Bakteriális identifikáció 16S rRNS gén szekvencia alapján MOHR ANITA SIPOS RITA, SZÁNTÓ-EGÉSZ RÉKA, MICSINAI ADRIENN
2100 Gödöllő, Szent-Györgyi Albert út 4.
[email protected], www.biomi.hu
TÖRZS AZONOSÍTÁS
Morfológia+Biokémia Biokémiai tesztek Gram festés • Még mindig a fajleírás alapvető kritériuma • Időigényes
•Labor intenzív • Atípusos törzsek esetében nehézségek Gyors identifikálás, automatizálás API VITEK
•A biokémiai tulajdonságok nem mindig
tükrözik a genetikai leszármazást (pl.: laterális géntranszfer)
TÖRZS AZONOSÍTÁS
MALDI Biotyper
Tömegspektrometria
Matrix-assisted Laser Desorption Ionisation-Time Of Flight
• 1991: első MALDI TOF tömeg spektrométer • 2008: első MALDI Biotyper Rendszer • Gyors • Azonosítás faj ill. genus szinten
Fehérje-spektrum (16S riboszómák)
• Laborok közötti kompatibilitás hiánya • Adatbázis (2000-3000 db) • Nem validált rendszer
TÖRZS AZONOSÍTÁS
Molekuláris Biológia DNS-DNS hibridizáció
• Teljes genom összehasonlítása •„GOLD STANDARD” • Fajleíráshoz szükséges
• Definitív (≥70%; ≤5°C Tm) • Költséges • Megbízható • Reprodukálható • Labor-intenzív • Nehezen elérhető (egyre kevesebb laborban végzik)
TÖRZS AZONOSÍTÁS
Molekuláris Biológia 16s riboszómális RNS gén meghatározás
• Minden baktériumban van (sőt!) • Optimális méret (1500bp): • Még vizsgálható • Elegendő információt hordoz
• Gyors (1-2 nap)
• Laborok közötti kompatibilitás • Kiterjedt adatbázis • Reprodukálható
• Nehezen definiálható •Validált rendszere: MicroSeq® Identification Systems (Lifetech)
A MOLEKULÁRIS ÓRÁK A molekuláris óra elmélete
A fehérjék változása az evolúció során időben egyenletes
„Molecules as documents of evolutionary History” J. Theoret. Biol. (1965) 8 357-366
E. Zuckerkandl, L. Pauling
Ha ismerjük két faj ugyanazon fehérjemolekulái közötti különbséget meghatározható az elválás időpontja
Riboszómális struktúrák az élővilágban
A MOLEKULÁRIS ÓRÁK
„Az élet fája”
A Molecular View of Microbial Diversity and the Biosphere Norman R. Pace Science (1997) Vol. 276 pp. 734-740
A 16S rRNS gén 510 bp
0 bp V1
V2
V3
1010 bp V4
V5
V6
V7
1500 bp V8
V9
A variabilitás >50%
Konzervatív és variábilis régiók (9 db)
Polimorfizmusok
Kópiaszám
Hossz-heterogenitás
A MÓDSZER ELVE Baktérium szuszpenzió
Azonosítás Adatbázisokban
Sejtek összegyűjtése
Nukleinsav (DNS) kivonás
Szekvenálás
16S rDNS Amplifikálás
Sanger, 1977
Mullis, 1983
A 16S rRNS gén
Ajánlott Definíció:
Azonosítás: • • •
Minimum >99% hasonlóság (ideális: >99,5%) Ellenőrzött típustörzs vagy referencia törzs szekvenciához Teljes hossz vizsgálata
>90%-ban genus szinten 65-83%-ban faj szinten 1-14%-ban nem azonosítható Valid fajok száma
Microseq adatbázisban található fajok %
% Fajok közötti távolság <3%
% Fajok közötti távolság <1%
Átlagos fajok közötti távolság %
Bacillus
76
77
3
1
8
Pseudomonas
71
70
21
2
3
Listeria
6
100
67
60
2
Acinetobacter
7
100
62
0
3
Edwardsiella
4
75
100
100
0,5
Shigella
4
100
100
50
0,9
Genus
Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Jill E. Clarridge, Clin Microbiol Rev. 2004 October; 17(4): 840–862.
ADATBÁZISOK Ingyenes, mindenki számára elérhető
Egyre növekvő számú adat Ellenőrzött?? Hibás szekvenciák (szekvenálási hibák, kimérák) >90 000 Leírt fajok és 16S rDNS szekvenciák számának változása SILVA adatbázisban
> 2 000 000
> 39 000
The All-Species Living Tree project: a 16S rRNA-based phylogenetic tree of all sequenced type strains. Yarza P, Richter M, Peplies J, Euzeby J, Amann R, Schleifer KH, Ludwig W, Glöckner FO, Rosselló-Móra R. Syst Appl Microbiol. 2008 Sep;31(4):241-50.
> 3 000 000
ELŐNYÖK - HÁTRÁNYOK
Előnyök: • Gyors
• Megbízható • Reprodukálható • Könnyen vizsgálható • Kiterjedt adatbázis (legnagyobb) • Laborok közötti kompatibilitás
(nyersadat) • Módszer- és adatbázis validált változata: Microseq (B:1400 +F:900)
Hátrányok: • Felbontás („Kritikus csoportok”) – Faj: 65-83% – Genus: 90% • Adatbázis hibák („hibás” típustörzsek) • Definíció hiánya (adatelemzés különbözhet laborok között) • Heterogenitás (kópiaszám,
polimorfizmus)
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!
