Clin Invest (49): 692-700, 1970. 28. Baginski E, Epstein E, Zak B. Some aspects of bilirubin determination in the newborn using dimethyl sulfoxide. Ann Clin Lab Sci 6 (10): 486-92, 1980. 29. Ballou D, Palmer G, Messy V. Direct demonstration of superoxide anion production during the oxidation of reduced flavin and its catalytic decomposition of erythrocuprein. Biochem Biophys Res Commun (36): 898-904, 1969. 30. Bär V. Radioszenzibiláló hatású antioxidáns kifejlesztése és alkalmazása az onkoradiológiai gyakorlatban, Kandidátusi Értekezés, 1978. 31. Barber A, Bernheim F. Lipid peroxidation: its measurement, occurrence and significance in animal tissue. Adv Gerontol Res (2): 355-403, 1967. 32. Bárdos L, Oppel K. Determination of glycohaemoglobin levels in ketonuric and non-ketonuric cows. Acta Veterinaria Hungarica 37 (3): 299-301, 1989. 33. Bárdos L, Szenci O, Oppel K, Gerszi K, Varga T. Blood pH, plasma carotene, vitamin A, albumin and globulin concentrations in newborn calves and in dams during the first three days of the postnatal period. Acta Veterinaria Hungarica 39 (12): 59-66, 1991. 34. Barker E, Arccasoz M, Smucler E. A comparison of the effects of partial surgical and partial chemical (CCl4) hepatectomy on microsomal cytochrome b5 and P450 and oxidative N-demethylation. Agents Actions (1): 27-34, 1969.
111
35. Barlow C, Maxwell J, Wallace V, Caughey V. Elucidation of the mode of binding of oxygen to iron in oxyhemoglobin by infrared spectroscopy. Biochem Biophys Res Commun (55): 91-95, 1963. 36. Barron E. Thiol groups of biological importance. Adv Enzymol (11): 201-266, 1951. 37. Barros Ad, Kaplan J. Phenobarbital-induced increase of NADH-cytochrome b5 reductase activity. Biochem Pharmacol 27: 367-368, 1978. 38. Barta E, Cronak V, Pechan I, Luknarova O, Verchovodko P, Rendekova V. Biochemical parameters in the blood in patients during open-heart surgery formation and elimination of free oxygen radicals. Bratsl Lek Listy 1 ( 94): 17-23, 1993. 39. Bartoli G, Dani A, Galeotti T, Russo M, Terranova T. Respiratory activity of Ehrlich ascites tumor cell nuclei. Z Krebsforsch (83): 223-231, 1975. 40. Bartoli G, Galeotti T, Azzi A. Production of superoxide anions and hydrogen peroxide in Ehrlich ascites tumor cell nuclei. Biochem Biophys Acta (497): 6226269, 1977. 41. Bates G, Schlabach M. The nonspecific binding of Fe3+ to transferrin in the absence of synergistic anions. J Biol Chem 250: 2177, 1975. 42. Bayse G, Michaels A, Morrison M. Lactoperoxidase-catalyzed iodination of tyrosine peptides. Biochim Biophys Acta (284): 30-33, 1972. 43. Beauchamp C, Fridovich I. Isozymes of superoxide dismutase from wheat germ. Biochim Biophys Acta 317 (1): 50-64, 1973. 44. Beck W. Occurrence and control of the phosphogluconate oxidation pathway in normal and leukemic leukocytes. J Biol Chem (232): 271-283, 1958. 45. Bedı S, Keszthelyi T, Mézes M, Adel J. A különbözı genotpusú anyajuhok vér Aés E-vitamin-tartalmának évszaki változása. Állattenyésztés és Takarmányozás 41 (2): 153-163, 1992. 46. Bedı S, Mézes M, Barcsákné Tóth G, Kövér L. A téli és nyári takarmányozás hatása a tej A- és E-vitamin tartalmára merinó anyajuhoknál. Állattenyésztés és Takarmányozás 37 (1): 63-71, 1991. 47. Bedı S, Mézes M, Vajda I. Investigation on trace element status of blood of Merino ewes during Permasel R and Permaco R treatment. In: 6th International Trace Element Symposium, 1989. 48. Beers R, Sizer I. Spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J Biol Chem 195: 133-140, 1952. 49. Bellisola G, Galassini S, Moschini G, Poli G, Perona G, Guidi G. Selenium and glutathione peroxidase variations induced by polyunsaturated fatty acids oral supplementation in humans. Clinica Chimica Acta (202): 75-85, 1992. 50. Benöhr H, Waller H. Glutathione. Klin Wochenshr (53): 789-802, 1975. 51. Bergmeyer H, Scheibe P, Wahlefeld A. Optimization of methods for aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase. Clin Chem 24 (1): 58-73, 1978. 52. Bettger W, Reeves P, Savage J, O'Dell B. Interaction of zinc and vitamin E in the chick. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 163 (3): 432-436, 1980.
112
53. Beutler E. Hemolytic Anemia in Disorders of Red Cell Metabolism. In: Plenum, New York, 1978. 54. Beutler E. A series of new screening procedures for pyruvate kinase deficiency, glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency, and glutathione reductase deficiency. Blood 28 (4): 553-62, 1966. 55. Bhagwat A, Sane P. Evidence for the involvement of superoxide anions in the oxygenase reaction of ribulose-1,5-diphosphate carboxylase. Biochem Biophys Res Commun (84): 865, 1978. 56. Bielski BHJ, Richter HW, Chan PC. Some properties of the ascorbate free radical. Ann N Y Acad Sci (258): 231, 1975. 57. Biemond P, Eijk Van H, Swaak A, Koster J. Iron mobilization from ferritin by superoxide derived from stimulated polymorphonuclear leukocytes. Possible mechanism in inflammation diseases. J Clin Invest (73): 1576, 1984. 58. Bieri J. Serum Vitamine E levels in a normal adult population in the Washington D.C. area. Proc Soc Exp Biol Med 117: 131-133, 1964. 59. Bilinski T, Krawiec Z, Liczmanski A, Litwinska J. Is hydroxyl radical generated by Fenton reaction in vivio? Biochem Biophys Res Commun (130): 533, 1985. 60. Blaauboer B, Graft Mv. 57, Photosensitisation in ruminants: porphyrins and phylloerythrin. In: Ruckebusch Y, Toutan P, Koritz G, eds. Veterinary Pharmacology and Toxicology. Lancester, England: MTP Press Limited, 1983. 61. Blázovics A, Fehér E, Fehér J. Role of free radical reactions in experimental hyperlipidemia in the pathomechanism of fatty liver. In: Csomós G, Fehér J, eds. Free Radical and the Liver. Berlin, Heidelberg, New York: Springer Verlag, 1992. 62. Boda D, Németh I. Oxidáns stresszhatás elleni védelem lehetısége a xantin oxidáz gyógyszeres gátlása útján. In: Tudományos ülés: Oxigén szabad gyökök és szövetkárosodás, 1984. január 10-11, Pécs, 1984. 63. Bodnár I, Karsai F, Gaál T. Tejelı tehenek energiaforgalmának ellenırzése komplex laboratóriumi módszerrel. Agrárvilág 3 (32): 34-38, 1990. 64. Bokori J, Fekete S. Complex study of the physiological role of cadmium, I. cadmium and its physiological role. Acta Veterinaria Hungarica 43 (1): 3-43, 1995. 65. Boross M, Pénzes L, Izsák J, Rajczy K, Beregi E. Effect of smoking on different biological parameters in aging mice. Z Gerontol 2 ( 24): 76-80, 1991. 66. Boveris A, Chance B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxyde. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochem J (134): 707-716, 1973. 67. Boveris A, Oshino N, Chance B. The cellular production of hydrogen peroxide. Biochem J (128): 617-630, 1972. 68. Bradley R, Anderson P, Wilesmith J. Changing patterns of nutritional myodegeneration (white muscle disease) in cattle in Great Britain. In: Vth International Conference on Production Disease in Farm Animals, Metabolic disorders in farm animals, October 1980, D-8000 Munchen, German Federal Republic, Institut fur Physiologie, Tierarztliche Fakultat, Universitat Munchen, Germany, 1981. 69. Brady P, Brady L, Parsons M, Ullrey D, Miller E. Effects of riboflavin deficiency on growth and glutathione peroxidase system enzymes in the baby pig. Journal of Nutrition 109 (9): 1615-1622, 1979.
113
70. Brawn K, Fridovich I. DNA strand scission by enzymically generated oxygen radicals. Arch Biochem Biophys (206): 414, 1981. 71. Bray RC, Cockle SA, Fielden EM, Roberts PB, Rotilio G, Calabrese L. Reduction and inactivation of superoxide dismutase by hydrogen peroxide. Biochem J (139): 43, 1974. 72. Brigelius R, Lenzen R, Sies H. Increase in hepatic mixed disulphides and glutathione disulfide levels elicited by paraquat. Biochem Pharmacol (31): 1637, 1982. 73. Briggs G, Haldane J. A note on the kinetics of enzyme action. Biochem J (19): 338339, 1925. 74. Brigham KL. Effect of N-acetylcysteine on the pulmonary response to endotoxin in the awake sheep and upon in vitro granulocyte function. J Clin Invest (73): 1772, 1984. 75. Britigan B, Pou S, Rosen G, Lilleg D, Beuttner G. Hydroxyl radical is not a product of the reaction of xanthine-oxidase and xanthine. The confounding problem of adventitious iron bound to xanthine oxidase. Journal of Biological Chemistry 265 (29): 17533-17538, 1990. 76. Britton L, Malinowki D, Fidovich I. Superoxide dismutase and oxygen metabolism in Streptococcus faecalis and comparisons with other organisms. J Bacteriol 134 (1): 229-236, 1978. 77. Brot N, Weissbach H. Biochemistry and physiological role of methionine sulfoxide residues in proteins. Arch Biochem Biophys 223: 271, 1983. 78. Brown K, Fridovich I. DNA strand scission by enzymatically generated oxygen radicals. Arch Biochem Biophys (206): 414, 1981. 79. Brubacher G, Vuilleumier J. Carotin in Blutplasma. In: Grenzach, ed. Methoden zur Bestimmung von beta-Carotin in Rovimix-beta-Carotin 10%, in Mischfuttern sowie von Carotin in Futtermitteln, Blutplasma und Milch, Dokumentation-dienst, Roche. Deutschland: Roche, 1980. 80. Bruns D, Morgan W, Davis J, JH L. Low apparent creatine kinase activity and prolonged lag phases in serum of patients with metastatic disease: elimination by treatment of sera with sulfhydryl agents. Clin Chem 11 (22): 1889-95, 1976. 81. Bunton CA. Oxidation of alpha-diketones and alpha-ketoacids by hydrogen peroxide. Nature (London) (163): 444, 1949. 82. Burk R, Nishiki KJ, Lawrence R, Chance B. Peroxide removal by seleniumdependent and selenium-independent glutathione peroxidases in hemoglobin-free perfused rat liver. J Biol Chem (253): 43-46, 1978. 83. Burton GW, Ingold KU. Beta-carotene: an unusual type of lipid antioxidant. Science (224): 569, 1984. 84. Bush B. Interpretation of laboratory results for small animal clinicians. Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1991. 85. Cadenas E, Boveris A, Ragan C, Stoppani A. Production of superoxide radicals and hydrogen peroxide by NADH-ubiquinone reductase and ubiquinol-cytochrome c reductase from beef heart mitochondria. Arch Biochem Biphys (180): 248-257, 1977.
114
86. Cadenas E, Sies H. Low level chemiluminescence of liver microsomal fractions initiated by tert-butyl hydroperoxide. Relation to microsomal hemoproteins, oxygen dependence, and lipid peroxidation. Eur J Biochem (124): 349, 1982. 87. Cadenas E, Sies H, Nastainczyk W, Ullrich V. Singlet oxygen formation detected by low-level chemiluminescence during enzymatic reduction of prostaglandin G2 to H2. Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem (364): 519, 1983. 88. Callahan J, Cook K. Mechanism of surfactant-induced changes in the visible spectrometry of metal-Chrome Azurol S complexes. Anal Chem 9 (56): 1632-40, 1984. 89. Carlson J, Yost G. 3-methylindole-induced acute lung injury resulting from ruminal fermentation of tryptophan. In: Cheeke P, ed. Toxicants of Plant Origine. Vol. 3, Proteins and Amino Acids. Boca Raton, Florida: CRC Press, Inc., pp. 107-123, 1989. 90. Carperter M. Antioxidant effects on the prostaglandin endoperoxide synthetase product profile. In: Physiological significance of lipid peroxidation. FASEB Symposium, 1981. 91. Cassel R, Fridivich I. Role of superoxide radical in the autoxidation of cytochrome c. Biochemistry (14): 1866-1869, 1975. 92. Cathcart R, Schweiss E, Saul RL, Ames BN. Thymine glycol and thymidine glycol in human and rat urine. A possible assay for oxidative DNA damage. Proc Natl Acad U S A (81): 5633, 1984. 93. Cederbaum A. Effect of hydroxyl radical scavengers in microsomal axidation of alcohols and on associated microsomal reactions. Biochemistry (17): 3058-3064, 1978. 94. Chance B. An intermediate compound in the catalase hydrogen peroxide reaction. Acta Chem Scand (1): 236-267, 1947. 95. Chance B. The iron-containing enzymes, C, The enzyme-subsrate compounds and mechanism of action of the hydro-peroxidases. In: Summer J, Mybäck U, eds. The Enzymes. New York: New York: Academiec, pp. 428-453, 1951. 96. Chance B. Pyridine nucleotide as an indicator of the oxygen requirements for energy-linked functions of mitochondria. Circ Res Suppl 1 (38): 31-38, 1976. 97. Chance B, Jamieson D, Coles H. Energy linked pyridine nucleotide reduction: inhibitory effects of hyperbaric oxygen in vitro and in vivo. Nature (206): 257-263, 1965. 98. Chance B, Oshino N. Analysis of the catalase-hydrogen peroxide intermediate in coupled oxidation. Biochem J (13): 564-567, 1973. 99. Chance B, Saronio C, Leigh JJ. Funkctional intermediates in reaction of cytochrome oxidase with oxigen. Proc Natl Acad Sci USA (72): 1635-1640, 1975. 100. Chance B, Saronio C, Waring A, Leigh JJ. Cytochrome c-cytochrome oxidase interaction at subzero temperatures. Biochim Biophys Acta (503): 37-55, 1978. 101. Chance B, Sies H, Boveris A. Hydroperoxide metabolism in mammalian organs. Physiological Reviewes 59: 527-604, 1979. 102. Chick B, McCleary B, Beckett R. Thiaminases. In: Cheeke P, ed. Toxicants of Plant Origine. Vol. 3, Proteins and Amino Acids. Boca Raton, Florida: CRC Press, Inc., pp. 73-91, 1989.
115
103. Chio K, Tappel A. Synthesis and characterization of the fluoresent products derived from malon-aldehyde and amino acids. Biochemistry (8): 2821-2827, 1969. 104. Chiu D, Lubin B, Shohet S. Peroxidative Reactions in Red Cell Biology. In: Pryor W, ed. Free Radical in Biology. Vol. 5. New York: Academic Press, pp. 112-159, 1982. 105. Chou P, Khan AU. L-Ascorbic acid quenching of singlet delta molecular oxygen in aqueous media: generalized antioxidant property of vitamin C. Biochem Biophys (115): 932, 1983. 106. Chow C. Vitamin E and oxidative stress. Free Radical Biology and Medicine 11: 215-232, 1991. 107. Cohen AM, Aberdroth RE, Hochstein P. Inhibition of free radical-induced DNA damage by uric acid. FEBS Lett (174): 147, 1984. 108. Collison MW, Beidler D, Grimm LM, Thomas JA. A comparison of protein Sthiolation (protein mixed-disulfide formation) in heart cells treated with tbuthylhydroperoxide or diamide. Biochim Biophys Acta (885): 58, 1986. 109. Colman N. The role of sulfhydryl groups in the catalytic function of isocitrate dehydrogenase, I, Reaction with 5,5`-dithiobis (2-nitrobenzoic acid). Biochemistry (8): 888-898, 1969. 110. Colman R. Effect of modification of methionyl residue on the kinetic and molecular properties of isocitrate dehydrogenase. J Biol Chem (243): 2454-2464, 1968. 111. Colnago G, Jensen L, Lony P. Effect of Selenium and Vitamin E on the Development of Immunity to Coccidiosis in chickens. Poultry Science 63: 11361143, 1984. 112. Commins M, Goodger B, Waltisbuhl D, Wright I, Siro C. Babesia bovis: studies of parameters influencing microvascular stasis of infected erytrocytes. Research in Veterinary Science 44: 226-228, 1988. 113. Conney A. Pharmacological implications of microsomal enzyme induction. Pharmac Rev 19 (3): 317-366, 1967. 114. Conover T. Respiration and adenosine triphosphate synthesis in nuclei. Curr Top Bioenerg 2: 235-265, 1967. 115. Conover T, Siebert G. On occurence of respiratory components in rat liver nuclei. Biochim Biophys Acta (99): 1-12, 1965. 116. Cotgreave I, Moldeus P, Orrenius S. Host biochemical defense mechanisms againts prooxidants. Annu Rev Pharmacol Toxicol (28): 189, 1988. 117. Coughlan R, Solomonson L. Cyanide in Biology. London: Academic Press, p. 133, 1981. 118. Cruz C, Wimberley P, Johansen K, Friis-Hansen B. The effect of vitamin E on erythrocyte hemolysis and lipid peroxidation in newborn premature infants. Acta Pediatrica Scandinavica (72): 823-826, 1983. 119. Czakó L, Takács T, Varga I, Tiszlavicz L, Hai D, Hegyi P, Matkovics B, Lonovics J. Involvement of oxygen-derived free radicals in L-arginine-induced acute pancreatitis. Dig Dis Sci 43 (8): 1770-1777, 1998. 120. Czech M. Molecular basis of insulin action. Annu Rev Biochem (46): 359-384, 1977.
116
121. Dahl TA, Midden WR, Hartman PE. Some prevalent biomolecules as defenses againts singlet oxygen damage. Photochem Photobiol (47): 357, 1988. 122. Daly J, Ertingshausen G. Direct method for determining inorganic phosphate in serum with the "CentrifiChem". Clin Chem 3 (18): 263-5, 1972. 123. Davies K, Delsignore M. Protein damage and degradation of oxygen radicals. J Biol Chem (262): 9895-9901, 1987. 124. Davies KJA. Protein damage and degradation by oxygen radicals. J Biol Chem (262): 9895, 1987. 125. Davies MJ, Forni LG, Willson RL. Vitamine E analogue Trolox C. ESR and pulse radiolysis studies of free radical reactions. Biochem J (255): 513, 1988. 126. De Duve C. Biochemical studies on the occurrence, biogenesis and life history of mammalian peroxisomes. J Histochem Cytochem (21): 941-948, 1973. 127. De Duve C. The separation and characterization of subcellular particles. Harvey Lect (59): 48-87, 1965. 128. De Duve C, Baudhuin P. Peroxisomes (microbodies and related particles). Physiol Rev (46): 323-357, 1966. 129. Del Maestro R, Thaw H, Björk J, Planker M, Arfors K. Free radicals as mediators of tissue injury. Acta Physiol Scand Suppl 792: 43-57, 1980. 130. Demopoulos H. The basis of free radical pathology. Fed Proc (32): 1859-1861, 1973. 131. Demopoulos H. The free radical pathology. Fed Proc (32): 1859, 1973. 132. Demopoulos H, Flamm E, Pietronigro D, Seligman M. The free radical pathology and the microcirculation in the major central nervous system disorders. Acta Physiol Sand Suppl 492: 91-119, 1980. 133. Di Luzio N. Antioxidants, lipid peroxidation and chemical-induced liver injury. Federation Proc (32): 1875-1881, 1973. 134. Dillard C, Dumelin E, Tappel A. Effect of dietary vitamin E on expiration of petane and ethane by the rat. Lipids (12): 109-114, 1977. 135. Dillard C, Kunert K, Tappel A. Effects of vitamin E, ascorbic acid and mannitol on alloxan-induced lipid peroxidation in rats. Arch Biochem Biohys 216: 204-212, 1982. 136. Dormandy T. Free radiccal oxidation and antioxidants. The Lancet 1: 647-650, 1978. 137. Douglas J, Finlayson N. Are increased individual susceptibility and environmental factors both necessary for the development of primary biliary cirrhosis? Br J Med 11: 419-420, 1979. 138. Drabkin D. Haemoglobin, Spectrometric studies, Part XIV. J Biol Chem (164): 703-708, 1946. 139. Drupt F, Paris M, Frydman A, Leclerc M. Serum albumin assay by bromocresol green method: application to different automatic apparatus. [Article in French]. Ann Pharm Fr 5 (32): 249-56, 1974. 140. Eisenwiener H. Kinetic determination of urea with the LKB system, Article in German. J Clin Chem Clin Biochem 6 (14): 261-4, 1972. 141. Epstein O, Arborgh B, Wroblewski R, Segiu M, Scheuer P, Scherlock S. Is copper hepatotoxic in primary biliary cirrhosis? Gut 10: 954, 1979.
117
142. Ernster L. DT-diaphorase. Methods Enzymol (10): 309, 1967. 143. Fantone J, Ward P. Role of oxygen-derived free radicals and metabiolites in leukocyte dependent inflammatory reactions. Amer J Pathol 3 (107): 397-418, 1982. 144. Farahani M, Simic MG. Hydroxyl radical induced cross-linking between phenylalanine and 2-deoxyribose. Biochemistry (27): 4695, 1988. 145. Fee J, Teitelbaum D. Evidence that superoxide dismutase plays a role in protecting red blood cells against peroxidative hemolysis. Biochem Biophys Res Commun (49): 150-158, 1972. 146. Fehér J, Bär Pollák Z, Sréter L, Fehér E, Toncsev H. Biochemical markers in carbon tertachloride - and galactosamine - inducedacut liver injuries: the effects of dihydroqunoline - type antioxidants. Br J Exp Path 63: 394-400, 1982. 147. Fehér J, Toncsev H, Fehér E, Kiss Á, Vasadi Á. Lysosomal enzymes in sera and granulocytes of patient’s with chronic liver diseases. Int J Tiss Reac (3): 31-37, 1981. 148. Fehér J, Vásárhelyi B, Blázovics A. Halothane hepatitis. Orvosi Hetilap 134 (33): 1795-1798, 1993. 149. Fehér J, Vereckei A. Szabadgyökök jelentısége az orvostudományban (Significance of free radical reactions in medicine). Budapest: Medicina Könyvkiadó, 1985. 150. Ferrendsen RW, Verma NC. A time resolved electron spin resonance study of the oxidation of ascorbic acid by hydroxyl radical. Biophys J (24): 93, 1978. 151. Fielden E, Roberts P, Bray R, Lowe D, Mautzner G, Rotilio G, Calabrese L. Mechanism of action of superoxide dismutase from pulse radiolysis and electron paramagnetic resonance, Evidence that only half the active site functions in catalysis. Biochem J (139): 49-60, 1974. 152. Fischer L, Hamburger S. Inhibition of alloxan action in isolated pancreatic islets by superoxide dismutase catalase, and a metal chelator. Diabetes 29: 213-216, 1980. 153. Flohé L, Schlegel W. Glutathion-peroxidase. IV. Hoppe-Seyler`s Z. Physiol. Chem. (352): 1401-1410, 1971. 154. Flohé R, Günzler WA, Schock HH. Glutathione peroxidase: a selenoenzyme. FEBS Lett (32): 132, 1973. 155. Floyd RA, West MS, Eneff KL, Hogsett WE, Tingey DT. Hydroxyl free radical mediated formation of 8-hydroxyguanine in isolated DNA. Arch Biochem Biophys (262): 266, 1988. 156. Fong K, McCay P, Poyer J, Misra H, Keele B. Evidence for superoxide-dependent reduction of Fe3+ and its role in enzymegenerated hydroxyl redical formation. Chem Biol Interact (15): 77-89, 1976. 157. Forman H, Boveris A. Mitochonrial Superoxide and Hydrogen Peroxide. In: Pryor W, ed. Free Radicals in Biology. Vol. 5. New York: Academic Press, pp. 75-89, 1982. 158. Forman H, Boveris A. Superoxide radical and hydrogen peroxide in mitochondria. In: Pryor W, ed. Free Radicals in Biology. Vol. 5. New York: Academic Press, pp. 65, 1981. 159. Forman H, Kennedy J. Superoxide production and electron transport in mitochonrial axidation of dihydroorotic acid. J Biol Chem (250): 4322-4326, 1975.
118
160. Forni L, Willson R. Vitamin C and consecutive hydrogen atom and electron transfer reactions is free radical protection: a novel catalytic role for glutathione. In: Mc Brien D, Slater C, eds. Protective Agents in Cancer. London: Academic Press, pp. 159, 1983. 161. Forstrom J, Zakowski J, Tappel A. Identification of the catalytic site of rat liver glutathione peroxidase as selenocysteine. Biochemistry 17 (13): 2639-2644, 1978. 162. Fowler C, Callingham B. Substrate-specific activation of rat liver mitochondrial monoamine oxidase by oxygen. Biochem Pharmacol (27): 1995, 1978. 163. Freedman RB. How many distinct enzymes are responsible for the several cellular processes involving thiol: protein-disulphide interchange. FEBS Lett (97): 201, 1979. 164. Freeman B, Crapo J. Biology of Disease, Free radicals and Tissue Injury. Lab Invest 5 (47): 412-426, 1982. 165. Fridovich I. Superoxide and superoxide dismutases. In: Eichhorn G, Marzilli L, eds. Advances of Inorganic Biochemistry. New York, Amsrerdam, Oxford: Elsevier, North Holland, pp. 67-90, 1979. 166. Fridovich I. Superoxide Dismutases. Ann Rev Biochem (44): 147-159, 1975. 167. Fridovich I. Superoxide radical: an endogenous toxicant. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. (23): 239-257, 1983. 168. Fridovich I, Handler P. Detection of free radicals generated during enzymatic oxidation by the initiation of sulfite oxidation. J Biol Chem (236): 1836-1840, 1961. 169. Gaál T. Glutation peroxidázok. Magyar Állatorvosok Lapja 120 (3): 160-164, 1998. 170. Gaál T, Karsai F, Mézes M, Ribiczey S, P, Brydl E. Blood lipid peroxidative (LP) parameters in dairy cows with various liver lipid contents. In: Matkovics B, Karmazsin L, Kalász H, eds. Radicals ions and tissue damage. Budapest: Akadémiai Kiadó, pp. 95-98, 1990. 171. Gaál T, Mézes M, Miskucza O, Ribiczey-Szabó P. Effect of fasting on blood lipid peroxidation parameters of sheep. Res Vet Sci (55): 104-107, 1993. 172. Gaál T, Mézes M, Noble R, Dixon J, Speake B. Development of antioxidant capacity in tissues of the chick embryo. Comp Biochem Physiol 112B (4): 711-716, 1995. 173. Galig T, Babior B. The killing of pathogenes by phagocytes. Ann Rev Med (32): 313-326, 1981. 174. Galvan A, Muscelli E, Catalano C, Natali A, Sanna G, Masoni A, Bernardini B, Barsacchi R, Ferrannini E. Insulin decreases circulating vitamin E levels in humans. Metabolism, - Clinical and Experimental 8 (45): 998-1003, 1996. 175. Gambino R, Desvarieux E, Orth M, Matan H, Ackattupathil T, Lijoi E, Wimmer C, Bower J, Gunter E. The relation between chemically measured total iron-binding capacity concentrations and immunologically measured transferrin concentrations in human serum. Clin Chem 12 (43): 2408-12, 1997. 176. Gandy S, Buse M, Crouch R. Protective Role of Superoxide Dismutase against Diabetogenic Drugs. J Clin Invest 70: 650-658, 1982.
119
177. Garber M, Roeder R, Davidson P, Pumfrey W, Schelling G. Dose-response effects of vitamin E supplementation on growth performance and meat characteristics in beef and dairy steers. Canadian Journal of Animal Science 76 (1): 63-72, 1996. 178. Garcia-Bunuel L. Lipid peroxidation in alcoholic myopathy and cardiomyopathy. Med Hypotheses (13): 217, 1984. 179. Gebicki J, Bielski B. Comparison of the capacities of the pergydroxyl radical and the superoxide radicals to initiate chain oxidation of linoleic acid. J Am Chem Soc (103): 7020-7022, 1981. 180. Gille J, Joenje H. Biological significance of oxygen toxicity: an introduction. In: Pelfrey C, ed. Membrane Lipid Oxidation. Vol. 3. Boca Raton, Ann Arbor, Boston: CRC press, pp. 1-32, 1991. 181. Gillette J, Brodie B, Ladu B. The oxidation of drugs by liver microsomes on the role of TPNH and oxygen. J Pharmacol Exp Ther (119): 532-543, 1957. 182. Ginsburg I, Borinski R, Malamud D, Sturckmayer F, Klimetzek V. Chemiluminescence and superoxide gneration by leukocytes stimulated by polyelectrolyte-opsonized bacteria: Role of polyarginine, polylysine, polyhistidine, cytochalasins and inflammatory exudates as modulators of the respiratory burst. Inflammation (51): 245-271, 1985. 183. Gitter M, Bradley R, Pepper R. Nutritional myodegeneration in dairy cows. Veterinary Record 2 (103): 24-26, 1978. 184. Goetzl E. Mediators of immediate hypersensitivity derived from arachidonic acid. N Eng J Med 4 (303): 822-825, 1980. 185. Goldstein B, Falk G, Benjamin L, McDonagh E. Blood Cells (2): 535, 1975. 186. Gornall A, Bardawill C, David M. Determination of serum proteins by means of the biuret reaction. J Biol Chem (177): 751-766, 1949. 187. Gotoh T, Shikama K. Generation of the superoxide radical during the autoxidation of oxymyoglobin. J Biochem (80): 397-399, 1976. 188. Grams GW, Eskins K. Dye-sensitized photooxidation of tocopherols. Correlation between singlet oxygen reactivity and vitamin E activity. Biochemistry (11): 606, 1972. 189. Granger D, Rutili G, McCord J. Superoxide radicals in feline intestinal ischaemia. Gastroenterology 81: 22-29, 1981. 190. Grimm LM, Collison MW, Fisher RA, Thomas JA. Protein mixed-disulfides in cardiac cells. S-Thiolation of soluble proteins in response to diamide. Biochim Biophys Acta (844): 50, 1985. 191. Gritz Bd, Rahko T. Pathological findings in dietary produced oxidative stress in growing pigs, 10th. Autumn Meeting. European Society of Veterinary Pathology, Zurich, 24-27 September 1990. Schweizer Archiv für Thierheilkunde 8 (132): 435, 1990. 192. Groves J. Cytochrome P-450 and Other Heme-Containing Oxygenases. In: Marzilli Ea, ed. Advances in Inorganic Biochemistry. North Holland: Elsevier North Holland, 1979. 193. Guarnieri C, Giorando E, Muscari C, Grossi L, Caldarera C. Alpha-tocopherol pretreatment improves endothelium-dependent vasodilation in aortic strips of young
120
and aging rats exposed to oxidative stress. Molecular and Cellular Biochemistry 157 (1-2): 223-228, 1996. 194. Gurtner G, Farrukh I, Adkinson N, Scinto A, Jacobson J, Michael J. Role of arachidonate mediators in peroxide-induced lung injury. Am Rev Respir Dis (136): 480, 1987. 195. Gutteridge JMC. Antioxidant properties of coeruloplasmin towards iron- and cooper-dependent oxygen radical formation. FEBS Lett (157): 37, 1983. 196. Haber F, Weiss J. The catalytic decomposition of hydrogen peroxide be iron salts. Proc R Soc London Ser A (147): 332, 1934. 197. Hafeman D, Sunde R, Hoekstra W. Effect of dietary selenium on erytrhocyte and liver glutathione peroxidase in the rat. Journal of Nutrition 104: 580-587, 1974. 198. Hakkarainen J, Työppönen J, Jönsson L. Vitamin E requirement of the growing rat during selenium deficiency with special reference to selenium dependent - and selenium independent glutathione peroxidase. J Vet Med 33: 247-258, 1986. 199. Halliwell B. The superoxide dismutaes activity of iron complexes. FEBS Lett (56): 34, 1975. 200. Halliwell B. Superoxide-dependent formation of hydroxyl radicals in the presence of iron chelates. FEBS Lett (92): 321-326, 1978. 201. Halliwell B, Gutteridge J. The importance of free radicals and catalytic metal ions in human diseases. Mol Asp Med 8 (2): 89-193, 1985. 202. Halliwell B, Gutteridge J. Oxygen free radicals and iron relation to biology and medicine: some problems and concepts. Arch Biochem Biophys (246): 501, 1986. 203. Handin R, Karabin R, Boxer B. Enhancement of Platelet Function by Superoxide Anion. J Clin Invest (59): 959-965, 1977. 204. Haraszti E. Mérgezı növények , növényi mérgezések. Vol. 1. 1 ed. Budapest: Mezıgazdasági Kiadó, 1985. 205. Harlan J, Callaham K. Role of hydrogen peroxide in the neutrophil-mediated release of prostacyclin from cultured endothelial cells. J Clin Invest (74): 44, 1984. 206. Harman D. The aging process. Proc Natl Acad Sci USA 11 (78): 7124-7128, 1981. 207. Harman D. Free radical theory of aging: dietary implications. Am J Clin Nut (25): 839-843, 1972. 208. Harman D. Free radical theory of aging: nutritional implications. Age (1): 145-152, 1978. 209. Harman D. Nutritional implicatons of the free radical theory of aging. J Am Coll Nutr (1): 27-34, 1982. 210. Harman D. Prolongation of life: role of free radical reactions in aging. J Am Ger Soc (17): 721-732, 1969. 211. Harper Jr D, Robinson F. Comparative pathology of animals exposed to carbon tetrachloride in oxygen at 258 mm. Hg and ambient air. Aerosp Med 38 (8): 784788, 1967. 212. Harrap K, Jackson C, Riches P, Smith S, Hill B. The occurrence of proteinbound mised disulfides in rat tissues. Biochim Biophys Acta (310): 104-110, 1973. 213. Heikkila R, Cohen G. 6-hydrowydopamine: evidence for superoxide radical as an oxidative intermediate. Science (181): 456-457, 1973.
121
214. Heikkila R, Winston B, Cohen G, Barden H. Alloxan-induced diabetes - evidence for hydroxyl-radical as a cytotoxic intermediate. Biochem Pharmacol 25: 10851092, 1976. 215. Hellman B, Idahl L, Lernmark A, Sehlin J, Täljedal I. Stimulation of insulin release by thiols. Biochim Biophys Acta (392): 101-109, 1975. 216. Herdt T, Smith J. Blood-lipid and lactation-stage factors affecting serum vitamin-E concentrations and vitamin-E cholesterol ratios in dairy cattle. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 8 (2): 228-232, 1996. 217. Hibbs J, Taintor R, Vavrin Z, Rachlin R. Nitric oxide: a cytotoxic activated macrophage effector molecule. Biochem Biophys Res Commun 157: 87, 1988. 218. Hidary H, Sano Y, Ambo K. Studies on volatile fatty acid oxidation and incorporation into the lipid of liver slices from alloxan diabetic and starved sheep. Tohoku Journal of Agricultural Rescarch 19 (2): 106-115, 1968. 219. Hidiroglou M, Hartin K. Vitamins A, E and selenium blood levels in the fat cow syndrome. Canadian Veterinary Journal 8 (23): 255-258, 1982. 220. Hildebrandt A, Roots I. Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) dependent formation and breakdown of hydrogen peroxide during mixed function oxidation reactions in liver microsomes. Arch Biochem Biophys (171): 385-397, 1975. 221. Hille R, Massy V. Studies on the oxidative half-reaction of xanthine-oxidase. J Biol Chem (256): 9090, 1981. 222. Hinkle P, Butow R, Racker E, Chance B. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylaltion. J Biol Chem (242): 5169-5173, 1967. 223. Hoey BM, Butler J. The repair of oxidized amino acids by antioxidants. Biochim Biophys Acta (791): 212, 1984. 224. Hornsby P, Crivello J. The role of lipid peroxidation and biological antioxidants in the function of the adrenal cortex. Molec Cell Endocrinol 30: 123-147, 1983. 225. Hornsby P, Crivello J. The role of lipid peroxidation and biological antioxidants in the function of the adrenal cortex, Part 1: A background review. Molec Cell Endocrinol 30: 1-20, 1983. 226. Horton A, Packer L. Interactions between malondialdehyde and rat liver mitochondria. J Gerontol (25): 199-204, 1970. 227. Hruban Z, Rechcigl MJ. Microbodies and related particles, Morphology, biochemistry and phyosiology. Int Rev Cytol Suppl (1): 1-296, 1969. 228. Hultgren B. Inherited, chronic, progressive hepatic degeneration in Bedlington terrier with elevated liver copper concentrations. Dissertation Abstracts International B 12 (44): 3678, 1984. 229. Hunt J, Dean R, Wolff S. Hydroxyl radical production and autoxidative glycosylation: glucose autoxidation as the cause of protein damage in the experimental glycation as a model of diabetes mellitus and aging. Biochem J (256): 205-212, 1988. 230. Husvéth F, Karsai F, Gaál T. Changes of certain lipid components in the plasma and liver of dairy cows during the perinatal period. Acta Veterinary Hungarica 30: 97112, 1983.
122
231. Hyslop P, Hinshaw D, Halsey W, Schraufstatter I, Sanerheber R, Spragg R, Jackson J, Cochrane C. Mechanism of oxidant-mediated cell-injury. J Biol Chem (263): 1665, 1988. 232. Ichida T, Nobuoka M. Measurement of total and direct bilirubin in low concentration of normal human serum with improved alkaline azobilirubin blue method. Clin Chim Acta 3 (20): 532-4, 1968. 233. Ito A, Hayashi S, Yoshida T. Participation of a cytochrome b5-like hemoprotein of outer mitochondrial membrane (OM cytochrome b) in NADH-semidehydroascorbic acid reductase activity in the liver. Biochim Biophys Res Commun 101 (2): 591598, 1981. 234. Ivanov V, Vaseneva I, Udintsev N. Lipid peroxidation in the liver of rats with alloxan diabetes. Probl Endokrinol Moscow (30): 70-73, 1984. 235. Jackson R, Chandler D, Fulmer J. Production of arachidonic acid metabolites by endothelial cells in hyperoxia. J Appl Physiol (61): 584, 1986. 236. Jacob H. Mechanisms of Heinz body formation and attachment to red cell membrane. Semin Hematol 7 (3): 341-354, 1970. 237. Jacob H, Lux S. Degradation of membrane phospholipids and thiols in peroxide hemolysis: studies in vitamin E deficiency. Blood 32 (4): 549-568, 1968. 238. Jacob H, Rain M, Dacie J. Altered sulfhydryl reactivity of hemoglobins and red blood cell membranes in congenital Heinz body hemolytic anemia. J Clin Invest 47 (12): 2664-2677, 1968. 239. Jain N. Essentials of Veterinary Hematology. Philadelphia: Lea and Febiger, 1993. 240. Jain S. The accumulation of malonyldialdehyde, an end product of fatty acid peroxidation, can disturb aminophospholipid organization in the membrane bilayer of human erythrocytes. J Biol Chem 259: 3391-3394, 1984. 241. Jain S. In vivo externalization of phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine in the membrane bilayer and hypercoagulability by the lipid peroxidation of erythrocytes in rats. J Clin Invest 76: 281-286, 1985. 242. Jain S, McVie R, Duett J, Herbst J. Erythrocyte membrane lipid peroxidation and glycosylated hemoglobin in diabetes. Diabetes 38: 1539-1543, 1989. 243. Jamieson D, Cass N. CNS and pulmonary damage in anesthetized rats exposed to hyperbaric oxygen. J Appl Physiol (23): 235-242, 1967. 244. Jerrett S, Jefferson D, Mengel C. Seizures, H2O2 formation and lipid peroxide in brain during exposure to oxygen under high pressure. Aerosp Med (44): 40-44, 1973. 245. Johnson W, Jefferson D, Mengel C. In vivo formation of H2O2 in red cells during exposure to hyperoxia. J Clin Invest (51): 2211-2213, 1972. 246. Johnston RJ, Keele BJ, Misra H, Webb L, Lehmeyer J, Rajagopalan K. Superoxide anion generation and phagocytic bactericidal activity. In: Bellanti J, Dayton D, eds. The Phagocytic Cell in Host Resistance. New York: Raven, pp. 61-75, 1975. 247. Joshi JG, Zimmermann A. Ferritin: an expanded role in metabolic regulation. Toxicology (48): 21, 1988. 248. Kagan V, Kotelevtzev S, Koslov Y. Role of enzymic lipid peroxidation in disassembly of liver endoplasmatic reticulum membranes. Proc Natl Acad Sci USSR (217): 213-216, 1974.
123
249. Kagan V, Packer L, Serbinova E. Relationships between free radical reactions and the function of the cytochrome P-450 system. In: Csomós G, Fehér J, eds. Free Radicals and the Liver. Berlin, Heidelberg: Springer Verlag, pp. 21, 1992. 250. Kakinuma K, Chance B. Spectrophotometric studies on NAD(P)H oxidase and myeloperoxidase. Biochim Biophys Acta (480): 96-103, 1977. 251. Kanofsky J. Singlet oxygen production by chloroperoxidase-hydrogen peroxidehalide systems. J Biol Chem (259): 5596, 1984. 252. Kanofsky J. Singlet oxygen production by lactoperoxidase: halide dependence and quantitation of yield. Photochem Photobiol (25): 105, 1984. 253. Kappus H. Oxidative sterss in chemical injury. Arch Toxicol (60): 144, 1987. 254. Karplus PA, Schulz GE. Refined structure of glutathione reductase at 1.54 A resoluton. J Mol Biol (195): 701, 1987. 255. Karsai F. Állatorvosi Kórélettan. Debrecen: Mezıgazdasági Kiadó, 1982. 256. Karsai F. VIII. fejezet, Anyagforgalmi és mozgásszervi betegségek. In: Karsai F, Vörös K, eds. Állatorvosi belgyógyászat. Vol. 1. Debrecen: Mezıgazda Kiadó, pp. 463, 1993. 257. Karsai F, Gaal T. Changes in certain parameters of lipid metabolism in dairy cows during the periparturient period. Deutsche Tierarztliche Wochenschrift 5 (94): 264268, 1987. 258. Kato R. Characteristics and differences in the hepatic mixed function oxidases of different species. Pharmac Ther 6: 41-98, 1979. 259. Kawade M. An automatic method for determination of alkaline phosphatase in serum using p-nitrophenylphosphate as substrate. Mie Med J 1 (14): 41-6, 1964. 260. Kellogg E, Fridovich I. Superoxide, hydrogen peroxide and singlet oxygen in lipid peroxidation by a xanthine oxidase system. J Biol Chem (250): 8812-8817, 1975. 261. Kennedy S, Rice D, Davidson W. Experimental myopathy in vitamin E- and selenium-depleted calves with and without added dietary polyunsaturated fatty acids as a model for nutritional degenerative myoppathy in ruminant cattle. Research in Veterinary Science 3 (34): 384-394, 1987. 262. Khan A. Enzyme system generation of singlet molecular oxygen observed directly by 1,0-1,8 µm luminescence spectroskopy. J Am Chem Soc (105): 7195, 1983. 263. Khan A, Lovejoy D, Sharma R, Sharma M, Prior M, Lille L. Effects of high dietary sulphur on enzyme activities, selenium concentrations and body weight of cattle. Canadian Journal Veterinary Research 51: 174-180, 1986. 264. Kibata M, Higuchi Y. Serum alpha-tocopherol, coenzyme Q and thiobarbituric acid - reactive substance in acute myocardial damage and stroke. In: Lubin B, Machlin L, eds. Vitamin E biochemical, hematological and clinical aspects. Vol. 393. New York: Ann New York Acad Sci, pp. 179-182, 1982. 265. Kimball R, Reddy K, Pierce T, Schwartz L, Mustafa M, Cross C. Oxygen toxicity: augmentation of antioxidant derense mechanisms in rat lung. Am J Physiol (230): 1425-1431, 1976. 266. Klebanoff S. Oxygen metabolism and the toxic properties of phagocytes. Ann Int Med (93): 480-489, 1980. 267. Klebanoff S. Role of the superoxide anion in the myeloperoxidase-mediated antimicrobial system. J Biol Chem (249): 3724-3728, 1974.
124
268. Kohut A, Mojzis J. Effect of allopurinol and superoxide dismutase on indomethacin-induced gastric lesions in the rat. Physiol Res 4 (42): 273-276, 1993. 269. Kondos A, McClymont G. Enhanced toxicity of carbon tetrachloride in sheep on high protein intakes. Aust Vet J (41): 349-351, 1965. 270. Kono Y, Fridovich I. Superoxide radical inhibits catalase. J Biol Chem (257): 5751, 1982. 271. Kónya L, Bencsath P, Szénási G, Takács L, Schaff Z, Vereckei A, Fehér J. Effect of free radicals in ischaemic renal failure in the dog. Acta Physiol Hung 4 (76): 319331, 1990. 272. Kosower E. A molecular basis for learning and memory. Proc Natl Acad Sci USA (69): 3292-3296, 1974. 273. Kosower E, Kanety-Londner H. Glutathione, 13, Mechanism of thiol oxidation by diazenedicarboxylic acid derivates. J Am Chem Soc 98 (10): 3001-3007, 1976. 274. Kosower N, Song K, Kosower E, Correa W. Glutathione, II, Chemical aspects of azoester procedure for oxidation to disulfide. Biochim Biophys Acta 192 (1): 8, 1969. 275. Kosower NS, Kosower EM. The glutathione status of cells. Int Rev Cytol (54): 109, 1978. 276. Koster JF, Slee RG. Lipid peroxidation of human erythrocyte ghost induced by organic hydroperoxydes. Biochim Biophys Acta (752): 233, 1983. 277. Krappanen E, Rizzo A, Saari L, Berg S, Bostrom H. Investigation on trichotecenestimulated lipid peroxidation and toxic effects of trichotecenes in animals. Acta Veterinaria Scandinavica 30 (4): 391-399, 1989. 278. Krogh A. The Anatomy and Physiology of Capillaries. 2 ed. New Haven: New Haven: Yale University Press, 1929. 279. Kubes P. Ischemia-reperfusion in feline small intestine: a role for nitric oxide. Am J Physiol 264: 143-149, 1993. 280. Kuriyama Y, Omura T, Siekevitz P, Palade G. J Biol Chem (244): 2017, 1969. 281. Kutas F, Veresegyházy T. Biokémiai Jegyzet. Budapest: Állatorvostudományi Egyetem, 1986. 282. Labbe G, Descatoire V, Lettéron P, Degott C, Tinel M, Larrey D, Carrion-Pavlov Y, Genéve J, Amouyal G, Pessayre D. The drug methoxsalen, a suicide substrate for cytochrome P-450, decreases the metabolic activation, and prevents the hepatotoxicity of carbon tetrachloride in mice. Biochem Pharmacol 36: 907-914, 1987. 283. Laczay P. Állatorvosi toxikológia. Vol. 1. 1 ed. Budapest: ÁOTE Gyógyszertani és Méregtani Tanszék, 1995. 284. Laczay P. Kandidátusi Értekezés: Az ionofor coccidiumellenes szerek jelentısebb toxikus interakciói broilercsirkén, Állatorvostudományi Egyetem, 1990. 285. Lantz G. Oxygen free radicals and reperfusion injury. In: Bonagura J, ed. Kirk's Current Veterinary Therapy XII. Small Animal Practice: WB Saunders, pp. 64-67, 1995. 286. Lantz G. Reperfusion injury in experimental canine gastric dilatation volvulus, Free Communications. In: AAHA’s 57th Annual Meeting, 1990.
125
287. Lantz G, Badylak S, Hiles M, Arkin T. Treatment of reperfusion injury in dogs with experimentally induced gastric dilatation volvulus. Am J of Vet Res 53 (9): 15941598, 1992. 288. Lash L, Jones D. Characterization of membrane-associated thiol oxidaes activity of rat small-intestine epithelium. Arch Biochem Biophys (255): 344, 1983. 289. Lauber K. Determination of serum iron and iron-binding capacity without deproteinization. [Article in German]. Z Klin Chem Klin Biochem 3 (3): 96-9, 1965. 290. Lawrence J, Loomis W, Tobias C, Turpin F. Preliminary observations on the narcotic effects of xenon with a review of values for solubilities of gases in water and oils. J Physiol (105): 197, 1946. 291. Lawrence R, Burk R. Glutathione-peroxidase activity in selenium-defficient rat liver. Biochem Biophys Res Comm (71): 952-955, 1976. 292. Lawrence R, Burk R. Species, tissue and subcellular distribution of non Sedependent glutathione peroxidase activity. J Nutr 108: 211-215, 1978. 293. Ledwozyw A, Kadziolka A. Ontogenesis of antioxidant enzymes in pig. Polskie Archivum Weterinaryjne (29): 77-94, 1989. 294. Lehninger A, Vercesi A, Bababunmi E. Regulation of Ca2+ release from mitochondria by the oxidation-reduction state of pyridine nucleotides. Proc Natl Acad Sci USA 75 (4): 1690-1694, 1978. 295. Lettéron P, Labbe G, Degott C, Berson A, Fromenty B, Delafroge M, Larrey D, Pessayre D. Mechanism for the protective effects of silymarin against carbon tetrachloride-induced lipid peroxidation and hepatotoxicity in mice. Biochem Pharm (39): 2027-2034, 1990. 296. Lind C, Hochstein P, Ernsto L. DT-diaphorase as a quinone reductase. A cellular control device against semiquinone and superoxide radical formation. Arch Biochem Biophys (216): 178, 1982. 297. Lindahl T. DNA repair enzymes. Annu Rev Biochem (51): 61, 1982. 298. Lo T, Sandi E. Selenium: occurence in foods and its toxicological significance review. J Env Pathol Toxicol (4): 193-218, 1980. 299. Lopez-Barea J, Lee CV. Mouse-liver glutathione reductase. Eur J Biochem (98): 487, 1979. 300. Lorentz K. Improved determination of serum calcium with 2-cresolphthalein complexone. Clin Chim Acta 3 (126): 327-34, 1982. 301. Loschen G, Flohe L, Chance B. Respiratory chain linked H2O2 production in pigeon heart mitochondria. FEBS Lett (18): 261-264, 1971. 302. Losonczi H, Pár S, Pakodi F, Nagy I, Jávor T. A trombocita-funkciók változása antioxidánsok hatására. In: Oxigén szabad gyökök és szövetkárosodás,Tudományos ülés, 1984, jún. 10-11., Pécs, 1984. 303. Lotscher H, Winterhalter K, Carafoli E, Richter C. Proc Natl Acad Sci USA (76): 4340, 1979. 304. Lott J, Patel S, Sawhney A, Kazmierczak S, Love JJ. Assays of serum lipase: analytical and clinical considerations. Clin Chem 7 (32): 1290-302, 1986. 305. Lowry O, Rosenbrough N, Farr A, Randall R. Protein measurement with the Folinphenol reagent. J Biol Chem 193: 265-275, 1951.
126
306. Lowseth L, Gillett N, Gerlach R, Muggenburg B. The effect of againg on haematology and serum chemistry values in the Beagle dog. Veterinary Clinical Pathology 1 (19): 13-19, 1990. 307. Lucy J. Structural interactions between vitamin E and polyunsaturated lipids. Wld Rev Nutr Diet (31): 184-189, 1978. 308. Maas J, Bulgin M, Anderson B, Frye T. Nutritional myodegeneration axxociated with vitamin E deficiency and normal selenium status in lambs. Journal of the American Veterinary Medical Association 2 (184): 201-204, 1984. 309. Magdus M. Kandidátusi Értekezés: Zsiranyagforgalmat befolyásoló tényezık vizsgálata, és az energiaellátás javitásának lehetıségei kérıdzıkben, Állatorvostudományi Egyetem, 1992. 310. Malaisse W, Malaisse-Legale F, Sener A, Pipeleers D. Proc Natl Acad Sci, USA 79: 927, 1982. 311. Mannervik B, Axelsson K. Role of cytoplasmic thioltransferase in cellular regulation by thiol-disulphide interchange. Biochem J (190): 125, 1980. 312. Marcus A. Pathways of oxigen utilization by stimulated platelets and leukocytes. Seminars in Hematology 3 (16): 188-195, 1979. 313. Marklund SL. Extracellular superoxide dismutase in human tissues and human cell lines. J Clin Invest (74): 1398, 1984. 314. Marklund SL. Human copper-containing superoxide dismutase of high molecular weight. Proc Natl Acad Sci U S A (79): 7634, 1982. 315. Marklund SL. Properties of extracellular superoxide dismutase from human lung. Biochem J (220): 269, 1984. 316. Mashino T, Fridovich I. Mechanism of the cyanide-catalysed oxidation of alphaketoalcohols. Arch Biochem Biophys (252): 163-170, 1987. 317. Masters S, Holmes R. Peroxisomes: new aspects of cell physiology and biochemistry. Physiol Rev (57): 816-882, 1977. 318. Matheson IBC, Etheridge RD, Kratowich NR, Lee J. The quenching of singlet oxygen by amino acid and proteins. Photochem Photobiol (21): 165, 1975. 319. Matkovics B, Kotormán M, Varga I, Hai D, Varga C. Oxidative stress in experimental diabetes induced by streptozotocin. Acta Physiol Hung 85 (1): 29-38, 1997-98. 320. Matkovics B, Novák Z, Varga S, Takács T. Haemorrheologiai és antioxidáns váltotások humán pankreatitiszben. Orvosi Hetilap 36 (31): 1663-1665, 1995. 321. Matkovics B, Sz Varga I. Peroxid anyagcsere enzimek, szuperoxid dizmutáz, peroxidáz és kataláz mennyiségi meghatározása biológiai anyagban. Laboratóriumi Diagnosztika 4: 91, 1977. 322. Matkovics B, Sz Varga I, Szabó L, Witas H. The effect of diabetes on the activities of the peroxide metabolism enzymes. Horm Metab Res (14): 77-79, 1982. 323. Matkovics B, Szabó L. Comparative superoxide dismutase activity studies. Michrochem J 30: 125-129, 1984. 324. Matkovics B, Szabó L, Sz Varga I. Lipid peroxidáció és redukált glutation anyagcsere enzimek aktivitás meghatározása biológiai mintákban. Laboratóriumi Diagnosztika 15 (4): 248-250, 1988.
127
325. Matkovics B, Szabó L, Sz Varga I. New results of our superoxide dismutase studies and future plans in this fields. Acta Universitatis Lodziensis Folia Biochimica et Biophysica (5), 1986. 326. Matsuo M, Gomi F, Dooley M. Age-related alterations in antioxidant capacity and lipid peroxidation in brain, liver and lung homogenates of normal and vitamin E deficient rats. Mech Ageing Dev 3 (64): 273-292, 1992. 327. Mavelli I, Cirilio MR, Rotilio G. Multiple electrophoretic variant of Cu, Zn superoxide dismutase as expression of enzyme aging. Effects of H2O2, ascorbate and metal ions. Bichem Biophys Res Commun (117): 677, 1983. 328. McCay P, Lai E, Poyer J, Dubose C, Janzen E. Oxygen- and carbon-centered free radical formation during carbon tetrachloride metabolism. Observation of lipid radicals in vivo and in vitro. J Biol Chem (259): 2135-2143, 1984. 329. McCord J, Fridovich I. The biology and pathology of oxygen radicals. Annals of Internal Medicine (89): 122-127, 1978. 330. McCord J, Fridovich I. Superoxide dismutase. An enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein). J Biol Chem (244): 6049-6055, 1969. 331. McCord J, Roy R. The pathophysiology of superoxide: roles in inflammation and ischaemia, Symposium in Active oxygen and Medicine. Canadian J Physiol Pharmacol 11 (60): 1346-1352, 1982. 332. McCroskey R, Chang T, David H, Winn E. p-Nitrophenylglycosides as substrates for measurement of amylase in serum and urine. Clin Chem 8 (28): 1787-91, 1982. 333. McIlroy S, Goodall E, Rice D, McNulty M, Kennedy D. Imroved performance in commercial broiler flocks with subclinical infectious bursal disease when fed diets containing incerased concentrations of vitamin E. Avian Pathology 22: 81-94, 1993. 334. McKnight R, Hunter FJ. Mitochondrial membrange ghosts produced by lipid peroxidation induced by ferrous ion, II, Composition and enzymatic activity. J Biol Chem (241): 2757-2765, 1966. 335. McLean A, McLean F. The effect of diet and 1, 1.1-trichloro-L,2-bis-(pchlorophenye) ethane (DDT) on microsomal hydroxylating enzymes and on sensitivity of rats to carbon tetrachloride poisoning. Biochen J 100: 564-71, 1969. 336. Mengel C. The effects of hyperoxia on red cells as related to tocopherol deficiency. Ann New York Acad Sci (203): 163-171, 1972. 337. Merril A, Lambeth J, Edmondson D, McCromic D. Formation and mode of action of flavoproteins. Annu Rev Nutr (1): 281, 1981. 338. Mézes M. Kandidátusi Értekezés: Lipidperoxidáció és az antioxidáns védırendszer mőködésének vizsgálata egyes gazdasági állatoknál, Gödöllıi Agrártudományi Egyetem, 1985. 339. Mézes M, Gábor G, Janbaz J, Bozó S, Gaál T, Ribiczeiné Szabó P, Bárány I. Energiahiányos takarmányozás hatása a tenyészbikák anyagcseréjére, 2. közlemény: a májenzimek, a pajzsmirigyhormonok, valamint a vörösvérsejtek lipidperoxid státuszának változása. Állattenyésztés és Takarmányozás 43 (5): 407-413, 1994. 340. Mézes M, Sályi G. Effect of acute selenium toxicosis on the lipid peroxide status and the glutathione system of broiler chickens. Acta Veterinaria Hungarica 42: 459463, 1994.
128
341. Mézes M, Sályi G. Kisérletes A-vitamin túladagolás hatása a pecsenyekacsa egyes termelési mutatóira, valamint a vérplazma és a máj A-vitamin tartalmára és lipidperoxid státuszára. Állattenyésztés és Takarmányozás 41 (4): 319-328, 1992. 342. Mézes M, Sályi G, Bánhidi G, Szeberenyi S. Effect of acute salinomycin-tiamulin toxicity on the lipid peroxide and atioxidant status of broiler chicken. Acta Veterinaria Hungarica 4 (40): 251-257, 1992. 343. Mézes M, Surai P, Sályi G, Speake B, Gaál T, Majdijan A. Nutritional metabolic disease of poultry and disorders of the biological antioxidant defence system. Acta Veterinaria Hungarica 45 (3): 349-360, 1997. 344. Michaelis L. Fundamentals of oxidation and reduction. In: Green DE, ed. Currents in Biochemical Research. New York: Interscience, pp. 207-227, 1946. 345. Mills GC. Hemoglobin catabolism. I. Glutathione peroxidase, an erythrocyte enzyme which protects hemoglobin from oxiative beakdown. J Biol Chem (229): 189-197, 1957. 346. Misra H, Fridovich I. The generation of superoxide radical during the autoxidation of hemoglobin. J Biol Chem (247): 6960-6962, 1972. 347. Misra H, Fridovich I. The role of superoxide anion in the autoxidation of epinephrine and a simple assay for superoxide dismutatses. J Biol Chem 247: 31703175, 1972. 348. Misra HL, Fridovich I. Univalent reduction of oxygen by reduced flavins and quinons. J Biol Chem (247): 188, 1972. 349. Misra HP. Generation of superoxide free radical during autoxidation of thiols. J Biol Chem (249): 2151-2155, 1974. 350. Modig H. Cellular mixed disulfide between thiols and proteins and their possible implication for radiation protection. Biochem Pharmacol (17): 177-186, 1968. 351. Morrison M, Allen PZ, Bright J, ayasinghe W. Lactoperoxidase. Identification and isolation of lactoperoxidase from salivary gland. Arch Biochem Biophys (111): 126-133, 1965. 352. Mudron P, Rehage J, Sallmann H, Mertens M, Scholz H, Kovac G. Plasma and liver alpha-tocopherol in dairy cows with left abomasal displacement and fatty liver. Journal of Veterinary Medicine, Series A 77 (2): 91-97, 1997. 353. Muth OH. Carbon tetrachloride poisoning of ewes on a low selenium ration. Am J Vet Res 21 (86-87), 1960. 354. Müller DPR. Free radical problems of the newborn. Proc Nutr Soc (46): 69-75, 1987. 355. Nagel R, Ranney H. Drug-induced oxidative denaturation of hemoglobin. Semin Hematol 10 (4): 269-278, 1973. 356. Nath K, Paller M, Croatt A. Dietary deficiency of antioxidants exacerbates ischemic injury in the rat. Kidney International 38 (6): 1109-1117, 1990. 357. Nielsen H, Finot P, Hurrell R. Reactions of proteins with oxidizing lipids 2. Influence on protein quality and on the bioavailability of lysine, methionine, cyst(e)ine and tryptophan as measured in rat assays. British Journal of Nutrition 53: 75-86, 1985. 358. Niki E, Saito T, Kamiya Y. The role of vitamin C as an antioxidant. Chemistry letters : 631-632, 1983.
129
359. Niki E, Yamamoto Y, Kamiya Y. Role of uric acid, cysteine and glutathione as chain breaking antioxidant in aqueous phase. Chem Lett 8: 1267, 1985. 360. Nishiki K, Oshino N, Jamieson D, Chance B. Oxygen toxicity in the perfused rat liver and lung under hyperbaric conditions. Biochem J (160): 343-355, 1976. 361. Nishikimi M. Generation of superoxide anion in the reaction of tetrahydropterins with molecular oxygen. Arch Biochem Biophys (166): 273-279, 1975. 362. Nishikimi M. Oxidation of ascorbic acid with superoxide anion generated by xanthine-xanthine oxidase system. Biochem Biophys Res Commun (63): 463, 1975. 363. Noguchi T, Cantor A, Scott M. Mode of action of selenium and vitamin E in prevention of exudative diathesis in chicks. J Nutr 103: 1502-1511, 1973. 364. Nohl H, Hegner D. Do mitochondria produce oxygen radicals in vivo? Eur J Biochem (82): 563-567, 1978. 365. Noseworthy J, Karnovsky ML. Role of peroxide in the stimulation of the hexose monophosphate shunt durint phagocytosis by polymorphonuclear leukocytes. Enzyme (13): 110-131, 1972. 366. Novák R, Bısze Z, Matkovics B, Fachet J. Gene affecting superoxide dismutase activity linked to the histocompatibility complex in H-2 congenic mice. Science 207 (426): 86-87, 1980. 367. Oei H, Bose S, McCord J. Ethanol-induced oxidative stress: role of acetaldehyde in determining xanthine dehydro- genase/oxidase ratio. In: Fourth international conference on superoxide and superoxide dismutase, September 1-6, Rome, 1985. 368. Oldham KT, Guice KS, Ward A, Johnson KJ. The role of oxygen radicals in immune complex injury. Free Radical Biology & Medicine 4: 387-397, 1988. 369. Omar R, Hasinoff B, Mejilla F, Rahimtula A. Mechanism of ochratoxin A stimulated lipid peroxidation. Biochemical Pharmacology 40 (6): 1183-1191, 1990. 370. Omata M. Role of reactive oxygen species (Ros) in model immune complex nephritis. Nippon-Jinzo-Gakkai-Shi 9 (32): 949-958, 1990. 371. Oshino N, Chance B. Properties of glutathione release observed during reduction of organic hydroperoxide, demethzlation of aminopyrine and oxidation of some substances in perfused rat liver and their imlications for the physiological function of catalase. Biochem J (162): 509-525, 1977. 372. Pacifici RE, Davies KJ. Protein, lipid and DNA repair systems in oxidative stress: the free radical theory of aging revisited. Gerontology 1-3 (37): 166-180, 1991. 373. Packer JE, Slater TF, Willson RL. Direct observation of a free radical interaction between vitamin E and vitamin C. Nature (London) (278): 737, 1979. 374. Palek J, Liu S, Snyder L. Metabolic dependence of protein arrangement in human erythrocyte membranes, I, Analysis of spectrin-rich complexes in ATP-depleted red cells. Blood 51 (3): 385-395, 1978. 375. Panagamala R, Cornwell D. The effects of Vitamin E on arachidonic acid metabolism. Ann New York Acad Sci (393): 376-390, 1982. 376. Panchenko L, Brusov O, Gerasimov A, Loktaeva T. Intramitochondrial localization and release of rat liver superoxide dismutase. FEBS Lett (55): 84-87, 1975. 377. Pár A, Jávor T. Alternatives in hepatoprotection: cytoprotection-influences on monoxidase system free radical scavengers. Acta Physiol Hung (64): 409, 1984.
130
378. Pardue H, Bacon B, Nevius M, Skoug J. Kinetic study of the Jaffe reaction for quantifying creatinine in serum: 1. Alkalinity controlled with NaOH. Clin Chem 2 Pt 1 (33): 278-85, 1987. 379. Parks D, Bulkley G, Granger D. Role of oxygen - derived free radicals in digestive tract disease. Surgery 3 (94): 415-422, 1983. 380. Parks D, Bulkley G, Granger D. Role of oxygen free radicals in shock, ishemia, and organ preservation. Surgery 3 (94): 428-432, 1983. 381. Patton S, Rosen G, Rauckman E. Superoxide production by purified hamster hepatic nuclei. Mol Pharmacol (18): 588, 1980. 382. Pazak H, Scholz R. Effects of maternal vitamin E and selenium status during the perinatal period on age-related changes in heart, lung and liver microsomal lipid peroxidation in rat pups. International Journal for Vitamin and Nutrition Research 66 (2): 134-140, 1996. 383. Pederson T, Buege J, Aust S. Microsomal electron transport. The role of reduced nicotinamide adenine dinucleotiode phosphate-cytochrome c reductase in liver microsomal lipid peroxidation. J Biol Chem (248): 7143-7141, 1973. 384. Peet R, Dickson J, Masters H, Johnston J. Exertional rhabdomyolysis in sheep. Australian Veterinary Journal 3 (56): 155-156, 1980. 385. Peeters-Joris C, Vandevoorde A, Baudhuin P. Subcellular localization of superoxide dismutase in rat liver. Biochem J (150): 31-39, 1975. 386. Pelissier M, Boisset M, Albrecht R. The effects of vitamin A nutritional status on microsomal lipid peroxidation and alpha-tocopherol level in rat liver. Experimentia 45: 342-343, 1989. 387. Perona G, Guidi G, Piga A, Cellerino R, Menna R, Zatti M. In vivo and in vitro variations of human erythrocyte glutatione peroxidase activity as result of cells ageing, selenium availability and peroxide activation. British Journal of Haematology (39): 399-408, 1978. 388. Perutz M, Lehmann H. Molecular pathology of human haemoglobin. Nature (London) 219 (157): 902-909, 1968. 389. Pincemail J, Defraigne J, Franssen C, Bonnet P, Deby-Dupont G, Pirenne J, Deby C, Lamy M, Limet M, Meurisse M. Evidence for free radical formation during human kidney transplantation. Free Radic Biol Med 3 (15): 343-348, 1993. 390. Pinto R, Bartley W. The nature of the sexlinked differences in glutathione peroxidase activity and aerobic oxidation of glutathione in male and female rat liver. Biochem J 115: 449-456, 1969. 391. Placer Z, Cushman L, Johnson B. Estimation of product of lipid peroxidation (malonyl dialdehyde) in biochemical systems. Anal Biochem (16): 359-364, 1966. 392. Porter D, Ingraham L. Concerning the formation of singlet O2 during the decomposition of H2O2 by catalase. Biochim Biophys Acta (334): 97-102, 1974. 393. Porter N. Prostaglandin endoperoxides. In: Pryor W, ed. Free Radicals in Biology. Vol. 4. New York: Academic Press, pp. 261-294, 1980. 394. Powis G. Metabolism and reactions of quinoid anticancer agents. Pharm Ther (35): 57, 1987.
131
395. Prochaska HJ, Talalay D. Purification and characterization of two isofunctional forms of NAD(P)H: quinone reductase from mouse liver. J Biol Chem (201): 1372, 1986. 396. Prohaska J, Ganther H. Glutathione peroxidase activity of glutathione-S-transferases purified from rat liver. Biochem Biophys Res Commun 76: 437-445, 1977. 397. Pryor W. The formation of free radicals and the consequences of their reactions in vivo. Photochem Photobiol 28: 787-801, 1978. 398. Pryor W. Free radical reactions and their importance in biochemical systems. Fed Proc (32): 1862-1869, 1973. 399. Pryor W. Free Radicals in Biology. New York: Academic Press, 1982. 400. Pryor W. Vitamin E: biochemical, hematological and clinical aspects. In: Lubin B, Machlin L, eds. Free radical biology: xenobiotics, cancer and aging. Vol. 293. New York: Ann New York Acad Sci, pp. 1-22, 1982. 401. Putnam M, Comben N. Vitamin E. The Veterinary Record 121 (December 5): 541545, 1987. 402. Rabl H, Khoschsorur G, Colombo T, Petritsch P, Rauchenwald M, Koltringer P, Tatzer F, Esterbauer H. A multivitamin infusion prevents lipid peroxidation and improves transplantation performance. Kidney Int 4 (43): 912-917, 1993. 403. Racker E. Glutathione-homocystine transhydrogenase. J Biol Chem (217): 867874, 1955. 404. Rafai P, Tuboly S, Biró H, Jakab L, Papp Z, Molnar L. Effect of selenium vitamin E and riboflavin supplementation of the feed o the humoral and cell-mediated immune responses of growing pigs. Acta Veterinaria Hungarica 3 (37): 201-217, 1989. 405. Rafai P, Tuboly S, Biró H, Jakab L, Papp Z, Molnár L. Effect of supplementing the feed of young pigs with selenium and vitamins A and B2 on the immune response and experimental Treponema hyodysenteriae infection, II, Effect of feed supplementation on some measures of humoral and cellular immunity. Magyar Állatorvosok Lapja 43 (12): 747-754, 1988. 406. Rammel C, Thompson K, Bentley G, Gibbons M. Selenium, vitamin E and polyunsaturated fatty acid concentrations in goat kinds with and without nutritional myodegeneration. New Zeland Veterinary Journal 1 (37): 4-6, 1989. 407. Ramsay W. The determination of the total iron-binding capacity of serum, 1957. Clin Chim Acta 259 (1-2): 25-30, 1997. 408. Ravindranath S, Fridovich I. Isolation and characterisation of mangenase-containing superoxide dismutase from yeast. J Biol Chem 250 (15): 6107-6112, 1975. 409. Recknagel R, Glende E. Chemical mechanisms in carbon tetrachloride toxicity. Crit Rev Toxicol (38): 263-270, 1973. 410. Reddy J, Tappel A. Effect of dietary selenium and autoxidized lipids on the glutathione peroxidase system of gastrointestinal tract and other tissues in the rat. J Nutr (104): 1069-1078, 1974. 411. Regiusné Mıcsényi Á, Anke M. A növények vastartalma és az állatok vasellátottsága. Állattenyésztés és Takarmányozás 41 (4): 369-377, 1992. 412. Reif D, Samokyszyn V, Miller D, Aust S. Alloxan- and glutathione-dependent ferritin iron release and lipid peroxidation. Arch Biochem Biophys (269): 407-414, 1989.
132
413. Reilly M, Delanty N, Lawson J, FitzGerald G. Modulation of oxidant stress in vivo, in chronic cigarette smokers. Circulation New York 1 (94): 12-25, 1996. 414. Rein H, Ristau J, Ruckpaul K. Regulation mechanisms of xenobiotics metabolizing liver cytochrome P-450 and toxicological implications. In: Csomós G, Fehér J, eds. Free Radical and the Liver. Berlin, Heidelberg: Springer Verlag, pp. 29, 1992. 415. Repine J, Eaton J, Anders M, Hoidal J, Fox R. Generation of hydroxyl radical by chemicals, enzymes and human phagocytes: an improved detection system using the antiinflammatory agent - dimethyl sulfoxide. J Clin Invest (64): 1642-1651, 1979. 416. Reynolds E, Treinen S, Moslen H. Free radical damage in liver. In: Pryor W, ed. Free radicals in biology. Vol. 4. New York: Academic Press, pp. 49-94, 1980. 417. Richmond W. Preparation and properties of a cholesterol oxidase from Nocardia sp. and its application to the enzymatic assay of total cholesterol in serum. Clin Chem 12 (19): 1350-6, 1973. 418. Rifkind R. Heinz-body anaemia: an ultrastructural study. II. Red cell sequestration and destruction. Blood 26 (4): 433-448, 1965. 419. Rings D. Therapeutic considerations in ketosis and hepatic lipidosis in cattle. Modern Veterinary Practice 8 (66): 523-526, 1985. 420. Root R, Metcalf J. H2O2 release from human granulocytes durint phagocytosis. J Clin Invest (60): 1266-1279, 1977. 421. Ross D. Glutathione, free radicals and chemotherapeutic agents. Mechanism of free radical-induced toxicity and glutathione-dependent protection. Pharmacol Ther (37): 231, 1988. 422. Ross D, Moldeus P. Antioxidant defense systems and oxidative stress. In: Pelfrey CV, ed. Membrane Lipid Oxidation. Vol. 2. Boca Raton, Florida: CRC Press, pp. 151-159, 1991. 423. Rowley D, Halliwell B. Superoxide-dependent formation of hydroxyl radicals in the presence of thiol compounds. FEBS Lett (138): 33-36, 1982. 424. Rytömaa T, Teir H. Relationship between tissue eosinophils and peroxidase activity. Nature (London) (192): 271-272, 1961. 425. Sacerdoti D, Abraham N, McGiff C, Schwartzman M. Renal cytochrome P-450Dependent Metabolism of Arachidonic Acid in Spontaneously Hypertensive Rats. Biohemical Pharmacology 3: 521-527, 1988. 426. Sagone ALJ, Greenwald J, Kraut F, Bianchine J, Singh D. Glucose: a role as e free radical scavenger in biological systems. J Lab Clin Med 1 (10): 97-104, 1983. 427. Sagripanti JL, Kraemer K. Site-specific oxidative DNA damage at polyguanosines produced by copper plus hydrogen peroxide. J Biol Chem 264 (3): 1729, 1989. 428. Salin M, McCord J. Free Radicals and Inflammation. J Clin Invest (56): 13191323, 1975. 429. Sallmann H, Fuhrmann H, Molnár S, Stegmanns T. Endogenous lipid peroxidation in broiler chickens under dietary loads. Fat Sci Technol 93: 457-462, 1991. 430. Sályi G, Mézes M, Bánhidi G. Changes in the lipid peroxide status of broiler chickens in acute monensin poisoning. Acta Veterinaria Hungarica 38 (4): 262-270, 1990. 431. Samokyszyn V, Miller D, Reif D, Aust S. J Biol Chem 264: 21-26, 1989.
133
432. Samuni A, Aronovitch J, Godinger D, Chevion M, Czapski G. On the cytotoxicity of vitamin C and metal ions. A site-specific Fenton mechanism. Eur J Biochem (137): 119, 1983. 433. Samuni A, Chevion M, Czapski G. Unusual copper-induced sensitization of the biological damage due to superoxide radicals. J Biol Chem (256): 12632-12635, 1981. 434. Sanders K, Ward S. Nitric oxide as a mediator of nonadrenergic, noncholinergic neurotransmission. Am J Physiol 262: 379-392, 1992. 435. Sárvári E, Blázovics A, Varga M, Sulyok B, Járay J, Lakatos M, Perner F. Glutation-S-transzferázok diagnosztikai jelentısége. Orvosi Hetilap 25 (139): 15311537, 1998. 436. Sas B. Contribution to the pathobiochemistry of furaziolidone induced oxidative toxicity in chickens. Acta Veterinaria Hungarica 41 (1-2): 103-121, 1993. 437. Sasinanea A, Cerone S, Streitenberger S, Garcia C, Auza N. Superoxide dismutase activity and reduced glutathione levels in Cu-overload in liver from sheep. Nutrition Research 17 (1): 115-123, 1997. 438. Sass M. Glutathione synthesis in cell-free preparations from erythrocytes of different ages. Clin Chim Acta 22 (2): 207-210, 1968. 439. Satoh M, Imazumi K, Bessho T, Shiga T. Increased erythrocyte aggregation in diabetes mellitus and its relationship to glycosylated haemoglobin and retinopathy. Diabetologia 27: 517-521, 1984. 440. Saunders B, Holmes-Siedle A, Stark B. Peroxidase. Washington: Butterworths, DC, 1964. 441. Sbarra A, Karnovsky M. The metabolic basis of phagocytosis. J Biol Chem (234): 1355-1362, 1959. 442. Scarpa A. . In: Giebisch G, Tostesin D, Ussing H, eds. Membrane Transport in Biology. Vol. 2. Berlin and New York: Springer-Verlag, pp. 263, 1979. 443. Schmidt J. Takarmányozástan. Budapest: Mezıgazda kiadó, 1993. 444. Schonbaum G, Chance B. Catalase. In: Boyer P, ed. The Enzymes. Vol. 13. 2 ed. New York: Academic, pp. 363-408, 1976. 445. Schwarz K. The cellular mechanisms of vitamin E action, direct and indirect effects of alpha-tocopherol on mitochondrial respiration. Ann New York Acad Sci (203): 45-52, 1972. 446. Schwarz K. Role of vitamin E, selenium and related factors in experimental nutritional liver disease. Federation Proc 24: 58-67, 1965. 447. Sedlak J, Lindsay R. Estimation of total protein-bound and nonprotein sulfhydryl groups in tissue with Ellman's reagent. Anal Biochem 25: 191-205, 1968. 448. Seligman M, Mitamura J, Shera N, Demopoulos H. Corticosteroid (methylprednisolone) modulation of photoperoxidation by ultraviolet light liposomes. Photochem Photobiol (29): 549-558, 1979. 449. Serbinova E, Ivanova S, Kitanova S, Packer L, Kagan V. Cytochrome P-450 under conditions of oxidative stress: role of antioxidant recycling in the protection mechanism. In: Advances in biology and medicine, 18th International meeting of oxygen transport to tissue, New York, 1990.
134
450. Setchell B. Poisoning of sheep with anthelmintic doses of carbon tetrachloride, Chemical Pathology. Aust Vet J (38): 580-582, 1962. 451. Sevanian A, Davies KJA, Hochstein DA. Conservation of vitamin C by uric acid in blood. J Free Rad Biol Med (1): 117, 1985. 452. Shamberger RJ. Genetic toxicology of ascorbic acid. Mutat Res (133): 135, 1984. 453. Shields G, Markowitz H, Klassen W, Cartwright G, Wintrobe M. J Clin Invest (40): 2007, 1961. 454. Shilling C, Adams B. A study of the convulsive seizures caused by breathing oxygen at high pressure. US Nav Med Bull (31): 112-121, 1933. 455. Sies H, Summer K. Hydroperoxide metabiolizing system in rat liver. Eur J Biochem (57): 503-512, 1975. 456. Siesjo B, Bendek G, Koide T, Westerberg E, Wieloch T. Influence of acidosis on lipid peroxidation in brain tissues in vitro. J Cereb Blood Flow Metab 5 (2): 253258, 1985. 457. Simensen M, Jensen P, Basse A, Gissel-Nielsen G, Leth T, Danielsen V, Nielsen H. Clinico-pathologic findings in young pigs fed different levels of selenium vitamin E and antioxidant. Acta Veterinaria Scandinavica 23 (2): 295-308, 1982. 458. Simpson I. The role of complement in glomerulonephritis. Aust N Z J Med (11): 101-103, 1981. 459. Singer T, Edmondson D. Topics in Molecular Oxygen Research. In: Hayasishi O, ed. Molecular Oxygen Biology. Amsterdam: North-Holland, pp. 315, 1974. 460. Slater T. Free radical mechanism in tissue injury. London: Pion Books, 1972. 461. Sohal R. Metabolic rate, aging, and lipofuscin accumulation. In: Soha R, ed. Age Pigment. Amsterdam, The Netherlands: Elsevier, North-Holland Biomedical Press, pp. 303-311, 1981. 462. Som S, Basu S, Deb S, Mukherjee D, Chatterjee I. Current Science (Bangalore) (49): 195-196, 1980. 463. Speer C, Pabst M, Hedegoard H, Rest R, Johnston R. Enhanced release of oxygen metabilites by monocyte-derived macrophages exposed to proteolytic enzymes: Activity of neutrophil elastase and cathepsin. G J Immunol (133): 2151-2156, 1984. 464. Spragg R, Hinshaw B, Hyslop P, Schraufstatter I, Cochrane C. Alteration in adenosine triphosphate energy change in cultured endothelial and P388D1 cells after oxidant injury. J Clin Invest 76: 1471, 1985. 465. Stadtman E, Kornberg A. The purification of coenzyme A by ion exchange chromatography. J Biol Chem (203): 47-54, 1953. 466. Stelmaszynska T, Zgliczynski J. Studies on hog intestine mucosa peroxidase. Eur J Biochem (19): 56-63, 1971. 467. Stern P, De Olazabal J, Bell N. Evidence for abnormal regulation of circulating 1 alpha,25-dihydroxyvitamin D in patients with sarcoidosis and normal calcium metabolism. J Clin Invest 4 (66): 852-5, 1980. 468. Stocker R, Yamamoto Y, McDonagh AF, Glazer AN, Ames BN. Bilirubin is an antioxidant of possible physiological importance. Science (235): 1043, 1987. 469. Stocks J, Dormandy T. The autoxidation of human red cell lipids induced by hydrogen peroxide. Br J Haematol 20 (1): 95-111, 1971.
135
470. Stone W, Bjorling D, Southard J, Galbreath J, Lindsay W. Evaluation of intestinal villus heigh in rats after ischemia and reperfusion, iv administration of superoxide dismutase, polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase, and two 21aminosteroids. American Journal of Veterinary Research 11 (53): 2153-2156, 1992. 471. Sugioka K, Nakano M. A possible mechanism of generation of singlet molecular oxygen in NADPH-dependent microsomal lipid peroxidation. Biochim Biophys Acta (423): 203, 1976. 472. Sulyok S, Bar-Pollak Z, Fehér E, Kemenes I, Kántor I, Fehér J. Liver lipid peroxidation induced by cholesterol and its treatment with a dihydroquinoline type free radical scavenger in rabbits. Acta Physiol Hung 3-4 (64): 437-442, 1984. 473. Surai P, Noble R, Speake B. Tissue-specific differences in antioxidant distribution and susceptibility to lipid peroxidation during development of the chick embryo. Biochim Biophys Acta (1304): 1-10, 1996. 474. Szabó M. Növényi eredető tápanyagok biológiai értékét csökkentô antinutritív tényezôk. Állattenyésztés Takarmányozás 31: 275-287, 1982. 475. Szilágyi M, Sankari S, Lindberg P, Wittmann M. Selenium status and serum biochemical parameters in halothane positive and negative pigs. Archiv für Tierzuch 3 (37): 279-286, 1994. 476. Szőcs A. A szelénhiány újszerő megítélése. Magyar Állatorvosok Lapja (39): 611614, 1984. 477. Takasu N, Asawa T, Komiya I, Nagasawa Y, Yamada T. Alloxan-induced DNA Strand Breaks in Pancreatic Islets, Evidence for H2O2 an intermediate. The Journal of Biological Chemistry 266 (4): 2112-2114, 1991. 478. Tanaka J, Fujiwara H, Torisu M. Vitamin E and immune response, I, Enhancement of helper T cell activity by dietary supplementation of vitamin E in mice. Immunology 38 (4): 727-734, 1979. 479. Tanimura H, Kato Hj, Hilkasa Y. The role of vitamin E in the etiology and treatment of pancreatitis. In: Lubin B, Machlin L, eds. Vitamin E: biochemical, hematological and clinical aspects. Vol. 393. New York: Ann New York Acad Sci, pp. 214-216, 1982. 480. Tappel A. Lipid peroxidation and fluorescent molecular damage to nembranes. In: Trump B, Arstila A, eds. In Pathobiology of Cell Membranes. 1 ed. New York: Academic Press, pp. 145-270, 1975. 481. Tappel A. Selenium-glutathione peroxidase and vitamin E. Am J Clin Nutr 27 (9): 960-965, 1974. 482. Teebor GW, Frenkel K, Goldstein MS. Ionizing radiation and tritium transformation both cause formation of 5-hydroxylmethyl-2'-deoxyuridine in cellular DNA. Proc Natl Acad Sci U S A (81): 318, 1984. 483. Theorell H. The iron-containing enzymes B. Catalases and peroxidases, Hydroperoxidases. In: Summer J, Myrbäck K, eds. The Enzymes. Vol. 2. New York: Academic Press, pp. 397-427, 1951. 484. Theorell H, Chance B, Yonetani T, Oshino N. The combustion of alcohol and its inhibition by 4-metyl-pyrazole in perfused rat livers. Arc Biochem Biophys (151): 434-444, 1972.
136
485. Thomas CE, Aust SD. Reductive release of iron from ferritin by cation free radicals of paraquat and other bipyridyls. J Biol Chem (261): 13064, 1986. 486. Thomas CE, Morehouse LA, Aust SD. Ferritin and superoxide-dependent lipid peroxidation. J Biol Chem 260: 3275-3280, 1985. 487. Thomas M, Mehl K, Pryor W. The role of the superoxide anion in the xanthineoxidase-nucleotid autoxidation of linoleic acid. Biochem Biophys Res Commun 83 (3): 927-932, 1978. 488. Thomas S, Witting P, Stocker R. 3-hydroxyanhranilic acid is an efficient, cellderived co-antioxidant for alpha-tocopherol, inhibiting human low density lipoprotein and plasma lipid peroxidation. Journal of Biological Chemistry 271 (51): 32714-32721, 1996. 489. Thor H, Smith MT, Harzell P, Bellomo G, Jewell SA, Orrenius S. The metabolism of menadione (2-methyl-1,4-naphthoquinone) by isolated hepatocytes. J Biol Chem (257): 12419, 1982. 490. Tolbert N. Metabolic pathways in peroxisomes and glyoxysomes. Annu Rev Biochem (50): 133, 1981. 491. Tom W, Fong L, Woo D, Prasongwatana V, Boyde T. Microsomal lipid peroxidation and oxidative metabolism in rat liver: influence of vitamin A intake. Chem Biol Interact (50): 361-366, 1984. 492. Trinder P. Determination of blood glucose using 4-amino phenazone as oxygen acceptor. J Clin Pathol 2 (22): 24-26, 1969. 493. Trush M, Mimnaugh E, Gram T. Activation of pharmacologic agents to radical intermediates. Implications for the role of free radicals in drug action and toxicity. Biochem Pharmacol 21 (31): 3335-3346, 1982. 494. Tsai L, Lee K, Tsai S, Lee S, Yu H. Changes of lipid peroxide levels in blood and liver tissue of patients with obstructive jaundice. Clin Chim Acta 1 (215): 41-50, 1993. 495. Tsen S, Collier G. The protective action of toxopherol against hemolysis of rat erythrocytes by dialuric acid. Can J Biochem Physiol (38): 957-964, 1960. 496. Turrens J, Boveris A. Generation of superoxide anion by the NADH dehydrogenase of bovine heart mitochondria. Biochem J (191): 421, 1980. 497. Turrens J, Freeman B, Crapo J. Hyperoxia increases H2O2 release by lung mitochondria and microsomes. Arch Biochem Biophys (217): 411, 1982. 498. Tyler D. Polarographic assay and intracellular distribution of superoxide dismutase in rat liver. Biochem J (147): 493-504, 1975. 499. Ursini F, Mairoino M, Valente M, Ferri L, Gregolin C. Purification from pig liver of a protein which protects liposomes and biomembranes from peroxidative degradation and exhibits glutathione peroxidase activity on phosphatidylcholine hydroperoxides. Biochim Biophys Acta (710): 197, 1982. 500. Van Epps D, Garcia M. Enhancement of neutrophil function as a result of prior exposure to chemotactic factors. J Clin Invest (66): 167, 1980. 501. Vásárhelyi B, Blázovics A, Fehér J. Az A-vitamin analóg és származék-család jelentısége a sejtmőködés szabályozásában. Orvosi Hetilap 134 (16): 845-848, 1993.
137
502. Vatassery G. In vitro oxidation of vitamins C and E, cholesterol, and thiols in rat brain synaptosomes. Lipids 30 (11): 1007-1013, 1995. 503. Vettore L, Griffin Tedesco C. Letter: Membrane lipid peroxidation in hypochromic red blood cells. Haematologica 60 (2): 250, 1975. 504. Vidigal-Martinelli C, Zinner K, Kachar B, Duran N, Cilento G. Emission of singlet oxygen during the peroxide-catalysed oxidation of malondialdehyde. FEBS Lett (108): 266, 1979. 505. Vormann J, Gunther T, Hollriegl V, Schumann K. Effect of various degrees and duration of magnesium deficiency on lipid peroxidation and mineral metabolism in rats. Journal of Nutritional Biochemistry 6 (12): 681-688, 1995. 506. Vörös K, Albert M, Vetési F, Harmat G, Binder K, Szaniszló F. Hepatic ultrasonographic findings in experimental carbon tetrachloride intoxication of the dog. Acta Veterinaria Hungarica 45 (2): 137-150, 1997. 507. Walford R. Immunology and aging. Am J Clin Path 9 (74): 247-253, 1980. 508. Wallimann M, Hanimann R, Rotz von A, Jucker H, Rotz von A. Selenium and vitamin E supply of swine in relation to mulbeery heart disease. Schwizer Archiv fur Tierhelkunde 11 (126): 553-631, 1984. 509. Warburg O, Negelein E. Über das Absorptionsspektrum des Atmungsferments. Biochem Z (214): 64-100, 1929. 510. Ward P, Cunningham T, Till G, Johnson K. Role of platelets in oxygen radical mediated responses. Fed Proc (46): 1448, 1987. 511. Warren J, Kunkel R, Johnson K, Ward P. Selective enhancement of rat phagocytes by IgA immmune complexes: Enhancement of O2- response by C5a and products of activated macrophages. Fed Proc (46): 2438, 1987. 512. Warren J, Kunkel S, Johnson K, Ward P. In vitro activation of rat neutrophils and alvcolar macrophages with IgA and IgG immune complexes. Amer J Path (129): 578-588, 1987. 513. Watanabe T, Nakamura T. The effects of linolate hydroperoxide on respiration and oxidative phosphorilation of rat liver mitochondria. J Biochem (Tokyo) 86 (4): 1041-1047, 1979. 514. Way J. Cyanide intoxication and its mechanism of antagonism. Annu Rev Pharmacol Toxicol 24: 451, 1984. 515. Wayner D, Burton G, Ingold K, Barclay L, Locke S. The relative contributions of vitamin E, urate, ascorbate and proteins to the total preoxyl radical-trapping antioxidant activity of human blood plasma. Biochim Biophys Acta (924): 408-419, 1987. 516. Wefers H, Sies H. The protection by ascorbate and glutathione against microsomal lipid peroxidation dependent on vitamin E. Eur J Biochem (174): 353, 1988. 517. Weiser H, Salkeld R. Acta vitaminologica et Enzymologica (31): 143, 1977. 518. Weisiger R, Fridovich I. Mitochondrial superoxide dismutase, Site of synthesis and intramitochondrial localization. J Biol Chem (248): 4793-4796, 1973. 519. Weisiger R, Fridovich I. Superoxide dismutase, Organalle specificity. J Biol Chem (248): 3582-3592, 1973. 520. Weitberg AB. Antioxidatns inhibit the effect of vitamin C on oxygen radicalinduced sister-chromatid exchanges. Mutat Res (191): 53, 1987.
138
521. Wermuth B, Platts L, Seidel A, Oesch F. Carbonyl reductase provides the enzymatic basis of quinone detoxification in man. Biochem Pharmacol (35): 1277, 1986. 522. Williams M, Van Kampen K, Norris F. Timber milkevtch poisoning in chickens, rabbits and cattle. Am J Vet 30: 2185, 1969. 523. Wispe J, Bell E, Roberts R. Measurement of expired ethane and penthane : influence of parenteral lipid infusion. Pediatric Research (19): 374-379, 1985. 524. Wolf V. Lipoxigenase and falvour of soybean protein products. J Agric Food Chem 23: 136-143, 1975. 525. Wolff S, Dean R. Glucose autoxidation and protein modification: the potential role of autoxidative glycosylation in diabetes. Biochem J (245): 243-250, 1987. 526. Wright CE, Tallan HH, Lin YY. Taurine: biological update. Annu Rev Biochem (55): 427, 1984. 527. Wu K, Trozzola A. Evidence for the production of singlet molecular oxygen from the quenching of excited-states of dialkyl ketones by molecular oxygen. J Photochem (10): 407, 1979. 528. Xu G, Diplock A. Glutathione peroxidase (EC 1.11.1.9.), glutathione-S-transferase (EC 2.5.1.13) superoxide -dismutase (EC 1.15.1.1) and catalase (EC 1.11.1.6) activities in tissues of ducklings deprived of vitamin E and selenium. British Journal of Nutrition 50: 437-444, 1983. 529. Yamazaki I. Peroxidase. In: Hauaishi O, ed. Molecolar Mechanism of Oxygen Activation. New York: Academic Press, pp. 535-558, 1974. 530. Yamini B, Stein S. Abortion, stillbirth, neonatal death, and nutritional myodegeneration in a rabbit breeding colony. Journal of the American Veterinary Medical Association 4 (194): 561-562, 1989. 531. Yonetani T. Studies on cytochrome c peroxidase, II, Stoichiometry between enzyme, H2O2 and ferrocytochrome c and enzymatic determination of extinction coefficients of cytochrome c. J Biol Chem (240): 4509-4514, 1965. 532. Yoshida M. Increases of urinary ketone body excretion in selenium-deficient rats is a ketone-specific change. J Nutr Sci Vitaminol Tokyo 37 (4): 425, 1991. 533. Yoshikawa T, Yasuda M, Ueda S, Naito Y, Tanigawa T, Oyamada H, Kondo M. Vitamin E in gastric mucosal injury induced by ischemia-reperfusion. American Journal of Clinical Nutrition (53): 210-214, 1991. 534. Young I, Purvis J, Lightbody J, Adgey A, Trimble E. Lipid peroxidation and antioxidant status following thrombolytic therapy for acute myocardial infarction. English Heart J 8 (14): 1027-1033, 1993. 535. Zeigler DM. Role of reversible oxidation-reduction of enzyme thiols-disulfides in metabolic regulation. Annu Rev Biochem (54): 305, 1985.
139
További mellékletek
1. Az LP összefoglaló folyamata Demopoulos és mtsai. (1980) nyomán (132): I. Iniciáció X. + szabadgyök (általában molekuláris O2-bıl képzıdı gyök, vagy hidroxilgyök)
-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2zsírsavlánc (lehet 1 telítetlen kettıskötéső zsírsavlánc, vagy a koleszterin is)
hidrogénelvonás *1 XH
+
alkilgyök -CH2-CH=CH-CH.-CH=CH-CH2-
cisz-transz izomérek kialakulása *2 alkilgyök izomer -CH2-CH=CH-CH=CH-CH.-CH2cisz
alkilgyök izomer -CH2-CH.-CH=CH-CH=CH-CH2transz
oxigén hozzáadódása *3 +O2
+ O2
-CH2-CH=CH-CH=CH-CH-CH2I O-O.
-CH2-CH-CH=CH-CH=CH-CH2I O-O.
további hidrogénelvonás *4 +R. -CH2-CH=CH-CH=CH-CH-CH2I O-OH
+R. -CH2-CH-CH=CH-CH=CH-CH2I O-OH
140
II. Propagáció -CH2-CH=CH-CH=CH-CH-CH2I O-OH spontán, vagy fémkatalízis során kialakuló átalakulás *5 -CH2-CH=CH-CH=CH-CH-CH2alkokxigyök I O.
.OH
+
szomszédos lipidmolekulákról történı hidrogénelvonás *6 -CH2-CH=CH-CH=CH-CH-CH2- + RH I O. -CH2-CH=CH-CH=CH-CH-CH2- + R. I OH III. Termináció alkoxigyök -CH2-CH=CH-CH-CH=CHI O. bisz-hidroperoxidok képzıdése *7
.OH +
RH
H2O + R.
+
.OH
-CH2-CH=CH-CH-CH=CH-CH2-CH=CH-CH-CH=CHI I OOH OOH további bomlás *8 aldehid -CH2-CH=C-CH=O
és
alkilgyök .CH=CH-
alkilgyökök további reakciója *9 .CH=CHalkilgyök
+
-CH2-CH=CH-CH-CH=CHalkoxigyök I .O -CH2-CH=CH-CH-CH=CHI O-CH=CH-
141
*1 A kettıs kötéssel a szomszédos szénatomon (α-metilén szénatom) gyökközpont jön létre, miután az iniciátor szabadgyök (X.) elvon egy allil-helyzető hidrogént. Ezzel szabadgyök állapota megszőnik (XH alakul ki), a lipidbıl pedig alkilgyök (R.) keletkezik. *2 Elektroneltolódások és konfigurációs vátozások jönek létre majdnem azonnal: elıbb a szabad elektron más szénatomokra történı eltolódása következik be, ezáltal a kettıs kötések egymáshoz közelebb kerülnek, így konjugált kettıs kötések jönnek létre (dién konjugáció). Ezzel néhány kettıs kötés a normál telítetlen zsírsavakra jellemzı ciszkonfiguráció helyett transz-konfigurációba kerül. *3 Az oxigén hozzáadódik az alkilgyökhöz, így peroxigyök (ROO.) keletkezik. *4 A peroxigyökök hidrogént vonnak el a közeli molekulákról (más telítetlen zsírsavakról, proteinekrıl, antioxidánsokról, nukleinsavakról), így metastabil (átmenetileg stabil) lipid-hidroperoxidok (ROOH) keletkeznek. *5 A lipid-hidroperoxidok (ROOH) spontán fel tudnak bomlani hidroxil- (.OH) és alkoxigyökökre (RO.). A fémkatalízis hatására további alkoxi- és peroxi-gyökök keletkeznek hidroxil- vagy hidrogénionokkal. *6 A szomszédos molekulákról (RH) történı hidrogénelvonással az alkoxi- és hidroxilgyökök megsemmisülnek, de azokról a molekulákból, amelyek hidrogénje elvonásra került, további gyökök képzıdnek. *7 Egy alkoxigyök tovább oxidálódhat és elbomolhat más α-metilén szénatomon létrejövı folyamatos szabadgyök támadások révén és így bisz-hidroperoxidok (vagyis egy zsírsavon két OOH-csoport) képzıdhet. *8 A módosult zsírsav ezután elbomlik, és aldehidek, illetve alkilgyök-fragmentumok keletkeznek belıle. *9 Az alkilgyökök képesek a körülöttük levı gyökökkel, pl. alkoxigyökökel reakcióba lépni, és így a folyamat a molekulák közötti oxigénnel kapcsolt hidak képzıdésével befejezıdik, vagy egy másik alkilgyökkel C-C kötések jönnek létre. Végül a termináció során az elızıkben említett stabil és metastabil végtermékek keletkeznek.
142
2. Az LP-s paraméterek meghatározására alkalmazott laboratóriumi módszerek részletes leírása
Malondialdehid (MDA) Reagensek: I. 20%-os triklórecetsav, II. 10%-os perklórsav elegyét tiobarbitursavval telítettem, szobahımérsékleten addig, amíg túltelített oldat nem képzıdött TBA reagens: I.:II.=1:3 Minta elıkészítés: 1 ml desztillált vizet (vak) vagy vvs-hemolizátumot (minta) 9 ml TBA reagenssel elegyítettem, majd a kémcsöveket 20 percen keresztül forró (100 oC-os) vízbe állítottam. Ezután a kémcsöveket lehőtöttem, majd 2500/perc fordulatszámon 15 percig centrifugáltam. A fotometriás méréshez a felülúszót használtam. Mérés: A méréseket desztillált vízzel (vakkal) szemben végeztem 532 nm hullámhosszon és megállapítottam az elegy optikai sőrőségét (denzitását) (OD). Számítás: Vössz x OD532 x hígítás / 0,1537 x Vminta = 10 x OD532 x 10 / 0,1537 (Vössz = az oldatok végsı mennyisége /ml/, Vminta = minta mennyisége /ml/, 0,1537 = moláris extinkciós koefficiensbıl eredı szám, 10 = a hemolízisbıl eredı hígítás) OD(hemolizátum)532 x 650,8 = nmol/l MDA (324). Redukált glutation (GSH) Reagensek: I. 0,4 mólos (pH: 8,9) Tris-HCl-puffer II. DTNB-oldat (Ellmann-reagens): 0,0198 g DTNB + 5ml metanol III. 5%-os triklórecetsav desztillált vizes oldata Minta elıkészítés: 0,5 ml mintához 2 ml 5%-os triklórecetsav oldatot adtam, ezzel a minta fehérje komponenseinek a kicsapódását idéztem elı. A csapadékot 3000/perc fordulatszámon 2 percig centrifugálva leülepítettem. A méréshez a felülúszót használtam. A felülúszó 1 mlét 2 ml Tris-HCl-pufferrel elegyítettem, majd 0,1 ml DTNB-oldatot adtam az elegyhez. Mérés: Az így keletkezett oldatot 5 pecig szobahımérsékleten állni hagytam, majd desztillált vízzel szemben (vak) 412 nm hullámhosszon spektrofotométerrel lemértem az optikai sőrőséget. Számítás: OD412 x Vössz x hígítás / 13,1 x Vminta = = OD(hemolizátum)412 x 3,1 x10 / 13,1 x 1=umol/l
143
(Vössz = az oldatok végsı mennyisége /ml/ , Vminta = minta mennyisége /ml/, 13,1 = a GSH DTNB-oldatban, 412 nm-en mért moláris extinkciós koefficiensbıl eredı szám, 10 = a hemolízisbıl eredı hígítás) (324). Glutation-peroxidáz (GSH-Px) Reagensek: I. 0,05 mólos (pH: 7,5) Tris-HCl-puffer 1., II. 6 mg redukált glutation 10 ml I.-ben (Tris-HCl-puffer 1-ben) oldva, III. 5 µl kumén-hidroperoxid-oldat 10 ml I.-ben (Tris-HCl-puffer 1-ben) oldva, IV. 15 %-os triklórecetsav desztillált vizes oldata, V. 0,4 mólos (pH: 8,9) Tris-HCl-puffer 2., VI. DTNB-oldat: 0,0198 DTNB 5 ml metanolban oldva. Minta elıkészítés: Kontroll: 0,7 ml I-hez (Tris-HCl-puffer 1.) 0,1 ml hemolizátumot és 0,1 ml II-t (redukáltglutation-oldat) adtam, majd 37 oC-on 10 percig inkubáltam, ezután 1 ml IV-el (triklórecetsav-oldat) a reakciót leállítottam. Késıbb 0,1 ml III-at (kumén-hidroperoxidoldat) adtam a rendszerhez. Az elegyet 3000/perc fordulatszámon 10 percig centrifugáltam, majd a felülúszót használtam a méréshez kontrollként. Minta: 0,7 ml I-hez (Tris-HCl-puffer 1.) 0,1 ml hemolizátumot, 0,1 ml II-t (redukáltglutation-oldat) és 0,1 ml III-at (kumén-hidroperoxid-oldat) adtam, majd 37 oC-on 10 percig inkubáltam. Egy ml IV-el (triklórecetsav-oldat) a reakciót leállítottam. Az elegyet 3000/perc fordulatszámon 10 percig centrifugáltam, majd a felülúszót használtam a méréshez kontrollként. Mind a kontroll, mind a minta esetén ugyanazt a módszert alkalmaztam, mint a GSH meghatározásnál leírtak esetében. Két ml V-et (Tris-HCl-puffer 2.) elegyítettem 1 ml felülúszóval (kontroll, minta), majd 0,1 ml VI-et (DTNB-oldatot) adtam a rendszerhez. Mérés: Öt perces szobahımérsékleten történı állás után az elegyeket desztillált vízzel (vak) szemben 412 nm hullámhosszon spektrofotométerrel mértem. Számítás: A GSH-Px esetében 1 egység (U) enzimaktivitásnak azt tekintjük, ami 1 perc alatt 1 µmol GSH-t alakít át 37 oC-on. A kontroll és minta optikai sőrőség értékeinek különbségét vettem: dOD dOD412 x Vössz x hígítás / 13,1 x Vminta x T dOD x 6,2 x 10 / 13,1 x 0,1 x 10 (Vössz = az oldatok /kontroll + minta/ végsı mennyisége /ml/ , Vminta = minta mennyisége /ml/, 13,1 = a GSH DTNB-oldatban, 412 nm-en mért moláris extinkciós koefficiensbıl eredı szám, T = inkubációs idı percben megadva, 10 = hígítás miatt alkalmazott szorzó) (324). A minták GSH-Px aktivitását azok fehérjetertalmára vonatkoztatva adtam meg.
144
Szuperoxid-dizmutáz (SOD) Reagensek: I. 0,05 mólos HCO3--puffer (pH:10,2): 3,597 g Na2CO3, 1,428 g NaHCO3, 0,037 g NaEDTA 1000 ml kétszer desztillált vízben hígítva II. adrenalin-oldat: 0,0165 g adrenalin 10 ml 0,01 mólos HCl-ben oldva III. extrakciós oldat: kloroform, etanol 2:1 arányú elegye Minta elıkészítés: 1 ml minta (hemolizátum) elegyítése 0,75 ml III-ban (kloroformban-etanol elegy), 10 perces szobahımérsékleten történı állás után 10 percig 5000/perc fordulatszámon centrifugáltam. A felülúszót használtam a mérésekhez. Kontroll készítése: 2,9 ml I.-hez (pH: 10,2 HCO3--puffer) 0,1 ml adrenalint adtam. Minta készítése: 2,9 ml I.-hez (pH: 10,2 HCO3--puffer) 0,1 ml adrenalint és 10 µmol minta-felülúszót adtam. Mérés: 480 nm hullámhosszon grafikus kijelzıvel ellátott spektrofotométerrel 5-10 percen keresztül szobahımérsékleten mértem. Közvetlenül a mérés elıtt pipettáztam az 1 cm-es küvettába a reagenseket és a mintákat. Számítás: A grafikon lineáris részének megfelelıen az 1 percen belüli optikai sőrőség változást (dOD) lemértem illetve kiszámítottam. gátlási % = (dODkontroll-dODminta) / dODkontroll x 100 SOD egység (U) = kapott gátlási % x Vössz x hígítás / 50 x Vminta kapott gátlási % x 1,75 x 10 / 50 x 0,01 (Vössz = az oldatok végsı mennyisége /ml/, Vminta = minta mennyisége /ml/, 10=a hemolizálásból eredı hígítás) (321). A minták SOD-aktivitását azok fehérjetartalmára vonatkoztatva adtam meg. Kataláz (CAT) Reagensek: I. 0,05 mólos (pH: 7,0) foszfát puffer: 5,46 g Na2HPO4 x 2H2O, 1,33 g KH2PO4, 500 ml desztillált vízben oldva II. 30 mM-os H2O2 oldat Minta elıkészítés: A hemolizátumot még egyszer 10x-es hígítással hígítottam, mert a vörösvérsejtekre nézve 100x-os hígítás szükséges a mérésekhez. A mérés elıtt közvetlenül 1 cm-es kvarcküvettába 2 ml I.-oldatot, majd 1 ml II.-oldatot mértem be, ezután az elegyhez 5 µl mintát adtam.
145
Mérés: 5-10 percen keresztül 240 nm hullámhosszon az I-oldattal szemben (vak) végeztem méréseket, feljegyeztem a kiindulási optikai sőrőséget, majd percenként leolvastam annak a csökkenését. Számítás: Az optikai sőrőség 1 perc alatti csökkenésével számoltam: dOD = (kiindulási optikai sőrőség - 5 vagy 10 perces érték / 5 vagy 10) dOD x Vössz x hígítás / 43,6 x Vminta = Egység (U) /ml CAT dOD x 3 x 10 / 43,6 x 0,005 = U/ml (43,6 = a H2O2 240 nm-en 1 cm-es küvettában mért moláris extinkciós koefficiensébıl eredı szám, Vössz = az oldatok végsı mennyisége /ml/, Vminta = minta mennyisége /ml/, 10=a hemolizálásból eredı hígítás) 1 Bergmeyer-egység (BU) annak az enzimaktivitásnak felel meg, amely esetében a CAT 1 perc alatt 1000 mg H2O2-t bont szobahımérsékleten. U/ml x 38 / 1000000 = BU / ml (321). A minták CAT aktivitását, azok fehérjetartalmára vonatkoztatva adtam meg. E-vitamin Reagensek és minta elıkészítés: A 0,2 ml-nyi vérplazmát vagy egyéb minták homogenizátumát 1 ml abszolút etanollal elegyítettem, majd Vortex-mixer segítségével összeráztam, ezután 5 percig 2500/perc fordulatszámomn centrifugáltam. Ezzel fehérjementesítettem és leválasztottam a tokoferolokat a lipoproteidekrıl. A lipidszármazékokat 3 ml petroléterrel kioldottam. A petroléteres fázis 2 ml-ét 452 nm-en petroléterrel szemben fotometráltam annak érdekében, hogy a karotinoidok okozta színintenzitásbeli változásokat kiszőrjem. A petroléteres fázist ezután 60 oC-on vákuumszárítóban bepároltam. Lehőlés után a maradékot 0,2 ml kloroformban oldottam, majd 1 ml abszolút etanolt adtam hozzá. Ezután 0,2 ml (0,1 %-os etanolban oldott) FeCl3-oldatot és 0,2 ml (0,2 %-os etanolban oldott) 2,2-dipiridil-oldatot adtam a rendszerhez. Ezután az elegyet összeráztam. Mérés és számítás: Az összerázás után 30 másodperccel 520 nm-en mértem az optikai sőrőség értékeit a reagensvakkal szemben. Az értéket korrigáltam a 452 nm-en mért érték 0,5-szörösével. Kontrollként 0,5 ml/l DL-α-tokoferolt (Merck) használtam. Összkarotin Reagensek és minta elıkészítés: A 0,2 ml vérplazma vagy az egyéb minták 1 ml abszolút etanollal történı fehérjementesítése után 3 ml-es petroléteres, Vortex-mixerrel történı kirázással a lipidoldékony anyagokat ki lehet vonni az elegybıl. A kirázás után az elegyet 5 percig, 3000/perc fordulatszámon centrifugáltam. Ezután a felülúszó 2 ml-ét 452 nm hullámhosszon fotometráltam.
146
Mérés: A vérplazma, vagy az egyéb minták petroléteres frakciójának ezen a hullámhosszon mutatkozó fényelnyelésének mértéke szoros összefüggést mutat az összkarotinoid tartalommal (79). Számítás: mg/kg (mg/l) összkarotin = OD452/ minta tömege x küvetta rétegvastagsága 3. A vizsgálatokban alkalmazott egyéb biokémiai paraméterek meghatározásához használt laboratóriumi módszerek A kiegészítı rutin klinikai biokémiai laboratóriumi vizsgálatokat a Diagnosticum Kft. által forgalmazott reagens-kittekkel végeztem: Összfehérje (TP): Kolorimetriás eljárás, az ún. Biuret-módszer. Elve: a fehérjék rézsókkal lúgos közegben színes komplexet képeznek KI, KNaSCN, CuSO4, NaOH felhasználásával. Az elegyben kialakult szín 546 nm-es hullámhosszon mérhetı fotometriásan. Az abszorbancia arányos a fehérjekoncentrációval (186). Egyes kísérleteknél alkalmaztam a biuret-módszernél érzékenyebb Lowry-féle fehérje kimutatást Folin-fenol reagens felhasználásával. Ennek a módszernek az az elve, hogy a Folin-reagensben lévı nehézfémsó kapcsolódik a fehérjék egyes fenol-csoportot tartalmazó aminosavinak (pl. tirozin) oldalláncaihoz. Ez a kapcsolódás a reagens színének megváltozását eredményezi . A mérések spektrofotométerrel 750 nm-es hullámhosszon végezhetık (305). Albumin (Alb): Kolorimetriás meghatározás. Elve: a brómkrezol-zöld enyhén savas közegben kötıdik az albuminhoz. A kialakult kékes-zöld komplex hatására az elegy 578 nm-es hullámhosszon mért abszorbanciája arányos a minta albuminkoncentrációjával (139). Kreatin-kináz (CK): Enzimatikus kolorimetriás eljárás. Elve: a kreatinfoszfát ADP hozzáadásával kreatin-kináz hatására kreatinná és ATP-vá alakul, az ATP D-glükóz hozzáadásával a hexokináz hatására D-glükóz-6-foszfátot és ADP-t képez, a D-glükóz-6foszfát NADP+ hozzáadásával a glükóz-6-foszfát dehidrogenáz hatására 6-foszfoglukonáttá és NADPH + H+-vá alakul. A reagensek az említetteken kívül imidazolt, magnézium-acetátot, N-acetilciszteint, AMP-t, EDTA-t és diadenozin-pentafoszfátot is tartalmaznak. A mérés 340 nm-es hullámhosszon fotometriásan történik, a reagens percenkénti abszorbanciaváltozása arányos a minta CK-aktivitásával (80). α-amiláz (Amyl): Enzimatikus kolorimetriás eljárás. Elve: p-nitrofenol-maltohepatozid α-amiláz hatására p-nitrofenollá és glükózzá alakul. A reagens etilidénnel blokkolt maltohepatozidot tartalmaz, amelyhez a p-nitrofenol kapcsolódik. A mintában lévı αamiláz a hét tagból álló poliszaharidmolekulát kisebb egységekre bontja, amelyeket a reagensben lévı α-glükozidáz glükózzá alakít. A reakció során felszabadult p-nitrofenol
147
arányos a minta α-amilázaktivitásával. A mérés 405 nm-es hullámhosszon történik, az abszorbancia percenkénti változása arányos az enzimaktivitással (332). Alanin-transzamináz (ALT): Enzimatikus kolorimetriás eljárás. Elve: az L-alanin α-ketoglutársavval ALT hatására piroszılısavvá és L-glutamáttá alakul, a piroszılısavból pedig NADH + H+ és laktát-dehidrogenáz (LDH) hozzáadásával L-laktát és NAD+ képzıdik. Az elegyben az NADH + H+ - NAD+ átalakuálás 340 nm-es hullámhosszon abszorbanciacsökkenést eredményez, aminek percenkénti változása arányos a minta ALT-aktivitásával (51). Aszparaginsav-transzamináz (AST).: Enzimatikus kolorimetriás eljárás. Elve: Laszparaginsav α-keto-glutársavval AST hatására oxálecetsavvá és L-glutaminsavvá alakul, az oxálecetsavból NADH + H+ és malát-dehidrogenáz hatására malát és NAD+ képzıdik. Az elegyben a NADH + H+ - NAD+ átalakuálás 340 nm-es hullámhosszon abszorbanciacsökkenést eredményez, aminek percenkénti változása arányos a minta AST-aktivitásával (51). Lipáz (Lipa): Kinetikus, a turbiditás megváltozásán alapuló meghatározás. Elve: a lipáz CaCl2 és a kolipáz jelenlétében trioleinbıl az olaj-víz határfelületén di-, monoglicerideket és oldható zsírsavakat hasít le. A reakcióelegy turbiditáscsökkenése arányos a minta lipáz-aktivitásával. A mérés 340 nm-es hullámhosszon történik, a minta percenkénti abszorbanciaváltozása arányos az enzimaktivitással (304). Bilirubin, össz és direkt (összBr, dirBr): Kolorimetriás eljárás, a klasszikus GrófJendrassik módszer módosítása. Elve: a szulfanilsavból nátrium-nitrittel diazotált szulfanilsav képzıdik, ami dimetilszulfoxid jelenlétében az összes bilirubinnal reagál és azobilirubint jön létre. Dimetilszulfoxid hiányában csak a direkt bilirubinnal alakul ki azobilirubin. Az elegy azobilirubin okozta 530 nm-es hullámhosszon mérhetı, abszorbanciaváltozása arányos a minta bilirubintartalmával (232) (28). Glükóz (G): Kolorimetriás, az ún. glükóz-oxidáz-peroxidáz (GOD-POD) meghatározás. Elve: a glükóz O2 és H2O jelenlétében glükóz-oxidáz hatására glukonsavvá és H2O2-vé alakul, a H2O2 fenollal és 4-amino-antipirinnel peroxidáz hatására vörös színő kinonszármazékká és H2O-vá alakul. A mérés 505 nm-es hullámhosszon történik. Az elegy színének abszorbanciája arányos a minta glükózkoncentrációjával (492). Karbamid (Karb): Enzimatikus kolorimetriás eljárás. Elve: a karbamid H2O és O2 jelenlétében ureáz hatására NH3-vá és CO2-dá bomlik, az NH3-ból képzıdı NH4+ 2-αketo-glutársavval 2NADH + H+-jelenlétében gluatminsav dehidrogenáz hatására Lglutaminsavvá bomlik, miközben NAD és víz képzıdik. Az elegyben a NADH + H+ NAD+ átalakulás 340 nm-es hullámhosszon abszorbanciacsökkenést eredményez, aminek percenkénti változása arányos a minta karbamidkoncentrációjával (140).
148
Vas (Fe): Kolorimetriás meghatározás. Elve: a vas II-, III-kromazurol-B-vel és cetiltrimetil-ammóniumbromiddal színes komplexet képez. A mérés 623 nm-es hullámhosszon történik, a színes komplex hatására a reagens abszorbanciája arányos a minta vastartalmával (88) . Vaskötı kapacitás (Fe-kötı kap.): Kolorimetriás meghatározás. Elve: a mintához adott ismert mennyiségő vassal a transzferrint telítjük, a vas feleslegének magnéziumkarbonáttal való adszorbeálása, majd centrifugálása következik. A szupernatáns vastartalmát az elıbb említett módon meghatároztam (407) (175, 289). Kreatinin (Crea): Kolorimetriás meghatározás, a klasszikus Jaffe-féle módszer. Elve: a kreatinin és a pikrinsav keveréke színes ionkötéses pikrinsavkomplexet képez. A reagensben a komplexképzıdés 492 nm-es hullámhosszon mérhetı abszorbancia egységnyi idın belüli változása a minta kreatinintartalmával arányos (378). Alkalikus-foszfatáz (ALKP): Enzimatikus kolorimetriás eljárás. Elve: a p-nitrofenilfoszfát alkalikus foszfatáz hatására lugos közegben hidrolizálódik és p-nitrofenollá, valamint foszfáttá bomlik. A reagens MgCl-ot is tartalmaz, ami az enzimatikus reakciókat katalizálja. A p-nitrofenol keletkezése az elegyben 405 nm-es hullámhosszon abszorbancianövekedést eredményez. Ennek percenkénti változása arányos a minta ALKP-aktivitásával (259). Anorganikus-foszfát (Pi): Pszeudokinetikus meghatározás. Elve: az ammónium molibdát kénsav jelenlétében foszfát hatására szervetlen foszfor-molibdénsav-komplexet képez. A képzıdött komplex révén az elegy 340 nm-es hullámhosszon bekövetkezı abszorbancianövekedése arányos a minta anorganikus-foszfát-koncentrációjával (122). Hemoglobin (Hb): Kolorimetriás meghatározás. Elve: A Hb Fe2+-csoportja káliumferricianid hatására methemoglobinná alakul, amibıl a káliumcianid ciánmethemoglobint képez. A ciánmethemoglobin 540 nm-en fotometriásan mérhetı, a Hb-koncentráció arányos az elegy abszorbanciájával. A vörösvérsejtekbıl és a teljesvérbıl egyaránt az említett módszert alkalmaztam (138). Kalcium (Ca): Kolorimetriás meghatározás. Elve: a kalcium lúgos közegben az ortokrezolftaleinnel bíborvörös komplexet ad. Az elegyben kialakult szín 570 nm-es hullámhosszon mért intenzitása arányos a minta kalciumtartalmával (467) (300). Koleszterin (Koleszt): Enzimatikus kolrimetriás eljárás. Elve: a koleszterinésztert a H2O jelenlétében a koleszterinészter-hidroláz hidrolizálja, így szabadkoleszterin keletkezik, amit O2 jelenlétében a koleszterin-oxidáz delta-4-kolesztenonná alakít, miközben H2O2 keletkezik. A képzıdött H2O2-t a peroxidáz, H2O-vé és oxigénné alakítja. Az oxigén a fenolból és a 4-amino-antipirinbıl vörösszínő kinonszármazékot képez. Az elegy vörösszínő kinonszármazék okozta 505 nm-es hullámhosszon mért abszorbanciaváltozása arányos a minta koleszterinkoncentrációjával (417).
149
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁSOK
Köszönetemet kívánom kifejezni elıször is témavezetımnek, Dr. Mézes Miklós professzornak, a Gödöllıi Agrártudományi Egyetem, Takarmányozástani Tanszék vezetıjének, aki elvállalta a témavezetést, hasznos tanácsokat adott, és egyes laboratóriumi vizsgálatok elvégzésében folyamatosan segítségemre volt, valamint a kutatómunkám eredményeinek összefoglalásában is nagy segítséget nyújtott. Köszönettel és hálával tartozom Dr. Gaál Tibornak az Állatorvostudományi Egyetem Belgyógyászati Tanszék Kórélettani Osztályának vezetıjének, hogy bölcs tanácsaival, gondos elırelátásával, az elméleti alapok nyújtásával lehetıvé tette, hogy a vezetése alatt lévı osztályon kutatómunkámat elvégezhessem. Hálámat szeretném kifejezni Dr. Vörös Károly és Dr. Karsai Ferenc professzoroknak, az Állatorvostudományi Egyetem Belgyógyászati Tanszékének jelenlegi és volt vezetıjének, mert lehetıvé tették, hogy az általuk vezetett tanszéken kutatómunkámat végezzem és szakmai tudásban elırejussak. Külön köszönöm Dr. Bertók Lórándnak, az Országos Frederique Joliot Curie Sugárbiológiai és Sugáregészségügyi Kutatóintézet Sugárbiológiai és Sugáralkalmazási Osztály vezetıjének, valamint kollégáinak, különösen Komáromi Sándornak a patkányokon végzett kísérletek lebonyolításában nyújtott segítségüket. Köszönöm Dr. Németh Tibornak, az Állatorvostudományi Egyetem Sebészeti és Szemészeti Tanszék munkatársának a kutyák veseautotranszplantációs kísérletében nyújtott segítségét. Köszönöm továbbá Dr. Móra Zsuzsának az Állatorvostudományi Egyetem Gyógyszertani és Méregtani Tanszék munkatársának egyes laboratóriumi paraméterek mérésében nyújtott segítségét. Hálával tartozom az Állatorvostudományi Egyetem Belgyógyászati Tanszék Klinikai Laboratóriumában korábban és jelenleg is dolgozó kollégáimnak és kolléganıimnek, különösen Forczig Mónikának, aki a szabadgyökös paraméterek mérésében, Dr. Szilágyi Attilának és Dr. Balogh Nándornak, akik a kísérletek lebonyolításában, valamint Jaksics Katalinnak, Hapekné Veress Évának és Leiner Ildikónak, akik a rutin klinikai laboratóriumi paraméterek mérésében nyújtottak segítséget.
150
Tartalomjegyzék JELÖLÉSEK ÉS RÖVIDíTÉSEK JEGYZÉKE .......................................................................... 0 I. BEVEZETÉS................................................................................................................ 3 I. 1. A TEMA JELENTOSEGE ............................................................................................. 3 I. 2. A KITUZÖTT CELOK ES A MEGOLDANDO FELADATOK ............................................... 4 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS...................................................................................... 7 II. 1. A SZABADGYÖK FOGALMA..................................................................................... 7 II. 2. AZ OXIGEN EREDETU SZABADGYÖKÖK ES A KEPZODESÜKHÖZ VEZETO NEHANY FOLYAMAT ..................................................................................................................... 7 II. 2. 1. Szuperoxidanion-gyök (O2.-) ....................................................................... 8 II. 2. 2. Hidrogén-peroxid (H2O2)............................................................................ 9 II. 2. 3. Hidroxil(anion)-gyök (OH.-) ......................................................................... 9 II. 2. 4. Alkoxi-gyökök (RO.) ................................................................................... 10 II. 2. 5. Szinglet-oxigén (1O2)................................................................................. 10 II. 3. AZ ROI-K KELETKEZÉSÉNEK SEJTSZINTŐ FORRÁSAI ............................................ 10 II. 3. 1. Mitokondriumok ......................................................................................... 11 II. 3. 2. Peroxiszómák.............................................................................................. 11 II. 3. 3. Endoplazmatikus retikulum ........................................................................ 11 II. 3. 4. Citoszol....................................................................................................... 11 II. 3. 5. Sejtmag ....................................................................................................... 12 II. 4. A LIPIDPEROXIDÁCIÓ (LP) FOGALMA ÉS FOLYAMATA .......................................... 12 II. 4. 1. Iniciáció (bevezetı szakasz)........................................................................ 13 II. 4. 2. Propagáció (tovaterjedés szakasza) ........................................................... 13 II. 4. 3. Termináció (befejezı szakasz) .................................................................... 14 II. 5. AZ LP SEJTSZINTŐ KÖVETKEZMÉNYEI ................................................................. 14 II. 5. 1. Membránok mikroarchitektúrájának károsodása....................................... 14 II. 5. 2. A sejtenzimek mőködésének gátlása ........................................................... 14 II. 5. 3. A lebontási (vég)termékek károsító hatásai................................................ 15 II. 5. 4. Fehérjék és nukleinsavak károsodása ........................................................ 15 II. 6. A SZABADGYÖKÖKKEL SZEMBENI VÉDEKEZÉS ÉS ELEMEINEK INTRACELLULÁRIS LOKALIZÁCIÓJA ............................................................................................................ 15 II. 6. 1. Mitokondrium ............................................................................................. 15 II. 6. 2. Citoszol....................................................................................................... 15 II. 6. 3. Szubcelluláris struktúrák ............................................................................ 16 II. 7. AZ ANTIOXIDÁNS ENZIMEK LOKALIZÁCIÓJA A VVS-EKBEN ................................... 16 II. 8. REGULÁCIÓS MECHANIZMUSOK ........................................................................... 17 II. 8. 1. A szervezet védekezése a fokozott oxigéntenzióval szemben....................... 17 II. 8. 2. Az antioxidáns védekezés regulációja ........................................................ 17 II. 9. ANTIOXIDÁNS ÉS PROOXIDÁNS ENZIMEK.............................................................. 18 II. 9. 1. Kataláz (CAT) (EC: 1.11.1.6)..................................................................... 18
151
II. 9. 2. Glutation-peroxidáz(ok) (GSH-Px) (EC: 1.11.1.9) és a glutation-Stranszferáz (GST) (EC: 2.5.1.18)............................................................................. 19 II. 9. 3. Hem-peroxidázok........................................................................................ 21 II. 9. 4. Tiol-transzferázok ....................................................................................... 21 II. 9. 5. DT-diaforáz (EC: 1.6.99) ........................................................................... 22 II. 9. 6. Citokrómoxidáz (citokróm-a3) (EC: 1.9.3.1).............................................. 22 II. 9. 7. Kevert funkciójú oxidázok........................................................................... 23 II. 9. 8. Szuperoxid-dizmutáz (SOD) (EC:1.15.1.1)................................................. 24 II. 9. 9. Glutation-reduktáz (EC:1.6.4.2)................................................................. 25 II. 9. 10. Repair-enzimek ......................................................................................... 26 II. 10. AZ LP ELLENI CELLULÁRIS VÉDEKEZÉS EGYÉB TÉNYEZİI .................................. 26 II. 10. 1. A glutation-rendszer ................................................................................. 26 II. 10. 2. Nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (NADP) ..................................... 27 II. 11. AZ ANTIOXIDÁNS SZUBSZTRÁTOK ...................................................................... 28 II. 11. 1. Fıbb természetes antioxidáns szubsztrátok: ............................................. 28 II. 11. 1. 1. E-vitamin ........................................................................................................28 II. 11. 1. 2. C-vitamin (aszkorbinsav /AH2) ......................................................................29 II. 11. 1. 3. Glutation (redukált glutation - GSH) ..............................................................31 II. 11. 1. 4. A-vitamin és karotin........................................................................................31 II. 11. 1. 5. Egyéb természetes antioxidáns szubsztrátok...................................................32 K-vitamin...........................................................................................................................32 Ubikinon............................................................................................................................32 Tiolok ................................................................................................................................32 Glükóz ...............................................................................................................................32 Cöruloplazmin ...................................................................................................................32 Transzferrin és ferritin .......................................................................................................32 Húgysav.............................................................................................................................33 Taurin ................................................................................................................................33 Bilirubin ............................................................................................................................33 Piroszılısav és az α-ketosavak .........................................................................................34 L-Karnozin (ß-alanil-L-hisztidin) ......................................................................................34 Aminosavak .......................................................................................................................34
II. 11. 2. Mesterséges antioxidáns szubsztrátok ...................................................... 34 II. 11. 2. 1. A butil-hidroxi-anizol (BHA), a butil-hidroxi-toluol (BHT) és az ethoxiquin (EMQ) ...............................................................................................................................34 II. 11. 2. 2. A deferoxamin.................................................................................................34 II. 11. 2. 3. Az allopurinol .................................................................................................35
II. 12. A SZERVEZET ÉLETTANI SZABADGYÖKÖS REAKCIÓI ........................................... 35 II. 12. 1. Alkohol-oxidáció....................................................................................... 35 II. 12. 2. A fagocitózis ............................................................................................. 36 II. 12. 3. Az immunitás............................................................................................. 37 II. 12. 4. A thrombocyták mőködése ........................................................................ 38 II. 12. 5. Az arachidonsav-metabolizmus ................................................................ 38 II. 12. 6. Az LP szerepe a mellékvesekéreg hormonok szintézisében....................... 39
152
II. 12. 7. Az öregedés szabadgyökös reakciókkal összefüggı vonatkozásai............ 39 II. 12. 8. Az antioxidáns védekezés egyes elemeinek élettani változásai ................. 40 II. 13. A TAKARMÁNYOZÁSSAL ÖSSZEFÜGGİ SZABADGYÖKÖS FOLYAMATOK.............. 41 II. 13. 1. A takarmányok táplálóanyagainak (szénhidrátok, fehérjék, zsírok) hatása a szervezet LP-s folyamataira ................................................................................. 41 II. 13. 2. A takarmányok vitamintartalmának hatása az LP-s folyamatokra .......... 42 II. 13. 3. A takarmányok mikroelemtartalmának hatása az LP-s folyamatokra...... 42 II. 13. 4. A takarmányok egyéb adalékanyagainak hatása az LP-s folyamatokra .. 43 II. 13. 5. A takarmányok nem esszenciális alkotóelemeinek és egyes mérgezı növényeknek hatása az LP-s folyamatokra ............................................................. 43 II. 13. 6. Egyéb szennyezıdések .............................................................................. 44 II. 14. KÁROS SZABAGYÖK REAKCIÓK .......................................................................... 45 II. 14. 1. Az ún. prooxidáns rendszerek................................................................... 45 Redoxi-ciklusos komponensek.......................................................................................... 45 Hidroperoxidok ................................................................................................................. 45 A nitrogénoxid (NO) és szerepe a szabadgyök-képzı folyamatokban .............................. 46
II. 14. 2. A vörösvérsejtek LP okozta károsodásai .................................................. 47 Hemoglobin (Hb) károsodása............................................................................................ 47
II. 14. 3. A membránkárosodás ............................................................................... 48 II. 14. 4. Az oxigéntoxicitás..................................................................................... 48 II. 14. 5. A szabadgyökök károsító hatása újszülöttekben....................................... 49 II. 15. XENOBIOTIKUMOK OKOZTA SZABADGYÖKÖS KÁROSODÁSOK ............................ 49 II. 15. 1. Széntetraklorid (CCl4).............................................................................. 50 II. 15. 2. Alloxán ..................................................................................................... 51 II. 15. 3. Halotán..................................................................................................... 52 II. 16. EGYES TERMÉSZETES KÓRFOLYAMATOKBAN JELENTKEZİ LP-S REAKCIÓK ....... 52 II. 16. 1. Gyulladásos, fertızéses és immunológiai eredető LP-s hatások különbözı állatokban ............................................................................................................... 52 II. 16. 2. A hyperglycaemia LP-s hatásai................................................................ 53 II. 16. 3. A gastrointestinalis tractus gyulladásos folyamataiban jelentkezı LP-s hatások .................................................................................................................... 54 II. 16. 4. A máj funkciózavarában jelentkezı LP-s hatások .................................... 54 II. 16. 5. A vizeletkiválasztó rendszer kórfolyamataiban jelentkezı LP-s hatások.. 55 II. 16. 6. Az izomdegenerációban jelentkezı LP-s hatások különbözı állatokban.. 55 II. 16. 7. Hypoxia - reperfusió LP-s hatásai ........................................................... 56 III. ANYAG ÉS MÓDSZER......................................................................................... 59 III. 1. A VÉRVÉTELEK MÓDJA ....................................................................................... 59 III. 2. A VÉRMINTÁK ELİKÉSZÍTÉSE ............................................................................. 59 III. 3. AZ ALKALMAZOTT LABORATÓRIUMI MÓDSZEREK .............................................. 59 III. 3. 1. Az LP-s paraméterek meghatározására alkalmazott laboratóriumi módszerek................................................................................................................ 59 III. 3. 1. 1. Malondialdehid (MDA) .................................................................................. 59 III. 3. 1. 2. Redukált glutation (GSH)................................................................................ 60
153
III. 3. 1. 3. Glutation-peroxidáz (GSH-Px) ........................................................................60 III. 3. 1. 4. Szuperoxid-dizmutáz (SOD)............................................................................60 III. 3. 1. 5. Kataláz (CAT) .................................................................................................60 III. 3. 1. 6. E-vitamin .........................................................................................................60 III. 3. 1. 7. Összkarotin ......................................................................................................61
III. 3. 2. Egyéb biokémiai paraméterek meghatározásához használt laboratóriumi módszerek ................................................................................................................ 61 III. 3. 3. A hematológiai paraméterek meghatározásához használt laboratóriumi módszerek ................................................................................................................ 61 III. 3. 4. A vizeletvizsgálat során alkalmazott laboratóriumi módszerek................. 61 III. 4. AZ ALKALMAZOTT STATISZTIKAI ANALÍZISEK MÓDJA.......................................... 62 IV. EREDMÉNYEK, KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK......................... 63 IV. 1. A VÖRÖSVÉRSEJTEK SZABADGYÖK REAKCIÓI ÉLETTANI KÖRÜLMÉNYEK KÖZÖTT SZARVASMARHÁBAN ÉS KUTYÁBAN ............................................................................. 63 IV. 1. 1. Szarvasmarhák ontogenezise során fellépı szabadgyök reakciók............. 63 IV. 1. 1. 1. Újszülött borjak vizsgálata ..............................................................................63 IV. 1. 1. 2. Szopós és növendék korú borjak vizsgálata ....................................................67
IV. 1. 2. A szabadgyökös reakciók változása kutyákban a kor függvényében ......... 70 IV. 1. 2. 1. Beagle kutyák vörösvérsejtjeiben tapasztalható szabadgyökös paraméterek és klinikai biokémiai vérparaméterek változásainak kor és ivar szerinti vizsgálata ...............70
IV. 2. A CCL4 ÉS AZ ALLOXÁN OKOZTA LP-S HATÁSOK VIZSGÁLATA A VÖRÖSVÉRSEJTEKBEN .................................................................................................. 74 IV. 2. 1. A széntetraklorid (CCl4) juhok és kutyák vörösvérsejt-LP-s paramétereire kifejtett hatásainak vizsgálata ................................................................................. 74 IV. 2. 1. 1. CCl4 hatása a juhok vörösvérsejtjeinek LP-s reakcióira .................................74 IV. 2. 1. 2. A CCl4 hatása a kutyák vörösvérsejtjeinek LP-s reakcióira ............................77
IV. 2. 2. Az alloxán LP-s hatásainak vizsgálata ...................................................... 80 IV. 2. 2. 1. A vörösvérsejtek LP változásai kutyák alloxán - diabetesében .......................81 IV. 2. 2. 2. A vörösvérsejtek LP változásai juhokban az alloxán hatására.........................83
IV. 3. A HYPOXIA - REPERFUSIÓNAK A VVS-EK LP-S PARAMÉTEREIRE KIFEJTETT HATÁSAINAK VIZSGÁLATA ............................................................................................ 86 IV. 3. 1. Hypoxia - reperfusio LP-s hatásainak vizsgálata patkánykísérletek során86 IV. 3. 1. 1. Hypoxia - reperfusio hatásának vizsgálata a vörösvérsejtek LP-s paramétereire patkány arteria mesenterica craniálisának átmeneti ligatúrája és reperfusiója során..........86 IV. 3. 1. 2. Hypoxia - reperfusio hatásának vizsgálata a vörösvérsejtek LP-s paramétereire patkány arteria mesenterica craniálisának átmeneti ligatúrája és reperfusiója során allopurinolos elıkezelésben...............................................................................................88
IV. 3. 2. Hypoxia - reperfusio hatásának vizsgálata a vörösvérsejtek LP-s paramétereire kutya vese-autotranszplantáció során ............................................. 90 IV. 4. JELLEMZİ SZERVKÁROSODÁSOKBAN ÉS/VAGY ANYAGFORGALMI BETEGSÉGBEN SZENVEDİ KUTYÁK ÉS SZARVASMARHÁK VÖRÖSVÉRJETJEINEK LP-S VÁLTOZÁSAI...... 94 IV. 4. 1. Egyes jellemzı szervkárosodásban szenvedı kutyák vörösvérjetjeinek LP-s változásai................................................................................................................. 94
154
IV. 4. 2. Az ellést követı relatív energiahiány hatása szarvasmarhák vörsvérsejtjeinek egyes LP-s paramétereire............................................................ 99 V. ÖSSZEFOGLALÁS ............................................................................................... 103 BEVEZETÉS ................................................................................................................ 103 TÉMA FELDOLGOZÁSA, EREDMÉNYEK, KÖVETKEZTETÉSEK, JAVASLATOK ................. 103 ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK ................................................................................ 106 SUMMARY ................................................................................................................. 108 MELLÉKLETEK ....................................................................................................... 110 IRODALMI HIVATKOZÁSOK JEGYZÉKE ........................................................................ 110 TOVÁBBI MELLÉKLETEK ............................................................................................ 140 1. Az LP összefoglaló folyamata Demopoulos és mtsai. (1980) nyomán (132): ... 140 I. Iniciáció ....................................................................................................................... 140
2. Az LP-s paraméterek meghatározására alkalmazott laboratóriumi módszerek részletes leírása..................................................................................................... 143 Malondialdehid (MDA) .................................................................................................. 143 Redukált glutation (GSH) ............................................................................................... 143 Glutation-peroxidáz (GSH-Px) ....................................................................................... 144 Szuperoxid-dizmutáz (SOD) ........................................................................................... 145 Kataláz (CAT)................................................................................................................. 145 E-vitamin......................................................................................................................... 146 Összkarotin ..................................................................................................................... 146
3. A vizsgálatokban alkalmazott egyéb biokémiai paraméterek meghatározásához használt laboratóriumi módszerek ........................................................................ 147 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁSOK .............................................................................. 150
155
BELSİ ÉS KÜLSİ TÉNYEZİK HATÁSA A VÖRÖSVÉRSEJTEK (vvs) LIPIDPEROXIDÁCIÓS (LP) ÉS ANTIOXIDÁNS FOLYAMATAIRA
(szarvasmarhákban, juhokban, kutyákban és patkányokban végzett vizsgálatok)
Vajdovich Péter Témavezetı: Mézes Miklós tanszékvezetı egyetemi tanár, a mezıgazdaságtudomány kandidátusa, Szent István Egyetem, Mezıgazdaság és Környezettudományi Kar, Takarmányozástani Tanszék
156
